TW200936056A - Hypoallergenic cereal protein and uses thereof - Google Patents
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Description
200936056 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於低致敏性榖類蛋白及低致敏性榖類蛋白預 防幼小哺乳動物中對榖類蛋白之過敏反應及過敏發生的用 途其中該等哺乳動物具有發生該等過敏之風險。 * 【先前技術】 . 在大多數情況下,食物過敏(生活中首次發生之食物過 敏係牛奶過敏)係由對食物中蛋白質之反應引起。在生命 β 早期,免疫系統尚在發育中且可能不會對飲食抗原產生耐 受性(亦可將此闡述為口服耐受性誘導不充分結果為, 嬰兒或兒童或幼小動物對飲食蛋白產生誇大之免疫響應並 對其發生過敏響應。食物過敏不僅可影響人類且亦可影響 諸如狗及貓等其他哺乳動物。 通常,食物超敏反應會在易感嬰兒、兒童或幼小動物首 人遇到含潛在過敏原之新穎食物時出現。除母乳外,人類 Φ兒通常遇到之第-飲食蛋白至少係牛奶蛋白且如上所述 ® +奶過敏為人類嬰兒最常見之食物過敏。普遍認為,確定 為對牛奶過敏之嬰兒對諸如即蛋白及穀類蛋白等其他飲食 «自發生特應性疾病及過敏之風險會增大,❿即使彼等嬰 兒已成功對牛奶蛋白產生口服财受性,其亦可能隨後在斷 奶期間將諸如印蛋白及榖類蛋白等其他飲食蛋白引入食物 中時對該等飲食蛋白發生過敏。該等過敏在臨床上可表現 為特應性疾病,例如特應性皮炎、Μ及哮喘。 自飲食觀點來看,存在兩種處理確定過敏的方法-必須 136999.doc 200936056 完全避免含過敏原之食物、或必須(例如藉由深度水解)處 理該等食物以降低其致敏性。含深度水解牛奶蛋白(由不 多於五種胺基酸組成之肽)之嬰兒配方物質係出於此後一 目的而製備。同樣,在(例如)美國專利第64〇3142號中已提 出製備對於伴侣動物具有低致敏性之寵物食品,其中懷疑 動物已發生食物過敏。 然而’業内首先需要有助於降低發生過敏之風險的產 no,即可促進對完整蛋白產生耐受性的產品,對於認為具 有該風險之兒童尤其如此(即,至少一個親近家庭成員患 有過敏之兒童)。舉例而言,業内已提出飯以部分水解牛 奶蛋白來誘導嬰兒對牛奶蛋白的口服耐受性。Fritsche等 人(J_ Allergy Clin. Immuno 卜第 100卷,第二期,第 266· 273頁,1997)已使用動物模型展示水解程度為18%之牛奶 蛋白之酶水解產物能夠誘導對完整牛奶蛋白之口服耐受 性,而水解程度為28°/。之水解產物卻不能。該等實驗結果 表明,預防性傲以大鼠該適度水解之牛奶配方物質(其致 敏性已降低至標準配方物質的1/1〇〇以下)會抑制特定IgE及 介體自腸肥大細胞釋放出來,二者均為速髮型過敏反應的 參數。 業内已提出多種其他方法來改良對牛奶蛋白之口服耐受 性的誘導及由此來預防對其發生過敏,該等方法包含如 WO 2003/099037中所提出之投與益生菌及如w〇 02/051437中所提出之投與能夠增強c〇x_2活性之化合物。 如上所述,除母乳外,幼小哺乳動物通常遇到之第一飲 136999.doc 200936056 蛋白係來自其他動物之乳蛋白,例如在人類嬰兒情況下 為牛奶。通常,隨後遇到之飲食蛋白係在斷奶開始時引入 之穀類蛋白,其對於人類嬰兒而言通常呈嬰兒穀類食品形 式。即使已成功引入乳蛋白,穀類蛋白在首次引入至幼小 乳動物食物中時亦可引起過敏反應。具體而言,小麥中 之白蛋白、球蛋白、麥穀蛋白及麥膠蛋白等蛋白質與人類 嬰兒中過敏之發生有關。榖類蛋白之特定致敏性性質與該 等蛋白之特定特徵一起引起開發解決其致敏性之特定方法 © 及產品的特定需求。 然而與乳蛋白相比,人們很少關注對所確定穀類蛋白 過敏反應之初級預防。事實上,此初級預防可能更為重 要’乃因對牛奶蛋白之過敏通常在二歲至五歲時自發消失 而對穀類蛋白之過敏通常較慢消失且甚至可終生存在。因 此’榖類蛋白與乳蛋白之致敏性質有所不同。因此,本發 明之目的係在具有穀類蛋白過敏反應風險之幼小哺乳動物 中提供預防榖類蛋白過敏反應之方法。 本發明之目的係提供基於穀類蛋白之部分水解產物之製 品來降低過敏及/或誘導口服耐受性,尤其是在對一般蛋 - 白質且具體而言對榖類蛋白具有發生過敏反應風險之嬰兒 及幼小哺乳動物中。 本發明之目的係提供低致敏性穀類製品,其呈易於在水 或乳中重構成之液體或乾燥產品形式。本發明之另一目的 係提供存於亦為低致敏性之基質中的該種製品。 【發明内容】 136999.doc 200936056 因此’在第-態樣中’本發明提供穀類蛋白之部分水解 產物,其尹該水解產物之水解程度介於9%與〗之間。 在第二態樣中,本發明提供製備穀類蛋白之部分水解產 物的方法,其包括混合穀粉與水、實施初步熱處理、添加 純化蛋白酶及在介於㈣與㈣間之溫度下水解混合物3〇 分鐘至2 4 G分鐘以獲得水解程度介於9 %與〗8 %間之部分水 解產物。 在第三態樣中,本發明提供穀類產品,其包括(以乾物 質重量百分比計)1_100%之穀粉(較佳151〇〇%之穀粉)、〇_ 40%之糖、0_30%之澱粉、及〇 3〇%之脂肪;及卜㈣之 水,其中縠粉中之蛋白質經部分水解且水解程度介於9% 與1 8 /〇之間。產品可為流體或具有軟食之黏度及質地。在 -個實施例中,產品呈乾燥或實f上乾燥之粉末形式。 在第四態樣中,本發明提供初級預防幼小哺乳動物對縠 類蛋白之過敏反應的方法’其包括飯以幼小哺乳動物治療 量的水解程度介於9 %與丨8 %間之榖類蛋白之部分水解產 物。 穀類蛋白之部分水解產物之水解程度較佳介於丨1%與 16%之間。 ' 【實施方式】 在本說明書中,下列術語具有如下含義:_ 穀類蛋白」意指在諸如大米、小麥、燕麥、玉米、大 麥黑麥及其混合物等穀類中發現之具有食用價值之任何 及所有蛋白質; 136999.doc 200936056 蛋白質之「水解程度」或rDH」意指完整蛋白中在水 解期間斷裂之肽鍵數篁除以完整蛋白中之肽鍵數量所得到 之百分比; 「低致敏性(HA)榖類蛋白」意指致敏性至少低於完整縠 類蛋白之1/1〇〇的部分水解之穀類蛋白(根據£1;£)11^(^” 96/4/EC關於乳蛋白之規定推得); 「口服耐受性」意指對經由口服途徑遞送之抗原具有免 疫學低反應性的活性狀態; 「初級預防對榖類蛋白之過敏反應」意指預防該過敏反 應之發生且包含降低該過敏反應之風險; 「純化蛋白酶」意指未受其他能夠水解碳水化合物之酶 (例如α-澱粉酶)污染的蛋白酶; 糖」意#曰用於穀類產品中以提供甜味之碳水化合物, 其包含(但不限於)蔗糖、葡萄糖及果糖; 除非另有說明,否則所有提到之百分比皆係重量百分 比。在本發明產品中之特定成份之上下文中,「乾燥重量 百分比」意指表示為產品中總乾燥物質百分比之彼成份的 量。 本發明提供榖類蛋白之部分水解產物,其DH介於9%與 18%之間,較佳介於11%與16%之間。榖類可為用於食用 目的之任何縠類,其包含大米、小麥、燕麥、玉米、大 麥、黑麥及其混合物。 本發明縠類蛋白之部分水解產物之致敏性可降低至完整 穀類蛋白的1/1〇〇以下,如由1?出扣116等人所闡述之技術所 136999.doc 200936056 量測(Int· Arch. Allemppl Imm.,%,289 293,η%卜 由此可將該等部分水解之穀類蛋白及含其之產品閣述為低 致敏性。 本發明縠類蛋白之部分水解產物可由業内已知之任何適 宜方法來製備。適宜起始材料為縠粉,例如小麥粉或大米 粉。穀粉之顆粒大小並不重要且粒徑可在(例如)介於2〇〇與 500 mcm之間變化。 製備本發明之穀類部分水解產物之方法的實例如下:_ 混合縠粉與水且將混合物加熱至6〇t _65它範圍之溫度並 保持10分鐘,然後冷卻至5rc。添加諸如細菌絲胺酸内切 蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(舉例而言,以商標―⑧出售 者)等蛋白酶且將混合物於55它下保持兩小時。然後升溫 至7〇C-75t並於此保持10分鐘。將混合物再次冷卻至55 °c並添加諸如來自解澱粉芽胞桿菌π心· amy!〇liqUefacier^及蘚樣芽胞桿菌(BacWus 請⑷ (得自 N〇V〇Zymes A/S Bagsvaerd,Denmark,商標為 Protamex®)之細菌蛋白酶的混合物等不同蛋白酶。將混合 物於55〇C下再次保持兩小時,然後升溫至85t與95。匸之 間,且於此保持30分鐘時間以鈍化酶並終止水解。由此所 獲得之部分水解之穀類蛋白係呈液體形式,且可以此狀態 使用或藉由業内已知之任何適宜技術(例如滾筒乾燥、喷 霧乾燥或擠壓)將其乾燥。 本發明之穀類部分水解產物或由其製得之產品可進一步 藉由擠壓步驟進行處理。可使用業内衆所周知之任何擠壓 136999.doc 200936056 方法及設備。然而,較佳地,用雙螺桿擠壓機在如下條件 下實施擠壓步驟:速度為200_260 rpm、溫度介於13〇它與 150C之間、產物流速介於6 kg/小時與8 kg/小時之間水 流速為7-11 且壓力介於5〇_15〇巴之間。擠壓步驟使 得可獲得特定質地之產品,該產品具有特定物理特徵,例 如溶解時間、重構成後黏度及諸如此類。 製備本發明穀類蛋白之部分水解產物之尤佳方法包括: 此合縠粉與水及緩衝劑(較佳在介於7〇與8 〇間之pH下), 實施預(第一)熱處理(然而此係可選的),添加純化蛋白酶 並將混合物在4CTC至8(TC或40°C至7(TC間之溫度下(第二 熱處理)保持30分鐘至24〇分鐘,以獲得水解程度介於9%與 18%間之部分水解產物。 在本發明一個實施例中’預(第一)熱處理係在介於4(TC 至9(TC之間、較佳介於6〇。〇與8〇。(:之間實施介於丨與8小時 之間、較佳介於2與3小時間之時間段。 在本發明一個實施例中,上文之第二熱處理由漸進式熱 處理所替代.在介於2與5小時之間、較佳介於3與4小時間 之時間段内溫度自室溫緩慢升至7〇〇c或⑼它。溫度上升速 率可介於0.05°C/min與(MOt/min之間、較佳介於〇,〇8°c/ mm與〇.3°C /min之間且最佳介於O.HTC /min與〇.l5t /min之 間。視需要,可使用平臺期將水解產物保持於熱處理之最 終溫度上達另一時間段(1、2、3或5小時)。 熱處理之最佳溫度高度依賴於穀類蛋白之性質及所用 酶。已發現,高於70〇C酶活性可能降低。 136999.doc 200936056 純化之蛋白酶可為未受α_澱粉酶污染之細菌蛋白酶,諸 如以商標 Alcalase AF® 出售之酶(N〇v〇zymes A/s Bags_ vaerd,Denmark),或動物來源之蛋白酶,諸如胰蛋白酶。 如熟習此項技術者所瞭解,預熱處理之目的係促進蛋白 刀子展開,使其較易進行隨後之酶水解。預熱處理可包括 例如在熱交換器中或使用直接噴射蒸汽於5〇<5(:與丨3(rc間 之溫度加熱15秒至1 〇分鐘之時間。 較佳地,水解在介於”力與⑽它間之溫度下進行3〇分鐘 至180分鐘,較佳60分鐘至12〇分鐘時間。然而,亦可考慮 更長時間’諸如4小時或5小時。在—些情況下’極短時間 (10或15分鐘)可能有利。 在幼小哺乳動物(例如人類嬰兒及幼兒)以及幼小伴侣動 物(例如狗與貓)之食品中,可使用本發明穀類蛋白之部分 水解產物來替代完整穀類蛋白。 本發明擴展至包括如下之產品(以乾物質之重量百分比 計广1-100%之穀粉,較佳15_1〇〇%之毅粉,其巾蛋白質經 部分水解且水解程度介於9%與18%之間;〇_4〇%之糖及 0-30%之脂肪,及1%_85%之水。 本發明產品可包括天‘然或水解激粉。水解殿粉可增加水 解穀類蛋白的量。 本發月產00可呈流體(液體)形式。所出售之該等產品為 即食型(無需進一步稀釋)。 本發明產品可呈脫水粉末形式,其經製備以藉由用水或 乳重構成來食用。 136999.doc 200936056 本發明產品可呈擠壓零食產品形式,其尤其擬供幼兒食 用。 當本發明產品呈用液體(水或乳)重構成之脫水速溶粉末 形式或呈液體穀類產品形式時,本發明所涵蓋之黏度範圍 介於0 mPa.s至4000 mPa.s之間、較佳介於1〇〇〇 mPa.s與 3500 inPa’s之間。對於斷奶食物而言,所達到之黏度較佳 介於2000 mPa.s至3000 mPa.s之間。黏度量測可藉由任何 已知之標準方法來實施。上文所示值係在6〇〇c、5〇 rpm、 ® 10 min下對用水稀釋為15.6%固體之產品實施量測而得 到。 本發明之脫水榖類粉末較佳含有70%-80%之縠粉、1 〇%_ 300/。之糖(較佳15%-20%)、2%-10%之脂肪及1%_3%之水(較 佳2%-3%)。該等產品亦可包含高達20%之澱粉。其以脫水 形式出售且藉由與液體乳(或奶粉與水之混合物)混合來重 新水合以形成供食用之軟食。 較佳地’使用本發明之穀類產品混合物、水及粉末狀低 ❿ 致敏性嬰兒配方物質(即含有部分水解乳蛋白且符合
Directive 96/4/EC要求之嬰兒配方物質)來製備軟食。另 , 外,可使用即食型液體HA嬰兒配方物質來重構成該穀類 產品(若可行)。其優點在於可提供致敏性實質上降低之基 於縠類的斷奶食物,此乃因食物中之所有蛋白質皆經受部 分水解。 軟食亦可藉由混合本發明穀類產品及其他含蛋白質之低 致敏性製品來製得。 136999.doc • 14· 200936056 在本發明一個實施例中 物與低致敏性蛋製品一起提供。 本發明穀類蛋白 之部分水解產
在另一實施例中,其他低致敏性製品可包括低致敏性乳 或低致敏性嬰兒配方物質。 例中’本發㈣類蛋白之部分水解產物包括 低致敏性蛋製品及低致敏性乳或嬰兒配方物質二者。 低致敏陡蛋製品可為專利公開案歐洲專利第Ep 186723 7A1 號及 w〇 2007/144397A1 中所闌述者。 低致敏性嬰兒配方物質可為含部分水解乳蛋白且符人 Directive 96/4/EC要求之嬰兒配方物f。其優點在於可提 供致敏性實質上降低之基於穀.蛋的斷奶食物,此乃因食 物中之所有蛋白質皆經受部分水解。 在另實施例中,縠類產品進一步含有乳固體。該產品 可經製備以僅藉由與水混合來食用。同樣,乳固體(若存 在)較佳由低致敏性嬰兒配方物質提供。 本發明之液體穀類產品較佳包括5%_1〇%之穀粉、2〇/〇_ 7%之乳固體、高達15%之脂肪、高達3〇%之糖、高達5%之 澱粉及75%-90%之水》該等產品可為指定的穀類乳飲料且 通常置於開啓即食的供一次食用之盒或瓶中出售。乳固體 較佳由低致敏性嬰兒配方物質提供。 本發明之縠類產品可含有澱粉。若存在澱粉,則其可為 天然澱粉或如業内習知而製得之部分水解澱粉,例如來自 美國專利第4,3 74,860號中者。殿粉水解程度可包括介於 DE 5至DE 55之間或介於DE 20至DE 45之間且最終介於郎 136999.doc -15· 200936056 25至DE 35之間。使澱粉水解程度最優化以獲得本發明最 終應用之良好感覺及理化性質。若期望產品具有部分水解 之殿粉以及部分水解之蛋白質,則用作起始材料之穀粉可 經受兩種水解,-種針對殿粉且另一種針對蛋白質。該等 水解可同時或依序實施。 〆 除諸如彼等上述穀類產品外’本發明榖類蛋白之部分水 解產物亦可用料常含有縠粉之任何食品(例如麵食、麵 包、蛋糕、餅乾等)中之成份,舉例而言,其呈其中蛋白 質經部分水解且水解程度介於9%與18%間之穀粉形式。 如上所ϋ,初、級預防對穀類蛋白發生過敏依賴於心力誘 導對蛋白質之口服耐受性。本發明之發明者相肖,此又可 藉由在部分水解蛋白之殘餘抗原性與其誘導口服耐受性之 能力之間取得平衡來達成。通常而言,水解蛋白之殘餘抗 原性應至少低於完整蛋白抗原性之1/1〇()。 不受限於理論,發明者已證實,蛋白質性質會大大㈣ 能夠增強初級預防過敏及料口服耐受性之最佳水解程 度。蛋白質不僅隨分子量且亦且尤其隨其序列、疏水性· 親水性程度、二維結構、pKa及許多其他特徵而變化。因 此’就算能夠預測π服耐受性誘導,其亦很困難。此外, 致敏性之性質/潛能在蛋白質家族之間變化很大,而且蛋 白/宿主相互作用及免疫系統反應在蛋白質之間可能差別 Μ ’❹’關於乳蛋白之知識便不能直接再運用 於穀類蛋白。 現在將參照以下實例來進一步闡述本發明。 136999.doc 16 200936056 製備穀類部分水解產物 實例1 混合10 Kg大米粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 理以部分水解碳水化合物内容物)與23 kg水並在55°C下加 熱。製備緩衝劑(Na(OH)2或1^011)2或€&(011)2)溶液並將其 添加至混合物中以調節pH。添加5%之Protamex®酶(批號 . 為 PW2A1006,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將 混合物在55 °C下保持2小時。在該第一水解步驟後,將混 Φ 合物在90°C下加熱10分鐘。然後將混合物冷卻至55°C,添 加 5% 之 Flavourzyme® 1000 L 酶(批號為 400904, Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在 55〇C 下 保持2小時。在該第二水解步驟後,將混合物在90°C下加 熱30分鐘且然後對其實施噴霧乾燥以獲得含有DH為14.2% 之部分水解大米蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例2 混合10 Kg大米粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 〇 理以部分水解碳水化合物内容物)與23 kg水並在55°c下加 熱。製備緩衝劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並將其 添加至混合物中以調節pH(調節至pH為7.8)。添加10%之 Alcalase®2.4 L 酶(批號為 500357,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在55°C下保持2小時。在 該第一水解步驟後,將混合物在9 〇。(:下加熱10分鐘。然後 將混合物冷卻至55°C,再添加10%之Alcalase酶並將混合 物在55°C下保持2小時。在該第二水解步驟後,將混合物 136999.doc • 17· 200936056 在90°C下加熱30分鐘且然後對其實施噴霧乾燥以獲得含有 DH為15.9%之部分水解大米蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例3 混合10 Kg大米粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 理以部分水解碳水化合物内容物)與23 kg水並在55°C下加 ' 熱。製備緩衝劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並將其 • 添加至混合物中以調節pH(pH為7.8)。添加5%之 AIcalase®2.4 L 酶(批號為 500357,Novozymes A/S 〇 Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在55°C下保持2小時。在 該第一水解步驟後,將混合物在90°C下加熱10分鐘。然後 將混合物冷卻至55°C,再添加5%之Protamex®酶(批號為 PW2A1006,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混 合物在55°C下保持2小時。在該第二水解步驟後,將混合 物在90°C下加熱30分鐘且然後對其實施喷霧乾燥以獲得含 有DH為11.2%之部分水解大米蛋白的粉末,將其保存於鋁 袋申。 ❹實例4 混合15 Kg小麥粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 . 理以部分水解碳水化合物内容物)與70 kg水並在55°C下加 熱。製備緩衝劑(Na(OH)24K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並將其 添加至混合物中以調節pH。添加5%之Protamex®酶(批號 為 PW2A1006,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將 混合物在55°C下保持2小時。在該第一水解步驟後,將混 合物在90°C下加熱1〇分鐘。然後將混合物冷卻至55°C,添 136999.doc -18- 200936056 加 5% 之 Flavourzyme® 1000 L 酶(批號為 400904, Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在 55〇C 下 保持2小時❶在該第二水解步驟後,將混合物在90°C下加 熱30分鐘且然後對其實施喷霧乾燥以獲得含有DH為12.7% 之部分水解小麥蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例5(非本發明之一部分) 混合15 Kg小麥粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 理以部分水解碳水化合物内容物)與70 kg水並在55。(:下加 ❿ 熱。製備緩衝劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並將其 添加至混合物中以調節pH。添加10%之Alcalase®2.4 L酶 (批號為 500357,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並 將混合物在55°C下保持2小時。在該第一水解步驟後,將 混合物在90°C下加熱10分鐘。然後將混合物冷卻至55°C, 再添加10%之A1 calase酶並將混合物在.55°C下保持2小時。 在該第二水解步驟後,將混合物在9〇°C下加熱30分鐘、使 用4 kDa膜對其實施超過濾且然後喷霧乾燥以獲得含有DH 為20.0%之深度水解小麥蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例6 • 混合15 Kg大米粉、70 kg水及用於調節pH之緩衝劑 (Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並藉由蒸汽喷射加熱數 秒。添加 5%之 Alcalase®2.4 L AF 酶(批號為 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在 60°C 下 保持1小時。在該水解步驟後,再次藉由蒸汽喷射加熱混 合物數秒。然後對混合物實施滾筒乾燥以獲得含有DH為 136999.doc -19- 200936056 13.2%之部分水解大米蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例7 混合15 Kg小麥粉、70 kg水及用於調節pH之緩衝劑 (Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並藉由蒸汽喷射加熱數 秒。添加 5% 之 Alcalase®2.4 L AF 酶(批號為RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在 60°C 下 • 保持2小時。在該水解步驟後,再次藉由蒸汽喷射加熱混 合物數秒。然後對混合物實施滚筒乾燥以獲得含有DH為 Ο 11%之部分水解小麥蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例8 混合15 Kg榖粉混合物(大米、小麥)、70 kg水及用於調 節pH之緩衝劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並藉由蒸 汽喷射加熱數秒。添加5%之Alcalase®2.4 L AF酶(批號為 RBN00013 > Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並在 60 °C下藉由連續管對混合物實施抽吸並持續1小時。在該水 解步驟後,再次藉由蒸汽喷射加熱混合物數秒。然後對混 ® 合物實施滚筒乾燥以獲得含有DH為9.2%之部分水解大米 蛋白及穀類蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例9 混合25 Kg小麥粉及70 kg水並在130°C下加熱。添加5% 之 Alcalase®2.4 L AF 酶(批號為 RBN00013、批號為 500357,Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物 溫度經3小時自60°C升至80°C (〜〇.ll°C/min)。在該水解步 驟後,將混合物在90°C下加熱15分鐘。然後將混合物冷卻 136999.doc -20- 200936056 至60°C以用於調配步驟,然後對其實施滾筒乾燥以獲得含 有部分水解小麥蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 實例10 混合15 Kg穀粉(大米、小麥)及乳蛋白及70 kg水及用於 調節pH之緩衝劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並藉由 蒸汽喷射加熱數秒’添加5%之Alcalase®2.4 L AF酶(批號 為 RBN00013,NOVOZYMES A/S Bagsvaerd,Denmark)並 將混合物於60°C下保持1小時。在該水解步驟後,藉由蒸 φ 汽喷射加熱混合物數秒。然後對混合物實施滾筒乾燥以獲 得水解穀類粉末,將其保存於鋁袋中。 實例11 混合20 Kg小麥粉(根據美國專利第4,374,860號實施預處 理以部分水解碳水化合物内容物)及30 kg水及用於調節pH 之緩衝劑^&(011)2或〖(01^)2或Ca(OH)2)溶液,添加5%之 Alcalase®2.4 L AF 酶(批號為 RBN00013,NOVOZYMES A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物於60 °C下保持2小 ® 時。在該水解步驟後,將混合物加熱至90°C並保持15分 鐘。將蔗糖、澱粉及脂肪添加至混合物中;藉由蒸汽喷射 . 對最終混合物實施熱處理數秒且然後滾筒乾燥及研磨以獲 得水解穀類粉末,將其保存於鋁袋中。 實例12 將20 kg小麥粉(根據美國專利第4,374,860號預處理以部 分水解碳水化合物内容物)及30 kg水及用於調節pH之緩衝 劑(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液與4 kg未經處理之小 136999.doc •21 - 200936056 麥粉混合,並藉由蒸汽喷射加熱數秒;添加5%之 Alcalase®2.4L AF酶(批號為 RBN00013,NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Denmark),混合物於60°C下保持2小時。在該 水解步驟後,將混合物加熱至90°C歷時15分鐘。將蔗糖、 澱粉及脂肪添加至混合物中;最終混合物由蒸汽喷射熱處 ' 理數秒,然後經滚筒乾燥及研磨以獲得水解穀類粉末,將 • 其保存於鋁袋中。 含穀類蛋白之部分水解產物之穀類產品 ❹ 實例13 本發明榖類產品之組合物之一個實例如下(除水外,各 成份重量皆基於乾物質): 蛋白質内容物部分水解之大米粉(實例6) 60% 糖 12% 天然馬鈴薯澱粉 15% 脂肪混合物 10% 維他命/礦物質預混合物 0.5% 水 2.5% 實例14 本發明穀類產品之組合物之另一實例如下(除水外,各 成份重量皆基於乾物質): 蛋白質内容物部分水解之大米粉(實例6) 75% 糖 15% 脂肪混合物 7% 維他命/礦物質預混合物 0.5% 136999.doc -22- 200936056 水 ^ 2.5% 實例13及14之產品可藉心合實例6(對於㈣⑺或實 例3及4(對於實例14)中獲得之產品並在含有脂肪及糖之每 一情況下省去最終乾燥步驟來劁 , _ & Α 來製仟。對於習用穀類產品而 吕’對混。物實施熱處理、滚筒乾燥及研磨。此時,可藉 由乾減合來添加諸如維他命或益生菌 敏性成份。 』热瑕汪次濕 實例15
下(除水外’各成 75% 15% 7% 0.5% 本發明穀類產品之另一組合物實例如 份重量皆基於乾物質給出): 蛋白質内容物部分水解之小麥粉(實例乃 糖 脂肪混合物 維他命/礦物質預混合物 水 實例16 2.5% 本發日請體縠類產品之組合物實例如 份重量皆表示為乾物質百分比): 下(除水外,各成 蛋白質内容物部分水解之大米粉(實例3) 蛋白質内容物部分水解之小麥粉(實例4) ΗΑ嬰兒配方物質 0.5% 5% 天然澱粉 12.5% 維他命/礦物質預混合物 1.5% 水 0.5% 80% 136999.doc ❹ 200936056 實例17 本發明液體穀類產品之組合物實例如下(除水外’各成 伤重量皆表示為乾物質百分比): 蛋白質内容物部分水解之大米粉(實例3) 0.5% 蛋白質内容物部分水解之小麥粉(實例4) 5% 水解乳清蛋白 1.5% 脂肪混合物 3.5% 乳糖 7.5% 天然澱粉 1.5% 維他命/礦物質預混合物 0.5% 水 80% 實例16與17之產品可藉由在水中混合部分水解大来粉及 小麥粉以及水解乳清蛋白、乳糖、澱粉及礦物質與維他命 之預混合物來製得n將產品混合物預熱至7(rc,依 序添加脂肪混合物(僅對於實例17)並對產物實施UHT處 理,然後冷卻。在冷卻期期間,在25〇/5〇巴下對產物實施
均質化,然後將其進一步冷卻至室溫,隨後在無菌條件下 將其封裝入盒或類似容器中。 實例18 本發明穀類產品之另一組合物實例如下(除水外,各成 份重量皆基於乾物質給出): 75% 19% 蛋白質及澱粉内容物部分水解之小麥粉(實例i2) 馬鈴薯澱粉 脂肪混合物 136999.doc •24· 2% 200936056 酶 0.5% 維他命/礦物質預混合物 0.4% 缓衝鹽 0.1% 水 3% 實例19 本發明縠類產品之另一組合物實例如下(除水外,各成 份重量皆基於乾物質給出): 蛋白質部分水解之小麥粉(實例4) 50% Ο 蛋白質部分水解之乳類(如美國專利第5〇39532號) 蛋白質部分水解之蛋類(如專利w〇2〇〇7/144397ai) 馬鈴薯澱粉 脂肪混合物 酶 20% 10% 14% 2%
維他命/礦物質預混合物 緩衝鹽 水 實例20 0.5% 0.4%0.1% 3% 本發明穀類產品之另 份重量皆基於乾物質給 '組合物實例如下(除水外,各成 出): 蛋白質及澱粉内 蔗糖 谷物部分水解 之小麥粉(實例12) 65% 10% 19% 馬鈴薯澱粉 脂肪混合物 酶 2% 0.5% 136999.doc -25. 200936056 維他命/礦物質預混合物 0.4% 緩衝鹽 0«1 % ^ 3% 藉由凝膠電泳對蛋白質/肽之分析
使用NuPAGE 12% Bis-Tris凝膠及銀染色藉由SDS-聚丙 烯醢胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析酶水解對大米粉及小 麥粉中之蛋白質的影響。結果示於圖1(大米)及2(小麥) 中。在圖1中’泳道5對應於實例1之水解產物、泳道6對應 於實例2之水解產物且泳道4對應於實例3之水解產物。在 圖2中’泳道3對應於實例4之水解產物且泳道4對應於實例 5之水解產物。該等圖展示,在所有情況下,由於水解過 程’部分水解產物之蛋白質帶較完整大米粉或完整小麥粉 大大削減。 藉由Kjeldahl程序來測定水解產物中之總氮量,根據 Adler-Nissen (J. Agric. Food. Chem. 27: 1256-1262, 1979) 藉由TNB S方法來量測水解程度。 穀類水解產物之殘餘致敏性 在部分水解之前及之後,使用自敏化大鼠肥大細胞釋放 之經氣標記之血清素之功能活體外分析來測定來自大米及 小麥之潛在抗原性分子的IgE依賴性致敏性。在大米之情 況下’使用全蛋白部分,在小麥之情況下,研究著重於麥 膠蛋白’麥膠蛋白係已知與發生小麥過敏有關之小麥蛋 白。 簡言之’該方法如下:在250 ml燒瓶中於RPMI中培養 136999.doc -26 - 200936056 RBL-2H3細胞。為進行脫粒分析,去除培養基,添加4 ml 胰蛋白酶-EDTA至細胞層中並在37°C下培育10分鐘。輕輕 振蕩以分開細胞,添加6 ml RPMI並混合。將9.5 ml混合物 分配於15 ml藍頂Falcon管中;在310 g下離心5分鐘 (SorvaU,轉子75 006445)。棄除上清液,添加10 ml RPMI ' 至細胞沈澱物中,混合並在3 1 0 g下離心5分鐘。棄除上清 • 液,添加10 ml RPMI至細胞沈殿物中,混合,計數細胞並 以4xl05/ml再懸浮於RPMI中。將100 μΐ此細胞懸浮液分配 〇 至96孔Costar板之孔中。在37°c下培育該板過夜。 自每一孔中去除50 μΐ培養基並替換為50 μΐ含有1 μΐ 3H 血清素之大鼠抗過敏原(麥膠蛋白/大米蛋白)IgE抗血清; 在37°C下培育2 h。用250 μΐ HBSS輕輕洗滌所有孔兩次, 完全去除上清液並添加150 μΐ稀釋於HBSS中之過敏原標樣/ 試樣/HBSS/TritonX。在37 °C下培育45分鐘、在140 g (Mistral 2000)下離心8分鐘並將50 μΐ上清液轉移至 Optiplate中。添加200 μΐ Microsint 40、混合並計數放射性 ❹ (Topcount Packard P-計數器)。 結果示於圖3及4中,從中可得出,與對應完整榖類蛋白 . 相比,部分水解榖類具有更低的致敏性: 8-25 pg大米蛋白抗原/g蛋白質。 25-175 pg麥膠蛋白/g蛋白質。 結果表示為每克蛋白質中能夠觸發肥大細胞之大米蛋白/ 麥膠蛋白的量。 在圖3中,自左至右,第二條柱係得自實例3之水解產 136999.doc -27- 200936056 物,第三條柱係得自實例〗之水解產物且第四條柱係得自 實例2之水解產物》在圖4中,自左至右,第二條柱係㈣ 實例4之水解產物且第三條柱係得自實例5之水解產物。 藉由餵以穀類蛋白水解產物來誘導對穀類蛋白之口服 受性 使用活體内大鼠模型來研究部分水解榖類產物之口服耐 ‘ 受性誘導能力。在實驗之第卜2' 3、8、9及1〇天,藉由 管飼法將不同實驗液體穀類蛋白/縠類水解產物或水(對照) ❹ 、給與以不含榖類蛋白之食物餵養之sprague-Dawley大鼠組 (6只動物/組)。在實驗之第14天,藉由皮下注射〇」mg抗 原(麥膠蛋白/大米蛋白)+0.2 ml 3% A1(〇H)3對所有大鼠實 施免疫。在第28天,對所有動物實施全麥膠蛋白/大米蛋 白口服攻擊,2小時後屠宰動物。 大鼠肥大細胞蛋白酶(RMCPII)釋放至血液中,然後IgE 介導觸發腸肥大細胞。口服攻擊釋放RMCpn係在腸肥大 .細胞層面上IgE敏化或耐受作用狀況的量度。RMCpiI含量 係基於「夾心ELISA」原理使用商業ELISA套組(Moredun Animal Health有限公司,Edinburgh,Scotland)來測定, 其中,板塗佈有單株抗RMCPII抗體,然後添加測試血清 及與辣根過氧化物酶偶合之第二羊抗RMCpn多株抗體。 實驗1:部分水解大米蛋白之耐受作用 在第1、2、3、8、9、1〇天藉由管飼法投與下列產物。 組A.完整大米蛋白(大米粉) 組B :來自實例丨之部分水解大米蛋白 136999.doc -28- 200936056 來自實例6之部分水解大米蛋白 組D : H2〇 實驗2 :部分水解小麥蛋白之耐受作用 〇 組A :完整:二8、9、1〇天藉由管飼法投與下列產私 70整小麥蛋白(小麥粉) 、且B .來自實例5之深度水解小麥蛋白 組C .來自實例4之部分水解小麥蛋白 組D : H2〇
乎示於圖5&(完整大米蛋白,來自實例!之部分水解大 ^白)、圖完整大米蛋白,來自實例6之部分水解大米 及圖6(完整小麥蛋白,來自實例5及4之深度水解及部 水解之J、麥蛋白)中。據觀察,在攻擊之前將兩種部分 、,解大米蛋白預防性地投與至動物中,其均能夠誘導對大 米蛋白之口服耐受性’如較低釋放MCPII所示。部分水解 +麥可觀察到類似結果’其能夠料對麥膠蛋白(小 麥主要抗原)之口服耐受性。相反,深度水解小麥蛋白 能誘導耐受性。 ,圖7展示如對於其他圖所閣述之另一劑量響應口服耐受 實驗使用75 mg、15〇 mg、300 mg劑量之小麥蛋白部 分水解產物(圖7中柱2-5之rHA小麥粉」)來誘導口服耐受 f·生。作為對照,使用完整/天然小麥粉(圖7中第一柱之「小 >」)。據觀察’藉由管飼法投與少至75 mg HA小麥仍 可誘導口服耐受性。 對於圖7實驗,使用下列產品(ha小麥粉): 136999.doc -29- 200936056 混合25 Kg小麥粉、75 kg水及用於調節pH之緩衝劑 (Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)溶液並藉由蒸汽喷射加熱數 秒。添加 5%之Alcalase®2.4 L AF 酶(批號為RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)並將混合物在 6〇。〇下 保持2小時。在該水解步驟後’將混合物加熱至9〇並保 持3 0分鐘。然後對混合物實施滾筒乾燥以獲得含有為 • 11.1 %之部分水解小麥蛋白的粉末,將其保存於鋁袋中。 然後將上文處理之小麥粉(「HA小麥粉」)混合於下列組 ® 合物(除水外,各成份重量皆基於乾物質給出)中。 為了對照,在下列組合物中使用天然小麥粉(代替經處 理之HA小麥粉): 蛋白質内容物部分水解之小麥粉,如上文 797% (或天然小麥粉) 4.3% 4.3% 10% 1.7% 糖 脂肪混合物 天然澱粉 ❷ 水 【圖式簡單說明】 • 圖1展示完整及水解大米蛋白之SDS-PAGE分析; 圖2展示完整及水解小麥蛋白之SDS-PAGE分析; 圖3展示本發明水解大米蛋白之殘餘致敏性; 圖4展示本發明水解小麥蛋白之殘餘致敏性; 圖5a及5b比較得自本發明水解大米蛋白及得自完整大米 蛋白之腸肥大細胞層面的活體内耐受作用能力;且 136999.doc •30· 200936056 圖6比較得自本發明水解小麥蛋白及得自完整小麥蛋白 之腸肥大細胞層面的活體内耐受作用能力。 圖7比較得自本發明不同濃度之水解小麥 :曰及得自6 整/天然小麥蛋白之腸肥大細胞層面的活體内森 ^ 又能力。 ❹ ❹ 136999.doc .31 -
Claims (1)
- 200936056 十、申請專利範圍·· 1. -種縠類蛋自之部分水解產物,其中該水解產物之水解 程度介於9%與18%之間。 2.如請求項】之水解產物,其尹該水解程度介於㈣與⑽ 3.如請求項1或2之水解產物,其中該穀類係大米、小麥、 黑麥、玉米、燕麥或其混合物。 4_ -種製備穀類蛋白之部分水解產物的方法,其包括混合 穀粉與水,實施預熱處理,添加純化蛋白酶,及在介於 ’c與㈣間之溫度下水解該混合物3〇分鐘至⑽分鐘 以獲得水解程度介於9%與18%間之部分水解產物。 5. 如請求項4之方法,其中該預熱處理係直接蒸汽喷射。 6. 如:未項4或5之方法’其中該純化蛋白酶係Αΐ_ AF®。 7. 如請求項4至6中任一項之方法, 間之溫度下實施該水解。其中在介於50。(:與6(TC 1其中該水解實施60至 8. 如請求項4至7中任一項之方法 18 0分鐘。 9. =求項4至8中任一項之方法,其中該部分水解產物之 水解程度介於11%與16%之間。 10. 如請求項4至9中任一項之古 榖類蛋白之部分水解產物之步驟:、中該方法包括擠壓該 "•「::。,其中蛋㈣經部分水解且水解程度介於9%與 136999.doc 200936056 12. 如請求項丨丨之榖粉,其中該水解程度介於ιι%與16%之 間。 13. —種穀類產品,其以乾物質之重量百分比計包括15_ unm之如請求項H412之穀粉、〇_4〇%之糖、〇·3〇%之 澱粉及0-30%之脂肪;及1-85%之水。 14·如請求項13之穀類產品,其在6〇t/5〇 rpm之黏度介於 * 2000 mPa,s與 3000 mPa.s之間。 15. 如請求項"至14中任-項之縠類產品,其中該榖類產品 包括低致敏性卵蛋白。 16. 如請求項13至15中任一項之榖類產品,其以乾物質之重 量百分比s十包括5%-1 0°/。之如請求項〗丨或12之穀粉、2%· 7 /〇之乳固體、達15%之脂肪、達3〇%之糖及達5%之澱 粉;及75%·90%之水。 17. 如請求項16之榖類產品,其中該等乳固體係由低致敏性 嬰兒配方提供。 18. 如請求項13至17中任一項之縠類產品,其中該榖類係大 響 米、小麥、黑麥或其混合物。 19. 一種初級預防幼小哺乳動物對榖類蛋白之過敏反應的方 ' 法,其包括向該幼小哺乳動物餵以治療量的水解程度介 於9%與1 8%間之榖類蛋白之部分水解產物。 2〇_如請求項19之方法,其中該幼小哺乳動物係人類嬰兒。 21·如請求項20之方法,其中該人類嬰兒具有對飲食蛋白發 生過敏反應之風險。 22.如請求項19至21中任一項之方法,其中該水解程度介於 136999.doc 200936056 11 %與16%之間。 23. —種在具有對飲食蛋白發生過敏反應之風險的嬰兒中增 強穀類蛋白之口服耐受性的方法,其包括向幼小哺乳動 物餵以治療量的如請求項1至3中任一項之榖類之部分水 解產物。136999.doc
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