KR101705150B1 - Ｒａｂ６ｋｉｆｌ／ｋｉｆ２０ａ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 올리고펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 개체의 암의 치료 및 예방을 위해 제제화된 서열번호 3, 4 및 5로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 약학적 조성물를 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 올리고펩티드 및 약학적 물질(agent)를 이용해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ／ＫＩＦ２０Ａ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신{RAB6KIFL/KIF20A EPITOPE PEPTIDE AND VACCINES CONTAINING THE SAME}
우선권
본 발명은 그 전체의 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는, 2008년 10월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/197,106호에 기반한다.
기술분야
본 발명은 생명과학 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 새로운 올리고펩티드와 그 사용법에 관한 것이다.
CD8 양성 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)는 주조직 접합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 클래스 I 분자에서 발견되는 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)으로부터 유래된 에피토프(epitope) 펩티드를 인식한 후, 상기 종양 세포를 사멸시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 첫 번째 예로서, 멜라노마 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리가 발견된 후, 주로 면역학적인 접근을 통해 많은 다른 TAA가 발견되었다(비특허문헌 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; 비특허문헌 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 몇몇의 이러한 TAA들은 현재 면역치료 타겟으로서, 임상 개발이 진행중이다.
강력하고, 특이적인 항종양 면역 작용을 유도할 수 있는 신규한 TAA의 동정은 다양한 암 종류를 위한 펩티드 백신 전략의 임상 활용 및 개발을 추가로 보장한다(비특허문헌 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; 비특허문헌 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; 비특허문헌 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; 비특허문헌 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; 비특허문헌 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; 비특허문헌 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; 비특허문헌 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; 비특허문헌 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양 관련 항원 유래 펩티드를 이용한 임상 시험에 관한 다수의 보고가 있었다. 불행히도, 매우 낮은 객관적 반응률이 현재까지 이러한 암 백신 시험에서 관찰되었다(비특허문헌 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; 비특허문헌 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; 비특허문헌 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
최근, HLA class I-결합 펩티드 서열은 알고리즘(algorithms)으로 사용되기 기대되고 있다(NPL 14: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-confirmed190, NPL 15: J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175, NPL 16: protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846). 하지만 기대되는 에피트프 펩티드가 자연적으로 타겟 세포에서 진행되고(processed) HLA 분자와 타겟세포 표면에서 발현될 수 있다고 말하기는 어렵다. 게다가, 예를 들어 BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)(비특허문헌 17: Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75.; NPL 18: Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81.))와 같은 알고리즘은 HLA 분자 결합 펩티드를 제시(suggesst)할 수 있지만, 제시된 펩티드는 정밀하지는 않다(NPL 19: Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6.). 따라서, TAA 스크리닝은 아직 많은 도전과 어려움을 가지고 있다.
췌장암은 빈약한 예후(poor diagnosis)를 가지고 있고, 약 5%(1)의 전반적인 5년의 생존율을 가지고 있다. 수술에 의한 절제가 장기적 생존의 유일한 선택으로 남아있지만, 절제할 수 있는 췌장암을 가진 환자는 소수에 불과하다(9-22%)(NPL 19: Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6.). 하지만, 치유력이 있다는 의지를 가지고 수술을 함에도 불구하고 이러한 환자들 중에서도 5년의 생존율은 대략 20%로 남아있다(NPL 23: Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103., NPL 24: Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31.). 80%가 넘는 환자들이 국부적으로 진행되거나 또는 전이성이 있는 질병을 가지고 있고, 그들의 중간 생존율은 6 내지 9 개월이다(NPL 25: Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54.). 따라서, 새로운 치료상의 양상(therapeutic modalities)는 중요한 문제이며, 면역 요법은 췌장암의 잠정적 치료법일 수 있다.
RAB6KIFL(KIF20A)는 Rab6 small GTPas와의 직접적인 상호 작용을 통해 골지 체(Golgi apparatus)의 다이나믹스(dynamic)에서 역할을 한다고 처음 규정되었다(NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5.). RAB6KIFL은 모토 단백질의 키네신 수퍼패밀리(superfamily)에 속하며, 분자와 세포기관의 교통정리(trafficking)에 중요한 역할을 한다(NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5., NPL 27: Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73., NPL 28: Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82.). 최근, Taniuchi K et al.에 의하면 RAB6KIFL은 췌장암 세포에서 과발현된다고 보고했다(NPL 29: Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12.). 여기에서는 RAB6KIFL이 췌장암 발암에 중요한 역할에 대한 증거를 발견했다.
23,040개의 유전자를 포함하는 게놈-와이드 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로필 분석을 통해, RAB6KIFL(KIF20A)는 최근 방광암(특허문헌 1: WO2006/085684), 소세포폐암(SCLC)(특허문헌 2: WO2007/013665), 호르몬-난치의 전립선 암(HRPC) (특허문헌 3: WO2008/102906)과 같은 몇몇 암에서 상향-조절됨이 보여졌고, 이는 아래 문서들에 인용되었다. 게다가, KIF20A 유전자 산물의 몇몇 에피토프 펩티드들 또한 규명되었다(PTL 4: WO2008/102557).
[인용문헌]
[특허문헌]
[특허문헌 1] WO2006/085684
[특허문헌 2] WO2007/013665
[특허문헌 3] WO2008/102906
[특허문헌 4] WO2008/102557
[ 비특허문헌 ]
[비특허문헌 1]: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
[비특허문헌 2]: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
[비특허문헌 3]: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
[비특허문헌 4]: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
[비특허문헌 5]: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
[비특허문헌 6]: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
[비특허문헌 7]: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
[비특허문헌 8]: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
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발명의 요약
본 발명은 부분적으로 면역 치료법의 새로운 표적의 발견을 기초로 한다. TAAs가 면역원성이 없기 때문에, 적절한 표적을 발견하는 것은 매우 중요하다. 특히, 이 발명은 진뱅크(Genebank) 등록번호 AF153329와 CR598555에 암호화되어 있고 NM_005733(서열번호: 1)에 명시되어 있는 RAB6KIFL(서열번호: 2)를 표적으로 하는데, 왜냐하면 RAB6KIFL이 방광암, 유방암, 담관 세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암(NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암 (SCLC)과 같은 몇몇 암에 상향조절된 것으로 밝혀졌기 때문이다. 이 발명은 에피토프 펩티드를 함유한 RAB6KIFL 유전자 산물을 제공하는데, 에피트포 펩티드는 상응하는 분자에 놀랍게도 특정적으로 강한 CTL 반응을 보인다. 본 발명의 펩티드를 사용해서 건강한 기증자에게서 얻어진 말초혈 단핵세포(PBMCs)를 자극시켰다. 또한, 본 발명은 각각의 펩티드에서 반응하는 HLA-A2 (A*0201) 양성 표적 세포를 특별히 인식하는 확립된 CTLs와 암에서 활성화되는 RAB6KIFL에 대항하여 강하고 특정한 면역 반응으로 유발하는 HLA-A2 (A*0210) 제한 에피토프 펩티드를 제공한다. 상기 결과들은 RAB6KIFL이 강한 면역성을 가지고 있으며, 그에 따른 에피토프가 암 면역제 치료법에 효율적인 표적임을 알려준다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호: 3, 4 및 5 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열뿐만 아니라 CTL 유도성을 갖는 올리고펩티드를 제공하는 것이다. 또한, 이 발명의 다른 실시예에서는, 변형된 올리고펩티드가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산들이 치환되거나, 삭제되거나, 삽입되거나 부가될 수 있다.
상기 올리고펩티드가 실험표적에 주입되었을 때, 올리고펩티드는 항체 발현 세포의 표면에 나타나고, 그리고 CTLs을 표적으로 하는 각각의 펩티드를 유도한다. 따라서, 본 발명의 목적은 항체가 존재하는 세포를 유도하는 방법뿐만 아니라, 항체 발현 세포와 이 펩티드의 어느 것 중에 존재하는 엑소솜(exosome)을 제공하는 것이다.
항암 면역 반응은 RAB6KIFL 올리고펩티드에 존재하는 엑소솜과 항체가 존재하는 세포뿐만 아니라, 본 발명의 RAB6KIFL 올리고펩티드 또는 올리고펩티드가 암호화된 폴리뉴클레오티드를 주입함으로써도 유도될 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 목적은 그 구성요소로써 엑소솜과 항원이 존재하는 세포뿐만 아니라 올리고펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 약제 또는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 약학적 약제 또는 약학적 조성물은 백신으로서 사용됨을 발견하였다.
또한, 본 발명은 RAB6KIFL 올리고펩티드, RAB6KIFL 올리고펩티드가 암호화된 폴리뉴클레티드, 엑소솜 또는 RAB6KIFL 올리고펩티드에 존재하는 항체가 존재하는 세포들 또는 본 발명의 약학적 약제를 주입하는 단계를 포함하는 CTLs를 유발하는 방법, 항암 면역을 유발하는 방법뿐만 아니라 암(종양)의 치료 그리고/또는 처치(즉, 예방), 그리고/또는 그에 따른 수술 후의 재발의 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 CTLs는 암에 대항하여 백신으로 사용을 확인하였다.
표적이 되는 암의 예는 방광암, 유방암, 담관 세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암(NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
이하 본 발명의 요약과 상세한 설명은 예시화된 실시예이고, 본 발명 또는 발명의 다른 실시예를 제한하지 않는다.
본 발명의 당업자들에게 다양한 면과 적용들은 이하 도면의 간단한 설명과 발명의 상세한 설명, 그리고 실시예를 고려하면 명백해 진다:
[도 1] 도 1은 cDNA 마이크로어레이 분석에 기초한 췌장암 세포에서의 RAB6KIFL mRNA의 두드러지고 빈번한 증가된 발현을 나타낸다. A는 췌장암 세포에서의 상향 조절된 유전자 리스트를 나타낸다. 이 유전자들은 정상 세포에 비해 암세포에서 과발현되었다. 췌장암세포에서의 RAB6KIFL mRNA의 발현은 6명의 췌장암 환자 모두에게서 현격하게 증가되었다. B는 cDNA 마이크로어레이 분석에 기초한 정상세포에서의 RAB6KIFL 유전자의 상대적인 발현율을 나타낸다. RAB6KIFL 유전자는 단지 정소(testis)과 흉선(thymus)에서만 희미하게 발현되었다. C는 이전의 cDNA 마이크로어레이 분석을 기초로 RAB6KIFL 유전자가 췌장암뿐만 아니라 많은 폐나 방광암에서도 발현이 증가하는 것을 나타낸다.
[도 2] 도 2는 인간의 정상세포, 암세포주 그리고 암 조직에 발현된 RAB6KIFL mRNA의 분석을 나타낸다. A는 AB6KIFL mRNA의 발현은 RT-PCR 분석을 통하여 다양한 정상조직에서 조사하였다. RAB6KIFL은 정소(testis)에서만 희미하게 발현되는 것을 나타낸다. B는 다양한 암세포주에서의 RAB6KIFL 발현의 RT-PCR 분석을 나타낸다. C는 췌장암 조직(T)과 정상조직(N)에서의 RAB6KIFL 발현의 RT-PCR 분석을 나타낸다. RAB6KIFL 유전자의 발현은 8개의 췌장암 조직 중 5개에서 감지되었다. 이와는 대조적으로, 정상 조직에서는 거의 발현되지 않았다.
[도 3] 도 3은 웨스턴 블롯 분석을 통해 감지된 RAB6KIFL 단백질의 췌장암-특이적 과발현을 나타낸다. A는 RAB6KIFL 단백질이 8개의 정상 조직에서는 발견되지 않았지만, 정소(testis)에서는 PANC1 세포 용해물에서 감지된 것과 유사한 움직임을 갖는 희미한 밴드가 나타난 것을 나타낸다. B는 두 명의 췌장암 환자에게서, RAB6KIFL 단백질이 암조직(T)에서는 발견되었지만, 그 주변의 정상조직(N)에서는 발견되지 않았다는 것을 나타낸다. 항 베타 액틴 블로팅(anti-beta-actin blotting)도 동등한 단백질 로딩(loading)을 모니터하기 위해 실행되었다.
[도 4] 도 4는 췌장암(A)과 다양한 정상조직(B)에서의 RAB6KIFL 단백질의 면역 조직 화학적 분석(immunohistochemical analyes)을 보여준다. 세포질(cytoplasm)과 9개의 케이스 중 6개의 암세포 핵들에서 주로 RAB6KIFL의 강한 염색이 관찰되는 반면, 그들의 인접한 정상 췌장 조직의 선방 세포(aciner cell)와 정상 선관 상피(ductal epithelium)에서는 매우 약한 염색이 관찰됐다. 유사한 강한 염색이 복막의 병소(metastatic foci)에서 관찰됐다. 암이 형성된 췌장염에서는 염색이 거의 발견되지 않았다. B는 RAB6KIFL이 정상 뇌, 폐, 간, 신장, 위, 소장, 결장, 비장, 골격근, 피부, 그리고 흉선에서 염색이 되지 않음을 나타낸다. 정소(testis)에서는 희미한(possible faint) 염색이 관찰되었다. 갈색에서는 양성의 염색 신호가 보여졌다. 스케일 바는 100마이크로미터를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 HLA-A2.1(HHD) Tgm을 이용해서 인간 RAB6KIFL의 HLA-A2-제한된 마우스 CTL 에피토프의 식별(identification)을 보여준다. A는 HLA-A2.1(HHD) Tgm이 7일과 14일에 체내에서 36개의 후보 펩티드들 중 선택된 3가지 종류의 펩티드들의 12가지 셋트의 홉합물과 펄스된 5 x 105 공통 유전자의 BM-DCs와 면역되었다는 것을 보여준다. 21일 날, 면역된 마우스에서부터 분리된 CD4-비장 세포들은 6일 동안 각 펩티드와 펄스된 BM-DCs에 자극되었다. CTL-생산하는 IFN-감마는 ELISPOT 분석에 의해 감지되었다. RAB6KIFL-A2-9-12(서열번호: 3), RAB6KIFL-A2-9-809(서열번호: 4), 및 RAB6KIFL-A2-10-284(서열번호: 5) 펩티드들은 펩티드에 반응하는 CTLs를 유도한다고 보여졌다. 이러한 분석들은 비슷한 결과로 두 번 행하였다. B는 RAB6KIFL-A2-9-809 펩티드에 면역된 HLA-A2(HHD) Tgm의 조직 표본의 항-CD4 또는 항-CD8 mAb와의 면역 조직 화학의 염색을 나타낸다. 두 번의 백신화 후, 이 표본들은 절개한 후, 분석하였다.
[도 6a-b] 도 6은 HLA-A2에 양성인 건강한 기증자의 PBMCs로부터 RAB6KIFL-특정의 인간 CTL의 유도를 나타낸다. a는 RAB6KIFL 펩티드-반응의 CTLs가 HLA-A2 양성의 건강한 기증자의 PBMCs로부터 생성된다는 것을 나타낸다. RAB6KIFL-A2-9-12(서열번호: 3), RAB6KIFL-A2-9-809(서열번호: 4), 및 RAB6KIFL-A2-10-284(서열번호: 5) 펩티드와 펄스된 자가조직의 단핵구-유래의 DCs와의 세 번의 자극 후에, 각 펩티드 또는 펩티드에 펄스되지 않은 T2 세포인 T2 세포(HLA-A2+, TAP 결핍)에 대항한 CTLs의 세포독성이 표준 51Cr 방출 분석(release assay)에 의해 감지하였다. 이 CTLs는 RAB6KIFL-A2-9-12(왼쪽), RAB6KIFL-A2-9-809(중간), 및 RAB6KIFL-A2-10-284 (오른쪽) 펩티드 펄스된 T2 세포들에 세포독성을 보였지만, 관련없는 HIV 펩티드와 펩티드-펄스되지 않은 T2 세포들에는 보이지 않았다. b는 이 CTLs가 RAB6KIFL+ HLA-A2(A*0201)+ 인간 췌장암 세포주 PANC1 및 결장암 세포주 CaCo-2에 세포독성을 보이지만, RAB6KIFL+ HLA-A2(A*0201)- 인간 췌장암 세포주 PK8에는 보이지 않음을 나타낸다.
[도 6c-d]. c는 상기 CTLs의 세포독성이 RAB6KIFL에 특이적임을 나타낸다. 상기 CTLs은 인간 RAB6KIFL 유전자와 형질전환된 RAB6KIFLlow HLA-A2+ 인간 간 세포주 SKHep1를 죽이지만, SKHep1/Mock을 죽이지 않는다. d는 항-HLA-class I mAb에 의한 세포독성의 억제를 나타낸다. 타겟 세포 PANC1이 각각 한 시간 동안 anti-HLA-class I mAb(W6/32, IgG2a) 또는 항-HLA-DR mAb(H-DR-1, IgG2a)에 배양한 후, RAB6KIFL-A2-9-12(위쪽), RAB6KIFL-A2-9-809(중간), 및 RAB6KIFL-A2-10-284 (아래쪽) 펩티드의 자극에 의한 건강한 기증자의 PBMCs로부터 발생한 CTLs가 첨가하였다. IFN-감마 생산이 W6/32에 의해 현저하게 억제되었지만, H-DR-1에서는 억제되지 않았다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 어떠한 것이라도 본 발명의 실시예를 수행 또는 검사하는데 사용될 수 있으나, 여기서는 바람직한 방법, 도구, 및 재료를 기술한다. 그러나 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용만을 기술하기 위한 목적이며, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.
본 명세서에서 언급된 개별 공개, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 인용된다. 그러나 본 명세서의 어느 것도 본 발명은 이전 발명으로 인하여 선행되는 문헌의 자격이 없다는 인정으로서, 만들어지지 않는다.
충돌이 일어날 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따른다. 추가로, 상기 재료, 방법, 및 실시예는 도시적 용도일 뿐이며, 한정하려는 의도는 아니다.
I. 정의
본 발명에서 사용되는 단어는 별도로 명시되지 않는 한, 단수를 의미한다.
본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기, 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기에 적용된다.
이 발명에서 종종 사용되는 "올리고펩티드"라는 용어는 이 발명에서 잔기가 20개 이하인, 바람직하게는 15개 이하의 길이인 펩티드를 지칭하고, 보다 바람직하게는 8개에서 11개의 잔기, 가장 바람직하게는 9개 혹은 10개의 잔기로 구성된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산, 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 a탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature commission)가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 심볼 또는 1문자 심볼에 의해 기재되어 질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한 호환적으로 사용되고 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 기재되는 아미노산과 유사하다.
별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "암"은 RAB6KIFL 유전자를 과발현하는 암을 말한다. RAB6KIFL을 과발현하는 암의 예로는 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 따로 특별히 나타내지 않는 한, 비-자가 세포(예를 들면, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도하는 T 림프구의 하위 군을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 업계에서 전통적인 기술중 하나로 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
II . 펩티드
RAB6KIFL에서 유래된 펩티드가 세포독성 T 림프구(CTLs)로 인식된 항체로써 역할을 하는지 증명하기 위해, RAB6KIFL(서열번호: 2)로부터 유래된 펩티드를 분석하여, 펩티드가 HLA 대립 유전자와 일반적으로 마주하는 HLA-A2(A*0201)에 제한되는 항원 에피토프인지 결정했다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). RAB6KIFL로부터 유래한 HLA-A2 결합 펩티드의 후보는 HLA-A2와의 결합 친화력에 관한 정보를 이용해서 판별했다. 이러한 펩티드가 적재된 수지상세포(Dc)들로 실험관 내 실험을 한 뒤, 각 펩티드를 이용해 CTLs가 성공적으로 만들어졌고, 특히 다음과 같은 펩티드를 이용하였다:
RAB6KIFL-A2-9-12(서열번호: 3);
RAB6KIFL-A2-9-809(서열번호: 4); 및
RAB6KIFL-A2-10-284(서열번호: 5).
이렇게 만들어진 CTLs는 각 펩티드와 펄스된 표적 세포에 대한 강력한 잠정적인 CTL활동을 보인다. 상기 결과는 RAB6KIFL이 CTL에 의해 인식된 항체라는 것과 펩티드는 HLA-A2(A*0201)에 의해 제한된 RAB6KIFL의 에피토프 펩티드라는 것을 증명하였다.
RAB6KIFL 유전자는 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암(NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC)과 같은 대부분의 암 세포에 과발현되기 때문에, 면역제 치료법의 좋은 표적이다. 따라서, 본 발명은 RAB6KIFL의 CTL이 인식된 에피토프에 상응하는 나노펩티드(아홉개의 아미노산 잔기들로 구성된 펩티드), 이카펩티드(열개의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드)와 같은 올리고펩티드를 제공한다. 특히 본 발명의 올리고펩티드의 선호하는 예는 서열번호: 3, 4 및 5 중에서 선택된 아미노산서열을 가지고있는 펩티드들이다.
일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75에서 기술한 바와 같이 소프트웨어 프로그램은 이제 인터넷에서 이용가능하며, 다양한 펩티드와 실리코의 HLA 항원 사이의 결합 친화력을 계산하는데 사용할 수 있다. HLA 항체와의 결합 친화력은, 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; 그리고 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81에 기술된 것처럼 측정할 수 있다. 결합 친화력을 결정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.; Protein Science, 2000, 9:1838-1846에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 프로그램들을 이용해 HLA 항체와 결합하도록 결정된 RAB6KIFL의 펩티드를 아우른다.
또한, 본 발명의 이러한 펩티드들은 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한 추가적으로 아미노산 잔기들이 옆에 배치될 수 있다. CTL 유도성을 가진 이러한 펩티드들은, 예를 들면, 40개 이하의 아미노산, 바람직하게는 20개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 15개 이하의 아미노산이다. 서열번호: 3, 4 및 5 그룹 중 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드가 옆에 배치된 아미노산 서열은 한정되지 않고, 본래 펩티드의 CTL 유도성을 해치지만 않는다면 어떠한 종류의 아미노산으로도 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 서열번호: 3, 4 및 5 그룹 중 선택된 아미노산 서열로 구성된, CTL 유도성을 가지는 펩티드를 제공한다.
일반적으로, 단백질에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 끼치지 않고, 또는 몇몇의 경우에는 심지어 본래 펩티드의 원하는 기능을 강화시킬 수 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 본래의 참조 서열과 비교하여, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입) 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려지고 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 상기 올리고펩티드는 CTL 유도성 및 서열번호: 3, 4 또는 5의 아미노산 서열 그룹중에서 선택된 하나, 둘 또는 심지어 다수의 아미노산이 삽입, 첨가, 결실, 및/또는 치환된 아미노산 서열을 모두 가질 수 있다.
당업자는 단일 아미노산 또는 아미노산의 일부 비율이 바뀌는, 아미노산 서열 각각의 삽입 또는 치환이 본래 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 결과를 내는 경향이 있음을 알고 있다. 이렇게, 이들은 보통 단백질의 변화가 본래 단백질과 유사한 특성과 기능을 갖는 변형된 단백질을 만드는 "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"이라고 일컫는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 보존되는 아미노산 측쇄 특성의 예는 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기의 작용기 또는 공통적인 특성을 갖는 측쇄가 포함된다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 측쇄를 포함하는 수산기 군(S, T, Y); 측쇄를 포함하는 황 원자(C, M); 측쇄를 포함하는 카르복실산 및 아미드(amide)(D, N, E, Q); 측쇄를 포함하는 염기(R, K, H); 및 측쇄를 포함하는 방향족(H, F, Y, W). 아울러, 하기의 8개 군은 각각 보존적 치환으로서 당업계에서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글라이신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E);
3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 이에 한정되지 않으며 상기 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 비-보존적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 변형된 펩티드는 CTL 유도성 펩티드의 다형성 변이, 종간 유사체(interspecies homologues), 및 RAB6KIFL의 대립 유전자를 제외하지 않는다.
필수적인 CTL 유도성을 유지하게 위해서, 적은 양의(예를 들어 1, 2 또는 몇몇개의) 혹은 적은 퍼센트의 아미노산을 변형(부가 또는 삭제) 할 수 있다. 여기서 "몇몇개"의 의미는 5개 이하의 아미노산, 예를 들어, 3개 이하를 의미한다. 변형될 아미노산의 퍼센트는 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 또는 1 내지 5%이다.
면역치료의 문맥으로 이용될 때, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소좀의 표면에 제시되며, 바람직하게는 HLA-A0206 항원과의 복합체로서 제시된다. 따라서, CTLs을 유도하는 펩티드뿐만 아니라, 상기 HLA-A0206 항원에 대한 높은 결합 친화성을 가진 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 상기 펩티드는 증가된 결합 친화성을 갖는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여, 아미노산 잔기들의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가를 통해서 변형될 수 있다. 자연적으로 나타난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있으며(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 이러한 규칙성에 기반한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들어, 높은 HLA-A2(A*0201) 결합 친화력을 가지는 펩티드는 류신 또는 메티오닌으로 교체된 N-말단으로부터 두번째 아미노산을 갖으며, C-말단에서 아미노산을 갖는 펩티드는 발린 또는 류신으로 교체된다. 따라서, N-말단에서 두번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 교체되거나 그리고/또는 C-말단이 발린 또는 루신으로 교체된 서열번호: 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 본 발명에서 다룬다. 치환은 마지막 아미노산에서뿐만 아니라, 펩티드의 잠재적 TCR 인지 위치에도 도입될 수 있다. 다수의 연구에서 예를 들어 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217)의 펩티드에서의 아미노산 치환은 본래와 동등하거나 또는 우수하다는 것을 보였다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
본 발명은 아미노산이 여기 기재된 서열들에 첨가될 수 있다는 것 또한 고려한다. 예를 들어, 하나, 둘 또는 몇몇개의 아미노산들이 본 발명의 N 그리고/또는 C-말단에 첨가될 수도 있다. 높은 HLA 항체 결합 친화력을 가지고 CTL 유도성을 보유하는 변형된 펩티드 또한 본 발명에 포함된다.
그러나, 상기 펩티드 서열이 상이한 기능을 갖는 내인성 또는 외인성의 아미노산 서열의 일부와 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 및/또는 알러지 증상과 같은 부작용이 유도될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드의 서열과 일치하는 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 경우를 방지하기 위하여, 우선 이용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하다. 목적 펩티드와 비교하여 1개 또는 2개 아미노산의 차이가 있는 펩티드조차 존재하지 않는다는 상동성 검색 결과가 확실해진다면, 상기 목적 펩티드는 이의 HLA 항원과의 결합 친화성, 및/또는 상기와 같은 부작용의 위험이 없는 CTL 유도성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.
비록 상기 기재된 바와 같이 HAL 항체에 높은 결합 친화력을 갖는 펩티드는 매우 효과적일 것으로 예상되지만, 지표로써 높은 결합 친화력을 보이는 것에 따라 선택된 상기 후보 펩티드들은 CTL 유도성의 존재를 더욱 조사되었다. 여기에서, 구문 "CTL 유도성"은 항원 제시 세포에 제시될 때, 세포 독성 T 림프구(CTLs)를 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 나아가, "CTL 유도성"은 상기 펩타이드의 CTL, 활성 유도, CTL 증식, 표적 세포의 CTL 용해 증진, 및 CTL IFN-감마 생성을 증가시키는 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들면, B-림프구, 대식세포, 및 수지상 세포(DCs)), 또는 좀더 특이적으로 인간 말초 혈액 단핵구성 백혈구로부터 유래된 수지상세포, 를 운반하는 항원 제시 세포를 유도하고, 상기 펩티드로 자극한 후, CD8-양성 세포를 혼합한 다음, 표적 세포에 대하여 CTL에 의해서 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정하는 것으로 수행된다. 반응 체계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal 에피토프 vaccine in HLA A*2010/DR 1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response) 이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포는 51Cr 등으로 방사선 표지 될 수 있으며, 세포독성 활성은 상기 표적세포로부터 방출되는 방사능으로부터 산출될 수 있다. 대안적으로, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 운반하는 항원 제시 세포(APCs)의 존재 하에 CTL에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-감마(IFN-gamma)를 측정하고, 항-IFN-감마 모노클로날 항체를 이용하여 상기 배지 내의 억제 구간을 가시화함으로써 측정할 수 있다.
위에서 언급한 것처럼 펩티드의 CTL 유도성을 관찰한 결과, HLA 항체에 높은 결합 친화력을 갖는 이 펩티드들은 꼭 높은 CTL 유도성을 가질 필요는 없다는 것이 발견됐다. 하지만, 이렇게 확인되고 평가된 펩티드들 중, 서열번호: 3, 4 및 5에서 지적된 아미노산 서열을 갖는 펩티드들 중에 선택된 나노펩티드 또는 데카펩티드들은 HLA 항체에 높은 결합 친화력뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보이는 것이 발견됐다. 따라서, 이러한 펩티드들이 본 발명의 바람직한 실시예로 예시화하였다.
또한, 상기 기재한 변형과 더불어, 본 발명의 펩티드는 결과적으로 연결된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 다른 물질들과 연결될 수 있다. 적합한 물질들은 그 예로 펩티드, 지질, 당 및 당 사슬, 아세틸기(acetyl group), 천연 및 합성 폴리머등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 상기 펩티드는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화(phosphorylation), 등과 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능을 부여하기 위하여(예를 들면, 표적화 기능, 및 전달 기능), 또는 상기 폴리펩티드를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다.
예를 들면, 폴리펩티드의 세포 내(in vivo) 안정성을 증가시키기 위하여, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 미메틱스(mimetics) 또는 비자연적인 아미노산을 도입할 수 있다는 것이 알려져 있다; 또한 이러한 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티드가수분해효소 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지가, 안정성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).
추가로, 본 발명의 상기 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 다른 펩티드들과 연결될 수 있다. 다른 펩티드들의 예들은 다른 TAA로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 둘 또는 다수의 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 연결될 수 있다. 스페이서 또는 링커를 통해 연결된 상기 펩티드들은 동일하거나 서로 다를 수 있다. 스페이서 또는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 펩티드인 것이 바람직하고, 펩티다제(psptidase), 프로테아제(protease) 및 프로테아좀(proteasome)과 같은 효소에 의해 절단될 수 있는 하나 또는 다수의 절단 위치를 갖는 펩티드인 것이 더욱 바람직하다. 링커 또는 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 펩티드는 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩티드에 연결된 이러한 펩티드를 포함한다.
또한, 명세서에서, 본 발명의 펩티드는 " RAB6KIFL 펩티드(들)" 또는 " RAB6KIFL 폴리펩티드(들) 또는 RAB6KIFL 올리고펩티드"로 기재될 수 있다.
Ⅲ. RAB6KIFL 펩티드들의 제조
본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 사용하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 펩티드들은 각각 합성되거나, 둘 또는 이상의 펩티드로 구성되는 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 다음으로, 상기 펩티드는 자연적으로 형성되는 숙주 세포 단백질 및, 이의 단편, 또는 다른 화학적 물질이 실질적으로 제거되도록 분리, 즉 정제 또는 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 선별된 아미노산 서열을 기초로 한 화학 합성을 통해 얻어질 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 종래 펩티드 합성 방법의 예들은 하기를 포함하나, 이에 한정하지 않는다:
(ⅰ) 펩티드 합성(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966;
(ⅱ) 단백질(The Proteins), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(ⅲ) 펩티드 합성(Peptide Synthesis)(일본어), Maruzen Co., 1975;
(ⅳ) 펩티드 합성의 기본 및 실험(일본어), Maruzen Co., 1985;
(ⅴ) 제약 개발(두 번째 권)(일본어), Vol. 14(펩티드 합성), Hirokawa, 1991;
(ⅵ) WO99/67288; 및
(ⅶ) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "고체상 펩티드 합성(Solid Phase peptide synthesis)", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
대안적으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 생산하기 위한 모든 공지된 유전 공학 기술을 적용하여 획득될 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들면, 우선, 발현할 수 있는 형태로 목적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터(예를 들면, 프로모터 서열에 상응하는 조절 서열의 하위 단계)가 제조되고 적합한 숙주 세포에 형질전환된다. 그리고 상기 숙주 세포는 목표 펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 또한, 상기 펩티드는 시험관 내 번역 체계(in vitro translation system)를 채택하여 시험관 내에서 생성될 수 있다.
IV . 폴리뉴클레오티드( Polynucleotides )
또한, 본 발명은 본 발명의 상기 언급된 펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클리레오티드를 제공한다. 이들은 RAB6KIFL/KIF20A 유전자의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 RAB6KIFL/KIF20A 유전자(서열변호: 3 또는 5, GenBank 등록번호 NM_005733 (서열번호: 1)로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이하, 구문 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화도(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정한 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정화되는 각 위치에서, 상기 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변화시키지 않고 이에 상응되는 임의의 코돈으로 변화할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 또한, 본 명세서에서 펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 일반적인 기술의 하나는 핵산 내의 각 코돈(예외 일반적으로 메티오닌(methionine)을 위한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판(tryptophan)을 위한 유일한 코돈인, TGG)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위하여 변형되는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 공개된 서열에 암시적으로 기재된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이의 변이체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되며, RNA에서는 T가 U로 치환된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 사이에 삽입하거나 또는 삽입하지 않은 채로, 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 삽입하는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 위치(예, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대하여 임의의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현을 위하여 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자 등이 있는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 폴리머라아제(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드의 조작에 의해서 제조될 수 있다.
재조합 및 화학적 합성 기술 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 컴피턴트(competent) 세포로 형질감염되었을 때 발현될 수 있는, 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 이용하여 증폭되거나 적합한 숙주에서 발현될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참조). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재된 바와 같이, 고체상(solid phase) 기술을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명에 포함된다.
V. 엑소좀( Exosomes )
본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소좀으로 부르는 세포 소낭(intracellular vesicles)을 추가로 제공한다. 엑소좀은, 예를 들어, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방을 위한 개체인 환자로부터 획득된 APCs를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 본 발명의 펩티드와 유사한 모양으로, 백신으로써 접종될 수 있다.
복합체에 구성되어 있는 HLA 항원의 종류는 치료 그리고/또는 예방을 요하는 개체의 항원과 매치되어야 한다. 일본인들과 백인들(Caucasian) 사이에 높게 나타나는 HLA-A2 타입의 사용은 효과적인 결과를 얻어내는데 호의적이고, HLA-A2 (A*0201)과 HLA-A2 (A*0206)과 같은 아류형(subtype)을 사용할 수 있다.
일반적으로, 병원에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 타입은 우선 조사되고, 이는 이 항원에 높은 수준의 결합 친화력 혹은 항원 제시에 의해 CTL 유도성을 갖는 펩티드를 적절히 선택할 수 있게 한다. 게다가, 높은 결합 친화력과 CTL 유도성을 보이는 펩티드를 얻기 위해서, 자연적으로 발생하는 RAB6KIFL 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 근거로 1, 2, 또는 몇몇개의 아미노산을 교체 또는 첨가할 수 있다.
본 발명의 엑소솜의 HLA-A2 (A*0201) 항원을 사용할 때, 서열번호: 3, 4 및 5의 서열이 선택된 펩티드(sequence selected peptide)를 가지는 펩티드를 사용할 수 있다.
Ⅵ. 항원제시 세포
또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하고 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APCs)를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 접촉 또는 발현가능한 형태의 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 획득되는 APCs는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 백신으로서 투여되거나 또는 본 발명의 펩티드, 엑소좀, 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과의 조합으로서 투여될 수 있다.
상기 APC는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 그들의 세포 표면에 단백질 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는, 수지상 세포(DCs), 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 수지상 세포는 APCs 중에서 강력한 CTL 유도 활성을 갖는 대표적인 APC이기 때문에, DCs는 본 발명의 APCs로 사용할 수 있다.
예를 들면, APC는 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DCs에 의해서 유도되고, 그런 다음 시험관 내, 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하여 수득할 수 있다. 본 발명의 펩티드가 상기 개체에 투여될 경우, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs는 개체의 체내에서 유도된다. 구문 "APC 유도"는 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하기 위해 본 발명의 펩티드, 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 세포와 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드를 상기 APCs에 도입하여, 상기 APCs가 상기 펩티드를 제시할 수 있게 한 후, 상기 APCs는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외(ex vivo) 투여는 하기의 단계를 포함한다:
a: 첫 번째 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;
b: 단계 a의 APCs와 펩티드를 접촉시키는 단계; 및
c: 펩티드가 담지된 APCs를 두 번째 개체에 투여하는 단계.
상기 첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 동일한 개체일 수 있으며, 또는 다른 개체일 수도 있다. 대안적으로, 본 발명에 따르면, 항원 제시 세포를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 이 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하고, 여기서 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체와 본 발명의 펩티드를 혼합하거나 만들어내는 단계를 포함하는 방법이다. 대안적으로, 본 발명은 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암 (SCLC)을 포함하는 암을 치료하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 단계를 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 나아가, 또한 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 상기 단계 b에서 획득한 APCs는 백신으로서 상기 개체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암 (SCLC)을 포함하는 암을 치료하는 펩티드를 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 상기 APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는다. "높은 수준의 CTL 유도성" 용어에 있어서, 상기 높은 수준이란 펩티드와 접촉하지 않거나 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉한 APC에 의한 CTL 유도성 수준에 대한 상대적인 것이다. 이러한 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs는 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 APCs 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNAs 또는 RNAs 형태일 수 있다. 도입을 위한 방법의 예는, 리포펙타민(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법과 같이, 당업계에서 일반적으로 수행되는 다양한 방법을 특정한 제한없이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 상기 유전자를 APCs에 전달함으로써, 상기 유전자는 상기 세포 내에서 전사, 번역 등을 거치며, 그리고 나서 수득된 단백질은 MHC 클래스 또는 클래스 에 의해 처리되고, 펩티드를 제시하기 위하여 제시 기작(presentation pathway)을 통해서 진행된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 APCs는 HLA 항원의 복합체 표면과 서열번호: 3, 4 및 5 중 선택된 아미노산 서열로 구성된 올리고펩티드에 나타난다. 바람직하게, 본 발명의 , APCs는 HLA-A2 항체를 운반하고, 특히 그 표면에서 HLA-A2(A*0201)을 운반한다. 대안적으로, HLA 항원과 복합체를 이룰 올리고펩티드는 서열번호: 3, 4 및 5 중에 선택된 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드다. 이 올리고펩티드에서 하나, 둘 또는 몇몇개의 아미노산은 교체, 삽입, 삭제 그리고/또는 추가될 수 있고, 예를 들어, N-말단에서 두번째 아미노산은 루신 또는 메티오닌으로 교체될 수 있고, 그리고/또는 C-말단 아미노 산은 발린 또는 루신으로 교체될 수 있다.
Ⅶ. 세포독성 T 세포( Cytotoxic T cells , CTLs )
본 발명의 임의의 펩티드에 대해서 유도되는 세포독성 T 세포는 생체 내(in vivo)에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하며 따라서 펩티드 그 자체와 유사한 유형으로, 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화되는 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.
이러한 세포독성 T 세포는 (1) 개체에 본 발명의 펩티드들을 투여하고, 개체로부터 유래된 세포독성 T 세포를 수집하거나 또는 (2) 개체 유래된 APCs, 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구성 백혈구를 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 펩티드들과 접촉(자극)하고, 세포독성 T 세포를 분리함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs로부터 자극됨으로써 유도되는, 상기 세포독성 T 세포는, 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 투여되거나, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드 또는 엑소좀을 포함하는 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 수득된 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포, 또는, 예를 들면, 유도에 사용된 동일한 펩티드에 대해 특이적으로 작용한다. 다른 말로, 상기 세포독성 T 세포는 표적 세포의 표면에서 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체와 함께 인지할 수 있고, 그 다음 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격한다. 상기 표적 세포는 내인성으로 RAB6KIFL 를 발현하는 세포이거나, 또는 상기 RAB6KIFL 유전자가 형질감염된 세포일 수 있다; 그리고 상기 펩티드에 의해서 자극되기 때문에 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포는 활성화된 CTL 공격의 표적으로서도 사용할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 표적 세포는 HLA-A2 항체, 특히 표면에서 HLA-A2(A*020)를 운반한다.
Ⅷ. T 세포 수용체 (T cell receptor , TCR )
또한, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)의 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 구성된 조성물, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 알파와 베타는 RAB6KIFL을 제시하는 종양 세포에 대하여 T 세포의 특이성을 줄 수 있는 TCR을 형성하는 능력을 가진다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 이 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 CTL에서 발현된 TCR의 TCR 알파(alpha-) 및 베타(beta-) 사슬의 핵산 서열이 높은 효율의 유전자를 인간의 주요 림프구로 변환할 수 있는 적절한 벡터를 만드는데 이용될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan RA et al., J Immunol, 171). 예를 들어, 이러한 벡터는 레트로 바이러스의 벡터이다. 유리하게, 본 발명은 우수한 암 세포 사멸 특성을 갖는 변형된 T 세포를 신속하고 용이하게 생성하게 할 수 있도록 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 T 세포)를 신속하게 변형시키는 규격화된 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RAB6KIFL, 즉 HLA-A2 (A*0201)의 문맥에서 서열번호: 3, 4 및 5에 결합하는 TCR 서브유닛 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질도입함으로써 제조되는 CTLs을 제공한다. 상기 형질도입된 CTLs은 생체 내의 암 세포로 귀소할 수 있으며, 공지된 시험관 내 배양 방법에 의해 증폭될 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 발명의 상기 T 세포는 치료 또는 보호를 필요로 하는 환자의 암을 치료 또는 방지하는데 유용한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다(WO2006/031221).
Ⅸ. 약학적 제제 또는 조성물
용어 "방지" 및 "예방"은 질환으로부터 사망 또는 질병률의 부담을 감소시킬 수 있는 어떠한 행위로 일컬어지도록 여기서 교대해서 쓰인다. 방지 및 예방은 "첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 방지 단계"에서 발생할 수 있다. 첫 번째 방지 및 예방은 질병의 발생을 피할 수 있는 반면, 두 번째 및 세 번째 단계의 방지 및 예방은 기능 복구 및 질환 관련된 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적인 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 질병 및 위급한 증상의 발달의 방지 및 예방에 목표를 둔다. 대안적으로, 방지 및 예방은, 예를 들어, 종양의 증식 및 전이를 감소시키는, 신생혈관억제를 감소시키는, 특정 질환의 심화를 경감시키는 것을 목적으로 하는 다양한 종류의 예방적 치료법을 포함할 수 있다.
암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암성 세포 성장의 억제, 종양의 퇴화 또는 퇴행, 암 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 감소, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 하기의 단계의 임의의 것을 포함한다. 효과적으로 암을 치료 및/또는 예방하는 것은 사망률을 감소시키고, 암을 가진 개인의 예후를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 지각할 수 있는 증상들을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료를 구성하며 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정적인 질환을 포함한다.
RAB6KIFL 발현이 정상 조직들에 비해서 다양한 암에서 상향 조절되므로, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 재발을 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소좀 또는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 APCs와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 구문 "펩티드의 표적화"는 표적 세포의 표면에서 HLA 항원과 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체가 인지(즉, 결합)한 후, 상기 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격하는 것을 의미한다.
또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 있어서, 하기 중 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 APC; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
대안적으로, 본 발명은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 하기 중 선택되는 활성 성분을 추가로 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산,
(c) 본 발명의 APC; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
대안적으로, 본 발명은 유효 성분으로서 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 추가로 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 APC; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중 선택되는 유효 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 상기 유효 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 APC; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
대안적으로, 상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 암의 예방 및 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로서의 용도를 확인하였다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 구문 "백신"("-면역원성 조성물-"도 의미함)은 동물에 주사되어 항종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질을 일컫는다.
상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 암의 치료 및/또는 방지에 사용될 수 있으며, 및/또는 개체 또는 인간을 포함한 환자 및 특히 산업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물인, 마우스, 쥐, 기니아 피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비원숭이(baboon), 및 침팬지에 한정하지 않지만, 이를 포함하는 임의의 다른 포유류 동물에서 이의 수술 후 재발을 방지하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 서열번호: 3, 4 및 5 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 올리고폴리펩티드는, 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는, HLA-A2 (A*0201)제한된 에피토프 펩티드라는 것을 발견하였다. 따라서, 서열번호: 3, 4 및 5 중에서 선택되는 아미노산 서열의 이러한 올리고펩티드 중 어느 것을 포함하는 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A2(A*0201)인 개체에 투여되는 것이 더욱 적합하다. 동일한 것이 이들 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해서 치료될 수 있는 암은 RAB6KIFL이 관련된, 예를 들면, 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC) 를 포함하는 모든 종류의 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명의 약학적 제제나 조성물
은 췌장암에 바람직하게 적용된다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 추가로 상기 언급한 활성 성분, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 가진 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력을 갖는 상기 다른 펩티드는 암 특이적 항원(예를 들면, 동정된 TAAs)에 의해서 예시화되나, 이에 한정되지 않는다.
만약 필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면, 본 발명의 임의의 펩티드와 같이, 물질이 활성 성분의 항종양 효과를 저해하지 않는 한, 선택적으로 활성 성분으로서 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제형은 항염증성 약제 또는 조성물, 진통제, 화학요법제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체 내의 다른 치료학적 물질을 포함하는 것에 추가로, 본 발명의 상기 약제는 또한 하나 또는 다수의 다른 약학적 제제 또는 조성물과 연속적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제는 조성물의 양은 예를 들면, 어떤 종류의 약학적 제제(들) 또는 조성물(들)이 사용되었는지, 치료되어야 할 질환, 및 투여 일정 및 경로 등에 따른다.
특히, 본 명세서에 언급된 성분에 추가로, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되는 형태의 제형을 갖는 당업계의 종래 다른 제제 또는 조성물을 포함할 수 있다고 이해된다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 제조의 물품 및, 예를 들어, 암과 같은 치료될 질환의 병리학적인 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조의 물품은 라벨(label)을 갖는 본 발명의 임의의 약학적 제제 또는 조성물의 용기(container)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플리스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 위의 라벨은 상기 약제 또는 조성물이 하나 또는 다수 조건의 질병의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다는 것을 나타내야 한다. 또한, 상기 라벨은 투여 등에 대한 지시를 나타낼 수 있다.
상기 기재된 용기에 추가적으로, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용가능한 희석제가 들어 있는 두 번째 용기를 선택적으로 추가하여 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 가능하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 또는 다수의 유닛 복용량 형태를 포함하는 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 제시될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들면, 금속 또는 브리스터 팩(blister pack)과 같은, 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시서와 수반될 수 있다.
(1) 활성 성분으로서 상기 펩티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물
본 발명의 상기 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물 또는, 만약 필요하다면, 종래의 제형 방법에 의해서 제형화된 것으로 직접적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 추가로, 약물에 일반적으로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특정한 제한 없이 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 멸균수, 생리식염수, 인산 완충액, 배양액 등이 있다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요에 따라, 안정화제(stabilizer), 현탁액(suspension), 보존제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 펩티드 둘 또는 그 이상으로 구성된 조합으로서 제조될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 칵테일(cocktail)의 형태를 취할 수 있으며 또는 표준 기술을 이용하여 서로 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결되거나 또는 단일 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 상기 조합 내의 펩티드는 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 APCs의 HLA 항원에 의하여 높은 농도로 제시된 뒤, 상기 나타난 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드로 본 발명의 펩티드로부터 자극된 개체로부터 APCs(예를 들면, DCs)의 제거에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 임의의 펩티드를 그 세포 표면에 제시하는 APCs를 얻을 수 있고, CTL은 이 APCs (예를 들면, DCs)를 개체에 재투여한 개체에서 유도되며, 그 결과, 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암 (SCLC)과 같은 암 세포에 대한 공격성이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 방지를 위한 약학적 제제 또는 조성물은, 세포의 면역력을 효과적으로 확립시킨다고 알려진 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 그들은 다른 유효 성분으로 투여될 수 있고, 그리고 그들은 과립으로 제조되어 투여될 수 있다. 아쥬반트는 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때 상기 단백질에 대한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 일컫는다. 본 명세서에서 아쥬반트는 하기의 문헌에 기재된 바를 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 아쥬반트의 예로는 인산 알루미늄(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 명반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
더욱이, 상기 펩티드가 미세한 마이크로미터 직경의 비드에 결합되어 있는 리포솜(liposome) 제형, 과립 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합되어 있는 제형이 일반적으로 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 개시하는(prime) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에서 CTL을 개시할 수 있는 제제 또는 조성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 엡실론(epsilon)- 및 라이신 잔기의 알파-아미노 군에 붙을 수 있으며, 그 뒤 본 발명의 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 지질 펩티드는 그런 다음 리포솜에 결합되거나, 또는 아쥬반트에 유화되어 미셀(micelle) 또는 입자(particle)로 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응의 지질 제조의 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질은 적절한 펩티드에 공유 결합되었을 때, CTL을 개시하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).
투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 등, 및 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 바람직하게는, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 보다 바람직하게는, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎, 이며 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.
(2) 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물
또한, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 발현할 수 있는 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 구문 "발현할 수 있는 형태"는 상기 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되었을 때, 항종양 면역력을 유도하는 폴리뉴클레오티드로서 생체 내(in vivo)에서 발현할 수 있음을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소(regulatory element)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되기 위하여 구비될 수 있다(예를 들면, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 기술을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 제 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조한다. DNA 기반한 전달 기술의 예로는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머(polymer), 펩티드-매개) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매게("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달(예를 들면, 미국 출원 제 5,922,687호 참조)을 포함한다.
또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은, 예를 들면, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터와 같은, 백시니아 바이러스의 이용을 수반한다. 숙주에 도입한 후, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로 인하여 면역 반응이 유발된다. 면역화 프로토콜에 있어서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들면, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재된다. 또 다른 벡터의 예로 BCG(Bacille Calmette Guerin)를 포함한다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재된다. 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 다양한 다른 벡터, 예를 들어, 아데노(adeno) 및 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터, 무독화시킨 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등, 이 명백할 것이다. 예를 들면, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조한다.
폴리뉴클레오티드의 개체로의 전달은, 상기 개체가 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 노출시키는 직접적, 또는 세포가 우선 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된 후, 상기 세포를 개체에게 이식하는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 두 가지 접근은 각각 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료법으로서 알려져 있다.
유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 또한 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야의 일반적으로 알려진 방법은 eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재된다.
투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사 등을 할 수 있으며, 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여의 용도를 발견한다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 적합한 수용체 내 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 양은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 바람직하게, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 보다바람직하게, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.
Ⅹ. 펩티드, 엑소좀 , APCs 및 CTLs 을 사용한 방법
본 발명의 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 및 APCs는 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 및 APCs는 화합물이 이들의 CTL 유도성을 억제하지 않는 한, 임의의 다른 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급한 임의의 약학적 제제 또는 조성물은 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있으며, 이에 추가적으로, 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 또한 하기 기재된 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다.
⑴ 항원 제시 세포(APCs)를 유도하는 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 APCs를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 APCs의 유도는 "Ⅵ. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 유도성은 또한 "VI. 항원 제시 세포"의 항목하에 언급되었다.
바람직하게는, APCs를 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:
a: 본 발명의 펩티드와 APCs를 접촉하는 단계; 및
b: 발현할 수 있는 형태의 본 발명의 폴리펩티드를 APCs내로 도입하는 단계.
이러한 APCs를 유도하는 방법은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)로 수행되는 것이 바람직하다. 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 상기 방법을 수행할 때, 유도되는 APCs는 처리한 개체 또는 다른 HLA 항원이 개체와 같은 개체들로부터 수득될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 의해 유도된 APCs는 HLA-A2 항원, 특히 표면에서 HLA-A2 (A*0201)를 운반한다.
⑵ CTLs을 유도하는 방법
더욱이, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 또는 상기 펩티드를 제시하는 APCs를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 세포 표면에서 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, CTLs을 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:
a: CD8-양성 T 세포를 HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 및/또는 엑소좀과 접촉하는 단계; 및
b. 본 발명의 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 인식하는 TCR 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포 내로 도입하는 단계.
이 발명의 펩티드를 개체에 투여하였을 때, CTL은 개체의 체내에서 유도되며, 상기 종양과 관련된 내피를 타겟팅하는 면역 반응의 힘을 강화시킨다. 대안적으로, 상기 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 생체 외(ex vivo) 치료 방법으로 사용될 수 있으며, 이는 개체 유래 APCs, 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 접촉(자극)하고, CTL을 유도한 후, 상기 활성화된 CTL 세포는 개체로 돌아온다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;
b: 단계 a의 APCs와, 상기 펩티드를 접촉시키는 단계;
c: 단계 b의 APCs와 CD8 + T 세포를 혼합하고, CTLs을 유도하기 위하여 공동 배양하는 단계; 및
d: 단계 c의 공동 배양으로부터 CD8 + T 세포를 수집하는 단계.
대안적으로, 본 발명에 따르면, CTLs을 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함한, CTLs을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 CTLs을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.
단계 d에 의해 수득된 세포독성 활성을 갖는 상기 CD8+ T 세포는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 또한, 상기 단계 c에서 상기 CD8+ T 세포와 혼합된 APCs는 상기 "Ⅵ. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APCs 내로 전이시킴으로써 제조될 수 있으나; 이에 한정되지 않고 본 발명의 펩티드를 효과적으로 제시하는 임의의 APC 또는 엑소좀은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
여기서 기술한 방법과 유사한 혹은 똑같은 방법과 재료가 실험에, 혹은 본 발명의 테스트에 사용될 수 있다 할지라도, 적절한 방법과 재료들이 기술되었다. 여기서 언급된 공개물, 특허출원, 특허, 그리고 다른 인용문헌들은 그 자체로 인용문헌에 병합된다. 충돌 (conflict)이 있을 경우, 정의들을 포함한 본 발명이 중재할 것이다 (control). 또한, 물질, 방법 그리도 실시예들은 단지 설명을 위한 것이지 한정하려는 의도는 아니다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하고, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 도와주기 위하여 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어느 방법으로든 한정하려는 의도가 아니다.
실시예
재료와 방법들
cDNA 마이크로어레이 분석
상기 기술한 바와 같이 cDNA 마이크로어레이(cNDA microarray) 분석에 의해 유전자 발현(gene expression)의 프로파일링(profiling)을 실시되었다(Nakamura T, et al. Oncogene 2004; 23:2385-400). 췌장암 및 췌장암과 인접해 있는 암이 아닌 정상 췌장 세포들의 세포 샘플들을 수술한 표본으로 부터 수득하였고, 모든 환자들은 이 연구 참여에 동의한다는 서면을 제출하였다. 도 1C에서 나타낸 바와 같이, 암세포에서의 RAB6KIFL mRNA을 정상적인 RAB6KIFL mRNA의 발현량으로 나누어 상대적인 발현율을 계산하였다. 도 1B에서 나타낸 바와 같이, 각각의 정상 세포에서의 RAB6KIFL mRNA의 발현양을 도 1B에서 지적한 40개의 정상 세포들에서 RNA 샘플의 동등한 양의 혼합물인 조절된 RNA에서의 RAB6KIFL mRNA 발현양으로 나누어서 정상 세포의 상대적인 발현량을 계산하였다.
마우스
프랑스, Pasteur 협회, nite d' Immunite Cellulaire Antivirale, ISDA-레트로바이러스 부서(Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999;29:3112-21)에서 HLA-A2.1 (HHD) Tgm; H-2Db-/- beta 2m-/- ㄷ더블 낙아웃 마우스를 인간 베타 beta 2m-HLA-A2.1에 도입(alpha 1, alpha 2)-H-2Db (alpha 3 transmembrane cytoplasmic; HHD) 단일 사슬 구성 유전자가 생성되었고, F.A. Lemonnier 박사를 통해 이를 제공받았다. 마우스들은 쿠마모토 대학(Kumamoto University)의 동물 자원 개발 센터에 맡겼으며, 쿠마모토 대학의 동물 관리 지침법에 따라 다루었다.
세포주 및 HLA -발현
인간 췌장암 세포주인 PANC1, 인간 결장 암 세포주인 CaCo-2, 그리고 TAP-결핍, HLA-A2 (A*0201)-양성 세포주인 T2가 리켄 세포 은행(Riken Cell Bank) (Tsukuba, 일본)에서 구입하였다. 인간 췌장암 세포주인 PK8은 토호쿠 대학 (Tohoku University)(일본, 센다이), 개발, 노화 및 암의 생물의학 연구 개발 연구소의 세포 자원 센터에서 제공받았다. 인간의 간 세포주인 SKHep1은 쿠룸 대학 (Kurume University)(Kurume, 일본)의 코고 이토 박사로부터 제공받았다. HLA-A2-양성 혈액 기증자와 세포 독성 순도 분석(cytotoxicity assays)를 위한 표적 세포주를 선별하기 위해 유동 세포 분석법(flow cytometry)과 항-HLA-A2 단일 클론의 항원(mAb)를 이용하여 HLA-A2 발현(expression)을 조사하였다. 상기 세포들은 체외에서 RPMI 1640, 또는 37도의 5%의 탄소 분위기에서 10%의 FCS를 제공받는 MEM 배지에서 보관하였다.
환자, 혈액 샘플, 그리고 종양 세포들
기증자들로부터 PBMCs를 사용한 병원 조사는 일본, 쿠마모토에 위치한 쿠마모토 대학의 협회 리뷰 위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인받았다. 혈액 샘플과 암 그리고 주변의 암이 아닌 세포들은 쿠마모토 대학 병원의 환자들에게 서면 동의를 받은 후 일상적인 진료 단계에서 수득하였다. 혈액 샘플은 또한 서면 동의를 얻은 후 건강한 기증자에게서도 수득하였다. 모든 샘플은 익명이며, 랜덤으로 번호가 매겼으며, 사용하기 전까지 -80 도에서 저장하였다. 모든 환자와 건강한 기증자는 일본 국적자이다.
역전사 PCR 과 노던블랏 분석
mRNA 레벨에서의 RAB6KIFL 발현을 평가하기 위해 정상 세포와 암 세포, 세포주의 역전사 PCR(RT-PCR)을 수행하였다. 프라이머 서열(primer sequence)은 하기와 같다: RAB6KIFL, 센스 5'- CTACAAGCACCCAAGGACTCT -3'(서열번호: 6) 및 안티센스 5'- AGATGGAGAAGCGAATGTTT -3'(서열번호: 7) 및 베타-엑틴, 센스 5'- CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3'(서열번호: 8) 및 안티센스 5'- TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(서열번호: 9), 그리고 초기 변성은 94도에서 5 분간 진행하였고, 58도의 어닐링(annealing) 온도에서 32-35 증폭 사이클로 반응시켰다.
베타-액틴 mRNA를 대조군(control)으로 사용하여 정량화(normalization)한 후, 세포와 세포주의 RAB6KIFL mRNA의 활성을 비교하였다.
웨트턴 블롯 분석 및 면역 조직 화학 검사
상기 기술한 바와 같이 RAB6KIFL 단백질의 웨스컨 블로팅과 면역 조직 화학적 염색(staining)을 수행하였다(Nakatsura T, et al. Bichem Biophys Res Commun 2001; 281:936-44. Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48). 인간의 정상 세포의 웨스턴 블롯 분석을 위해, 미리 만들어진 성인의 정상 세포 블랏을 사용하였다. 여기서 사용된 일차 항체(primary antibody), 항-RAB6KIFL 다클론성 항체, 단일 클론의 항-b-액틴 항체는 베틸 실험실(Bethyl Laboratories, Inc)(미국, 텍사스, 몽고메리)과 시그마(독일, 슈타인하임)에서 각각 구입하였다. 상기 기술한 바와 같이 RAB6KIFL-A2-284 펩티드로 면역된 HLA-A2.1 (HHD) Tgm의 세포 표본의 CD4 또는 CD8의 면역 조직 화학적 염색을 수행하였다(Matsuyoshi H, et al. 2004;172:776-86).
렌티바이러스의 유전자 도입( Lentiviral gene transfer )
상기 기술된 바와 같이 랜티바이러스의 벡터를 이용한 유전자 도입을 수행하였다(Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002; 30:11-7). 구체적으로, RAB6KIFL cDNAs와 10 마이크로 그램의 pCMV-VSV-G-RAV-Rev와 pCAG-HIV gp를 지닌(carrying) 17 마이크로 그램의 CSII-CMV-RfA와 CSIIEF-RfA 자가 비활성화 벡터(Miyoshi H, et al. J Virol 1998; 72: 8150-7)를 리포 펙타민(Lipo-fectamine) 2000 시약(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, 미국)를 사용한 10 cm 배양 접시에서 배양한 293T 세포에 형질전환했다. 형질전환 60시간 후, 배지는 회수하고, 바이러스 입자들은 초원심분리(ultra-centrifugation)(50000 x g, 2시간)에 의해서 팰렛화하였다(pelleted). 팰렛(pellet)은 50 micro-L의 RPMI 1640 배지에 현탁시키고, 10 micro-L의 바이러스 현탁액(viral suspension)은 96-웰 플라이트 평저(flat-bottom)에 웰당 5 x 104 SKHep1 세포를 첨가하였다. 형질전환된 RAB6KIFL 유전자의 발현은 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.
RAB6KIFL 에 반응하는 쥐 CTLS 와 IFN -감마 효소에 연결된 면역스팟 분석( immunospot assay )의 유도
HLA-A2 (A*0201)이 암호화된 분자의 결합부위 (binding motif)를 지닌 인간의 RAB6KIFL에서 유래된 펩티드(순도 > 95%)를 BIMAS 소프트웨어 프로그램 (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD)을 이용해서 선별하고, 36개의 펩티드를 합성하였(다(American Peptide Company, CA, 미국). HLA-A2로 제한된(restricted) HIV 펩티드(SLYNTYATL)(서열번호: 10)가 관련없는 펩티드(irrelevant peptide)로 사용되었다. 펩티드로 쥐를 면역시키는 것은 앞에서 기술된 바와 같이 실행하였다(Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2003; 306:16-25). 각 펩티드와 펄스가 된 또는 되지 않은 공통 유전자(syngeneic) BM-DC(1 x 104/well)의 자극에 의해 IFN-감마/1 x 105 CD4- 비장 세포(spleen cell)를 생산하는 세포의 주기(frequency)는 이미 기술한 바와 같이 효소에 연결된 면역스팟(ELISPOT) 분석에 의해 분석하였다(Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97).
RAB6KIFL -에 반응하는 인간 CTLs 의 유도
HLA-A2(A*0201)이 암호화된 분자의 결합부위(binding motif)를 지닌 인간의 RAB6KIFL에서 유래된 펩티드(순도 > 95%)를 BIMAS 소프트웨어 프로그램 (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD)을 이용해서 선별하고, 36개의 펩티드를 합성하였다(American Peptide Company, CA, 미국)(표 1 및 2). HLA의 내용에 존재하는 펩티드에 대항한 CTL 반응을 유도하기 위해 단핵구를 유도하는(Monocyte-derived) DCs가 항원이 존재하는 세포들(antigen-presenting cells)로 사용되었다. 이미 기술한 바와 같이 DCs는 시험관 배양에서 생성하였다(Yoshitake Y, et al. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press). 보다 구체적으로, Ficoll-Plaque를 사용한 HLA-A2에 양성인 정상 공여자로부터 분리한 PBMCs 용액(GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, 영국)을 마이크로비드(microbeads)로 CD8+ 군(population)과 CD14+ 군으로 분리하였다(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일). DCs를 생성하기 위해, 100ng/mL 과립구 대식세포 집락 촉진 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(GM-CSF; Pepro Tec Inc., NJ, 미국)와 2%의 열-비활성 자가 조직의 플라즈마를 포함하는 AIM-V(Invitrogen)의 10ng/mL의 인터루킨(interleukin)(IL)-4(PeproTec)의 존재하에 상기 CD14+ 군을 배양하였다. 배양한 지 5일이 후, DCs를 성숙시키기 위해 OK-432를 접시에 첨가하였다. 사이토킨이 생성된 DCs(cytokine-generated DCs)를 배양하기 시작한지 7일이 지난 후, AIM-V에서 37 도에서 2시간 동안 4 micro g/mL 베타 2-마이크로글로블린(beta 2-microglobulin)의 존재 하에 20 ng/mL의 HLA-A2 결합 펩티드와 펄스하였다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국). DCs와 반응한 이러한 펩티드들은 그 후 방사선으로 조사하였고(irradiated)(40 Gy), 자가조직의(autologous) CD8+ T 세포들과 1대 50의 비율로 혼합하여, 항-CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec)와 함께 PBMCs의 양성 선택(positive selection)에 의해 수득하였다. 상기 배지들은 24개의 웰 플레이트에 설치하고, 각 웰은 자가조직의(autologous) 플라즈마와 2 mL의 AIM-V에서, DCs와 반응한 1 x 105 펩티드, 2 x 106 CD8+ T 세포와 5 ng/mL의 인간 재조합형(recombinant) IL-7(Wako, Osaka, 일본)를 포함한다. 2 일이 지난 후, 상기 배지들은 최종 농도가 20 IU/mL이 될때까지 인간 재조합형 IL-2 (PeproTec Inc.)를 첨가하였다. 7 일과 14 일에 같은 과정을 이용해서 펩티드가 증착된(peptide-loaded) 자가조직의 DCs의 자극(stimulation)을 추가적으로 2 주 더 수행하였다. 마지막 자극으로부터 6일이 지난 후, 유도된 CTLs의 항원 특정 반응은 51Cr 방출 분석과 IFN-감마 ELISPOT 분석(IFN-gamma ELISPOT assay)을 통해 확인하였다.
암 세포주에 대항하는 CTL 반응
지정된 effector/target ratio에서 타겟 세포(5 x 103/웰)로써, 각 암세포 또는 펩티드가 펄스된(pulsed) T2 세포와 CTLs은 같이 배양되었고, 기준 51Cr 방출 분석은 앞서 언급한 것처럼 실행하였다(Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004; 10:6437-48. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press.). 보다 구체적으로, 타겟 세포는 이산화 탄소 인큐베이터에서 37 도C에서 한 시간 동안 3.7 KBq Na2 51Cr4(Perkin Elmer Life Sciences)로 라벨을 붙였다. 라벨 붙여진 세포는 200 microL 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이드의 최종 볼륨에서 효과기 세포(effector cells)와 혼합하고, 배양하였다. 6시간의 배양 후에, 표면에 뜬 50 microL는 각 웰로부터 수집하였고, 감마 카운터를 사용해서 방사성 양을 측정하였다. 구체적인 세포독성은 구체적인 51Cr 방출 퍼센트를 계산해서 확인하였다.
HLA-class I의 블로킹, 즉 HLA-DR은 앞서 기술한 바대로 수행하였다(Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48., Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press). 구체적으로, CTLs를 51Cr 방출 분석 또는 ELISPOT 분석에서 암 세포주와 함께 배양하기 전에, 타겟 암 세포는 한 시간 동안 10 micro g/mL anti-class I mAb, W6/32 또는 10 micro g/mL anti-HLA-DR mAb, H-DR-1과 함께 배양하였고, 그리고 나서 세포독성 활성 또는 CTLs에 의한 IFN-감마의 생성의 mAbs의 영향을 검사하였다.
통계적 분석
처리 그룹 사이의 ELISPOT 분석과 암 사이즈에서 얻어진 데이터의 차이점의 통계학적 중요성을 평가하기 위해 투 테일드 스튜던트 t 테스트(Two-tailed Student's t-test)가 사용하였다. P<0.05의 값은 중요한 것으로 여겨진다. 통계학적 분석은 상업적인 통계학적 소프트웨어 패키지를 이용해 실행하였다(SPSS for Windows, version 11.0, Chicago, IL, 미국).
결과
췌장암에서 상향 조절된 rab6kifl 유전자의 판별 및 cDNA 마이크로어레이에 기초한 다양한 악성종양
27648개의 유전자를 포함하는 게놈-와이드 cDNA 마이크로어레이를 사용하여, 6개의 췌장암 세포의 유전자 발현 프로파일과 그에 근접한 정상 세포들이 미리 검사하였다. 분석이 끝난 후, 6개의 유전자가 선택하였다. 왜냐하면 이러한 유전자의 상대적인 발현율은 정상적인 세포와 비교했을 때 췌장암 세포에서 5배나 높기 때문이다(도 1A)(Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95). 상기 유전자의 발현은 4개의 배아세포를 포함한 29가지 종류의 정상 세포에서의 cDNA 마이크로 어레이 분석을 이용해서 분석하였다. 결과적으로, RAB6KIFL/KIF20A는 췌장암의 새로운 TAA로 초점이 맞춰졌다. 췌장암 세포에서의 RAB6KIFL 유전자의 발현은 테스트한 6명의 환자 모두에게서 두드러지게 강화되는 것을 확인하였다(the average of the relative expression ratio:32,000, range:15-72,000). 게다가, RAB6KIFL 유전자는 정소(testis)과 가슴샘(thymus)에서 희미하게 발현되는 것을 확인하였다(도 1B). 이전의 cDNA 마이크로어레이 분석을 토대로 보면, RAB6KIFL 유전자의 발현 레벨은 또한 폐와 방광 암에서 강화된 것을 확인하였다(도 1C)(Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400, Kitahara O, et al. Cancer Res 2001;61:3544-9, Hasegawa S, et al. Cancer Res 2002;62:7012-7, Kikuchi T, et al. Oncogene 2003; 22:2192-205, Obama K, et al. Hepatology 2005; 41:1339-48).
정상적인 장기, 암 세표계 그리고 췌장암 세포에서의 RAB6KIFL mRNA 와 단백질의 발현
RT-PCR 분석을 이용해서 mRNA 레벨의 정상 세포에서의 RAB6KIFL 유전자의 발현을 분석하였다. 정상 세포에서의 RAB6KIFL의 준정량적(semiquantitative) RT-PCR 분석은 RAB6KIFL이 오직 정소(testis)에서만 발현된다는 것을 확인하였다(도 2A). RT-PCR 분석을 이용해서 RAB6KIFL 유전자의 발현은 거의 모든 췌장 그리고 다른 HLA-A2 양성 암 세포주에서 감지되는 것을 확인하였다(도 2B).
그 뒤에, 췌장암 세포와 그에 인접한 정상 세포들의 RT-PCR 분석을 이용해서 RAB6KIFL 유전자의 발현이 분석하였고, 이는 수술로 절제하였다. RAB6KIFL 유전자의 발현은 8개의 췌장암 세포 중 5개에서 발견되었고, 정상 세포에서는 거의 발견되지 않았다(도 2C). 또한, 피부와 복막의 병소(metastatic foci)에서 상기 발현이 발견되었다.
암과 몇몇 정상 세포에서의 RAB6KIFL 단백질의 발현은 또한 웨스턴 블로팅으로 검사하였다(도 3A 및 B). RAB6KIFL 단백질은 8개의 정상 세포에서 발견되지 못했고, 정소(testis)도 PANC1 세포들의 용해물(lysate)에서 발견된 움직임과 유사한 매우 희미한 밴드만 확인하였다(도 3A). 이와는 대조적으로, RAB6KIFL 단백질은 검사한 두 명의 환자의 췌장암 세포에서 발견되었지만, 그에 인접한 정상 세포에서는 발견되지 않았다(도 3B).
RAB6KIFL의 암과 연관된 과발현을 확인하기 위해서, 면역 조직 화학 분석을 이용해 많은 파라핀이 포함된(paraffin-embedded) 췌장암 세포 표본들이 검사하였다. RAB6KIFL의 강한 염색이 주로 췌장암의 암세포의 세포질(cytoplasm)에서 발견된 반면, 매우 약한 염색이 그 그 정상 근접한 췌장암 세포의 선방 세포와 정상 선관 상피에서 발견되었다(도 4A). 또한, 유사한 강한 염색이 복막 병소에서 감지되었다(도 4A). 어떠한 염색도 암이 형성된 췌장염의 세포 표본에서 발견되지 않았다(도 4A). RAB6KIFL은 정상 뇌, 폐, 간, 신장, 복부, 소장, 결장, 비장, 골격근, 피부, 흉선(thymus) 그리고 정소(testis)에서 염색되지 않았다(도 4B).
RAB6KIFL 에서 얻어진 HLA -A2(A*0201) 결합 펩티드의 예측
표 1 및 표 2는 예상 높은 결합 친화력의 점수 순으로 RAB6KIFL 단백질의 HLA-A2(A*0201) 결합펩티드를 나타낸다. 총, 잠정적인 HLA-A2 결합력의 36개의 펩티드가 선정하였다.
RAB6KIFL로부터 분리한 HLA-A2(A*0201) 결합 9mer 펩티드
Designation start position Subsequence Score SEQ ID
204 LLSNEVIWL 459
RAB6KIFL-A2-9-12 12 LLSDDDVVV 199 서열번호:3
715 KMLEPPPSA 191
750 KLGESLQSA 164
300 SIWISFFEI 131
38 NLLSDCSVV 106
688 QLQEVKAKL 88
695 KLQQCKAEL 75
RAB6KIFL-A2-9-809 809 CIAEQYHTV 59 서열번호:4
11 GLLSDDDVV 52
436 TLGRCIAAL 49
179 ILPRSLALI 41
183 SLALIFNSL 41
625 KLNILKESL 37
781 ILIKQDQTL 36
231 GLQEEELST 31
494 TLHVAKFSA 29
556 SMYGKEELL 24
788 TLAELQNNM 20
209 VIWLDSKQI 20
스타트 포지션은 RAB6KIFL의 N-말단으로부터의 아미노산의 갯수를 나타낸다.
결합 스코어는 물질들과 방법에 의해 얻어진다.
RAB6KIFL로 부터 분리한 HLA-A2(A*0201) 결합 10mer 펩티드
Designation start position Subsequence Score SEQ ID
654 LLQEARQQSV 485
788 TLAELQNNMV 285
724 RLLRTELQKL 182
39 LLSDCSVVST 119
11 GLLSDDDVVV 106
400 KISELSLCDL 97
573 LLLKERQEKL 66
97 VLQAPKDSFA 46
RAB6KIFL-A2-10-284 284 AQPDTAPLPV 29 서열번호: 5
132 GQASFFNLTV 27
625 KLNILKESLT 26
382 SIFSIRILHL 25
203 PLLSNEVIWL 22
455 NLVPFRDSKL 21
506 QLVHAPPMQL 21
98 LQAPKDSFAL 21
66 KVYLRVRPLL 21
스타트 포지션은 RAB6KIFL의 N-말단으로부터의 아미노산의 갯수를 나타낸다. 결합 스코어는 물질들과 방법에 의해 얻어진다.
HLA -A2.1( HHD ) 이식 유전자를 가진 쥐를 이용한 RAB6KIFL -유래 및 HLA -A2-제한된 마우스 CTL 에피토프의 확인
RAB6KIFL-유래 및 HLA-A2-제한된 CTL 에피토프를 확인하기 위해, 36개의 다른 후보 펩티드들을 선별하였다. 각각은 9개 혹은 10개의 아미노산으로 구성되어 있으며, HLA-A2(A* 0201)에 높은 예상 결합값을 가지고 있고, 세상에서 가장 흔한 HLA-allelic 산물이며, NIH BIMAS에 의해 제공되는 HLA 펩티드 결합 예상 알고리즘을 기초로 하였다(표 1 및 표 2). 어떤 것이 펩티드에 반응하는 CTLs를 유도할 수 있는지 결정하기 위해서, HLA-A2.1 (HHD) Tgm에서 분리하였고, 이 36개의 펩티드들로부터 선택된 세 가지 종류의 펩티드들의 혼합물의 12가지 셋트로 자극된 BM-DCs와 두 배로 복강내 면역된 CD4-비장 세포들은 다시 실험관에서 각 펩티드와 펄스된 BM-DCs와 반응시켰다. 그 결과, CD4-비장 세포는 RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809, 그리고 RAB6KIFL-A2-10-284 펩티드와 자극받고, ELISPOT 분석에서 펩티드에 특정한 방식으로 상당한 양의 IFN 감마를 생산하였다. 이러한 CD4-비장 세포(2 x 104)는 RAB6KIFL-A2-9-12 펩티드와 펄스된 BM-DCs에 반응하여 149.0 plus/minus 22.2 spot counts/well을 보이는 반면, 펩티드 로딩(peptide loading)이 없는(P<0.01) BM-DCs의 존재하에서는 32.6 plus/minus 9.9 spot counts/well을 확인하였다. 이와 마찬가지로, RAB6KIFL-A2-809펩티드로 펄스된 BM-DCs로 자극받은 CD4-비장 세포들은 117.2 plus/minus 23.4 spot counts/well을 보이는 반면, 펩티드 로딩이 없는 BM-DCs의 존재하에서는 51.4 plus/minus 7.8 spot counts/well을 확인하였다. 더군다나, RAB6KIFL-A2-10-284로 펄스된 BM-DCs로 자극받은 CD4 비장 세포는 또한 141.2 plus/minus 5.5 spot counts/well을 보인 반면, 펩티드 로딩이 없는 BM-DCs의 존재하에서는 19.2 plus/minus 5.2 spot counts/well을 확인하였다. 이러한 결과는 RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-809 그리고 RAB6KIFL-A2-10-284 펩티드는 HLA-A2.1 (HHD) Tgm에서 HLA-A2 restricted CTL 에피토프 펩티드가 될 수 있고, 이러한 펩티드들은 인간 CTLs의 에피토프로 기대된다.
HLA -A2.1( HHD ) Tgm 의 에피토프 펩티드, RAB6KIFL -A2-9-809의 면역에 의해 유도되는 자가면역 현상의 비발현
RAB6KIFL 펩티드와 면역이 자가면역 반응을 유도하는지 유무를 조사하는 것은 매우 중요하다. 따라서 본 발명자들은 HLA-A2 (HHD)에서 항-CD4와 항-CD8dmfh 처리된 몇몇 중요기관들의 면역 조직 화학 분석을 실행했고, 이는 RAB6KIFL-A2-9-809로 두 번 백신처리된 후에 수행하였으며, 이는 인간과 쥐 RAB6KIFL 사이에서 아미노산 서열이 완전히 보존된 것이다. 그 결과, 자가면역을 나타내는 림프구 침입 또는 세포 파괴와 같은 병리학적인 변화들이 관찰되지 않았다(도 5B). 비정상적인 털, 피부, 설사 그리고 무게 감량과 같은 자가면역 질환에 감염된 마우스에게서 종종 발견되는 이상들 또한 이들 마우스에서는 발견되지 않았다. 이러한 결과들은 RAB6KIFL-A2-809 펩티드에 자극받은 림프구는 적어도 HLA-A2 Tgm에서는 정상 세포를 공격하지 않는다는 것을 나타낸다.
HLA -A2(A*0201)-양성의 건강한 기증자에의 PBMCs 으로부터의 RB6KIFL -반응 CTLs의 유도
RAB6KIFL-A2-9-12(서열번호:3), RAB6KIFL-A2-9-809(서열번호:4) 그리고 RAB6KIFL-A2-10-284(서열번호: 5) 펩티드의 자극에 의해 HLA-A2 (A*0201)에 양성인 건강한 기증자의 PBMCs로부터 RAB6KIFL-특정적인 CTLs의 생성을 수행하였다. PBMCs는 HLA-A2-양성의 건강한 기증자로부터 분리하였고, PBCMs로부터 분리된 CD8+ T 세포는 각 펩티드와 펄스된 자가 조직의 단핵구 유래 DCs와 배양하였다. 세 번의 자극 후에, 펩티드-펄스된 T2 세포에 대항한 세포독성 활동은 51Cr 방출 분석(도 6a)와 IFN-감마 ELISPOT 분석(데이타 미기재)으로 검사하였다. 두 명의 건강한 기증자의 PBMCs로부터 유도된 CTLs는 RAB6KIFL-A2-9-12(서열번호:3), RAB6KIFL-A2-9-809(서열번호: 4) 또는 RAB6KIFL-A2-10-284(서열번호:5) 펩티드에 펄스된 T2 세포에 대해 세포독성 활성을 나타냈지만, 관련없고 HLA-A2-제한된 HIV 펩티드와 펄스된 T2 세포, 또는 펩티드 로딩이 없을 시에는 나타내지 않았다. 유사한 반응이 다른 기증자에게서 관찰되었다(데이타 미기재). 상기 결과들은 CTLs가 펩티드 특정 세포독성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.
이에 이어서, 이러한 CTLs가 RAB6KIFL 및 HLA-A2 (A*0201)을 나타내는 인간 암 세포주를 죽일 수 있는지 조사하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, RAB6KIFL-A2-9-12(왼쪽), RAB6KIFL-A2-9-809(중간), 또는 RAB6KIFL-A2-10-284(오를쪽) 펩티드로 자극받은 RAB6KIFL에 반응하는 CTLs는 PANC1(RAB6KIFL+, HLA-A2+), CaCo-2(RAB6KIFL+, HLA-A2+)에 세포독성을 나타냈지만, 건강한 기증자의 PK8 (RAB6KIFL+, HLA-A2-)에는 나타내지 않는 것을 확인하였다.
게다가, RAB6KIFL 유전자로 형질전환된 SKHep1/RAB6KIFL (RAB6KIFLhigh, HLA-A2+), SKHep1(RAB6KIFLlow, HLA-A2+) 세포들(도 2B)은 이러한 펩티드들이 암세포들의 RAB6KIFL 단백질로부터 자연스럽게 처리되는지 확인하기 위해 타겟 세포로 사용하였다. 도 6c에서 나타낸 바와 같이, RAB6KIFL-A2-9-12(왼쪽), RAB6KIFL-A2-9-809(중간), 및 RAB6KIFL-A2-10-284(오른쪽) 펩티드의 자극으로 유도된 CTLs는 SKHep1/RAB6KIFL에 대해 세포독성을 나타냈지만 SKHep1/Mock에 대해서는 나타내지 않았다. 이러한 결과는 이 펩티드들이 HLA-A2 분자의 맥락의 암세포들의 표면에서 자연스럽게 진행되며 발현될 수 있다는 것을 나타낸다.
유도된 CTLs가 HLA-class I-제한된 방식에서 타겟 세포들을 인식하는지 확인하기 위해서, HLA-class I(W6/32)에 대한 mAb를 사용해 HLA-class I 블로킹 분석을 실행해 CTLs에 의한 암세포의 인식을 막았다. 그 결과, 항-HLA class I은 RAB6KIFL-A2-9-12(왼쪽), RAB6KIFL-A2-9-809(중간), 또는 RAB6KIFL-A2-10-284(오른쪽) 펩티드의 자극에 의해 생성된 CTLs의 ELISPOT 분석의 PANC1 세포의 자극을 받은 IFN-감마 제조를 현저하게 막을 수 있었고, 이는 통계적 유의성을 갖는 것을 확인하였다(도 6d, P < 0.01). 이러한 결과들은 상기 유도된 CTLs이 HLA-class I-제한된 방법에서 RAB6KIFL를 발현하는 타겟 세포들을 인식한다는 것을 나타낸다.
토론(Discussion)
실시예에 따르면, RAB6KIFL는 췌장암의 항암 면역제치료법의 촉망받는(promising) 타켓으로써 TAA임을 나타낸다. 항암 면역제 치료법을 확립하기 위해서는, 정상 세포에서는 발현되지 않지만 종양 세포에서는 강하게 발현되는 TAAs를 규명하는 것이 중요하다. cDNA 마이크로어레이 분석에 의하면 RAB6KIFL mRNA는 췌장암 세포에서 과발현되고(Imai K, Hirata S, Irie A, Senju S, Ikuta Y, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda T, Nakatsuru S, Nakagawa H, Nakamura Y, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95), 정상 세포들과 정소(testis)과 흉선(thymus)를 제외한 많은 정상 어른 세포들에서는 거의 발현되지 않는다는 것을 보여준다(도 1B). 게다가, RAB6KIFL 유전자는 췌장암에서뿐만 아니라 폐와 방광암에서도 과발현되었다(도 1C). RT-PCR 분석에서는 RAB6KIFL mRNA가 몇몇 암세포주와 췌장암 세포에 종종 발현되었지만, 정소(testis)을 제외한 골수를 포함한 정상 어른 세포에서는 발견되지 않았음을 확인하였다(도 2). 유사하게도, 웨스턴 블롯 분석과 면역 조직 화학 분석에서도 RAB6KIFL 단백질이 췌장암 세포에서는 발견되었지만, 정상 세포와 정소(testis)을 제외한 흉선(thymus)를 포함하는 정상 어른 세포에서는 발견되지 않았음을 확인하였다(도 3 및 4). 이러한 관찰 결과들은 단백질 레벨에서의 암 정소(testis) 같은 TAA로써의 RAB6KIFL의 성질을 서포트한다.
항암 면역제 치료법으로 유용한 타겟으로써 또 다른 키 포인트는 TAAs의 식별을 위해서, 암세포의 증식, 침입, 전이, 그리고 생존에 필수불가결한 항원을 고르는 것이다. 최근, Taniuchi et al.의 보고에 따르면 RAB6KIFL는 이전에 기술된 역할인 막이동(membrane traffic)(Echard A, et al. Science 1998;279:580-5)과 세포질분열(cytokinesis)(Fontijn RD, et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55, Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000; 19:5711-9)에 더해, 췌장암 발암과 연관된다(Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12). 이는 작은 간섭(small interfering) RNA에 의한 췌장암 세포에서의 내생의 RAB6KIFL의 하향 조절(down-regulation)은 디스크(disc), large homologue 5(DLG5), cargo protein of RAB6KIFL와의 접촉을 통해서 암세포 성장에 급격한 완화를 초래한다는 것을 보여줬고(Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12), 따라서 이는 RAB6KIFL가 췌장암 발암에 중요한 역할을 한다는 것을 제시하며, 따라서 항암 면역요법의 잠정적으로 유용한 타겟이 된다.
HLA-A2-제한된 에피토프 펩티드를 규명하고, 그들의 면역원성을 평가함으로써 여기서 면역요법 타겟으로써의 RAB6KIFL의 잠재력을 증명하였다. HLA-A2(HHD) Tgm을 이용한 실험에서는 세 개의 HLA-A2-제한된 RAB6KIFL 에피토프 펩티드들을 규명했고, 이 펩티드들은 림프구 침입이나 세포 파괴(도 5)와 같은 자가면역 현상을 야기하지 않고, BIMAS 알고리즘(algorithm)에 의해서 HLA-A2(A*0201)에 결합 친화력을 가질 것으로 예상되는 36개의 후보 펩티드들과 백신화된 HLA-A2-제한된 마우스 CTLs의 성장을 자극할 수 있다. 게다가, RAB6KIFL에 반응하는 CTLs는 세 명의 독립적인 건강한 기증자의 세 개의 펩티드 중 모두에서 자극받은 PBMCs로부터 생성될 수 있었다(도 6). 상기 CTLs는 유사한(cognate) 펩티드로 펄스된 T2 세포뿐만 아니라 RAB6KIFL와 HLA-A2를 모두 발현하는 암세포주도 죽일 수 있다.
이러한 펩티드에 항원 특이적인 CTLs는 CTLs가 인간 RAB6KIFL 유전자에는 형질전환된 SKHep1 세포에는 세포독성을 나타냈지만, mock-transfected SKHep1에는 나타내지 않았다는 발견들을 통해 확인하였다. 이러한 데이터들은 상기 RAB6KIFL 펩티드(RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809, 및 RAB6KIFL-A2-10-284)가 암세포의 RAB6KIFL의 단백질로부터 자연스럽게 제조된 것이고, CTLs에 의해 인식될 HLA-A2 분자와 함께 세포 표면에 나타난다. 게다가, RAB6KIFL-A2-9-809 펩티드가 암세포에서의 RAB6KIFL-A2-9-12 및 RAB6KIFL-A2-10-284 보다 RAB6KIFL 펩티드로부터 더 효율적으로 가공될 가능성이 있는데, 왜냐하면 RAB6KIFL-A2-9-809 펩티드-유도하는 CTLs는RAB6KIFL-A2-9-12 또는 RAB6KIFL-A2-10-284와의 자극으로 유도된 CTLs에 의해 매개된 세포독성과 비교했을 때 RAB6KIFL 및 HLA-A2를 발현하는 암세포에 대해 강한 세포독성을 나타내기 때문이다.
내생의 쥐 H-2b-encoded class I 분자의 발현이 없는 HLA-A2.1(HHD) Tgm가 RAB6KIFL의 HLA-A2-restricted CTL 에피토프 펩티드를 규명하기 위해 사용하였다. HLA-A2.1 (HHD) Tgm는 펩티드를 기본으로 하는 면역요법의 임상 전의 평가를 위한 다목적 동물모델이라고 보고되었다(Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25, Pascolo S, et al. J Exp Med 1997; 185: 2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999; 29: 3112-21). TAAs의 백신화에 의해 유도된 역효과를 피하기 위해, 어른 정상 세포에서 거의 발현되지 않는 RAB6KIFL가 타겟으로 선택하였다. 하지만, RAB6KIFL의 백신화가 항암 면역 요법 도중 혹은 후에 자가면역을 유도했는지를 결정하는 것은 매우 중요하다. 여기서 세 개의 에피토프 펩티드 중 두 개의 아미노산 서열은 인간과 쥐 사이에서 보존되지 않았다(RAB6KIFL-A2-9-12, 인간: LLSDDDVVV(서열번호: 3), 마우스: LLSDEDVVD(서열번호: 11); RAB6KIFL-A2-10-284, 인간: AQPDTAPLPV(서열번호: 5), 마우스: AQPDTVPVSV)(서열번호: 12). 따라서, HLA-A2 Tgm에서의 자가면역 현상은 인간과 쥐 사이에서 완벽하게 보존된 아미노산 서열의 RAB6KIFL-A2-9-809 펩티드의 두 번의 백신화 후에 조사하였다. HLA-A2 Tgm을 사용하는 장점 중 하나는 체내에서 자가면역 현상의 가능성을 조사할 수 있다는 것이다. 물론, 여기서 조사된 정상적인 세포의 갯 수는 제한적이기 때문에, 여기서 조사되지 않은 몇몇 정상 세포에서의 RAB6KIFL의 발현 가능성을 배제하는 것은 가능하지 않다. 따라서, 암 면역요법을 위한 RAB6KIFL 펩티드를 사용할 때는 자가면역 질병의 유도(induction)에 대해 조심해야 한다.
결론적으로, 최근의 결과는 RAB6KIFL는 RAB6KIFL와 HLA-A2를 발현하는 암세포에 반응하는 CTLs를 끌어낼 수 있는 에피토프 펩티드를 포함하는 TAA이라는 것을 제시한다. RAB6KIFL는 인간 악성 종양의 넓은 범위에 높이 발현되기 때문에, 따라서 RAB6KIFL는 악성 종양의 넓은 스펙트럼, 특히 췌장암의 치료의 펩티드를 기본으로 하는 면역요법의 유망한(promising) 타겟이다. 따라서 췌장암 환자의 RAB6KIFL-특이적 CTLs의 유도 능력의 추가적인 조사는 의학 출원(clinical application)에 중요한 의미를 가지는 문제로 남아있을 것이다.
본 발명은 신규한 TAAs에 대해서 기술하고 있으며, 구체적으로 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도하고 다양한 암 형태에 적용가능한 RAB6KIFL로부터 유래한 TAAs에 대해서 기술하고 있다. 이러한 TAAs는 또한 예를 들면, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종(cholangiocellular carcinoma), 식도암, 위암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 췌장암, 신장 암종 및 연조직 종양(soft tissue tumor)와 같은 암, RAB6KIFL 와 관련된 질환에 대한 펩티드 백신으로서 개발을 더욱 정당화한다.
본 발명은 명세서에서 상세하고, 이의 특이적인 실시예를 참조로 기재되어 있으나, 앞서 기술한 설명은 본질적으로 예시 및 설명이며, 본 발명과 이의 바람직한 실시예를 예시하는 바로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통해, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있으며, 본 발명의 목적 및 한계는 첨부된 청구항에 의해서 정의된다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> RAB6KIFL/KIF20A EPITOPE PEPTIDE AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> 11fpi-04-06 <150> US61/197,106 <151> 2008-10-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3471 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (497)..(3166) <400> 1 tttttcccct taagacaaag caagcaccct aaaccagtta ccctgtgcac tcctgttaag 60 attgttgcta aggaaggaca ggagttggct gctgaagcct caagatttcc tttaggctct 120 taggtaagaa atgtctaagg ttcaaggaaa aaggttaagt tggaagaatc ccaggcaaaa 180 taagtgcgaa tccacgacag ttggtaaccc ggacccacat tagaactcag aggtcaagca 240 gaagcgaacg actggaattc cagtcaggcc cgcccccttt ccttacgcgg attggtagct 300 gcaggcttcc ctatctgatt ggccgaacga acgcagcgcg taatttaaaa tattgtatct 360 gtaacaaagc tgcacctcgt gggcggagtt gtgctctgcg gctgcgaaag tccagcttcg 420 gcgactaggt gtgagtaagc cagtatccca ggaggagcaa gtggcacgtc ttcggaccta 480 ggctgcccct gccgtc atg tcg caa ggg atc ctt tct ccg cca gcg ggc 529 Met Ser Gln Gly Ile Leu Ser Pro Pro Ala Gly 1 5 10 ttg ctg tcc gat gac gat gtc gta gtt tct 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gtcagctact ctcctgaaga 3230 aataggtctc ttttatgctt taccatatat caggaattat atccaggatg caatactcag 3290 acactagctt ttttctcact tttgtattat aaccacctat gtaatctcat gttgttgttt 3350 ttttttattt acttatatga tttctatgca cacaaaaaca gttatattaa agatattatt 3410 gttcacattt tttattgaat tccaaatgta gcaaaatcat taaaacaaat tataaaaggg 3470 a 3471 <210> 2 <211> 890 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gln Gly Ile Leu Ser Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ser Asp Asp 1 5 10 15 Asp Val Val Val Ser Pro Met Phe Glu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gly 20 25 30 Ser Val Val Arg Lys Asn Leu Leu Ser Asp Cys Ser Val Val Ser Thr 35 40 45 Ser Leu Glu Asp Lys Gln Gln Val Pro Ser Glu Asp Ser Met Glu Lys 50 55 60 Val Lys Val Tyr Leu Arg Val Arg Pro Leu Leu Pro Ser Glu Leu Glu 65 70 75 80 Arg Gln Glu Asp Gln Gly Cys Val Arg Ile Glu Asn Val Glu Thr Leu 85 90 95 Val Leu Gln Ala Pro Lys Asp Ser Phe Ala Leu Lys Ser Asn Glu Arg 100 105 110 Gly Ile Gly Gln Ala Thr His Arg Phe Thr Phe Ser Gln Ile Phe Gly 115 120 125 Pro Glu Val Gly Gln Ala Ser Phe Phe Asn Leu Thr Val Lys Glu Met 130 135 140 Val Lys Asp Val Leu Lys Gly Gln Asn Trp Leu Ile Tyr Thr Tyr Gly 145 150 155 160 Val Thr Asn Ser Gly Lys Thr His Thr Ile Gln Gly Thr Ile Lys Asp 165 170 175 Gly Gly Ile Leu Pro Arg Ser Leu Ala Leu Ile Phe Asn Ser Leu Gln 180 185 190 Gly Gln Leu His Pro Thr Pro Asp Leu Lys Pro Leu Leu Ser Asn Glu 195 200 205 Val Ile Trp Leu Asp Ser Lys Gln Ile Arg Gln Glu Glu Met Lys Lys 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Asn Gly Gly Leu Gln Glu Glu Glu Leu Ser Thr Ser 225 230 235 240 Leu Lys Arg Ser Val Tyr Ile Glu Ser Arg Ile Gly Thr Ser Thr Ser 245 250 255 Phe Asp Ser Gly Ile Ala Gly Leu Ser Ser Ile Ser Gln Cys Thr Ser 260 265 270 Ser Ser Gln Leu Asp Glu Thr Ser His Arg Trp Ala Gln Pro Asp Thr 275 280 285 Ala Pro Leu Pro Val Pro Ala Asn Ile Arg Phe Ser Ile Trp Ile Ser 290 295 300 Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Leu Tyr Asp Leu Leu Glu Pro Pro 305 310 315 320 Ser Gln Gln Arg Lys Arg Gln Thr Leu Arg Leu Cys Glu Asp Gln Asn 325 330 335 Gly Asn Pro Tyr Val Lys Asp Leu Asn Trp Ile His Val Gln Asp Ala 340 345 350 Glu Glu Ala Trp Lys Leu Leu Lys Val Gly Arg Lys Asn Gln Ser Phe 355 360 365 Ala Ser Thr His Leu Asn Gln Asn Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe 370 375 380 Ser Ile Arg Ile Leu His Leu Gln Gly Glu Gly Asp Ile Val Pro Lys 385 390 395 400 Ile Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg Cys Lys 405 410 415 Asp Gln Lys Ser Gly Glu Arg Leu Lys Glu Ala Gly Asn Ile Asn Thr 420 425 430 Ser Leu His Thr Leu Gly Arg Cys Ile Ala Ala Leu Arg Gln Asn Gln 435 440 445 Gln Asn Arg Ser Lys Gln Asn Leu Val Pro Phe Arg Asp Ser Lys Leu 450 455 460 Thr Arg Val Phe Gln Gly Phe Phe Thr Gly Arg Gly Arg Ser Cys Met 465 470 475 480 Ile Val Asn Val Asn Pro Cys Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Thr Leu His 485 490 495 Val Ala Lys Phe Ser Ala Ile Ala Ser Gln Leu Val His Ala Pro Pro 500 505 510 Met Gln Leu Gly Phe Pro Ser Leu His Ser Phe Ile Lys Glu His Ser 515 520 525 Leu Gln Val Ser Pro Ser Leu Glu Lys Gly Ala Lys Ala Asp Thr Gly 530 535 540 Leu Asp Asp Asp Ile Glu Asn Glu Ala Asp Ile Ser Met Tyr Gly Lys 545 550 555 560 Glu Glu Leu Leu Gln Val Val Glu Ala Met Lys Thr Leu Leu Leu Lys 565 570 575 Glu Arg Gln Glu Lys Leu Gln Leu Glu Met His Leu Arg Asp Glu Ile 580 585 590 Cys Asn Glu Met Val Glu Gln Met Gln Gln Arg Glu Gln Trp Cys Ser 595 600 605 Glu His Leu Asp Thr Gln Lys Glu Leu Leu Glu Glu Met Tyr Glu Glu 610 615 620 Lys Leu Asn Ile Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ser Phe Tyr Gln Glu Glu 625 630 635 640 Ile Gln Glu Arg Asp Glu Lys Ile Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu Gln 645 650 655 Glu Ala Arg Gln Gln Ser Val Ala His Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu 660 665 670 Ala Leu Arg Arg Ser Gln Arg Leu Ala Ala Ser Ala Ser Thr Gln Gln 675 680 685 Leu Gln Glu Val Lys Ala Lys Leu Gln Gln Cys Lys Ala Glu Leu Asn 690 695 700 Ser Thr Thr Glu Glu Leu His Lys Tyr Gln Lys Met Leu Glu Pro Pro 705 710 715 720 Pro Ser Ala Lys Pro Phe Thr Ile Asp Val Asp Lys Lys Leu Glu Glu 725 730 735 Gly Gln Lys Asn Ile Arg Leu Leu Arg Thr Glu Leu Gln Lys Leu Gly 740 745 750 Glu Ser Leu Gln Ser Ala Glu Arg Ala Cys Cys His Ser Thr Gly Ala 755 760 765 Gly Lys Leu Arg Gln Ala Leu Thr Thr Cys Asp Asp Ile Leu Ile Lys 770 775 780 Gln Asp Gln Thr Leu Ala Glu Leu Gln Asn Asn Met Val Leu Val Lys 785 790 795 800 Leu Asp Leu Arg Lys Lys Ala Ala Cys Ile Ala Glu Gln Tyr His Thr 805 810 815 Val Leu Lys Leu Gln Gly Gln Val Ser Ala Lys Lys Arg Leu Gly Thr 820 825 830 Asn Gln Glu Asn Gln Gln Pro Asn Gln Gln Pro Pro Gly Lys Lys Pro 835 840 845 Phe Leu Arg Asn Leu Leu Pro Arg Thr Pro Thr Cys Gln Ser Ser Thr 850 855 860 Asp Cys Ser Pro Tyr Ala Arg Ile Leu Arg Ser Arg Arg Ser Pro Leu 865 870 875 880 Leu Lys Ser Gly Pro Phe Gly Lys Lys Tyr 885 890 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artifical peptide sequence <400> 3 Leu Leu Ser Asp Asp Asp Val Val Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificial peptide sequence <400> 4 Cys Ile Ala Glu Gln Tyr His Thr Val 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificial peptide 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Claims (23)

  1. 서열번호 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 분리된 올리고펩티드.
  2. 서열번호 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 올리고펩티드로서 상기 올리고펩티드는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 두 개의 치환을 가지며 세포독성 T 림프구(CTL) 유도성을 나타내는 올리고펩티드:
    (a) 서열번호 4, 3 또는 5의 아미노산 서열의 N-말단으로부터의 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환, 및
    (b) 서열번호 4, 3 또는 5의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 루신으로 치환.
  3. 삭제
  4. 약학적으로 허용가능한 담체, 및 제 1항 또는 제 2항의 하나 이상의 올리고펩티드 또는 상기 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암의 치료 또는 예방, 또는 그 수술 후의 재발을 방지하기 위한 약학적 제제.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제제는 HLA 항원이 HLA-A2인 개체로의 투여를 위해 제제화된 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 담관세포 상피성 암, 식도암, 비소세포폐암 (NSCLC), 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 제제는 백신인 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  8. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 표면에 제시하는 것을 특징으로 하는 엑소솜.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
  10. 항원제시세포(antigen-presenting cell)를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조에 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하는 방법.
  11. 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포를 유도하기 위한 시험관 내 방법:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드와 항원제시세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원제시세포에 도입시키는 단계.
  12. CTL 유도를 위한 약학적 조성물의 제조에 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하는 방법.
  13. 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 CTL 유도를 위한 시험관 내 방법:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 항원제시세포와 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 엑소솜(exosome)과 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드 및 항원제시세포의 HLA 항원의 복합체에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR) 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성의 T 세포에 도입시키는 단계.
  14. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 타겟으로 하는 분리된 CTL.
  15. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 타겟으로 하는 분리된 CTL로서 항원제시세포 표면상의 HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체에 결합할 수 있는 CTL.
  16. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하여 유도된 분리된 CTL.
  17. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하여 유도된 분리된 CTL로서, CTL을 유도하기 위하여 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의하여 유도된 CTL:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 항원제시세포와 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 엑소솜(exosome)과 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드 및 항원제시세포의 HLA 항원의 복합체에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR) 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성의 T 세포에 도입시키는 단계.
  18. HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 항원제시세포.
  19. HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 항원제시세포로서, 항원제시세포를 유도하기 위하여 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의하여 유도된 항원제시세포:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드와 항원제시세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원제시세포에 도입시키는 단계.
  20. 개체에 있어서 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신의 제조에 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분(active ingredient)을 이용하는 방법:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 하나 이상의 올리고펩티드;
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 하기 (c-1) 내지 (c-4)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 분리된 CTL;
    (c-1) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 타겟으로 하는 분리된 CTL;
    (c-2) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 타겟으로 하는 분리된 CTL로서 항원제시세포 표면상의 HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체에 결합할 수 있는 CTL;
    (c-3) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하여 유도된 분리된 CTL; 및
    (c-4) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 이용하여 유도된 분리된 CTL로서, CTL을 유도하기 위하여 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의하여 유도된 CTL:
    (가) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 항원제시세포와 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계;
    (나) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 표면에 제시하는 엑소솜(exosome)과 CD8-양성인 T 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (다) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드 및 항원제시세포의 HLA 항원의 복합체에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR) 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성의 T 세포에 도입시키는 단계; 및
    (d) 하기 (d-1) 내지 (d-2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분리된 항원제시세포;
    (d-1) HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 항원제시세포 및
    (d-2) HLA 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 항원제시세포로서, 항원제시세포를 유도하기 위하여 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의해 유도된 항원제시세포:
    (가) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드와 항원제시세포를 접촉시키는 단계; 및
    (나) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원제시세포에 도입시키는 단계.
  21. 약학적으로 허용가능한 담체, 및 제 1항 또는 제 2항의 하나 이상의 올리고펩티드, 상기 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 HLA 항원과 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드의 복합체를 표면에 제시하는, 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의하여 유도된 분리된 항원제시세포를 포함하는 시험관내에서 CTL을 유도하기 위한 조성물:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드와 항원제시세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원제시세포에 도입시키는 단계.

  22. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 활성 성분을 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물:
    (a) 제 1항 또는 제 2항의 하나 이상의 올리고펩티드;
    (b) 발현할 수 있는 형태로서 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 제시하는 하나 이상의 항원제시세포; 및
    (d) 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드 및 항원제시세포 표면의 HLA 항원의 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 CTL.
  23. 제 1항 또는 제 2항의 올리고펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
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