TW201000119A - MYBL2 epitope peptides and vaccines containing the same - Google Patents

Description

201000119 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於生物科璺的a 行子的領域’更具體地來說係有 關於癌症治療的領域。本發明胜s丨古關 . 4货明将別有關於新穎胜肽，其為 極有效的癌疫苗以及治療和預防腫瘤的藥物。 【先前技術】 目前已證實CD8陽性細胞毒性τ淋巴細胞（以下簡稱 CTLs)會辨認位於主要組織相容複合體（MHC)第一類分子上 之衍生自腫瘤相關抗原（以下簡稱TAAs)的抗原決定位胜 肽，並殺死腫瘤細胞。雖然黑色素瘤抗原（MAGE)家族係第 一個被發現的腫瘤相關抗原，許多其他的腫瘤相關抗原已 經由免疫方法發現（Boon T，Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 1 77-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1，183(3): 725-9)，而其中一些腫瘤相關抗原 現在則作為臨床研究中的免疫治療標靶。 鑑別可能會引發與特定抗腫瘤免疫反應的新TAAs，可 作為各種癌症中胜肽接種策略之臨床使用發展的依據 (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55； Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42； VissersJLetal., Cancer Res 1999 Novi, 59(21): 5554-91 van der Burg SHetal., J Immunol 1 996 May 1, 1 56 ( 9 ): 3308- 1 4 ； Tanaka F et al. , Cancer Res 1 997 Oct 1 5, 57( 20 ): 4465-8 ； Fujie T et al., Int 2125-10524-PF 4 .201000119 J Cancer 1 999 Jan 18，80(2): 1 69-72 ; Kikuchi M et ai·

Int J Cancer 1 999 May 5, 81(3)： 459-66 ； Oiso M et al Int J Cancer 1 999 May 5，81 (3): 387-94)。至今已有文 獻報導使用這些腫瘤相關抗原衍生胜肽的數個臨床試驗。 很不幸地’目前在這些癌症疫苗試驗中只能觀察到低客觀 反應率（objective response rate) (Belli F et al.，j Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20)： 4169-80 ； Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42； Rosenberg SA et al.， Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15)。 由於TTA可降低因TAA刪除、突變或向下調控所產生 的癌細胞免疫逃逸，因此TAA對癌細胞的增生及存活是不 可或缺的，且是免疫治療的重要標纪。 藉由分析cDNA資料庫，已知c-myb proto-致癌基因 探針（Nomura N et al·，Nucleic Aicds Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089) (GenBank Accession No: NM_002466,序列識別號：21，編碼基因產物序列識別號： 21 )、v-myb myeloblastosis病毒致癌基因同源（鳥類）-類 2為轉錄因子基因的MYB家族。在分析前，MYB已知為一調 控細胞週期的分子，且此調控係藉由CDK2-cyclin A及 CDK2-cyclin E複合物所誘導之填酸化來完成（Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9): 1855-64, Lane et al. , Oncogene 1 997 May 22; 14(20:2445-53, Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1 997 Jan 21; 94(2): 532-536, Johnson K et a 1., J Biol Chem 1 999 Dec 17; 2125-10524-PF 5 201000119 274(51):36741-9)。由目前的文獻來看，Mip/LIN-9可控 制MYBL2的表現，且此兩蛋白皆藉由調控s及Μ週期來促 進細胞週期的進行。（pi Ikinton M et al.，J Bi〇i chem 2007 Jan 5;282(1) :168-75)。此外，以含 23,040 個基因 的genome-wide cDNA晶片來分析基因的表現，發現在許多 癌細胞中MYBL2被向上調控。事實上，已有許多公開文獻 指出在許多癌細胞中MYBL2被向上調控，例如睪丸癌 (W02004/031410)、胰臟癌（W02004/031412)、膀胱癌 (W02006/085684)、非小細胞肺癌（W02004/03141 3)、小細 胞肺癌（W02007/01 3665)以及食道癌（W02004/03141 0)，上 述内容皆屬於本發明之範疇。因此，MYBL2可視為一的癌 抗原’ MYBL2衍生的抗原決定位胜肽可能可用於癌症的免 疫治療，以治療各種癌症。 【發明内容】 本發明係以一適當的抗原決定位胜肽為目標進行免疫 治療。由於免疫系統認為TAA為自身物質，因此不具有天 生的免疫抗原性，故發現適當的標靶物變的極為重要。由 於已發現MYBL2在癌症（例如’睪丸癌、胰臟癌、膀胱癌、 非小細胞肺癌、小細胞肺癌以及食道癌）中可被向上誘導， 因此本發明進一步針對MYBL2(序列識別號：22，其被

GeneBank編號丽―〇〇24 66(序列識別號：21)所編碼）進行研 究。特別是，含抗原呈現細胞之MYBL2基因產物可誘發對 於相對應分子具有專一性的CTLs。利用衍生自的

2125-10524-PF 6 201000119 HLA-A*2402結合候選胜肽刺激從健康捐贈者得到的週邊血 液單核細胞（PBMCs)。本發明進一步地提供已確立CTLs， 該細胞毒性T淋巴細胞專一地辨識以個別候選胜肽脈動產 生的（pulsed) HLA-A24陽性標的細胞，以及辨識JJLA-A24 之表位胜狀，此表位胜狀可引強烈與專一發對抗MYBL2的 免疫反應。這些結果證明MYBL2具有強大的免疫性，而其 抗原決定位為腫瘤免疫治療的有效標的。

因此’本發明提供一種具有細胞毒性T細胞誘發性之 分離的胜肽，以及一選自序列識別號：丨、2及13的胺基 酸序列。本發明之胜肽包含丨個、2個或以上之取代、插 入、刪除或增加的胺基酸，但此修改的胜肽仍保留原始的 細胞毒性T淋巴細胞誘發性。 當投與本發明之胜肽至一個體時，該胜肽存在抗原表 現或外吐小體的表面上’然後誘發以個別胜肽為目標的細 胞毒性T淋巴細胞。因此，根據本發明的觀點，本發明也 提供呈現本發明的任何胜肽的抗原呈現的細胞與外吐小 體，以及提供用以引發抗原呈現之細胞的方法。 抗腫瘤免疫反應係經由投予本發明MYBL2或編碼該多 肽之多料m表現瞧2纽肽之外吐小體與抗原 表現細胞。因Λ ’本發明提供含有多肽或含有編碼該多胜 肽之多核酸的藥劑’以及作為其活性成分的外吐小體盘抗 原表現細胞。本發明之藥劑係用來作為疫苗。 此外’本發明提供用來治療及/或預防癌症（腫瘤）及/ 或預防其術後復發的方法，以及提供誘發CTLs的方法、誘

2125-10524-PF 201000119 矣抵抗腫瘤相關的内皮細胞層而產生之免疫反應與抗腫瘤 免疫力的方法，該方法包括以下步驟：投與多胜肽， 、編碼MYBL2多胜肽 '外吐小體或表現訂此2多胜狀之抗原 表現細胞的多核蒼酸，或本發明之藥劑。另外，本發明之 CTLs也可作為對抗癌症的疫苗。癌症包括，但不限於，睪 丸癌、胰臟癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌以及 食道癌。 為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更 明顯易f董’下文特舉較佳實施例，並配合所附圖*，作詳 細說明如下： 【實施方式】 I.定義 除非特別說明，本發明中所有的技術及科學用語皆與 一般熟悉此技術領域人士所了解的定義相同。然而，若有 不一致的時候’將以本發明之定義為主。 除非有特別說明，否則本發明中所使用的“ 一種，，、 ‘‘一個”、“該”或“該等，，係指“至少—種”。 本發明中所述“多胜肽”、，“胜肽”或“蛋白質，，係 指胺基酸殘基的聚合物，該等名詞在本文中可互換使用。 該等名詞應用於胺基酸聚合物一1申之 、丫心一種或以上之胺基 酸殘基係修飾的殘基或非天然產生的殘其Γ ]夕戈I (例如：對應之天 然胺基酸的人工化學模擬物質），以及庫 汉愿用於天然產生的胺 基酸聚合物。 2125-10524-PF 8 201000119 本發明中的“胺基酸”係指天然產生與合成的胺基酸 以及胺基酸類似物與功能與天然胺基酸類似的胺基酸模擬 物。天然產生的胺基酸係那些被基因密碼編碼的胺基酸以 及那些在細胞中轉譯後被修飾的胺基酸（例如：羥脯胺酸 (hydroxyproline)、7* _叛基谷教酸（carb〇Xygiutamate) 與0-磷絲胺酸（phosphoserine))。 “胺基酸類似物，’係指 與天然胺基酸具有相同之基本化學結構（一個結合至氫、羧 基、胺基與R基團的〇；碳）但具有一修飾之R基團或修飾之 月架（例如·咼絲胺酸（h〇moserine)、正白胺酸 (norleucine) 甲硫胺酸（methionine)、亞石風 (sulfoxide)、曱硫胺酸甲基锍（methi〇nine社让“ sulfonium))的化合物。“胺基酸模擬物”係指與一般胺基 酸具有相似功能但結構不同的化學化合物。 本文中的胺基酸可用一般所知的3個字母表示或以 IUPAC IUB Biochemical Nomenclature CominiSSi〇n 建議 的單一字母表示。 除非特別說明，否則本發明中的“基因”、“多核苷 酸”、“核苷酸”與“核酸”可交互使用，這些名詞與胺 基酸以其常用的單一字母密碼表示。 除非特別說明，本發明中所述之“癌症，，係指過度表 現MYBL2基因的癌症，例如，睪丸癌、胰臟癌、膀胱癌、 非小細胞肺癌、小細胞肺癌以及食道癌。

11.胜肽 2125-10524-PF 201000119 為了證明衍生自MYBL2胜肽的功能為被CTLs辨識的抗 原’因此分析衍生自MYBL2的胜肽（序列識別號：22)以確 疋其是否為被人類白血球抗原_A24(以下簡稱HLA-A24)(其 為常見的人類白血球抗原等位基因（HLA leies))所限定 的抗原表位（Date Y et al.，Tissue Antigens 47: 93-101， 1 996 ； Kondo A et al. , J Imnmnol 1 55: 4307-1 2, 1 995 ； Kubo RT et al., J I_un〇i 1 52: 391 3一24，1 994)。利用 對於HLA-A24的結合親合力，可鑑定出可與MYBL2衍生胜 肽結合的HLA-A24候選物。將載有這些胜肽的樹狀細胞在 體外刺激T細胞之後，利用下列每一胜肽順利地建立細胞 毒性T淋巴細胞。 MYBL2-A24-9-1 00 (序列識別號：丄） MYBL2-A24-9-370(序列識別號：2)以及 MYBL2-A24-1 0-197(序列識別號：13)。 廷些已建立的CTL顯示CTL對抗以個別胜肽衝擊之目 才示細胞所產生之有效的專一活性。這些結果證明訂此2係 一種被CTL辨識的抗原，而此胜肽係被HU—A24所限定之 MYBL2抗原決定胜肽。 由於MYBL2基因在大部分癌症病人（例如，睪丸癌、胰 臟癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌以及食道癌） 身上皆過度表現’因此若要評估免疫療法的臨床效力是否 增加，該基因係一良好的評估目標。因此，本發明提供由 MYBL2獲得之CTL辨識抗原決定位（CTL —

epitopes)的九胜肽（由9個胺基酸殘基組成的胜肽）與十 2125-10524-PF 10 201000119 胜肽（由ίο個胺基酸殘基組成的胜肽）。在本發明中，九胜 肽或十胜肽的胺基酸序列可選自於序列識別號：卜2及丄3。 一般來說，現在在網際網路上可獲得軟體程式，例如 Parker KC et al. , J Immunol 1994 Jan 1, 152(1)： 163-75 所述的程式可經由電腦模擬Cin si liC0)計算各種胜肽與 人類白血球抗原之間的結合親合力。舉例來說，與人類白 血球抗原的結合親合力可利用parker et al 】

Immunol 1994 Jan 1， 152(1): 163—75 與 Kuzushima κ al·’ Blood 200 1’ 98(6): 1 872-81 所述的方法來測量。 確定結合親合力的方法描述於Journal of i_un〇1〇gicai

Methods，1 995，185: 1 81-1 90.與 Protein Science, 2000, 9: 1838-1846等文獻中。因此，本發明包含會與HU抗原 結合之MYBL2的胜肽。 可在本發明之九胜肽及十胜肽側邊加上胺基酸，此胜 狀仍然具有其可被CTL誘發的能力。此具有m刺激能力 .，的胜肽一般來說少於約4〇個胺基酸，通常少於約2〇個胺 基酸，通常少於約15個胺基酸。此含九胜肽及十胜肽的特 定的胺基酸序列並無特別限制，可由任何胺基酸所組成， 因此其並不會降低CTL的誘發性。因此，本發明更提供具 有CTL誘發性的胜月太’且此胺基酸序㈣自於序列識別 號：1 、 2 及 13 。 一般已知修飾蛋白質當中卜2或以上個的胺基酸並不 會影響該蛋白質的功能，或在一些情況下甚至可增加原始 蛋白質之期望的功能。事實上，已知修飾的胜肽（即由修飾

2125-10524-PF 201000119 之胺基酸序列組成的胜肽，修飾（即取代，增加、去除或插 入）1、2或數個胺基酸殘基至一原始的參考序列）能保持原 始胜肽的生物活性（Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1 984, 81： 5662-6 *. Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1 982, 1 0： 6487-500 ； Da 1badie-McFar1 and et al., Proc Natl Acad Sci USA 1 982，79: 6409-1 3 )。因此，在一實 施例中’本發明具有CTL誘發性的胜肽可由含有序列識別 號：1、2及13胺基酸序列的胺基酸組成，其中之1個、2 個或數個以上的胺基酸係可被插入、添加、去除及/或取代。 熟悉此技術領域人士可辨識到改變單一胺基酸或一小 部分胺基酸的特定添加或取代作用會保留原始胺基酸側鏈 的性質，因此稱該作用為“保留取代作用（c〇nservative substitution)，’ 或“保留修飾作用（conservative modi fi cat ion) ’，其中’'蛋白質之修改產生具有相似功能 的蛋白質。提供相似.功能之胺基酸的保留取代作用表 (Conservative substitution tables)已為眾人所熟知。 胺基酸側鏈之特性的例子為疏水性胺基酸（A、丨、[、m、f、 p、w、Y、v)、親水性胺基酸（R、D、N、c ' E、Q、G、Η、κ、 S T)以及具有以下宫能基或共同特性的側鏈：脂肪族側鏈 (g'a'v'l、I、ρ):含有經基的側鏈（S、T、Y);含有硫

元子的側鏈（C、M);含有羧酸與醯胺的侧鏈（D' N、£、q) L 含有驗基的側鏈（R、K、H);以及含有芳香族的側鏈（H、卜 Y、W)。另外，還有以下8個基團’其中每個基團含有可互 作保留取代作用的胺基酸：

2125-10524-PF 12 .201000119 1) 丙胺酸（A)，甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)、麩胺酸（E); 3) 天門冬胺酸（N)、麵醯胺酸（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（κ); 5) 異白胺酸（I)、白胺酸（L)、曱硫胺酸（M)、纈胺酸 (V)； 6) 苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸(W); 7) 絲胺酸（S)、羥丁胺酸（T);以及 8) 半胱胺酸（C)、曱硫胺酸（M)(參考例如：Creighton, Proteins 1984)。 該等保留特性的修飾胜肽也包含在本發明的胜肽。然 而，本發明之胜肽並不限定為此類胜肽，可保留CTL誘發 性的非保留修飾作用胜肽也包含在本發明中。再者，該修 飾之胜狀未排除多癌變異體（polymorphic variants)、種 間同系物（interspecies homologues)與 MYBL2 等位基因 (alleles)的CTL誘發胜肽。 為了保留必要的CTL誘發性，可修改（插入、添加、移 除及/或取代）少數（1個、2個或數個）或少量百分比的胺基 酸。此處的“數個”係指5個或以下的胺基酸，例如：4 或3個或以下。胺基酸的修改百分比可為2〇%或以下，例 如：15%以下、10%或1%至5%。 本發明之較佳胜狀為MYBL2-A24~9-100(序列識別號 別號：2)、及 1 3)的同源性分析 1) 、 MYBL2-A24-9-370(序列識 MYBL2-A24-10-197(序列識別號： 2125-10524-PF 13 201000119 (homo 1 ogy ana 1 y s i s )顯示這些胜肽與衍生自任何其他已 知人類基因產物的胜肽不具有顯著的同源性。因此，這降 低了它們使用於免疫治療時產生未知或不良免疫反應的可 能性。從此觀點來看，這些胜肽可用於引發腫瘤病患（例 如’睪丸癌、胰臟癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺 癌以及食道癌）抵抗腫瘤相關之内皮細胞層之MYBL2的免 疫力。 當這些胜肽用於免疫治療時，本發明之胜肽存在於細 胞或外吐小體的表面’且與HLA形成一複合物。因此，除 了胜肽的CTL誘發性之外，還需選擇對HLA具有高度結合 親合力的胜肽。該等胜肽可經由取代、插入、移除及/或添 加來修飾胺基酸序列殘基以達到較高的結合親合力。除了 自然呈現的胜肽之外’由於已知經由結合至人類白血球抗 原所王現之胜肽序列的規則性（j I mmun〇 i 1 g g 4，1 5 2 : 3 913 ; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155： 4 3 0 7 ) ’以此規則性為基礎的修飾作用可用於本發明的致免 疫性胜肽上。例如，也可適當地將其N端之第二胺基酸被 苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代，及/或將其胺 基酸在C端被苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲 硫胺酸取代。為了增加HLA-A-24'的結合親合力，本發明包 含具有序列識別號s : 1、2或13胺基酸序列，其中序列識 別號s : ；1、2或13胺基酸序列的N端第二胺基酸被苯丙胺 酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代，及/或序列識別號s: 1、2或13胺基酸序列的C端被苯丙胺酸、白胺酸、異白 2125-10524-PF 14 201000119 胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代。取代作用不只發生在末端 胺基酸，也會發生在胜肽之可能的T細胞受體識別區（the position of potential TCR recognition) 0 數個研究證 明胜肽中的胺基酸取代作用可與原始的CAP1、p53 (264-272) 、Her-2/neu (369-377)或 gpl〇〇 (209-217)相 同或更好（Zaremba et al. Cancer Res. 57，4570-4577,

1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1:168(3):1338-47., S. 0. Dionne etal. Cancer Immunol imraunother. (2003) 52: 1 99-206 and S. 0. Dionne et al.

Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53， 307-314)。 此外，可將1至2個胺基酸添加至本發明之胜肽的n 和/或c端。本發明也包括該等具有高度HU結合親合力及 保留CTL誘發性的修飾胜肽。 然而，當胜肽序列與具有不同功能之内源性或外源性 蛋白質的部分胺基酸序列相同時，可能會引起抵抗特定物 質而生的刻作用，例如：自體免疫疾病及/或過敏症狀。因 此’較佳可利用現有的資料庫進行同源性研究，以避免胜 肽的序列與另—蛋白f的胺基酸序列相符。當同源性研究 清楚地證明—胜肽與目標胜肽甚至不存有1或—2個不同的 胺基酸，則可修飾該目標胜肽以增加其與人類白血球抗原 的結合親合力及/或增加其細胞毒性T淋巴細胞誘發性，而 不會有任何產生副作用的風險。 雖然預期如上所述之董+人进音& ‘ > 之對人類白血球抗原具有高度結合

2125-10524-PF 15 201000119 親合力的胜肽具有高效力’然而根據其高度結合親合力而 選出的候選胜肽需進一步地檢視其是否具有細胞毒性τ淋 巴細胞誘發性。此處所述的‘‘細胞毒性T淋巴細胞（CTL) 誘發性”係指當CTL存在於抗原呈現細胞上時胜肽誘發 CTL的能力。再者，“ CTL誘發性”包括胜肽誘發CTL活化、 CTL增生、促進目標細胞之CTL溶解（iySis)以及增加ctl 干擾素-T產生的能力。 經由誘發載有人類主要組織相容複合體抗體的抗原呈 現細胞（例如：B淋巴細胞、巨蠻細胞與樹狀細胞（Dcs))一 或更具體地說誘發衍生自人類週邊血液單核白血球的樹狀 細胞一完成細胞毒性T淋巴細胞誘發性的確定，以胜肽刺 激之後，再與CD8陽性細胞混合，然後測量細胞毒性τ淋 巴細胞對抗目標細胞時所產生與釋放的干擾素_ r。為了表 現人類白血球抗原（例如：BenMohamed L, Krishnan R Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61 (8): 764-79、相關文章、書籍、 Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A^020l/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response 所述的人類 白血球抗原）’可使用基因轉殖動物作為反應系統。舉例來 說，可利用51鉻這類物質來放射標記目標細胞，然後由目 標細胞釋出的放射性計算細胞毒殺活性。或者CTL誘發性 可在載有固定化胜肽之抗原呈現細胞的存在下經由測量細 胞毒性T淋巴細胞產生與釋出的干擾素—r以及檢視培養 2125-10524-PF 16 201000119 基上抗干擾素-r單株抗體的抑制區來檢視該活性。 如上所述檢視胜肽之CTL誘發性的結果顯示：對，，於HLA 具有高度結合親合力的胜肽不必然具有高誘發性。然而， 自含有胺基酸序列之序列識別號：1、2、或3之胜肽所選 出的九胜肽或十胜肽顯示特別高的CTL誘發性以及對於 HLA的高度結合親合力。因此’這些胜肽為本發明之較佳 貫施例。

除了以上所討論之修飾，本發明之胜肽也可進一步地 連接至其他的物質，此連接胜肽保有原本胜肽的ctl誘導 性。此適當的物質包括：胜肽、脂肪、糖與泰鏈、乙醯基、 天然與合成的聚合物等。只要修飾作用未破壞原本胜狀的 生物活性，則該胜肽可包含的修飾作用包括糖化作用、側 鏈氧化作用或磷酸化作用等。這些修飾作用可給予額外的 功能（例如：標靶功能與傳送功能）或用以安定多胜肽。 例如’為了增加多胜肽的體内安定性，在此項技術中 已知可使用D-胺基酸、胺基酸模擬物或非天然的胺基酸； 此概念可應用於本發明之多胜肽4胜肽的安定性可利用 ::方法分析。例如’ T用肽酶(peptidases)舆各種生物 介質-例如：人類血聚與血清—測試安定性(參考― ^ Eur J Drug Metab Pharmacokln 1 986, 1 1： 291-302)。 本發明之胜肽位於細胞的 或外吐小體與HLA抗原結合成 因此本發明之胜肽包括位於細 表面（例如，抗原呈現細胞） 一複合體，且可誘導CTLs。 胞的表面或外吐小體表面的

2125-10524-PF 17 201000119 胜肽。外吐小體可以日本專利公報i卜51〇5〇7及 W099/03499所述之方法形成，以及可使用由接受治療及/ 或預防之患者所獲得的APC來形成。具有本發明胜肽之外 吐小體或細胞可像疫苗一樣接種。 包含上述複合物的HLA抗原必須與需要治療或/預防 的的個體相互配對。例如，在日本族群中，Hu抗原以 HLA-A24，特別是HLA-A2402最為普遍，因此適合用來治療 曰本族群βA24型普遍存在於曰本人及高加索人，因此可 獲得較佳的效果，且也可使用其子型，如A24〇2。一般來 說，臨床上，在預先鑑定患者的HLA抗原型，可篩選出與 特定抗原具有高結合親合力的的胜肽’或在抗原存在時具 有CTL誘導性。 '、 當在外吐小體或細胞上使用A24型之Hu抗原時，此 胜肽較佳具有序列識別號：i、2或13之序列。 在本發明中，本發明之胜肽也可稱為“mybl2胜肽” 或“ MYBL2聚胜肽”。 Π I. MYBL2胜肽的製備 本發明之胜肽可利用已 重組去氧核糖核酸技術或化 胜肽可個別地合成或合成為 多胜肽。該胜肽可被分離， 無其他天然產生宿主細胞蛋 學物質。 知的技術製備。例如，可利用 學合成合成該胜肽。本發明之 包含2個或以上之胜肽的較長 即大致上係純化或分離出來而 白質及其片段或其他任何的化

2125-10524-PF 18 201000119 本發明之胜肽可以選擇的胺基酸序列為基礎然後經由 化學合成而獲得。例如，一般的胜肽合成方法可用來合成， 包括： (i) Peptide Synthesis, Interscience， New York, 1 966 ； (ii) The Proteins， Vo 1. 2，Academic Press, New

York, 1976 ； (iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co.， 1975; (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)， Maruzen Co. ， 1985; (v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol· 14 (peptide synthesis), Hirokawa， 1991 ； (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2， Sol id Phase Peptide Synthesis”，Academic Press, New York, 1980， 100-118 。 或者’本發明之胜肽可利用任何已知用以製造胜肽的 基因工程法來獲得（例如：M〇rriscm J，J Bacteriology 1977, 132： 349-51 ； C1ark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu 以 ) 1 983， 1〇 1: 347_62)。 例如首先氣備一表達形式（expressible form)(例如，對 應於一促進劑序列之調節序列的下游）之擁有多核苷酸（該

2125-10524-PF 19 201000119 多核苷酸編碼目標胜狀）的適當載體’並將該載體轉換至一 適當的宿主細胞内。然後培養該宿主細胞進而產生玉人成 興趣的胜肽。該胜肽也可利用轉譯系統在^ f/ 製造。 IV.多核苷酸 本發明更提供一種多核苷酸，其編碼任何上述之本發 明的胜肽。該多核苷酸包括衍生自天然產生之MYBL2基因 (GenBank Accession No.題_002466(序列識別號：21)) 的多核苷酸與其具有保留修飾之核苷酸序列的多核苷酸。 此處所述之“保留修飾之核苷酸序列，，係指編碼完全相同 或大體上相同之胺基酸序列的序列。因為基因密碼的衰 亡，造成大量功能性相同的核酸編碼任何指定的蛋白質。 例如，密碼子GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。 因此，在每個丙胺酸被一密碼子指定的位置上，該密碼子 可改變成所述之任何相對應的密碼子而不需改變編碼的多 胜肽。該核酸變異體係“寂靜的變異體 variations)，其為—種保留修飾的變異體。本文所述的 每一種編碼胜肽的核酸序列也描述核酸之每一種可能的寂 靜變異體。具備此技術的人員將辨識到在一核酸（除了 AUG 之外一其通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，以及除了 tgg之 外一其通常為色胺酸的唯一密碼子）的每—密碼子可經過 修飾而產生功能性相同的分子。目此，編碼胜肽之核酸的 每一寂靜變異體係含蓄地描述於每一揭露的序列中。

2125-10524-PF 20 201000119 本發明之多核苷酸可由去氧核糖核酸、核糖核酸及其 衍生物組成。去氧核糖核酸適當地由鹼基（例如：A、τ、c 與G)組成，而在核糖核酸中τ被u取代。 本發明之多核苷酸可利用或不利用介於中間的間隔胺 基酸序列（i nterveni ng a：mino aci d sequences)編碼多種 本發明的胜肽。例如，該間隔胺基酸序列可提供多核苷酸 或轉譯胜肽的分裂位置（例如：酶識別序列）。此外該多核 苷酸可在編碼序列（其編碼本發明的胜肽）之外包含任何額 外的序列。舉例來說，該多核苷酸可為一重組多核苷酸， 其包括表現胜肽所需的調節序列或可為一具有標誌基因與 同類物的表現載體（質體）。該等重組多核苷酸一般可經由 傳統的重組技術使用聚合酶與内核酸酶等進行多核苷酸的 控制而製備。 重組與化學合成技術皆可用以製造本發明的多核苦 酸。例如’多核苷酸可經由插入一適當的載體而製得，當 該多核苷酸轉染入一適當的細胞時即可表現。或者可利用 聚合_鏈鎖反應（PCR)技術或在適當的宿主中放大多核普 酸（參考 Sambrook ei a人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1 989 )。或者，可利用如 Beaucage SL & lyei· RP， Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al. , EMBO J 1984，3: 801-5所述的固相技術合成多核苷酸。 V.抗原呈現細胞（APCs) 21

2125-10524-PF 201000119 本發明也提供抗原呈現細胞，該抗原呈現細胞於其表 面呈現形成於人類白血球抗原與本發明之胜肽之間的複合 物。經由接觸本發明之胜肽或載入表現形式之核苷酸（其編 碼本發明之胜肽）而獲得的抗原呈現細胞可衍生自接受治 療和/或預防的病患，並且該抗原呈現細胞可如疫苗般單獨 地投與或與其他藥物（包括本發明的胜肽、外吐小體或細胞 毒性τ細胞）同時投與。 抗原呈現細胞不只限於特定種類的細胞，其包括樹狀 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans ceUs)、巨噬細胞、B細 胞與活化的T細胞，已知這些細胞在其細胞表面存在蛋白 質的抗原（proteinaceous antigens)以便於被淋巴細胞辨 識。由於樹狀細胞係抗原呈現細胞當中具有最強之細胞毒 性T淋巴細胞誘發活性的代表性抗原呈現細胞，因此樹狀 細胞可作為本發明的抗原呈現細胞。 舉例來說，從週邊血液單核細胞誘發樹狀細胞，然後 以本發明之胜肽在體外（/y7以⑽、活體外（α ⑺）或活 體内（νπ 接觸（刺激）這些樹狀細胞便可得到抗原呈 現細胞。當將本發明之胜肽投與至個體時，纟現本發明之 胜肽的抗原呈現細胞便在個體體内被誘發。“誘發抗原呈 現細胞，’包括以本發明之胜肽或編碼本發明之胜肽的核= 酸接觸（刺激）—細胞，以表現細胞表面上之人類白血球抗 原舆本發明之胜肽之間所形成的複合物。或是在將本發明 之胜肽載入抗原呈現細胞使得該抗原呈現細胞表現該胜肽 之後，可將該抗原呈現細胞如疫苗般地投與至個體。例如，

2125-10524-PF 22 201000119 /舌體外（ez 的投與可包括以下步驟： a:從第一位個體收集抗原呈現細胞； b ·以胜肽接觸步驟a的抗原呈現細胞以及 者 投與該載有胜肽的抗原呈現細胞至第二位個體。 第一位與第二位個體可為同一個體或不同個體。或 本發明提供用來生產誘發抗原呈現細胞之藥學組合物 的胜肽。本發明亦提供一種製備誘導抗原呈現細胞的醫藥 ，·成物3外，本發明更提供用來誘發抗原呈現細胞的胜 肽步驟b所彳于的抗原呈現細胞可如疫苗般地投與至個體。 k本發明的觀點來看，抗原呈現細胞具有高度的細胞 毒性，τ·淋巴細胞誘發性。“高度的細胞毒性τ淋巴細胞誘 發性當中的高度係與未以胜肽接觸或以未能誘發細胞毒 陡Τ淋巴細胞之胜肽接觸的抗原呈現細胞相互比較的程 度。該等具有高度細胞毒性Τ淋巴細胞誘發性的抗原呈現 ”’田胞可、，’二由種方法來製備，該方法包括在禮分轉移含有 多核苷酸（其編碼本發明的胜肽）之基因至抗原呈現細胞的 步驟。該載入的基因可為去氧核糖核酸或核糖核酸形式。 載入的方法包括此技術領域一般所使用的各種方法一例 如.脂質體轉染、電轉染與磷酸鈣法等。更具體地說，可 使用 Cancer Res 1 996, 56: 5672_7 ; J J關unQl 1 998, 1 6 1: 5607-1 3 ； J Exp Med 1 996, 184: 465-72 ； Published

Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281所述的方法。將基因轉移至抗原呈現細胞内， 該基因在細胞内進行轉錄、轉譯與類似作用，所得的蛋白

2125-10524-PF 23 201000119 質經由第一類或第二類主要組織相容複合體⑽此）處理，然 後經過一表現途徑來表現部分的胜肽。 VI.細胞毒性τ細胞 被誘發而抵抗任何本發明之胜肽的細胞毒性τ細胞加 強了活體内標靶腫瘤相關之内皮細胞層的免疫反應，因此 該細胞毒性τ細胞可作為類似於胜肽的疫苗。因此，本發 明提供分離出來的細胞毒性τ細胞，該細胞毒性τ細胞被 本發明之胜肽專一地誘發或活化。 此細胞毒性Τ細胞可經由（1)投與至一個體或（2)在體 外以本發明之胜肽接觸（刺激）個體衍生的抗原呈現細胞與 CD8陽性細胞或週邊血液單核白血球。 細胞毒性Τ細胞（其由表現本發明之胜肽的抗原呈現 細胞經由刺激而被誘發）可衍生自接受治療和/或預防的病 患，並且可因應調節的目的而單獨投與或與其他藥物（包括 本發明的胜肽或外吐小體)共同投貞。所獲得的細胞毒性τ 、-’田胞專地產生作用並抵抗表現本發明之胜肽或同樣用以 產生誘發作用之胜肽的目標細胞。該目標細胞可為内源性 表現MYBL2細胞或為以瞧2基因轉染的細胞；而因為被 胜肽刺激而在細胞表面表現本發明之胜肽的細胞也可作為 被活化之細胞毒性τ淋巴細胞攻擊的目標。 VII. τ細胞受體（TCR)

本發明也提供—種包含編碼多胜肽（該多胜肽能夠形 2125-10524-PF 24 201000119 成τ細胞欠體的次單位）之核酸的組合物以及使用該組合 物的方法。該τ細胞受體次單位能夠形成τ細胞受體，該 Τ細胞受體提供Τ細胞抵抗表現MYBL2腫瘤細胞的專一性。 利用此技術中已知的方法可確認以本發明之一個或以上胜 肽誘發之細胞毒性τ淋巴細胞之τ細胞受體次單位—α與 沒鏈的核酸（W02007/〇32255 如d Morgan et al. , J Immunol, 1Ή’ 3288 (2003))。該衍生的T.細胞受體可以高活性結合 顯現MYBL2胜肽的目標細胞，並且隨意地在活體内或體外 有效地殺死表現MYBL2胜肽的目標細胞。 編碼T細胞受體次單元的核酸可被併入適當的載體 中’例如：反轉錄病毒載體。這些載體在此項技術中已為 吾人所熟知。該等核酸或含有該有用核酸的載體可轉移至 一 T細胞中，例如：從病患得來的τ細胞^有利之處是本 發明提供一現成的組合物’使得病患自身的T細胞（或其他 哺乳動物的T細胞）快速地修飾，進而快速且容易地產生具 有極佳之癌細胞殺死特性的修飾T細胞。 同時，本發明提供以核酸轉導而製備的CTL，此核酸 編碼連接至MYBL2胜肽一例如HLA-A24當中的序列識別 號：1、2與13—的T細胞受體次單元多胜肽。被轉導的 CTL在活體内能夠返回癌細胞，並且可藉由所熟知的體外 培養方法進行擴增（例如：Kawakami et al.，J Immunol.， 142，3452-3461 (1 989))。本發明之T細胞可用以形成能 有效治療或預防需接受治療或預防之病患之癌症的致免疫 組合物（W02006/03 1 22 1 )。 2l25-l〇524-PF 25 201000119 預防包括任何降柄、亡+ , 7降低因疾病所造成之死亡或發病的活 動。預防可發生在“如纽 吐 、 在初級、弟二級與第三級的預防”。當 初級預防避免了疾病的發展， 饮弟一級與苐二級的預防活動 便著重於預防疾病的惡化與症狀顯現，以及經由恢復功能 與降低疾病相關的併發症來降低已發生之疾病的負面影 響。或者，預防包括一庳、> 从江 R泛的預防治療，其目的在減緩特 定疾病的嚴重性，例如：減少腫瘤的增生與轉移。 癌症的治療'和/或預防和/或其術後復發的預防包括任 何下列的步驟，例如： .手術私除癌細胞、抑制癌細胞的生 長、腫瘤的衰退或退化、誘發癌症發生的緩解與抑制作用、 腫瘤缓解以及轉移的減少赤也' 的减v或抑制。有效治療和/或預防癌症 會減少死亡率與改盖志、庶、广虫u t 千，、文。心癌病患的預後、減少腫瘤標記在血 液中的含量以及減緩伴隨癌症而來並可查覺的症狀。例 如，症狀的減輕或改善係指有效地治療和/或預防包括 10%、20%、30%或以上的減輕，或指病況穩定。 V111.藥劑及組成物 與正常的組織相比較之下，MYBL2之表現在與腫瘤相 關的内皮細胞層内會特別升.高，目此本發明之胜肽或編碼 該胜狀的多核錢可妹治療和/或預防癌症，和/或預防 其術後復發。目此，本發明提供-用來治療及/或預防癌 症’及/或預防其術後復發的藥劑或組成物，該藥劑包括一 個或以上之作為活性成分之本發明的胜肽或編碼該胜肽的 多核苷酸。或者，本發明之胜肽可在任何前述之外吐小體

2125-10524-PF 26 201000119 或細胞（例如：作為藥劑或組成物的ApCsH^表面上表現。 此外，前述之標妹何本發明之胜肽的細胞毒性τ細胞也 可作為本藥劑或組成物的活性成分。 在另一實施例中，本發明另提供活性成份的使用，此 活性成份擇自於： (a )本發明之胜肽， (b) 在一可表現之形式中’編碼本發明胜肽之核酸， (c) 本發明之APC， (d) 本發明之細胞毒性τ細胞 以製備治療癌症的醫藥組成物或藥劑。 此外，本發明另提供-活性成份，此活性成份擇自於 (a) 本發明之胜肽 (b) 在一可表現之形式 A r 編碼本發明胜肽之核酸， (c) 本發明之apc， (d) 本發明之細胞毒性了細胞 以治療癌症。 此外’本發明更提供_ 法或程序以用於治療癌症， 與一活性成形成一藥學上或 成份擇自於： 種製備藥學組成物或藥劑的方 其中本發明之方法或程序包括 生理上可接受之載體，此活性 (a )本發明之胜肽 (b) 在― (c) 本發 (d) 本發 可表現之形式Φ，始跋士於 飞r 、，扁碼本發明胜肽之核酸 明之APC， 明之細胞毒性T細胞

2125-10524-PF 27 201000119 在另一實施例中，★ 藥劑的方法及程序來以用供—種製備藥學組成物或 -序包括混合-活成中本發明之方法 體’此活性成份擇自於： 載 (a) 本發明之胜肽 編碼本發明胜肽之核酸 (b) 在一可表現之形式中 (c) 本發明之apc， (d) 本發明之細胞毒性了細胞 此外，本發明之醫藥组 後再發生。 ，’成物可用來預防癌症及避免術 本藥劑或組成物可作為為疫苗。在本發明中，“疫苗，， (也稱為免疫组合物）-詞係、指接種至動物體内後具有引發 抗腫瘤免疫性功能的物質。 本發明之藥劑或組成物可用以治療和/或預防預防癌 症’和/或預防其術後復發，其可適用於個體或病患，包括： 人類或任何其他的哺乳動物—包括小鼠、大鼠、天竺鼠、 兔子、猫、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與 黑獲猩’特別是經濟上重要的動物或畜產動物，但不只限 於此類。 根據本發明，已發現含有序列識別號：丨、2或Η之 胺基酸序列的多胜肽纟HLA —Α24限定的表面胜肽或候選 物’其可誘發有效力且專—的免疫反應。因此，包含任何 該等多胜肽與序列識別號：丨、2與13胺基酸序列的本發 明藥劑或組成物特別適合投予至HLA抗原為hu_A24的個

2125-10524-PF 28 201000119 體。含有編碼任何該等多胜肽之多核苷酸的藥劑或組成物 也可作相同的應用。 以本發明之藥劑或組成物治療的癌症未受限定，其包 括所有形式的癌症，而MYBL2皆與其相關，這些癌症的例 子包括·睪丸癌、騰臟癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細 胞肺癌以及食道癌。 除了前述的活性成分之外，本發明之藥劑或組成物還

可包含其他能夠誘發CTL抵抗癌細胞的胜肽、編碼其他胜 肽的其他多核苷酸、表現其他胜肽的其他細胞或同類物。 此處所述之能夠誘發CTL·抵抗癌細胞的其他胜肽係以癌專 一的抗體（例如··被鑑別的腫瘤相關抗原）為例子，但不因 此受到限制。 如果有需要，本發明之藥劑或組成物可隨意地包含其 =的治療物質作為—活性成分，只要該物質未抑制活性成 分（例如：本發明之任何胜肽）在内皮細胞層上的抗腫瘤作 用。例如，處方可包括抗發炎劑、止痛劑、化學治療劑與 相似物。除了包含其他的治療物質在藥劑本身之外，本發 明之藥劑或組成物也可與一個或以上的其他藥學製劑連續 或同時投與。藥劑或藥學製劑的量#視使用之藥學製劑的 开/式所治療疾病以及投與時程與途徑而定。 、 解的是，除了此處特別提及的成分之外，本發明 之藥劑或組成物可包括其他在一般技 式的製劑。 芩慮到處方形 在本發明之一實施例中 本發明之藥劑或組成物可包

2】25-lG524-PF 29 201000119 括在含有用以治療疾病（例如：癌症）病理狀態之物質的商 品與套組之中。該商品可包括任何該藥劑或組成物的容器 與標籤。適當的容器包括瓶子、小玻璃瓶與試管。該容器 可為各種材質’例^玻璃或塑膠。在容器上的標鐵應標 明用以治療或預防-個或以上之病症的製劑。該標鐵也可 標明投與方式等資訊。 除了上述的容器之外’包含本發明之藥劑或組成物的 套組可任意地包含第二個貯存藥學上可接受之稀釋劑的容 器。該套組可進-步地包含商業上或使用者所認可的其他 原料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、針筒以 及藥品使用說明。 該藥學組合物也可存在於一包裝或配藥裝置 (disPenser device)中，其中含有一個或以上之單位劑量 形式的活性成分。該包裝可包括金屬或塑料膜，例如：罩 板包裝（blister pack)。依循使用說明可進行該包裝或配 藥裝置的投與。 (1)含有胜肽並以其為活性成分的藥劑或組成物 本發明之胜肽可作為一藥劑或組成物而直接地投與， 或者，如果有需要，可以一般的配製方法配製該胜肽。在 之後的例子中，除了本發明的胜肽之外，一般用於藥物中 的載體、賦形劑與這類物質也可適當地包含其中而沒有特 足的限制。該等載體的例子為無菌水、生理食鹽水、磷酸 緩衝液、培養液與這類物質。有必要的話，該藥劑或組成 物還可包含安定劑、懸浮液、防腐劑、介面活性劑與這類

2125-10524-PF 30 201000119 物質。本發明之藥劑或組成物可用於抗癌症。 本發明的胜肽可配製在一組合中，為了在活體内誘發 CTL，該組合包含2個或以上的本發明胜肽。該胜肽組成物 可混合在一混合物中，或利用標準技術相互結合。例如， 該胜肽可化學連結或表現成單一融合多胜肽序列le fusion polypeptide seqUence)。在組合中的胜肽可以相 同或不同。經由投與本發明之胜肽，在抗原呈現細胞上之 (') 人類白血球抗原（HLA antiSens)週邊表現高密度的胜肽， 然後專一地與複合物（其形成於顯現之胜肽與人類白血球 抗原之間）反應的CTL被誘發。或者，從個體移出之抗原呈 現細胞（例如：樹狀細胞）獲得在其細胞表面表現任何本發 明之胜肽的抗原呈現細胞，以本發明之胜肽刺激該抗原呈 現細胞，將這些抗原呈現細胞（例如：樹狀細胞）再投與至 個體，CTL在個體體内被誘發，便可增加對於癌細胞，如 睪丸癌、胰臟癌、膀胱癌、非小細胞肺癌' 小細胞肺癌以 Lj 及食道癌的侵害。 用以治療和/或預防癌症的藥劑或組成物可包含一佐 劑（藥劑或組成物中包含作為活性成分的本發明胜肽），如 此將可有效地建立細胞的免疫性，或者該等藥劑可與其他 活性成分一起投與或可將該等藥劑配製成顆粒（granuies) 配方並進行投與。佐劑係指當與具有免疫活性之蛋白質同 時（或連續地）投與時能夠增加對抗蛋白質之免疫反應的化 合物。本發明中的佐劑包括文獻（Clin Microbic)i Rev 1 994, 7 : 277-89)中所述的佐劑。佐劑的例子包括，但不限於，

2125-10524-PF 201000119 磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素及其 類似物，但不因此受限制。 此外’胜肽連接至數毫米直徑小珠的脂質體劑型、顆 粒劑型以及脂質連接至胜肽的劑型也便於使用。 在一些實施例中’本發明之藥劑或組成物可更包含啟 動（prime)CTL的成分。已確定脂質係能夠在活體内啟動 CTL對抗病毒抗原的製劑或組成物。舉例來說，棕櫚酸殘 基可連接至離胺酸殘基的ε -與α -胺基，然後連接至本發 明的胜肽。該脂類胜肽可以合併至脂質體中或在佐劑中乳 化，然後以微膠粒或顆粒形式直接地投與，大腸桿菌脂蛋 白 （ 例 如 ： tripalmitoyi—s_ glycerylcysteinlysery卜serine (P3CSS))係另一個脂質 啟動細胞毒性T淋巴細胞反應的例子，當大腸桿菌共價地 連接至一適當的胜肽時，大腸桿菌可啟動細胞毒性τ淋巴 細胞（其例見 Deres et al.，Nature 1 989, 342: 561-4)。 投與的方法可為口服的、皮膚内的、皮下的、靜脈内 /主射技與或這類方式以及全身性的投與或局部投與至目標 位置的鄰近區域。投與可為單次投與或增加為多次投與。 本發明之胜肽的劑量可根據治療的疾病、病患的年紀、體 重、投與的方式與這類狀態而適當地調整，其—般劑量為 0-001毫克至1 000毫克，例如：0 001毫克至丨〇〇〇毫克或 0.1宅克至1G毫克，並且可數天至數月投與—次。熟悉此 技術的人員可選擇—適當的劑量。 (2) 3有多核苷酸並以其為活性成分的藥劑或組成物

2125-10524-PF 201000119 本發明之藥劑或組成物也可包含編碼本文揭露之表現 形式之胜肽的核酸。此處所稱之表現形式”係指當多核 苦酸載入一細胞時’該多核苦酸將在活體巧表現成誘發抗 腫瘤免疫性的多胜肽。在一實施例中’吾人感興趣之多核 苷酸的核酸序列包括表現該核苷酸所需要的調節元素。可 如此裝置該多核苷酸使其適當地插入目標細胞的基因組 (同源重組基因盒載體（homologous recombination cassette vectors)例子的描述見 Thomas KR & Capecchi MR Cell 1 987，51: 503-12)。其例見 Wolff et al. , Science 1 990，247: 1465-8;美國專利案號 5, 580, 859; 5, 589, 466 ; 5’804’566 ; 5,739，118 ; 5,736,524 ; 5,679,647 與 98/04720。以去氧核糖核酸為基礎之傳送技術的例子包括 “裸露的去氧核糖核酸（naked DNA)” 、助益的（布比卡因 (bupivacaine)、聚合物、胜肽促成的）傳送、陽離子脂質 複合物與顆粒促成的（particle-nie(iiated)( “基因搶’，） 或壓力促成的傳送（其例見美國專利案號5, 922, 687)。 本發明之胜肽也可經由病毒或細菌的載體表現。表現 載體的例子包括弱病毒宿主（attenuated viral hosts)， 例如：牛痘或禽痘。此方法的例子包括使用牛痘病毒為一 表現核苷酸序列（其編碼胜肽）的載體。該重組的牛痘病毒 經由載入一宿主而表現致免疫的胜肽，並因此引發免疫反 應。用於免疫計畫之牛痘載體與方法的例子可見美國專利 案號4,722,848。另一载體為卡介苗（BCG, BaciUe Calmette Guerin)。卡介苗載體描述於 St〇ve；r et al.

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Nature 1^1，351: 456-60。其他各種用於治療投與或免 疫的載體例子一例如：腺與腺相關的病毒載體、反轉錄病 毒載體、沙門氏菌傷寒载體、解毒的炭疽熱毒素載體及其 類似物一將顯而易見。其例見Shata et al. , Mol Med Today 2000, 6: 66-71 ； Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806 ; Hippetal.， In Viv〇 2000， 14: 571-85。 多核普酸可直接地傳送入一病患（病患直接接受多核 普酸運送載體（p〇lynucle〇tide-carrying vector))或非 直接地傳送入一病患（首先在體外以吾人感興趣之多核普 酸轉換細胞，然後將該細胞移植入病患體内）。這兩種方式 分別為眾人所知的活體内（/万Fj?· 與活體外（基 因治療。 基因治療的方法可見Goldspiel ef <3厶，Clinical Pharmacy 1 993, 12: 488-505 ； Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95 ； Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96 ； Mulligan, Science 1993, 260: 926-32 ； Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217 ；

Trends in Biotechnology 1 993，11(5): 155-215。也可 用於本發明之一般所知的重組去氧核糖核酸技術係描述於 Ausubel 以 a人，Current Protocols in Molecular

Biology，John Wiley & Sons，NY，1 993 與 Krieger，Gene

Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 。 投與的方法可為口服的、皮膚内的、皮下的、靜脈内 2I25-I0524-PF 34 201000119 注射投與或這類方式以及全Iwώ ρ β ^ 久王身性的投與或局部投與至目標 位置的鄰近區域。投與可為單次投與或增加為多次投與。 在適當載體中或以多核芽酸（其編玛本發明之胜肽）轉換之 細胞中的多核苷酸的劑量可根據治療的疾病、病患的年 紀、體重、投與的方式與這類狀態而適當地調整，其一般 劑量為〇·〇〇ι毫克至1 000毫克，例如：〇 〇〇1毫克至1〇〇〇 毫克或0.1 *克至10毫克，並且可每數天至數月投與一 次。熟悉此技術的人員可選擇一適當的劑量。 IX.使用胜肽、外吐小體、APC與CTL的方法 本發明之胜肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用以誘發抗 原呈現細胞與細胞毒性Τ淋巴細胞。本發明之外吐小體與 抗原呈現細胞也可用以誘發細胞毒性τ淋巴細胞。該等胜 肽、多核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞也可與任何其他 化合物併用，只要該等化合物未抑制它們的細胞毒性τ細 胞誘發性。因此，任何上述之本發明的藥劑皆可用以誘發 細胞毒性Τ淋巴細胞，另外，那些含有胜肽與多核苷酸的 藥劑也可如以下所述地用以誘發抗原呈現細胞。 (1)誘發抗原呈現細胞的方法

本發明提供利用本發明之胜肽或編碼該等胜狀之多枝 苦酸誘發抗原呈現細胞的方法。抗原呈現細胞的誘發可依 循之前‘‘ π.抗原呈現細胞”段落中所述的方法進行。本發 明也提供一種誘發具有高度細胞毒性τ淋巴細胞誘發性之 抗原呈現細胞的方法’該誘發作用也描述於之前的‘‘ ν I 2125-10524-PF 35 201000119 抗原呈現細胞”段落中。 (2)誘發細胞毒性T淋巴細胞的方法 此外’本發明提供使用本發明之胜肽' 編碼該胜肽之 多核苷酸或表現該胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞誘發細 胞毒性T淋巴細胞的方法。當投與本發明之胜肽至一個體 時’細胞毒性T淋巴細胞在個體體内被誘發，然後標乾與 腫瘤相關之内皮細胞層的免疫反應強度增加。或者，該胜 肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用於活體外的治療法，在此 方法中’在體外以本發明之胜肽接觸（刺激）由個體衍生的 抗原呈現細胞與CD8陽性細胞或週邊血液單核白血球，妙 後在誘發細胞毒性T淋巴細胞後，將該活化的細胞毒性τ 淋巴細胞植回該個體。例如，該方法可包括以下步驟： a :由個體收集抗原呈現細胞， b :以胜肽接觸步驟a的抗原呈現細胞， c :將步驟b的抗原呈現細胞與CD8+ T細胞混合，並且 共同培養以誘發細胞毒性T淋巴細胞，以及 d:從步驟c的共同培養物收集出CD8+ T細胞。 另外，本發明提供使用本發明之胜肽製造一誘發細胞 毒性T淋巴細胞的藥學組合物。本發明亦提供一種製備含 CTL醫藥組成物的方法。此外，本發明更提供用以誘發細 胞毋性T淋巴細胞的本發明胜肽。 步驟d所得之具有細胞毒性的CDs+ τ細胞可如疫苗般 投與至個體。在步驟C與CD”細胞混合的抗原呈現細胞 也可經由“VI.抗原呈現細胞”段落所詳述的方法製備，其

2125-10524-PF 36 201000119 製備係將為本發明 之胜肽編媽的基因轉移入抗原

發明的範圍。 【實施例】 材料與方法 細胞株 將 EB 病毒（Epstein-bar virus)轉化成 HLA_A24 陽性 人類B淋巴細胞’以建立A24淋巴母細胞株（A24 lymphoblastoid cell line)(A24LCL)細胞。 衍生自MYBL2之候選胜肽的選擇 利用結合預測軟體 “BIMAS”（httP://www-bimas.cit nih· g〇v/molbi〇/hla_bind)預測結合至人類白血球抗原 -A*2402與人類白血球抗原-A*0201分子之MYBL2衍生 9-mer與l〇-mer胜肽，該軟體系統描述於parker KC et al.(J Immunol 1994，152(1 ): 163-75)與 Kuzushima K et al. (Blood 2001， 98(6): 1872-81 )。這些胜肽係由

Sigma (Sapporo，Japan)根據標準固相合成法合成並經由 逆相高效液相層析法純化。以分析的高效液相層析法與質 譜分析分別確定該等胜肽的純度與特性。將20毫克/毫升 2125-10524-PF 37 201000119 的胜肽溶於二曱基亞砜並貯存在攝氏_8〇<>{：。 體外之細胞毒性τ淋巴細胞的誘發 將單核白血球衍生的樹狀細胞作為抗原呈現細胞，以 誘發對抗存於人類白血球抗原上之胜肽所弓丨起的細胞毒性 T 淋巴細胞反應。如（NakaharaSet al.，CancerRes2〇〇3

Jul 15，63(14): 4112-8)所述的在體外產生樹狀細胞。具 體地來說，經由FiC〇U-PlaqUe(Pharmacia)溶液從一正常 志願者分離出來的週邊血液單核細胞（PBMCs) (hla_a*24〇 陽性）係經由黏附至一塑膠組織培養皿（Bect〇n Dickinson)(便於以單核白血球片段培養）而分離。將該單 核白血球滋養的族群培養在含有2%熱不活化自體血清 (autologous serura，AS)的 AIM 一 v Medium (Invii：r〇gen)， 其中含有1 0 0 0單位（u ) /毫升的粒細胞-巨噬細胞集落刺激 因子（granulocyte-macrophage co1ony-stimu 1 ating factor (GM-CSF))(R&D System)與 1 000 單位 / 毫升的介白 素（interleukin, IL)-4(R&D System)。培養 7 天之後，在 攝氏37度的AIM-V Medium中以含有3微克（micrograms)/ 毫升之/52微球蛋白之20微克/毫升之每一合成的胜肽衝 擊該細胞介素誘發的樹狀細胞3小時。產生的細胞似乎在 其細胞表面上表現與樹狀細胞相關的分子，例如：CD8〇、 CD83、CD86與第二類人類白血球抗原（未顯示數據）。然後 利用Mitomycin C(MMC)(以30微克/毫升進行30分鐘）使 這些受胜肽衝擊的樹狀細胞失活，並且將其以1 ·· 2〇的比例 2125-10524-PF 38 201000119

與自體CD8+T細胞混合，然後以CD8 Positive Isolation K i t ( Dyna 1)選擇陽性反應的樹狀細胞。將這些培養物置於 48孔的孔盤中’每一孔含有〇· 5毫升的aim-V/2%自體血清 培養基’另外含有1.5 X 1〇4個胜肽衝擊的樹狀細胞、3 X 105個CD8+ T細胞與1〇奈克（ng)/毫升的IL-7(R&D system)。3天之後，以介白素_2(chiron)補給這些培養物 至最後濃度為20國際單位（ιυ)/毫升。在第7天與第14天 進一步地以自體胜肽衝擊的樹狀細胞刺激該T細胞。這些 樹狀細胞每一次皆以上述的相同方法製備。在第21天第3 回合的胜肽刺激之後測試抵抗胜肽衝擊之A24LCL細胞的 細胞毒性 T 淋巴細胞（Tanaka H et a 1.，Br J Cancer 20 01

Jan 5，84(1): 94-9 ; Umano Y et al., Br J Cancer 2001

Apr 20, 84(8)： 1052-7； Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 1 5, 1 0(24): 8577-86 ； Suda T et al. , Cancer

Sci 2006 May，97(5): 411-9 ; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug，96(8): 498-506)。 CTL的擴增程序 利用類似於Riddell等人所述的方法（Walter EA et al·’ N Engl J Med 1 995 Oct 19，333(1 6): 1038-44;

Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23) 在培養基中擴増細胞毒性T淋巴細胞。總數為5 x 104的 細胞毒性T淋巴細胞與2種人類B淋巴母細胞株懸浮於25 毫升的AIM-V/5%自體血清培養基中，在40奈克/毫升之抗 2125-10524-PF 39 201000119 CD3單株抗體（Pharmingen)存在下利用MM(：使細胞失活。 在開始培養1天之後，將12〇國際單位/毫升之几_2添加 至該培養物中。在第5、8與Π天以含有30國際單位/毫 升之IL-2的新鮮AIM-V/5%自體血清培養基供給該培養物 (Tanaka H et al. , Br J Cancer 200 1 Jan 5, 84(1)： 94-9 ; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1 052-7 ； Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24)： 8577-86 ； Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5)： 411-9 ； Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8) : 498-506)。 專一的CTL活性

為了檢視細胞毒性τ淋巴細胞的專一活性，進行丨NF一 ^酶連結免疫斑點（ELI SPOT)分析與INF-τ酵素連結免疫 吸附法（ELISA)。具體地來說，胜肽衝擊的A24LCL(1 X 10V 孔）係製備成刺激物細胞（st i mu 1 at or ce 11 s )。在限制稀釋 之後，在48孔中的培養細胞或細胞毒性T淋巴細胞株係作 為反應物細胞（responder cel Is)。在製造程序之下進 INF-rELISPOT分析與INF-r酵素連結免疫吸附法分析。T 結果 衍生自MYBL2之HLA-A24結合胜肽的預測 表1依照結合親合力的高低依序來表示MYBL2的 HLA-A*2402結合胜肽。表1顯示衍生自mYBL2的9_mer及 2125-10524-PF 40 201000119 10-mer胜肽。分析所有具有與HLA-A24結合能力的20個 胜肽，以鑑定出抗原決定位胜肽 表一、衍生自MYBL2的HLA-A24結合胜肤 啟始位置 胺基酸序列 結合分數 序列識別號 100 KYGTKQWTL 400 1 370 EYRLDGHTI 50 2 431 SFLDSCNSL 43. 2 3 458 NFWNKQDTL 20 4 533 KPLPQTPHL 14. 4 5 156 RWAEIAKML 13. 44 6 291 KWVVEAANL 12 7 48 QFGQQDWKF 11 8 253 EQEPIGTDL 10. 08 9 100 KYGTKQWTLI 100 10 675 LFMQEKARQL 30 11 48 QFGQQDWKFL 20 12 197 KPPVYLLLEL 15. 84 13 291 KWVVEAANLL 14. 4 14 72 RWVVEAANLL 14. 4 15 335 SAEDSINNSL 12. 096 16 144 RIICEAHKVL 12 17 104 KQWTLIAKHL 11.2 18 299 LLIPAVGSSL 10. 08 19 1 509 KYSMDNTPHT 10 20 啟始位置顯示衍生自MYBL2之N端胺基酸殘基號。 結合分數由“BIMAS”獲得。 以限定HLA-A*2402之MYBL2預測胜肽誘發CTL以及建立被 2125-10524-PF 41 201000119 MYBL2衍生之胜肽刺激的CTL細胞株 根據“材料與方法”中所述的步驟產生針對衍生自

MYBL2之胜肽的細胞毒性τ淋巴細胞。以INF- γ ELI SPOT 分析法確定胜肽專一的細胞毒性T淋巴細胞活性（第1 a_c 圖）。與對照孔相比較之下，MYBL2-A24-9-l〇〇(序列識別 號：1) 、MYBL2-A24-9-370 (序列識別號·♦ 2)及 MYBL2-A24-10-1 97(序列識別號：13)產生有效力的INF_ r。此外，在陽性孔號碼#5以序列識別號：1刺激的細胞、 在# 4以序列識別號：2刺激的細胞’以及在# 1以序列識別 號：13刺激的細胞被擴增並建立CTL細胞株。以I評- γ 酵素連結免疫吸附法確認那些CTL細胞株的CTL細胞活性 (第2a-c圖）。結果顯示相對於未以胜肽衝擊的目標細胞， 所有的CTL細胞株對於以相對應之胜肽衝擊的目標細胞產 生有效力的INF-r。另一方面，經由表1顯示的其他胜肽 刺激無法建立CTL細胞株，儘管那些胜肽可能與 HLA-A*2402具有結合活性。例如，第id圖與第2d圖顯示 以MYBL2-A24-1 0-48(序列識別號：12)刺激之CTL反應的 典型陰性數據。因此’有3個衍生自MYBL2的胜肽被篩選 為能夠誘發有效力之細胞毒性T淋巴細胞株的胜肽。 抗原胜肽的同源性分析 已證明以MYBL2-A24-9-l〇〇(序列識別號：丨）、 MYBL2-A24-9-3!0(序列識別號：2)及 MYBL2-A24-10-197(序 列識別號：1 3)分別刺激的CTL會表現顯著且專一的CTL細 2125-10524-PF 42 201000119 胞活性。 此結果可歸因於上述胜肽的序列與衍生自其他已知會 使人類免疫系統敏感之分子的同源胜肽。為了排除此可能 性’使用 BLAST 演算法（http://www.ncbi. nlin.nih.g〇v/ blast/blast.cgi)對這些胜肽序列進行同源性分析，其顯 示無一序列具有顯著的同源性。該同源性分析的結果顯示 MYBL2-A24-9-1 00 (序列識別號：1)、MYBL2-A24-9-37〇(序 列識別號：2)及MYBL2-A24-10-197(序列識別號：13)都分 別為獨特的序列，因此’就我們目前所知，這些分子對不 相關分子產生非意料之免疫反應的可能性極小。 最後確認衍生自MYBL2之新穎的人類白血球抗原 -A*2402表面胜肽。此外，已證實MYBL2的表位胜肽能用 於癌症的免疫治療。 產業的利用性 本發明提供新穎的TAA，其特別衍生自MYBL2，其可促 進有效且專一地產生抑制癌症的免疫反應，且可廣泛地應 用於各種癌症。此TAA更可作為一胜肽疫苗以對抗與mybl2 相關的疾病’例如，録’特別的是，睪丸癌、胰臟癌、 膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌以及食道癌。 …雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限疋本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離 和範圍内，當可作些許之更動與潤饰，因此本發明^= 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

2125-10524-PF 43 201000119 【圖式簡單說明】 第1圖為一系列之照片。第la_ld圖顯示CTLs的 INF-γ ELISP0T分析結果’其可被MYBL2衍生胜肽所誘導。 相較於對照組’第#5號孔以MYBL2-A24-9-1 00 (序列識別 號：1)刺激（第la圖）、第#4號孔以MYBL2-A24-9-370(序 列識別號：2)刺激C第lb圖），以及在第#1號孔以 MYBL2-A24-1 0-1 97(序列識別號：13)刺激CTL(第lc圖）可 大量產生INF-r。相較之下，以MYBL2-A24-1 0-48 (序列 識別號：1 2)刺激CTL可產生非專一性的丨NF_ 7以對抗胜 肽衝擊之目標細胞。在這些圖當中’孔上的方塊區域顯示 從相對應之孔中得來的細胞係擴增來建立CTL細胞株。在 圖中，+代表對抗以適當胜肽衝擊之目標細胞時的丨NF_ T產生而 代表對抗未以任何胜肽衝擊之目標細胞 時的INF - 7^產生。 第2圖為一系統之曲線圖。第2a-2d圖顯 MYBL2-A24-9-1〇〇(序列識別號：〗）（第2a圖） MYBL2-A24 + 37〇(序列識職：2)(第 ^ 圖），以 乂 MYBL2-A24-HM97(序列識別號：13)(第&圖）建立之口 細胞株的勝"LISA分析結果。其結果證明以每—胜月 刺激而建立的細胞#性τ淋巴細胞株在與對照組比名 會有效地產生INF-r。相及妯，^曲別 ^ 7相反地在典型的陰性反應中， MYBL2-A24-1 · ι 〇 . '' 、斤幻識別唬.12)建立的細胞毒性 細胞未產生對抗胜肽衝擊目標細㈣Μ⑽ 圖）。在圖中，“ +，，神矣斟俨上 ，、弟2c 代表對抗以適备胜肽衝擊之目標細胞

2125-I0524-PF 44 201000119 時的干擾素-r產生，而“”代表對抗未以任何胜肽衝擊 之目標細胞時的干擾素-τ產生。 【主要元件符號說明】 無 2125-10524-PF 45 201000119 序列表 <110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> MYBL2抗原決定位胜肽及含此胜肽之疫苗

<130> ONC-A0807-TW <150> 61/060,293 <151> 2008-06-10 <160> 22 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成之胜肽序列 <400> 1

Lys Tyr Gly Thr Lys Gin Trp Thr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 2

Glu Tyr Arg Leu Asp Gly His Thr lie 1 5 <210> 3 2125-10524-PF 201000119 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400〉 3

Ser Phe Leu Asp Ser Cys Asn Ser Leu 1 5 <210〉 4 <211> 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成之胜肽序列 <400〉 4

Asn Phe Trp Asn Lys Gin Asp Thr Leu 1 5 <210〉 5 <211> 9 <212> PRT <213〉 人工序列 <220> <223〉 人工合成之胜肽序列 <400> 5

Lys Pro Leu Pro Gin Thr Pro His Leu 1 5 <210〉 6 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 2

2125-10524-PF 201000119 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 6

Arg Trp Ala Glu He Ala Lys Met Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成之胜肽序列 <400〉 7

Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 8

Gin Phe Gly Gin Gin Asp Trp Lys Phe 1 5 <210〉 9 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成之胜肽序列

2125-10524-PF 201000119 <400〉 9

Glu Gin Glu Pro lie Gly Thr Asp Leu 1 5 <210〉 <211> <212> <213> 10 10 PRT 人工序列 <220> <223> 人工合成之胜肽序列 C 、 <400> 10

Lys Tyr Gly Thr Lys Gin Trp Thr Leu lie 1 5 10 <210〉 11 <211> <212> <213> 10 PRT 人工序列 <220〉 <223> 人工合成之胜肽序列 C..) <400> 11

Leu Phe Met Gin Glu Lys Ala Arg Gin Leu 1 5 10 <210〉 <211> <212〉 <213〉 12 10 PRT 人工序列 <220〉 <223> 人工合成之胜肽序列 <400〉 12 4

2125-10524-PF 201000119

Gin Phe Gly Gin Gin Asp Trp Lys Phe Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 13

Lys Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu 1 5 10 <210〉 14 <211> 10 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 14

Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成之胜肽序列 <400> 15

Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp Leu 1 5 10 5

2125-10524-PF 201000119 <210〉 16 <211〉 10 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223> 人工合成之胜肽序列 <400> 16

Ser Ala Glu Asp Ser lie Asn Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成之胜肽序列 <400〉 17

Arg lie lie Cys Glu Ala His Lys Val Leu 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成之胜肽序列 <400〉 18

Lys Gin Trp Thr Leu lie Ala Lys His Leu 1 5 10 <210〉 19 6

2125-10524-PF 201000119 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成之胜肽序列 <400> 19

Leu Leu lie Pro Ala Val Gly Ser Ser Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成之胜狀序列 <400> 20

Lys Tyr Ser Met Asp Asn Thr Pro His Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 2731 <212> DNA <213〉人類 <220>

<221> CDS <222〉 （216)..(2318) <400> 21 60 120 180 gcgcttggcg ggagatagaa aagtgcttca acccgcgccg gcggcgactg cagttcctgc gagcgaggag cgcgggacct gctgacacgc tgacgccttc gagcgcggcc cggggcccgg agcggccgga gcagcccggg tcctgacccc ggcccggctc ccgctccggg ctctgccggc gggcgggcga gcgcggcgcg gtccgggccg ggggg atg tct egg egg aeg ege 2125-10524-PF 7 233 281 201000119

Met Ser Arg Arg Thr Arg 1 5 tgc gag gat ctg gat gag ctg cac tac cag gac aca gat tea gat gtg

Cys Glu Asp Leu Asp Glu Leu His Tyr Gin Asp Thr Asp Ser Asp Val 10 15 20 ccg gag cag agg gat age aag tgc aag gtc aaa tgg acc cat gag gag

Pro Glu Gin Arg Asp Ser Lys Cys Lys Val Lys Trp Thr His Glu Glu 25 30 35 gac gag cag ctg agg gcc ctg gtg agg cag ttt gga cag cag gac tgg

Asp Glu Gin Leu Arg Ala Leu Val Arg Gin Phe Gly Gin Gin Asp Trp 40 45 50 aag ttc ctg gcc age cac ttc cct aac ege act gac cag caa tgc cag

Lys Phe Leu Ala Ser His Phe Pro Asn Arg Thr Asp Gin Gin Cys Gin 55 60 65 70 tac agg tgg ctg aga gtt ttg aat cca gac ett gtc aag ggg cca tgg

Tyr Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp Leu Val Lys Gly Pro Trp 75 80 85 acc aaa gag gaa gac caa aaa gtc ate gag ctg gtt aag aag tat ggc Thr Lys Glu Glu Asp Gin Lys Val lie Glu Leu Val Lys Lys Tyr Gly 90 95 100 aca aag cag tgg aca ctg att gcc aag cac ctg aag ggc egg ctg ggg Thr Lys Gin Trp Thr Leu He Ala Lys His Leu Lys Gly Arg Leu Gly 105 110 115 aag cag tgc cgt gaa ege tgg cac aac cac etc aac cct gag gtg aag Lys Gin Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Glu Val Lys 120 125 130 aag tet tgc tgg acc gag gag gag gac ege ate ate tgc gag gcc cac Lys Ser Cys Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg lie lie Cys Glu Ala His 135 140 145 150 aag gtg ctg ggc aac ege tgg gcc gag ate gcc aag atg ttg cca ggg

Lys Val Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu lie Ala Lys Met Leu Pro Gly 155 160 165 agg aca gac aat get gtg aag aat cac tgg aac tet acc ate aaa agg

Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp Asn Ser Thr lie Lys Arg 329 377 425 473 521 569

617 665 713 2125-10524-PF 8 761 201000119 170 175 180 aag gtg gac aca gga ggc ttc ttg age gag tee aaa gac tgc aag ccc 809

Lys Val Asp Thr Gly Gly Phe Leu Ser Glu Ser Lys Asp Cys Lys Pro 185 190 195 cca gtg tac ttg ctg ctg gag etc gag gac aag gac ggc etc cag agt 857

Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu Glu Asp Lys Asp Gly Leu Gin Ser 200 205 210 gcc cag ccc aeg gaa ggc cag gga agt ett ctg acc aac tgg ccc tee 905

Ala Gin Pro Thr Glu Gly Gin Gly Ser Leu Leu Thr Asn Trp Pro Ser 215 220 225 230 gtc cct cct acc ata aag gag gag gaa aac agt gag gag gaa ett gca 953

Val Pro Pro Thr lie Lys Glu Glu Glu Asn Ser Glu Glu Glu Leu Ala 235 240 245 gca gcc acc aca teg aag gaa cag gag ccc ate ggt aca gat ctg gac 1001

Ala Ala Thr Thr Ser Lys Glu Gin Glu Pro lie Gly Thr Asp Leu Asp 250 255 260 gca gtg ega aca cca gag ccc ttg gag gaa ttc ccg aag cgt gag gac 1049

Ala Val Arg Thr Pro Glu Pro Leu Glu Glu Phe Pro Lys Arg Glu Asp 265 270 275 cag gaa ggc tee cca cca gaa aeg age ctg cct tac aag tgg gtg gtg 1097

Gin Glu Gly Ser Pro Pro Glu Thr Ser Leu Pro Tyr Lys Trp Val Val 280 285 290 gag gca get aac etc etc ate ccc get gtg ggt tet age etc tet gaa 1145

Glu Ala Ala Asn Leu Leu lie Pro Ala Val Gly Ser Ser Leu Ser Glu 295 300 305 310 gcc ctg gac ttg ate gag teg gac cct gat get tgg tgt gac ctg agt 1193

Ala Leu Asp Leu lie Glu Ser Asp Pro Asp Ala Trp Cys Asp Leu Ser 315 320 325 aaa ttt gac etc cct gag gaa cca tet gca gag gac agt ate aac aac 1241

Lys Phe Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ser Ala Glu Asp Ser lie Asn Asn 330 335 340 age eta gtg cag ctg caa geg tea cat cag cag caa gtc ctg cca ccc 1289

Ser Leu Val Gin Leu Gin Ala Ser His Gin Gin Gin Val Leu Pro Pro 345 350 355 2125-10524-PF 9 1337201000119 cgc cag cct tcc gcc ctg gtg ccc agt gtg acc gag tac cgc ctg gat Arg Gin Pro Ser Ala Leu Val Pro Ser Val Thr Glu Tyr Arg Leu Asp 360 365 370 ggc cac acc ate tea gac ctg age egg age age egg ggc gag ctg ate Gly His Thr He Ser Asp Leu Ser Arg Ser Ser Arg Gly Glu Leu lie 375 380 385 390 ccc ate tec ccc age act gaa gtc ggg ggc tet ggc att ggc aca ccg Pro He Ser Pro Ser Thr Glu Val Gly Gly Ser Gly lie Gly Thr Pro 395 400 405 1385 1433

ccc tet gtg etc aag egg cag agg aag agg cgt gtg get ctg tec cct Pro Ser Val Leu Lys Arg Gin Arg Lys Arg Arg Val Ala Leu Ser Pro 410 415 420 1481 gtc act gag aat age acc agt ctg tec ttc ctg gat tec tgt aac age Val Thr Glu Asn Ser Thr Ser Leu Ser Phe Leu Asp Ser Cys Asn Ser 425 430 435 etc aeg ccc aag age aca cct gtt aag acc ctg ccc ttc teg ccc tec Leu Thr Pro Lys Ser Thr Pro Val Lys Thr Leu Pro Phe Ser Pro Ser 440 445 450 cag ttt ctg aac ttc tgg aac aaa cag gac aca ttg gag ctg gag age Gin Phe Leu Asn Phe Trp Asn Lys Gin Asp Thr Leu Glu Leu Glu Ser 455 460 465 470 1529 1577 1625

ccc teg ctg aca tec acc cca gtg tgc age cag aag gtg gtg gtc acc Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Val Cys Ser Gin Lys Val Val Val Thr 475 480 485 1673 aca cca ctg cac egg gac aag aca ccc ctg cac cag aaa cat get geg Thr Pro Leu His Arg Asp Lys Thr Pro Leu His Gin Lys His Ala Ala 490 495 500 ttt gta acc cca gat cag aag tac tec atg gac aac act ccc cac aeg Phe Val Thr Pro Asp Gin Lys Tyr Ser Met Asp Asn Thr Pro His Thr 505 510 515 1721 1769 cca acc ccg ttc aag aac gcc ctg gag aag tac gga ccc ctg aag ccc Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala Leu Glu Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Pro 520 525 530 1817 2125-10524-PF 10 201000119 ctg cca cag acc ccg cac ctg gag gag gac ttg aag gag gtg ctg cgt 1865

Leu Pro Gin Thr Pro His Leu Glu Glu Asp Leu Lys Glu Val Leu Arg 535 540 545 550 tct gag get ggc ate gaa etc ate ate gag gac gac ate agg ccc gag 1913

Ser Glu Ala Gly lie Glu Leu lie lie Glu Asp Asp lie Arg Pro Glu 555 560 565 aag cag aag agg aag cct ggg ctg egg egg age ccc ate aag aaa gtc 1961

Lys Gin Lys Arg Lys Pro Gly Leu Arg Arg Ser Pro lie Lys Lys Val 570 575 580 egg aag tct ctg get ett gac att gtg gat gag gat gtg aag ctg atg 2009

Arg Lys Ser Leu Ala Leu Asp He Val Asp Glu Asp Val Lys Leu Met 585 590 595 atg tee aca ctg ccc aag tct eta tee ttg ccg aca act gee cct tea 2057

Met Ser Thr Leu Pro Lys Ser Leu Ser Leu Pro Thr Thr Ala Pro Ser 600 605 610 aac tct tee age etc acc ctg tea ggt ate aaa gaa gac aac age ttg 2105

Asn Ser Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly lie Lys Glu Asp Asn Ser Leu 615 620 625 630 etc aac cag ggc ttc ttg cag gee aag ccc gag aag gca gca gtg gee 2153

Leu Asn Gin Gly Phe Leu Gin Ala Lys Pro Glu Lys Ala Ala Val Ala 635 640 645 cag aag ccc ega age cac ttc aeg aca cct gee cct atg tee agt gee 2201

Gin Lys Pro Arg Ser His Phe Thr Thr Pro Ala Pro Met Ser Ser Ala 650 655 660 tgg aag aeg gtg gee tgc ggg ggg acc agg gac cag ett ttc atg cag 2249

Trp Lys Thr Val Ala Cys Gly Gly Thr Arg Asp Gin Leu Phe Met Gin 665 670 675 gag aaa gee egg cag etc ctg ggc ege ctg aag ccc age cac aca tct 2297

Glu Lys Ala Arg Gin Leu Leu Gly Arg Leu Lys Pro Ser His Thr Ser 680 685 690 egg acc etc ate ttg tee tga ggtgttgagg gtgtcacgag cccattctca 2348

Arg Thr Leu lie Leu Ser 695 700 tgtttacagg ggttgtgggg gcagaggggg tctgtgaatc tgagagteat tcaggtgacc 2408 2125-10524-PF 11 201000119 tcctgcaggg ccatgtgctg tccacttcca ccaagcccac ggggtgctcc ctcttaaaaa agcct tctgc ccctgttgcc ggtctgcctg gtcaggcctg tgtgctcacc aaaaaaaaaa caccagcccc gagcccagct gttccctccc gcctcatctc ctctcttggt aaa tccccagact gtgggcggct caaggccaca agaccctgct gcattttttt ctcaggtgga cctggtgcta gggagctccg taggatgggg ggaagaataa ggcaacaggg acaacaaagt tcagcttctc gatgtggcca aattgcctct 2468 2528 2588 2648 2708 2731 <210> 22 <211> 700 <212> PRT <213〉人類 <400> 22

Met Ser Arg Arg Thr Arg Cys Glu Asp Leu Asp Glu Leu His Tyr Gin 15 10 15

Asp Thr Asp Ser Asp Val Pro Glu Gin Arg Asp Ser Lys Cys Lys Val 20 25 30 1./ Lys Trp Thr His Glu Glu Asp Glu Gin Leu Arg Ala Leu Val Arg Gin 35 40 45

Phe Gly Gin Gin Asp Trp Lys Phe Leu Ala Ser His Phe Pro Asn Arg 50 55 60

Thr Asp Gin Gin Cys Gin Tyr Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp 65 70 75 80

Leu Val Lys Gly Pro Trp Thr Lys Glu Glu Asp Gin Lys Val He Glu 85 90 95 2125-10524-PF 12 201000119

Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Lys Gin Trp Thr Leu lie Ala Lys His 100 105 110

Leu Lys Gly Arg Leu Gly Lys Gin Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His 115 120 125

Leu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ser Cys Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg 130 135 140 lie lie Cys Glu Ala His Lys Val Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu lie 145 150 155 160

Ala Lys Met Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp 165 170 175

Asn Ser Thr He Lys Arg Lys Val Asp Thr Gly Gly Phe Leu Ser Glu 180 185 190

Ser Lys Asp Cys Lys Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu Glu Asp 195 200 205

Lys Asp Gly Leu Gin Ser Ala Gin Pro Thr Glu Gly Gin Gly Ser Leu 210 215 220

Leu Thr Asn Trp Pro Ser Val Pro Pro Thr lie Lys Glu Glu Glu Asn 225 230 235 240

Ser Glu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ser Lys Glu Gin Glu Pro 245 250 255 lie Gly Thr Asp Leu Asp Ala Val Arg Thr Pro Glu Pro Leu Glu Glu 260 265 270

Phe Pro Lys Arg Glu Asp Gin Glu Gly Ser Pro Pro Glu Thr Ser Leu 13

2125-10524-PF 201000119 275 280 285

Pro Tyr Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu He Pro Ala Val 290 295 300

Gly Ser Ser Leu Ser Glu Ala Leu Asp Leu lie Glu Ser Asp Pro Asp 305 310 315 320

Ala Trp Cys Asp Leu Ser Lys Phe Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ser Ala 325 330 335

Glu Asp Ser lie Asn Asn Ser Leu Val Gin Leu Gin Ala Ser His Gin 340 345 350

Gin Gin Val Leu Pro Pro Arg Gin Pro Ser Ala Leu Val Pro Ser Val 355 360 365

Thr Glu Tyr Arg Leu Asp Gly His Thr lie Ser Asp Leu Ser Arg Ser 370 375 380

Ser Arg Gly Glu Leu lie Pro lie Ser Pro Ser Thr Glu Val Gly Gly 385 390 395 400

Ser Gly lie Gly Thr Pro Pro Ser Val Leu Lys Arg Gin Arg Lys Arg 405 410 415

Arg Val Ala Leu Ser Pro Val Thr Glu Asn Ser Thr Ser Leu Ser Phe 420 425 430

Leu Asp Ser Cys Asn Ser Leu Thr Pro Lys Ser Thr Pro Val Lys Thr 435 440 445

Leu Pro Phe Ser Pro Ser Gin Phe Leu Asn Phe Trp Asn Lys Gin Asp 450 455 460 14

2125-10524-PF 201000119

Thr Leu Glu Leu GIu Ser Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Val Cys Ser 465 470 475 480

Gin Lys Val Val Val Thr Thr Pro Leu His Arg Asp Lys Thr Pro Leu 485 490 495

His Gin Lys His Ala Ala Phe Val Thr Pro Asp Gin Lys Tyr Ser Met 500 505 510

Asp Asn Thr Pro His Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala Leu Glu Lys 515 520 525

Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Leu Pro Gin Thr Pro His Leu Glu Glu Asp 530 535 540

Leu Lys Glu Val Leu Arg Ser Glu Ala Gly lie Glu Leu lie lie Glu 545 550 555 560

Asp Asp lie Arg Pro Glu Lys Gin Lys Arg Lys Pro Gly Leu Arg Arg 565 570 575

Ser Pro lie Lys Lys Val Arg Lys Ser Leu Ala Leu Asp He Val Asp 580 585 590

Glu Asp Val Lys Leu Met Met Ser Thr Leu Pro Lys Ser Leu Ser Leu 595 600 605

Pro Thr Thr Ala Pro Ser Asn Ser Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly lie 610 615 620

Lys Glu Asp Asn Ser Leu Leu Asn Gin Gly Phe Leu Gin Ala Lys Pro 625 630 635 640 15

2125-10524-PF 201000119

Glu Lys Ala Ala Val Ala Gin Lys Pro Arg Ser His Phe Thr Thr Pro 645 650 655

Ala Pro Met Ser Ser Ala Trp Lys Thr Val Ala Cys Gly Gly Thr Arg 660 665 670

Asp Gin Leu Phe Met Gin Glu Lys Ala Arg Gin Leu Leu Gly Arg Leu 675 680 685

Lys Pro Ser His Thr Ser Arg Thr Leu lie Leu Ser 690 695 700 16

2125-10524-PF

Claims (1)

1. 201000119 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離之具細胞毒性τ細胞誘發性之九胜肽 或十胜肽，其中該九胜肽或十胜肽包含一擇自序列識別 波.2 2胺基酸序列的胺基酸序歹^。 2. —種九胜肽或十胜肽，其含有一胺基酸序列，該胺 基酸序列係擇自下列所紐成之族群：序列識別號s : 1、^ 及13。 3. 一種具有細胞毒性Τ淋巴細胞誘發性的胜肽，其中 該胜肽包含一胺基酸，該胺基酸擇自下列所組成之族群： (a)序列識別號：1、2或13 ;以及 2或13，其中一、二或數個胺基 (b)序列識別號 酸被取代、插入、刪除或添加。 4.如申請專利範圍第3項所述之胜肽’其具有下列 或二個特徵： 2或13的N端第二個胺基酸係 苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸與 (a)序列識別號： 擇自下列所組成之族群 色胺酸，以及 ⑻序列識別號：卜2或13的。端胺基酸係擇自 列所組成之族群：苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺 與甲硫胺酸。 5· -種醫藥組成物，包含一或複數個申請專利範圍 Η項之胜肽，或—編瑪該胜肽之聚核酸，以及—藥學 可接文之載體，該醫藥組成物的目的擇自於下列所組成 2125-10524-PF 1 201000119 (i ) Μ瘤的治療， (i i)腫瘤的預防 (i i i )預防腫瘤術後的復發，以及 (i v )上述之組合。 6. 如申請專利範圍第5項所述之醫藥組成物，該醫藥 組成物係投予至一白血球抗原為HU_A24之個體。 7. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，該醫藥 組成物用於治療癌症。 8. 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，其中該 組成物包括一疫苗。 9. 一種利用申請專利範圍第1至4項中任一項所述之 胜肽誘發一具有高度細胞毒性τ淋巴細胞誘發性之抗原呈 現細胞的方法。 10· 一種利用申請專利範圍第1至4項中任一項所述 之胜肽誘發細胞毒性Τ淋巴細胞的方法。 11.如申請專利範圍第10項所述之誘發具有高度細 胞毒性Τ淋巴細胞誘發性之抗原呈現細胞的方法，其中該 方法包括導入一含有編碼申請專利範圍第卜4項所述胜肽 之核酸的基因至一抗原呈現細胞中。 1 2. —種經分離之細胞毒性τ細胞，其標靶至申請專 利範圍第1至4項所述之任何胜肽。 13. —種經分離之細胞毒性τ細胞，其被申請專利範 圍第1至4項所述之任何胜肽所誘發。 14. 一種經分離之抗原呈現細胞’其細胞表面上存有 2125-10524-PF 2 201000119 人類白血球抗原及申請專利範園第丨至4項任一項所述胜 肽之複合物。 ί 5 ·如申請專利範圍第丨4項戶斤述之抗原呈現細胞，其 中該細胞係以申請專利範圍第9或1 2項之方法所誘導。 16. 一種誘發一個體中抗癌症免疫反應的方法，該方

   法包括投予該個，-·· —胜肽之疫苗、 核酸。 2125-10524-PF 3