KR20110016952A

KR20110016952A - Ｍｙｂｌ２ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR20110016952A
Application number: KR1020107028961A
Authority: KR
Inventors: 타쿠야 츠노다; 류지 오사와
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2011-02-18
Also published as: US20110189213A1; CA2727482A1; IL209870A0; TW201000119A; JP2011522777A; CN102119170A; MX2010013688A; BRPI0913436A2; WO2009150822A1; RU2496787C2; EP2297180A4; AU2009258775A1; RU2010154101A; EP2297180A1; AU2009258775B2

Abstract

암에 대한 펩티드 백신이 본 명세서에 기재된다. 구체적으로 본 발명은 CTL을 유도하는 MYBL2로부터 유래된 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 기재하고 있다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드로 펄스된 HLA-A24 양성 표적 세포를 특이적으로 인식하는 확립된 CTL을 제공한다. 또한, 항원 제시 세포를 유도하는 방법뿐만 아니라, 상기 펩티드의 어느 하나를 제시하는 항원 제시 세포 및 엑소솜을 제공한다. 또한, 본 발명은 엑소솜 및 항원 제시 세포뿐만 나이라, MYBL2 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로서, 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 CTL을 유도하는 방법, MYBL2 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 항원 제시 세포, 또는 본 발명의 약학적 제제를 이용한 항종양 면역력을 유도하는 방법뿐만 아니라, 암(종양)의 예방 및/또는 치료, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 방법을 제공한다. 표적이 되는 암은 이에 한정되지 않지만, 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암을 포함한다.

Description

ＭＹＢＬ２ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신{MYBL２ EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME}

본 발명은 그 전체의 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는, 2008년 6월 10일에 미국 가출원 제 61/060,293호에 기반한다.

본 발명은 생명화학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 백신 및 종양 예방 및 치료를 위한 약물로써 매우 효과적으로 사용될 수 있는 신규한 펩티드에 관한 것이다.

CD8 양성 CTL은 주조직적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 클래스 I 분자에서 발견되는 종양 관련 항원(TAA)로부터 유래된 에피토프(epitope) 펩티드를 인식한 후, 상기 종양 세포를 사멸시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 첫 번째 예로서, 멜라노마 항원(MAGE) 패밀리가 발견된 후, 면역학적인 접근에도 불구하고 많은 다른 TAA가 발견되었다(Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 몇몇의 이러한 TAA들은 현재 면역치료 표적으로서, 임상 개발이 진행중이다.

강력하고, 특이적인 항종양 면역 작용을 유도할 수 있는 신규한 TAA를 동정하는 것을 다양한 암 종류를 위한 펩티드 백신 전략의 임상 활용 및 개발을 더욱 보장한다(Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양 관련 항원 유래 펩티드를 이용한 임상 시험에 관한 다수의 보고가 있었다. 불행히도, 매우 낮은 객관적 반응률이 현재까지 이러한 암 백신 시험에서 관찰되었다(Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

이러한 TAA를 이용하는 것은 잘 알려진 치료학적으로 유발되는 면역 선택의 결과 TAA의 결실, 변이 또는 저발현에 기여하는 암 세포의 면역 회피의 위험을 최소화할 수 있기 때문에, 암 세포의 증식 및 분화에 필수 불가결한 TAA는 면역 치료를 위한 표적으로서 매우 공격적이다.

c-myb 원발암유전자 프로브를 이용한 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해서(Nomura N et al., 핵산 Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089), MYBL2(GenBank Accession No: NM_002466, 서열번호 21, 유전자 산물 서열번호 22를 암호화함), a v-myb 골수아구증 바이러스성 암유전자 호모로그(homolog)(조류)-유사 2는 MYB 패밀리의 전사인자의 구성원으로 동정되었다. 이러한 동정 이전에는, MYLB2는 CDK2-사이클린(cyclin) A 및 CDK2-사이클린 E 복합체에 의한 사이클린 유도 인산화를 조절하는 것뿐만 아니라, 세포 사이클 진행을 조절하는데 관여하는 분자로 알려졌다(Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9):1855-64, Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53, Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536, Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17;274(51):36741-9). 근래의 보고에서는 Mip/LIN-9가 MYBL2의 발현을 조절하며, 두 단백질은 S 및 M기 사이클린의 조절에도 불구하고, 세포 주기 진행을 촉진시키는데 주요한 역할을 수행한다고 나타났다(Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5;282(1):168-75). 추가로, 23,040 유전자를 포함하는 게놈 와이드 cDNA 마이크로어레이를 이용한 이러한 유전자 발현 프로파일의 분석을 통해서, MYBL2는 또한 다수의 암에서 과발현되는 신규한 분자로서 규명되었다. 사실, MYBL2는 그 내용이 본 명세서에 참조되어 기재된 예를 들어, 고환종양(WO2004/031410), 췌장암(WO2004/031412), 방광암(WO2006/085684), 비소세포암(WO2004/031413), 소세포폐암(WO2007/013665), 및 식도암(WO2004/031410)을 포함하는 다수의 암 세포에서 과발현된다는 것이 나타났다. 따라서, MYBL2는 신규한 암항원(oncoantigen)으로 볼 수 있으며, MYBL2로부터 유래된 에피토프 펩티드는 다양한 암의 치료를 위한 암 치료법으로 활용될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 면역 치료법의 표적이 될 수 있는 적합한 에피토프 펩티드의 발견에 부분적으로 근거한다. TAA는 일반적으로 면역 체계에서 "자가"로 인식되며, 이로 인해서 종종 선천성 면역원성을 갖지 않는 것으로 인식되기 때문에, 적합한 표적의 발견은 매우 중요하다. MYBL2가 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암과 같은 암에서 과발현되는 것으로 인식한 뒤, 본 발명은 추가 분석을 위해서 MYBL2(GenBank Accession No. NM_002466(서열번호 21)의 유전자에 의해서 암호화되는 서열번호 22)를 표적으로 삼았다. 구체적으로, 상응되는 분자에 대하여 특이적으로 CTL을 유도하는 에피토프 펩티드를 포함하는 MYBL2 유전자 산물들이 선택되었다. 건강한 기증자로부터 획득한 말초단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 MYBL2 유래된 HLA-A*2402 결합 후보 펩티드를 이용하여 자극되었다. 각각의 후보 펩티드로 펄스된 HLA-A24 양성 표적 세포를 특이적으로 인식하는 CTL이 확립되었으며, MYBL2에 대하여 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 제한적 에피토프가 동정되었다. 이러한 결과들은 MYBL2가 강력한 면역원성이며, 이의 에피토프가 종양 면역 치료법을 위해서 효과적인 표적이라는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1, 2, 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열뿐만 아니라, CTL 유도성을 갖는 펩티드를 제공한다. 본 발명은 변형된 펩티드가 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한, 서열번호 1, 2, 또는 13의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및 첨가된 아미노산 서열을 갖는 변형된 펩티드를 고려한다.

개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드는 항원 제시 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시되며, 그런 다음 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 목적은 항원 제시 세포를 유도하는 방법뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드 중 어느 하나를 제시하는 항원 제시 세포 및 엑소솜을 제공하는 것이다.

항종양 면역 반응은 본 발명의 MYBL2 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 상기 MYBL2 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해서 유도된다. 따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함하는 엑소솜 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 약학적 제제는 백신으로서 특별한 유용성을 발견한다.

본 발명의 다른 목적은 CTL을 유도하는 방법, 종양 관련 내피에 대한 면역 반응 및, MYBL2 폴리펩티드, MYBL2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엑소솜(exosome) 또는 MYBL2 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포 또는 본 발명의 약학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법인 항면역을 유도하는 방법뿐만 아니라, 암(종양)의 치료 및/또는 예방(즉, 방지), 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 방법을 제공하는 것이다. 더욱이, 본 발명의 CTL은 또한 암에 대한 백신으로서의 용도를 밝힌다. 고려되는 암의 예로는 이에 한정되지 않으나, 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암을 포함한다.

상기에 대하여 추가로, 본 발명의 다른 목적 및 특징은 하기의 발명의 상세한 설명을 함께 있는 도면과 실시예와 결합하여 읽을 때, 보다 명확하게 될 것이다. 그러나, 상기 본 발명의 요약 및 하기의 발명의 상세한 설명 모두는 내용을 예시한 것이며, 본 발명 또는 본 발명의 다른 내용이 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 본 발명은 다수의 구체적인 내용을 참조로 하여 본 명세서에 기재되어 있지만, 이러한 설명은 본 발명을 예시하는 것이며, 이는 본 발명의 한계를 만드는 것이 아니라고 이해될 수 있다. 다양한 변형 및 활용은 하기 첨부된 청구항에 기재된, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않으면서, 당업자에게 일어날 수 있다. 유사하게, 본 발명의 다른 목적, 특징, 이익 및 장점은 이러한 요약 및 하기 기재된 특정 내용에 분명하게 나타났으며, 당업자에게 명백할 수 있다. 이러한 목적, 특징, 이익 및 장점은 상기를 함께 있는 실시예, 데이타, 도면 및 이로부터 이끌어낼 수 있는 모든 합리적인 추론, 단독 또는 본 명세서에 통합된 참조의 고려와 병합하여 명백해질 수 있다.

본 발명의 다양한 측면 및 활용은 도면의 간단한 설명과 본 발명의 상세한 설명과 여기에 따라오는 바람직한 실시예를 고려하면, 당업자에게 명백해질 수 있다.
[도. 1] 도 1은 MYBL2로부터 유래된 펩티드를 이용하여 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는, 일련의 그림, (a) - (d)로 구성된다. MYBL2-A24-9-100(서열번호 1)에 의해서 자극된 웰 넘버 #5에 있는 CTL(a), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2)에 의해서 자극된 웰 넘버 #4에 있는 CTL(b), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13)에 의해서 자극된 웰 넘버 #1에 있는 CTL(c)은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 산물을 나타낸다. 대조적으로, 특이적 IFN-감마 산물이 펩티드 펄스된 표적 세포(d)에 대하여 MYBL2-A24-10-48(서열번호 12)로 자극한 CTL로부터 검출되지 않았다. 사각형 상자로 나타나는 상기 웰 안의 세포는 CTL 라인을 확립하기 위하여 확장되었다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 표적세포에 대한 IFN-감마 산물을 나타내며, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 산물을 나타낸다.
[도. 2] 도 2는 상기 IFN-감마 ELISA 분석에서 MYBL2-A24-9-100(서열번호 1)을 이용하여 확립된 CTL 라인(a), MYBL2-A24-9-370를 이용하여 확립된 CTL 라인(서열번호 2)(b), 및 MYBL2-A24-10-197를 이용하여 확립된 CTL 라인(서열번호 13)(c)의 IFN-감마 ELISA 분석 결과를 나타내는 일련의 그래프, a 내지 d로 구성된다. 이러한 결과는 각각의 펩티드를 이용한 자극에 의해서 확립된 CTL 라인은 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 산물을 나타낸다는 것을 보여준다. 대조적으로, 특이적 IFN-감마 산물이 펩티드 펄스된 표적 세포(d)에 대하여 MYBL2-A24-10-48(서열번호 12)로 자극한 CTL로부터 검출되지 않았다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 표적세포에 대한 IFN-감마 산물을 나타내며, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 산물을 나타낸다.

비록, 본 명세서에 기재된 어떠한 방법들 및 재료와 유사하거나 동등한 방법들 및 재료는 본 발명의 실시예를 수행 또는 검사하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 도구 및 재료는 여기에 기재된다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 상세한 설명에 이용된 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 봉 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.

본 명세서에서 언급된 발표, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 통합된다. 그러나, 본 명세서의 어느 것도 본 발명은 이전 발명으로 인하여 선행되는 문헌의 자격이 없다는 인정으로서, 만들어지지 않는다.

I. 정의

별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따른다.

단어 본 명세서에 사용된 단어는 달리 구체적으로 지적되지 않는 한, 단수를 의미한다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 명세서에서 아미노산 잔기의 폴리머(polymer)를 나타내기 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된 잔기이거나, 자연적으로 생성된 아미노산 폴리머뿐만 아니라, 자연적으로 생성되는 아미노산에 상응되는 인공적인 화학적 미메틱(mimetic)과 같은 비 자연적으로 생성된 잔기인 아미노산 폴리머에 적용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "아미노산"은 자연적으로 생성된 아미노산과 유사하게 기능을 하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 미메틱(mimetic)뿐만 아니라, 자연적 및 합성된 아미노산을 나타낸다. 자연적으로 발생되는 아미노산은 세포에서 번역(translation)된 후, 변형된 아미노산뿐만 아니라, 유전자 코드에 의해서 암호화되는 아미노산이다. 상기 "아미노산 유사체" 구문은 자연적으로 발생되는 아미노산으로서, 동일한 기본 화학 구조(수소, 카르복시 그룹, 아미노 그룹, 및 R 그룹에 알파 탄소(alpha carbon)가 결합)를 갖고 있으나, 변형된 R 그룹 또는 변형된 백본(backbone)(호모세린(homo세린), 노르류신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭시화물(sulfoxide), 메틸-메치오닌-술포늄(methionine methyl sulfonium)을 갖는 화합물을 나타낸다. 상기 "아미노산 미메틱" 구문은 일반적인 아미노산과 다른 구조를 갖고 있으나, 유사한 기능을 갖는 화학적 화합물을 나타낸다.

아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 상징 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 협회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장되는 한-문자 상징으로 나타낼 수 있다.

용어 "유전자(gene)", "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "뉴클레오타이드(nucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)"은 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 따로 구체적으로 지적하지 않는 한, 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해서 나타난다.

별도로 정의되지 않는 한, 용어 "암" 은 예를 들어 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암을 포함하는 MYBL2 유전자가 과발현되는 암을 일컫는다.

II . 펩티드

MYBL2로부터 유래된 펩티드가 세포독성 T림프구(CTLs)에 의해서 인식되는 항원으로서 기능을 한다는 것을 나타내기 위하여, MYBL2로부터 유래된 펩티드(서열번호 22)는 이들이 일반적으로 HLA 대립형질과 대립하는 HLA-A24에 의해서 제한되는 항원 에피토프인지를 확인하기 위하여 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). MYBL2로부터 유래된 HLA-A24 결합 펩티드의 후보는 이들의 HLA-A24에 대한 결합 친화력을 기준으로 확인하였다. 이러한 펩티드를 넣은 수지상 세포(DCs)에서 의해서 시험관 내(in vitro) T 세포의 자극 이후, CTL은 하기의 각각의 펩티드를 이용하여 성공적으로 확립되었다:

MYBL2- A24-9-100(서열번호 1);

MYBL2-A24-9-370(서열번호 2); 및

MYBL2-A24-10-197(서열번호 13).

이렇게 확립된 CTL은 각각의 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대하여 강력하고 특이적인 CTL 활성을 보인다. 이러한 본 발명의 결과는 MYBL2가 CTL에 의해서 인식되는 항원이며, 상기 펩티드는 HLA-A24에 의해서 제한되는 MYBL2의 에피토프 펩티드일 수 있다는 것을 나타낸다.

MYBL2 유전자는 예를 들어, 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암을 포함하는 대부분의 암 조직에서 과발현되기 때문에, 이는 면역 치료를 위한 좋은 표적으로 나타난다. 따라서, 본 발명은 MYBL2의 CTL 인식 에피토프에 상응되는 노나펩티드(nonapeptide)(9개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드) 및 데카펩티드(decapeptide)(10개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드)를 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 바람직한 노나펩티드 및 데카펩티드의 예는 서열번호 1, 2, 및 13 가운데서 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함한다.

일반적으로 Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75에 기재된 것과 같이, 인터넷에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은 가상으로(in silico) 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화력을 계산하는데 사용할 수 있다. HLA 항원과의 결합 친화력은 예를 들어, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; 및 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 결합 친화력을 결정하기 위한 방법이 예를 들어, Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 및 Protein Science에 기재된다. 따라서, 본 발명은 알려진 프로그램을 이용하여 동정된 HLA 항원에 결합하는 MYBL2의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는 결과되는 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한, 추가적인 아미노산 잔기가 측면에 위치할 수 있다. CTL 유도성을 갖는 이러한 펩티드는 전형적으로 40개 아미노산 미만이며, 종종 약 20개 아미노산 미만이며, 대개 약 15개 아미노산 미만이다. 상기 본 발명에 따른 노나펩티드 및 데카펩티드 주위의 특정 아미노산 서열(예, 서열번호 1, 2, 및 13 가운데 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드들)은 제한되지 않으며, 본래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 어떠한 종류의 아미노산으로도 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CTL 유도성을 갖는 펩티드 및 서열번호 1, 2, 및 13 가운데 선택되는 아미노산 서열을 제공한다.

일반적으로, 단백질에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 끼치지 않으며, 몇몇의 경우에는 심지어 본래 펩티드의 원하는 기능을 강화시킬 수 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 본래의 참조 서열과 비교하여, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 첨가, 결실 또는 삽입) 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려졌다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 하나의 실시예에서, 본 발명의 펩티드 CTL 유도성 및 하나, 둘 또는 심지어 다수의 아미노산이 삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환된 서열번호 1, 2, 및 13 가운데 선택되는 아미노산 서열 모두를 가질 수 있다.

당업자는 단일 아미노산 또는 아미노산의 일부 비율이 바뀐, 아미노산 서열의 각각의 첨가 또는 치환이 본래 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 결과를 내는 경향이라는 것을 알고 있다. 보통, 이들은 단백질의 변화가 본래 단백질과 유사한 기능을 갖는 변형된 단백질을 만드는 보존적 치환" 또는 "보존적 변형"이라고 일컫는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 보존되는 아미노산 측쇄 특성의 예는 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기의 기능적 그룹 또는 공통적인 특성을 갖는 측쇄가 포함된다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 측쇄(S, T, Y)를 포함하는 수산기 그룹; 측쇄(C, M)를 포함하는 황 원자; 측쇄(D, N, E, Q)를 포함하는 카르복실산 및 아미드(amide); 측쇄(R, K, H)를 포함하는 염기; 및 측쇄(H, F, Y, W)를 포함하는 방향족. 추가로, 하기의 8개 그룹은 각각 보존적 치환으로서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글라이신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E);

3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(isoleucine)(I), 류신(leucine)(L), 메티오닌(methionine)(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(phenylalanine)(F), 타이로신(tyrosine)(Y), 트립토판(tryptophan)(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(methionine)(M)(예, Creighton, Proteins 1984 참조).

이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명에 따른 펩티드로 간주된다. 그러나 본 발명의 펩티드는 여기에 한정되지 않으며 상기 변형된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 비-보존적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 변형된 펩티드는 CTL 유도성 펩티드의 다형성 변이, 종간 유사체(interspecies homologues), 및 MYBL2의 대립형질을 제외하지 않는다.

필요한 CTL 유도성을 유지하기 위하여, 사람들은 몇몇(예를 들어, 1, 2 또는 다수) 또는 낮은 퍼센트의 아미노산을 변형(삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환)할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "다수"는 5개 미만의 아미노산, 예를 들어, 4개 또는 3개 이하를 의미한다. 아미노산의 퍼센트는 바람직하게 20% 미만이며, 보다 바람직하게는 15% 미만이며, 그보다 더욱 바람직하게는 10%미만 또는 1 내지 5%이다.

본 발명의 바람직한 펩티드의 유사성 분석은, MYBL2-A24-9-100(서열번호 1), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13) 펩티드가 다른 알려진 인간 유전자 산물로부터 유래한 펩티드와 현저한 유사성을 가지고 있지 않다는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 펩티드가 면역 치료법으로 사용되었을 경우, 알려지지 않거나 원하지 않은 면역 반응을 발생시킬 수 있는 가능성은 매우 낮다. 따라서, 이러한 펩티드는 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암과 같은 암 세포에서 MYBL2에 대한 종양 환자의 면역력을 유도하는데 매우 유용할 것으로 예상된다.

면역 치료법의 문맥으로 이용될 때, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시되며, 바람직하게는 HLA 항원과의 복합체로서 제시된다. 따라서, CTL 을 유도할 뿐만 아니라, 상기 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화력을 가진 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 상기 펩티드는 증가된 결합 친화력을 갖는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여, 아미노산 잔기들의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가를 통해서 변형될 수 있다. 자연적으로 나타나는 펩티드 이외에, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있으며(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 이러한 규칙성에 기반한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들어, HLA-A24 결합 친화력을 증가시키기 위하여, N 말단의 두 번째 아미노산을 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환 및/또는 C 말단의 아미노산을 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, N 말단 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환 및/또는 C 말단의 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된, 서열번호 1, 2 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 본 발명에 의해서 포함된다. 치환은 마지막 아미노산 위치뿐만 아니라, 펩티드의 TCR 인식 가능 부위에서 도입될 수 있다. 다수의 연구에서 펩티드 내의 아미노산 예를 들어 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) 또는 gp100_(209-217)등의 펩티드에서 아미노산 치환은 본래와 동등하거나 또는 우수하다는 것을 보였다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003) 52: 199-206, 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004) 53, 307-314).

또한, 본 발명은 상기 원하는 펩티드의 N 및/또는 C 말단에 하나 내지 2개의 아미노산을 첨가하는 것을 고려한다. 또한, 이러한 높은 HLA 항원 결합 친화력을 가지면서 CTL 유도성을 보유하는 변형된 펩티드는 본 발명에서 포함된다.

그러나, 상기 펩티드 서열이 상이한 기능을 갖는 내인성 또는 외인성의 아미노산 서열의 일부와 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 및/또는 알러지 반응과 같은 부작용이 유도될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드의 서열과 일치하는 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 경우를 회피하기 위하여, 우선 상기 이용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성을 수행하는 것이 바람직하다. 목적 펩티드와 비교하여 1개 또는 2개 아미노산의 차이가 있는 펩티드조차 존재하지 않는다는 상동성 검색결과가 확실해진다면, 상기 목적 펩티드는 이의 HLA 항원과의 결합 친화력을 증가시키기 위해서, 및/또는 상기와 같은 부작용의 위험이 없는 CTL 유도성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.

비록 상기 기재된 바와 같이 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화력을 갖는 펩티드는 매우 효율적이라고 예상되지만, 지표로서 높은 결합 친화력의 존재에 따라 선택된 후보자 펩티드들은 CTL 유도성의 존재를 더욱 조사한다. 여기에서, 구문 "CTL 유도성"은 항원 제시 세포에 제시될 때, 세포독성 림프구(CTL)을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 나아가, "CTL 유도성"은 상기 펩타이드의 CTL 활성 유도, CTL 증식, 표적 세포의 CTL 용해, 및 CTL IFN-감마 생성을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들어, B-림프구, 대식세포, 및 수지상 세포(DCs))를 운반하는 항원 제시 세포, 또는 보다 구체적으로 인간 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DC의 유도한 후, 및 상기 펩티드로 자극한 다음, CD8-양성 세포와 혼합한 후, 표적 세포에 대하여 CTL에 의해서 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정하는 것에 의해서 수행된다. 반응 체계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 만들어진 형질전환 동물이 사용될 수 있다(예를 들어, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response에 기재됨). 예를 들어, 상기 표적 세포는 ⁵¹Cr 등으로 방사선 표지될 수 있으며, 세포독성 활성은 상기 표적세포로부터 방출되는 방사능으로부터 산출될 수 있다. 대안적으로, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 운반하는 항원 제시 세포의 존재하에, CTL에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-감마를 측정하고, 항 IFN-감마 단일클론 항체를 이용하여 상기 배지 내의 억제 구간을 가시화함으로써 측정할 수 있다.

상기 기재한 바와 같이, 펩티드의 CTL 유도성 검사 결과, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화력을 갖는 펩티드들은 반드시 높은 유도성을 갖지 않는다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 상기 확인되고, 검사된 펩티드 가운데, 서열번호 1, 2, 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 노나펩티드 또는 데카펩티드는 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화력뿐만 아니라, 특히 높은 CTL 유도성을 보이다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 시험된다.

또한, 상기 기재한 변형 외에, 본 발명의 펩티드는 결과적으로 연결된 펩티드가 본래 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하는 한, 다른 물질과 연결될 수 있다. 적합한 물질의 예는 하기를 포함한다, 예를 들어: 펩티드, 지질, 당 및 당 사슬, 아세틸 그룹(acetyl group), 천연 및 합성 폴리머 등. 상기 펩티드는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화(phosphorylation) 기타와 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능을 부여하기 위하여 (예, 표적화 기능, 및 전달 기능), 또는 상기 폴리펩티드를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다.

예를 들어, 폴리펩티드의 세포외(in vivo) 안정성을 증기시키기 위하여, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 미메틱스(mimetics) 또는 비자연적인 아미노산을 도입할 수 있다는 것이 알려져 있다; 또한 이러한 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 가수분해 효소 및 인간 플라즈마 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지가 안정성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다(참조, 예, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

본 발명의 펩티드는 HLA 항원과 조합이 복합체로서 세포(예, 항원 제시 세포)의 표면 또는 엑소솜에 제시된 다음, CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시된 펩티드를 포함한다. 이러한 엑소솜은 바람직하게, 예를 들어 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/0349이 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 획득한 APC를 이용하여 제조될 수 있다. 상기 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 세포는 백신으로서 접종될 수 있다.

상기 복합체에 포함되는 HLA 항원 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원과 반드시 일치해야한다. 예를 들어, 일본 인구에서는 HLA-A24, 구체적으로 HLA-A2402가 일반적이며, 따라서 일본 환자의 치료를 위해서 적합하다. 일본 및 백인에게 높게 발현되는 A24 종류를 이용하는 것은 효과적인 결과를 얻는데 알맞으며, 또한 A2402와 같은 서브타입의 용도를 찾았다. 일반적으로, 임상에서는 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원 종류가 우선 검사하고, 이는 특정 학원에 대한 높은 결합 친화력 또는 항원 제시에 의해서 CTL 유도성을 갖는 펩티드의 선택에 적합하게 이용할 수 있다.

바람직하게는 엑소솜 또는 세포를 위한 A24 종류의 HLA 항원을 이용할 때, 서열번호 1, 2 또는 13의 서열을 갖는 펩티드가 사용된다.

이하, 본 발명의 펩티드는 또한 "MYBL2 펩티드(들)" 또는 "MYBL2 폴리펩티드(들)"로서 기재될 수 있다.

III . MYBL2 펩티드의 제조

본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 이용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 각각 합성되거나, 둘 또는 이상의 펩티드로 구성되는 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 숙주 세포 단백질 및, 이의 단편, 또는 다른 화학적 물질이 실질적으로 제거되도록 분리, 즉 정제될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열에 기반하여 화학적 합성을 통해 획득될 수 있다. 합성에 적용할 수 있는, 종래 펩티드 합성 기술의 예는 하기를 포함한다:

(i) 펩티드 합성(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966;

(ii) 단백질(The Proteins), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) 펩티드 합성(Peptide Synthesis)(일본어), Maruzen Co., 1975;

(iv) 펩티드 합성의 기본 및 실험(일본어), Maruzen Co., 1985;

(v) 제약 개발(두 번째 권)(일본어), Vol. 14(펩티드 합성), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; 및

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "고상 펩티드 합성(Solid Phase peptide synthesis)", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

대안적으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 생산하기 위한 모든 공지된 유전 공학 기술을 적용하여 획득될 수 있다(예, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들어, 우선, 발현할 수 있는 형태로 목적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터(예, 프로모터 서열에 상응하는 조절 서열의 하위 단계)가 제조되고, 적합한 숙주 세포에 형질전환된다. 그리고 상기 숙주 세포는 관심있는 펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 또한, 상기 펩티드는 시험관 내 번역 체계(in vitro translation system)를 채택하여 시험관 내에서 생성될 수 있다.

IV . 폴리뉴클레오티드( polynucleotide )

또한, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클리레오티드를 제공한다. 이들은 MYBL2 유전자의 보존적 변형형 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 자연적으로 발생되는 MYBL2 유전자(GenBank Accession No. NM_002466(서열번호 21))로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이하, 구문 "보존적 변형 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화도(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정한 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정화되는 각 위치에서, 상기 코돈은 암호화하는 폴리펩티드를 변화시키지 않고, 이에 상응되는 코돈으로 변화할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적 변형 변이의 한 종이다. 또한, 본 명세서에서 펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 침묵 변이의 가능성을 기재한다. 일반적인 기술의 하나는 핵산 내의 각 코돈(예외 일반적으로 메티오닌(methionine)을 위한 유일한 코돈인 AUG, 트립토판(tryptophan)을 위한 유일한 코돈인, TGG)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위하여 변형되는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 침묵 변이는 각각의 밝혀진 서열에 암시적으로 기재된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이의 변이체로 구성될 수 있다. DNA는 적합하게 A, T, C, 및 G로 구성되며, RNA에서 T는 U로 치환된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 사이에 삽입하거나 또는 삽입하지 않은 채로, 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 끼어드는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드(예, 효소 인식 서열) 또는 번역된 펩티드의 절단 위치를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코돈 서열에 대하여 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현을 위하여 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자 등이 있는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 폴리머라아제(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해서 폴리뉴클레오티드의 조작에 의해서 제조될 수 있다.

재조합 및 화학적 합성 기술 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 형질전환될 때, 컴피턴트(competent) 세포로 전이되었을 때, 발현될 수 있는 적합한 벡터에 삽입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 이용하여 증폭되거나, 적합한 숙주에서 발현될 수 있다(참조, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재된 바와 같이, 고체상(solid phase) 기술을 이용하여 합성될 수 있다.

V. 항원 제시 세포( antigen - presenting cells )( APCs )

또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제공하고 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 접촉 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드를 도입함으로써 획득되는 APC는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 백신으로서 투여되거나 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과의 조합으로 투여될 수 있다.

상기 APC는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 세포의 표면에 단백질 항원을 제시한다는 것이 알려져 있는 수지상 세포(DCs), 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. DC는 APC 가운데 강력한 CTL 유도 활성을 갖는 대표적인 APC이기 때문에, DC는 본 발명의 APC로서 용도를 발견한다.

예를 들어, APC는 말초 혈액 단핵구로부터 유래된 DC에 의해서 유도되고, 그리고 시험관 내, 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하여 획득될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 상기 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC는 개체의 체내에서 유도된다. 구문 "APC 유도"는 본 발명의 펩티드 또는 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 제시하는 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드, 및 세포 표면의 본 발명의 펩티드와 세포를 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드를 상기 APC에 도입하여, 상기 APC가 상기 펩티드를 지시할 수 있게 한 뒤, 상기 APC는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체 외(ex vivo) 투여는 하기의 단계를 포함한다:

a: 첫 번째 개체로부터 APC를 수집하기;

b: 단계 a의 APC와 펩티드를 접촉시키기; 및

c: 펩티드가 들어간 APC를 두 번째 개체에게 투여하기.

상기 첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 동일한 개체일 수 있으며, 또는 다른 개체일 수도 있다. 대안적으로, 본 발명에 따르면 항원 제시 세포를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 추가로, 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다. 나아가, 본 발명은 또한 항원 제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 상기 단계 (b)에서 획득한 APC는 백신으로서 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 APC는 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는다. "높은 수준의 CTL 유도성" 용어에 있어서, 높은 수준이란 펩티드와 접촉하지 않거나 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉한 APC에 의한 CTL 유도성 수준에 대한 상대적인 것이다. 이러한 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APC는 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 APC 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 도입을 위한 방법의 예는 동업계에서 일반적으로 수행되는 다양한 방법을 특정한 한계 없이 이용할 있으며, 리포펙타민(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 유전자를 APC에 전달시킴으로써, 상기 유전자는 상기 세포 내에서 전사, 번역 등을 거치며, 그리고 획득된 단백질은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 의해서 처리되고, 부분적인 펩티드를 제시하기 위하여, 제시 기작(presentation pathway)을 통해서 진행된다.

VI . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T cell )

본 발명의 어떠한 펩티드에 대해서 유도되는 세포독성 T 세포는 생체 내(in vivo)에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하며, 따라서 펩티드 그 자체와 유사한 유형으로 백신으로서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 어떠한 펩티드에 의해서 특이적으로 유도 또는 활성화되는 분리된 세포독성 T 세포를 또한 제공한다.

이러한 세포독성 T 세포는 (1) 개체에게 투여하기 또는 (2) 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 펩티드와 개체 유래된 APC 및 CD8-양성 세포 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 접촉하기(자극하기)에 의해서 획득될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 제시하는 APC로부터 자극됨으로써 유도되는 세포독성 T 세포는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래할 수 있으며, 그 자체로 투여되거나, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하는 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 획득된 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포 또는 예를 들어 유도에 사용된 동일한 펩티드에 대하여 특이적으로 행동한다. 상기 표적 세포는 내인적으로 MYBL2를 발현하는 세포이거나, 또는 상기 MYBL2 유전자가 형질감염된 세포일 수 있다; 그리고 상기 펩티드에 의해서 자극되어, 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포는 활성화된 CTL 공격의 표적으로서 역할을 할 수 있다.

VII . T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)의 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 서브유닛은 MYBL2를 제시하는 종양 세포에 대하여 T 세포의 특이성을 줄 수 있는 TCR을 형성하는 능력을 가진다. 당업계에서 알려진 방법을 이용하여, 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드를 이용하여 유도된 CTL의 TCR 서브유닛으로서, 알파(alpha-) 및 베타(beta-) 사슬이 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288(2003)). TCR의 유도체는 높은 결합활성을 갖는 MYBL2 펩티드를 나타내는 표적 세포와 결합할 수 있으며, 선택적으로 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 MYBL2 펩티드를 제시하는 표적 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 중재할 수 있다.

상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 핵산은 예를 들어 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)와 같은 적합한 벡터에 도입될 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려졌다. 상기 핵산 또는 이들을 포함하는 벡터는 유용하게 T 세포, 예를 들어 환자로부터 유래한 T 세포로 전이될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 T 세포)의 신속한 변형하여, 우수한 암 세포 사멸 특성을 갖는 변형된 T 세포를 신속하고 용이하게 생성하게 할 수 있는 규격화된 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HLA-A24의 문맥에서, 예를 들어, 서열번호 1, 2, 또는 13의 MYBL2 펩티드와 결합하는 TCR 서브유닛 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 이용한 형질도입에 의해서 제조되는 CTL을 제공한다. 상기 형질도입된 CTL은 생체 내의 암 세포로 귀소할 수 있으며, 공지된 시험관 내 배양 방법에 의해서 증대될 수 있다(예, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 T 세포는 치료 또는 보호가 필요한 환자의 암을 치료 또는 방지하는데 유용한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다(WO2006/031221).

방지 및 예방은 질병으로부터 사망 또는 질병률의 부담을 감소시킬 수 있는 어떠한 활동을 포함한다. 방지 및 예방은 "첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 수준"에서 발생할 수 있다. 첫 번째 방지 및 예방은 질병의 발달을 피할 수 있는 반면, 두 번째 및 세 번째 단계의 방지 및 예방은 기능 복구 및 질환 관련된 합병증을 감소시킴으로써, 이미 확립된 질병의 부정적인 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 질병 및 위급한 증상의 발달의 방지 및 예방에 목표를 둔다. 대안적으로, 방지 및 예방은 특정 질환의 심화를 경감시키는 것을 목적으로 하는 다양한 종류의 예방적 치료법을 포함한다, 예, 종양의 증식 및 전이를 감소시키기.

암의 치료 및/또는 예방, 또는 이의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암 재발의 억제 및 경감의 유도, 종양 감소 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 하기의 단계의 어느 것이든 포함한다. 효과적으로 암을 치료 및/또는 예방하는 것은 사망률을 감소시키며, 암을 가진 개인의 예후를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 지각할 수 있는 증상들을 감소시킨다. 예를 들어, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료를 구성하며, 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 이상의 감소 또는 안정적인 질환을 포함한다.

VIII . 약학적 제제 또는 조성물

MYBL2 발현은 정상 조직에 비해서 다수의 암에서 과발현되므로, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 대안적으로 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 APC와 같은 세포의 어느 하나의 표면에 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 어느 하나의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 활성 성분으로서 이용될 수 있다.

또한, 다른 실시예에서, 본 발명은 암 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하데 있어서, 하기 중 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(b) 본 명세서서 발현할 수 있는 형태로 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 암을 치료하는데 사용하기 위한 하기 중 선택되는 활성 성분을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 활성 성분으로서 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 상기 활성 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 암의 예방 및 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로서의 용도를 찾았다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 구문 "백신"(면역원성 조성물도 의미함)은 동물에 주사되어 항종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질을 일컫는다.

상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 암의 치료 및/또는 방지에 사용될 수 있으며, 및/또는 개체 또는 특히 인간 및 특히 산업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물인 마우스, 쥐, 기니아 피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비원숭이(baboon), 및 침팬지를 포함하는 동물에서 이의 수술 후 재발을 방지하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1, 2, 및 13 가운데 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 HLA-A24 제한적 에피토프 펩티드 또는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 후보자라는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 서열번호 1, 2 또는 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 어느 것을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A24인 개체에 투여되는 것이 더욱 적합하다. 동일한 것이 이러한 폴리펩티드의 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해서 치료되어야 하는 암은 MYBL2가 관련된, 예를 들어 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암을 포함하는 모든 종류의 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 추가로 상기 언급한 활성 성분, 암 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 암 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 있는 다른 펩티드는 암 특이적 항원에 의해서 예시화되나(예를 들어, 동정된 TAA), 이에 한정되지 않는다.

만약 필요하다면, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 물질이 예를 들어, 본 발명의 어느 펩티드와 같은 활성 성분의 항종양 효과를 제한하지 않는 한, 선택적으로 활성 성분으로서 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제형은 항염증성 약제 또는 조성물, 진통제, 화학요법제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체 내의 다른 치료학적 물질을 포함하는 것 이외에, 상기 본 발명의 약제는 또한 연속적 또는 동시에 하나 또는 다수의 다른 약학적 제제 또는 조성물과 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제의 양은 예를 들어 어떤 종류의 약학적 제제(들) 또는 조성물(들)이 사용되었는지, 치료되어야 할 질병, 및 투여 일정 및 방법 등에 따른다.

특히 본 명세서에 언급된 성분에 추가로, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되는 종류의 제형을 갖는 종래의 다른 제제 또는 조성물을 포함할 수 있다고 이해된다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 제조의 물품 및 예를 들어 암과 같은 치료될 질병의 병리학적인 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조의 물품은 라벨(label)을 갖는 본 발명의 어떠한 약학적 제제 또는 조성물의 용기(container)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플리스틸과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 위의 라벨은 상기 약제 또는 조성물이 하나 또는 다수 조건의 질병의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다는 것을 나타내야 한다. 또한, 상기 라벨은 투여를 위한 지시 등을 나타낼 수 있다.

상기 기재된 용기에 추가적으로 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용가능한 희석제가 들어 있는 두 번째 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 가능하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 또는 다수의 유닛 복용량 형태를 포함하는 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 제시될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 브리스터 팩(blister pack)과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시에 의해서 수반될 수 있다.

(1) 활성 성분으로서 상기 펩티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

본 발명의 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로, 만약 필요하다면, 보편적인 제형 방법에 의해서 제형화된 것으로 직접적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 추가로, 약물에 일반적으로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특정한 제한 없이 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 멸균수, 생리식염수, 인산완충액, 배포 배양액 등이 있다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요에 따라, 스태빌라이저(stabilizer), 현탁액(suspension), 보존제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 펩티드 둘 또는 이상으로 구성된 조합으로서 제조될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 칵테일(cocktail)의 형태를 취할 수 있으며, 또는 표진 기술을 이용하여 서로 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드는 화학적으로 연결되거나 또는 단일 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 상기 조합 내의 펩티드는 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 APC의 HLA 항원에 의하여 높은 농도에서 제시된 뒤, 상기 나타난 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 대안적으로 본 발명의 어느 하나의 펩티드를 그 세포 표면에 제시하는 APC는 상기 개체로부터 APC(예를 들어, DC)를 제거함으로써 획득되며, 이는 본 발명의 펩티드에 의해서 자극되며, CTL은 이러한 APC(예를 들어, DC)를 개체에 재투여함으로써 개체내에서 유도되며, 그 결과 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암과 같은 암 세포에 대한 공격성이 증가할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 방지를 위한 약학적 제제 또는 조성물은 세포의 면역력을 효과적으로 확립시킨다고 알려진 보조제를 포함할 수 있다, 대안적으로 상기 약학적 제제 또는 조성물은 다른 활성 성분과 함께 투여될 수 있다 또는 과립으로 제조되어 투여될 수 있다. 보조제는 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 일컫는다. 본 명세서에서 보조제는 하기의 문헌에 기재된 바를 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 보조제의 예는 인산 알루미늄(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 명반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

더욱이, 상기 펩티드가 미세한 마이크로미터 직경의 비드에 결합되어 있는 리포솜(liposome) 제형, 과립 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합되어 있는 제형이 일반적으로 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 개시하는(prime) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에서 CTL을 개시할 수 있는 제제 또는 조성물로서 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 엡실론(epsilon) -및 라이신 잔기의 알파-아미노 그룹에 붙을 수 있으며, 그 뒤 본 발명의 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 리피드 펩티드는 그 뒤, 리포솜에 결합되거나 또는 보조제에 유화되어 미셀(micelle) 또는 입자(particle)로 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응의 리피드 제조의 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질 단백질은 적절한 펩티드에 공유 결합되었을 때, CTL을 개시(prime)하는데 이용할 수 있다(예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 등, 및 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 예를 들어, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들어, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠에 한 번씩 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

(2) 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

또한, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 발현할 수 있는 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 구문 "발현할 수 있는 형태"는 상기 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되었을 때, 항종양 면역력을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 생체 내(in vivo)에서 발현하는 것을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소(regulatory element)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되기 위하여 구비될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 기술을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors를 참조). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 제 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720 참조한다. DNA 기반한 전달 기술의 예는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머(polymer), 펩티드-매개) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매게("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달(예를 들어, 미국 출원 제 5,922,687호 참조)을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스의 이용을 포함한다, 예, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 벡터. 숙주에 도입한 후, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로인하여 면역 반응이 유발된다. 면역화 프로토콜에 있어서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재된다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재된다. 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 다양한 다른 벡터, 예를 들어, 아데노(adeno) 및 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스, 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터, 무독화시킨 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등은 명백할 것이다. 예를 들어 Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85을 참조한다.

폴리뉴클레오티드의 환자에게로 전달하는 것은 상기 환자가 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 노출되는 직접적 또는 세포가 우선 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된 후, 상기 세포를 환자에게 이식하는 간접적으로 될 수 있다. 이러한 두 가지 방법은 각각 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료법으로서 알려져 있다.

유전자 치료의 방법을 위한 일반적인 리뷰는 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 또한 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야의 일반적으로 알려진 방법은 eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재된다.

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사할 수 있으며, 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여는 용도를 발견한다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 적합한 수용체 내 또는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 폴리뉴클레오티드의 양은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 예를 들어, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들어, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠에 한 번씩 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

IX . 펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTL 을 이용하는 방법

본 발명의 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 APC 및 CTL을 유도하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APC은 CTL을 유도하는데 이용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APC는 화합물이 이들의 CTL 유도성을 억제하지 않는 한, 다른 화합물과 조합으로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급한 약학적 제제의 어느 하나는 CTL을 유도하는데 이용될 수 있으며, 이에 추가적으로 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제는 또한 하기 기재된 APC를 유도하는데 이용될 수 있다.

(1) 항원 제시 세포(APC)를 유도하는 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 APC를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 APC의 유도는 "VI. 항원 제시 세포" 섹션에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 유도성은 또한 상기 "VI. 항원 제시 세포"의 항목하에 언급되었다.

(2) CTL을 유도하는 방법

더욱이, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 엑소솜 또는 상기 펩티드를 제시하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하였을 때, CTL은 개체의 체내에서 유도되며, 상기 종영 관련 내피를 표적으로 하는 면역 반응의 힘을 강화시킨다. 대안적으로, 상기 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 생체 외(ex vivo) 치료 방법으로 사용될 수 있으며, 이는 개체 유래 APC 및 CD8-양성 세포 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 접촉(자극)하고, CTL을 유도한 후, 상기 활성화된 CTL 세포는 개체로 돌아온다. 예를 들어, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a: 개체로부터 APC를 수집하기;

b: 단계 a의 APC와 펩티드를 접촉시키기;

c: 단계 b의 APC와 CD8+ T 세포를 혼합하고, CTL을 유도하기 위하여 공동 배양하기; 및

d: 단계 c의 공동 배양으로부터 CD8+ T 세포를 모으기.

대안적으로, 본 발명에 따르면 CTL을 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 추가로, 본 발명은 CTL을 유도하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 CTL을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.

단계 d에 의해서 획득되는 세포독성 활성을 갖는 CD8+ T 세포는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 또한, 상기 단계 c에서 CD8+ T 양성 세포와 혼합된 APC는 상기 "VI. 항원 제시 세포" 섹션에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APC에 전이시킴으로써 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 효과적으로 제시하는 모든 APC 또는 엑소솜은 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하고, 당업자가 이를 만들고, 이용하는 것을 도와주기 위하여 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어느 방법으로든 한정하려는 의도가 아니다.

실시예

재료 및 방법

세포주

A24 림포블라스토이드 세포주(A24 lymphoblastoid cell line, A24LCL) 세포는 엡스테인 바(Epstein-bar) 바이러스를 HLA-A24 양성 인간 B 림프구로 형질전환하여 확립되었다.

MYBL2 로부터 유래된 펩티드의 후보자 선택

HLA-A*2402에 결합하는 MYBL2로부터 유래된 9머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)를 이용하여 측정되었으며, 이 알고리듬은 Parker KC et al.에 의해서 기재되었다(J Immunol 1994, 152(1): 163-75) 및 Kuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)).

이러한 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따라 Sigma(Sapporo, Japan)에 의해서 합성되었으며, 역상 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatographym, HPLC)에 의해서 정제되었다. 상기 순도(>90%) 및 펩티드의 동정은 분석적인 HPLC에 및 질량분석법 분석을 각각 이용하여 확인하였다. 펩티드는 20 mg/㎖ 디메틸폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 뒤, -80℃에 보관되었다.

시험관 내( In vitro ) CTL 유도

단핵구 유래 수지상 세포(DCs)는 인간 백혈구 항원(HLA)에 지시된 펩티드에 대하여 세포독성 T림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여, 항원 지시 세포로서 이용되었다. DC는 하기 기재된 바와 같이, 시험관 내에서 생성되었다(Nakahara S et al., 암 Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). 구체적으로, 정상 지원자(HLA-A*2402 positive)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque)(Pharmacia) 용액에 의해서 분리된 말초단핵세포(PBMCs)는 단핵구 분획을 강화시키기 위하여, 플라스틱 조직 컬쳐 디쉬(Becton Dickinson)에 유착에 의해서 분리되었다. 상기 단핵구가 강화된 집단은 2% 열-비활성화 자가조직 유래의 세럼(자가 조직의 serum, AS)를 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 과립구-대식세포 colony-stimulating factor(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 1000 U/㎖ 및 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System) 1000 U/㎖의 존재하에 배양되었다. 배양 7일 후, 상기 사이토카인 유도된 DC는 37℃에서 3시간 동안 베타2-마이크로불린(beta2-microglobulin) 3 mcg/㎖의 존재하에 AIM-V 배지에서 20 mcg/㎖의 각각의 합성된 펩티드를 이용하여 펄스되었다. 상기 생성된 세포는 이러한 세포의 표면에 CD80, CD83, CD86, 및 HLA 클래스 II(결과는 보이지 않음)와 같은 DC 관련된 분자를 발현한다고 나타났다. 그리고 이러한 펩티드 펄스된 DC는 미토마이신 C(Mitomycin C, MMC)(30분 동안, 30 mcg/㎖)에 의해서 비활성화되었으며, CD8 양성 분리 키트(Dynal)를 이용한 양성 선택에 의해서 획득된 자가 조직의 CD8+ T 세포와 1:20의 비율 혼합되었다. 이러한 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에 셋팅되었다; 각각의 웰은 1.5 × 10⁴ 펩티 펄스 DC, 3 × 10⁵ CD8+ T 세포, 및 10 ng/㎖ IL-7(R&D System)이 있는 0.5 ㎖ AIM-V/2% AS 배지를 들어있다. 3일이 지난 후, 이러한 배양은 최종 농도가 20 IU/㎖이 되도록 IL-2(CHIRON)을 첨가하였다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포는 상기 자가 조직의 펩티드 펄스된 DC를 이용하여 더욱 자극되었다. 상기 DC는 상기 기재된 방법에 의해서 매번 제조되었다. CTL은 21일째 펩티드 자극 3회 이후, 펩티드 펄스된 A24LCL 세포에 대하여 실험하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 확대 과정

CTL은 Riddell et al.에 의해서 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여, 배양액에서 확대되었다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 전체 5 × 10⁴CTL은 항 CD3 단일클론 항체(Pharmingen) 40 ng/㎖의 존재하여, MMC에 의해서 비활성화된 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주를 이용하여, AIM-V/5% AS 배지 25 ㎖에서 현탁하였다. 상기 배양 시작 이후 첫 번째날, IL-2 120 IU/㎖이 상기 배양에 첨가되었다. 상기 배양은 5, 8 및 11일에, IL-2 30 IU/㎖을 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 공급한다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

특이적 CTL 활성

특이적 CTL 활성을 검사하기 위하여, 인터페론(IFN)-감마 효소-연결 면역스팟(ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소 결합 면역흡착검사(ELISA)를 수행하였다. 구체적으로, 펩티드 펄스 A24LCL(1 × 10⁴/웰)는 자극기(stimulator) 세포로서 제조되었다. 48 웰에서 배양된 세포는 반응기(responder) 세포로서 이용되었다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석은 제조업체의 과정에 따라 수행되었다.

결과

MYBL2 로부터 유래된 HLA -A24 결합 펩티드의 예측

표 1은 높은 결합 친화력의 순서로 MYBL2의 HLA-A*2402 결합 펩티드를 나타낸다. 표 1은 MYBL2로부터 유래된 9머(9mer) 및 10머(10mer) 펩티드를 나타낸다. 강력한 HLA-A24 결합 능력을 갖는 전체 20개의 펩티드가 선택되었으며, 에피토프 펩티드로 결정하기 위하여 검사되었다.

HLA -A*2402에 의해서 제한된 MYBL2로부텅 유래한 예측되는 펩티드에 의한 CTL 유도, 및 MYBL2 유래 펩티드를 이용하여 자극된 CTL 라인 확립

이러한 MYBL2로부터 유래된 펩티드를 위한 CTL은 "Materials and Methods"에 기재된 프로토콜에 따라 생성되었다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 분석(도 1 a ~ c)에 의해서 결정되었다. MYBL2-A24-9-100(서열번호 1), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13)은 대조군 웰에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타냄을 보였다. 더욱이, 서열번호 1을 이용하여 자극된 웰 넘버 #5의 세포, 서열번호 2를 이용하여 자극된 웰 넘버 #4의 세포, 및 서열번호 13 이용하여 자극된 웰 넘버 #1의 세포는 증식되고, CTL 라인을 확립시켰다. 이러한 CTL 라인의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 분석(도 2a ~ c)에 의해서 결정되었다. 모든 CTL 라인이 펩티드 펄스 하지 않은 표적 세포에 비하여, 이에 상응되는 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 산물을 나타냄을 보였다. 반면, 표 1의 펩티드들은 HLA-A*2402와 결합 활성을 가질 가능성이 있음에도 불구하고, 표 1에 나타난 다른 펩티드를 이용한 자극에 의해서는 CTL 라인이 확립되지 않았다. 예를 들어, MYBL2-A24-10-48(서열번호 12)를 이용하여 자극된 CTL 반응의 전형적인 네거티브 데이타(negative data)는 도 1d 및 도 2d에 나타났다. 상기, 본 명세서의 결과는 이러한 MYBL2로부터 유래된 펩티드가 강력한 CTL 라인을 유도하는 능력이 있다는 것을 알려준다.

항원 펩티드의 상동성 분석

MYBL2-A24-9-100(서열번호 1), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13)에 의해서 자극된 CTL은 현저하고, 특이적인 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 MYBL2-A24-9-100(서열번호 1), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13)의 서열이 인간 면역 체계를 민감하게 만든다고 알려진 다른 분자로부터 유래한 펩티드와 상동성을 갖고 있다는 사실 때문일 것이다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석은 이러한 펩티드 서열에 대하여 유의한 상동성을 가진 서열이 없다는 것을 밝힌 BLAST 알고리듬(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 쿼리(query)로써 이용하여 수행하였다. 이러한 상동성 분석의 결과는 MYBL2-A24-9-100(서열번호 1), MYBL2-A24-9-370(서열번호 2), 및 MYBL2-A24-10-197(서열번호 13)의 서열이 특이적이며, 따라서 본 출원인이 아는바, 이러한 분자들인 몇몇의 관련되지 않은 분자들에 대한 의도하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성이 거의 없다는 것을 의미한다.

결론적으로, 신규한 HLA-A24 MYBL2로부터 유래된 에피토프 펩티드가 동정되었으며, 암 면역 치료법으로서 활용될 수 있다는 것을 나타냈다.

산업상 이용가능성

본 발명은 신규한 TAA에 대해서 기술하고 있으며, 구체적으로 강력하고 특이적인 면역 반응에 의해서 유도되고, 다양한 암에 적용될 수 있는 MYBL2로부터 유래한 TAA에 대해서 기술하고 있다. 이러한 TAA는 MYBL2와 관련된 질환, 예를 들어 암이며, 보다 구체적으로 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포암, 소세포폐암, 및 식도암에 대한 펩티드 백신으로서 더욱 개발을 보장한다.

본 발명은 명세서에서 상세하고, 이의 특이적인 실시예를 참조로 기재되어 있으나, 앞서 기술한 설명은 본질적으로 예시 및 설명이며, 본 발명과 이의 바람직한 실시예를 예시하는 바로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통해, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있으며, 본 발명의 목적 및 한계는 첨부된 청구항에 의해서 정의된다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> MYBL2 EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> 10fpi-12-03 <150> 61/060,293 <151> 2008-06-10 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Lys Tyr Gly Thr Lys Gln Trp Thr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Glu Tyr Arg Leu Asp Gly His Thr Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Ser Phe Leu Asp Ser Cys Asn Ser Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Asn Phe Trp Asn Lys Gln Asp Thr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Lys Pro Leu Pro Gln Thr Pro His Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 6 Arg Trp Ala Glu Ile Ala Lys Met Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 7 Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 8 Gln Phe Gly Gln Gln Asp Trp Lys Phe 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 9 Glu Gln Glu Pro Ile Gly Thr Asp Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 10 Lys Tyr Gly Thr Lys Gln Trp Thr Leu Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 11 Leu Phe Met Gln Glu Lys Ala Arg Gln Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 12 Gln Phe Gly Gln Gln Asp Trp Lys Phe Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 13 Lys Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14 Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 15 Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 16 Ser Ala Glu Asp Ser Ile Asn Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 17 Arg Ile Ile Cys Glu Ala His Lys Val Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 18 Lys Gln Trp Thr Leu Ile Ala Lys His Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 19 Leu Leu Ile Pro Ala Val Gly Ser Ser Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 20 Lys Tyr Ser Met Asp Asn Thr Pro His Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 2731 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (216)..(2315) <400> 21 gcgcttggcg ggagatagaa aagtgcttca acccgcgccg gcggcgactg cagttcctgc 60 gagcgaggag cgcgggacct gctgacacgc tgacgccttc gagcgcggcc cggggcccgg 120 agcggccgga gcagcccggg tcctgacccc ggcccggctc ccgctccggg ctctgccggc 180 gggcgggcga gcgcggcgcg gtccgggccg ggggg atg tct cgg cgg acg 230 Met Ser Arg Arg Thr 1 5 cgc tgc gag gat ctg gat gag ctg cac tac cag gac aca gat tca gat 278 Arg Cys Glu Asp Leu Asp Glu Leu His Tyr Gln Asp Thr Asp Ser Asp 10 15 20 gtg ccg gag cag agg gat agc aag tgc aag gtc aaa tgg acc cat gag 326 Val Pro Glu Gln Arg Asp Ser Lys Cys Lys Val Lys Trp Thr His Glu 25 30 35 gag gac gag cag ctg agg gcc ctg gtg agg cag ttt gga cag cag gac 374 Glu Asp Glu Gln Leu Arg Ala Leu Val Arg Gln Phe Gly Gln Gln Asp 40 45 50 tgg aag ttc ctg gcc agc cac ttc cct aac cgc act gac cag caa tgc 422 Trp Lys Phe Leu Ala Ser His Phe Pro Asn Arg Thr Asp Gln Gln Cys 55 60 65 cag tac agg tgg ctg aga gtt ttg aat cca gac ctt gtc aag ggg cca 470 Gln Tyr Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp Leu Val Lys Gly Pro 70 75 80 85 tgg acc aaa gag gaa gac caa aaa gtc atc gag ctg gtt aag aag tat 518 Trp Thr Lys Glu Glu Asp Gln Lys Val Ile Glu Leu Val Lys Lys Tyr 90 95 100 ggc aca aag cag tgg aca ctg att gcc aag cac ctg aag ggc cgg ctg 566 Gly Thr Lys Gln Trp Thr Leu Ile Ala Lys His Leu Lys Gly Arg Leu 105 110 115 ggg aag cag tgc cgt gaa cgc tgg cac aac cac ctc aac cct gag gtg 614 Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Glu Val 120 125 130 aag aag tct tgc tgg acc gag gag gag gac cgc atc atc tgc gag gcc 662 Lys Lys Ser Cys Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg Ile Ile Cys Glu Ala 135 140 145 cac aag gtg ctg ggc aac cgc tgg gcc gag atc gcc aag atg ttg cca 710 His Lys Val Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu Ile Ala Lys Met Leu Pro 150 155 160 165 ggg agg aca gac aat gct gtg aag aat cac tgg aac tct acc atc aaa 758 Gly Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Ile Lys 170 175 180 agg aag gtg gac aca gga ggc ttc ttg agc gag tcc aaa gac tgc aag 806 Arg Lys Val Asp Thr Gly Gly Phe Leu Ser Glu Ser Lys Asp Cys Lys 185 190 195 ccc cca gtg tac ttg ctg ctg gag ctc gag gac aag gac ggc ctc cag 854 Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu Glu Asp Lys Asp Gly Leu Gln 200 205 210 agt gcc cag ccc acg gaa ggc cag gga agt ctt ctg acc aac tgg ccc 902 Ser Ala Gln Pro Thr Glu Gly Gln Gly Ser Leu Leu Thr Asn Trp Pro 215 220 225 tcc gtc cct cct acc ata aag gag gag gaa aac agt gag gag gaa ctt 950 Ser Val Pro Pro Thr Ile Lys Glu Glu Glu Asn Ser Glu Glu Glu Leu 230 235 240 245 gca gca gcc acc aca tcg aag gaa cag gag ccc atc ggt aca gat ctg 998 Ala Ala Ala Thr Thr Ser Lys Glu Gln Glu Pro Ile Gly Thr Asp Leu 250 255 260 gac gca gtg cga aca cca gag ccc ttg gag gaa ttc ccg aag cgt gag 1046 Asp Ala Val Arg Thr Pro Glu Pro Leu Glu Glu Phe Pro Lys Arg Glu 265 270 275 gac cag gaa ggc tcc cca cca gaa acg agc ctg cct tac aag tgg gtg 1094 Asp Gln Glu Gly Ser Pro Pro Glu Thr Ser Leu Pro Tyr Lys Trp Val 280 285 290 gtg gag gca gct aac ctc ctc atc ccc gct gtg ggt tct agc ctc tct 1142 Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu Ile Pro Ala Val Gly Ser Ser Leu Ser 295 300 305 gaa gcc ctg gac ttg atc gag tcg gac cct gat gct tgg tgt gac ctg 1190 Glu Ala Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asp Pro Asp Ala Trp Cys Asp Leu 310 315 320 325 agt aaa ttt gac ctc cct gag gaa cca tct gca gag gac agt atc aac 1238 Ser Lys Phe Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ser Ala Glu Asp Ser Ile Asn 330 335 340 aac agc cta gtg cag ctg caa gcg tca cat cag cag caa gtc ctg cca 1286 Asn Ser Leu Val Gln Leu Gln Ala Ser His Gln Gln Gln Val Leu Pro 345 350 355 ccc cgc cag cct tcc gcc ctg gtg ccc agt gtg acc gag tac cgc ctg 1334 Pro Arg Gln Pro Ser Ala Leu Val Pro Ser Val Thr Glu Tyr Arg Leu 360 365 370 gat ggc cac acc atc tca gac ctg agc cgg agc agc cgg ggc gag ctg 1382 Asp Gly His Thr Ile Ser Asp Leu Ser Arg Ser Ser Arg Gly Glu Leu 375 380 385 atc ccc atc tcc ccc agc act gaa gtc ggg ggc tct ggc att ggc aca 1430 Ile Pro Ile Ser Pro Ser Thr Glu Val Gly Gly Ser Gly Ile Gly Thr 390 395 400 405 ccg ccc tct gtg ctc aag cgg cag agg aag agg cgt gtg gct ctg tcc 1478 Pro Pro Ser Val Leu Lys Arg Gln Arg Lys Arg Arg Val Ala Leu Ser 410 415 420 cct gtc act gag aat agc acc agt ctg tcc ttc ctg gat tcc tgt aac 1526 Pro Val Thr Glu Asn Ser Thr Ser Leu Ser Phe Leu Asp Ser Cys Asn 425 430 435 agc ctc acg ccc aag agc aca cct gtt aag acc ctg ccc ttc tcg ccc 1574 Ser Leu Thr Pro Lys Ser Thr Pro Val Lys Thr Leu Pro Phe Ser Pro 440 445 450 tcc cag ttt ctg aac ttc tgg aac aaa cag gac aca ttg gag ctg gag 1622 Ser Gln Phe Leu Asn Phe Trp Asn Lys Gln Asp Thr Leu Glu Leu Glu 455 460 465 agc ccc tcg ctg aca tcc acc cca gtg tgc agc cag aag gtg gtg gtc 1670 Ser Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Val Cys Ser Gln Lys Val Val Val 470 475 480 485 acc aca cca ctg cac cgg gac aag aca ccc ctg cac cag aaa cat gct 1718 Thr Thr Pro Leu His Arg Asp Lys Thr Pro Leu His Gln Lys His Ala 490 495 500 gcg ttt gta acc cca gat cag aag tac tcc atg gac aac act ccc cac 1766 Ala Phe Val Thr Pro Asp Gln Lys Tyr Ser Met Asp Asn Thr Pro His 505 510 515 acg cca acc ccg ttc aag aac gcc ctg gag aag tac gga ccc ctg aag 1814 Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala Leu Glu Lys Tyr Gly Pro Leu Lys 520 525 530 ccc ctg cca cag acc ccg cac ctg gag gag gac ttg aag gag gtg ctg 1862 Pro Leu Pro Gln Thr Pro His Leu Glu Glu Asp Leu Lys Glu Val Leu 535 540 545 cgt tct gag gct ggc atc gaa ctc atc atc gag gac gac atc agg ccc 1910 Arg Ser Glu Ala Gly Ile Glu Leu Ile Ile Glu Asp Asp Ile Arg Pro 550 555 560 565 gag aag cag aag agg aag cct ggg ctg cgg cgg agc ccc atc aag aaa 1958 Glu Lys Gln Lys Arg Lys Pro Gly Leu Arg Arg Ser Pro Ile Lys Lys 570 575 580 gtc cgg aag tct ctg gct ctt gac att gtg gat gag gat gtg aag ctg 2006 Val Arg Lys Ser Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Glu Asp Val Lys Leu 585 590 595 atg atg tcc aca ctg ccc aag tct cta tcc ttg ccg aca act gcc cct 2054 Met Met Ser Thr Leu Pro Lys Ser Leu Ser Leu Pro Thr Thr Ala Pro 600 605 610 tca aac tct tcc agc ctc acc ctg tca ggt atc aaa gaa gac aac agc 2102 Ser Asn Ser Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Ile Lys Glu Asp Asn Ser 615 620 625 ttg ctc aac cag ggc ttc ttg cag gcc aag ccc gag aag gca gca gtg 2150 Leu Leu Asn Gln Gly Phe Leu Gln Ala Lys Pro Glu Lys Ala Ala Val 630 635 640 645 gcc cag aag ccc cga agc cac ttc acg aca cct gcc cct atg tcc agt 2198 Ala Gln Lys Pro Arg Ser His Phe Thr Thr Pro Ala Pro Met Ser Ser 650 655 660 gcc tgg aag acg gtg gcc tgc ggg ggg acc agg gac cag ctt ttc atg 2246 Ala Trp Lys Thr Val Ala Cys Gly Gly Thr Arg Asp Gln Leu Phe Met 665 670 675 cag gag aaa gcc cgg cag ctc ctg ggc cgc ctg aag ccc agc cac aca 2294 Gln Glu Lys Ala Arg Gln Leu Leu Gly Arg Leu Lys Pro Ser His Thr 680 685 690 tct cgg acc ctc atc ttg tcc tgagg tgttgagggt gtcacgagcc 2340 Ser Arg Thr Leu Ile Leu Ser 695 700 cattctcatg tttacagggg ttgtgggggc agagggggtc tgtgaatctg agagtcattc 2400 aggtgacctc ctgcagggag ccttctgcca ccagcccctc cccagactct caggtggagg 2460 caacagggcc atgtgctgcc ctgttgccga gcccagctgt gggcggctcc tggtgctaac 2520 aacaaagttc cacttccagg tctgcctggt tccctcccca aggccacagg gagctccgtc 2580 agcttctccc aagcccacgt caggcctggc ctcatctcag accctgctta ggatggggga 2640 tgtggccagg ggtgctcctg tgctcaccct ctcttggtgc atttttttgg aagaataaaa 2700 ttgcctctct cttaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2731 <210> 22 <211> 700 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Ser Arg Arg Thr Arg Cys Glu Asp Leu Asp Glu Leu His Tyr Gln 1 5 10 15 Asp Thr Asp Ser Asp Val Pro Glu Gln Arg Asp Ser Lys Cys Lys Val 20 25 30 Lys Trp Thr His Glu Glu Asp Glu Gln Leu Arg Ala Leu Val Arg Gln 35 40 45 Phe Gly Gln Gln Asp Trp Lys Phe Leu Ala Ser His Phe Pro Asn Arg 50 55 60 Thr Asp Gln Gln Cys Gln Tyr Arg Trp Leu Arg Val Leu Asn Pro Asp 65 70 75 80 Leu Val Lys Gly Pro Trp Thr Lys Glu Glu Asp Gln Lys Val Ile Glu 85 90 95 Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Lys Gln Trp Thr Leu Ile Ala Lys His 100 105 110 Leu Lys Gly Arg Leu Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His 115 120 125 Leu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ser Cys Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg 130 135 140 Ile Ile Cys Glu Ala His Lys Val Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu Ile 145 150 155 160 Ala Lys Met Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp 165 170 175 Asn Ser Thr Ile Lys Arg Lys Val Asp Thr Gly Gly Phe Leu Ser Glu 180 185 190 Ser Lys Asp Cys Lys Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu Glu Asp 195 200 205 Lys Asp Gly Leu Gln Ser Ala Gln Pro Thr Glu Gly Gln Gly Ser Leu 210 215 220 Leu Thr Asn Trp Pro Ser Val Pro Pro Thr Ile Lys Glu Glu Glu Asn 225 230 235 240 Ser Glu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ser Lys Glu Gln Glu Pro 245 250 255 Ile Gly Thr Asp Leu Asp Ala Val Arg Thr Pro Glu Pro Leu Glu Glu 260 265 270 Phe Pro Lys Arg Glu Asp Gln Glu Gly Ser Pro Pro Glu Thr Ser Leu 275 280 285 Pro Tyr Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu Ile Pro Ala Val 290 295 300 Gly Ser Ser Leu Ser Glu Ala Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asp Pro Asp 305 310 315 320 Ala Trp Cys Asp Leu Ser Lys Phe Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ser Ala 325 330 335 Glu Asp Ser Ile Asn Asn Ser Leu Val Gln Leu Gln Ala Ser His Gln 340 345 350 Gln Gln Val Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ser Ala Leu Val Pro Ser Val 355 360 365 Thr Glu Tyr Arg Leu Asp Gly His Thr Ile Ser Asp Leu Ser Arg Ser 370 375 380 Ser Arg Gly Glu Leu Ile Pro Ile Ser Pro Ser Thr Glu Val Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Ile Gly Thr Pro Pro Ser Val Leu Lys Arg Gln Arg Lys Arg 405 410 415 Arg Val Ala Leu Ser Pro Val Thr Glu Asn Ser Thr Ser Leu Ser Phe 420 425 430 Leu Asp Ser Cys Asn Ser Leu Thr Pro Lys Ser Thr Pro Val Lys Thr 435 440 445 Leu Pro Phe Ser Pro Ser Gln Phe Leu Asn Phe Trp Asn Lys Gln Asp 450 455 460 Thr Leu Glu Leu Glu Ser Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Val Cys Ser 465 470 475 480 Gln Lys Val Val Val Thr Thr Pro Leu His Arg Asp Lys Thr Pro Leu 485 490 495 His Gln Lys His Ala Ala Phe Val Thr Pro Asp Gln Lys Tyr Ser Met 500 505 510 Asp Asn Thr Pro His Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala Leu Glu Lys 515 520 525 Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Leu Pro Gln Thr Pro His Leu Glu Glu Asp 530 535 540 Leu Lys Glu Val Leu Arg Ser Glu Ala Gly Ile Glu Leu Ile Ile Glu 545 550 555 560 Asp Asp Ile Arg Pro Glu Lys Gln Lys Arg Lys Pro Gly Leu Arg Arg 565 570 575 Ser Pro Ile Lys Lys Val Arg Lys Ser Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp 580 585 590 Glu Asp Val Lys Leu Met Met Ser Thr Leu Pro Lys Ser Leu Ser Leu 595 600 605 Pro Thr Thr Ala Pro Ser Asn Ser Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Ile 610 615 620 Lys Glu Asp Asn Ser Leu Leu Asn Gln Gly Phe Leu Gln Ala Lys Pro 625 630 635 640 Glu Lys Ala Ala Val Ala Gln Lys Pro Arg Ser His Phe Thr Thr Pro 645 650 655 Ala Pro Met Ser Ser Ala Trp Lys Thr Val Ala Cys Gly Gly Thr Arg 660 665 670 Asp Gln Leu Phe Met Gln Glu Lys Ala Arg Gln Leu Leu Gly Arg Leu 675 680 685 Lys Pro Ser His Thr Ser Arg Thr Leu 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Lys Pro Pro Val Tyr Leu Leu Leu Glu Leu Glu Asp 195 200 205 Lys Asp Gly Leu Gln Ser Ala Gln Pro Thr Glu Gly Gln Gly Ser Leu 210 215 220 Leu Thr Asn Trp Pro Ser Val Pro Pro Thr Ile Lys Glu Glu Glu Asn 225 230 235 240 Ser Glu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ser Lys Glu Gln Glu Pro 245 250 255 Ile Gly Thr Asp Leu Asp Ala Val Arg Thr Pro Glu Pro Leu Glu Glu 260 265 270 Phe Pro Lys Arg Glu Asp Gln Glu Gly Ser Pro Pro Glu Thr Ser Leu 275 280 285 Pro Tyr Lys Trp Val Val Glu Ala Ala Asn Leu Leu Ile Pro Ala Val 290 295 300 Gly Ser Ser Leu Ser Glu Ala Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asp Pro Asp 305 310 315 320 Ala Trp Cys Asp Leu Ser Lys Phe Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ser Ala 325 330 335 Glu Asp Ser Ile Asn Asn Ser Leu Val Gln Leu Gln Ala Ser His Gln 340 345 350 Gln Gln Val Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ser Ala Leu Val Pro Ser Val 355 360 365 Thr Glu Tyr Arg Leu Asp Gly His Thr Ile Ser Asp Leu Ser Arg Ser 370 375 380 Ser Arg Gly Glu Leu Ile Pro Ile Ser Pro Ser Thr Glu Val Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Ile Gly Thr Pro Pro Ser Val Leu Lys Arg Gln Arg Lys Arg 405 410 415 Arg Val Ala Leu Ser Pro Val Thr Glu Asn Ser Thr Ser Leu Ser Phe 420 425 430 Leu Asp Ser Cys Asn Ser Leu Thr Pro Lys Ser Thr Pro Val Lys Thr 435 440 445 Leu Pro Phe Ser Pro Ser Gln Phe Leu Asn Phe Trp Asn Lys Gln Asp 450 455 460 Thr Leu Glu Leu Glu Ser Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Val Cys Ser 465 470 475 480 Gln Lys Val Val Val Thr Thr Pro Leu His Arg Asp Lys Thr Pro Leu 485 490 495 His Gln Lys His Ala Ala Phe Val Thr Pro Asp Gln Lys Tyr Ser Met 500 505 510 Asp Asn Thr Pro His Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala Leu Glu Lys 515 520 525 Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Leu Pro Gln Thr Pro His Leu Glu Glu Asp 530 535 540 Leu Lys Glu Val Leu Arg Ser Glu Ala Gly Ile Glu Leu Ile Ile Glu 545 550 555 560 Asp Asp Ile Arg Pro Glu Lys Gln Lys Arg Lys Pro Gly Leu Arg Arg 565 570 575 Ser Pro Ile Lys Lys Val Arg Lys Ser Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp 580 585 590 Glu Asp Val Lys Leu Met Met Ser Thr Leu Pro Lys Ser Leu Ser Leu 595 600 605 Pro Thr Thr Ala Pro Ser Asn Ser Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Ile 610 615 620 Lys Glu Asp Asn Ser Leu Leu Asn Gln Gly Phe Leu Gln Ala Lys Pro 625 630 635 640 Glu Lys Ala Ala Val Ala Gln Lys Pro Arg Ser His Phe Thr Thr Pro 645 650 655 Ala Pro Met Ser Ser Ala Trp Lys Thr Val Ala Cys Gly Gly Thr Arg 660 665 670 Asp Gln Leu Phe Met Gln Glu Lys Ala Arg Gln Leu Leu Gly Arg Leu 675 680 685 Lys Pro Ser His Thr Ser Arg Thr Leu Ile Leu Ser 690 695 700

Claims

서열번호 22의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포독성 T 세포 유도성을 갖는 분리된 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide).
서열번호 1, 2, 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide).
하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포독성 T림프구(CTL) 유도성을 갖는 펩티드:
(a) 서열번호 1, 2, 및 13; 및
(b) 서열번호 1, 2, 및 13에서 1, 2, 또는 다수의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 또는 첨가되는 아미노산.
하기 특성 중 하나 또는 두 개를 갖는 제 3항의 펩티드:
(a) 서열번호 1, 2 또는 13의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이거나 또는 상기 아미노산으로 변형된 것이다, 및
(b) 서열번호 1, 2 또는 13의 아미노산 서열의 C 말단 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이거나 또는 상기 아미노산으로 변형된 것이다.
하기로 구성된 군으로부터 선택되는 목적을 위해서 제형화 된, 제 1항 내지 제 4항의 하나 또는 다수의 펩티드, 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 약학적으로 하용가능한 담체와 조합으로 포함하는 약학적 조성물:
(i) 종양의 치료,
(ii) 종양의 예방,
(iii) 종양의 수술 후 재발 방지, 및
(iv) 이의 조합.
HLA 항원이 HLA-A24인 개체에 투여되기 위해서 제형화 된 제 5항의 약학적 조성물.
암의 치료를 위해서 제형화 된, 제 6항의 약학적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은 백신(vaccine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 이용하여 높은 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포를 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 이용하여 CTL을 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 항원 제시 세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 10항의 높은 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포를 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 세포독성 T 세포.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 이용하여 유도되는, 분리된 세포독성 T 세포.
HLA 항원 및 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는, 분리된 항원 제시 세포.
제 14항에 있어서, 상기 세포는 제 9항 또는 제 12항의 방법에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell).
제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.