TW200927102A - Methods of treating a flaviviridae family viral infection, compositions for treating a flaviviridae family viral infection, and screening assays for identifying compositions for treating a flaviviridae family viral infection - Google Patents

Methods of treating a flaviviridae family viral infection, compositions for treating a flaviviridae family viral infection, and screening assays for identifying compositions for treating a flaviviridae family viral infection Download PDF

Info

Publication number
TW200927102A
TW200927102A TW097135844A TW97135844A TW200927102A TW 200927102 A TW200927102 A TW 200927102A TW 097135844 A TW097135844 A TW 097135844A TW 97135844 A TW97135844 A TW 97135844A TW 200927102 A TW200927102 A TW 200927102A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
alkyl
hcv
rna
inhibitor
Prior art date
Application number
TW097135844A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen R Quake
Shirit Einav
Jeffrey S Glenn
Robert Mcdowell
Wenjin Yang
Doron Gerber
Hadas Dvory-Sobol
Original Assignee
Univ Stanford
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Stanford filed Critical Univ Stanford
Publication of TW200927102A publication Critical patent/TW200927102A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/67—Phosphorus compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D235/08—Radicals containing only hydrogen and carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D235/12—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G01N2333/186—Hepatitis C; Hepatitis NANB
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

200927102 九、發明說明： 本申請案主張2007年9月18曰申請之題為"METHODS OF TREATING HEPATITIS C VIRUS INFECTION"的美國臨時 申請案第60/973,309號之優先權，該案之全文係以引用的 方式併入本文中。 此外，本申請案主張2008年8月14曰申請之題為 "METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING HEPATITIS C VIRUS INFECTION"的美國臨時申請案第61/088,759號 φ 之優先權，該案之全文係以引用的方式併入本文中。 此外，本申請案主張2008年8月28曰申請之題為 "METHODS OF TREATING A FLAVIVIRIDAE FAMILY VIRAL INFECTION，COMPOSITIONS FOR TREATING A FLAVIVIRIDAE FAMILY VIRAL INFECTION，AND SCREENING ASSAYS FOR IDENTIFYING COMPOSITIONS FOR TREATING A FLAVIVIRIDAE FAMILY VIRAL INFECTION"的美國臨時申請案第61/092,537號之優先權， 〇 該案之全文係以引用的方式併入本文中。 根據由美國國立衛生研究院（the National Institutes of Health)授予之授權號第ROl DK066793號及第IROl HG002644-01A1號，美國政府擁有本發明中之某些權利。 【先前技術】 全世界有超過1.5億人感染C型肝炎病毒（HCV)。令人遣 憾地，該等個體中之許多人不能藉助於由使用干擾素與利 巴韋林（ribavirin)之組合治療組成的當前護理標準清除其 134691.doc 200927102 感染。此外，該治療與顯著副作用有關，而不可能由許多 個體使用。因此，當前療法不適用於大多數患者，且迫切 需要治療HCV感染之新藥（參見Annals Internal Med. 132:296) 〇 9.6-kb正單鏈RNA HCV基因組編碼3,000-胺基酸聚合蛋 白’該聚合蛋白經蛋白分解方式加工為結構蛋白（其為成 熟病毒之組份）及非結構蛋白（NS)(其與複製病毒基因組有 關）(Curr Top Microbiol Immunol 242，55-84 (2000)) 〇 如 © 同其他正鏈 RNA 病毒（Β· N. Fields，D. M. Knipe 及 Ρ· Μ.
Howley(編輯），Fields Virology.(Lippincott-Raven Publications ’ Philadelphia » Pa.，1996，"The viruses and their replication"中））一樣，HCV似乎與細胞内膜結構結合而複 製。在為HCV之情況下，該等結構係稱為膜網（J Virol 76 ’ 5974-5984 (2002))且咸信其由NS4B蛋白誘導。亦需要 NS4B將其他病毒NS蛋白組裝於RNA複製之表觀位點内（J Virol 78 ’ 1 1393-1 1400 (2004))。不知病毒RNA，尤其產生 W 子代基因組所需之負鏈模板可如何併入或保持於該等複製 位點處。 此項技術中正需要治療HCV感染之藥劑；及鑑定適合於 治療HCV感染之候選藥劑的方法。 【發明内容】 簡言之，本揭示案之實施例包括組合物、醫藥組合物、 治療感染來自黃病毒科病毒之病毒的宿主之方法、治療宿 主中HCV複製之方法、抑制宿主中NS4B多肽與HCV負鏈 134691.doc 200927102 RNA之3，UTR結合之方法、治療宿主之肝臟纖維化之方 法、鑑定治療C型肝炎病毒（HCV)感染之候選藥劑的方 法，及其類似方法。 治療感染來自黃病毒科病毒之病毒的宿主之一例示性方 法尤其包括：向該宿主投與治療有效量之抑制劑以降低宿 主中之病毒負荷。 治療宿主中HCV複製之一例示性方法尤其包括：向該患 有HCV病毒感染之宿主投與抑制劑。在—實施例中，該抑 ©制劑係選自由以下各物組成之群：克立味唾（ciemiz〇ie)、 克立咪唾類似物、具有克立咪唾骨架之化合物及該等化合 物之電子等排體。 抑制宿主中NS4B多肽與HCV負鍵RNA之3，utr結合的一 例示!生方法尤其包括.向患有病毒感染之該宿主投與抑制 劑。在一實施你i中，肖抑制劑係_丨 各 群：克立味唾、克立味。坐類似物、具有克立料骨架=化 & 合物及該等化合物之電子等排體。 —治療宿主之肝臟纖維化之一例示性方法尤其包括：向該 宿主投與治療有效量之抑制劑。在一實施例中，該抑㈣ 係選自由以下各物組成之群：克立㈣、克立^坐類似 物、具有克立味喷骨架之化合物及該等化合物之電子等排 體。 -例示性組合物尤其包括：抑制劑。在一實施例中，該 抑制劑係選自由以下各物組成之群：克立咪唾、克立味唑 類似物、具有克立咪唾骨架之化合物及該等化合物之電子 134691.doc 200927102 等排體。 一例示性醫藥組合物尤其句杯. 丹巴栝.選自以下之群之化合 物：克立咪唑類似物、具有券立* 兄立水唆骨架之化合物及該等 化合物之電子等排體。 治療患有來自黃病毒科病毒之病毒的病毒感染之宿主的 一例示性醫藥組合物尤其包括：抑制劑。在—實施例中， 該抑制劑係選自由以下各物組成之群：克立咪唑類似物、 具有克立咪唑骨架之化合物及該等化合物之電子等排體。 治療患有來自黃病毒科病毒之病毒的病毒感染之宿主的 例不性組合物尤其包括：抑制劑，其中該抑制劑係選自 由以下各物組成之群：克立咪唑類似物、具有克立咪唑骨 架之化合物及該等化合物之電子等排體。 鑑定治療C型肝炎病毒（HCV)感染之候選藥劑之一例示 性方法尤其包括：i)結合HCV 3，UTR負鏈核酸之hcv NS4B多肽；及π)包含HCV 3iUTr負鏈聚核苷酸之核酸； 及b)測定（若存在）測試藥劑對於NS4B與HCV 3'UTR負鏈核 酸結合之效應’其中抑制NS4B與HCV 3，UTR負鏈核酸結 合之藥劑為治療HCV感染之候選藥劑。 【實施方式】 在更詳細描述本揭示案之前，應瞭解本揭示案並不限於 所述特定實施例，且本發明之各種實施例（當然）可進行變 化。亦應瞭解本文所用術語僅用於描述特定實施例之目 的’且不欲為限制性的，因為本揭示案之範疇僅受到隨附 申請專利範圍之限制。 134691.doc 200927102 當提供值之範圍時，應瞭解，除非内容明確另作規定， 否則在該範圍之上限與下限之間的各居中值至下限單位之 十分之一及在該所述範圍内之任何其他所述值或居中值包 涵於本揭示案中。該等較小範圍之上限及下限可獨立地包 括於較小範圍内，且亦包涵於本揭示案中，以所述範圍内 之任何、’、·！特疋排除之界限為條件。當所述範圍包括界限之 一或兩者時，排除該等所包括之界限之任一者或兩者的範 圍亦包括於本揭示案十。
❹ 除非另外定義，否則本文所用之所有科技術語均具有與 -般熟習本揭示案所屬之技術者所通常瞭解之含義相同之 含義。儘管在本揭示案之實踐或測試中亦可使用任何與本 文_所述之方法及材料類似或等效之彼等者但現仍對較 佳方法及材料進行描述。 於本說明書中所引用之所有公開案及專利係以引用的方 式并本文中’如同各個別公開案或專利經特 明以引用的方式併入一般，且 …表 相 且以引用的方式併入本文令以 揭不且描述與引用公開案有關之方法及/或材 何公開案係對於其申請日期之 用任 承切太掘-安卜 的揭不内谷，且不應視為 早於根據先前揭示案之該公開案之曰 其可茫需要供之公開曰期可能不同於實際公開曰期， 具』月b需要獨立地證實。 此項技術者在聞讀的閱讀本 見’本文所述及所說明之個別實施例二之 組份及特徵’其可在不背離者-有離黄 揭不案之範轉或精神的情功 134691.doc 200927102 :易於自其他若干實施例中之任—者之特徵分離或與之組 任何所述方法可以所述事件之次序或以邏輯上可能之 任何其他次序進行。 除非另有所述，否則本揭示案之實施例將使用合成有機 •學技術、生物化學技術、生物學技術、分子生物學技 重組0:^八技術、藥理學技術及其類似技術，該等技術 U項技術之技能範圍之内。該等技術在文獻中經充分說 明。
在詳細描述本揭示案之實施例之前，應瞭解，除非另有 所述，否則本揭示案並不限於特定材料、試劑、反應物 質、製造方法或其類似物，因此可進行變化。亦應瞭解本 文所用之術語僅為描述特定實施例之目的而並非意欲具有 限制性。在本揭示案中步驟亦可能以邏輯上可能之不同順 序進行。 應注意，如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除 非内容另作明確規定，否則單數形式”一及"該"包含複數 指不物。因此，例如"化合物"包括單一化合物及複數種化 合物。在本說明書中及隨後之申請專利範圍中’除非明確 具有相反含義，否則將參考經定義以具有以下含義之諸多 術語〇 定義 在描述及主張所揭示之標的時，將根據下述定義使用以 下術語。 黃病毒"意謂黃病毒科之任何病毒，包括彼等感染人類 134691.doc 11 200927102 及非人類動物之病毒。編碼該等病毒之聚核苷酸及多肽序 列為此項技術中所熟知，且可（例如）以Genbank寄存編號 NC_004102、AB031663、D1 1355、D11168、AJ238800、 NC—001809 、NC—001437 、NC_004355 NC_004119 、 NC_003996、NC_003690、NC_003687、NC_003675、 NC_003676、NC_003218、NC_001563、NC_000943、 NC_003679、NC—003678、NC—003677、NC一002657、 NC_002032 及 NC—001461 見於 NCBI GenBank 資料庫中，該 〇 等資料庫條目之全部内容係以引用的方式併入本文中。 如本文中所使用之術語"測定"、"量測"、"評估"及"檢測" 可互換使用，且包括定量與定性測定。 如本文中所使用之術語η微流體"裝置係指在任何給定用 途或操作期間（例如樣品製備、樣品分離、化學合成、樣 品結合、樣品洗滌等）沿流體流路操縱微量流體之任何裝 置，其中”微量"意謂約10毫微微升（femtoliter)至500 μ卜 例如約100毫微微升至約200 μΐ。微流體裝置含有至少一個 ® 流體流路，經由該流路流體流經該裝置，其中裝置中可存 在複數個流路’該等流路可交叉或可能不交叉且可以任何 便利組態定位。一般而言，本發明之方法實踐所用之微流 體裝置具有位於流體流路之一些位點處之至少一個微隔 室，其中術語"微隔室"意謂可含有微量流體之任何類型之 結構，且包括微腔室、微通道、微管道及其類似物。視微 隔室之性質而定’微隔室可為穿過裝置之整個流體流路 (例如在流體流路為微通道時）或僅佔據裝置之流體流路之 134691.doc -12- 200927102 π刀如本文中所使用之術語微腔室意謂體積介於約1 μΐ至500 μΐ才黃截面積介於約〇 〇5 ^(其中腔室深度為 μιη)至5 cm (其中腔室深度為！麵）；例如體積介於約心1 至500 μ卜橫截面積介於約〇5 cm2(其中腔室深度為_ μιη)至約5 cm (其中腔室深度為1 ;或體積介於約π μ 至200 μ卜橫截面積介於約丄cm2(其中腔室深度為細㈣ 至约4 cm (其中腔室深度為s〇〇㈣之任何結構或隔室。微 隔室結構可具有任何便利组態，包括正方形、圓形、長方 ©形、八角形、不規則形等。微通道或微管道為經定尺寸或 組態以便流體能夠藉由毛細管流動流經微通道之微隔室， 亦即微通道具有毛細管尺寸。毛細管尺寸意謂一側至另一 侧之任何橫截面尺寸（例如直徑、通道兩個壁之間的最寬 點等）均不超過約250 μηι之結構或容器。微通道之任何橫 截面尺寸可介於約10至250 μιη，通常在約5〇至2〇〇 μιη之範 圍内。流過微通道之流體亦可經加壓。 ◎ 在本文中可互換使用之術語”多肽"及"蛋白"係指具有任 何大於三之數量的胺基酸之聚合形式，其可包括編碼及非 編碼胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具 有經修飾肽主鏈之多肽。該術語包括融合蛋白，包括（但 不限於）具有異源胺基酸序列之融合蛋白，具有異源及原 生前導序列’有或無Ν末端甲硫胺酸殘基之融合物；免疫 標籤蛋白；具有可偵測之融合搭配物的融合蛋白，例如包 括作為融合搭配物之螢光蛋白、β_半乳糖苷酶、螢光素酶 等之融合蛋白；及其類似物。 I3469l.doc 200927102 術語"核酸分子"及"聚核苷酸"可互換使用且係指具有任 何大於三之數量的核苷酸（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸） 之聚合形式’或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結 構，且可執行任何已知或未知之功能。聚核苷酸之非限制 性實例包括基因、基因片段、外顯子、内含子、信息 RNA(mRNA)、轉移rna、核糖體RNA、核酶、cDNA、重 組聚核苷酸、分枝聚核苷酸、質體、載體、具有任何序列 之經分離DNA、控制區、具有任何序列之經分離rna、核 © 酸探針及引子。核酸分子可為直鏈或圓形的》 當用於經分離化合物之情形中時，如本文中所使用之術 语經分離"係指在異於化合物天然存在之環境的環境中的 所關注之化合物。"經分離"意欲包括樣品内之化合物，該 等樣品大體上富集戶斤關注之化合物且/或其巾所關注之化 合物經部分或大體上純化 80重量％純淨，至少9〇重 至少約99重量％純淨。本 。經分離之化合物通常為至少約
外消旋及經拆分之對映異構純形式及其醫藥學上可接受之 上可接受之
啟動子序列與編碼序列之間可存在未轉譯 且仍可認為啟動子序列與編碼序列" 134691.doc •14· 200927102 操作性連接”。 如本文中所使用之術語"治療"經定義為以藥劑對疾病、 病症或病狀發揮作用以減輕或改善疾病、病症或病狀之藥 理學及/或生理學效應及/或其症狀。如本文中所使用之"治 療”涵蓋對宿主（例如哺乳動物’通常為人類或獸醫相關之 非人類動物）之疾病的任何治療，且包括·⑷降低確定為 易患上該疾病但尚未診斷為感染上該疾病之個體之疾病發 生的風險，（b)阻礙疾病之發展，及⑷使疾病減輕，亦即 ©使疾病消退及/或減輕—或多個疾病症狀。”治療”亦意 涵傳遞抑制劑以提供藥理學效應，即使在無疾病或餘之 情況下。舉例而言，.·治療"包涵傳遞疾病或病原體抑制 劑，其提供個體中提高或適宜之效應（例如降低病原體負 載，減少疾病症狀等）。 如本文中所使用之術語"預防性治療"係指完全或部分預 防疾病或其症狀，且/或在部分或完全治癒疾病及/或可歸 Θ 因於該疾病之副作用方面可具有治療性。 如本文中所使用之術語"宿主”、"個體"、"患者"或"生物 體"包括人類及哺乳動物（例如小鼠、大鼠、豬、貓、犬及 馬）。本揭不案之化合物可投與之典型宿主為哺乳動物， 尤其靈長類，尤其人類。對於獸醫應用而言，廣泛多種個 體為合適的’例如家畜，諸如牛、綿羊、山羊、母牛、豬 及其類似物，家禽’諸如雞、鴨鵝、火雞及其類似物； 及馴養動物’尤其寵物，諸如犬及描。對於診斷或研究應 用而S ’廣泛多種哺乳動物為合適個體，包括齧齒動物 134691.doc •15· 200927102 諸如近親配 (例如小鼠、大鼠、倉鼠）、兔、靈長類及豬 種豬及其類似物。術語"活宿主”係指包括任何生物體或上 述彼等動物之活的宿主。術語"活宿主"係指整個宿主或生 物艘且不僅為自活宿主切除之一部分(例如肝臟或其他器 官）。 如本文中所使用之術語”單位劑型"係指適用作人類及動 物個體之整體劑量的物理上離散單位，各單位含有以足以 與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或媒劑結合產生所需效 © 應的一定量計算之預定數量之化合物（例如，如本文所述 之抗病毒化合物^單位劑型之規格視所用特定化合物及 欲達成之效應及在宿主中與各化合物相關之藥效學而定。 "醫藥學上可接受之賦形劑”、"醫藥學上可接受之稀釋 劑"、"醫藥學上可接受之載劑"及"醫藥學上可接受之佐劑" 意謂適用於製備-般安全、無毒且生物學上與其他方面均 適宜之醫藥組合物的賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑，且包 括可為獸醫用途以及人類醫藥用途所接受之賦形劑、稀釋 齊J冑劑及佐劑。如本說明書及申請專利範圍中所用之" 醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑及佐劑"包括一 種及多種該等賦形劑、稀_、制及佐劑。 本文t所用之醫藥組合物"意欲包涵適用於向個體（諸 如哺此動物’尤其人類）投與之組合物。一般而言，”醫藥 組合物”為無_ & B ^ _ 、、、 較佳不含能夠引起個體中不當反應之 〜物(例如醫藥組合物令之化合物為醫藥級卜醫藥組合 物可㈣計用於向有此需要之個體或患者經由諸多不同投 134691.doc -16 - 200927102 藥途徑投與，該等投藥途徑包括經口、頰内、經直腸、非 經腸、腹膜内、皮内、氣管内、肌肉内、皮下、吸入及其 類似途徑。 如本文中所用之術語"治療有效量"係指所投與抑制劑之 -實施例在某種程度上減輕所治療之病狀(諸如病毒感染) 的或多種'症狀之量，及/或在某種程度上預防病狀（所治 療之宿主患有或具有發展成該病症之風險）的-或多種症 狀之量。 醫藥學上了接受之鹽"係指保持游離驗之生物效率及特 性且藉由與無機酸或有機酸（諸如氫氣酸、氫溴酸、硫 酸、硝酸、碟酸、甲績酸、乙項酸、對甲苯項酸、水揚 酸蘋果酸、順丁烯二酸、琥拍酸、酒石酸、棒樣酸及其 類似物）反應獲得之鹽。 在所揭示抑制劑之實施例形成鹽的情況下，該等鹽係屬 於本揭示案之料内1非另作說明，否則提及本文之式 中之任一者之抑制劑應理解為包括提及其鹽。本文所用之 術語"鹽"表示與無機及/或有機酸及鹼所形成之酸式及/或 驗式鹽。此外，當抑制劑含有驗性部分及酸性部分時兩 1·生離子(内鹽）可形成且包括於如本文中所用之術語"鹽" 内。儘管在（例如）製備期間可用之分離或純化步驟中其他 :亦適用，但醫藥學上可接受(例如無毒、生理學上可接 鹽較佳。藥劑之化合物之鹽可(例如)藉由使該藥劑與 疋量（諸如等量）之酸或鹼在介質（諸如可使鹽沈澱之介 質）中或在水性介質中反應繼而冷凍乾燥來形成。 134691.doc -17- 200927102 ❹
含有驗性部分之藥劑之實施例可與多種有機酸及無機酸 形成鹽。例示性酸加成鹽包括乙酸鹽（諸如與乙酸或三鹵 乙酸形成之鹽，例如三氟乙酸）、已二酸鹽、海藻酸鹽、 抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫 鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸 鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烧基硫酸鹽、乙 磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫 酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫氯酸鹽（與氫氣酸形成）、氫溴 酸鹽（與溴化氫形成）、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸 鹽、順丁烯二酸鹽（與順丁烯二酸形成）、甲磺酸鹽（與甲磺 酸形成）、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果膠 酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特 戊酸鹽、丙酸鹽、水揚酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽（諸如， 與硫酸形成之鹽）、磺酸鹽（諸如，本文所提及之磺酸鹽）、 酒石酸鹽、硫氰酸鹽、曱苯續酸鹽（t〇luenesulf〇nate)(諸如 曱苯磺酸鹽（tosylate))、十一烷酸鹽及其類似鹽。 含有酸性部分之藥劑之實施例可與多種有機鹼及無機鹼 形成鹽。例示性鹼式鹽包括銨鹽；鹼金屬鹽，諸如，納、 鋰及鉀鹽；鹼土金屬鹽，諸如，鈣及鎂鹽；與諸如本乍生 (benzathine)、二環己胺、海卓胺（與NN—雙（脫氫松香基） 乙二胺形成）、N-甲基葡糖胺、N_甲基_D·葡糖醯胺^ 第三丁胺之有機鹼（例如，有機胺）形成之鹽；及與諸如精 胺酸、離胺酸之胺基酸形成之鹽；及其類似鹽。 鹼性含氮基團可用以下試劑進行第四銨化：諸如低碳烷 134691.doc •18· 200927102 基鹵化物（例如，曱基、乙基、丙基及丁基之氣化物溴 化物及碘化物）、硫酸二烷酯（例如，硫酸二甲酯、硫酸二 乙酯、硫酸二丁酯及硫酸二戊酯）、長鏈鹵化物（例如，癸 基、月桂基、十四烷基及硬脂醯基之氯化物、溴化物及峨 化物）、芳烷基幽化物（例如，苯曱基溴及苯乙基溴）及其他 物質》 八 本揭示案中所述之該等藥劑之溶劑合物亦涵蓋於本文 中。 © 在所揭示活性劑（化合物及其鹽）可以其互變異構形式存
在的情況下，所有該等互變異構形式均涵蓋於本文中作Z 本揭不案之一部分。 州、
該等試劑之所有立體異構物，諸如可由於各取代基上之 不對稱碳而存在之彼等立體異構物，包括對映異構形式 (即使在無不對稱碳的情況下其亦可存在）及非對映異構形 式，均涵蓋於本揭示案之範疇内。本文所述化合物之個別 立體異構物可（例如）大體上不含其他異構物或可混合為 (例如)外消旋體或與所有其他立體異構物或其他所選：體 異構物混合。本揭示案之化合物的立體對稱中心可具有如 IUPAC 1974 Recommendati〇n_ 定義之8或尺構型。 術語”前藥”係指活體内轉化為生物活性形式之藥劑。前 藥通常為有料’因為在一些情況下，其可能比母體化人 物更易於投與。其可能(例如)藉由經口投與而具有生物可 用性而母體化合㈣能或具有較小生物可㈣。 比母趙藥物具有改良之醫藥組合物中的溶解性。前藥可藉 134691.doc 200927102 由各種機制轉化為母體藥物，該等機制包括酶促過程及代 謝水解作用。Jucker，編輯 Progress in Drug Research， 4:221-294 中之Harper，N.J. (1962). Drug Latentiation; E. B. Roche 編輯.Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs，APhA ; Acad. Pharm. Sci. 中之Morozowich等人.（1977). Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design ; E. B. Roche，編輯.（1977). Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design，Theory and © Application，APhA ; H. Bundgaard，編輯·（ 1985) Design of Prodrugs，Elsevier ; Wang等人.（1999) Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drug，Curr. Pharm. Design. 5(4):265-287 ； Pauletti等人.（1997). Improvement in peptide bioavailability : Peptidomimetics and Prodrug Strategies，Adv. Drug. Delivery Rev. 27:235-256 ; Mizen 等人.（1998). The Use of Esters as Prodrugs for Oral Delivery of β-Lactam antibiotics > Pharm. Biotech. 1 1,:345-365 i 〇
Gaignault等人.（1996). Designing Prodrugs and Bioprecursors I. Carrier Prodrugs，Pract. Med. Chem. 671-696 ; G. L. Amidon，P. I. Lee及 E. M. Topp編輯，Transport Processes in Pharmaceutical Systems，Marcell Dekker，第 185-218頁 中之M. Asgharnejad (2000). Improving Oral Drug Transport Via Prodrugs ; Balant 等人.（1990) Prodrugs for the improvement of drug absorption via different routes of administration，Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet.， 134691.doc -20- 200927102 15(2) : 143-53 ; Balimane及 Sinko (1999). Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleoside analogues > Adv. Drug Delivery Rev. > 39(1-3):183-209 ； Browne (1997). Fosphenytoin (Cerebyx) 5 Clin. Neuropharmacol. 20(1) : 1-12 ; Bundgaard (1979). Bioreversible derivatization of drugs-principle and applicability to improve the therapeutic effects of drugs » Arch. Pharm. Chemi. 86(1): 1-39 ; H. Bundgaard編輯.（1985) Design of Prodrugs，New o York : Elsevier ; Fleisher等人.（1996). Improved oral drug delivery ： solubility limitations overcome by the use of prodrugs > Adv. Drug Delivery Rev. 19(2) : 115-130 ; Fleisher 等人.（1985). Design of prodrugs for improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting ， Methods Enzymol. 112 : 360-81 ; FarquharD，等人.（1983). Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups，J. Pharm. Sci.， 72(3) : 324-325 ; Han，H.K.等人.（2000). Targeted prodrug w design to optimize drug delivery，AAPS PharmSci.， 2(1) : E6 ; Sadzuka Y. (2000). Effective prodrug liposome and conversion to active metabolite，Curr. Drug Metab.， 1(1):31-48 ; D.M. Lambert (2000) Rationale and applications of lipids as prodrug carriers，Eur. J. Pharm. Sci.，11增子 2:S15-27 ; Wang，W.等人·（1999) Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drugs. Curr. Pharm. Des.，5(4):265-87。 134691.doc -21 - 200927102 術π技藥係指將化合物引入宿主中。本發明之實施例 的化合物之較佳投藥途徑包括經口投藥及靜脈内投藥^然 而’可使用任何投藥途徑，諸如局部、皮下、經腹膜動 脈内、吸入、經陰道、經直腸、經鼻、引入腦脊髓液中或 滴入體腔中》 術έ吾脂族基”係指飽和或不飽和直鏈或支鏈烴基且包涵 (例如）烷基、烯基及炔基。 術語"烷"或"烷基"係指具有1至12個碳原子，較佳1至8個 © 碳原子之直鏈或支鏈烴基，諸如曱基、乙基、正丙基、異 丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、戊基、己基、庚基、 正辛基、十二基、十八基、戊基、2乙基己基及其類似基 團。術浯"經取代之烷基"係指經一或多個以下基團取代之 烷基：較佳選自芳基、經取代之芳基、雜環、經取代之雜 環、碳環、經取代之碳環、函基、羥基、經保護之羥基、 烧氧基（例如C1至C7)(視情況經取代）、醯基（例如c丨至 C7)、芳氧基（例如C1至C7)(視情況經取代）、烷基酯（視情 況經取代）、芳基酯（視情況經取代）、烷醯基（視情況經取 代）、芳醯基（視情況經取代）、羧基、經保護之羧基、氰 基、硝基、胺基、經取代之胺基、（經單取代之）胺基、（經 二基取代之）胺基、經保護之胺基、醯胺基、内醯胺、脲 基、胺基曱酸酯基、續酿基等。 術語"經取代之烷基"係指經以下基團取代一至三次之以 上定義之烷基：羥基、經保護之羥基、胺基、經保護之胺 基、氰基、由基、三氟甲基、經單取代之胺基、經二取代 134691.doc •22- 200927102 之胺基、低碳燒氧基、低碳烧基硫基、缓基、經保護之缓 土或㉟基⑮基及/或經基鹽。當與雜芳基環之取代基 :〇使用時術浯’經取代之（環烷基）烷基"及"經取代之環 烷基如下文所疋義經與對於"經取代之烷基，，所列相同之 基團取代。 術。烯基係才曰具有2至12個碳原子，較佳2至4個碳原 子及至v冑碳碳雙鍵（順式或反式）之直鏈或支鍵煙基， 諸如乙稀基。術語’’經取代之稀基"係指經—或多個以下基 ©團取代之稀基··較佳選自芳基、經取代之芳基、雜環、經 取代之雜環、碳環、經取代之碳環、函基、經基、烧氧基 (視If I!取代）、芳氧基（視情況經取代）、烧基醋（視情況 經取代）、芳基酯(視情況經取代）、烷醯基(視情況經取 代）、芳醢基（視情況經取代）、氛基 '硝基、胺基、經取代 之胺基冑胺基、内醯胺、腺基、胺基甲酸醋基、續醯基 及其類似基團。
術浯炔基"係指具有2至12個碳原子，較佳2至4個碳原 子及至v個碳碳二鍵之直鍵或支鏈烴基，諸如乙块基。 術語"經取代之炔基，，係指經—或多個以下基團取代之炔 基·較佳選自芳基、經取代之芳基、雜環、經取代之雜 =奴環、經取代之碳環、画基、經基、烧氧基（視情況 ，、！取代）、芳氧基（視情況經取代）、烧基醋（視情況經取 代）、芳基視情況經取代）、燒醯基（視情況經取幻、芳 醯基（視情況經取代）、氰基、確基、胺基、經取代之胺 基、酿胺基、内醢胺、腺基、胺基甲酸醋基、伽基及其 134691.doc •23· 200927102 類似基團。 術語”烷氧基"係指與氧鍵聯之烷基，由此：R_〇_。在該 官能基中，R表示烷基。一實例為甲氧基CH3〇-。 "有機基團”可經官能化或另外包含與有機基團結合之其 他官能基’諸如羧基、胺基、羥基及其類似基團，其可經 保護或不經保護。舉例而言，詞語"烷基"意欲不僅包括純 開鏈飽和烴烷基取代基，諸如甲基、乙基、丙基、第三丁 基及其類似基團，且亦包括含有此項技術中已知之其他取 © 代基（諸如羥基、烷氧基、烷基磺醯基、鹵素原子、氰 基、硝基、胺基、羧基等）的烷基取代基。因此，"烷基"包 括謎、酯、鹵烷基、硝基烷基、羧基烷基、羥基烷基、續 酸基烷基等。 術語"齒基"及"鹵素"係指氟基、氣基、溴基或碘基。可 存在一或多個相同或不同之鹵素。尤其受關注之鹵素包括 氣基及溴基。 術語"鹵烷基"係指經一或多個鹵素原子取代之如上所定 義之烧基。鹵素原子可相同或不同。術語"二卣燒基"係指 經兩個可相同或不同之鹵基取代之上述烷基。術語"三齒 烷基"係指經三個可相同或不同之函基取代之上述烧基。 術語"全鹵烷基"係指如上所定義之鹵烷基，其中該燒基中 之各氫原子均經鹵素原子置換。術語"全氟烴基"係指如上 所定義之鹵烷基，其中該烷基中之各氫原子均經氛基 換。 Α 術語"環院基"係指完全飽和或部分不飽和之單環、雙環 134691.doc -24- 200927102 或三環飽和環。該基團之實例包括環丙基、環丁基、環戊 基、環己基、環庚基、金剛烧基、環辛基、順十氫萘或反 十氫萘、雙環[2.2.1]庚_2-烯、環己小烯基、環戊_丨·烯 基、1,4-環辛二烯基及其類似基團。 術语’·（環烷基）烷基"係指經以上所定義之烷基取代的以 上所定義之環烷基。該基團之實例包括（環己基）曱基、3_ (環丙基）-正丙基、5_(環戊基）己基、6•(金剛烷基）己基及 其類似基團。 © 術浯經取代之苯基"係指經一或多個部分，且在一些情 況下經一個、兩個或三個部分取代之苯基，該等部分選自 由以下基團組成之群：齒素、羥基、經保護之羥基、氰 基、硝基、三氟曱基、C1至C7烷基、C1至C7烷氧基、C1 至C7醯基、C1至C7醯基氧基、羧基、氧基羧基、經保護 之羧基、羧基曱基、經保護之羧基甲基、羥基曱基、經保 護之經基甲基、胺基、經保護之胺基、（經單取代之）胺 基、經保護之（經單取代之）胺基、（經二取代之）胺基、甲 〇 酿胺、經保護之甲醯胺、N-(C1至C6烷基）曱醯胺、經保護 之N-(C1至C6烷基）曱醯胺、N，N二（CuC6烷基）曱醯胺、 三氟甲基、N-((C1至C6烷基）磺醯基）胺基、N-(苯基磺醯 基）胺基或苯基，其經取代或未經取代，使得（例如）產生聯 苯基或萘基。 術語"經取代之苯基"之實例包括單基）苯基或二（鹵 基）苯基’諸如2、3或4-氣苯基，2,6-二氣苯基，2,5-二氣 苯基’ 3,4-二氣苯基，2、3或4-溴苯基，3,4-二溴苯基，3- 134691.doc -25- 200927102 氯-4-氟苯基，2、3或4-氟苯基及其類似基團；單（羥基）笨 基或二（羥基）苯基諸如，2、3或4-羥基苯基，2,4_二羥基 苯基，其經保護之-羥基衍生物及其類似基團；硝基苯 基，諸如，2、3或4-硝基苯基；氰基苯基，例如，2、3或 ‘氰基苯基；單（烷基）苯基或二（烷基）苯基，諸如，2、3 或4·甲基苯基，2,4-二f基苯基，2、3或4-(異丙基）苯基， 2、3或4-乙基苯基，2、3或4-(正丙基）苯基及其類似基 團；單（烷氧基）苯基或二（烷氧基）苯基，例如，2,6_二曱氧 © 基苯基，2、3或4-(異丙氧基）苯基，2、3或4-(第三丁氧基） 苯基，3-乙氧基-4-甲氧基苯基及其類似基團；2、3或4_三 氟甲基苯基；單羧基苯基或二羧基苯基或（經保護之羧基） 笨基，諸如，2、3或4-羧基苯基或2,4-二（經保護之羧基） 苯基；單（羥基甲基）苯基或二（羥基甲基）苯基或（經保護之 經基曱基）苯基，諸如，2、3或4-(經保護之經基甲基）苯基 或3,4-二（經基曱基）苯基；單（胺基曱基）苯基或二（胺基甲 基）本基或（經保護之胺基曱基）苯基，諸如，2、3或4-(胺 基甲基）苯基或2,4-(經保護之胺基甲基）苯基；或單（N_(甲 基績酿基胺基））苯基或二（N-(曱基磺醯基胺基））苯基，諸 如’ 2、3或4-(N-(曱基確醯基胺基））苯基。術語”經取代之 苯基”亦表示經二取代之苯基，其中取代基不同，例如為 3-甲基-4-羥基苯基、3-氣_4-羥基苯基、2-曱氧基-4-溴苯 基、4-乙基-2·羥基苯基、3-羥基-4-硝基苯基、2-羥基-4-氣苯基及其類似基團。 術語"（經取代之苯基）烷基"係指與一上述烷基連接之一 134691.doc • 26- 200927102 上述經取代之苯基。該等基團之實例包括諸如：2·苯基-卜 氯乙基、2-(4’-甲氧基笨基）乙基、4·(2，，6,_二羥基苯基）正 己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧基苯基）正戊基、3_(2,6，二甲基 苯基）正丙基、4_氣_3_胺基苯甲基、6_(4，·甲氧基苯基）_3_ 羧基（正己基）、5-(4·-胺基甲基苯基）_3_(胺基甲基）正戊 基、5-苯基_3_側氧基-正戊基、（4羥基萘_2基）尹基及 其類似基團。 〇 ❹ 術語，，芳，，或”芳基，，係指較佳具有6至12員之含芳族同素環 (亦即烴）單、雙或三環基團，諸如苯基、萘基及聯苯基。 術π經取代之芳基"係指經一或多個以下基图取代之芳 基：較/圭選自烷基、經取代之烷基、稀基(視情況經取 代）、芳基（視情況經取代）、雜環（視情況經取代）、鹵基、 經基、院氧基（視情況經取代氧基（視，障況經取代）、 烧醢基（視情況經取代）、芳酿基（視情況經取代）、垸基醋 (視it况&取代）、芳基輯（視情況經取代）、氰基確基、 胺基、經取代之胺基、醯胺基、㈣胺、腺基、胺基甲酸 S曰基續醯基等，其中視情況—或多對取代基連同其所鍵 結之原子一起形成3至7員環。 術語”雜芳基"係指具有1至4個雜原子（諸如氧、硫及/或 氮原子’尤其氮’單獨或與硫或氧環原子結合之形式)之 視情況經取代之五員或六員環。此外，上述視情況經取代 之五員或六員環可視情況與芳族5員或6員環系_合。舉 例而言，該等環可視愔伢彻# 〇方族5員或6員環系統（諸如吡 咬或三吐系統）铜合且較佳與笨環稍合。 134691.doc •27- 200927102 以下環系統為由術語"雜芳基"表示之雜環（經取代或未經 取代）基團之實例：噻吩基、呋喃基、β比略基、》比咯咬 基、咪°坐基、異噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、 四嗤基、D塞三。坐基、π惡三唾基、D比咬基、哺咬基、β比唤 基、建嗪基、噁嗪基、三唤基、嘆二嗪基、四唾基、1，5-[b]噠嗪基及嘌呤基，以及苯稠合衍生物，例如苯并噁唑 基、苯并噻唑基、苯并咪唑基及吲哚基。 上述視情況經取代之雜芳基環之取代基可包括一至三個 © 鹵基、三鹵甲基、胺基、經保護之胺基、胺基鹽、經單取 代之胺基、經二取代之胺基、羧基、經保護之羧基、羧酸 鹽、羥基、經保護之羥基、羥基鹽、低碳烷氧基、低碳烷 基硫基、烷基、經取代之烷基、環烷基' 經取代之環燒 基、（環烷基）烷基、經取代之（環烷基）烷基、苯基、經取 代之苯基、苯基烷基及（經取代之苯基）烷基。雜芳基之取 代基如上文所定義，或在三齒曱基之情況下，可為三氟甲 基、二氣甲基、二溴甲基或三碘甲基。當與以上雜芳基環 之取代基結合使用時，，，低碳烷氧基"意謂以至以烷氧基， 類似地，"低碳烷基硫基"意謂(^至以烷基硫基。 術語"雜環"、"雜環基"係指完全飽和或部分不飽和或完 全不飽和基團，包括在至少一個含碳原子環中具有至少一 個雜原子之芳族（"雜芳基"）或非芳族環基（例如3至Η員單 環、7至17負雙環或H)至2Q貝三環環系統，較佳含有總共3 至10個環原子）。含有雜原子之雜環基之各環可具有卜 2、3或4個選自氮原子、氧原子及/或硫原子之雜原子，其 134691.doc -28- 200927102 中氣及硫雜原子可視情況經氧化且氣雜原子可視情況經第 四銨化。雜環基可在環或環系統之任何雜原子或碳原子處 連接。多環雜環之環可經由一或多個螺環接稠合、橋接及/ 或接合。 ❹
例示性單環雜環基團包括吡咯啶基、吡咯基、吡唑基、 氧雜環丁烧基、吡唑琳基、咪唆基、咪吐咐基、咪唑唆 基、噁唑基、噁唑啶基、異噁唑基、異噁唑基、噻唑 基、噻二唑基、噻唑啶基、異噻唑基、異噻唑啶基、呋喃 基、四氫咬Π南基、β塞吩基、嗔二吐基、略咬基、派嗪基、 2-側氧基哌嗪基、2_側氧基哌啶基、2-側氧基吡咯啶基、 2-側氧基氮呼基、氮呼基、4-哌啶酮基、吡啶基、吡嗓 基、’变基、建°秦基、三嘻基、四氫略喃基、四》坐基、三 唾基、嗎啉基、噻嗎啉基、噻嗎啉基亞颯、噻嗎啉基硬、 1，3-二氧戊環及四氫-Μ_二侧氧基噻吩基及其類似基團。 例示性雙環雜環基團包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并噪 唑基、苯并噻吩基、Ρ昆啶基、喹啉基、四氫異喹啉基、異 喹啉基、苯并咪唑基、苯并哌喃基、吲嗪基、苯并呋喃 基、苯并呋喃基、二氫苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、 苯并間二氧雜戊烯基、二氫苯并二氧雜戊烯基、苯并二氧 己環基、啐喏啉基、喹喏啉基、吲唑基'吡咯幷吡啶2、 吱味幷Μ基（諸如㈣幷[2,3_啦錢"夫喃扣2仲比 啶基或呋味幷[2,3仲比啶基)、二氫異，嘴基、二氫喧唑 啉基（諸如3,4-二氫_4-側氧基·喹唑啉基）、四氫喹啉基、氮 雜雙環貌基（諸如6_氮雜雙環[3.2]]辛幻、氮雜螺院基（諸 134691.doc •29- 200927102 :氧“氮雜螺[4.物)，幷_基(諸如咪 3 ㈣-3·基）、三峻幷㈣基（諸如1，2,4-三唾幷 [4, -aM咬-3·基）及六氫咪唾幷吼咬基（諸如】ms泰六 氫味唾幷Π，5-小比嘴_3_基）及其類似基團。 、 例不性三環雜環基包括㈣基、苯并㈣基、啡咐基、 吖咬基、啡咬基”山基及其類似基團。 術》口經取代之雜環"及"經取代之雜環基"係指經一或多 Ο
個較佳選自以下基團之基團取代的雜環基：燒基、經取代 之院基、稀基、側氧基、芳基、經取代之芳基、雜環、經 取代之雜環、碳環（視情況經取代）、幽基、經基、垸氧基 (視If况經取代）、芳氧基（視情況經取代）、院酿基（視情況 經取代）、芳酿基（視情況經取代）、燒基醋（視情況經取 代）、芳基酯（視情況經取代）、氰基、硝基、醯胺基、胺 基絰取代之胺基、内醯胺、脲基、胺基甲酸酯基、磺醯 基等，其中視情況一或多對取代基與其所鍵結之原子一起 形成3至7員環。 術語"烷醯基"係指與羰基鍵聯之烷基（其可視情況如上所 述經取代）（亦即_c(〇)_烧基）。類似地，術語"芳醯基"係指 與羰基鍵聯之芳基（其可視情況如上所述經取代）（亦即_c(o)· 方基）。 術語"（經單取代之）胺基”係指具有一選自由以下基團組 成之群之取代基的胺基：苯基、經取代之苯基、烷基、經 取代之燒基、C1至C4醯基、C2至C7稀基、C2至C7經取代 之稀基、C2至C7炔基、C7至C16烷基芳基、C7至C16經取 13469l.<j〇c -30- 200927102 代之烷基芳基及雜芳基。（經單取代之）胺基可另外具有由 術語"經保護之（經單取代之）胺基"包涵之胺基_保護基。術 語"（經二取代之）胺基"係指具有兩個選自由以下基團組成 之群之取代基的胺基：苯基、經取代之苯基、烷基、經取 代之烷基、C1至C7醯基、C2至C7烯基、C2至C7炔基、C7 至C16烷基芳基、C7至C16經取代之烷基芳基及雜芳基。 該等兩個取代基可相同或不同。 所定義之雜 〇 ❹ 術語"雜^基（统基）"係指在任何位置經如 芳基取代之如上所定義之烷基。 ••電子等排體"為具有不同分子式但具有類似或相同外層 電子排列以及具有類似特性（例如，藥理學特性（例如藥物 代謝動力學及藥效學））之不同原子、分子或離子。 本發明之實施例提供治療黃病毒科病#感染之方法，治 療黃病#科病毒感染之組合物(包括抑制劑及藥劑之組 合），醫藥組合物，治療宿主中Hcv複製之方法抑制宿 主中刪B多肽與HCV負鏈舰之3Wr結合的方法，治療 宿主之肝臟纖維化之方法，及較治療黃病毒科病毒感染 之組合物之㈣檢測法。詳言之，本發明之實施例提供^ 型肝炎病毒引起之感染之方法及治療由C型肝炎病 毒引起之感染之組合物。 ==之實_提供包括可用於治療受到黃病 :染之宿主之藥劑的組合物(包括醫藥組合物)，在本文t 抑:劑”。詳言之，抑制劑可用於治療感染C: 肝炎病毒之宿主。抑制劑可屬於—或多個以下群組 134691.doc -31 · 200927102 咪唑、克立咪唑類似物及具有克立咪唑骨架之化合物；與 克立咪唑具有結構相似性之H1拮抗劑、H1受體拮抗劑； 西講沙星（cinoxacin)、西諾沙星類似物及具有西諾沙星骨 架之化合物；正腎上腺素、正腎上腺素類似物及具有正腎 上腺素骨架之化合物；格列本脲（glybenclamide)、格列本 脲類似物及具有格列本脲骨架之化合物；螺朵林 (spiradoline)、螺朵林類似物及具有螺朵林骨架之化合 物；托品醯胺（tropicamide)、托品醢胺類似物及具有托品 〇 醯胺骨架之化合物；下述其他抑制劑或其類似物中之一 者；及上述任一者之電子等排體；及其類似物，下文將對 其進行更詳細描述。 本發明之實施例亦提供鑑定抑制HCV NS4B與HCV RNA 結合之藥劑的活體外方法。本發明之實施例提供治療宿主 之HCV感染的方法，該等方法通常包括向該宿主投與治療 有效量之抑制NS4B與HCV RNA結合的抑制劑以降低宿主 中之病毒負荷。 ® 如實例1中所述，已觀察到HCV NS4B與HCV RNA之3'- UTR結合。本發明之實施例之某些方法使用該相互作用以 提供鑑定干擾該相互作用且因此為開發用於治療HCV感染 之藥劑候選者之抑制劑的方法。因此，本發明之實施例提 供篩選檢測法以鑑定抑制NS4B與HCV之3'-UTR結合的抑 制劑。 藉由篩選方法之一實施例所鑑別之抑制劑（包括下文所 討論之抑制劑）為開發用於治療病毒感染之藥物的候選 134691.doc -32- 200927102 者，其中該病毒為NS4B-編碼病毒。NS4B編碼病毒包括黃 病毒科病毒，其包括（但不限於）黃病毒（/7aWWrw«se)、痕病 毒及C型肝炎病毒。該等病毒亦包括黃熱病病 毒（_ye//ow /ever Wrwi1，YFV);登革病毒Wrw5)， 包括登革型1-4;日本腦炎病毒（•/apawese Wrws);澳洲墨萊溪谷腦炎病毒（Mwrraj Fa//e>>五 ν/ΓΜ·5);聖路易腦炎病毒（5Ϊ. Wrwj);西 方尼耳病毒（Few Wrw);蜱傳播腦炎病毒（HcA:-&c?rne 〇 e«ce_p/2a/z7ii v/rw·?);庫寧病毒（尺virus);中歐腦炎病 毒（Cewira/ _Ewn9/?e<3« ewce/?/m/zD Wrwi);蘇聯春夏型腦炎 病备{Russian spring-summer encephalitis virus) ’，波瓦氣病 毒Wrw·?);卡薩努森林病病毒（Kyasanur Forest disease virus);及鄂木斯克出 jk熱病毒（OwsA: Aemorr/iagk fever virus) ° 根據本發明之實施例的抑制劑（例如抗HCV劑）之鑑定及 其在抑制HCV複製及治療HCV感染中之用途尤其受關注。 ® 欲抑制之HCV可具有任何基因型（基因型1、2、3、4、5、 6及其類似基因型）以及任何HCV基因型之亞型（例如la、 lb、2a、2b、3a等）。由於當前HCV基因型1通常最難以治 療，故應用本發明之實施例之方法及藥劑治療感染HCV基 因型1及基因型1亞型尤其受關注。 雖然以下說明書中提及HCV，但該提及僅為清晰說明且 並非意欲將以下揭示内容限於HCV。如上所述，本揭示案 可應用於任何編碼核苷酸結合NS4B蛋白之病毒（例如具有 134691.doc -33- 200927102 結合HCV負鏈RNA之3I-UTR的NS4B多肽之黃病毒）。 篩選方法 本發明之實施例提供鑑定調節RNA與RNA結合蛋白結合 之藥劑（抑制劑）的活體外無細胞法。該等方法通常包括在 微流體裝置中使（例如）測試藥劑與RNA及活體外轉錄且轉 譯之結合RNA的蛋白接觸；及偵測（若存在）測試藥劑對 RNA與蛋白結合之效應。因此，本發明之實施例提供鑑定 調節膜結合蛋白活性之藥劑的活體外無細胞法（cell-free G method)。該等方法之實施例通常包括在微流體裝置中使 (例如）測試藥劑與膜結合蛋白接觸；及測定（若存在）測試 藥劑對膜結合蛋白活性之效應。 在一實施例中，本發明提供鑑定抑制NS4B與HCV RNA，尤其HCV之3’-UTR結合之藥劑的活體外無細胞方 法。該等方法通常包括使HCV 3’-UTR結合NS4B多肽與 HCV 3'-UTR在測試藥劑存在下接觸；及偵測（若存在）測試 藥劑對NS4B多肽與HCV3’-UTR結合之效應。 ® 適用於篩選方法之一實施例中的NS4B多肽結合負鏈 HCV RNA之 3’UTR(SEQ ID NO:2，圖 3)。在一實施例中， 合適NS4B多肽以約1 nM至6 nM(例如約1 nM至1.5 nM、約 1.5 nM至 2 nM、約 2 nM至 2.5 nM、約 2.5 nM至 3 nM、約 3 nM至3.5nM、約3.5nM至4nM、約4nM至4·5nM、約4.5 nM至5 nM或約5 nM至6 nM)之Kd結合負鏈HCV RNA之 3'UTR。
適用於該篩選方法之實施例中的HCV 3'-UTR負鏈RNA 134691.doc •34- 200927102 結合NS4B多肽包括包含以下結構域之NS4B多肽，該結構 域結合（以核苷酸非依賴型方式）在圖3中所述之核苷酸序列 (SEQ ID NO:2)之約1〇〇個核苷酸至約200個核苷酸之區 段、約200個核苷酸至約300個核苷酸之區段、約300個核 苷酸至約400個核苷酸之區段、約400個核苷酸至約500個 核苷酸之區段或整個長度（其為HCV基因組之負鏈的 3’UTR)上具有至少約80%、至少約85%、至少約90°/。、至 少約95%、至少約98%、至少約99°/。或100%—致性的核苷 Ο 酸序列之至少15、至少20、至少25、至少3 0、至少3 5、至 少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少125、至 少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少 275、至少300、至少325、至少350、至少400、至少450、 至少500或至少525個鄰接核苷酸之區段。 舉例而言，在一些實施例中，合適NS4B結合在圖3中所 述之核苷酸序列（SEQ ID NO:2)之約1〇〇個核苷酸至約2〇〇 個核苷酸之區段、約200個核苷酸至約300個核苷酸之區 段、約300個核苷酸至約400個核苷酸之區段、約4〇〇個核 苷酸至約500個核苷酸之區段上或在整個長度上具有至少 約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約 98%、至少約99°/❶或100% —致性的核苷酸序列之約丨5至 20、約20至25、約25至30、約30至35、約35至40、約40至 45、約45至50、約50至75、約75至1〇〇、約1〇〇至125、約 125 至 150、約 150 至 175、約 175 至 200、約 200 至 225、約 225 至 250、約 250 至 275、約 275 至 300、約 300 至 325、約 134691.doc •35- 200927102 325至350、約350至400、約400至450、約450至500或約 500至525個鄰接核苷酸之區段。 在一實施例中，合適NS4B多肽包含在圖7B中所述胺基 酸序列（SEQ ID NO:13)之約1〇〇個鄰接胺基酸至150個鄰接 胺基酸之區段、約150個鄰接胺基酸至約200個鄰接胺基酸 之區段、約200個鄰接胺基酸至約250個鄰接胺基酸之區段 上或在整個261個鄰接胺基酸上具有至少約75%、至少約 80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約 Ο 98%、至少約99%或1 00%胺基酸序列^致性的胺基酸序 列。 在一些實施例中，與圖7B中所述之胺基酸序列相比，合 適NS4B多肽包含一個、兩個、三個、四個、五個、六 個、七個、八個、九個、十個或十至十五個胺基酸序列取 代物。在一些實施例中，合適NS4B多肽在核苷酸結合基 元（例如GSVGGLGK，SEQ ID No. 16 ;圖7B中所述胺基酸 序列中之胺基酸130-136)中包含一或多個胺基酸取代物以 〇 W 便NS4B多肽不結合GTP但保持與負鏈3’UTR RNA(SEQ ID No.1)結合。 在一實施例中，NS4B多狀為融合蛋白’例如包含以下 各物之多肽：NS4B多肽及異源（非NS4B)多肽（例如融合搭 配物），其中合適異源多肽（融合搭配物）包括（但不限於）抗 原決定基標記（例如谷胱甘肽-S-轉移酶、血球凝集素 (HA;例如 CYPYDVPDYA(SEQ ID No. 17))、FLAG(例如 DYKDDDDK，SEQ ID No. 18)、c-myc(例如 CEQKLISEEDL， 134691.doc •36- 200927102 SEQ ID No. 19)及其類似物）；提供可偵測信號之多肽（例 如將又質轉化為可比色、螢光偵測之產物及其類似物的 酶，其中合適酶包括（但不限於）螢光素酶、鹼性磷酸酶過 氧化酶及其類似物；螢光蛋白（例如綠色螢光蛋白、紅色 榮光蛋白、黃色螢光蛋白及其類似物）；發光蛋白；及其 類似物）；提供多肽純化便利之多肽（例如金屬離子親和 狀’例如（His)n，例如6His，及其類似物；谷胱甘肽_s_轉 移酶’及其類似物）；提供插入真核細胞膜中之多肽；提 © 供溶解性之多肽；提供與另一部分、固體載體之連接的多 狀’及其類似物。在一實施例中，NS4B多肽亦可經可债 測標記’例如以放射性標記來標記。在一實施例中， NS4B多肽經生物素標記。 在一實施例中，用於該檢測法之NS4B多肽經可偵測標 記’例如直接經可偵測標記。合適之可偵測標記包括（例 如）放射性標記；作用於受質以產生有色發光或螢光產物 ❹ 之酶；螢光蛋白（例如綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅 色榮光蛋白及其類似物）；螢光團（例如螢光素、若丹明 (rhodamine)、四甲基若丹明、伊紅、赤藻紅、香豆素、曱 基-香豆素、芘、孔雀石綠、芪、螢光黃、Cascade Blue 、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705及俄勒岡 綠）；及其類似物。在一實施例中，NS4B多肽在（例如）使 用包括饋有螢光標記胺基酸之tRNA之活體外轉錄/轉譯系 統之活體外轉譯期間經標記》 134691.doc •37- 200927102 在一實施例中’ NS4B多肽固定於固體載體上。NS4b多 肽可直接或間接固定於固體載艎上。在一實施例中，間接 固定可藉由將特異性結合NS4B之抗體固定於固體載體上 達成。 在一實施例中，NS4B多肽可在活體外產生，例如NS4B 多肽可以化學方式合成；藉由細胞活體外重組產生；或可 使用活體外轉錄/轉譯系統產生。活體外轉錄/轉譯系統為 此項技術中已知’且可使用任何已知活體外轉錄/轉譯系 © 統或其合適修改系統。舉例而言’可使用兔網狀紅血球活 體外轉錄/轉譯系統。作為另一實例，可使用T7偶合小麥 胚芽提取混合物（諸如由Promega出售之彼等者藉由活 體外轉錄及轉譯製備多肽之方法為此項技術中已知。參見 (例如）"Methods in Molecular Biology : In vitro Transcription and Translation Protocols" (2007) Guido Grandi編輯，Humana Press。 在一實施例中，NS4B多肽經純化，例如NS4B多肽為至 少約80°/。、至少約85%、至少約90%或至少約95%純的。在 其他實施例中，NS4B多肽未經純化，例如NS4B多肽係小 於80%、小於75%、小於50%純或小於25%純的。舉例而
言’若使用活體外轉錄/轉譯系統製備NS4B多肽，則NS4B 多肽可不經進一步純化直接自活體外轉錄/轉譯系統使 用0 在一實施例中，NS4B多肽與脂質雙層（例如微粒體膜製 備物）結合。在一實施例中，NS4B多肽插入脂質雙層中且 134691.doc -38 - 200927102 展現天然拓撲結構》在一實施例中，NS4B多肽在轉譯（例 如在活體外轉錄/轉譯系統中）之後立即插入脂質雙層中。 在一實施例中，NS4B多肽可在一檢測方法中以約1阿托 莫耳（attomole)至1飛莫耳（femtomole)、約1飛莫耳至1皮莫 耳、約1皮莫耳至1奈莫耳、約1奈莫耳至50奈莫耳、約50 奈莫耳至100奈莫耳、約100奈莫耳至500奈莫耳、約500奈 莫耳至 1 μηιοί、約 1 μπιοί 至 50 μιηοΐ、約 50 μιηοΐ 至 100 μιηοΐ、約 100 μιηοΐ至 500 μιηοΐ、約 500 μπιοί至 1 mmol、約 〇 1 mmol 至 50 mmol、約 50 mmol 至 100 mmol 或大於 100 mmol之量存在。 本揭示案之實施例包括與在無測試試劑之情況下NS4B 多肽與HCV負鏈RNA之3'UTR的結合相比，抑制NS4B多肽 與HCV負鏈RNA之3'UTR結合至少約5%、至少約10%、至 少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約 35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約 60%、至少約70%、至少約80%或至少約90°/。或90%以上之 w 抑制劑。 在一實施例中，抑制劑為抑制NS4B多肽與HCV負鏈 RNA之3MJTR之結合者，其中50%抑制濃度（IC50值）為約 100 μΜ至 50 μΜ、約 50 μΜ至 25 μΜ、約 25 μΜ至 10 μΜ、 約 10 μΜ至 5 μΜ、約 5 μΜ至 1 μΜ、約 1 μΜ至 500 ηΜ、約 500 ηΜ至 400 ηΜ、約 400 ηΜ至 300 ηΜ、約 300 ηΜ至 250 ηΜ、約 250 ηΜ至 200 ηΜ、約 200 ηΜ至 150 ηΜ、約 150 ηΜ 至 100 ηΜ、約 100 ηΜ 至 50 ηΜ、約 50 ηΜ 至 30 ηΜ、約 30 134691.doc -39- 200927102 nM至 25 nM、約 25 nM至 20 nM、約 20 nM至 15 nM、約 15 nM至10 nM、約10 nM至5 nM或小於約5 nM。 在一實施例中，進一步在以細胞為主之檢測法中對抑制 NS4B多肽與HCV負鏈RNA之3’UTR結合之測試藥劑測試其 抑制HCV複製之能力。在該等實施例中，使所關注之測試 試劑與具有全部或部分HCV基因組之哺乳動物細胞接觸； 且測定（若存在）測試藥劑對HCV複製之效應。合適細胞包 括容許HCV複製之哺乳動物肝細胞，例如容許HCV複製之 〇 永生化人類肝細胞細胞株。舉例而言，合適哺乳動物細胞 為Huh7肝細胞或Huh7肝細胞之亞純系，例如Huh-7.5。合 適細胞株係描述於（例如）Blight等人（2002) J. Virol· 76:13001 ;及 Zhang 等人（2004) J. Virol. 78:1448 中。在一 實施例中，細胞中之HCV基因組包含報導基因，例如編碼 螢光素酶、螢光蛋白或提供可偵測信號之其他蛋白的核苷 酸序列；且測定（若存在）測試藥劑對HCV複製之效應係藉 由偵測報導基因之信號達成。 ^ 因此，在一實施例中，與在無測試試劑之情況下HCV之 複製水準相比，所關注之測試藥劑（例如抑制劑）抑制HCV 複製至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、 至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少 約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約 80%或至少約90%或90%以上。 可使用本揭示案之實施例篩選多種不同測試藥劑。候選 藥劑包涵大量化學品類別，例如分子量大於5 0道爾頓且小 134691.doc •40- 200927102 於約10,000道爾頓、小於約5,000道爾頓或小於約2,500道 爾頓之小有機化合物。測試藥劑可包含與蛋白結構相互作 用所需之官能基，例如氫鍵，且可包括至少一個胺、羰 基、羥基或羧基或至少兩個該等官能化學基團。測試藥劑 可包含經一或多個以上官能基取代之環碳或雜環結構及/ 或芳族或聚芳族結構。測試藥劑亦見於包括肽、醣類、脂 肪酸、膽固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組 合之生物分子中。 〇 在一實施例中，抑制劑抑制NS4B與負鏈HCV RNA之
3'UTR的結合。在一實施例中，抑制劑以小於約500 nM之 IC50值抑制NS4B與負鏈HCV RNA之3'UTR的結合，例 如，在一些實施例中，抑制劑以約500 nM至400 nM、約 400 nM 至 300 nM、約 300 nM 至 250 nM、約 250 nM 至 200 nM、約 200 nM至 150 nM、約 150 nM至 100 nM、約 100 nM 至 50 nM、約 50 nM至 30 nM、約 30 nM至 25 nM、約 25 nM 至 20 nM、釣 20 nM至 15 nM、約 15 nM至 10 nM、約 10 nM ® 至5 nM或小於約5 nM之IC50值抑制NS4B與負鏈HCV RNA 之3’UTR的結合。 在一實施例中，與未與抑制劑接觸之HCV感染細胞中 HCV複製水準相比，抑制劑在與HCV感染細胞（例如HCV 感染肝細胞）接觸時，抑制該細胞中HCV複製至少約5%、 至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少 約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約 5 0%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90% 134691.doc -41 · 200927102 或或9 0 %以上。 在一實施例中，與未與抑制劑接觸之細胞產生之感染性 HCV病毒粒子數目相比’抑制劑在與HCV感染細胞⑼如 HCV感染肝細胞）接觸時，使HCV感染細胞產生之感染性 HCV病毒粒子之量降低至少約5%、至少約1〇%、至少約 15%、至少約20%、至少約25%、至少約3〇%、至少約 35%、至少約4〇。/0、至少約45%、至少約5〇%、至少約 60%、至少約70%、至少約8〇%或至少約9〇%或9〇%以上。 在一實施例中，與未以抑制劑治療之個體中HCV病毒負 荷相比，抑制劑在向此有需要之個體以一或多個劑量投與 時，使個體中之HCV病毒負荷降低至少約5%、至少約 10%、至少約15°/。、至少約20%、至少約25。/。、至少約 30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約 50〇/。、至少約60%、至少約70%、至少約8〇%或至少約9〇% 或90%以上。 測試藥劑係由多種來源獲得，該等來源包括合成或天然 化合物庫。舉例而言，諸多方法可用於多種有機化合物及 生物分子之隨機及引導合成，包括隨機之寡核苷酸及募肽 之表現。或者，可獲得或易於產生細菌、真菌、植物及動 物提取物形式之天然化合物庫。此外，天然或合成產生之 庫及化合物易於經由習知化學、物理及生化方法修飾，且 可用於產生組合庫。已知之藥理學藥劑可經受引導或隨機 之化學修飾’諸如酿基化、燒基化、g旨化、酿胺化等等， 以產生結構類似物。此外，篩選可針對已知藥理學活性化 134691.doc •42· 200927102 合物及其化學類似物，或針對具有未知特性之新顆藥劑， 諸如經由合理藥物設計產生之彼等藥劑。 在一實施例中，測試藥劑為合成化合物。諸多技術可用 於多種有機化合物及生物分子之隨機及引導合&，& 機寡核㈣之表現。參見’（例如則时式明確地併入 本文中之WO 94/則4,其討論產生新顆化合物之方法， 包括隨機化學方法以及酶促法。
在另-實施财，測試試劑係以可獲得或易於產生之細 菌、真菌、植物及動物提取物形式之天然化合物庫提供、。 此外，天然或合成產生之庫及化合物易於經由習知化學、 物理及生化方法經修飾。已知藥理學藥劑可經受引導或隨 機化學修飾（包括酶促修飾）以產生結構類似物。 在一實施例中，測試藥劑為有機部分。在通常描述於 WO 94/24314中之實施例中，測試藥劑係自一系列可經化 學修飾之受質合成。本文中之"化學修飾”包括傳統化學反 應以及酶促反應。該等受質通常包括（但不限於）烷基（包括 烷烴、烯烴、炔烴及雜烷基）、芳基（包括芳烴及雜芳基）、 醇類、醚類、胺類、醛類、酮類、酸類、酯類、醯胺類、 環狀化合物、雜環化合物（包括嗓吟、喷咬、笨并-氮 呼、β-内醯胺、四環素、頭孢菌素及碳水化合物）、膽固醇 (包括雌激素、雄激素、可的松（cortis〇ne)、伊的松 (ecodysone)等）、生物鹼（包括麥角、長春花、箭毒、吡咯 嗓及絲裂徽素）、有機金屬化合物、含雜原子之化合物、 胺基酸及核苷。可在該等部分上進行化學（包括酶促）反應 134691.doc -43- 200927102 以形成可隨後使用本發明之方法測試的新穎受質或候選藥 劑。 在一實施例中，除測定測試藥劑對抑制NS4b與Hcv負 鍵RNA之3MUTR結合之效應之外，亦使用熟知檢測法（諸如 錐蟲藍拒染法、MTT(溴化3-(4,5·二甲基噻唑_2_基）_2 5-二 苯基-2H-四唑鑌）檢測法及其類似方法）對測試藥劑可對活 的真核細胞展現之任何細胞毒素活性進行評估。認為不具 有顯著細胞毒素活性之藥劑為以供進一步開發之候選藥 © 劑。 、、 除了 NS4B多肽之外，HCV負鏈RNA之3iUTR及測試藥 劑、多種其他試劑可包括於篩選檢測法中。其包括諸如 鹽、中性蛋白（例如白蛋白）、清潔劑等之試劑，包括用於 促進最佳結合活性及/或降低非特異性或本底活性之藥 劑。可使用改良檢測效率之試劑，諸如蛋白酶抑制劑、核 酸酶抑制劑、抗微生物劑等。以任何次序添加檢測混合物 ◎之組伤以提供必要活性。在任何合適溫度下執行培育，通 常在4 C與40。〇之間。培育期經選擇以獲得最佳活性，但 亦可、i最佳化以促進快速高通量筛選。在一些實施例中， ’··、 J時與1小時、約1小時與2小時或約2小時與4小時為 足夠的。 2月之實施例之檢測法可包括對照，其中合適對照包 剞钟Γ(例如包含觸3多狀及HCV負鍵RNA之3，UTR在無 物：藥劑之情況下的樣品)。一般而言，複數個檢測混合 不同藥劑浪度並列進行以對各種濃度獲得不同反應。 134691.doc -44· 200927102 一般而言，該等濃度中之一者充當陰性對照，亦即在零濃 度下或低於偵測水準之下。 可使用根據本發明之實施例之方法的多種檢測法中之任 一者測定（若存在）測試試劑對NS4B多肽與HCV負鏈RNA之 3'UTR之結合的效應。 在一些實施例中，在微流體裝置中進行篩選檢測。適用 於本發明之一或多種方法中的微流體裝置係描述於例如美 國專利第 5,770,029號；第 5,755,942號；第 5,746,901 號； © 第 5,681，751 號；第 5,658,413 號；第 5,653,939 號；第 5,653,859 號；第 5,645,702 號；第 5,605,662 號；第 5,571,410 號；第 5,543,838 號；第 5,480,614 號；第 7,076,092 號；第 7,067,263 號；及 Maerkl 及 Quake (2007)
Science 315:233中，其全部係以引用的方式併入本文中。 在一實施例中，篩選方案可根據以下討論進行° 篩選抑制NS4B之RNA結合之化合物的檢測法： 1) 藉由 OmniGrid Micro(GeneMachines)微陣列點樣儀 ❹ 使用 CMP3B 針（TeleChem International ’ Inc.)以微陣列 * 式且分別以680 mm及320 mm之行距及列距將庫化合物（溶 解於DMSO中）點樣於環氧化物塗佈之玻璃基板載片（CEL Associates)上。對於一次篩選，以高濃度（約1 mM)重複點 樣化合物兩次。對於二次篩選，使用低於一次筛選濃度1〇 倍之濃度且對於各化合物點樣重複至少5次° 2) 使陣列乾燥。 3) 在 GenePix4000b(Molecular Devices)上對陣列進行 口口 134691.doc 45· 200927102 質控制。 4) 在SMZl 500(Nikon)立體鏡上手動使陣列與微流體裝置 對準。對於一次篩選使用大型裝置（2400個單元池（unit cell))且對於二次篩選使用較小裝置（640個單元池）。 5) 將陣列與裝置在黑暗中在40°C下在加熱板上接合隔 夜。 6) 使裝置進行表面圖案化（參見下文）。· 7) 使用偶合轉錄/轉譯兔網狀紅血球系統（Promega)在2 © pL犬微粒體膜（Promega)存在下晶片外表現NS4B-GFP。 8) 將蛋白及Cy5標記之HCV RNA探針（以1.5 nM之濃度） 裝載於晶片中且使其在5〇!11]^1^?68〖0出？116.8)緩衝液 中培育5-20 min。 9) 藉由啟動夾層閥分隔各單元池且培育30 min以使得可 進行蛋白與表面生物素標記之抗GFP抗體結合、庫化合物 溶劑化及蛋白與標靶RNA之平衡。 10) 藉由關閉"按鈕"膜以及腔室閥執行MITOMI以捕獲表 ^ 面結合複合物同時去除任何液相分子。 11) 以Hepes KOH(pH 6.8)緩衝液短暫洗滌以移除未捕獲 之未結合物質。 12) 在經修改之 arrayWoRxe(AppliedPrecision)微陣列掃 描儀上掃描裝置以偵測蛋白合成及經捕獲之分子。 13) 圖像及數據分析：以 GenePix3.0(Molecular Devices) 分析圖像。各單元池產生單一數據點，其係由Cy5中值信 號與GFP中值信號之比率組成，因此表示表面結合RNA與 134691.doc -46- 200927102 表面結合表現之蛋白的比率。將來自多個數據點之數據平 均化且計算其標準差。將結果標準化為在不含抑制性化合 物之單元池中量測之信號。冑彡界限（例％ :對於一次筛 選中之抑制而言大於90%之抑制’對於二次筛選而言大於 2 · 5倍之抑制）。 表面化學： 所有裝置在控制管線中在10 ?以與15 psi2間驅動且對於 流動管線在4 psi與6 psi之間驅動。為進行初始表面衍生步 ^ 驟，腔室閥保持關閉以防止液體進入含有經點樣RNA標靶 之腔室中。 首先’將所有可及表面區域藉由經由所有通道使經生物 素標6己之BSA(Pierce)於dH2〇中再懸浮至2 mg/mL之溶液流 動30 min ’繼而進行1〇 min PBS洗滌而經衍生。隨後使5〇〇 pg/mL中性鍵親和素（Neutravidin，Pierce)於PBS中之溶液 流動20 min，繼而進行1〇 min PBS洗滌。隨後，關閉"按鈕" 膜且再繼續PBS洗務5分鐘。隨後將除60 μπι由按钮遮蔽之 〇 圓形區域之外的所有剩餘可及表面區域用與以上相同之生 物素標記溶液鈍化30 min，繼而進行10 min PBS洗務。最 終，將經生物素標記-抗-GFP抗體（Abeam)於PBS中之 2%BSA中之1:1溶液裝載2-5 min，之後，將”按紐”膜打開 且繼續流動20 min，使得先前遮蔽之圓形區域可進行特異 性功能化。此再次繼之以10 min PBS洗滌完成表面衍生程 序。 因此，在一實施例中，本發明之一實施例之篩選方法包 134691.doc -47- 200927102 括偵測（若存在）測試試劑對NS4B多肽與HCV RNA之3，UTR 之結合的效應，該方法包含：⑷使來自一或多個測試藥劑 來源之一或多種測試藥劑經由在平面基板中製造之分析裝 置之一或多個微流體通道流動，其中該或該等微流體通道 具有至少一個在約0.1 4111至500 μιη之範圍内的橫截面尺 寸；（b)使該或該等測試藥劑與至少一種包#NS4b多肽及 包含HCV RNA之3，UTR之核酸的第一樣品接觸；及为在裝 置之偵測區中偵測（若存在）測試藥劑對NS4B多肽與 〇 RNA之3’UTR之結合的效應。在一些實施例中，該方法在 接觸步驟（b)之後另外包含一或多個洗滌步驟。在一實施例 中，偵測步驟包含偵測與NS4B多肽結合之第—可偵測標 記之比率及與包含3，UTR之核酸結合之第二可俄測標記之 比率》在一實施例中，該方法可使用微流體分析裝置。 抑制劑 本發明之實施例提供可用於治療感染黃病毒科病毒之宿 ±之抑制劑。詳言之，該抑制劑可用於治療感染c型肝炎 病毒之宿主。該抑制劑可屬於（例如且不限於）一或多個以 下群組.A立味4、克立味唾類似物及具有克立味唾骨架 之化σ物，與克立咪唑具有結構相似性之⑴拮抗劑、出 受體括抗劑；西諾沙星、西諾沙星類似物及具有西諾沙星 骨架之化合物，正腎上腺素、正腎上腺素類似物及具有正 腎上腺素骨架之化合物；格列本腺格列本腺類似物及具 有格列本脲骨架之化合物；螺朵林螺朵林類似物及且有 螺朵林骨架之化合物；托品酿胺、托品醯胺類似物及具有 134691.doc •48- 200927102 托品醯胺骨架之化合物；下述各種化合物中之抑制劑中之 任-者；上述任一者之電子等排體；及其類似物。在一實 施例中，抑制劑為克立咪唾、克立味唾類似物及具有克立 味唾骨架之化合物。在-實施例中，抑制劑為克立㈣類 似物及具有克立咪唾骨架之化合物。本發明之實施例包括 組合物、醫藥組合物、液體組合物、凝膠組合物及其類似 物（包括（但不限於）控制釋放及持續釋放調配物）中所含之 抑制劑。在-實施例中，該抑制劑與另一藥劑（例如本揭 © 示案之其他抑制劑或其他藥劑）組合使用以治療黃病毒科 病毒感染，且在各種實施例中，該等藥劑中之每一者或該 等藥劑中之一者在控制釋放或持續釋放調配物中。在一些 情況下，術語"抑制劑"可稱為藥劑、化合物、活性劑或藥 物。 如上所述，適用於本發明之方法中的說明性抑制劑可屬 於一或多個以下群組：克立咪唑、克立咪唑類似物及具有 克立咪唑骨架之化合物；與克立咪唑具有結構相似性2H1 〇 拮抗劑、H1受體拮抗劑；西諾沙星、西諾沙星類似物及具 有西諾沙星骨架之化合物；正腎上腺素、正腎上腺素類似 物及具有正腎上腺素骨架之化合物；格列本脲、格列本脲 類似物及具有格列本脲骨架之化合物；螺朵林、螺朵林類 似物及具有螺朵林骨架之化合物；托品醯胺、托品酿胺類 似物及具有托品酿胺骨架之化合物；下述具有抑制活性之 化合物及其類似物；上述任一者之電子等排體；及其類似 物0 134691.doc •49- 200927102 在下文化合物之描述中，以上定義之術語具有其所定義 之3義’且下文提及之定義描述所述抑制劑之較佳實施 例。提及本部分所述之較佳實施例之"芳基,,及/或,,烷基"係 指芳基及烷基之較佳實施例定義。 術語"烷基’’係指諸如甲基、乙基、異丙基、異丁基及三 氣甲基之基團。除該等實施例之外，術語烷基包括具有以 下結構中之一者的基團：
〇，K>K3，f〇〇 術語"芳基"係指選自以下基團A-F之基團。
基團B
基團C 自獨 之群：-H、 -烧基、 -Br、-CM、 垸基 Η 烷基 1 入 〆 烷基、 0^0 、 /Ν、/烷基 σ^ο 、 坑基 ' Η \ /S、N,统基 统基 ο 烷基 Η 、 9 其中X〗-X5當存在於基團A、b及C之化合物中時各 -F、-Ο-烷基、乂、炫基、 分、n 134691.doc •50· 200927102 基 炫基 ο Λ Ο νη5 、〇Η及 人烷基 在一實施例中，基團c之至少一個位置（Χι〇(5)經（非氫 取代。
κτ N^\w Χ3
χ5 ~基團D ❹ Ο
X4基團E χ5 基團F 其中在基團D、E及F之化合物中，γ係選自由以下美團 組成之群：-〇、_S、_ΝΗ、·Ν_烷基及N_醯基；&係選$由 以下基團組成之群：-H、_CH3、_a、_F、％及Μ% ; 且X4及X〆若存在）獨立地選自由j^^CH3組成之群。 如上所述，抑制劑包括（但不限於）克立咪唑、克立咪唑 類似物及具有克立料骨架之化合物；及具有上述 之任一者的化合物之任一者之電子等排體。 土 因此’本發明之實施例包括克立咪唑及具有克立咪唑骨 架之抑制劑。克立咪峻及具有克立咪唑骨架之化合物之结 構如下所示(克立咪唑骨架如左側所示且克立咪 側 所示）： 134691.doc 200927102
在克立咪唑骨架之一實施例中’ Rl係選自由 成之群：_H、Λ =0,1,2 及 以下基團組 n=0,1,2 Ο 在-實施例中，〜為一’且芳基(如上所示之基 團A-F)在A處經取代。在一實施例中，芳基及烷基可選自 本部分所述之較佳實施例。 在克立咪唑，架X之一實施例中，Rz係選自由以下基團組 成之群：_Η& Μί=〇,1,2,其中χ係選自由以下基團組成之
群：-燒基、-芳基、坑基、
二
’烷基
炫.基 、、乂 •烷基 、Υ Ο 或烷基 0 及 。在一實施例中，芳基及烷基可選自本部分所述之 較佳實施例。 在克立咪唑骨架之一實施例中，R4_r7中之每一者獨立 地選自由以下基團組成之群：-H、-Cl、_F、<%、 义 NH： ‘烷基 烷基 I,Ν 烷基 礼烷基〇\ O’ 炫基 父 '班基 S、 烷基、/、NH2、 烷，基 ’N、醯基 /S、M/烷基 ^ Ϊ ?\ ?\ Η 、炫基、^ΝΗ2、3S 乂, 二S、y炫基 基 OH及八CT烷基 13469l.doc -52- 200927102 在—實施例中，烧基可選自本部分所述之較佳實施例。 在一實施例中，該等位置（R4_R7)中僅兩者經取代，且對於 各、”至取代之位置而言，取代部分係獨立地選自由以下基團 組成之群：_α、_卜偶及_随3，而其他位置未經取代 (在該位置處具有；。在另—實施例中，取代， 且對於各經取代之位置而言，取代部分係選自由以下基團 組成之群：·α、_F、_cm〇CH3，而未經取代。 ❹ 在克立味唑骨架之-實施例中，-或多組相鄰基團(r4 與Rs Rs與R6或Re與R7)由含有5與7個原子之間的環連 〇-| 广〇、， 接。在—實施例中，該環包含選自由、一丨及k〇一'組成之群 〇-| 構。在—實施例中，R5與心藉由具有選自由、一!及 〇/\组成之群之結構的環中之一者連接。 成之群：
CI
在克立咪唑骨架之一實施例中，R1係選自由以下基團組
134691.doc 53- 200927102 Ο ❹
選自由以下g團組成之群：-Η、-CH3、-CF3、-CH2CH3、
0〆、
ch2〇h、-〆、&〇、、、认、-κ及; R‘ 係選自由以下基團組成之群：_H及_NH“尺5及R6獨立地 選自由以下基團組成之群：-H、-CH3、cn、F、-〇CH3、』、<坑基 坑基 Η -ΝΗ2、 气基 坡基 〇〆’、、0 '烷基 烷基 I /Ν、. .Ν> 、醯基
烷基 I Η •芳基 乂炫基、Χη, Ο 入fT烷基 〇 〇 〇 ώ 、人Η”人口《人/ 烷基 NH2、’、0H及 且R7為-H。在一實施例中，烷基可選自本部分所述之較佳 實施例。 本發明之抑制劑之其他實施例包括克立咪唑及具有克立 味坐月条之化合物的電子等排體。克立味唾之苯并咪唾核 心結構之電子等排體包括由以下結構定義之化合物（笨并 咪唾核心結構僅供參考而展示；在該等結構之每一者中，
Ri-Rz及R4-R7係如上所定義且&可為諸如由R4_R7描述之基 團）。 134691.doc •54· 200927102 以下，纟。構為苯并咪°坐核心結構： R4
R7 Ri 以下化合物為吲唑核心結構，苯并咪唑核心結構之電子 等排體：
❹ 以下化合物為吲哚核心結構，苯并咪唑核心結構之電子 等排體：
以下化合物為笨并異。惡唑核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體：
以下化合物為咪唑幷吡啶核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體：
134691.doc •55· 200927102
以下化合物為η比β坐幷β比咬核心結構，苯并喷》坐核心結構 之電子等排體：
❹ 以下化合物為吡咯幷吡咬（氮雜吲哚）核心結構，苯并咪 唑核心結構之電子等排體：
r2 以下化合物為異噁唑幷吡啶核心結構，苯并咪唑核心結 構之電子等排體： R4
R5
N
◎ 1 R7 R1、 R7 以下化合物為咪唑幷哌嗪核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體： rTxVr2
Ri 〇 以下化合物為吡唑幷哌嗪核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體： 134691.doc -56 - 200927102
R*i 〇 以下化合物為吡咯幷哌嗪核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體：
❹ 以下化合物為異噁唑幷哌嗪核心結構，苯并咪唑核心結 構之電子等排體：
。 以下化合物為咪唑幷哌嗪核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體：
以下化合物為吡唑幷嘧啶核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體：
以下化合物為吡咯幷嘧啶核心結構，苯并咪唑核心結構 之電子等排體： 134691.doc -57- 200927102
R2 R7 Ri
Ji 6 N N «1 構=:=:異°惡唾幷物心結構，苯并㈣心結 Ο ❹
N
R5\/N
,Ν Rl 〇 以下化合物為嘌呤核心結構 等排體： 苯并咪唾核心結構之電子
Ν Ν Ν 物： h3c h3c
Vr2
Ri
R5\^N
在-實施例中，抑制劑為具有以下結構中之一者之化合 ϊϊ> H3CiyH3cr^^N‘ H3C h3c 'N Cl(X 在一實施例中，抑制劑為具有以下結構中之—
Cl
Cl 物 者之化合 a:u 叱 αV>-Br
在一實施例中，抑制劑包括5,6_二取代之克立味唾化合 物。在一實施例中，抑制劑包括新穎、6_二取代之克立咪 134691.doc -58- 200927102 唑化合物，其中取 例中，抑心 w括一乙氧基取代基。在-實施 …. 稱一取代之克立咪唑化 合物： r5
，其中心及尺6包括以上對於R5及116所 述之基團。在另—實施例中，R5係選自由以下基團組成之
Η 气基 群· _H、_CH3、Cl、F、_〇ch3、_ΝίΙ2、/Ν、烷基、/Ν、炫基、 炫基 〇 〇 〇 ^基、·^νη2、Λ〇η、 烧基及 S02CH3 ; r6係選自由以下基團組成之群：_Η、_c 醢基 人'烷基
Cl、F ，烷基 OCH: 儿,,
烷基 I 坑基 醯基 又 •烷基 、- Ο 、OH、，'Ο""4"及-NH2。在一實施例中， 烧基可選自本部分所述之較佳實施例》 此外，表1包括新穎抑制劑之結構及製備新穎抑制劑之 說明性原料： 表1 結構 說明性原料 1 UYY> χτ> Cl 人 134691.doc •59- 200927102 ❹ ❹ 2 :χ» :χ» r Η 3 Ca> 〔。^〇c、 4 οα> 5 〇α> a 〇α> u Η 6 χγ> 7 XX》 ^Οο, 8 οα:， Η 9 οα> ^>〇, /〇ΧΧ， Η 10 "〇> X» Η 134691.doc -60- 200927102 ❹ ❹
11 ^o> H 12 F3COc> F3Cx» H 13 :χ» :a> 卜 H 14 Cko> CIT» H 15 1!»> 16 X» X» H 17 J〇Qn ^o> H 18 C»> H 19 〇〇> 〇〇> H 134691.doc •61 - 200927102 20 )0) Η 21 ^<>0， 人、 22 α> nOc' 此外，表2包括基於以下結構之新穎抑制劑之結構：
Ri r2 R4 Rs R6 r7 Cl Η Η Η Η F o Η Η Η Η Η Η Η Η ^c, Η Η Η Η 、:acl Η Η Η Η ^c, 〇、 ο Η Η Η Η 134691.doc -62· 200927102
134691.doc •63- 200927102
0、 Η Η Η Η ^n〇 Η Η Η Η Cl 1 ΆΝ、 Η Η Η Η 1 卜N、 Η Η Η Η ^c, F 1 卜N、 Η Η Η Η 、:XX 1 A/N、 Η Η Η Η 1 Η Η Η Η 'Λ/Ν、 Η Η Η Η X^C1 〇、 1 P、 Η Η Η Η 5ac, 1 Η Η Η Η Cl 1 p、 Η Η Η Η a 1 ΆΝ、 Η Η Η Η F 1 ΆΝ、 Η Η Η Η 、:)a 1 ΆΝ、 Η Η Η Η 134691.doc -64- 200927102
7 I 卜Ν、 Η Η Η Η 1 ρ、 Η Η Η Η 〇、 1 Άν、 Η Η Η Η 1 &Ν、 Η Η Η Η CI 1 Η Η Η Η 1 'Α^Ν、 Η Η Η Η F I ΆΝ、 Η Η Η Η I Μ、 Η Η Η Η 1 ρ、 Η Η Η Η Όα。/ 1 卜Ν、 Η Η Η Η 〇、 1 Η Η Η Η ca0. 1 'Λ/Ν、 Η Η Η Η F Η Η Η Η 、:IX Η Η Η Η 134691.doc -65- 200927102 ❹ ❹ Η Η Η Η acl Η Η Η Η ^c, 〇\ Η Η Η Η Η Η Η Η Cl Η Η Η Η 、λΑ Η Η Η Η F Η Η Η Η 、;α Η Η Η Η 、λΑ Η Η Η Η 、/丄 Η Η Η Η 〇、 Η Η Η Η ία Η Η Η Η CI Η Η Η Η '/丄 Η Η Η Η 134691.doc -66- 200927102 ❹ ❹ F 'aA Η Η Η Η Η Η Η Η 'λΑ Η Η Η Η Η Η Η Η ca0. 'λΑ Η Η Η Η F -κ Η Η Η Η -κ Η Η Η Η -κ Η Η Η Η 、:acl -κ Η Η Η Η 0\ -κ Η Η Η Η ζΧΧ -κ Η Η Η Η CI -κ Η Η Η Η -κ Η Η Η Η F -κ Η Η Η Η 134691.doc -67- 200927102
-K H H H H -K H H H H 、:XX -K H H H H 0、 -K H H H H 5α -K H H H H Cl -K H H H H -K H H H H -K H H H H -K H H H H -K H H H H -K H H H H F H H ch3 ch3 H H H ch3 ch3 H % H H ch3 ch3 H H H ch3 ch3 H 134691.doc -68- 200927102
〇、 Η Η ch3 ch3 H Η Η ch3 ch3 H Cl Η Η ch3 ch3 H Η Η ch3 ch3 H F Η Η ch3 ch3 H Ά Η Η ch3 ch3 H kyx Η Η ch3 ch3 H 〇、 Η Η ch3 ch3 H ^χχ Η Η ch3 ch3 H CI Η Η ch3 ch3 H Η Η ch3 ch3 H F Η Η ch3 ch3 H Η Η ch3 ch3 H Η Η ch3 ch3 H 134691.doc -69- 200927102
H H ch3 ch3 H 〇、 H H ch3 ch3 H H H ch3 ch3 H F cf3 H H H H cf3 H H H H ^c, cf3 H H H H cf3 H H H H ^PLC1 〇、 cf3 H H H H cf3 H H H H Cl cf3 H H H H cf3 H H H H F cf3 H H H H 、:IX cf3 H H H H cf3 H H H H 134691.doc -70. 200927102
α cf3 H H H H 〇、 cf3 H H H H ca cf3 H H H H Cl cf3 H H H H cf3 H H H H F cf3 H H H H cf3 H H H H cf3 H H H H cf3 H H H H 〇、 cf3 H H H H cf3 H H H H ^0, F yj〇 H H H H ^C1 H H H H ^C1 .j〇 H H H H 134691.doc -71 - 200927102
,j〇 H H H H (f^j >o^U H H H H 〇、 Γι >cA^ H H H H V- Cl H H H H a CIA^\ 、aA^ H H H H fi^l i^AJ H H H H F fs H H H H ΛΑ iJ^J H H H H {S iJkJ H H H H λ {S iJkJ H H H H fs Cl iJ^J H H H H iJKj H H H H {S H H H H 1 F F^^O〆 i^XJ H H H H 134691.doc -72- 200927102
yj〇 H H H H rJO H H H H yj〇 H H H H "Χ^〇Η 〇 ch3 H ch3 ch3 H Ve 0 H H ch3 ch3 H ^X\〇Me 0 ch3 H ch3 ch3 H 0 H H ch3 ch3 H 〇 ch3 H ch3 ch3 H ch3 H ch3 ch3 H /O H H ch3 ch3 H /O ch3 H ch3 ch3 H H H Cl Cl H ch3 H Cl Cl H 134691.doc -73- 200927102
0 Η Η C1 Cl H 0 ch3 Η C1 Cl H Ί- 0 Η Η C1 Cl H ^〇Me 0 ch3 Η C1 Cl H n\〇Et 〇 Η Η C1 Cl H 0 ch3 Η C1 Cl H Η Η C1 Cl H ch3 Η C1 Cl H /Ο Η Η C1 Cl H Ί /Ο ch3 Η C1 Cl H Η Η och3 och3 H ch3 Η och3 och3 H 0 Η Η och3 och3 H 134691.doc -74- 200927102
0 ch3 Η och3 och3 H 0 Η Η och3 och3 H 0 ch3 Η och3 och3 H 0 Η Η och3 och3 H 0 ch3 Η och3 och3 H Η Η och3 och3 H ch3 Η och3 och3 H /〇 ch3 Η och3 och3 H
克立咪唑為HI受體拮抗劑，且與克立咪唑具有結構相似 性之其他H1受體拮抗劑可適用於本發明之方法之實施例。 與克立咪唑具有結構相似性之說明性H1受體拮抗劑包括 (但不限於）稱為以下類別之化合物：醇胺（例如苯海拉明 (diphenhydramine)、卡比沙明（carbinoxamine)及氯馬斯汀 (clemastine))、乙二胺（例如美0比拉敏（mepyramine)及曲0比 那明（tripelennamine)(克立σ米嗤屬於該類））、烧基胺（例如 曲普利咬（triprolidine)及氣芬尼拉明（chlorpheniramine))、 0底唤（例如美克利嗪（meclizine)及高氣環唤(homchlorcyclizine)) 134691.doc -75- 200927102 及啡喧唤（例如異丙嗓（promethazine))。 本發明之實施例可包括克立咪唑、克立咪唑類似物及具 有克立咪唑骨架之化合物及其電子等排體的前藥，其係由 肝酶活化（例如經藉由CYP3 A促進氧化分裂反應之基團取 代之環-1，3-丙酯等）❶該等修飾可使克立咪唑失活或活性 降低直至在肝臟中才活化（參見Current Opinion in Investigational Drugs 2006，第 7 卷第 2 期，109-117 ; J. Med. Chem. 2008，51，2328-2345 ;及 Nucleosides， 〇 Nucleotides，and Nucleic Acids，24 (5-7):375-381 (2005)， 其每一者係以引用方式為了相應討論而併入本文中）。
Zierz及 Greither(1952)(Artztliche Wochenschrift 7:30， 704-7，Clinical evaluation of Allercur > a new antihistamine) 描述克立咪嗤，報導了來自Schering AG之產物。 Finkelstein 等人（（1960) J Am Pharm Assoc Am Assoc ; 49:18-22)報導了克立咪唑氫氯酸鹽之藥理學，描述其展示 有效延長之抗組織胺活性及相對較高程度之抗組織胺特異 ® 性且極有效拮抗組織胺氣溶膠支氣管痙攣。據報導經分離 兔回腸之自發活動性及經麻醉犬之腸運動性降低，且對慢 性胃瘺犬之組織胺誘導之胃液分泌無顯著影響，表明H1受 體之選擇性。 A.A. Jacques及 V.H. Fuchs(1960，International Record of Medicine，"Clinical Evaluation of Clemizole in Allergic Rhinitis")報導克立咪唑可用於管理過敏性病症之臨床調 查。其報導在豚鼠及人類中評估克立咪唑之抗組織胺活 134691.doc -76- 200927102 性’且克立咪吐在預防豚鼠中組織胺誘導之哮喘方面優於 阿托品（atropine)及其他抗組織胺劑。將組織胺及組織胺與 克立味唾之混合物藉由在人類個體中皮下注射所產生之效 應進行比較。向組織胺中添加克立咪唑據報導使得組織胺 誘導之風療塊及注射疼痛減輕。基於以下先前臨床報導， 選擇克立咪唑用於該研究：其迅速減輕過敏性症狀及顯著 較低之副作用發病率，其具有在超過5〇〇名患有季節性及 常年性花粉病枯草熱及各種皮膚學病狀（例如蓴痲疹、神 ® 經性皮炎、濕疹、食品及藥物過敏症）之患者中所報導之 極佳臨床結果。如jacques&Fuchs所總結，克立咪唑之先 前臨床經驗表明該抗組織胺劑對延長之投藥尤其具有良好 耐受性。
Zierz及Greither報導所治療患者中僅有1 3%嗜眠，且 Dulce未觀察到副反應，即使使用12〇 mg之每日劑量。每 曰給予90至300 mg克立咪唑歷時高達五曰之24名患者據報 導僅略微疲乏且具有較不頻繁之胃壓迫。對其他抗組織胺 劑展示不良耐受性之患者據報導對克立咪唑無反應。在兒 里中，投與克立咪唑不產生耐受不良跡象。向成人及兒童 給予克立咪唑丹寧酸鹽或克立咪唑氫氣酸鹽以減輕與過敏 性鼻乂 '哮％、血管舒縮性鼻炎相關之症狀及各種同時發 生之病狀。症狀包括彼等通常與過敏性鼻漏、打喷嗔、鼻 後滴漏、流淚及鼻及眼睛發癢相關之症狀。該研究中包括 二種劑型，且通常根據患者之年齡及症狀嚴重性使用。四 個成人僅肌肉内接受10 mg(1 ml)克立咪唑，而其他3名患 134691.doc -77- 200927102 者肌肉内接受單次10 mg(1 ml)劑量之克立味峻氯氣酸鹽， 繼而2茶匙量之口服懸浮液，每日服用四次歷時五日。其 他患者每日接受1或2片克立哺吐氫氣酸鹽旋劑（2〇或4〇叫 總劑量）-至四次歷時一或兩週；—成人每日接受i片鍵劑 /、次歷_週。其他患者每日接受一或兩茶匙量(2〇或 mg總劑量之氫氣酸鹽形式之克立咪唑）之口服懸浮液二至 四次歷時五至六日。在104名給予各種劑型克立咪唑之個 體中，92名對治療有反應。克立咪唑尤其在減輕打喷嚏及 © 鼻漏中有效。據推斷，克立味唾似乎為具有顯著較低之副 作用發病率的有效抗組織胺劑。嗜眠為歸因於使用該藥物 之僅有副作用；該副反應僅在i 04名所治療患者中之2名中 明顯且無需中斷治療。 B.A. Wansker(1962，Skin，"Clemizole Hydrochloride : A Clinical Evaluation of its Antipruritic Effect")報導在隨 機選擇之患者上進行的臨床研究中’該等患者之發疼為皮 膚病之突出症狀。有效性之標準為發癢減輕。克立咪唑氫 氣酸鹽之劑量根據瘙癢嚴重性進行個別化β大多數患者曰 間接受20 mg 3次外加就寢時40 mg，在24小時期間總共 100 mg。劑量總共介於每日40 mg至160 mg。治療持續時 間自1週至12週變化。四十三名患者治療2週或2週以下， 且24名患者治療超過2週。無患者治療小於1週。77名患者 接受克立咪唑（呈20 mg錠劑形式）或安慰劑（相同外形之玉 米澱粉及乳糖錠劑）。患者以每日40至160 mg(大多數接受 100 mg)來治療^ 24名患者治療超過2週，其中一些患者治 134691.doc -78- 200927102 =達12週。據報導㈣發疼極佳減輕且23%報導發 好減輕。注意到4名患者有輕微副作用(嗜眠最常見)。據推 斷克立咪唑氫氣酸鹽為一種耐受良好之安全藥物。該化合 物基本上無臨床上可觀察之副作用且似乎相當迅速地發二 作用·通常在24至48小時内_在其減輕發療之能力方面。 克立咪唑在美國以Allercur®(J. B. R0erig and ❹
C，any，Div.，Chas.pfizer&c〇，inc 之產品）銷售。j B. Roerig & Co. Division > Chas. Pfizer & Co. , 立咪唑丹寧酸鹽之商標名為AUercur 口服懸浮液；對於克 立咪唑氫氣酸鹽之商標名為非經腸Alkrcur及錠劑 AUercur。1966年PDR稱讚克立咪唑之優勢為：具有格外 良好之耐受性。然而，該藥物當前未在美國銷售，但該化 合物易於以純品形式自Sigma-Aldrich購得。 根據本發明之一實施例，用於治療患有Hcv感染之患者 的簡單及便利給藥方案包括先前展示有效將克立咪唑用於 止癢之任何方案。在—實施例中，使用BID給藥方案。在 實施例中，方案為1〇〇 mg，口服（p〇)，每曰兩次（Βι〇)。 本發明之實施例提供克立咪唑之新穎單位劑型，包括25 mg、50 mg、75 mg、1〇〇 mg、125 叫、150 mg及 200 mg 單位劑型。在一實施例中，單位劑型為錠劑；在另一實施 例中，早位劑型為膠囊。在一實施例中，克立咪嗤之持續 釋放調配物係在本發明所提供之錠劑及膠囊中。在另一實 施例中，單位劑型為液體。 根據本發明之方法之一實施例治療三名慢性感染 134691.doc •79- 200927102 腳(基因型4)之患者。所有患者均為男性，且具有基線 ALT升尚及在29〇，_韻，_ m/mi之範圍内的大量卿 病毒曰負荷。當隨後在克立味峻給藥方案（1〇〇mgp〇B⑼第 2週量測時所有患者均經受HCV病毒負荷下降，且至第4 週，所有患者具有幾乎等於或低於HCV谓測限值之Hcv含 量。在克立咪嗤單一療法治療再經數曰之後執行病毒負荷 量測ί艮可能所有患者均具有低於谓測限值之hcv含量。 4週克立米唑單一療法之後，外加4週以克立咪唑_標準劑 〇量聚乙二醇化干擾素治療，所有患者之hcv病毒負荷均低 於偵測限值。 由於根據本發明之方法之實施例已展示克立咪嗤具有針 對基因型1、2及4(就演化年齡及對干擾素之反應而言其跨 越HCV基因型之全部）之抗Hcv活性，故克立味嗤應對於 冶療所有患有HCV之患者（無論何種基因型）均較為理想。 根據本發明之方法之實施例的克立味啥之有效給藥亦包 Q 括以 150 叫 P〇 BID、75 mg P〇 BID及 50 mg po BID給藥。 總曰劑量亦可分於多次劑量中，此舉使得在具有較小鎮靜 可能性同時保持足夠功效的情況下每次投與較低劑量。或 者且尤其對於較難以治療之病例而言，可使用根據本發 月之方法的較頻繁給藥方案（例如每日三次（TID)投與或每4 或6 J時投與25 mg、50 mg、75 mg、150 mg或更高劑 量）。 類似地，本發明之實施例之持續釋放調配物可有助於經 較長時間間隔維持病毒抑制濃度。在說明性實施例中，持 134691.doc 80- 200927102 續釋放調配物劑量為50、75、100及15〇 mg p〇 mD，及 100、150、200及300 mg p〇 qd。根據本發明之方法之實施 例，克立咪唑亦可藉由經皮、舌下、肌肉内或經直腸途徑 投與。在一實施例中，向患有HCV但無其他需要以抗組織 胺劑治療之病狀的患者投與克立咪唑。在另一實施例中， 患者患有HCV及需要以抗組織胺劑治療之病狀，且克立味 唑及除克立咪唑之外的抗組織胺劑組合用於分別治療患者 HCV感染及需要抗組織胺劑治療之病狀。 雖然在上述3名患者中，克立咪唑單一療法在第4週停 止，但可根據本發明之方法繼續進行單一療法歷時高達12 週、24週、36週或48週或48週以上以提供持續病毒反應， 且在本發明之一些實施例中無限期地繼續給藥或繼續給藥 直至進一步治療不再具有明顯益處為止。 在對於HCV相關晚期肝病（ESLD)而言將進行肝臟移植之 患者的匱况下，應瞭解若在移植時存在病毒血症，則存在 新移植物感染HCV之約1〇〇%可能性。然而，亦已知，在 移植之别有效治療HCV可減少或排除新移植物中Hcv之復 發。因此’可執行根據本發明之方法的以克立咪唑單一療 法進行之治療以在肝臟移植之前降低或消除Hcv病毒負 荷，且可有助於預防移植之後的HCV復發。此外，通常患 有ESLD之移植前患者或HCV復發之移植後患者不能耐受 王劑量之標準護理療法（聚乙二醇化干擾素及利巴韋林）。 因此，根據本發明之方法，克立咪唑單一療法或克立咪唑 外加減y劑量之聚乙二醇化干擾素及利巴韋林可用於治療 134691.doc -81. 200927102 該等患者。類似地’克立咪唑外加硝唑尼特（nitaz〇xanide) (或另一噻唑啶或其任一者之持續調配物）可用於治療該等 患者，克立咪唑外加硝唑尼特（或另一噻唑啶或其任一者 之持續調配物）外加標準護理藥物（以降低或常規劑量，視 耐受性而定）同樣可用於治療該等患者。 〇 以4週克立咪唑單一療法治療，繼而4週克立咪唑及標準 劑量之聚乙二醇化干擾素治療之患者隨後進—步以确嗤尼 特及聚乙：醇化干擾素組合療法治療。然而，根據本發明 之方法m坐與聚乙二醇化干擾素之組合可繼續總共 12週、24週、36週或48週或48週以上之干擾素以辅助促進 持續病毒反應。類似地，可將利巴韋林添加至以聚乙二醇 化干擾素治療期間（或治療起始時）以在干擾素治療期間提 供三重組合療法。或者’在該等治療中，可與聚乙二醇化 干擾素—起或與聚乙二醇化干擾素及利巴韋林-起使用硝 唑尼特。 〇 類似&上述方案中之克立咪°坐單-治療期可為（例如 且不限於）4週或12週。根據本發明之方法，在其他實施例
中，亦可在3曰、7曰痿：Μ月+ -TAB 次2週或可立即開始（亦即無克立咪唑 單一療法治療階段）克立咪唑組合療法。 根據本發明之方法之實絲彳丨， 貫轭例，克立咪唑之組合治療包括 (例如且不限於）以克立啐地从 ’、 見立味唑外加硝唑尼特治療，以 唑繼而硝唑尼特治療， ^ ^ 咪嗤外加確唾尼特及NS31 白酶抑制劑治療，以克立啐咄冰、λ ^ A L 兄立+坐外加硝唾尼特外加NS3蛋白 酶抑制劑外加NS5B聚合酶 蛋 刊片』，口瀠，以克立咪唑外加 134691.doc •82- 200927102 NS3蛋白酶抑制劑外加NS5B聚合酶抑制劑治療，以克立咪 °坐外加硝°坐尼特外加NS3蛋白酶抑制劑外加NS4B第二兩性 螺旋抑制劑治療，以克立咪唑外加硝唑尼特外加NS4B第 二兩性螺旋抑制劑治療，以克立咪。坐外加NS3蛋白酶抑制 劑外加NS4B第二兩性螺旋抑制劑治療，及所有以上各物 添加利巴韋林，克立咪唑外加利巴韋林，克立咪唑繼而硝 唑尼特外加利巴韋林。 根據本發明之組合療法，硝唑尼特投藥可為（供說明之 © 用且不限於）500 mg po BID »其他劑量、其他噻唑啶或硝 唑尼特或另一噻唑啶之其他調配物（諸如持續釋放調配物） 亦可用於本發明之組合療法。 在本發明之實施例所提供之其他方法及單位劑型中，使 用本文所述之克立咪唑衍生物及類似物替代以上治療方法 及單位劑型中之克立°米嗤。 可適用於本揭示案之方法的其他H1受體拮抗劑包括： 痕唤：布克力嗪（Buclizine)、氣環唤（Chlorcyclizine)、 桂利嗪（Cinnarizine)、氯西尼0秦（Clocinizine)、經唤 (Hydroxyzine)、尼普拉嗪(Niaprazine)、奧沙米特（Oxatomide) 、二苯甲基化合物（賽克利嗓（Cyclizine)、美克利唤）、左 西替利嗪（Levocetirizine)及西替利唤（Cetirizine)。 三環及四環化物：阿希斯坦（Ahi stan)、乙異丁唤 (Etymemazine)、經基乙基丙美沙嗓（Hydroxyethylpromethazine) 、異丙美沙嗓（Isopromethazine)、異西喷地（Isothipendyl)、 美啥他嗪（Mequitazine)、曱地0秦（Methdilazine)、奥索馬°秦 134691.doc -83- 200927102 (Oxomemazine)、異丙嗓（Promethazine)、嗟丙錄 (Thiazinamium)、阿紮他定（Azatadine)、氣苯西泮 (Clobenzepam)、赛庚咬（Cyproheptadine)、地普托品 (Deptropine)、異西噴地（Isothipendyl)、氣雷他定 (Loratidine)、匹美嚷 '•頓（Pimethixene)、盧帕他定 (Rupatadine)、地氣雷他定（Desloratidine)、_ 替芬 (Ketotifen)及阿利馬唤（Alimemazine)。 其他：阿司味°坐（Astemizole)、氮拉斯汀（Azelastine)、 © 彼泊斯汀（Bepottastine)、巴米品（Bamipine)、賽特辛 (Cetoxine)、克立味唾、氣苯托品（Clobenztropine)、地普 托品（Deptropine)、迪美伯（Dimebon)、依巴斯汀 (Ebastine)、依美斯 ί丁（Emedastine)、依匹斯汀（Epinastine)、 左卡巴斯 iT (Levocabastine)、美海屈林（Mebhydrolin)、咪 0坐斯汀（Mizolastine)、苯茚胺（Phenindamine)、曲托喧琳 (Tritoqualine)、特非那定（Terfenadine)及非索非那定 (Fexofenadine) ° #| W 適用於本發明之方法之實施例的說明性HI拮抗劑包括如 下所示類別之彼等化合物。 在一實施例中，H1拮抗劑可包括具有以下結構所述之通 式之乙醇胺/烷基胺：
在如上所示之兩個結構中之每一者中，Ri及R2各自獨立 地為芳基（例如如上所示之基團A-F) ; R3係選自由-H及-CH3 134691.doc -84- 200927102 組成之群；Y係選自由-CH2·或-Ο-組成之群；且以係選自 由以下基團組成之群： N〇 坑•基
γΝ、烷基’ Y 〇 ❹
基可選自本部分所述之較佳實施例。 在一實施例中’ H1拮抗劑可包括具有以下結構所述之通 式之乙二胺： ^R3 R2 在如上所示之結構中，心及尺2各自獨立地為芳基（例如 如上所示之基團A-F) ’且&係選自由以下基團組成之群： 烧基 烷基，γΝ、燒基 yNv
在一實施例中 ，烷 基可選自本部分所述之較佳實施例。 在一實施例中’ H1拮抗劑可包括具有以下結構所述之通 式之哌嗪：
在如上所示之結構中，心及！^各自獨立地選自芳基（例 如如上所示之基團A-F)，且&係選自由以下結構組成之 13469l.doc • 85 · 200927102 群 n=1,2 在一實施例中，芳基及烷基可選 自本部分所述之較佳實施例。 在一實施例中，H1拮抗劑可包括具有以下結構之化合 物： 〇
在如上所示之結構中，Y1々4及U8獨立地選自由以 基團組成之群：_N_、-CH_及_CR，其中轉選自由
團組成之群：媽…卜-^心在-實施例中二 或多個且-或多個Υ5_γ^ _N_。 下基團組成之群…,。係選自由 組成之群。R2為烧基（例如該部分之較佳實^ _ ' 烷基）。R丨係選自由以下基團組成之群： 不之 \乂: VN〇 烷基 气基 \rN、烷基
13469】 .doc • 86 . 200927102 在一實施例中’芳基及烷基可選自本部分所述之較佳實 施例。 如以下實例中所述’金精三羧酸（aurintricarb〇xyHc aCld，結構如下）為一種抑制劑；然而，其為ONA:蛋白質 相互作用之非特異性抑制劑，且因此較佳不用作藥物：
之化合物：正腎上腺素、正腎上腺素類似物及具有正腎上 腺素骨架之化合物。下文展示正腎上腺素骨架之通用結 構。
%2 0 在如上所示之正腎上腺素骨架結構中，Y、Y'及Y"獨立 地選自由以下基團組成之群：-N_、CH-及-CR，其中R係 選自-CH3、-F-、-C1及-〇CH3 ; 1及R2獨立地選自由η及烷 基組成之群；且R3及R4獨立地選自由及以下基團中之一 者組成之群：_H、-CH3、-ΟΗ及-Ο-烷基，其中在一實施例 中’垸基係選自本部分所述較佳實施例中所述之烷基。 在一實施例中’ R_3及R4藉由含有3個與7個原子之間的環 連接。在一實施例中’環為螺-環丙基，其中r3&R4各自 為-CH2-CH2- 〇 I34691.doc • 87 · 200927102 在一實施例中，r5及r6各自獨立地選自由以下基團組成 之群.-H、-Ch 、-烷基、-OH及-Ο-烷基’其中在一實 施例中’貌基係選自本部分所述之較佳實施例中所述之烷 基0 在一實施例中，Rs為_〇H或烷基，而r6係選自由以下 基團組成之群：、-C卜-F、-烷基及-0-烷基，其中在一 實施例中’貌基係選自本部分所述之較佳實施例中所述之 烧基。 在另一實施例中，R0為-OH或-Ο-烷基，而R5係選自由以 下基團組成之群：_H、_ci、-F、_院基或-〇-燒基，其中在 一實施例中’烷基係選自本部分所述之較佳實施例十所述 之烧基。 * 在一實施例中，Rs及&獨立地選自含有5個與7個原子之 間的環。 在一實施例中，該環係選自由以下結構組成之群：
或 抑制劑之實施例包括屬於一或多個以下群組之化合物. 正腎上腺素、正腎上腺素類似物及具有正腎上腺素骨架之 化合物。正腎上腺素骨架具有以下通用結構： R3 R4 t 由以下基團組 在如上所示之結構中 ，R!及R_2獨立地選自 134691.doc • 88 - 200927102 成之群：-Η、-CH3、-CI^CH3、-CH(CH3)2及_CH2CH(CH3)2 ;R3及R4獨立地選自由以下基團組成之群：_H、_CH3、 -CH2CH3 ^ -CH(CH3)2 ^ -CH2CH(CH3)2 > -OH^-OCHs ； R5 及R6獨立地選自由以下基團組成之群：_H、_CH3、_CH2CH3 、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-oh、-〇CH3、c1、f、Βγ 及 cf3。 抑制劑之實施例包括屬於一或多個以下群組之化合物： 咖驗類似物及咖啡驗（如下所示）： ® H c i ph3
O^N^N CHj 〇 抑制劑之實施例包括屬於—或多個以下群組之化合物： 西諾沙星（右侧之結構）、西諾沙星類似物及具有西諾沙星 月架之化合物。西諾沙星骨架具有以下通用結構（左側之 結構）：
❹ 在如上所不之西諾沙星骨架中，Y及p獨立地選自由善 5 〇成之^，Rl係選自由以下基團組成之群：-Η、-CH3 〇 X vVx. 及 A ; X及χι獨立地選自
V%、\人〜 0 " 由-η及燒基組成 取之群，且R2係選自由以下基團組成之
群：-H 芳基 〇’1’2及n=0,1,2，其中在一實施例中，烷基係 134691 .doc -89- 200927102
選自本部分所述之較佳實施例中所述之烷基。 在—實施例中，R3及R4獨立地選自由以下基團組成之 群._H、-Cl、_F、_CH4-〇CH3。在另一實施例中，h及 自獨立地經一選自由以下基團組成之群之 代：_c1、-f、-Ch3l〇CH3。 图取 、在另—實施例中，R3及R4由含有5個與7個原子之間的環 連接。在-實施财，該環係由選自由以下 的結構形成： 群 ❹ 在西諾沙星骨架之—實施例中，γ係選自由以下基團組 成之群.CH、CCH3、N、CC1及CF ; γ，係選自由以下基團 組成之群· CH、CCH3、N、CC1及CF ; R,係選自由以下基團 ’且成之群._C〇2H、_CC>2CH3、_c〇2CH2CH3 及·c〇NCH3;且 R2係選自由以下基團組成之群：偶、偶吸、丄、
及 在西諾沙星骨架之一實施例中 ，其具有以下結構：
t34691.doc 200927102 CF ’ Y1係選自由以下基團組成之群：、CCH3、N、 CC卜CF ; R丨係選自由以下基團組成之群：_c〇2h、_c〇2CH3 、-co2ch2ch3、-conch3 ; r2係選自由以下基團組成之 群：-CH3、-CH2CH3、xk、
;且 及 R3及R·4獨立地選自由以下基團組成之群： ❺ 、Cl及F 。 抑制劑之實施例包括R-(-)·變嗎啡鹼氫氣酸鹽半水合物 及R-(-)-變嗎啡驗氫氣酸鹽半水合物類似物：
H ch3 抑制劑之實施例包括屬於一或多個以下群組之化合物： 格列本脲、格列本脲類似物及具有格列本脲骨架之化合 G 物格列本腺骨架之結構如左側所示且格列本脲之結構如 右側所示： L 格列本脲
‘ \ I 〇 在如上所示之格列本脲骨架中，γ、γ，、γ"及Y"，獨立地 選自由以下基團組成之群：_N_、_CH_&_C_X。在一實施 例中，-或多個Y、Y，、Y，，及γ，，為_N_，且一或多個Y、 134691,doc -91 · 200927102 γ、Y’’及Y’’’為-C-x。X係選自由以下基團組成之群、cH3 、-F、-Cl-及-〇CH3。
Ri為芳基，其中在一實施例中，芳基係選自本部分所述 之較佳實施例中所述之芳基；且心、尺3及心獨立地選自由 以下基團組成之群：-H、-CH3、-CH2CH3及異丙基。在-·* 實施例中，R2、I及R4中之兩者或兩者以上為_H。 I係選自由以下基團組成之群中之一者： 烷基 芳基
n=0,1,2 ' ' n=l,2 ^ ’ ’其中在一實施例中，烷基係選自 本部分所述之較佳實施例中所述之烷基。在一實施例中， 下基團組成之群中之一者： 抑制劑之實施例包括格列本脲類似物及具有格列本脲骨 架之化合物。格列本脲骨架之結構如下所示：
-r5 N N R3 R4 在如上.所示之f列本脲骨架中，Ri係選自由以下基團3
成之群-〜 .——CT、F,v、cr及 R2、R3及R4獨立地選自由以下基團組成之群：H、、 CHAH3及CH(CH3)2;且&係選自由以下基團組成之群： ch3、ch2ch3、 、、人、\0、 抑制劑之實施例包括r(_)_n_烯丙基去甲變嗎啡鹼氫溴酸 鹽（如下所示）及R(-)-N-烯丙基去曱變嗎啡鹼氫溴酸鹽類似 cr 134691.doc •92- 200927102 物：
抑制劑之實施例包括LFM-A13(如下所示）及LFM_A13類 似物：
Br
〇 抑制劑之實施例包括Ro 41-0960(如下所示）及尺〇 41 0960類似物： 0
N〇2 Ο 抑制劑之實施例包括屬於一或多個以下群組之化合物： 托品醯胺、托品醯胺類似物及具有托品醯胺骨架之化合 物。托品醯胺骨架之結構如左側所示且托品醯胺之結構如 右側所示：
托品醯胺 0 oh 八
Ri R2 在如上所示之托品醢胺骨架中，R!為芳基，其中在—實 施例中，芳基係選自本部分所述較佳實施例中所述之关 . , 芳基 基。在一實施例中，R!為苯基。R2為门n=1,2 ;且 R·3為烷基，其中在一實施例中，烷基及芳基獨立地選自 134691.doc •93- 200927102 本部分所述較佳實施例中所述之貌基及芳基。 抑制劑之實施例包括（±)-沙力度胺（thalidomide)及（士)_沙 力度胺類似物。在本發明之一實施例中，抑制劑為不同於 沙力度胺或沙力度胺類似物之化合物。
抑制劑之實施例包括U-62066(如下所示）及似 物：
抑制劑之實施例包括釕紅h3丨5Ruoru(nh3)4〇r_3丨5 h及釘紅類似 物然而，該等化合物通常具有非特異性活性且因此可能 不適合於開發為藥物。
抑制^之實施例包括氟化4_(2_胺基乙基）苯磺醯基氫氣 o=s=o (φ.Ηα 酸鹽Η2Ν^ 及氟化4_(2-胺基乙基）苯磺醯基氫氣酸鹽類似 物。氟化4-(2-胺基乙基）苯磺醯基氫氯酸鹽為不可逆絲胺 酸蛋白酶抑制劑且可為蛋白質或DNA之共價修飾劑且因此 可能不適合於開發為抗病毒藥物。 抑制劑之實施例包括替沃噻噸（thi〇thixene) 134691.doc -94- 200927102
，及替沃噻噸類似物。 抑制劑之實施例包括（±)-3-胺基-1 ·羥基-2-吡咯啶酮及 (±)-3-胺基-1·經基-2-°比洛咬嗣類似物。 抑制劑之實施例包括S(-)-3PPP氫氣酸鹽（丙克拉莫 (Preclamol)氫氣酸鹽，由Astra銷售）及s(_)_3ppp氫氣酸鹽 (丙克拉莫氫氣酸鹽）類似物。 ❹ 抑制劑之實施例包括螺朵林、螺朵林類似物及具有螺朵 林骨架之化合物。螺朵林骨架之結構如左側所示且螺朵林 之結構如右側所示：
❹ Y及Y’獨立地選自由-CH2-Y為-Ο-且 γ·為-CH2-。 ’芳基獨立地選自本部分 在如上所示之螺朵林骨架中， 及-〇-組成之群。在一實施例中， Rl為芳基，其中在一實施例中 所^^實施财所述之芳基。在—㈣實施例中，R1 為、2’其中Xl及X2各自獨立地選自由以下基團組成 之群：-CH3、-F、-C1 及-OCFT -h 由 CH3。在—實施例中，χαχ各 自為-C1 〇 R2係選自由及-榇其& # A ^ « 3(S 土、、成之群，其中在一實施例中， 烷基獨立地選自本部分 參> , I敕佳實施例中所述之烷基。在 一實施例中，r24_CH3。 134691.doc •95· 200927102 ,v〇 選自本 烷基 R3係選自由以下基團組成之群：ΥΝ、貌基、γΝ- 及Υ ，其中在一實施例中，烷基及芳基獨立地 部分所述較佳實施例中所述之貌基及芳基。 在一實施例中，r3、\:n\/。 在一實施例中，螺朵林骨架之結構如下所示：
在如上所示之螺朵林骨架中，Ri_R5獨立地選自由以下 基團組成之群：Η、CH3、Cl、F及〇CH3。 醫藥調配物及投藥途徑 本發明之實施例包括在本文巾賴別且與—或多種醫藥 〇學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑及/或佐劑一起調配 之一或多種抑制劑。此外，本發明之實施例包括該等與— 或多種醫藥學上可接受之助劑一起調配之抑制劑。詳言 之，一或多種抑制劑可與一或多種醫藥學上可接受之賦^ 劑稀釋劑、載劑及/或佐劑一起調配以提供本發明之組 合物之實施例^ 在—實施例中，抑制NS4B多肽與HCV負鏈rna之 '°之抑制劑（通常下文稱為”本發明之活性劑"或"藥物"） 可與-或多種醫藥學上可接受之賦形劑一起調配。 134691.doc -96. 200927102 多種醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中已知。醫藥 學上可接受之賦形劑已充分描述於多種刊物中，該等刊物 包括（例如）A. Gennaro (2000)”Remington : The Science and Practice of Pharmacy，"第 20版，Lippincott ’ Williams，& Wilkins i Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel等人編輯，第 7版，Lippincott， Williams » & Wilkins ;及 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe 等人編輯，第 3 版.Amer. Ο Pharmaceutical Assoc ο 醫藥學上可接受之賦形劑（諸如媒劑、佐劑、載劑或稀 釋劑）易於為公眾所用。此外，醫藥學上可接受之助劑（諸 如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其 類似物）易於為公眾所用。 在本發明之一實施例中，使用能夠產生所需效應（例如 減少病毒負荷、減輕肝臟纖維化、提高肝功能及其類似效 應）之便利方法向宿主投與抑制劑。因此，本發明之實施 ® 例提供併入多種調配物中之抑制劑以供治療性投藥。舉例 而言，本發明之實施例提供藉由與適當醫藥學上可接受之 載劑或稀釋劑組合而調配至醫藥組合物中且調配為固體、 半固體、液體或氣體形式之製劑（諸如錠劑、膠囊、散 劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射液、吸入劑及氣溶 膠）的抑制劑。 在本發明之實施例之醫藥劑型中，抑制劑可以其醫藥學 上可接受之鹽形式存在，或本發明之活性劑可單獨使用或 134691.doc -97- 200927102 與其他醫藥活性化合物適當結合以及組合使用。以下方去 及賦形劑僅為例示性的且並非以任何方式限制本發明。 對於口服製劑而言’抑制劑可單獨使用或與適當添加劑 組合使用以製備錠劑、散劑、顆粒或膠囊，例如與以下習 知添加劑組合，諸如乳糖、甘露糖醇、玉米澱粉或馬鈐薯 澱粉；與黏合劑組合，諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、 阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；與崩解劑組合，諸如玉米殺 粉、馬鈐薯澱粉或羧曱基纖維素鈉；與潤滑劑組合，諸如 © 滑石或硬脂酸鎂，·及若需要與稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、 防腐劑及調味劑組合。 抑制劑之實施例可藉由將其溶解、懸浮或乳化於水性或 非水性溶劑中而調配為供注射用之製劑，該溶劑係諸如植 物或其他類似油類、合成脂肪酸甘油酯、高碳脂肪酸或丙 二醇之酯；且若需要其具有習知添加劑，諸如増溶劑、等 滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑。 0 抑制劑之實施例可以氣溶膠調配物形式使用以經由吸入 投與。抑制劑之實施例可調配為可接受之加壓推進劑，諸 如二氣二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物。 此外，抑制劑之實施例可藉由與多種基劑（諸如乳化基 齊J或水心生基劑）混合而製備為栓劑。抑制劑之實施例可 經直腸經由栓劑投與。栓劑可包括諸如可可脂、碳蠟及聚 乙二醇之媒劑，其在體溫下熔融，但在室溫下凝固。 可提供用於經口或經直腸投藥之單位劑型（諸如糖漿、 醜劑及懸浮液），其中各劑量單位（例如茶匙量、湯起量、 134691.doc 98- 200927102 錠劑或栓劑）含有預定量之含有一或多種抑制劑之組合 物。類似地，用於注射或靜脈内投藥之單位劑型可包含於 無菌水、標準生理食鹽水或另一醫藥學上可接受之載劑中 的呈溶液形式之組合物中之抑制劑。 抑制劑之實施例可於本發明之可注射組合物中調配。一 般而言，可注射組合物經製備為液體溶液或懸浮液；亦可 製備適合於在注射之前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形 式。亦可將製劑於脂質體媒劑中乳化或將活性成份（抑制 © 劑）囊封於脂質體媒劑中。 在一實施例中，抑制劑經調配用於藉由連續傳遞系統傳 遞。術語"連續傳遞系統"在本文中可與"受控傳遞系統"互 換使用且包涵與導管、注射裝置及其類似物組合之連續 (例如受控）傳遞裝置（例如泵），該等裝置為此項技術中已 知0 機械或電動機械輸注泵亦可適用於本揭示案。該等裝置 之實例包括彼等描述於（例如）美國專利第4,692,147號；第 4,360,019號’第 4,487,603號；第 4,360,019號；第 4,725,852 號，第 5,820,589號；第 5,643,2〇7號；第 6 198 966號中之 裝置及其類似物。一般而言，抑制劑之傳遞可使用多種可 再填充果系統中之任一者實現。泵隨時間提供穩定之控制 釋放。在一些實施例中，抑制劑在藥物不可滲透中貯器中 之液體調配物中，且以連續方式傳遞至個體。 在一實施例中’藥物傳遞系統為至少部分可植入裝置。 可使用此項技術中熟知之方法及裝置將該可植入裝置植入 134691.doc •99- 200927102 任何合適植入位點。植入位點為個體體内藥物傳遞裝置引 入且安置之位點》植入位點包括（但不必限於）皮下 (subdermal，subcutaneous)、肌肉内或個體體内之其他合 適位點。在一些實施例中，由於植入及移除藥物傳遞裝置 之便利性而使用皮下植入位點。 適用於本揭示案之藥物釋放裝置可基於多種操作模式中 之任一者。舉例而言，藥物釋放裝置可基於擴散系統、對 流系統或可蝕性系統（例如基於溶蝕（erosi〇n)之系統）。舉 © 例而言’藥物釋放裝置可為電化學泵、滲透泵、電滲透 泵 蒸乳麗力泵或渗透衝擊基質（osmotic bursting matrix) ’當將藥物併入聚合物中且聚合物伴隨藥物浸潰聚 合材料（例如生物可降解、藥物浸潰聚合材料）之降解提供 藥物調配物釋放時。在其他實施例中，藥物釋放裝置係基 於電擴散系統、電解泵、發泡泵、壓電泵、水解系統等。 基於機械或電動機械輸注泵之藥物釋放裝置亦可適用於 ©本揭示案。該等裝置之實例包括彼等描述於（例如）美國專 利第 4,692，147 號；第 4,360,019 號；第 4,487,603 號；第 4,360,019號；第4,725,852號中之裝置及其類似物。一般而 言’本發明之治療方法可使用多種可再填充非可替換泵系 統中之任一者實現。泵及其他對流系統由於其通常隨時間 更加穩定之控制釋放而通常較佳。由於滲透泵具有更加穩 疋控制釋放與相對較小之尺寸的組合優勢（參見（例如）pct 公開申請案第WO 97/27840號及美國專利第5,985,305號及 第5,728,396號），所以在一些實施例中使用滲透泵❶適用 134691.doc -100· 200927102 於本揭示案之例示性滲透驅動裝置包括（但不必限於）彼等 描述於美國專利第3,760,984號；第3,845,770號；第 3,916,899號；第 3,923,426號；第 3,987,790號；第 3,995,631 號；第 3,916,899號；第 4,016,880號；第 4,036,228號；第 4，111，202號；第 4，111，203號；第 4,203,440號；第 4,203,442 號；第 4,210，139號；第 4,327,725 號；第 4,627,850號；第 4,865,845號；第 5,057,318號；第 5,059,423號；第 5，112,614 號；第 5，137,727號；第 5,234,692號；第 5,234,693 號；第 © 5,728,396號中之裝置及其類似物。 在一些實施例中，藥物傳遞裝置為可植入裝置。可使用 此項技術中熟知之方法及裝置將該藥物傳遞裝置植入任何 合適植入位點。如本文所述，植入位點為個體體内藥物傳 遞裝置引入且安置之位點。植入位點包括（但不必限於）皮 下（subdermal，subcutaneous)、肌肉内或個體體内之其他 合適位點。 在一些實施例中，使用可植入藥物傳遞系統（例如可程 〇 式化以提供藥劑投與之系統）傳遞活性劑。例示性可程式 化可植入系統包括可植入輸注泵。例示性可植入輸注泵或 適於與該等泵聯合使用之裝置為描述於（例如）美國專利第 4,350，155號；第 5,443,450號；第 5,814,019號；第 5,976，1〇9 號；第 6’017,328 號；第 6，171，276號；第 6,241，704號；第 6,464,687號；第6,475，180號及第6,512,954號中之彼等者。 可經調適用於本揭示案之另一例示性裝置為Synchr〇med輸 注果（Medtronic)。 134691.doc 200927102 抑制劑之合適賦形媒劑為（例如）水、鹽水、右旋糖、甘 油、乙醇或其類似物，及其組合。此外，若需要，則媒劑 可含有少量助劑（諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑）^製備 該等劑型之有效方法為熟習此項技術者已知或對其顯而易 見。參見（例如）Remingt〇n，s pharmaceutical ，
Mack Publishing Company ’ Easton，Pennsylvania，第 17 版，1985。在任何情況下，欲投與之組合物或調配物將含
有一定量之抑制劑足以在受治療之個體中達成需要狀態。 醫藥學上可接受之賦形劑（諸如媒劑、佐劑、載劑或稀 釋劑)易於為公眾所用。此外，醫藥學上可接受之助劑(諸 如PH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其 類似物）易於為公眾所用。 本揭示案之組合物可與持續釋放或控制釋放基質一起使 用。此外’本揭示案之實施例可與使用持續釋放調配物之 其他療法結合使^如本文所用之持續釋放基料由可藉 由基於酶或酸水解或藉由溶解而降解之物f (通常 物）製成的基質。在插入體内後，~ ° ^ 暴質受到酶及體液之作 用。持續釋放基質適宜地選自生物相容性物質，諸如脂質 體、聚丙交醋（聚乳酸）、聚乙交醋（乙醇酸之聚合物）、聚 丙交醋共乙交醋(乳酸與乙醇酸之共聚物)、聚酸軒 酸醋 '多1、玻糖搭酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、錢'、 脂肪酸、鱗脂、多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸（諸 丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸）、聚核苷酸、聚乙歸旯 埽、聚乙婦基…嗣及聚秒氧。例示性生物可降心 134691.doc -102- 200927102 包括聚丙交酯基質、聚乙交酯基質及聚丙交酯共乙交酯 (乳酸與乙醇酸之共聚合物）基質。 在另一實施例中，在控制釋放系統中提供本發明之醫藥 組合物（以及組合組合物）。舉例而言，可使用靜脈内輸 注、可植入滲透泵、經皮貼片、脂質體或其他投藥模型投 與抑制劑。在一實施例中，可使用泵（Sefton (1987). CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 ; Buchwald 等人（1980). Surgery 88:507 ; Saudek 等人（1989). N. Engl. J. Med. © 321:574)。在另一實施例中，使用聚合材料。在另一實施 例中，將控制釋放系統接近於治療標把（亦即大腦）安置， 因此僅需要少量全身劑量。其他控制釋放系統在評述
Langer (1990). Science 249:1527-1533 中討論。 在另一實施例令，本揭示案之組合物（以及組合組合 物’無論以獨立單位劑型投與或以單次劑型一起投與）可 滲透至吸收性材料（諸如縫合線、繃帶及紗布）中或塗佈於 固相材料表面上。此類其他傳遞系統將易於為熟習此項技 術者所顯而易見。 治療方法 本揭示案之實施例包括治療感染黃病毒科之病毒的方 法。詳^之，本文所述或使用本發明之篩選方法所鑑別之 抑制劑可用於治療黃病毒科病毒感染。在一實施例中，抑 制劑可與其他抗病毒劑組合以治療黃病毒科病毒感染。該 方法之實施例包括向有此需要之個體投與一或多種抑制 刪B多肽與HCV負鍵RNA之3，utr之結合的抑制劑。在一 134691.doc 200927102 實施例中，本發明提供治療黃病毒感染（例如HCV感染）之 方法及減少可能作為HCV感染之續發症發生之肝臟纖維化 之方法。 在一實施例中，抑制劑可包括一或多種上述抑制劑。在 一實施例中，抑制劑為克立咪峻氫氯酸鹽（1-對氣苯甲基· 2-(1-«比咯啶基）甲基苯并咪唑氫氣酸鹽）、其類似物或衍生 物（類似物）。關於克立咪唑及克立咪唑之給藥的其他細節 如上所述。 〇 在一實施例中，抑制劑之有效量為當以一或多個劑量向 有此需要之宿主（例如人類）投與時與未以抑制劑治療之個 體中之病毒負荷相比將個體中之HCV病毒負荷減少至少約 10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約 30°/〇、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約 50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約 70%、至少約75%、至少約80°/〇、至少約85%或至少約90% 或90%以上之量。 病毒負荷可藉由量測血清中之病毒力價或含量來量測。 該等方法包括（但不限於）定量聚合酶鏈反應（PCR)及分枝 DNA(bDNA)測試。已開發出量測HCV RNA之病毒負荷（力 價）之定量檢測法。可購得許多該等檢測法，包括定量反 轉錄 PCR(RT-PCR)(Amplicor HCV Monitor™ > Roche Molecular Systems，New Jersey);及分枝DNA(脫氧核糖 核酸）信號擴增檢測法（QuantiplexTM HCV RNA Assay (bDNA)，Chiron Corp.，Emeryville，California)。參見（例 134691.doc 104· 200927102 如）Gretch等人.（1995) Ann. Intern. Med. 123:321-329。由 Chiron Corporation以商標名Procleix®出售之核酸測試法 (NAT)亦受關注，其中NAT同時測試HIV_1及HCV之存在。 參見（例如）Vargo 等人.（2002) Transfusion 42:876-885。 在一些實施例中’抑制劑之有效量為當以一或多個劑量 向有此需要之宿主（例如人類）投與時與未以抑制劑治療之 個體中之肝功能相比將個體中之肝功能提高至少約1〇%、 至少約1 5%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少 © 約3 5%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約 55%、至少約60%、至少約65°/。、至少約70%、至少約 75%、至少約80%、至少約85〇/〇或至少約90%或9〇%以上之 量。 在一些實施例中’抑制劑之有效量為當以一或多個劑量 向有此需要之宿主（例如人類）投與時與未以抑制劑治療之 個體中之肝臟纖維化程度相比將宿主中之肝臟纖維化減少 至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少 約30%、至少約35°/。、至少約40%、至少約45%、至少約 50%、至少約55%、至少約6〇%、至少約65%、至少約 70%、至少約75%、至少約·、至少約85%或至少約9〇% 或90%以上之量。 肝臟纖維化減少量係藉由分析肝臟生檢樣品測定。肝臟 生檢之分析包含評估兩個主要要素：作為嚴重性及正在進 行之疾病活性之量度的由"等級"評估之壞死性炎症，及作 為長期疾病冑展之反映的由•，階段"評估之纖維化病變及實 134691.doc •105· 200927102 質或血管重塑。參見（例如）Brunt (2000) HePat〇i. 31:241· 246 ;及METAVIR (1994) Hepatology 20:15-20。基於肝臟 生檢之分析，賦予一分值。存在多種標準化記分系統’其 提供纖維化程度及嚴重性之定量評估。其包括 METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig及 Ishak記分系統。 METAVIR記分系統係基於肝臟生檢之各種特徵之分 析，該等特徵包括纖維化（門靜脈纖維化、小葉中心纖維 化及硬化）；壞死（碎片狀壞死及小葉狀壞死、嗜酸回縮 〇 (acidophilic retraction)及氣球樣變性）；炎症（門靜脈管炎 症、門靜脈淋巴凝集及門靜脈炎症分布）；膽管變化；及 Knodell指數（門靜脈周壞死、小葉狀壞死、門靜脈炎症、 纖維化及總體疾病活性之計分）。METAVIR系統中各階段 之定義如下：分值：〇，無織維化；分值：1，門靜脈管星 形擴大但無隔膜形成；分值：2，門靜脈管擴張，其中形 成少量隔膜；分值：3，大量隔膜但無硬化；及分值：4, 硬化。
Knodell記分系統（亦稱為肝炎活性指數）基於分值將標本 分類為四種組織特徵類型：I·門靜脈周及/或橋接壞死；π· 小葉内變性及局灶狀壞死；III.門靜脈炎症；及IV.纖維 化。在Knodell分階系統中，分值如下：分值：〇，無纖維 化；分值：1，輕度纖維化（纖維狀門靜脈擴大）；分值： 2，中度纖維化；分值：3，嚴重纖維化（橋接纖維化）；及 分值：4，硬化•分值愈高，肝臟組織損傷愈嚴重. Knodell (1981) Hepatol· 1:431 〇 134691.doc 200927102 在Scheuer記分系統中，分值如下：分值：〇，無纖維 化’分值：1 ’纖維變性門靜脈管擴大；分值：2，門靜脈 周或門靜脈-門靜脈隔膜，但結構完整；分值：3 ,纖維 化，其中結構扭曲但無明顯硬化；分值：4，極可能或確 定之硬化。Scheuer (1991) J. Hepatol. 13:372。
Ishak記分系統係描述於ishak (1995) J. Hepatol. 22:696-099中。階段〇 ’無纖維化；階段1，一些門靜脈區纖維狀 擴大’有或無短纖維狀隔膜；階段2，大多數門靜脈區纖 © 維狀擴大’有或無短纖維狀隔膜；階段3，大多數門靜脈 區纖維狀擴大，具有偶見之門靜脈與門靜脈（ρ_ρ)橋接；階 段4’門靜脈區纖維狀擴大’具有標記之橋接（ρ_ρ)以及門 靜脈-中心（P-C);階段5，標記之橋接（ρ_ρ及/或p_c)，具有 偶見之結節（不完全硬化）；階段6，硬化，極可能或確定。 本發明療法之益處亦可藉由使用Child Pugh記分系統量 測及評估’該記分系統包含基於血清膽紅素含量異常、也 清白蛋白含量異常、凝血酶原時間異常、腹水之存在及嚴 ® 重性及腦病之存在及嚴重性的多要素評分系統。基於該等 參數之異常的存在及嚴重性’可將患者歸於三類增加嚴重 性之臨床疾病中之一者中：A、B或C。 本揭示案之實施例提供適用於治療患有病毒感染之患者 的方法、抑制劑及醫藥調配物。在一實施例中，患者感染 有HCV但未知感染有任何其他病毒，包括（但不限 於）HIV。在另一實施例中’患者感染有HCV及一或多種其 他病毒，包括（但不限於）HIV。在一實施例中，患者藉由 134691.doc •107- 200927102 僅投與適用於治療HCV感染之如本文所述之單一抑制劑治 療病毒感染。在另一實施例中，患者藉由投與適用於治療 HCV病毒感染之本文所述之抑制劑以及已知適用於治療病 毒感染之一或多種其他藥劑治療病毒病毒感染。在一實施 例中，該或該等其他藥劑不包括CCR-5拮抗劑。在另一實 施例中，該或該等其他藥劑包括CCR-5拮抗劑，且患者感 染有HCV但未知感染（或未感染）有HIV。 劑量 〇 可向宿主投與一或多個劑量之抑制劑之實施例。在一實 施例中，可投與每劑約10 mg至1000 mg、例如每劑約10 mg 至 20 mg、約 20 mg 至 25 mg、約 25 mg 至 50 mg、約 50 mg 至 75 mg、約 75 mg 至 100 mg、約 100 mg 至 125 mg、約
125 mg至 150 mg、約 150 mg至 175 mg、約 175 mg至 200 mg、約 200 mg 至 225 mg、約 225 mg 至 250 mg、約 250 mg 至 300 mg、約 300 mg 至 350 mg、約 350 mg 至 400 mg、約 400 mg至 450 mg、約 450 mg至 500 mg、約 500 mg至 750 mg 或約750 mg至1000 mg之量的抑制劑。 在一實施例中，每劑之抑制劑之量係基於每單位體重來 碟定。舉例而言，在一實施例中，可投與約0.5 mg/kg至 100 mg/kg，例如，每劑約 0.5 mg/kg至 1 mg/kg、約 1 mg/kg 至 2 mg/kg、約 2 mg/kg 至 3 mg/kg、約 3 mg/kg 至 5 mg/kg、 約 5 mg/kg 至 7 mg/kg、約 7 mg/kg 至約 10 mg/kg、約 10 mg/kg至 1 5 mg/kg、約 1 5 mg/kg至 20 mg/kg、約 20 mg/kg至 25 mg/kg ' 約 25 mg/kg 至 30 mg/kg、約 30 mg/kg 至 40 134691.doc -108- 200927102 mg/kg、約 40 mg/kg至 50 mg/kg、約 50 mg/kg至 00 mg/kg、 約 60 mg/kg 至 70 mg/kg、約 70 mg/kg 至 80 mg/kg、約 80 mg/kg至 90 mg/kg或約 90 mg/kg至 100 mg/kg或大於約 100 mg/kg之量的抑制劑。 關於克立咪唑給藥之其他細節如上所述。 熟習此項技術者將易於瞭解劑量含量可隨特定抑制劑之 功能、症狀之嚴重性及個體對副作用之易感性而變化。給 定化合物之較佳劑量可易於由熟習此項技術者藉由各種方 © 法確定。 在一實施例中，投與多次劑量之抑制劑。投與抑制劑之 頻率可視多種因素（例如症狀之嚴重性及其類似因素）中之 任一者而變化。舉例而言，在一實施例中，至少每月一 次、每月兩次 '每月三次、每隔一週（q〇w)、每週一次 (qw)、每週兩次（biw)、每週三次（tiw)、每週四次每週五 次、每週六次、每隔一日（q〇d)、每日（qd)、一日兩次（㈣ 或-曰三次（tid)投與抑制劑。如以上所討論，在一實施例 中，持續投與抑制劑。 投與抑制劑之持續時間（例如投與抑制劑所經時段）可視 多種因素中（例如争去应雍笼w & 土 町仅Ν視 言，可經約-日$ 者而變化。舉例而 月約兩個月、約兩週至四週、約一個月至兩個 、 月至四個月、約四個月至六個月、約六個 八個月、約人個月至1年、約1年至2年或約2年至4年 以上之時段投與抑制劑。 年或年 投第途徑 134691.doc 200927102 本發明之實施例提供、Α 八/〇療病毒感染之方法，其包含使用 任何適合於藥物傳遞之 匕含使用 體方法以及全身法及途徑（包括活體内及離 制劑。 身及局部投樂途徑)向宿主(例如人類)投與抑 投藥途徑包括鼻内、 异内肌肉内、氣管内、皮下、皮内、局 部施用、靜脈内、經亩賸彡_自 η 从 _ 鼻、經口及其他腸内及非經 腸投藥途徑。若需要，目丨丨4a # 則投樂途徑可視藥劑及/或所需效 Ο 應而定經組合或調節。活性劑可以單次劑量或多次劑量投 ”本文所述之許多抑制劑適合於經口投與，其可能對於 大多數患者而言較佳。 、 可使用適合於傳遞習知藥物之可用習知方法及途徑（包 ^全身或局部途徑）向宿主投與抑制劑之實施例。一般而 。本揭不案/函蓋之投藥途徑包括（但不限於）腸内、非經 腸或吸入途徑。 不同於吸入投藥之非經腸投藥途徑包括(但不限於)局 部、經皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内 及靜脈内途徑’亦即任何不同於經由消化道之投藥途徑。 可進行非經腸投藥以實現抑制劑之全身或局部傳遞。當需 要全身傳遞時’投藥通常包括侵入性或全身吸收局部或點 膜投與醫藥製劑。 抑制劑亦可藉由腸内投藥傳遞至個體。腸内投藥途徑包 括（但不限於）經口及經直腸（例如使用栓劑）傳遞。 經由皮膚或黏膜投與抑制劑之方法包括（但不限於）局部 施用合適醫藥製劑’經皮傳遞、注射及經表皮投藥。對於 134691.doc -110- 200927102 經皮傳遞而言，吸收促進劑或離子導入療法為合適方法。 離子導入傳遞可使用市售"貼片"實現，該等貼片經由電脈 衝持續穿過未破損皮膚傳遞其產品歷時數日或數曰以上。 組合療法 本發明之實施例包括治療病毒感染之方法、抑制劑及醫 藥調配物。適用於本揭示案之方法的抑制劑及醫藥調配物 之實施例可與其他抗病毒劑組合使用以治療病毒感染。在 一實施例中，根據本發明之方法，用於治療感染黃病毒科 Q 病毒感染之宿主之抑制劑與一或多種其他抗HCV藥劑組合 使用以治療HCV感染。在一實施例中，根據本發明之方 法，預防NS4B與HCV RNA之3'-UTR結合的抑制劑（在本文 中亦稱為"HCV NS4B拮抗劑"）可與一或多種其他抗HCV藥 劑組合使用以治療HCV感染。 當前治療HCV感染之醫療實踐通常使用干擾素-α單一療 法或利巴韋林（諸如病毒嗤（Rebetol)或可匹格（Copegus))與 干擾素-α(諸如干擾素a 2b)或聚乙二醇化干擾素（諸如派羅 ® 欣（Pegasys，由 Roche 鎖售）或佩樂能（PEG-Intron，由 Schering Plough銷售））之組合療法。根據本揭示案之方 法，抑制劑可與該等標準療法組合使用以治療HCV感染。 正在開發許多HCV蛋白酶抑制劑用於治療HCV感染，且 根據本揭示案之方法，共投與預防NS4B與HCV RNA之3’-UTR之結合的抑制劑與HCV蛋白酶抑制劑可有效治療 HCV。在一實施例中，干擾素α及/或核苷類似物（諸如利巴 韋林）亦用於該組合療法中。合適HCV蛋白酶抑制劑包括 134691.doc -111 - 200927102 (但不限於）泰拉派維（telaprevir，VX-950，Vertex)、BILN 2061 及BI12202(Boehringer Ingelheim)、保斯派維（boceprevir ，SCH 503034 * Schering Plough) ' ITMN191 (Roche/ InterMune/Array BioPharma)、MK-7009(Merck)、TMC435350 (Tibotec/Medivir)、ACH-1095及 ACH-806(Achillion/Gilead)， 及其他NS3/NS4A蛋白酶抑制劑，包括（但不限於）Presidio 正在開發中之化合物。 正在開發許多HCV RNA聚合酶（NS5B)抑制劑用於治療 © HCV感染，且根據本揭示案之方法，共投與預防NS4B與 HCV RNA之3'-UTR之結合的抑制劑與HCV RNA聚合酶抑 制劑可有效治療HCV。在一實施例中，干擾素α及/或核苷 類似物（諸如利巴韋林）及/或HCV蛋白酶抑制劑亦用於該組 合療法中。合適HCV RNA聚合酶抑制劑包括（但不限於）瓦 諾 °比他濱（valopicitabine，ΝΜ283，Idenix/Novartis)、 HCV-796(Wyeth/ViroPharma)、R1626(Roche)、R7128(Roche/ Pharmasset)、GS-9190(Gilead)、MK-0608(Merck)、PSI- o w 6130(Pharmasset)及PFE-868,554(PFE)。 正在開發許多Toll樣受體（TLR)促效劑用於治療HCV感 染，且根據本揭示案之方法，共投與預防NS4B與HCV RNA之3'-UTR之結合的NS4B拮抗劑與TLR促效劑可有效治 療HCV。在一實施例中，干擾素α及/或核苷類似物（諸如利 巴韋林）及/或HCV蛋白酶抑制劑及/或HCV RNA聚合酶抑 制劑亦用於該組合療法中。合適TLR促效劑包括（但不限 於）TLR7促效劑（亦即 ΑΝΑ245 及 ANA975(Anadys/Novartis)) 134691.doc -112- 200927102 及TLR9促效劑（亦即艾克倫（Actilon，Coley)及IMO-2125(Idera)) ° 正在開發許多噻唑啶衍生物用於治療HCV感染，且根據 本揭示案之方法，共投與預防NS4B與HCV RNA之3'-UTR 之結合的NS4B拮抗劑與噻唑啶（包括（但不限於）硝唑尼特 (Alinia，或硝《坐尼特之其他持續釋放調配物或其他嘆嗤 °定，Romark Laboratories))可有效治療HCV。在一實施例 中，干擾素α及/或核苷類似物（諸如利巴韋林）及/或HCV蛋 Ο 白酶抑制劑及/或HCV RNA聚合酶抑制劑及/或TLR促效劑 亦用於該組合療法中。 在本揭示案之方法的另一實施例中，共投與預防NS4B 與HCV RNA之3’-UTR之結合的抑制劑與親環素抑制劑（亦 即 NIM-81 l(Novartis)及 DEBIO-02 5(Debiopharm))及 /或 α-葡 糖普酶抑制劑（亦即塞而高斯（Celgosivir，Migenix))及/或 一或多種來自本文所討論之一或多種其他類別之HCV治療 劑的藥劑係用於治療HCV感染。此外，NS4B内存在若干 標靶，且根據本揭示案之方法，與該等其他標靶相互作用 之化合物可與預防NS4B與HCV RNA之3'-UTR結合之NS4B 拮抗劑及視情況本文提及之一或多種其他類別之抑制劑組 合使用以治療HCV感染。該等其他NS4B標靶包括：N末端 兩性螺旋（參見PCT公開案WO 2002/089731，該案係以引 用的方式併入本文中）；NS4B GTP酶（參見PCT公開案WO 2005/032329，該案係以引用的方式併入本文中）；第二兩 性螺旋，第一兩性螺旋在NS4B中之PIP2結合活性（參見美 134691.doc •113- 200927102 國臨時專利申請案第60/057,1 88號，該案係以引用的方式 併入本文中）。 可與本揭示案之預防NS4B與HCV RNA之3'-UTR結合之 抑制劑組合使用之其他藥劑包括：（i)靶向NS5A之藥劑， 包括（但不限於）A-831(Arrow Therapeutics)、AZD2836 (Astra Zeneca)及XTL/Presidio或BMS正在開發中之藥劑（參 見 PCT公開案 WO 2006/133326及 WO 2008/021928，該等案 係以引用的方式併入本文中）；（H)靶向TBC1D20及/或 © NS5A與TBC1D20相互作用之藥劑（參見PCT公開案WO 2007/018692及美國專利申請案第1 1/844,993號，該等案係 以引用的方式併入本文中）；（iii)靶向NS4B之GTP酶活性的 藥劑（參見PCT公開案WO 2005/032329及美國專利申請公 開案2006/0199174，該等案係以引用的方式併入本文中）； (iv)抑制由HCV兩性螺旋（諸如彼等NS5A、NS4B及NS5B中 發現之兩性螺旋）所介導之膜結合之藥劑（參見前述PCT公 開案WO 2002/089731) ; (v)靶向HCV蛋白中之PIP2或 ® BAAPP域（諸如彼等NS4B及NS5A中發現者）之藥劑（參見前 述美國臨時專利申請案60/057，188) ; (vi)靶向HCV進入、 組裝或釋放之藥劑，包括協同受體之抗體；（vii)靶向HCV NS3解旋酶之藥劑；（viii)siRNA、shRNA、反向RNA或其 他靶向HCV中之序列的基於RNA之分子；（ix)靶向微 RNA122或調節HCV複製之其他微RNA之藥劑；（X)靶向 PD-1、PD-L1或PD-L2相互作用或路徑之藥劑（參見美國專 利申請公開案 20080118511、20070065427、20070122378， 134691.doc -114- 200927102 該等案係以弓丨用&女斗、# x +、. 用的方式併入本文中），及（xi)靶向HCV兩性 螺旋功能之藥劑，諸如AH2抑制劑。 在本揭示案之另一實施例中，預防NS4B與HCV RNA之 3’-UTR結♦的抑制劑與一或多種能夠治療财感染之藥物 組合使用以治療同時感染爾與HCV之患者。在本揭示案 之另一實施例中，預防NS4B與HCV RNA之3，-UTR結合的 抑制劑與-或多種能夠治療HBV感染之藥物組合使用以治 療同時感染HBV與HCV之患者》在一實施例中，預防 © NS4B與HCV RNA之3'-UTR結合的抑制劑與pD_L1抑制劑 組合使用以治療病毒感染。 如上所述，本發明之實施例包括投與本文所鑑別（或藉 由使用本發明之篩選之一實施例所鑑別）之抑制劑以及至 少一種其他治療劑以治療病毒感染。合適之其他治療劑包 括（但不限於）利巴韋林；核苷類似物（例如左旋韋林 (levovirin)、偉拉咪定（viramidine)等）；NS3抑制劑；NS5 抑制劑；干擾素；及副作用控制劑。 在一實施例中，至少一種其他合適治療劑包括利巴韋 林。利巴韋林（Ι-β-D-呋喃核糖基-出-丨二肛三唑-3·曱醯 胺，購自 ICN Pharmaceuticals , Ine，costa Mesa，Calif.) 係描述於Merck Index(第十一版）中之化合物第8199號。其 製備及調配係描述於美國專利第4,211，771號中。本揭示案 亦涵蓋利巴韋林衍生物之用途（參見（例如）美國專利第 6,277,830號）° 在一實施例中’至少一種其他合適治療劑包括左旋韋 134691.doc •115· 200927102 林。左旋韋林為利巴韋林之L_對映異構物，且與Th2免疫 反應相比展現提高TM免疫反應之特性。左旋韋林係由 ICN Pharmaceuticals製備。 在一實施例中，至少一錄：Air人、Λ , 種其他σ適治療劑包括偉拉咪 定。偉拉咪定為利巴韋林之3_甲脉衍生物，且充當利巴韋 林之前藥。其係由腺苷脫胺酶有效轉化為利巴韋林。 適用於組合療法之核普類似物包括(但不限於)利巴韋 林、左旋韋林、偉拉咪定、愛沙托立賓（isatodbine)、美國 〇專利第5,559，101號中所揭示且由美國專利第5,559，101號之 式！所包涵之卜夫锋核糖基核普（例如i仙_β夫痛核糖基尿 ㈣、1Ά咬痛核糖基-5-氟尿哺H-β·!^夫喘核糖基 胞痛咬、9-P-L-吱喃核糖基腺嗓吟、9_p_L咳味核糖基次 黃示7 9 P-L-呋喃核糖基烏嘌呤、9-P-L-呋喃核糖基_6_ 硫代鳥嘌呤、2-胺基-a-L-呋喃核糖基[匕^:七”噁唑啉、 〇2,02-脫水-i-a—L —呋喃核糖基尿嘧啶、呋喃核糖基 ◎ 尿鳴咬1_(2,3,5-二-〇-苯甲醯基-a-呋喃核糖基）_4-硫代尿 嘧定1-a-L-呋喃核糖基胞嘧啶、Ι-α-L-呋喃核糖基_4_硫 代尿嘧啶、1_a_L-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶、2-胺基-β-L-阿 拉伯呋喃糖[1，，2，:4,5]噁唑啉、02,02-脫水44-阿拉伯呋 喃糖基尿嘧啶、2，-脫氧-β-L-尿苷、3,5，-二-〇-苯甲醯基_2, 脫氧硫代β-L-尿苦、2，-脫氧-β-L-胞苷、2，-脫氧-p-L-4-硫代尿苷、2，-脫氧-β-L-胸苷、21-脫氧-P-L-5-氟尿苷、 2’’3’-二脫氧尿苷、脫氧_p_L_5·氟尿苷及2，_脫氧_p_ L-肌皆）；美國專利第6 423,695號中所揭示且由美國專利 134691.doc -116- 200927102 第6,423,695號之式I所包涵之化合物；美國專利公開案第 2002/0058635號中所揭示且由美國專利公開案第 2002/0058635號之式1所包涵之化合物；WO 01/90121 A2 中所揭示之核苷類似物（Idenix); WO 02/069903 A2中所揭 示之核苦類似物（Biocryst Pharmaceuticals Inc.) ; WO 02/057287 A2或WO 02/057425 A2中所揭示之核苷類似物 (均為Merck/Isis);及其類似物。 在一實施例中，至少一種其他合適治療劑可包括HCV O NS3抑制劑。合適HCV非結構蛋白-3(NS3)抑制劑包括（但 不限於）美國專利第6,642,204號、第6,534,523號、第 6,420,380 號、第 6,410,531 號、第 6,329,417 號、第 6,3 29,3 79號及第6,323，180號中所揭示之三肽（Boehringer-Ingelheim);美國專利第6,143,715號中所揭示之化合物 (Boehringer-Ingelheim);美國專利第 6,608,027號中所揭示 之大環化合物（Boehringer-Ingelheim);美國專利第 6,617,309號、第6,608,067號及第6,265,380號中所揭示之 NS3 抑制劑（Vertex Pharmaceuticals)；美國專利第 6,624,290號中所揭示之氮雜肽化合物（8(；1161411§);美國專 利第5,990,276號中所揭示之化合物（Schering) ; Pause等人 (2003) J. Biol. Chem. 278:20374-20380 中所揭示之化合 物；NS3抑制劑 BILN 2061(Boehringer-Ingelheim ; Lamarre 等人（2002) Hepatology 36:301A;及 Lamarre 等人（2003 年 10 月 26 曰）Nature doi:10.1038/nature02099) ; NS3 抑制劑 VX-950(Vertex Pharmaceuticals ; Kwong 等人（2003 年 10 月 134691.doc -117- 200927102 24 曰-28 曰）54th Ann. Meeting AASLD) ; NS3 抑制劑 SCH6(Abib 等人（2003 年 10 月 24 日-28 日）Abstract 137. Program and Abstracts of the 54th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD). 2003 年 10 月 24 曰-28 曰.Boston，MA.) ; WO 99/07733 > WO 99/07734 ' WO 00/09558、WO 00/09543、 WO 00/59929或WO 02/060926中所揭示之NS3蛋白酶抑制 劑中之任一者（例如，WO 02/060926中第224-226頁之表中 © 所揭示之化合物2、3、5、6、8、10、11、18、19、29、 30、31、32、33、37、38、55、59、71、91、103、104、 105、112、113、114、115、116、120、122、123、124、 125、126及127);美國專利公開案第2003019067號、第 2003 01 87018號及第20030186895號之任一者中所揭示之 NS3蛋白酶抑制劑；及其類似物。 在一實施例中，用於本發明之組合療法之NS3抑制劑為 特定NS3抑制劑類別中之成員，例如抑制NS3絲胺酸蛋白 〇 酶活性且對其他絲胺酸蛋白酶（諸如人類白血球彈性蛋白 酶、豬胰腺彈性蛋白酶或牛胰腺胰凝乳蛋白酶或半胱胺酸 蛋白酶（諸如人類肝臟組織蛋白酶B))不展示大量抑制活性 之NS3抑制劑。 在一實施例中，至少一種其他合適治療劑包括NS5B抑 制劑。合適HCV非結構蛋白-5(NS5 ; RNA依賴性RNA聚合 酶）抑制劑包括（但不限於）美國專利第6,479,508號中所揭示 之化合物（Boehringer-Ingelheim);均由 Boehringer Ingelheim 134691.doc -118- 200927102
在2002年7月18日申請之國際專利申請案第PCT/CA02/01127 號、第 PCT/CA02/01128號及第 PCT/CA02/01 129號中之任 一者中所揭示之化合物；美國專利第6,440,985號中所揭示 之化合物（ViroPharma) ; WO 01/47883中所揭示之化合 物，例如 JTK-003(Japan Tobacco) ; Zhong 等人（2003) Antimicrob, Agents Chemother. 47:2674-2681 中所揭示之二 核皆酸類似物；Dhanak 等人（2002) J. Biol Chem. 277 (41):38322-7中所揭示之苯并噻二嗪化合物；WO 〇 02/100846 A1 或 WO 02/100851 A2 中所揭示之NS5B抑制劑 (均為 Shire) ; WO 01/85172 A1 或 WO 02/098424 A1 中所揭 示之NS5B抑制劑（均為 Glaxo SmithKline) ; WO 00/06529或 WO 02/06246 A1中所揭示之NS5B抑制劑（均為Merck); WO 03/000254 中所揭示之NS5B抑制劑（Japan Tobacco); EP 1 256,628 A2中所揭示之NS5B抑制劑（八经〇111*〇11);几1<：-002(Japan Tobacco) ; JTK-109(Japan Tobacco);及其類似 物0 ® 在一實施例中，用於本發明之組合療法之NS5抑制劑為 特定NS5抑制劑類別之成員，例如抑制NS5 RNA依賴性 RNA聚合酶且對其他RNA依賴性RNA聚合酶及DNA依賴性 RNA聚合酶缺乏大量抑制效應之NS5抑制劑。 在一實施例中，至少一種其他治療劑為干擾素，例如干 擾素-a(IFN-a)。任何已知IFN-α可用於本發明之治療方 法。如本文中所使用之術語"干擾素-a"係指抑制病毒複製 及細胞增殖且調節免疫反應之相關多肽家族。術語"IFN- 134691.doc • 119· 200927102 α"包括天然存在之IFN-α ;合成IFN-α ;衍生IFN-α(例如聚 乙二醇化IFN-α、糖基化IFN-α及其類似物）；及天然存在 或合成IFN-a之類似物；具有抗病毒特性的基本上任何 IFN-a，如對於天然存在之IFN-a所述。 合適a干擾素包括（但不限於）天然存在之IFN-a(包括（但 不限於）天然存在之IFN-a2a、IFN-a2b);重組干擾素a-2b，諸如干擾能-A(Intron-A)干擾素（構自Schering Corporation，Kenilworth，N.J.);重組干擾素 a-2a，諸如 Ο 羅飛龍（Roferon)干擾素（購自 Hoffmann-La Roche， Nutley，N. J·);重組干擾素a-2C，諸如貝羅福（Berofor)cx2 干擾素（購自 Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.， Ridgefield，Conn.);干擾素α-nl，天然α干擾素之純摻合 物，諸如蘇飛龍（Sumiferon，購自 Sumitomo，Japan)，或 諸如惠福仁（Wellferon)干擾素a-nl(INS，購自01&乂〇-Wellcome Ltd.，London，Great Britain);及干擾素a-n3， 天然a干擾素之混合物（由Interferon Sciences製備且以商標 名阿飛龍（Alferon)購自 Purdue Frederick Co.，Norwalk， Conn.) 〇 術語"IFN-α”亦包涵複合IFN_a «複合IFN-a(亦稱為 "CIFN”及"IFN-con"及"複合干擾素"）包涵（但不限於）美國 專利第4,695,623號及第4,897,471號中所揭示之表示IFN-conl、IFN-con2及IFN-con3之胺基酸序列；及由測定天然 存在干擾素α之一致序列所定義之複合干擾素（例如 Infergen®，InterMune，Inc.，Brisbane，Calif.)。IFN- 134691.doc -120- 200927102 coni為Infergen®acon-l產品中之複合干擾素藥劑。 Infergen®複合干擾素產品在本文中由其商標名（Infergen®) 或其通用名（干擾素acon-1)提及。編碼IFN-con之DNA序列 可如上述專利中所述或其他標準方法合成。在一實施例 中，至少一種其他治療劑為CIFN。 在一實施例中，包含IFN-a及異源多肽之融合多肽亦可 用於本發明之組合療法。合適IFN-a融合多肽包括（但不限 於）Albuferon-alphaTM(人類白蛋白與IFN-a之融合產物； © Human Genome Sciences ;參見（例如）Osborn等人（2002)1· Pharmacol. Exp. Therap. 303:540-548)。亦適用於本揭示案 者為IFN-α之基因改組形式。參見（例如）Masci等人（2003) Curr. Oncol. Rep. 5:108-113。其他合適干擾素包括馬飛龍 (Multiferon，Viragen)、美杜莎（Medusa)干擾素（Flamel Technology)、羅特龍（Locteron，Octopus)及 ω 干擾素 (Intarcia/Boehringer Ingelheim) ο 術語"IFN-α"亦包涵經衍生（例如針對天然存在之肽進行 〇 W 化學修飾）以改變某些特性（諸如血清半衰期）之IFN-α衍生 物。因此，術語"IFN-a”包括糖基化IFN-a ;以聚乙二醇衍 生之IFN-a("聚乙二醇化IFN-a");及其類似物。聚乙二醇 化IFN-a及其製備方法如（例如）美國專利第5,382,657號； 第5,981，709號及第5,951，974號中所討論。聚乙二醇化IFN-a包涵PEG與上述IFN-a分子中之任一者之結合物，包括（但 不限於）與干擾素a-2a(羅飛龍，Hoffman La-Roche， Nutley，N.J.)、干擾素 a 2b(干擾能，Schering-Plough， I34691.doc • 121 - 200927102
Madison ’ N.J.)、干擾素 a-2c(貝羅福 a，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，Germany)結合之 PEG ;及由測定天 然存在干擾素α之一致序列所定義之複合干擾素 (Infergen®，InterMune，Inc” Brisbane，Calif.) 〇 在一實施例中’ IFN-α多肽可以一或多個聚乙二醇部分 修飾，亦即聚乙二醇化。聚乙二醇化IFN_a多肽之pEG分 子與IFN-a多肽之一或多個胺基酸侧鏈結合。在一實施例 中，聚乙二醇化IFN-a僅在一個胺基酸上含有peg部分。 © 在另一實施例中，聚乙二醇化IFN-a在兩個或兩個以上胺 基酸上含有PEG部分’例如iFN_a含有與兩個、三個、四 個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同胺基酸殘 基連接之PEG部分^ IFN-a可直接經由胺基、硫氫基、羥 基或羧基與PEG偶合（亦即無需鍵聯基團）。 為確定抑制劑（諸如克立咪唑）與其他抗HCV藥劑之最優 組合，可在各種抗HCV藥劑之各種組合存在下執行Hcv複 ◎ 製檢測及/或動物研究。在另一藥劑（在其上進行單一療法 觀察者）存在下對複製之抑制增強為組合療法潛在益處之 證據。 舉例而言，圖1A及1B展示在克立咪唑與NS3蛋白酶抑制 劑（SCH5 03034)之各種組合存在下使用螢光素酶報導基因 鍵聯HCV基因組的HCV複製檢測法。在該檢測中，螢光素 酶活性與HCV RNA基因組複製成正比。在該方法中，將 Huh 7.5細胞以野生型螢光素酶報導基因鍵聯11(：^基因組 電穿孔，且將置於板中之重複樣在指定濃度之克立咪唑與 134691.doc -122- 200927102 SCH503034(SCH)存在下培養72小時，繼而溶解及測定螢 光素酶活性’基本上如（Nature Biotechnology 26，1〇19_ 1027 (2008)，該文獻之全文係以引用的方式包括於本文 中）所述。結果可在線性或對數標度上繪製為藥物濃度之 函數以產生複製抑制曲線。在增加濃度之克立咪唑存在 下，NS3抑制劑之抑制曲線展示顯著較多之抑制。詳言 之，在低微莫耳濃度之SCH5〇3〇34(諸如U微莫耳）下添 加克立咪唑可以劑量依賴性方式使對HCV複製之抑制增強 ^ 達數個對數級。類似地，根據本發明之方法，當共投與 NS4B拮抗劑與其他NS3蛋白酶抑制劑，及與具有不同於與 克立咪唑具有相同作用機制之NS4B拮抗劑之作用機制的 其他抗HCV藥劑時預期組合療法之功效增強（與單一療法 相比）。該等結果不僅提供克立咪唑與8€115〇3〇34之組合療 法的明顯證據，且展示在使用本揭示案所提供之該等及類 似組合療法之活體内療法之後可預期改良之功效及可能降 ^ 低之耐藥性。此外，該等結果展示熟習此項技術者可易於 執行檢測以確定適用於本發明之方法之實施例的ns4b拮 抗劑與鑒於本文之揭示内容的其他抗11(：¥藥劑之最佳組合 療法。 在一實施例中’副作用控制劑可用於本發明之治療方法 中且其包括有效控制疼痛之藥劑；改善胃腸不適之藥 劑；止痛藥；消炎藥；抗精神病藥；抗神經病藥、抗焦慮 藥及ΐς血劑。此外，本發明之實施例涵蓋在以本發明之療 法伯療期間使用任何化合物緩解性護理遭受疼痛或任何其 134691.doc -123· 200927102 他副作用之患者。例示性緩解劑包括乙醯胺苯酚、布洛芬 (ibuprofen)、其他NSAID、H2阻斷劑及抗酸劑。 適合於治療之宿主 適合於以該抑制劑之一實施例或該方法之一實施例治療 之宿主包括感染有黃病毒之宿主。如本文中所使用之術語 "黃病毒"包括黃病毒科之任何成員，包括（但不限於）登革 病毒，包括登革病毒1、登革病毒2、登革病毒3、登革病 毒4(參見（例如）GenBank寄存編號第M23027號、第M19197 〇 號、第A34774號及第M14931號）；黃熱病病毒；西尼羅 (We st Nile)病毒；日本腦炎病毒；聖路易腦炎病毒；牛病 毒性腹瀉病毒（BVDV);及C型肝炎病毒（HCV);及上述任 一者之任何血清型、菌株、基因型、亞型、準種或分離 株。若黃病毒為HCV，則HCV為諸多基因型、亞型或準種 中之任一者，包括（例如）基因型1，包括la及lb、2、3、 4、6等及亞型（例如2a、2b、3a、4a、4c等）及準種。 適合於以本發明之實施例治療之宿主包括治療失敗患 者。如本文中所使用之術語”治療失敗患者π(或"治療失敗"） 通常係指未能對先前之HCV療法反應之HCV-感染患者（稱 為''不反應者”）或最初對先前療法反應但未維持治療反應之 患者（稱為"復發者"）。先前療法通常可包括以不同於本揭 示案之抑制劑的任何抗病毒劑進行的治療。 適合於以本揭示案之實施例治療之宿主包括已臨床上診 斷為感染有HCV之個體。感染有HCV之個體可藉由其血液 中偵測到HCV RNA及/或其血清申具有抗HCV抗體來鑑 134691.doc -124- 200927102 別。 臨床上θ斷為感染有Hcv之個體包括原態個體（例如先 前未對HCV治療之個體）。 適口於以本揭不案之實施例治療之宿主包括HCV力價為 每毫升血凊至少約丨〇5、至少約5 X丨〇5或至少約1Μ個HCv基 因組複本的個體。患者可感染有任何HCV基因型（基因型 1，包括la及lb、2、3、4、6等及亞型（例如2a、2b、3a 等）），尤其難以治療基因型（諸如HCV基因型丨）及特定HCV 〇 亞型及準種。 亦適合於治療者為由於慢性HCV感染而展現嚴重纖維化 或早期硬化（未代償失調，Child_pugh等級A或A以下）或較 晚期硬化（代償失調，Child-Pugh等級B或C)及儘管先前進 行抗病毒/台療但仍具有病毒企症或對以已知抗病毒劑治療 具有禁忌症的HCV陽性宿主（如上所述）。 在一實施例中，患有METAVIR記分系統之階段3或階段 0 4肝臟纖維化之HCV陽性宿主適合於以本揭示案之方法治 療。在另一實施例中，適合於以本揭示案之實施例治療之 宿主為患有具有臨床特徵之代償失調硬化之患者，包括患 有嚴重晚期肝硬化之患者，包括彼等等候肝臟移植之患 者。在另一實施例中，適合於以本揭示案之實施例治療之 宿主包括患有較輕度纖維化之患者，包括彼等患有早期纖 維化（METAVIR、Ludwig及Scheuer記分系統中之階段 2 ;或Ishak記分系統中之階段1、2或3)之患者。 在本揭示案之一實施例中，為有助於最佳地選擇很可能 134691.doc -125- 200927102 又孤於治療之患者以及監測治療功效尤其面對潛在抗藥 性突變病毒的情況下，使用由本發明提供之適當診斷測試 可具有極大益處。舉例而言，評估給定患者中所發現之特 定病母對於所涵蓋之療法的敏感性可有助於鑑別候選患者 與相應適當療法之間的最佳配合。在克立味嗤、克立咪唾 類似物、具有克立咪唑骨架之化合物或本文中所鑑別之其 他抑制劑的情況下，此可藉由自給定患者HCV分離物分離 NS4B序列及測定藥物抑制患者nS4B同功異型物結合rna ^ 之力效來進行。此尤為重要，因為由於患者來源之接種物 可能不易於培養，故當前仍無有效方法研究給定患者病毒 之藥物敏感性。使用該等診斷檢測法引導治療之價值已在 HIV中得以廣泛驗證。 複製檢測方案 在一實施例中’複製檢測方案可包括以下階段。應注意 以下複製檢測方案為非限制性的，且作為複製檢測方案之 一說明性實施例而提供。 階段1 : RNA轉錄 1) 在 37°C 下以 Xbal將 FL-J6/JFH-5，C19Rluc2AUbi 質體線 性化2小時，且在丨％瓊脂糖凝膠上電泳以檢驗消化之完 成。 2) 在30C下以綠豆核酸酶處理30 min來消化5'突出端。 3) 使用Seal限制性核酸内切酶將Bart79I-luc質體線性化 (類似於如 Elazar 等人 J. Virol· 2003, 77 (10):6055-61 中所 述之Bart79I質體’其例外為新黴素磷酸轉移酶基因已置換 134691.doc •126- 200927102 為編碼螢火蟲螢光素酶之基因），隨後在凝膠上檢查線性 化模板DNA以證實裂解完成，繼而以蛋白酶k消化。 4) 藉由以蛋白酶K消化30 min，苯酚-氣仿提取、乙醇沈 澱且隨後以1 pg/μΐ再懸浮來純化模板。 5) 為進行轉錄反應，藉由使用FL-J6/JFH-5’C19Rluc2AUbi 之 T7 Megascript套組（Ambion，Austin，TX)或 Bart79I-luc 之 RiboMax M 套組（proinega，Madison，WI)使用 1 gg純化 模板。將反應物在37 °C下培育4 he © 6)添加脫氧核糖核酸酶歷時15 min。 7) 以等體積苯酚/氣仿提取且隨後以等體積氯仿提取。將 水相回收且轉移至新管中。 8) 藉由添加1體積異丙醇且充分混合使RNA沈澱。 9) 在-20 C下將混合物冰;東至少15 min。在4°C下以最大 速度離心15 min來使rna粒化。 10) 小心移除上清液且將RNA以1 μβ/μΐ再懸浮於無核糖 核酸酶/脫乳核糖核酸酶之水中。 〇 11) 在凝膠上電泳且檢驗RNA濃度。 12) 製備等分試樣且儲存於_80。〇下。 階段2 :電穿孔Huh7.5細胞 1) 將細胞以P B S洗務-—次，進行姨蛋白酶化。 2) 將每10 cm含完全培養基之培養盤之總體基5 ml的細胞 再懸浮於50 ml試管中。 3) 將細胞在4°C下以i〇〇〇xRPM粒化5 min。吸取少量且再 懸浮於10 ml冰冷無核糖核酸酶過濾卜PBS(BioWhitaker) 134691.doc -127- 200927102 中-溫和地上下約吸取5次以除去細胞團。 4) 如前所述以1000XRPM將細胞再次粒化且再次再懸浮 於 10 ml冰冷 PBS(BioWhitaker)中。 5) 移除10 μΐ等分試樣以測定細胞濃度。 6) 將細胞再次粒化且以1.5 X 1 〇7個細胞/毫升最終濃度再 懸浮於冰冷無核糖核酸酶PBS中。 需要：每一次電穿孔（ep)於0.4 ml中之6x106個細胞及5
Mg FL-J6/JFH-5'C19Rluc2AUbi RNA或 Bart79I-luc RNA 〇 ® 7)將5 pg RNA等分試樣置於Eppendorf管中（每ep—管）。 8) 移除0.4 ml細胞懸浮液且添加至rna中。藉由吸取混 合兩次。 9) 立即轉移〇.4 ml至2 mm間隙之ep小杯中。 10) 將細胞進行脈衝：820 v，5次脈衝，99 psec，220 ms間隔時間，單極。 11) 將細胞靜置15 min。 ❹ 12)使用小杯包裝中之Pasteur吸管將細胞轉移至培養基 中。自所有管製備通用儲備液。 13) 在96孔培養盤中每孔安置ι〇,00〇個細胞。 14) 稍微將培養盤進行旋轉以使細胞均勻地置於培養盤 中。 15) 在處理之前培育24小時。 階段3 :培養盤處理 1)在電穿孔之後約24小時製備具有所需濃度藥物之培養 基。 134691.doc -128- 200927102 2) 吸取培養基且添加100 μΐ新鮮培養基及藥物。保留最 初未經處理之孔且再保留最後未經處理之孔。 3) 每曰進行重複歷時2日以上。 階段4 :收集（自電穿孔第5日） 1) 阿拉馬藍（Alamar blue)檢測法 a) 加入用於本底扣除（以及易於發現顏色變化）之培養 基。 b) 吸取培養基。 © c)製備培養基外加10%阿拉馬藍之儲備液。每孔總體積 為100 μΐ 。 d)在37°C下培育2-2.5小時（或直至存在顏色變化）。 c) 在flex station中進行培養盤讀取。 2) 水母（Renilla)螢光素酶檢測法 b)吸取具有阿拉馬藍之培養基。 b) 以lxPBS洗滌。 c) 完全吸取（吸取，隨後傾斜且再次吸取缓衝液剩餘 ❹ 物）。 d) 確保所需溶解緩衝液：螢火蟲緩衝液或水母緩衝液。 e) 添加30 μΐ lx溶解緩衝液（添加1體積5x溶解緩衝液至4 體積無菌水中）。 f) 將培養盤震盪15 min。 g) 在-80°C下冰凍。此時，可停止或繼續進行隨後階段。 階段5 :藉由光度計讀取 a)將培養盤解凉·。 134691.doc -129- 200927102 b)將培養盤保留在冰上直至準備讀取。 c)製備所需受質試劑；對於水母受暂 可又質而言：將水母緩衝 液解凉·’製備1體積1 〇〇 X水母luc受皙々k >可又質外加100體積luc檢測 緩衝液+ 2 ml以供引發先声钟夕_ ~ f尤度°十之用（例如，對於4 ml水母 luc受質而言，添加40 ui檢測緩衝液）。對於螢火蟲受質而 言：將10 ml螢火蟲緩衝液解凍且添加至螢光素酶試劑 中。 d)使用標準光度計根據製造商之說明讀取培養盤。 實例 提供以下實例以向一般熟習此項技術者提供完整的揭示 内备及如何進行及使用本揭示案之描述，且並非意欲限制 本揭示案之範疇亦非意欲指出以下實驗為所執行之全部或 僅有之實驗。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量 為重量平均分子量，溫度以。c計，且壓力為大氣層或接近 大氣層。可使用標準縮寫，例如bp，驗基對；kb，千驗 基，pi，皮升’ S或sec ’秒；min，分鐘；h或hr，小時； aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；加，核苷酸； i.m· ’肌肉内；ι·ρ. ’腹膜内；s c ’皮下；及其類似縮 寫》 實例1 : 全世界超過1.5億人類感染有c型肝炎病毒（HCV)。令人 遺撼地’該等個體中有許多者不能藉助於由干擾素與利巴 韋林k參見該實例結束時參考文獻之編號列表）之組合組成 的當前護理標準清除其感染。此外，該治療與顯著副作用 134691.doc -130- 200927102 相關，而不可能為許多個體所使用。因此，當前療法不適 用於大多數患者1，且迫切需要新穎HCV藥物1。 9.6-kb正單鏈RNA HCV基因組編碼3,000-胺基酸聚合蛋 白，該聚合蛋白經蛋白分解方式加工為結構蛋白（其為成 熟病毒之組份）及非結構蛋白（NS)(其與複製病毒基因組2有 關）。如其他正鏈RNA病毒3，HCV似乎與細胞内膜結構結 合進行複製。在為HCV之情況下，該等結構稱為膜網4且 咸信其由NS4B蛋白誘導。亦需要NS4B將其他病毒NS蛋白 Ο 組裝於RNA複製之表觀位點5内。不知病毒RNA，尤其產 生子代基因組所需之負鏈模板可如何併入或保持於該等複 製位點處。 已展示NS4B與HCV RNA共定位於膜網6’7上，表明在實 際病毒RNA複製中NS4B與病毒RNA緊密接觸。A型肝炎及 脊髓灰質炎小核糖核酸病毒具有稱為2C之蛋白，其為複 製、結合RNA8’9所需且具有N末端兩性螺旋及核苷酸結合 基元8_1G。NS4B含有相同結構特徵，且兩者均為HCV複製 〇 W 所需5，π。本發明之方法部分來自以下發現：NS4B類似地 結合RNA，該相互作用為HCV生活週期之關鍵，及NS4B 所結合之RNA可受藥理學破壞之影響。本發明以一定方式 提供活體外RNA結合檢測法使得能夠同時分析多個病狀、 突變株及重複樣，進行定量解離常數（Kd)量測及潛在藥理 學抑制劑之高通量篩選。 如同大多數藥物標靶12—樣，NS4B為一種膜蛋白（SEQ ID No: 13)，如圖7b所示。眾所皆知膜蛋白難以在生化上尤 134691.doc -131 - 200927102 其以醫藥筛選所需之量表現及表徵。此外，藉由清潔劑溶 解可改變其天然膜結合拓撲結構。為改善該等問題，本發 明提供微流體工具以在消耗奈升蛋白的情況下執行結合檢 測。此使得能夠使用活體外細胞溶解物表現系統，其補充 有微粒體膜以產生更多天然摺疊條件，在該等條件下獲得 迄今為止可獲得之最佳NS4B拓撲結構數據I3。相對於習知 表現方法降低之產率為低的樣品消耗所抵銷。 先前量測藥物相互作用之微流體工具受限於可催化螢光 €) 爻質形成之酶促標把14。在本發明之一實施例中，藉由使 用機械捕獲分子間相互作用（MIT0MI)(先前已用於量測轉 錄因子與DNA之間的相互作用之微流體親和力檢測法…直 接量測結合常數。使用本發明之方法獲得之結果展示 MITOMI不僅可用於量測膜蛋白_RNA相互作用之結合常 數，且可用於在高通量篩選中量測該等相互作用藉由小分 子所達成之抑制。後者目的在用於製造已知在化學相容性 〇 方面具有限制性之裝置的彈性體的情況下尤其另人驚 討’在本文中吾人展示此並不會阻礙其用於藥物篩選亦不 會阻礙具有所需藥理學特性之小分子之發現。综上所述， 使用本發明之該等方法獲得之結果揭示一種新穎hcv標靶 且形成微流體技術可用於發現新穎藥物之第一證明，由此 成功地元成超過十年之努力而將微流體工具用於藥物發 現 18，19 。 結果 微仙'體平台用於RNA結合之用途藉由研究來自胚胎致死 134691.doc -132- 200927102 異常視覺系統（elav)家族之兩種人類蛋白（先前已完全表 徵其RNA結合活性）得以驗證》隨後將該方法應用於研究 RNA與跨膜HCV NS4B蛋白之相互作用。該平台係用於⑴ 測試HCV NS4B結合RNA之假設，（ii)測定該相互作用之 Kd，（iii)研究該結合之受質特異性，（iv)確定NS4B内RNA 結合所需之胺基酸及（v)篩選NS4B RNA結合及HCV複製之 藥理學抑制劑之化合物庫。 微流艘檢測法驗證：HuD與RNA之結合。HuD為來自 © ELAV樣家族之具有完全表徵之RNA結合活性的宿主細胞 蛋白2()_22。其為含有3個保守RNA識別基元之細胞質蛋白， 經由該等識別基元其結合基因（諸如編碼細胞激素之基因 及原致癌基因）之3’UTR(非轉譯區）中之AU富含元件 (ARE)。針對兩種Cy3標記之RNA探針測試結合：AU3及與 HuD之結合削弱之已知AU3突變體21，22(圖5) »基本上如 Maerkl及Quake15所述執行以MITOMI進行之RNA結合實 驗，其例外為在該情況下使用RNA替代DNA(圖10) ^ 〇 簡言之，將以Cy3標記之標靶RNA序列之微陣列點樣於 環氧化物塗佈之載片上。藉由將陣列中之各點與裝置中之 單元池對準，使用該等陣列程式化微流體裝置。在微流體 裝置與微陣列接合之後，對其進行表面圖案化，該表面圖 案化在各單元池内產生塗佈有生物素標記之抗組胺酸抗體 之圓形區域。隨後將該裝置以含有編碼同框融合有C末端 V5-6組胺酸標籤之HuD(HuD-V5-his)或同框融合有C末端6 組胺酸標籤之Gus蛋白（Gus-his)的DNA模板的活體外轉錄/ 134691.doc -133- 200927102 轉譯混合物裝載。添加氟硼熒（Bodipy)標記之tRNALys以供 蛋白標記之用。隨後使用微機械閥將各單元池分隔，繼而 進行培育以使蛋白合成’所合成之蛋白與表面生物素標記 之抗his抗體結合，標靶RNA溶劑化及蛋白與標靶RNA平衡 化。隨後藉由致動"按鈕"膜執行MITOMI以捕獲表面結合 複合物同時去除任何液相分子。短暫洗滌以移除未捕獲之 未結合物質之後，以陣列掃描儀相繼偵測所捕獲之分子及 所表現之蛋白。藉由量測Cy3之中值信號與氟硼熒之中值 Ο 信號之比率對於各數據點計算所結合RNA與所表現蛋白之 比率。 如圖5a所示，該檢測法偵測到HuD與AU3 RNA探針之強 結合；〇118-1^3之本底結合低於1111〇信號7-16倍》此本底水 準不隨RNA探針濃度而增加且自所有腔室減去（圖11)。相 比於與AU3突變體探針之結合親和力’HuD與AU3探針之 結合親和力大的多：AU3結合之測定為23土5 nM且 AU3突變體結合之Kd為268±95 nM(圖5a)。該等值與先前 〇 凝膠遷移檢測法21，22中之量測相符且用以驗證RNA-蛋白相 互作用之MITOMI微流體親和力檢測法。圖12展示另一來 自ELAV樣家族之蛋白HuR之RNA結合分析。 NS4B結合HCV RNA及藉由微流體測定Kd。隨後將該系 統用於測試HCV NS4B是否結合RNA。由於NS4B在病毒 RNA複製中很重要，且引發正鏈RNA合成可能起始於負鏈 RNA之3'末端，故首先使用表示為3'負末端之探針測試 NS4B與該區域之結合。將NS5A之兩性螺旋（AH)與GFP之 134691.doc •134- 200927102 N末端之融合5用作陰性對照。該蛋白亦與膜結合且因此可 經由GFP與抗GFP之相互作用將微粒體膜固定於裝置表面 (圖5c)。在3.4±1_0 nM下量測NS4B結合至HCV負鏈RNA之 3'末端的Kd(圖5d)。其似乎為HCV NS4B結合RNA之第一 證據。使用重組形式之表現於大腸桿菌（E. coli)中之純化 NS4B 的習知 GST下拉檢測法（GST pull down assay)及 RNA 濾膜結合檢測法證實該發現（圖13)，但其較不便利且受本 發明之方法所提供之分析類型及高通量形式影響。
〇 NS4B特異性結合負病毒鏈之3’末端。使用三種其他HCV 探針量測所觀察到之NS4B-HCV RNA相互作用之受質特異 性（圖6a)。表示為5'UTR pos及YUTR pos之探針分別對應 於正病毒鏈之5'UTR及3’UTR，且5'負末端對應於負鏈之i 末端。重複RNA結合實驗且對比NS4B與等莫耳濃度（3 nM) 之各種探針之結合。如圖6b所示，雖然NS4B結合所有四 種HCV探針，但其與3'負末端探針之表觀親和力大於與所 測試之其他三種HCV RNA區域或無關δ病毒RNA基因組序 〇 列23’24之表觀親和力5-12倍（參見圖6b)。該等發現支持以 下結論：RNA序列且可能二級RNA結構決定NS4B與負鏈 之3'末端結合之特異性。 NS4B中之精胺酸富含樣基元為RNA結合及HCV複製所 必需。已報導引起蛋白與RNA之間相互作用的各種結構基 元25。其中之一者為精胺酸富含基元（ARM)。ARM最初定 義為病毒、噬菌體及核糖體蛋白中所發現之短（10至20個 胺基酸）精胺酸富含序列（圖7a)9’25’26。除精胺醆殘基佔優 134691.doc -135- 200927102 勢之外，ARM序列之間幾乎不存在一致性。隨後，鑑別出 由含有較少量精胺酸之較長序列組成之ARM樣基元9’26。 NS4B之一級序列之檢驗揭示存在多個正電胺基酸（參見圖 7b)。該等精胺酸殘基中之大多數處於NS4B之C末端區域 中之最後71個胺基酸中（圖7b及7c)。基於經驗拓撲結構研 究，使用糖基化標記13，預測該區域形成細胞質片段。該 區域之元件與先前所述之ARM樣基元一致。 使用一系列點突變，吾人測試由NS4B結合RNA是否由 〇 NS4B之正電殘基中之一些來介導。以Ala-Ala取代192-193 位置上之Arg-Arg稱為"RRa突變”且在247-248位置上之類 似取代基表示"RRb突變"。如圖7d所示，在RRb突變將 NS4B與3’負末端探針之結合降低5倍的同時，RRa突變之 RNA結合活性在相同探針濃度（1.5 nM)下完全去除。該等 結果支持以下假設：所測試之精胺酸殘基介導活體外藉由 NS4B達成之RNA結合。為測試該等正電殘基亦對於HCV 複製重要之假設，將該等突變引入高效率次基因組HCV複 ◎ 製子中且將該等複製子在標準複製子菌落形成檢測法中檢 測。如圖16所示，在RRb突變將複製降低約45倍的同時， 具有RRa突變之複製子之RNA複製完全喪失。此外，複製 抑制之程度與由各種突變引起之NS4B RNA結合損傷程度 相關（圖7d)。此外，對照實驗表明對複製之顯著效應並非 由蛋白表現改變或蛋白錯誤定位造成。相反地，該等微小 突變似乎影響NS4B中之關鍵調節位點。該等結果支持以 下結論：HCV RNA之有效結合為活體外病毒複製所需。 134691.doc -136- 200927102 資料庫中當前可獲得之天然Hcv分離物之序列的比對揭示 該等正電殘基在所有HCV基因型中高度保守。該保守支持 以下結淪：活體内高效病毒感染需要該等RNA結合殘基。 抑制性化合物之高通量篩選。根據本發明之方法篩選化 合物庫以鑑別可抑制rNA_NS4B相互作用之小分子。如圖 8a所示，將來自小分子庫之128〇種化合物點樣於環氧化物 塗佈之載片上作為微陣列。將該陣列乾燥，且隨後與上述 微流體裝置對準且接合。如前所述執行剩餘檢測，其例外 〇 為將該裝置以NS4B_GFP蝗而以Cy5標記之3,末端負RNA探 針裝載。在一次篩選中，將化合物以約丨mM之濃度點 樣。使用僅兩個微流體裝置兩次重複篩選整個庫。在128〇 種化合物中，發現104種對藉由NS4B達成之rNa結合具有 抑制效應（>90%抑制）。此外，存在11〇種化合物，其中兩 個所測試之重複樣之間存在顯著差異或量測中之一或兩者 由於技術原因而中斷。 ◎ 將一次篩選中所鑑別之214(104+1 10)種化合物進行二次 篩選（圖8a)。此係以類似方式進行，其例外為使用較小裝 置’所點樣之化合物濃度比一次篩選中低1 〇倍且對於各化 合物點5個重複樣。所測試之214種化合物中證實十八種化 合物顯著抑制由NS4B達成之RNA結合（圖8b)。所鑑別化合 物中之大多數不抑制HuR蛋白與其自身4a標靶RNA序列 (圖12)之結合’且其亦不抑制HuR與其先前所述之hcv RNA標把：負病毒鍵之3·末端27之結合，表明該等採樣 (hit)具有特異性。圖14提供支持篩選之正確性的該等數據 134691.doc -137· 200927102 及其他數據。 HCV RNA複製之抑制劑。量測以上所鑑別之抑制性化 合物對HCV RNA複製之活體内抗病毒效應。在以具有螢 光素酶報導基因之全長HCV RNA基因組電穿孔28之後，使 Huh7.5細胞在增強濃度之該等化合物存在下生長。在第 小時執行螢光素酶檢測。同時’藉由基於阿拉馬藍之檢測 法評估在該等化合物存在下細胞之生存力。該等化合物中 之六種展示一些抗病毒效應，對此僅可歸因於細胞毒性。 © 發現克立咪唑氫氣酸鹽（1-對氣苯曱基-2-(1-处咯啶基）曱基 苯并咪唑氫氣酸鹽，一種H1組織胺受體拮抗劑）顯著抑制 HCV複製。在20 μΜ濃度之藥物下量測到病毒複製降低十 倍，其中EC50值為約8 μΜ(圖8c)。在該等濃度下，不存在 可量測之細胞毒性（圖8 c)。藉由在感染有感染性hcv純系 (J6/JFH)之克立咪唑處理Huh7 5細胞中執行實時pcR檢測 獲得類似結果29(圖15)。克立咪唑對於藉由NS4B達成之 ❹ RNA結合之活體外！C5〇值為約24±1 nM(圖8句。 克立咪峻氩氣酸鹽衍生物分子之增強之效能及功效：使 用本文所述之方法進行篩選，本申請案鑑定出具有增強之 效能的克立咪唑類似物。一個該分子之實例如圖17所示， 其具有以下數據： 圖17A:克立咪唑氫氣酸鹽之化學結構。 圖17B:具有增強之效能及功效的克立咪唑衍生物分子 之化學結構》 圖17C:克立咪唑衍生物分子及母體克立咪唑氫氣酸 134691.doc -138· 200927102 鹽化合物（□)之活體外抑制曲線，如微流體所量測。 圖17D :在增加濃度之克立味唾衍生物分子（β)及克立咪 唑氫氣酸鹽（口）存在下HCV複製之劑量反應曲線，如由 HCV感染細胞中之實時PCR檢測所量測。 條塊表示標準差。 如可見到’該衍生化合物具有增強之活體外效能（6 ηΜ 之IC5 0值與克立咪唑之24 mM相比）（圖17C)。重要地，該 化合物亦以1 μΜ之EC50值（與克立咪η坐之8 μΜ相比）展示針 © 對細胞中之HCV複製之更高抗病毒活性（圖178D)。 综上所述，以上數據與抗性突變株之分析組合提供克立 咪唑作用機制之令人信服之遺傳、生化及藥理學證據。此 外，該等數據展示使用本發明之方法可鑑定更有效之抑制 性分子。 克立咪峻抗性突變株。克立咪唑抗病毒活性之作用機制 進一步藉由選擇克立咪唑抗性HCV突變株來證實。將已建 Θ 立之具有HC V複製子之細胞及重新以基因型11}次基因組 HCV複製子（Bart 79I)30電穿孔之Huh7細胞在藥物存在下繼 代’產生約60個能夠在化合物存在下生長之菌落，將丨丨個 個別菌落成功地進行擴大、繼代5_10次且對在該等細胞中 複製之HCV RNA進行序列分析。此外，分離來自克立咪 唾抗性菌落集合之RNA且將其進行類似分析。發現三個菌 落具有包含定位於NS4B區之突變的複製子，且發現6個菌 落具有包含定位於負鏈3,末端RNA區之突變的複製子。（注 意’在圖17B之克立咪唑衍生物分子存在下所選擇之抗性 134691,doc •139· 200927102 突變之位置定位於HCV基因組内之類似位置）。此外，存 在一個具有定位於NS4B與負鏈3'末端之突變的菌落及一個 賦予對克立咪唑之抗性之突變位置尚未鑑定的菌落。在無 藥物之情況下同時繼代之10個複製子菌落中未鑑定到該等 突變。 將克立咪唑抗性NS4B突變株中之兩者詳細表徵。第一 個突變株W55R如圖9a所述。其包括在所預測NS4B之細胞 質定向片段内之胺基酸55處以精胺酸取代色胺酸。該突變 Ο 足以在細胞中賦予克立咪唑抗性表型：以自W55R突變細 胞提取之整個細胞RNA轉染（圖9b)或以編碼該點突變之活 體外轉錄之J6/JFH RNA及鍵聯之螢光素酶報導基因轉染 (圖9c)的Huh7.5細胞不受1 0 μΜ克立σ米峻影響。克立p米嗤 對W55R突變株J6/JFH RNA之EC50值為約18 μΜ(對野生型 RNA之EC50值的2.25倍）。類似於其他抗NS3蛋白酶抑制劑 之HCV突變株31，W55R突變株複製之絕對水準低於野生型 基因組，表明抗藥突變株以削弱複製適應性為條件而產 ❹生。 亦將該突變引入NS4B-GFP載體中，且使用本發明之活 體外微流體檢測法測試所得載體之RNA結合活性。儘管在 10 ηΜ克立咪唑存在下突變株與野生型NS4B蛋白均經受 RNA結合之約2倍減少，但由於突變株之基線RNA結合較 高，故在克立咪唑存在下藉由突變株達成之RNA結合之殘 餘量與在無克立咪唑的情況下藉由野生型達成之結合相當 (圖9d)。此外，如圖9e所示，該突變株以0.75 ηΜ之Kd(與 134691.doc -140- 200927102 野生型NS4B之3.4 nM相比）展示與病毒RNA之較大表觀親 和力。 在抗性菌落以及彙集抗性細胞中鑑定出稱為R214Q之第 二克立咪唑抗性突變。其包括在NS4B之細胞質C末端片段 内之胺基酸214處以麩醯胺取代精胺酸。在對該突變進行 之細胞及活體外分析中獲得類似於第一突變之結果，其中 在螢光素酶報導基因鍵聯複製檢測法中EC50值為40.3 μΜ(高於對野生型RNA之EC50值約5倍）且在活體外結合檢 Ο 測法中Kd為0.6 nM。很可能，該等兩種突變改變NS4B之 構形以增加其對病毒RNA之親和力。實際上藉由活體外 RNA結合檢測法量測之Kd反映該假設。綜上所述，以上數 據提供克立咪唑作用機制之令人信服之遺傳及生化證據。 討論 以上結果展示HCV NS4B結合RNA，及該結合對於病毒 基因組負鏈之3'末端具有特異性。由於該相互作用之活體 内特異性尚未定量測定，在外推本文所報導之活體外結果 之數值時通常應慎重。NS4B中之精胺酸富含樣基元為 RNA結合及HCV複製所必需。發現克立咪唑氫氯酸鹽在對 宿主細胞具有極小毒性的情況下具有由其抑制NS4B之 RNA結合所介導之對HCV RNA複製之顯著活體内抗病毒 效應。 由於NS4B與膜結合5且已知其誘導膜複製位點4，故其 RNA結合活性提供將病毒基因組併入HCV複製室之機制。 此可能促進引發自膜固定之負鏈合成初始正鏈。NS4B亦 134691.doc -141 - 200927102 可藉由其與NS5B聚合酶或複製複合物之其他組件之相互 作用32募集聚合酶複合物至HCVRNA而發揮作用。 克立咪唑對於藉由NS4B達成之RNA結合之活體外IC50 值為約24士 1 nM，而其對於病毒複製之EC50值為約8 μΜ。 不良細胞滲透性可能為對於藉由NS4B達成之活體外RNA 結合所量測之1C 5 0值與對於細胞中之抗病毒效應所量測之 EC50值之間的約400倍差異之原因。改良之藥物傳遞及根 據構效關係（SAR)分析優化化合物預期提供更有效之抗病 〇 毒劑，且本發明之微流體系統及筛選方法可有利於該方 法。 該研究亦展示微流體方法之效用。與當前所使用之方法 相比，微流體親和力檢測法具有若干重要優勢，此使其成 為藥物發現，尤其針對膜結合標靶之有前景及通用工具。 首先，藉由哺乳動物網狀紅血球溶解物在微粒體膜存在下 之蛋白合成提供蛋白摺疊之天然條件。第二，微流體檢測 法消除對於高含量蛋白表現及純化的需要，其為當前所用
Q 方法所面臨之問題。第三，該檢測法能夠偵測短暫及低親 和力之相互作用15。第四，微流體裝置能夠進行諸多平行 量測，且因此可用於高通量篩選。最後，且儘管已知用於 製造該裝置之彈性體的化學相容性問題，使用該裝置及方 法可成功地篩選及發現具有所需藥理學特性之小分子。 如同HIV及結核病一般，HCV之有效的藥理學對照將可 能最佳藉由針對獨立病毒特異性標靶之多種藥物之混合物 達成。甚至中等NS4B抑制劑與現存及/或其他新出現之抗 134691.doc -142 - 200927102 HCV藥劑之組合代表一具吸引力之範例以供增加當前病毒 反應率之用。儘管可獲得比克立咪唾更有效之抑制劑，但 由於克立咪唑已在人類中廣泛使用（儘管用於不同適應 症），故根據本發明可發現其直接用作抗HCV治療劑及充 當下一代抗HCV策略之關鍵組份。 方法 質體：使用標準重組DNA技術以建構及純化所有質體。 藉由自動DNA測序分析由PCR擴增之所有區域》自大型細 〇 菌培養物製備質體DNA且將其藉由Maxiprep套組（Marligen Bioscienees)純化。自 New England Biolabs賭得限制酶。
由 cDNA純系之 ORFeome庫（Open .biosystems)獲得 HuR及 HuD之開放閱讀框架（ORF)。藉由使用門控（gateway)技術 (Invitrogen)將該等ORF插入表現載體pcDNA-Dest 40載體 (Invitrogen)中使得可添加C末端V5-his標蕺。 t 先前描述編碼同框融合有C末端GFP之基因型la之NS4B 的質體pcDNA-NS4B-GFP5。藉由定位誘變（使用QuikChange 〇 套組（Stratagene))將突變RRa、RRb及W55R引入該質體 中。如先前所報導建構質體NS5A(AH)GFP。由Roche獲得 Gus-his載體。 藉由自Bart79I質體33以含有EcoRV限制性位點之引子擴 增5’UTR正序列，以EcoRV消化及接合至pcDNA3.1 (Invitrogen)之相應位點中產生編碼正病毒鏈之5'UTR之質 體pcDNA3.1-5'UTR pos。同樣產生編碼負RNA鏈之3·末端 區域之質體pcDNA3.1-3·負末端，其例外為EcoRV側接插 134691.doc -143- 200927102 入物以反向接合。 類似地產生質體pcDNA3.1-3'UTR pos及5'負末端，其例 外為插入之基因藉由Hindlll及Xho 1限制性位點側接。 藉由將Nhel側接HDV序列插入以Xbal切割之pSPT19載體 (Roche Diagnostics)中選瘦編碼δ病毒基因組RNA序列之載 體 23,24 。 由全長HCV基因組組成且表現水母螢光素酶之質體FL-J6/JFH-5’C19Rluc2AUbi為 Dr.Charles M. Rice所贈予 28。藉 © 由定位誘變（使用QuikChange套組（Stratagene))將W55R突 變引入該質體中。 活體外RNA轉錄及螢光及放射性標記》以Xbal將負病毒 鏈及正病毒鏈之5’及3’末端區域之質體DNA線性化。以 Xbal將δ基因組序列之質體DNA線性化。隨後將線性化質 體以蛋白酶Κ處理，繼而苯酚-氯仿提取且以乙醇沈澱。將 DNA再懸浮於無核糖核酸酶之水中至1 pg/μΐ之最終濃度。 使用4 gg DNA作為模板以便用Τ7 MEGAscript(Ambion)根 ^ 據製造商之方案進行轉錄。藉由添加5 U RQ1脫氧核糖核 酸酶（Ambion)及在37°C下培育15 min將模板DNA消化。將 未併入之核糖核苷酸藉由使用Micro Bio-Spin P-30管柱 (Bio-Rad)之尺寸排阻法移除，且將經轉錄之RNA以苯酚-氣仿提取，繼而於乙醇中沈澱。將RNA顆粒以70%乙醇洗 務且再懸浮於H20中。藉由量測260 nm下之光學密度執行 RNA濃度測定。藉由1%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色 證實RNA之完整性及其濃度。 B4691.doc -144- 200927102 藉由使用Label IT套組（Mirus)根據製造商之方案將RNA 序列以Cy5標記，繼而在microspin管柱（Mirus)上純化且進 行乙醇沈澱。藉由在260 nm下量測核染料結合物之分光光 度法吸光度及Cy5之λΜΑΧ(65 0 nm)測定每RNA分子之螢光 標記數目。其與探針長度成比例且用於調節結合實驗結 果。 用於研究藉由HuR及HuD達成之RNA結合的Cy3標記之 RNA探針係自IDT購得。 〇 如先前所述進行以32P放射性標記RNA探針34。 裝置設計：基本上如所述進行裝置製造及設計15。簡言 之，具有致動閥所需之所有通道的''控制"層位於含有受控 通道網路之”流動"層之上。在流動層上執行所有生物學檢 測及流體控制。在控制通道穿過流動通道之處設置一閥。 兩個通道之間的連接區中之所得薄膜可藉由液壓致動偏 轉。使用複合閥系統使得大量彈性體微閥可在該等裝置内 執行複合流體控制。經由插入刺穿聚矽氧之孔穴中之鋼銷 ◎ 實現將流體引入該等裝置中。電腦控制之外部螺線管閥使 得可致動多元調節器，多元調節器又使得可複合處理大量 微閥。各單元池係由三個微機械閥以及一"按鈕"膜控制（圖 10)。各單元池之"按鈕膜"遮蔽兩個"夾層"閥之間的流動通 道内之一圓形區域。微陣列與裝置對準及接合使得可將所 點樣物質（RNA探針或抑制性化合物）置於各單元池之”RNA 腔室”内。該腔室可隨後藉由控制π頸閥"對流動通道開 放。所用裝置具有640或2400個單元池。 134691.doc •145· 200927102 RNA結合檢測法。所用方法為先前對於蛋白-DNA相互 作用所述之方法15的修改（圖10)。 1.可溶性蛋白：A : RNA排列及裝置對準》首先，藉由 OmniGrid Micro(GeneMachines)微陣列點樣儀，使用 CMP3B針（TeleChem International，Inc·)，以 680 mm及 320 mm之行距及列距將Cy3標記之標靶RNA序列之稀釋系列 (IDT)分別以微陣列形式點樣於環氧化物塗佈之玻璃基板 載片（CEL Associates)上。各樣品溶液含有1%於dH20中之 O BS A以防止標靶RNA與環氧化物官能基共價鍵聯且用於在 對準期間觀測。點樣之後，將陣列在GenePix4000b (Molecular Devices)上進行品質控制。隨後在SMZ1 500 (Nikon)立體鏡上手動將陣列對準微流體裝置且在黑暗中在 40°C下之加熱板上接合隔夜。 B :表面化學（圖10c)。所有裝置在控制管線中在10 psi 與1 5 psi之間驅動且對於流動管線在4 psi與6 psi之間驅 動。為進行初始表面衍生步驟，腔室閥保持關閉以防止液 〇 體進入含有經點樣RNA標靶之腔室中。首先，將所有可及 表面區域藉由使經生物素標記之BSA(Pierce)於dH20中再 懸浮至2 mg/mL之溶液流動通過所有通道歷時30 min，繼 而進行10 min PBS洗蘇來衍生。隨後，500 pg/niL中性鏈 親和素（Pierce)於PBS中之溶液流經表面20 min，繼而進行 10 min PBS洗滌。隨後，關閉"按鈕"膜且再繼續PBS洗滌5 分鐘。隨後將除60 μιη由按鈕遮蔽之圓形區域之外的所有 剩餘可及表面區域以與以上相同之生物素標記溶液鈍化30 134691.doc -146- 200927102 min，繼而進行10 min PBS洗蘇。最終，將經生物素標記-5-組胺酸抗體（Qiagen)於PBS中之2% BSA中之1:1溶液裝載 2-5 min，之後，將"按紐”膜打開且繼續流動20 min，使得 先前遮蔽之圓形區域可進行特異性功能化。此再次繼之以 10 min PBS洗務，完成表面衍生程序。 C :蛋白合成及MITOMI。隨後製備標準25 pL TNT T7 偶合小麥胚芽提取混合物（Promega)，且以1_ pL tRNAZ^i-虞砺熒-//(Promega)及2 pL編碼適當蛋白（HuR、HuD或Gus) Ο 之質體DNA模板加釘（spike)。將混合物立即裝載於裝置中 且沖洗5 min，之後將腔室閥打開使得可以小麥胚芽提取 物將腔室終端填充（dead end fill)。再次關閉腔室閥且繼續 再沖洗5 min。隨後，將分隔各單元池之隔離閥關閉，繼 而打開腔室閥使得可藉由擴散使單元池平衡。將整個裝置 在溫度控制顯微鏡載物台上加熱至30°C且培育高達90 min 以完成蛋白合成，蛋白與表面結合生物素標記-5-組胺酸抗 體結合，標靶RNA溶劑化及蛋白與標靶RNA平衡。隨後藉 W 由關閉"按鈕"膜以及腔室閥執行MITOMI以使得可捕獲表 面結合複合物同時去除任何液相分子。徑向封閉防止兩個 界面之間形成溶劑袋（pocket)且有效產生零死體積同時保 持分子間相互作用之平衡濃度以供^貞測。繼之進行5 min PBS洗滌以移除未捕獲之未結合物質。隨後在改良 array WoRxe(AppliedPrecision)微陣列掃描儀上使裝置成像 以偵測蛋白合成及捕獲之分子。 D :圖像及數據分析。以 GenePix3.0(Molecular Devices) 134691.doc -147- 200927102 分析所有圖像。對於各實驗而言，在MITOMI及最終PBS 洗滌之後採集圖像。此係用於測定表面結合蛋白（FITC通 道）以及表面結合標靶RNA(Cy3通道）之濃度。各單元池產 生單一數據點，其係由Cy3中值信號與氟硼熒中值信號之 比率組成；因此表示表面結合RNA與表面結合表現蛋白之 比率。將來自多個數據點之數據平均化且計算其標準差。 隨後將結果標準化為1。對於所測試之各探針而言，包括 10-20之間的重複樣。各實驗中包括對照蛋白Gus-O his(Roche)且進行相同分析。當存在時，Gus-his之彳貞測信 號係用於本底扣除。 2:膜結合蛋白。類似於上述過程進行藉由NS4B達成之 RNA結合之偵測，除以下修改之外。藉由使用偶合轉錄/ 轉譯兔網狀紅血球系統（Promega)表現NS4B，隨後裝載於 微流體裝置中。將2 μίν犬微粒體膜（Promega)添加至反應混 合物中以使得可進行適當蛋白摺疊。使用NS4B-GFP構築 體，因此消除對反應混合物中之之需 要。將生物素標記之抗GFP抗體（Abeam)用於使由按紐界 定之經保護之圓形區域特異性功能化。經由蛋白與表面結 合抗GFP抗體之相互作用將蛋白固定於晶片上。將表面結 合蛋白及Cy5標記之HCV RNA探針裝載於晶片中且使其在 50〇1^11^?63尺011(?116.8)緩衝液中培育5-2〇111111。隨後執 行1^1丁01^1，繼而在1^?68 1<：011(?116.8)緩衝液中短暫洗 滌。隨後掃描該裝置且如上所述將結果定量。同樣檢測 NS4B-GFP 突變體及 NS5A(AH)_GFP。以 NS5A(AH)_GFP偵 134691.doc -148· 200927102 測之信號係用於本底扣除。 抑制性化合物庫之篩選。使用OmniGrid Micro (GeneMachines)微陣列點樣儀及 CMP3B 針（TeleChem International，Inc.)以微陣列形式將溶解於二曱亞礙 (DMSO)中之Lopac庫之1280種化合物（Sigma)點樣於環氧化 物塗佈之玻璃基板載片（CEL Associates)上。對於一次篩 選，將化合物以高濃度（約1 mM)兩次重複點樣。將該陣列 乾燥，且隨後與微流體裝置對準且接合。將兩個大型裝置 〇 (每裝置2400個單元池）用於一次篩選。其餘程序類似於上 述程序（RNA結合檢測法）進行。簡言之，使裝置進行在各 單元池内產生塗佈有生物素標記之抗GFP抗體之圓形區域 的表面圖案化。隨後，將使用偶合轉錄/轉譯兔網狀紅血 球系統（Promega)在微粒體膜（Promega)存在下”晶片外"製 備之所表現NS4B-GFP裝載於晶片中且與表面生物素標記 之抗GFP抗體結合。隨後裝載1.5 nM濃度之Cy5標記之3·負 末端RNA探針。隨後將各單元池分隔，繼而培育30 min以 〇 V 使得可進行蛋白與表面生物素標記之抗GFP抗體結合、庫 化合物溶劑化及蛋白與標靶RNA之平衡。隨後，執行 MITOMI以捕獲表面結合之複合物同時去除任何液相分 子。短暫洗滌以移除未捕獲之未結合物質之後，掃描該裝 置且分析結果。藉由量測Cy3之中值信號與氟硼熒之中值 信號之比率對於各數據點計算所結合RNA與所表現蛋白之 比率。將結果標準化為在不含有抑制性化合物之單元池中 所量測之信號。在一次篩選中大於90%抑制係定義為抑制 134691.doc -149- 200927102 之界限（cutoff)。對高於此界限之104種化合物及產生不明 確結果之其他110種化合物進行二次篩選。此係類似地執 行，其例外為使用兩個較小裝置（每一裝置640個單元池）， 所點樣之化合物濃度比一次筛選中之濃度低10倍，且對於 各化合物點5個重複樣。認為大於2.5倍之抑制為顯著的。 進一步分析此篩選中所鑑定之1 8種化合物對HCV RNA複 製之抗病毒效應。 活體外RNA結合之IC50值之測定》為進行IC50值之準確 〇 量測，藉由連續流動將抑制性化合物之連續稀釋液裝載於 微流體裝置上，同時在流動通道中維持化合物之穩定濃 度。此有助於避免所點樣化合物由於不完全溶解及/或化 合物與PDMS之結合所致之預期損失。該實驗基本上如對 於跨膜蛋白之RNA結合檢測法所述來執行，其例外為在抑 制性化合物存在下或無抑制性化合物的情況下在裝置中培 育所表現之蛋白及Cy5標記之HCV RNA探針。如以下統計 分析部分中所述量測IC50值。 〇
重組NS4B之表現及純化。在大腸桿菌BL21中表現GST-NS4B及GST且如他處所述來純化11。使NS4B與N末端6his-MISTIC蛋白（轉譯IM蛋白構築體之膜結合序列）同框融合 35。將以mistic-NS4B質體轉型之大腸桿菌隔夜培養物在 400 ml新鮮培養基中1:100稀釋且在37°C下生長至0D為 0.8。隨後添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG) (Invitrogen)至0· 1 mM之最終濃度。在37°C下生長3小時之 後，將細胞粒化且再懸浮於30 ml溶解緩衝液（50 mM 134691.doc -150- 200927102
NaCn，50 mM Tris HCL(pH8)、100 mM咪唑、10 mM癸基 麥芽糖苷，完全EDTA無蛋白酶抑制劑（Roche Applied Science))中》藉由在1〇,〇〇〇 psi之壓力下1分鐘在弗氏壓碎 器（French Press)中一個循環使細胞溶解，繼而以12,000 g 在4°C下離心5分鐘。將上清液裝載於鎳管柱（Amersham) 上。洗滌之後，使蛋白在含有400 mM咪唑之緩衝液中溶 離。添加20%之最終濃度的甘油，且將樣品儲存在-20°C 下。藉由SDS-PAGE監視純化。使用RC-DC檢測法（Bio- © Rad)量測總蛋白濃度。藉由西方墨點分析（Western blot analyse)使用針對 6-his(Santa Cruz Biotechnology)及 NS4B(Virostat)之單株抗體鑑定NS4B-mistic。以類似方式 表現及純化6his-mistic。 GST下拉檢測法。類似於先前所述之策略36，將1 經 純化GST-NS4B或GST在37°C下在50 μΐ含有32Ρ標記之活體 外轉錄HCV RNA(對應於負病毒鏈之3'末端）及結合緩衝液 (10 mM DTT，10 mM NaHEPES(pH 7.4)，33 mM NaC卜 Ο 0.1 mM EDTA，10 mM MgCl2)的反應混合物中培育1小 時。隨後添加50 μΐ tRNA預塗谷胱甘肽-璦脂糖珠粒 (Sigma)，繼而在4°C下培育1小時以使得GST與珠粒結合。 隨後將珠粒在結合緩衝液中洗滌三次且藉由樣品等分試樣 之液體閃爍計數量測結合之RNA。與在無T7 RNA聚合酶 的情況下所製備之RNA探針之對照培育係用於本底扣除。 RNA濾膜結合檢測法。基本上如所述34執行檢測。簡言 之，將各種濃度之mistic-NS4B蛋白或mistic對照在30°C下 134691.doc -151 - 200927102 與3.3 nM 32P標記之活體外轉錄HCV RNA探針一起在結合 緩衝液（50 mM HEPES(pH 7.0)，50 mM NaCl，1 mM MgCl2，10 ng/μΐ tRNA及0.2 mM癸基麥芽糖苷）中以40 μΐ 之最終體積培育1小時。將膜在結合緩衝液中預浸泡且由 上至下如下組裝於點潰墨法裝置（Schleicher & Schull)中： 硝基纖維素（Biorad)、Hybond N+(Amersham Biosciences)、 Whatman 3 mm遽紙。將結合反應物裝載於繪點裝置上且 經由膜過濾。洗滌之後，將膜風乾且藉由磷酸成像觀察。 Ο 結果表示所結合RNA之百分比，其係藉由硝基纖維素膜中 所偵測之信號除以硝基纖維素及Hybond膜中所偵測信號之 總和來計算。 細胞培養物及電穿孔。將Huh-7.5細胞保持於補充有1% L-麩胺醯胺（Gibco)、1°/。青黴素、1%鏈黴素（Gibco)、lx非 必需氨基酸（Gibco)及10%胎牛血清（Omega Scientific)之 Dulbecco改質之最低必需培養基（Gibco)中。將細胞株在以 0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA處理及以1:5之稀釋度接種後 〇 每週兩次繼代。將於生長中之Huh-7.5細胞胰蛋白酶化且 藉由以700 g離心5 min來收集。隨後將細胞在冰冷無核糖 核酸酶PBS(BioWhittaker)中洗滌三次且以每毫升1.5*107個 細胞再懸浮於PBS中。藉由使用T7 MEGAscript套組 (Ambion)進行Xbal線性化DNA模板之活體外轉錄產生用於 電穿孔之野生型或突變體FL-J6/JFH-5'C19Rluc2AUbi RNA，繼而純化，基本上如上所述（活體外RNA轉錄及螢 光標記）。將5 pg RNA與400 μΐ經洗蘇Huh-7.5細胞在2 mm 134691.doc •152· 200927102 間隙之小杯（BTX)中混合且立即以BTX-830電穿孔儀進行 脈衝處理（0.82 kV，五個99 ps脈衝）。在25°C下回收1〇分鐘 之後’將經脈衝處理之細胞於丨0 ml經預熱之生長培養基 中稀釋。將來自數次電穿孔之細胞彙集至通用儲備液中且 接種於6孔培養盤中（每孔5*1〇5個細胞）^ 24小時之後，將 培養基替換，且使細胞在筛選中所鑑定之各種抑制性化合 物（Sigma)之連續稀釋液存在下生長。分析18種鑑定化合 物中之1 7種市售化合物。未經處理之細胞用作水溶性化合 Ο 物之陰性對照。對於溶解於DMSO中之化合物，使未經處 理之細胞在相應濃度之溶劑存在下生長作為陰性對照。每 曰更換培養基。72小時處理之後，對細胞進行基於阿拉馬 藍生存力檢測及螢光素酶檢測。 生存力檢測法❶72小時處理之後，將細胞在37〇c下在 10%阿拉馬藍試劑（TREK Diagnostic Systems)存在下培育3 小時》隨後將培養盤進行掃描且藉由使用FLEXstati〇n „ & 384(Molecular Devices，lnc.)偵測螢光。視抑制性化合物 之溶劑：水（不在DMSO中之其他化合物）或DMs〇(d〇42、 (婦丙基去甲變嗎啡驗）、R-1 08、托品酿胺，沙力度胺、格 列本脲、LFM-A13)而定，分別將信號相對於未經處理之 樣品或在DMS Ο存在下生長之樣品標準化。 螢光素酶檢測法。使用水母螢光素酶檢測法（Pr〇mega) 測定病毒RNA複製。在此檢測法令分析與上述進行生存力 檢測相同之樣品。根據製造商之方案，將細胞以冰冷pBS 洗務且自培養盤上刮下至250 μ1冰冷水母溶解緩衝液中。 134691.doc •153· 200927102 隨後將20 μΐ細胞溶解物裝載於96孔培養盤上。注入100 μΐ 含有檢測受質之水母螢光素酶檢測緩衝液，且使用 Berthold LB 96 V光度計量測螢光素酶活性。如上所述， 將信號相對於未經處理之樣品或在相應濃度之DMS0存在 下生長之樣品標準化。 將以 100 u/ml 干擾素 a B2(PBL biomedical labs)處理之樣 品中所偵測之螢光素酶活性用作陽性對照，在72 hr處理下 展示三個對數減少。將該實驗重複四次，每次一式三份。 Ο 藉由使用式Y=a+(b-a)/(l + 10A(X-c))將數據擬合為三參數邏 輯曲線（BioDataFit，Chang Bioscience，Inc.)來量測 IC50 值。 實時PCR ·如所述29，將5χ104個Huh7.5細胞以力價為 1·4χ104 TCID50/ml之細胞培養物生長之HCV感染》感染之 後2小時，將細胞在培養基中洗滌三次。隨後將細胞每日 以各種濃度之克立咪唑處理。72小時之後，對樣品進行上 述生存力檢測，繼而添加TRIzol試劑（Invitrogen)且根據製 w 造商之說明一式三份提取總細胞RNA。隨後使用無規六聚 物及 Superscript II反轉錄酶（Invitrogen，Carlsbad，CA)執 行反轉錄。在所得cDNA上執行實時PCR以定量各樣品中 之HCV及肌動蛋白RNA(獨立反應物中）之量。使用活體外 轉錄之HCV RNA及人類肌動蛋白標準（Applied Biosystems，Foster City，CA)作為標準。使用引子 AGAGCCATAGTGGTCT(SEQ ID No: 17)A CCAAATCTCCA GGCATTGAGC(SEQ ID No: 18)及探針 6-羧基螢光素- I34691.doc -154- 200927102 CACCGGAATTGCCAGGACGACCGG-6(SEQ ID No:19)羧 基四曱基若丹明將HCV定量。使用β-肌動蛋白對照試劑 (Applied Biosystems)根據製造商之說明將肌動蛋白定量。 將HCV RNA含量調節為肌動蛋白含量且相對於未經處理 之樣品標準化。 抗性突變株之選擇。將已建立之具有HCV複製子之細胞 及重新以基因型lb次基因組HCV複製子（Bart 79I)30電穿孔 之Huh7細胞在新黴素及增加濃度之克立咪唑（1-16 μΜ)存 〇 在下繼代。將能夠在化合物存在下生長之菌落分離且繁殖 5-10個繼代。該等繼代中存活11個菌落（約60個菌落中）且 如先前所述11進行序列分析。 全細胞RNA電穿孔。自克立咪唑抗性複製子純系及未經 處理之複製子細胞，使用TRIzol試劑（Invitrogen)提取全細 胞RNA。如上所述將等量的全細胞RNA(50pg)電穿孔於 Huh7.5細胞中。使細胞在G418選擇下，在有或無克立咪唑 存在下生長3週。使用Image J(NIH)在固定及以結晶紫染色 ® 之後測定菌落數目。 統計分析。藉由將數據藉由非線性最小二乘回歸擬合 (BioDataFit，Chang Bioscience)擬合為描述平衡結合之方 程式：Y=a*X/(b+X)(a及b分別表示最大結合及Kd)來測定 解離平衡常數。藉由使用式Y=a+(b-a)/(l + 10A(X-c))(a、b 及c分別表示最小結合、最大結合及logEC50)將數據擬合 為三參數邏輯曲線（BioDataFit，Chang Bioscience，Inc)來 量測IC50值》 134691.doc -155- 200927102 其他資訊。 校正曲線：為證實經乾燥所點樣RNA探針之充分溶解及 排除大部分溶劑黏至組成微流體裝置之聚二甲基矽氧烷 (PDMS)上之可能性，產生校正曲線。藉由連續流動將已 知濃度之可溶性經標記RNA探針裝載於裝置中，且將多個 單元池之Cy3信號之平均值平均化^基於此曲線計算出該 檢測法中所用標靶RNA序列之實際濃度。實際檢測之濃度 平均為所點濃度之〇.55±0.02。值得注意的，基於典型印染 〇 (print)體積與單元池體積之間的比率計算出類似因子 (0.57)。所有提供之數據根據此因子來調節。 使用高離子強度緩衝液之RNA結合實驗：用於RNA結合 實驗之緩衝液之離子強度可對蛋白-RNA相互作用有影 響。為證實RNA結合檢測中所偵測之高親和力相互作用並 非低離子強度緩衝液所致之增強之靜電相互作用之結果， 藉由使用高（150 mM)離子強度條件之微流體執行NS4B之 RNA結合實驗。在PBS(137 mM NaCM，2.7 mM KC1，10 ® mM Na2HP04，2 mM KH2P〇4)或 150 mM Hepes存在下藉由 NS4B達成之RNA結合類似於以通常其他研究者用於RNA 結合檢測之50 mM Hepes緩衝液所彳貞測之結合（J Biol Chem 280，36417-36428(2005)及 J Virol 80，9865-9875 (2006)， 該等文獻之每一者係以引用的方式併入本文中）。在高離 子強度條件下NS4B與HCV負鏈RNA之3'末端之結合的Kd 經量測為6.6 士 3.3 nM(與在低（50 mM)離子強度條件存在下 3.4±1.0 nM之Kd相比）。該等結果表明所觀察到之RNA-結 134691.doc -156- 200927102 合僅存在少量靜電組份。 ΑΤΑ以劑量依賴性方式抑制藉由NS4B達成之RNA結 合：在庫篩選之前，已確定可在藥理學上抑制藉由NS4B 達成之HCV RNA結合。金精三羧酸（ΑΤΑ)為一種已知抑制 蛋白與核酸相互作用之化合物（]^11(：16丨〇3(^£13代84，3055-3064 (1977)，該文獻係以引用的方式併入本文中）。因 此，ΑΤΑ應抑制NS4B與HCV RNA之結合。為測試該假 設，在增加濃度之ΑΤΑ存在下重複NS4B RNA結合檢測。 © 實際上，發現ΑΤΑ以劑量依賴性方式抑制藉由NS4B達成 之HCV RNA之結合，其中IC50值為0.49±0.01 μΜ(ρ值-0.0003)(圖 14) ° 與該結果一致，ΑΤΑ為在LOPAC庫篩選中所鑑定之18種 化合物中之一者。由於該化合物先前已展示抑制NS4B之 RNA結合活性，故該化合物充當篩選之有效性的適用内部 對照。 小分子篩選中所鑑定之採樣的特異性：為確定小分子篩 ^ 選中所鑑定之採樣之特異性，選擇HuR蛋白（用於驗證吾等 RNA結合檢測法之人類RNA結合蛋白中之一者）。有趣的 是，除結合其標靶RNA序列4A(圖12)之外，該蛋白先前已 由其他研究者（Virology 274，378-390 (2000)，該文獻係以 引用的方式併入本文中）展示結合負HCV鏈之3’末端。在展 示抑制藉由NS4B達成之RNA結合之抑制性分子存在下， 測試HuR與一致4A RNA序列之結合。大多數採樣對RNA 結合無抑制效應，包括0.1 mM濃度下之克立咪唑。類似 134691.doc -157- 200927102 地，0.1 mM所鑑定之化合物對HuR與負HCV RNA鏈之3'末 端之結合不具有抑制效應。與其他採樣相比，已知為蛋 白-核酸相互作用之非特異性抑制劑之ΑΤΑ顯著抑制HuR與 4A及負HCV鏈之1末端之結合。該等結果支持以下結論： 所鑑定之採樣（包括克立咪唑）實際上對藉由NS4B達成之 RNA結合具有特異性。 實例1之圖示說明 圖4A說明合成5,6-二取代之克立咪唑化合物之通用方法 Ο 之一實施例。圖4B及圖4C說明合成兩種5,6-二取代之克立 咪唑化合物之實施例。 圖5a-5d說明在微流體平台上所量測之蛋白-RNA相互作 用之結果。圖5a為說明用於研究HuD與RNA之結合的標靶 RNA序列及使用微流體親和力分析量測之Kd值與先前藉由 凝膠遷移檢測法21 ’ 22量測之值的比較之表。ND=未測定。 圖5b說明HuD與增加濃度之AU3〇)RNA及AU3突變體 (△)RNA之結合曲線，如微流體親和力檢測法中所測定。 〇 W 對於各曲線展示在兩個獨立實驗中量測之10-20個重複樣 之標準化平均值。誤差條塊表示標準差。圖5c為來自微流 體晶片之螢光圖像之數位圖像：左：NS4B-GFP及NS5A(AH)-GFP經由其與抗GFP之相互作用固定於微流體裝置表面 上；中：對應於負病毒鏈之3’末端區域之RNA探針係以 Cy5標記且與蛋白一起在該裝置上培育。表示所結合之 RNA的Cy5信號在短暫洗滌之後展示；右：Cy5信號與GFP 信號之疊加表示所結合RNA與蛋白比率。圖5d為說明 134691.doc -158- 200927102 NS4B與RNA探針之連續稀釋液的活體外結合曲線之圖。 圖6a及6b說明展示NS4B辞異性結合HCV負鏈RNA之3·末 端之結果。圖6a說明為本揭示案之實施例設計之四種HCV 探針。5'UTR(非轉譯區域）p〇s及3’UTR pos分別對應於正病 毒鏈之5’UTR及3'UTR，且5’負末端及3·負末端分別對應於 負鏈之5'末端及3'末端區域。展示該等序列關於HCV開放 閱讀框架（ORF)之位置。圖6b為說明NS4B與等莫耳濃度之 四種HCV探針及非HCV β·ΝΑ(δ病毒RNA)探針之部分結合 © (fractional binding)之圖。負基因組鍵之3’末端>5χ較有 利。 圖7a-7d說明NS4B内之RNA結合域之鑑定及結果》圖7a 說明病毒及噬菌體蛋白中所發現之已知賦予RNA結合之精 胺酸富含序列9’25 ’ 26。下方展示與精胺酸富含樣基元相當 精密地符合之NS4B之末端環中之元件。所列蛋白為HIV Rev及Tat25 ; λ、Φ21及P22噬菌體抗終止子N蛋白25 ;箣竹 花葉病病毒（BaMV)26及脊髓灰質炎病毒2C9之三基因區蛋 ® 白l(TGBpl)。圖7b說明NS4B(基因型la)之一級序列中之正 電胺基酸（R及RR，黑體及加下劃線者）。圖7c為表明NS4B 之預測跨膜及細胞内域之示意圖。NS4B之C末端片段中之 保守正電胺基酸展示為R或RR。圖7d為說明介導藉由 NS4B達成之RNA結合之精胺酸殘基的圖。藉由微流體親 和力分析測定野生型NS4B-GFP、RRa及RRb NS4B-GFP突 變體及NS5A(AH)-GFP與負病毒RNA鏈（1.5 nM)之3’末端之 結合。條塊表示標準差。 134691.doc -159- 200927102 圖8a-8d說明小分子餘；里4a - =fc i I ，# # 刀卞師選揭不克立咪唑虱氣酸鹽抑制藉
由NS4B達成之RNA結合及活體内HCV RNA複製之結果。 ★圖8a為表示低嚴格度量測128〇種化合物之抑制作用的°第一 師選之數位圖像’纟中該等化合物之抑制作用分類為具有 兩（淺灰色）、不明確（黑色）或無（灰色）抑制作用。基於初始 篩選’隨後再次以Μ高嚴格度及較大數目之重複樣㈣ 214種化合物，且經由活體内細胞檢測法測試最佳18種抑 制劑抑制HCV複製之能力。圖崎明展示藉由最佳的18種 小分子活體外抑制NS4B_RNA結合之圖。圖8c為展示活體 内HCV螢光素酶-鍵聯報導基因細胞檢測法之圖，其展示 克立咪唾抑制HCV複製(左轴，下方之曲線♦)而如阿拉馬藍 所量測對細胞無可量測之毒性（右軸，上方之曲線口）。圖 8d為展示克立咪唑之活體外NS4B_RNA結合：抑制曲線之 圖。 圖9a-9e說明對應於克立咪唑抗性突變體數據之結果。 複製子細胞在克立咪唑存在下繼代且將個別菌落分離、繁 殖且對其中所具有之HCV基因組進行序列分析。圖93為 表明NS4B之預測跨膜及細胞内片段之示意圖。保守正電 胺基酸展示為R或RR〇克立咪唑抗性突變W55R展示為w R。圖9b為說明以自具有野生型或W55R突變體純系之細胞 提取之50 全細胞RNA電穿孔，繼而在不存在（白色條塊） 或存在（灰色條塊）1〇 μΜ克立咪唾的情況下生長之5 、、田胞中HCV複製之圖。結果表示與各相應未經處理之對照 相比所獲得之菌落之相對數目。圖9c說明藉由在不存在 134691.doc -160- 200927102 (白色條塊）或存在（灰色條塊）1〇 μΜ克立味β坐情況下執行之 電穿孔活體外轉錄螢光素酶報導基因鍵聯之野生型或 W55R突變體HCV RNA基因組引發的HCV複製檢測法。結 果表示各基因組相對於其未經處理之水準的複製水準。圖 9d說明如由微流體在10 ηΜ克立咪唑存在（灰色條塊）及其 不存在（白色條塊）下活體外量測之野生型NS4B及W55R NS4B突變體之HCV RNA結合。圖9e說明W55R NS4B突變 體（實線，〇)及野生型NS4B(虛線，▲)與RNA探針之連續稀 〇 釋液的活體外結合曲線。 圖1(^-10〇說明基於微流體之！^^八結合檢測法之示意 圖。該流程中展示每個微流體裝置之數百/數千單元池中 之3個個別單元池。圖i〇a說明隔室及微機械閥。在控制信 道穿過流動通道之處設置一閥。兩個通道之間的連接區中 之所得薄膜可藉由液壓致動偏轉。使用複合閥系統使得大 量彈性體微閥在該等裝置内執行複合流體控制。 0 圖1〇&說明該實驗方案。上方之*表示Cy3標記之RNA探 針。下方之*表示表面結合之氟硼熒標記蛋白。 圖1 〇b( 1)說明將以Cy3標記之標靶rna序列以微陣列形 式點樣於環氧化物塗佈之載片上。 圖l〇b(2)說明將微流體裝置與載片對準且接合使得陣 列中之各點與裝置中之單元池接觸。對裝置進行在各單元 池内產生塗佈有生物素標記之抗組胺酸抗體之圓形區域的 表面圖案化（參見補充之圖l〇c)。分隔流動通道與RNA腔室 之"頸閥"在該過程期間保持關閉。 134691.doc 200927102 圖l〇b(3)說明隨後將該裝置以含有編碼Ms標記蛋白之 DNA模板的活體外轉錄/轉譯混合物裝載。添加氟硼癸標 記之tRNALys以供蛋白標記之用。 圖l〇b(4)說明各單元池隨後藉由控制兩個"夾層"微機械 閥來分隔。 圖l〇b(5)說明打開"頸閥"藉由組合流動通道隔室與rna 腔室形成單一隔室。繼之進行培育以使蛋白合成已合成 之蛋白與表面生物素標記之抗his抗體結合，標靶rna溶劑 Ο 化及蛋白與標把RNA平衡。 圖1 〇b(6)說明隨後藉由致動"按鈕"膜執行mit〇mi以捕獲 表面結合複合物同時去除任何液相分子。 圖1 〇b(7)說明"夾層"閥打開繼而短暫洗滌以移除未捕獲 之未結合物質。 圖l〇b(8)說明"按鈕"膜打開且藉由陣列掃描儀掃描該裝 置。偵測所捕獲之RNA分子及表現之蛋白。藉由量測cy3 之中值信號與氟硼熒之中值信號（由下方〇表示）對於各數據 點计异所結合RNA與所表現蛋白之比率。 圖l〇c說明表面圖案化。圖10(；(1)說明藉由使生物素標記 之BSA溶液（金)流經所有流動通道來衍生可及表面區域。圖 10c(2)說明裝載中性鏈親和素溶液·）。圖1〇e(3)說明啟 動按鈕"膜。圖l〇c(4)說明以生物素標記之溶液（金)鈍化除 由按鈕遮蔽之60 μιη圓形區域之外的所有剩餘可及表面區 域^ 5) ”按鈕"膜打開。6)裝載生物素標記之抗體溶液（·） 使得將先前遮蔽之圓形區域特異性功能化。圖丨〇e(7)說明 134691.doc •162- 200927102 將活體外表現之蛋白（ρ)裝載於裝置中且與塗佈離散圓形 區域之生物素標記抗體結合。所述步驟中之每一者均繼之 以PBS洗滌》 圖11 a-lib說明展示吾等RNA結合檢測法中信噪比之 圖。圖11a為說明HuD-his(·)及Gus-his(口）與增加濃度之 AU3 RNA探針結合之圖。展示代表性實驗❶條塊表示標準 差。圖11a及lib為說明NS4B-GFP-微粒體膜mm(·，實線） 及NS5A(AH)-GFP-mm(_，虚線）與增加濃度之負鏈3'末端 〇 之結合的曲線。灰色條柱表示信噪比最大之探針濃度之範 圍。吾等報導之實驗中之全部均在該範圍内執行。展示代 表性實驗。條塊表示標準差。 圖12a-12c說明藉由ELAV樣家族之另一人類蛋白 HuR(ELAV L1)達成之RNA結合的基於微流體之分析之結 果。圖12a說明用於研究HuR與RNA結合之標粗RNA序列 及藉由習知RNA結合方法（EMBO J 16，2130-2139 (1997) ’該文獻係以引用的方式併入本文中）展示之表型。 圖12b說明藉由微流體達成之HuR結合RNA。將Cy3標記 之標靶RNA序列之微陣列用於程式化微流體裝置，且檢測 裝置上表現之氣删癸標記蛋白與該等RN A序列之結合。結 果表示所結合RNA(中值Cy3信號）與所表現蛋白（中值氟棚 熒信號）之比率。展示在兩個獨立實驗中量測之1〇_2〇個重 複樣之標準化平均值。誤差條塊表示標準差。灰色條塊表 示HuR-his之結合且透明條塊表示用作陰性對照之Gus his 之結合。 134691.doc -163- 200927102 圖12c說明HUR結合不受5種最具活性化合物影響，但受 ΑΤΑ影響。吾人測試在存在及不存在NS4B RNA結合抑制 劑下HUR與其4Α RNA標靶之結合。數據表示10-20個重複 樣之平均值且條塊表示標準差。 圖13a-13c說明藉由習知方法獲得之NS4B與HCVRNA結 合之結果。使NS4B在大腸桿菌中表現，與GST或mistic-6his融合且純化。圖13a說明由GST下拉檢測法所量測之 GST-NS4B及GST與對應於負病毒鏈3’末端之32P標記之 O RNA探針的結合活性》圖13b說明代表性RNA濾膜結合檢 測法之硝基纖維素膜。展示與10 mM mistic-NS4B(左圖）或 2 mM mistic-NS4B(右圖）結合之32P標記之HCV RNA探針。 圖13c說明如由濾膜結合檢測法所量測，所結合RNA占蛋 白濃度為10 mM(灰色條塊）及2 mM(白色條塊）之mistic-NS4B及mistic蛋白之百分比。
圖14a說明ΑΤΑ以劑量依賴性方式抑制藉由NS4B達成之 RNA結合之結果。在增加濃度之ΑΤΑ存在下，藉由NS4B 〇 達成之RNA結合之劑量反應曲線如由微流體所量測。γ轴 為相對於無ΑΤΑ的情況下之結合，所結合RNA與蛋白比 率。X軸為 ΑΤΑ 濃度（μΜ)。使用式 Y=a+(b-a)/(l + l〇A(X-c))(BioDataFit，Chang Bioscience)將數據擬合為 3 參數邏 輯曲線且在0.49±0.01 μΜ下計算IC50值（p值-0.0003)。 圖1 5說明藉由實時PCR檢測法展示克立咪唑抑制HCV複 製之結果。實時PCR檢測HCV複製水準展示克立咪唑抑制 HCV複製（左轴♦(下方之曲線））而對細胞無可量測之毒性 134691.doc • 164· 200927102 (右軸，(上方之曲線））。 圖16為展示RRb突變將複製降低約45倍及具有RRa突變 之複製子於RNA複製中完全缺失之數位圖像。 圖17A展示克立咪唑氫氯酸鹽之化學結構。 圖17B展示具有增強之效能及功效之克立咪唑衍生物分 子之化學結構。 圖17 C說明展示如藉由微流體所量測，克立味。坐衍生物 分子（*)及母體克立咪唑氫氣酸鹽化合物（□)之活體外抑制 © 曲線圖（所結合RNA/蛋白比率與化合物濃度（μΜ))。 圖17D說明展示如由HCV感染細胞中之實時PCR檢測所 量測，在增加濃度之克立咪唑衍生物分子（·）及母體克立 咪唑氫氣酸鹽化合物（□)存在下HCV複製之劑量反應曲線 的圖（相對病毒複製與化合物濃度（μΜ))。 參考文獻，其每一者係併入本文中： 1. Liang，T.J.，Rehermann，Β.，Seeff，L.B. & Hoofnagle ，J.H. Pathogenesis，natural history，treatment，and prevention of hepatitis C. Ann Intern Med 132 » 296-305 (2000)° 2. Reed，K.E. & Rice，C.M. Overview of hepatitis C virus genome structure，polyprotein processing，and protein properties. Curr Top Microbiol Immunol 242 » 55-84 (2000)。 3. B. N. Fields，D. Μ· Knipe及 P. M. Howley (編輯）， Fields Virology. (Lippincott-Raven Publications ， -165- 134691-doc 200927102
Philadelphia ， Pa. ， 1996)中之 Rice ， C.M. Flaviviridae : The viruses and their replication o 4. Egger，D.等人.Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex. J Virol 76 > 5974-5984 (2002)。 5. Elazar，Μ·，Liu，P.，Rice，C.M. & Glenn，J.S. An N-terminal amphipathic helix in hepatitis C virus o (HCV) NS4B mediates membrane association，correct localization of replication complex proteins，and HCV RNA replication. *7 Γζ>ο/ 78，11393-11400 (2004)。 6. Gosert，R.等人.Identification of the hepatitis C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons. «/ h>c>/ 77，5487-5492 (2003)。 7. El-Hage，N. & Luo，G. Replication of hepatitis C virus RNA occurs in a membrane-bound replication o complex containing nonstructural viral proteins and RNA. J Gm 84，2761-2769 (2003)。
8. Kusov，Y.Y.，Probst，C.，Jecht，Μ.，Jost，P.D. & Gauss-Muller > V. Membrane association and RNA binding of recombinant hepatitis A virus protein 2C. Jrc/z FYro/ 143，931-944 (1998) o 9. Rodriguez，P.L. & Carrasco，L. Poliovirus protein 2C contains two regions involved in RNA binding activity. 134691.doc -166 - 200927102 /5/0/ C7zem270，10105-101 12 (1995)。 10. Echeverri，A.C. & Dasgupta，A. Amino terminal regions of poliovirus 2C protein mediate membrane binding. 208，540-553 (1995) °
11. Einav，S.，Elazar，M.，Danieli，T. & Glenn，J.S. A nucleotide binding motif in hepatitis C virus (HCV) NS4B mediates HCV RNA replication. J Virol 78 » 1 1288-1 1295 (2004)。
❹ 12. Overington JP，A.-L.B.，Hopkins AL. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5 f 993-996 (2006)。 13. Lundin，Μ.，Μοηηέ，M.，Widell，A.，Von Heijne， G. & Persson，M.A.A. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. J Virol 77 > 5428-5438 (2003) ° 14. Hadd AG，R.D.，Halliwell JW，Jacobson SC，
Ramsey JM. Microchip device for performing enzyme assays. 69，3407-3412 (1997) o 15. Maerkl，S.J· & Quake，S.R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. 315，233-237 (2007) o 16. Toepke » M.W. & Beebe > D.J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a chip 6 j 1484-1486 (2006) ° 134691.doc -167- 200927102 17. Lee，J.N.，Park，C. & Whitesides，G.M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Anal chem 75 > 6544-6554 (2003) ° 18. Whitesides，G.M. The origins and the future of microfluidics. iVaiwre 442 ， 368-373 (2006) o 19. Kang，L.，Chung，B.G.，Langer，R. & Khademhosseini ，A. Microfluidics for drug discovery and development : from target selection to product lifecycle management. ❾ ίοί/αγ 13，1 -13 (2008)。 20. Myer，V.E.，Fan，X.C. & Steitz，J.A. Identification of HuR as a protein implicated in AUUUA-mediated mRNA decay.五·/ 16，2130-2139 (1997)。 21. Park，S.，Myszka，D.G·，Yu，Μ.，.Littler，S.J. &
Laird-Offringa，I.A. HuD RNA recognition motifs play distinct roles in the formation of a stable complex with AU-rich RNA. Mo/ Ce/Wo/ 20，4765-4772 (2000) ° 22. Park-Lee ，S. ，Kim，S. & Laird-Offringa，I.A.
Characterization of the interaction between neuronal RNA-binding protein HuD and AU-rich RNA. J Biol 278，39801-39808 (2003) ° 23. Glenn » J.S. » Taylor > J.M. & White » J.M. In vitro-synthesized hepatitis delta virus RNA initiates genome replication in cultured cells. J Virol 64 > 3104-3107 (1990)° 134691.doc -168- 200927102 24. Glenn，J.S·，Watson，J.A.，Havel，C.M. & White， J.M. Identification of a prenylation site in delta virus large antigen. Science 256 > 133 1-1333 (1992) 0 25. Burd，C.G. & Dreyfuss，G. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 265 » 615-621 (1994) °
26. Wung，C.H.等人.Identification of the RNA-binding sites of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaic potexvirus. J Gen Virol 80 ( Pt 5) > 1119-1126 (1999) 。 27. Spangberg，K.，Wiklund，L. & Schwartz，S. HuR，a protein implicated in oncogene and growth factor mRNA decay » binds to the 3' ends of hepatitis C virus RNA of both polarities. Virology 274 * 378-390 (2000) ° 28. Tscherne ， D.M.等人. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. ·/ h>o/ 80，1734-1741 (2006) o 29. Lindenbach，B.D.等人.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. 309 ， 623-626 (2005) 0 3 0. Elazar，M.等人.Amphipathic helix-dependent localization of NS5A mediates hepatitis C virus RNA replication. J Virol 77 » 6055-6061 (2003) ·> 3 1. Tong，X.等人.Identification and analysis of fitness of 134691.doc •169- 200927102 resistance mutations against the HCV protease inhibitor SCH 503034. 3«"·νζ>α/ 70，28-38 (2006)。 32. Dimitrova，Μ·，Imbert，I.，Kieny，Μ.P. & Schuster， C. Protein-protein interactions between hepatitis C virus nonstructural proteins. J Virol 77 > 5401-5414 (2003)。 33. Blight，K.J.，Kolykhalov，A.A. & Rice，C.M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell 〇 culture. iScz.ewce 290，1972-1974 (2000)。 34. Huang，L.等人.Hepatitis C virus nonstructural protein 5A (NS5A) is an RNA-binding protein. J Biol Chem 280 ， 36417-36428 (2005)» 35. Roosild，T.P.等人.NMR structure of Mistic，a membrane-integrating protein for membrane protein
expression. Science 307 > 13 1 7-1321 (2005) o 3 6. Schilders，G.，Raijmakers，R.，Raats，J.M.H. & Pruijn » G.J.M. MPP6 is an exosome-associated RNA-binding protein involved in 5.8S rRNA maturation. Nucleic acz.c/5 re·? 33 ， 6795-6804 (2005)。 實例2 : 為證實克立咪唑在治療感染有HCV之患者中的活體内功 效，將3名慢性感染有HCV之患者以100毫克克立咪唑治療 8週（p.o. BID)。在第一個四週克立咪唑單一療法之後，添 加聚乙二醇化干擾素。圖2中提供血清中之基線特徵及連 134691.doc -170- 200927102 續HCV病毒負荷。在以克立哺„坐單獨治療之後，Hcv病毒 負荷顯著降低，在治療4週之後變得完全或幾乎不可偵 測。該等結果證實克立咪唑在治療感染有HCV之患者中有 效。 實例3 : 圖4A說明可用於生產5,6_二取代之克立咪唑化合物之方 法。詳言之，該等方法可生產化合物i(以甲基在5及6位置 處二取代（圖4B))及化合物2(&C1基在5及6位置處二取代 〇 (圖 4C))。 二取代之克立咪唑可藉由以下步驟合成：4,5_二取代_ 苯-1,2-二胺（A)與2-氣-乙醯亞胺酸乙酯（B)縮合產生2_氣甲 基^…-二取代-^-苯并咪唑…”繼而以卜溴曱基-‘氣-苯 (D)烷基化得到ι_(4_氣-苯甲基）_2氣甲基_5 6二取代_1H_ 苯并咪唑（E);及最終以吼咯啶將i 氣-苯甲基）_2_氣甲 基-5,6-二取代-1H-苯并咪唑烷基化產生5 6_二取代之克 立咪唑^-(和氣-苯甲基）-5,6-二取代-2-吡咯啶-1-基甲基-1H-苯并啼^坐）（g)。 實例4 : 如下所示之表3說明使用本文所述之螢光素酶及阿拉馬 藍檢測法的克立咪唑類似物對HCV RNA複製（AV)及細胞 生存力（Viab)之效應。量測兩個濃度下之化合物活性以測 疋效應是否為劑量依賴性的。數值表示化合物治療之後剩 餘正常活性（病毒複製或細胞生存力）之百分比；該等值亦 經結合以提供相對活性之粗趟度量測。 134691.doc -171 - 200927102 在兩種濃度之化合物（5微莫耳及10微莫耳）下測定各化 合物相對於無藥物對照之抑制百分比，且記錄於表中。此 外，將該等百分比轉化為如下記分系統："-"=90-100%殘 餘活性（亦即無效應）；" + "=60-90%殘餘活性；”++"=30-60%殘餘活性；"+++"=0-30°/。殘餘活性。因此，在該複製 檢測法中得分為+++之化合物與得分為+之化合物相比具有 較大抗病毒活性（AV)。類似地，在細胞代謝檢測法（Viab= 生存力）中得分為+之化合物與得分為+++之化合物相比具 〇 有較小毒性。 該等結果證實H1拮抗作用可自抗病毒活性分離，且缺乏 H1活性所需之第三胺基之化合物可相對於克立咪唑展示提 高之抗病毒效應；許多化合物在抗病毒活性與對細胞生存 力之影響之間展示強烈差異，支持以下結論：前者之活性 由特異性抑制NS4B/RNA結合引起；且許多化合物展示抑 制HCV RNA複製在較高（10 uM)濃度下更顯著之劑量依賴 性活性。綜上所述，該等構效關係展示本文所述之克立咪 ® 唑之已知及新穎類似物可阻礙HCV複製，且缺乏HI拮抗作 用（及所伴隨之CNS效應）之類似物維持可接受之治療比 率0 134691.doc -172- 200927102 表3
5uM 10 uM 5uM 10 uM AV Viab AV Viab AV Viab AV Viab Ο (X” ^>c， 62 107 37 93 + - -H- - c'Ocv 87 99 60 94 + - + - "^>0. Cl 30 83 8 70 +-H- + +++ + ⑴ ^〇Br 23 81 8 68 +++ + +++ + ai>- s>Br 3 54 2 51 +++ ++ +++ +4- 〇c:”。H ^〇Br 50 97 28 90 ++ - +++ - a> 0 74 101 54 96 + - -H- - a> "Of 30 87 12 76 -f-H- + -HH- + 134691.doc -173- 200927102 CO 49 99 23 84 ++ - +++ + 70 98 58 100 + +4* - 關鍵詞： 9〇-1 〇〇%殘餘活性（無效應） + 60-90%殘餘活性 〇 ++ 30-60%殘餘活性 +++ 0-30%殘餘活性 應注意比率、濃度、量及其他數值數據在本文中可以範 圍形式表達。應瞭解該範圍形式係為便利及簡潔而使用， 且因此應以靈活方式解釋以不僅包括明確描述為該範圍之 界限之數值且包括該範圍内之所有個別數值或子範圍，如 同各數值及子範圍均經明確描述一般。為進行說明，，，約 0.1%至約5%”之濃度範圍應解釋為不僅包括明確描述之約 © 0.1重量％至約5重量％之濃度，且包括所指範圍内之個別 濃度（例如1%、2%、3%及4%)及子範圍（例如〇.5〇/〇、 1.1%、2.2%、3.3。/。及4.4%)。術語”約”可包括所修正數值 之 ±1%、±2%、±3%、土4%、±5%、±6%、±7%、±8%、 ±9%或±1〇〇/0或±ι〇〇/0以上。此外，短語"約，父，至，〆，，包括，，約 Y至約'y·"。 應強調本揭示案之上述實施例僅為實施例之可能實例， 且僅為清晰瞭解本揭示案之原理而閣述。可在大體上不背 134691.doc -174- 200927102 離本揭示案之精神及原理的情況下對本揭示案之上述實施 例進行許多修改及改變。所有該等改變及修改意欲在本文 中包括於本揭示案之範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1A及1B展示說明在克立咪唑與NS3蛋白酶抑制劑 (SCH503 034)之各種組合存在下使用螢光素酶報導基因鍵 聯之HCV基因組的複製檢測法之數據的曲線圖。 圖2說明患者血清中之基線特徵及連續HCV病毒負荷。 〇 圖3說明HCV正鏈RNA基因組之5'非轉譯區及HCV負鏈 RNA之3 ·非轉譯區的RNA鏈。 圖4A說明合成5,6-二取代之克立咪唑化合物之通用方法 之一實施例。圖4B及圖4C說明合成兩種5,6-二取代之克立 咪唑化合物之實施例。 圖5a-5d說明在微流體平台上所量測的蛋白質-RNA相互 作用之結果。 圖6a及6b說明展示NS4B特異性結合HCV負鏈RNA之3’末 端之結果。 圖7a-7d說明NS4B内之RNA結合域之鑑別及結果。 圖8a-8d說明小分子篩選揭示克立咪唑氫氣酸鹽抑制藉 由NS4B達成之RNA結合及活體内HCV RNA複製之結果。 圖9a-9e說明對應於克立咪唑抗性突變體數據之結果。 圖10a-10c說明基於微流體之RNA結合檢測法之示意 圖。 圖lla-llb說明展示吾等RNA結合檢測法中信噪比之曲 134691.doc -175- 200927102 線圖。 圖12a-12c說明藉由ELAV樣家族之另一人類蛋白 HuR(ELAV L1)達成之RNA結合的基於微流體之分析之結 果。 圖13a-13c說明藉由習知方法獲得之NS4B與HCVRNA結 合之結果。 圖14說明ΑΤΑ以劑量依賴性方式抑制藉由NS4B達成之 RNA結合的結果。 © 圖15說明藉由實時PCR檢測法展示克立咪唑抑制HCV複 製之結果。實時PCR檢測HCV複製水準展示克立咪唑抑制 HCV複製（左軸♦(下方之曲線）），而對細胞無可量測之毒性 (右軸，(上方之曲線））。 圖16為展示RRb突變將複製降低約45倍及RNA複製中完 全缺失具有RRa突變之複製子的數位圖像。 圖17A展示克立咪唑氫氯酸鹽之化學結構。 圖1 7B展示具有增加之效能及功效的克立咪唑衍生物分 ®子之化學結構。 圖1 7C說明展示由微流體所量測的克立咪唑衍生物分子 (·)及母體克立咪唑氫氯酸鹽化合物（□)之活體外抑制曲線 圖（所結合RNA/蛋白質比率與化合物濃度（μΜ))。 圖17D說明展示如由HCV感染細胞中之實時PCR檢測法 所量測，在增加濃度之克立咪唑衍生物分子（·）及母體克 立咪唑氫氯酸鹽化合物（□)存在下HCV複製之劑量反應曲 線圖（相對病毒複製與化合物濃度（μΜ))。 134691.doc -176- 200927102
序列表 <110>美國史丹佛大學 <12〇>治療黃病毒科病毒感染之方法、治療黃病毒科 病毒感染之組合物及用於鑑定供治療黃病善科 病毒感染之組合物的篩選檢浪]法 <130> 221907-2100 <140> 097135844 <141> 2008-09-18 <150> 60/973,309 <151> 2007-09-18 <150> 61/088,759 <151> 2008-08-14 <150> 61/092,537 <15丨> 2008-08-28 <160> 19 <170> Patcntln version 3.5
<210> 1 <211> 341 <212> DNA <213> C型肝炎病毒 <400> 1 gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcstgcag cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c
<210> 2 <211〉 341 <212> DNA <2Π> C型肝炎病毒 Q <400> 2 w cggucggggg acuacccccg cugugaggug guacuuagug aggggacacu ccuugaugac agaagugcgu cuuucgcaga ucgguaccgc aaucauacuc acagcacguc ggagguccug gggg£gaggg cccucucggu aucaccagac gccuuggcca cucauguggc cuuaacgguc cugcuggccc aggaaafiaac cuauuugggc gaguuacgga ccucuaaacc cgcacggggg cguucugacg aucggcucau cacaacccag cgcuuuccgg aacaccauga cggacuaucc cacgaacgcu cacgggsccc uccagagcau cuggcacgug g
<210> 3 <211> 447 <212> DNA <213> C型肝炎病毒 <400> 3 gatatcataa tacgactcac tatagccagc ccccgattgg gggcgacact ccaccataga tcactcccct gtgaggaact actgtcttca cgcagaaagc gtctagccat ggcgttagta 134691·序列表.doc 60 120 180 240 300 341 60 120 180 240 300 343 60 Ϊ20 200927102 tgagtgtcgt gcagcctcca ggaccccccc tcccgggaga gccatagtgg tctgcggaac cggtgagtac accggaattg ccaggacgac cgggtccttt cttggatcaa cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa agggcgcgcc atggatcgat atccagcaca gtggcggccg ctcgagt 180 240 300 360 420 447 ❺ <210> 4 <211> 526 <212> DNA <213> C型肝炎病毒 <400> 4 acucgagcgg ccgccacugu gcuggauauc gauccaugsc gcgcccuuug guuuuucuuu gagguuuagg auucgugcuc auggugcacg gucuacgaga ccucccgggg cacucgcaag cacccuauca ggcaguacca caaggccuuu cgcgacccaa cacuacucgg cuagcagucu cgcgggggca cgcccaaauc uccaggcauu gagcggguug auccaagaaa ggacccgguc guccuggcaa uuccggugua cucaccgguu ccgcagacca cuauggcucu cccgggaggg gggguccugg aggcugcacg acacucauac uaacgccaug gcuagacgcu uucugcguga agacaguagu uccucacagg ggagugaucu augguggagu gucgccccca aucgggggcu ggcuauagug agucguauua ugauaucugc agaauuccac cacacuggac uaguggaucc gagcucggua ccaagcuuaa guuuaaacgc uagccagcuu gggucu 60 120 180 240 300 360 420 480 526 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223> RNA結合域 <400> 5 Thr Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gin 15 10 15
<210> 6 <211> 17 <212> PRT 人工序列 <220> <223> KNA結合域 <400> 6 Ala Leu Gly He Scr Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5 10 15
Pro <210> 7 <211> 18 <212> PRT <2]3>人工序列 134691-序列表.d〇c 2- 200927102 <220〉 <223> RNA結合域 <400> 7
Met Asp Ala Gin Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala GIu Lys Gin Ala 15 10 15
Gin Trp <210〉 8 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> RNA結合域 <400> 8
Gly Thr Ala Lys Ser Arg Tyr Lys Ala Arg Arg Ala Glu Leu lie Ala 15 10 15
<210> 9 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉RNA結合域 <400> 9
Gly Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala lie 15 10 15
Glu Arg
<210〉 10 <211> 38 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> RNA結合域 <400〉 10
Met Asp Asn Arg lie Thr Asp Leu Leu Thr Arg Ser Gly Tyr Leu Arg 15 10 15
Thr Ser Glu Pro Arg Gly Ala Gly Gin Gin Leu Val Val His Ala Val 20 25 30
Ala Gly Ala Gly Lys Thr 35 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 134691-序列表.doc 200927102 <220> <223> RNA結合域 <400> 11
Asn Glu Arg Asn Arg Arg Ser Asn <210> 12 <211> 57 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> RNA結合域 <400> 12
Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg 1 5 10 15
Leu lie Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr 20 25 30
Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala lie Leu Ser Ser 35 40 45
Leu Thr Val Thr Gin Leu Leu Arg Arg 50 55 <210> 13 <211> 261 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>膜蛋白序列 <400> 13
Ala Ser His Leu Pro Tyr lie Glu Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Gin 15 10 15
Phe Lys Gin Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gin Thr Ala Ser Arg His Ala 20 25 30 ❹
Glu Val lie Thr Pro Ala Val Gin Thr Asn Trp Gin Lys Leu Glu Val 35 40 45
Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe lie Ser Gly lie Gin Tyr Leu 50 55 60
Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala He Ala Ser Leu Met 65 70 75 80
Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gin Thr Leu 85 90 95
Leu Phe Asn lie Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Ala Pro 100 105 1ΪΟ
Gly Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala He -4- 134691-序列表.doc 200927102 115 120 125
Gly Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp lie Leu Ala Gly Tyr 130 135 140
Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys lie Met Ser Gly 145 150 〗55 160
Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala lie Leu 365 170 175
Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Ser Ala Ala He Leu Arg 180 185 190
Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu 195 200 205 lie Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Va! 210 215 220
Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala lie Leu Ser Ser Leu 225 230 235 240
Thr Val Thr Gin Leu Leu Arg Arg Leu His Gin Trp lie Ser Ser Glu 245 250 255
Cys Thr Thr Pro Cys 260 <210〉 14 <211> 17 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223> RNA探針序列 <400> 14 auuuauuuau uuauuua 17 <2】0> 15 0<211> 17 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223> RNA探針序列 <400> 15 cuuucuuucu uucuuuc 17 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>核苷酸結合序列 <400> 16
Gly*Ser Val Gly Gly Leu Gly Lys 134691-序列表.doc 200927102 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗原決定基標籤 <400> 17
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>抗原決定基標籤 <400> 18
Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr 15 10 15
Thr Gly Ala Gly Cys 20 <210> 19 <21]> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>抗原決定基標籤 <400> 19
Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly 15 10 15
Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly 20
O -6- 134691-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200927102 十、申請專利範圍： 1. 一種抑制劑之用途，其係用於製備治療經黃病毒 (F/aWWrzWae)科病毒之病毒之宿主的藥劑，其中該抑制 劑可降低該宿主中病毒量。 2. 如請求項1之用途，其中該等黃病毒科病毒包括選自由 以下病毒組成之群的病毒：黃病毒（//av/Wrws)、瘦病毒 、C型肝炎病毒、黃熱病病毒（_ye//ow /ever Wrw·?，YFV);登革病毒（Dengue virus);日本腦炎病毒 (Japawese Ewcep/za/zD Wrw·?);澳洲墨萊溪谷腦炎病毒 (Murray Valley Encephalitis virus) ’，聖路鬲锻炎病 KSt. Louis Encephalitis virus) ·，西兄备病秦（West Nile vz'rw·?);碑傳播腦炎病毒Wrws); C型肝炎病毒；庫寧病毒Wrw«s);中歐腦炎病毒 (Cewira/ Ewropeara ewcep/za/zD 蘇聯春夏型腦炎 病毒{Russian spring-summer encephalitis virus)；波瓦森 病毒（尸Wrw·?);卡薩努森林病病毒（欠yasawwr O Foresi Wrws);及郭木斯克出血熱病毒（Ow·^ hemorrhagic fever virus) ° 3. 如請求項1之用途，其中該病毒為C型肝炎病毒。 4. 如請求項1之用途，其中該抑制劑具有以下結構：
    其中R!係選自由以下基團組成之群：-H、 ’>T 坑基 n=0,1,2 及 134691.doc 200927102 芳基 n-o,it2 . f 其中n2係選白、 其中x係選自*以下基團組成之群：姐乂。,1,2， V、基以下基團貌1且成之群：-烧基、·芳基、 、、’、坑基\人燒基.p) ό ΡγΗ或烷基 异VNJ 〇 人、\Ό VN'
    獨立地選自劑包括非環狀基團’則r4-r7中每一者係 自由”基團組成之群：_H、_C1、_F、_CH、 Η 榜此 3-OCH3 、nh2 、烧基 烷基 又 ‘烷基 烷基 Η ，N、Q/烷基 0 气基 ^烷基 醯基 0、、/ 、 〇 Ό 、 〆〇、烷基 H 、 W基 人，炫基 Ά基 Ο X s 、及〆烷基. 9 Η 烷基 V ’s、nh2人Η, :- Sx抑制劑包括環狀基團’貝4 一或多個相鄰基團 (諸如Rh、Rs、Rs與R·6或R_6與R?)係由含有介於5與7個 原子之間的環連接； 其中該烷基獨立地選自由以下基團組成之群：甲基、 乙基、異，基^三y基及具有以下結構中之一 團：μ<Μ-〇，Κ3; 其中該芳基獨立地選自由基團Α至基團F組成之群： 134691.doc -2- 200927102 G X1 X2
    Xi X2
    X5X4基團A; 乂基團B;x5 基團c.其中X〗-X5當存在於基團A、B及c之化合物中時，各自係 -F、-Ο-垸基k基、父 烷基 〇 、燒基 nh2 烷基 Η 烷基 N 〆 ，、烷基、 基 /N；s 彳烷基 u 〇 > 0 ^0 /S、NT烷基 Η 、 烧基 基 X L 烷基 J 烷基
    X3 X4 κγχ 基團D ; N X4基團E ;及 ,Χ3 Xs 丞囡υ ; ，〜基團E ;及 x5 基團F，其 中在基團D、E及F之化合物中，γ係選自由以下基團組 成之群· _〇、_S、·ΝΗ、_Ν·烷基及-Ν·醯基；Χ3係選自 由以下基團組成之群：_H、_CH3、_F、cf3及-0CH3; 且X4及Xs若存在，則獨立地選自由H及CH3組成之群e o 5.如明求項4之用途，其中該抑制劑為具有以下結構之化 合物：
    6. ’項5之用途’其中Rs及Re獨立地選自由以下基團 組成之群 LH、-CH3、C1、F、_0CH3、_NH2、』、' 134691.doc 200927102 烷基 /N、烷基 · > Η 燒丨基 Λ 、酿基、、醢基、0/ 烷基 S:烷基/N 、〇 (Λ > > 〇>/P /S、N，烷基 /S、NH2、 Η /S、n'炫基 Ά基 > 〇 人/烷基 0 〇 〇 ^基 、^nh2、义加及乂〇,炫基。
    0 /烷基
    如請求項1之用途，其中該抑制劑具有以下結構：
    其中 Ri係選自由以下基團組成之群
    CI '
    -4- 134691.doc 200927102
    L係選自由以下基團組成之群· _H、-CH3、_CF3、 •ch2ch3、ch2oh、 ο
    、PN、、、暑'
    ❹ 烷基 I R4係選自由·Η及-ΝΗ2組成之群· Rs及R6獨立地選自由以下基圏組成之群：_H、-CH3 Cl、F 嬝基 A 统•基 Η 酿基 -〇CH3、 -ΝΗ2、 烷基 /N、烷基 > Η 烷基 ✓•Ί /坑基 οΛο 1 /Ν、<^烷基 ,οΛο 、 ^芳基 Λ ，s>'烷基 -烷基 Η 坑基 、 缒基 入广基 统基 、〇H及 垸基 ;且 R7 為-H 〇 如請求項1之用途，其中該抑制劑係選自由克立咪0坐 (clermzole)及克立咪唑鹽組成之群。 9.如„月求項i之用途，《中該抑制劑包括該抑制劑之電子 荨排體（isostere)。 〇·如《月求項!之用途，其中該克立咪唑鹽為克立咪唑氫氣 酸鹽，且為每劑約bmg至200 mg之量。 U.如請求項1〇之用途，其中該劑量係-曰給予兩次。 1 2 ·如e青求項1夕田 用途，其中該藥劑係與至少一種選自由以 134691.doc 200927102 下/口療劑組成之群的其他治療劑組合使用：抗治療 劑、HCV NS3蛋白酶抑制齊^、HCV NS5b rna依賴性 RNA聚合酶抑制劑、噻唑啶、持續釋放噻唑啶、核苷類 似物及干擾素-α。 13·如請求項1之用途，其中該抑制劑係選自由以下各物組 成之群’克立咪唑、克立咪唑類似物及具有克立咪唑骨 架之化口物’與克立咪唑具有結構相似性之出拮抗劑、 Η1受體拮抗劑；西諾沙星(cin〇xacin)、西諾沙星類似物 及具有西❹星骨架之化合物；正腎上腺素、正腎上腺 素類似物及具有正腎上腺素骨架之化合物；格列本腺 (glybenClamide)、格列本腺類似物及具有格列本腺骨架 之化合物；螺朵林（SP—)、螺朵林類似物及具有螺 朵林骨架之化合物；托品酿峰〇picamide)、托品醯胺 類似物及具有托品酿胺骨架之化合物；該等化合物中每 一者之電子等排體，及其組合。 ❹ 14. -種抑制劑之用途，其係用於製備治療宿主肝臟纖維化 之樂劑’其中該抑制劑係選自由以下各物組成之群：克 立㈣、克立咪唾類似物、具有克立咪唾骨架之化合物 及該等化合物之電子等排體。 15. 一種組合物，其包含抑制劑。 16. 如：求項15之組合物’其中該抑制劑係選自由以下各物 =之群：克饱、克立料類似物及具有克立㈣ 骨架之化合物；與克…具有結構相似性之m拮抗 劑，受體抬抗劑；西諾沙星、西諾沙星類似物及具有 134691.doc 200927102 西諾沙星骨架之化合物；正腎上腺素、正腎上腺素類似 物及具有正腎上腺素骨架之化合物；格列本脲、格列本 脲類似物及具有格列本脲骨架之化合物；螺朵林、螺朵 林類似物及具有螺朵林骨架之化合物；托品醯胺、托品 醯胺類似物及具有托品醯胺骨架之化合物；該等化合物 中每一者之電子等排體，及其組合。 17. 如請求項15之組合物，其另外包含至少一種選自由以下 各物組成之群的其他治療劑：抗HCV治療劑、HCV NS3 © 蛋白酶抑制劑、HCV NS5B RNA依賴性RNA聚合酶抑制 劑、噻唑啶、持續釋放噻唑啶、核苷類似物及干擾素_α。 18. 如請求項15之組合物，其中該抑制劑具有以下結構： ί4 y x >-r2 R7 R1 ，
    其中R!係選自 芳基 Wn=0,l,2 . y 由以下基團組成之群 -Η、 炫基 '' n=0,1,2 及 -Η 及'^n=(U2， 炫基、-芳基、 O-H或烷基 其中R·2係選自由以下基團組成之群 其中X係選自由以下基團組成之群 V3、坡基、γΝ、炫基、Ά燒基、、乂/ 烷基 -
    其中若該抑制劑包括非環狀基團，則R4_R7中每一者係 134691.doc 200927102 獨立地選自由以下基團組成之群： Η 烷基 ' -OCH3 ' NH2 ' ，N、炫基、丄 气基 人,炫基、^、 Η 燒基 Ο Ο 〇 、烷基、 Η、-Cl、-F、_cH3 H 坑基 '醢基 醯基 nh2 人 烷基 Y烷基 5 〇 、 烷基、 OH及
    其中若該抑制劑包括環狀基團，則一或多個相鄰基團 (諸如，R4及R5、RS及&或^及^係由含有介於5與*7個 原子之間的環連接； 其中該烧基獨立地選自由以下基團組成之群：甲基、 乙基、異丙基、三氟甲基及具有以下結構中之一之某 團：卜〇，丨~〇,丨"
    其中該芳基獨立地選自由基團A至基團F組成之群：
    其中Xi-Xs當存在於基團A、B及C之化合物中時各自獨立 地選自由以下基團組成之群：-H、-烧基、-Br、-Cl、-F 烷基 坑基 (f% \/S、n，炫基 〇-烷基 、烷基 烷基 I ，N、烷基 烷基 〇.wP nh2 134691.doc 200927102
    烧基 ίέ基 Ah, 烷基
    X3 心基團E %X3 及 < 基團F，其 中在基團D、E及F之化合物中，γ係選自由以下基團組 成之群：-Ο、-S、-NH、-N-烷基及·Ν_醯基；&係選自 由以下基團組成之群：-Η、-CH3、-c卜-F、CF3及-〇CH3 ; 且X4及Xs若存在，則獨立地選自由組成之群。 〇 19. 如明求項18之組合物，其中該抑制劑為具有以下結構之 化合物：
    其中該Rs及該r6基團不為乙氧 20. Ο 如請求項19之組合物，其中1^及尺6獨立地選自由以下基 -CH3、ci、F、_〇CH3 團組成之群：-Η UI 烷基 I Π /烷基、 ，Ν、烷基 % Η 芳基 、 户、坑& 炊基 Η 、 坑基 zN， ~醯基 烷基 \ >N， Η -Νν & 一坑基 燒基 Η 丨、·νη2气基 /Ν、〆统基0々、、0 烧基 w基 νη2 、Α〇Η及 ’'Ο/ 烷基 21. 22. 如請求項15之組合物，其中該組合物為醫藥組合物。 一種醫藥組合物，其係用於治療患有黃病毒科病毒之病 毒之病毒感染的宿主，該醫藥組合物包含抑制劑。 134691.doc -9- 200927102 23. —種鑑定候選藥劑之方法，該候選藥劑係用於治療C型 肝炎病毒（HCV)感染，該方法包含： a) 使測試藥劑與包含以下各物之樣品接觸：i)結合 HCV 3'UTR負鏈核酸之HCV NS4B多肽；及ii)包含HCV 3’UTR負鏈聚核苷酸之核酸；及 b) 測定（若存在）該測試藥劑對NS4B與該HCV 3'UTR負 鏈核酸之結合的效應， 其中抑制NS4B與該HCV 3'UTR負鏈核酸之結合的藥劑為 © 治療HCV感染之候選藥劑。 134691.doc •10·
TW097135844A 2007-09-18 2008-09-18 Methods of treating a flaviviridae family viral infection, compositions for treating a flaviviridae family viral infection, and screening assays for identifying compositions for treating a flaviviridae family viral infection TW200927102A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97330907P 2007-09-18 2007-09-18
US8875908P 2008-08-14 2008-08-14
US9253708P 2008-08-28 2008-08-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW200927102A true TW200927102A (en) 2009-07-01

Family

ID=40468758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097135844A TW200927102A (en) 2007-09-18 2008-09-18 Methods of treating a flaviviridae family viral infection, compositions for treating a flaviviridae family viral infection, and screening assays for identifying compositions for treating a flaviviridae family viral infection

Country Status (8)

Country Link
US (3) US8895598B2 (zh)
EP (1) EP2203168B1 (zh)
JP (1) JP5715820B2 (zh)
CN (1) CN101903026B (zh)
AR (1) AR066165A1 (zh)
AU (1) AU2008302295B2 (zh)
TW (1) TW200927102A (zh)
WO (2) WO2009039248A2 (zh)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5715820B2 (ja) 2007-09-18 2015-05-13 スタンフォード ユニバーシティー フラビウイルス科ファミリーのウイルスへの感染を治療する方法ならびに、フラビウイルス科ファミリーのウイルスへの感染を治療するための組成物
US8940730B2 (en) 2007-09-18 2015-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions of treating a Flaviviridae family viral infection
US9149463B2 (en) 2007-09-18 2015-10-06 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University Methods and compositions of treating a Flaviviridae family viral infection
US9101628B2 (en) 2007-09-18 2015-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and composition of treating a flaviviridae family viral infection
EP2408448A4 (en) * 2009-03-18 2012-09-19 Univ Leland Stanford Junior METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING FLAVIVIRIDAE VIRUS INFECTIONS
CN102448458B (zh) 2009-03-18 2015-07-22 小利兰·斯坦福大学理事会 治疗黄病毒科病毒感染的方法和组合物
WO2010118286A2 (en) * 2009-04-09 2010-10-14 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Benzimidazole modulators of h1 receptor and/or ns4b protein activity
WO2010132810A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Concert Pharmaceuticals, Inc. Deuterium modified benzimidazoles
US20120232062A1 (en) * 2009-10-20 2012-09-13 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Azaindazoles to treat flaviviridae virus infection
US20110165037A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-07 Ismagilov Rustem F Interfaces that eliminate non-specific adsorption, and introduce specific interactions
RU2436786C1 (ru) * 2010-07-23 2011-12-20 Александр Васильевич Иващенко Замещенные индолы, противовирусный активный компонент, способ получения и применения
CN107141309A (zh) 2011-01-11 2017-09-08 桑诺维恩药品公司 杂芳基化合物及其使用方法
CA2831710A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Bayer Intellectual Property Gmbh Substituted benzimidazoles as mps-1 kinase inhibitors
EP2583680A3 (en) 2011-10-21 2013-06-12 Abbvie Inc. Mono (PSI-7977) or combination treatment of DAAs for use in treating HCV
SE1450130A1 (sv) 2011-10-21 2014-05-07 Abbvie Inc Förfaranden för att behandla hcv innefattande minst två direktverkande antivirala agenser, ribavirin men inte interferon
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
WO2013086133A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for treating viral diseases
BR112014030940B1 (pt) * 2012-06-11 2022-09-06 UCB Biopharma SRL Benzimidazóis que modulam tnf-alfa e composição farmacêutica compreendendo os mesmos
CN103585616B (zh) * 2013-08-14 2015-05-27 南京工业大学 二肽类似物的用途
PT3035926T (pt) 2013-08-19 2020-09-01 Univ California Compostos e métodos para tratar um distúrbio epiléptico
WO2015050998A2 (en) 2013-10-01 2015-04-09 The Broad Institute, Inc. Sieve valves, microfluidic circuits, microfluidic devices, kits, and methods for isolating an analyte
HRP20220822T1 (hr) 2015-02-25 2022-10-28 The Regents Of The University Of California 5ht agonisti za liječenje poremećaja epilepsije
WO2017004454A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Eiger Group International, Inc. Use of chloroquine and clemizole compounds for treatment of inflammatory and cancerous conditions
CA3013408A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Substituted indole compound derivatives as dengue viral replication inhibitors
US10653678B2 (en) 2016-04-11 2020-05-19 Genfit Methods of treatment for cholestatic and fibrotic diseases
SG10202004425XA (en) 2016-04-11 2020-06-29 Genfit Methods of treatment for cholestatic and fibrotic diseases
CA3022119A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Emory University Alkyne containing nucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto
WO2018129702A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 史仅 蚊虫叮咬瘙痒寨卡等病毒预防医疗器具
CN108096562B (zh) * 2017-12-25 2021-05-11 武汉百药联科科技有限公司 20s蛋白酶体抑制剂在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的用途
BR102017028623A2 (pt) * 2017-12-29 2019-07-16 Instituto Butantan Composição farmacêutica para o tratamento de infecção causada por vírus da família flaviviridae, e, uso da composição
CN108660253B (zh) * 2018-04-17 2022-05-31 广东省妇幼保健院（广东省妇产医院、广东省儿童医院） 一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的探针、引物、检测试剂盒及检测方法
CN109020895B (zh) * 2018-08-07 2020-04-24 枣庄学院 一种金属催化的1-苄胺基取代苯并咪唑的合成方法
HRP20240401T1 (hr) 2018-10-05 2024-06-07 Annapurna Bio Inc. Spojevi i pripravci za liječenje patoloških stanja koja su povezana s djelovanjem apj receptora
US20200323813A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Tremeau Pharmaceuticals, Inc. Treatment of viral hemorrhagic fevers with cox-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs
WO2021030268A2 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
CN115884770A (zh) * 2020-03-09 2023-03-31 南京强新生物医药有限公司 治疗冠状病毒感染的联用药物及治疗方法
CN111393372B (zh) * 2020-05-12 2022-08-26 中国药科大学 一种苯并咪唑衍生物及其制备方法和用途
WO2023225324A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for treating fatty liver and viral infections

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2689853A (en) * 1954-09-21 Certain i
US2684327A (en) * 1951-11-02 1954-07-20 United Chromium Inc Bright nickel plating
GB1045534A (en) * 1963-02-09 1966-10-12 Schering Ag New 1-benzyl-5,6-dialkoxy benzimidazoles and a process for their manufacture
DE1620449C3 (de) * 1964-07-23 1974-02-21 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Substituierte Benzimidazole und Verfahren zu ihrer Herstellung
US3428634A (en) * 1965-03-13 1969-02-18 Acraf 3-tertiary amino alkoxy-1-hydrocarbon indazoles
DE2436883C2 (de) * 1974-07-29 1985-08-22 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Benzimidazol-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel
US4269835A (en) * 1979-12-13 1981-05-26 Whittle Barry J Nasal composition for relieving nasal distress
EP0694535A1 (en) 1994-04-29 1996-01-31 Eli Lilly And Company Non-peptidyl tachykinin receptor antagonists
US5552426A (en) * 1994-04-29 1996-09-03 Eli Lilly And Company Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide
JP2001513084A (ja) * 1997-02-25 2001-08-28 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ，レプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー，デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシズ 逆転写酵素の非ヌクレオシド阻害剤としての置換ベンズイミダゾール
US6211177B1 (en) * 1998-11-24 2001-04-03 Cell Pathways, Inc. Method for treating neoplasia by exposure to substituted 2-aryl-benzimidazole derivatives
US6770666B2 (en) 1999-12-27 2004-08-03 Japan Tobacco Inc. Fused-ring compounds and use thereof as drugs
US6476062B2 (en) * 2000-03-30 2002-11-05 Schering Corporation Chemokine receptor antagonists
US6448281B1 (en) * 2000-07-06 2002-09-10 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Viral polymerase inhibitors
JP2004504356A (ja) 2000-07-20 2004-02-12 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスのプロセシングおよび複製の抑制
ATE295727T1 (de) * 2001-03-22 2005-06-15 Ucb Sa Verwendung bestimmter substituierter pyrrolidone wie z.b. piracetam bei der behandlung von viralen und anderen erkrankungen
AR035543A1 (es) * 2001-06-26 2004-06-16 Japan Tobacco Inc Agente terapeutico para la hepatitis c que comprende un compuesto de anillo condensado, compuesto de anillo condensado, composicion farmaceutica que lo comprende, compuestos de benzimidazol, tiazol y bifenilo utiles como intermediarios para producir dichos compuestos, uso del compuesto de anillo con
CA2473236A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Neurogen Corporation Melanin concentrating hormone receptor ligands: substituted 2-(4-benzyl-piperazin-1-ylmethyl)- and 2-(4-benzyl-diazepan-1-ylmethyl)-1h-benzoimidazole analogues
TW200509958A (en) * 2003-02-14 2005-03-16 Combinatorx Inc Methods and reagents for the treatment of diseases and disorders associated with increased levels of proinflammatory cytokines
EA200501570A1 (ru) * 2003-04-07 2006-06-30 Аксис Фармасьютикалз, Инк. Новые гидроксаматы как лечебные средства
WO2005012288A1 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Genelabs Technologies, Inc Bicyclic imidazol derivatives against flaviviridae
WO2005032329A2 (en) * 2003-08-22 2005-04-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for identifying anti-hcv agents
US20050192261A1 (en) * 2003-09-15 2005-09-01 Jost-Price Edward R. Methods and reagents for the treatment of immunoinflammatory disorders
US20070269420A1 (en) * 2003-11-24 2007-11-22 Chunduru Srinivas K Compounds, Compositions and Methods for Treatment and Prophylaxis of Hepatitis C Viral Infections and Associated Diseases
BRPI0508107A (pt) * 2004-02-27 2007-07-17 Hoffmann La Roche derivados de indazol e composições farmacêuticas contendo os mesmos
GB0416728D0 (en) 2004-07-27 2004-09-01 7Tm Pharma As Medicinal use of receptor ligands
BRPI0513811A (pt) * 2004-07-27 2008-07-15 Gilead Sciences Inc imidazo [4,5-d] pirimidinas, seus usos e processos de preparação
WO2006135383A2 (en) 2004-08-04 2006-12-21 Myriad Genetics, Inc. Indazoles
CA2608631C (en) * 2005-06-09 2014-07-29 Biolipox Ab Method and composition for treating inflammatory disorders
CA2651943C (en) 2006-03-02 2015-06-30 Siga Technologies, Inc. Antiviral drugs for treatment of arenavirus infection
US20090192169A1 (en) 2006-03-31 2009-07-30 Ian Egle Bicyclic Benzimidazole Compounds and Their Use as Metabotropic Glutamate Receptor Potentiators
US8008481B2 (en) 2006-03-31 2011-08-30 Ericsson Anna M Indazole compounds
US20080161324A1 (en) * 2006-09-14 2008-07-03 Johansen Lisa M Compositions and methods for treatment of viral diseases
DE102007028521A1 (de) 2007-06-21 2008-12-24 Merck Patent Gmbh Indazolamidderivate
US9101628B2 (en) * 2007-09-18 2015-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and composition of treating a flaviviridae family viral infection
JP5715820B2 (ja) 2007-09-18 2015-05-13 スタンフォード ユニバーシティー フラビウイルス科ファミリーのウイルスへの感染を治療する方法ならびに、フラビウイルス科ファミリーのウイルスへの感染を治療するための組成物

Also Published As

Publication number Publication date
AR066165A1 (es) 2009-07-29
US20150044169A1 (en) 2015-02-12
EP2203168A2 (en) 2010-07-07
WO2009039248A8 (en) 2009-05-28
US8895598B2 (en) 2014-11-25
CN101903026A (zh) 2010-12-01
WO2009039246A3 (en) 2009-06-11
AU2008302295B2 (en) 2013-11-28
WO2009039248A3 (en) 2009-09-24
AU2008302295A1 (en) 2009-03-26
CN101903026B (zh) 2013-05-08
US20100260717A1 (en) 2010-10-14
EP2203168B1 (en) 2014-07-16
JP2010539241A (ja) 2010-12-16
US20110052536A1 (en) 2011-03-03
WO2009039246A2 (en) 2009-03-26
EP2203168A4 (en) 2011-10-26
WO2009039248A2 (en) 2009-03-26
JP5715820B2 (ja) 2015-05-13
US9061010B2 (en) 2015-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW200927102A (en) Methods of treating a flaviviridae family viral infection, compositions for treating a flaviviridae family viral infection, and screening assays for identifying compositions for treating a flaviviridae family viral infection
Kaptein et al. A pan-serotype dengue virus inhibitor targeting the NS3–NS4B interaction
US9101628B2 (en) Methods and composition of treating a flaviviridae family viral infection
Lim et al. Ten years of dengue drug discovery: progress and prospects
Wagner et al. Highlights of the structure–activity relationships of benzimidazole linked pyrrolidines leading to the discovery of the hepatitis C virus NS5A inhibitor pibrentasvir (ABT-530)
US20120232062A1 (en) Azaindazoles to treat flaviviridae virus infection
Sayce et al. Targeting a host process as an antiviral approach against dengue virus
US20150152064A1 (en) Methods and compositions of treating a flaviviridae family viral infection
Jiang et al. 2-((4-Arylpiperazin-1-yl) methyl) benzonitrile derivatives as orally available inhibitors of hepatitis C virus with a novel mechanism of action
Gu et al. Identification of PTC725, an orally bioavailable small molecule that selectively targets the hepatitis C virus NS4B protein
JP6996720B2 (ja) フラビウイルス感染に対する抗ウイルス治療
US20070269420A1 (en) Compounds, Compositions and Methods for Treatment and Prophylaxis of Hepatitis C Viral Infections and Associated Diseases
US20110217265A1 (en) Screening for Inhibitors of HCV Amphipathic Helix (AH) Function
JP2012520885A (ja) フラビウイルス科ウイルス感染症を治療する方法および組成物
KR20220035322A (ko) Pi4-키나아제 억제제 및 이의 사용 방법
US10869873B2 (en) Methods and compositions for treating viral diseases
US8940730B2 (en) Methods and compositions of treating a Flaviviridae family viral infection
AU2014201019A1 (en) Methods of treating a flaviviridae family viral infection and compositions for treating a flaviviridae family viral infection
CN106588764B (zh) 丙型肝炎病毒的抑制剂
Wang et al. Phenotypic Screening to Discover Inhibitors of Dengue Virus
Bryson Novel Targets Within the Hepatitis C Virus Nonstructural Protein NS4B and Their Inhibition Using Distinct Classes of Small Molecules