TW200927099A - A novel alpha-(n-sulfonamido)acetamide compound as an inhibitor of beta amyloid peptide production - Google Patents

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200927099 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於具有藥物及生物影響（bio-affecting)特性之 (2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯 基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺、其醫藥組合物、其製備 . 方法及使用方法。該新穎化合物具有獨特的Αβ胜肽生成抑 制作用，藉此防止腦中Αβ胜肽及/或類澱粉蛋白沈積物之

•I 積聚，且適用於治療或延緩阿茲海默氏病（AD)、唐氏症候 φ 群（Down syndrome)、輕度認知障礙及其他與β-類殿粉胜肽 有關之病狀的發作。 本申請案主張2007年10月31曰申請之美國臨時申請案第 60/984,118號之權利。 【先前技術】 阿茲海默氏病（AD)為一種進行性神經退化性疾病，其係 以記憶喪失開始且進展至包括嚴重認知障礙、行為改變及 運動功能降低（Grundman，Μ.等人，jrcA TVewro/. (2004) ® 61:59-66 ; Walsh，D.Μ.等人，(2004) 44:181-193)。 其為最常見之癡呆形式且係心血管病症及癌症後死亡之第 - 三個主要原因。AD之代價巨大且包括患者與家屬之痛苦

. 及患者與照顧者之生產力損失。目前未有能有效預防AD 或逆轉臨床症狀及潛在病理生理學之治療。 對於癡呆患者之AD的確診需要在屍體剖檢後對神經炎 斑塊及神經原纖維纏結數量及定位進行組織病理學評估 (Consensus recommendations for the postmortem diagnosis 135297.doc 200927099 of Alzheimer's disease. iVewroZjz'c»/ (1997) 18: S1-2)。 在患有第21對染色體三體症（Trisomy 21)(唐氏症候群）之患 者中觀察到類似改變。斑塊主要由β-類澱粉（Αβ)胜肽組 成，該等胜肽係由類澱粉前驅蛋白（ΑΡΡ)之逐步蛋白質裂 解而形成，藉由β-位點ΑΡΡ裂解酶（BACE)以產生Ν-末端且 - 藉由γ-分泌酶以產生C-末端（Selkoe，D.J., Physiol Rev. . (2001) 81: 741-766)。γ-分泌酶為一種包括尼卡斯群 (Nicastrin)、Aph-1、ΡΕΝ-2、及早老素-l(PS-l)或早老素-〇 2(PS-2)之跨膜蛋白複合物（Wolfe, M.S.等人， (2004) 305: 1119-1123)。咸信 PS-1 及 PS-2 含有 γ-分泌酶之 催化部位。 Αβ40為所合成之Αβ的最豐富之形式（80-90%)，而Αβ42 與AD發病機理關係最為密切。詳言之，導致罕見、家族 形式AD之APP、PS-1及PS-2基因突變暗示Αβ42聚集體為主 要有毒物質（Selkoe, D.J.，i?ev., (2001) 81: 741- 766)。現有證據表明寡聚、原纖維狀及細胞内Αβ42在疾病 應 w 過程中具有重要作用（Cleary, J.P.等人，iVai iVeMrowz·. (2005) 8: 79-84)。形成Αβ42之酶（諸如γ-分泌酶）抑制劑代 ' 表治療AD之潛在疾病調節治療劑。 - γ-分泌酶除ΑΡΡ外還裂解多種I型跨膜蛋白（Pollack，S.J. 等人，Cwrr /«veW/g Drwgi1 (2005) 6: 35-47)。儘管大 多數該等裂解事件之生理意義未知，但遺傳學證據指示 Notch信號傳導需要Notch之γ-分泌酶裂解（Artavanis-Tsakonas，S.等人，(1999) 284(5415): 770-6 ; 135297.doc 200927099

Kadesch，Τ.;五;cp Ce// Λα. (2000) 260(1):卜 8)。在給藥 γ· 分泌酶抑制劑之齧齒動物中，已在胃腸（GI)遂、胸腺及脾 臟中鑑別出藥物相關毒性（Searfoss，G.H.; J〇rdan等人’ J Biol Chem. (2003) 278: 46107-46116 ; Wong，G.T.等人 ’ J Biol Chem. (2004) 279: 12876-12882 ; Milan。，J.等人’ 7bhco/ 5W. (2004) 82: 341-358)。該等毒性可能與對Notch . 信號傳導之抑制有關（Jensen，J.等人，ΛΓαί (2000) 24: 36-44) ° 〇 機理性毒性之鑑別為以γ-分泌酶抑制劑是否能達成可接 受之治療指數提出疑問。相對於Notch處理而言對Αβ形成 之選擇性抑制、藥物動力學、藥物布置及/或組織特異性 藥效學可能影響治療範圍。 有證據表明腦中Αβ含量藉由抑制γ-分泌酶而減少可能預 防 AD之發作及進展（8611<;〇6,0./>/2>^_〇/.^?^.(2001) 81: 741-766 ; Wolfe, Μ.，·/. Mei C/zew. (2001) 44: 2039-2060)。有 新近資料顯示Αβ在其他疾病中之作用，該等疾病包括輕度 ® 認知障礙（MCI)、唐氏症候群、腦類澱粉血管病變 (CAA)、路易體癡呆（dementia with Lewy bodies，DLB)、 肌萎縮性側索硬化症（ALS-D)、包涵體肌炎（IBM)及與年齡 - 相關之黃斑部變性。有利地，可能使用抑制γ-分泌酶且降 低Αβ生成之化合物來治療該等或其他Αβ相關疾病》 過量生成及/或減少清除Αβ導致CAA(Thal，D.等人，乂 iVeMropai/z. Ex/?. iVewro· (2002) 61: 282-293)。在該等患者 中，血管類澱粉沈積物導致血管壁退化及可能在老年患者 135297.doc 200927099 中造成10-15%出血性中風的動脈瘤。如在AD中，編碼Αβ 之基因的突變導致CAA的早期發作形式（稱為荷蘭型腦出 血併發類澱粉變性病），且類似於患者，表現此突變蛋白 之小鼠出現CAA。特異靶向γ-分泌酶之化合物可能減少或 預防CAA。 DLB表現為幻視、妄想及帕金森病（parkinsonism)。有趣 . 地，引起Αβ沈積物之家族性AD突變亦會導致路易體及 DLB症狀（Yokota，Ο.等人，Jcitz TVewropai/zo/(2002) G 104: 637-648)。此外，偶發性DLB患者具有類似於AD中的 Αβ沈積物（Deramecourt，V_ 等人，TVewro/ (2006) 65: 278-288)。基於此資料，Αβ很可能驅使DLB中 之路易體病變，且因此γ-分泌酶抑制劑可能減少或預防 DLB。 約25%之ALS患者具有明顯癡呆或失語症（Hamilton, R.L. 等人，Jcia iVewropai/zo/ (2004) 107: 515-522)。大 部分（約60%)該等命名為ALS-D之患者含有主要由TDP-43 蛋白組成之泛素陽性包涵體（Neumann, M.等人，《Sciewce (2006) 314: 130-133)。約30%之ALS-D患者具有導致其癡 • 呆之與Αβ —致之類澱粉斑塊（Hamilton，R.L.等人， - Neuropathol (Berl) (2004) 107: 515-522) ° 1¾ # ^ it T * 類澱粉顯像劑鑑別且潛在地可由γ-分泌酶抑制劑治療。 IBM為一種罕見、與年齡相關之骨骼肌退化性疾病。 IBM肌肉中Αβ沈積物之出現及在轉殖基因小鼠中藉由關注 肌肉之ΑΡΡ過度表現而對疾病數種態樣之重演支持了 Αβ在 135297.doc 200927099 IBM中之作用（評述於Murphy, M.P.等人，iVewroMgY (2006) 66: S65-68)。特異靶向γ-分泌酶之化合物可能減少或預防 IBM。 在與年齡相關之黃斑部變性中，Αβ被鑑別為玻璃膜疣 (drusen)(視網膜色素上皮細胞（rpe)下面之細胞外沈積物） • 之數種成份之一（Anderson, D.H.等人，·Εχρ五及以（2004) • 78: 243·256Ρ近期的一項研究顯示小鼠中Αβ與黃斑部變 性之間存在潛在聯繫（Yoshida，Τ.等人，·/ /«vew 〇 (2005) 115: 2793-2800)。已在AD患者中發現Αβ沈積及核 上内障（supranuclear cataracts)之增加（Goldstein，L.E.等 人，lawcei (2003) 361: 1258-1265)。特異靶向γ-分泌酶之 化合物可能減少或預防與年齡相關之黃斑部變性。 基於Notch信號傳導在腫瘤形成中之作用，抑制γ-分泌 酶之化合物亦可能適用作治療癌症之治療劑（Shih，Ι.-Μ.等 人，Cawcer (2007) 67: 1879-1882)。

Smith等人在2000年8月3 1曰公開之國際申請案WO W 00/50391中揭示一系列可調控類澱粉β蛋白生成之磺醯胺 化合物以作為治療多種疾病、尤其阿茲海默氏病及其他與 類澱粉沈積有關的疾病之手段。 - 1999年12月14日公開之日本專利第11343279號揭示一系 列磺醯胺衍生物，其為適用於治療自體免疫疾病之TNF_a 抑制劑。

Parker等人在2003年7月3日公開之國際申請案WO 03/053912中揭示一系列α-(Ν-磺醯胺基）乙醯胺衍生物以作 135297.doc -10- 200927099 為適用於治療阿茲海默氏病及其他與β·類澱粉胜肽有關之 病狀的β-類澱粉抑制劑。

Parker等人未揭示或描述屬於WO 03/053912中化學式之 定義範圍内的本發明之新穎化合物。令人驚奇地，已發現 (2尺)-2-[[(4-氣苯基）續醯基][[2-氟-4-(1,2,4-"惡二唑-3-基）笨 基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺具有使之適用於治療阿茲 海默氏病及其他與β-類澱粉胜肽有關之病狀的獨特屬性。 【發明内容】 本發明係關於具有式I之（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2- 氟-4-(1’2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5 5 5三氟戊醯 胺、其醫藥調配物及其在抑制遭受或易患阿茲海默氏病 (AD)或其他與β_類澱粉胜肽有關之病症的患者^^生成中之 用途。

在另一實施例中’本發明提供-種醫藥組合物，其包含 治療有效量之叫2_[[⑷氣苯基)續酿基][[2_ I】2 4 =二唾-3-基)苯基]曱基]胺基]_5,5,5_三氟戊醯胺以及醫藥 學上可接受之佐劑、载劑或稀釋劑。 在又一實施例中，本發明提供-種治療、減輕或延緩與 135297.doc -11 · 200927099 β-類殿粉胜肽有關之病症、尤其阿茲海默氏病、腦類殿粉 血管病變、輕度認知障礙及唐氏症候群發作之方法，該方 法包含與習知佐劑、載劑或稀釋劑一起投與治療有效量之 (2R)-2-[[(4-氣苯基）續醯基][[2-氟-4-(1，2,4-。惡二峻-3-基）苯 基]甲基]胺基]-5，5,5-三氟戊醯胺或其溶劑合物或水合物。 • 在另一態樣中，本發明提供一種製備（2R)-2-[[(4_氣苯 基）項醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唾-3-基）苯基]曱基]胺基]_ 5，5,5 -二氟戊醯胺之方法，其包含在惰性有機溶劑中在 ❹ 鹼、較佳諸如碳酸鉋之無機鹼存在下使（R)-2-(4-氣苯基磺 酿胺基）-5,5,5-三氟戊酿胺與3_(4_(溴甲基）_3_氟苯基）_ 1，2,4-噁二唑反應之步驟。 在又一態樣中，本發明提供一種製備（2r)_2-[[(4-氣苯 基）磺醯基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基 5,5,5_三氟戊酿胺之方法，其包含以下步驟： (a) 使（R)-2-(4-氣-Ν-(4-氰基-2-氟节基）苯基磺酿胺基）_ 5,5,5-三氟戊醢胺與胲反應，及 〇 (b) 在惰性有機溶劑中在酸催化劑存在下用原曱酸三乙 S旨處理所得（R)-2-(4-氣-N-(2-氟-4_(N’_羥基甲脒基） 苄基）苯基磺醯胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺。 - 當本發明之化合物具有不對稱碳原子時，本發明包括式 I化合物之外消旋體以及個別對映異構體形式及如本文所 述之對掌性及外消旋中間體。諸如（R)或之單一名稱的 使用意欲主要包括一種立體異構體。可根據已知方法，例 如分步結晶法、吸附層析法或其他合適分離方法，將異構 135297.doc -12. 200927099 體之物刀離為個別異構體。可在引入合適成鹽基團之 '、吊用方式將所得外消旋體分離為對映體，例如，藉由 以光學活性成鹽劑形成非對映異構體鹽之混合物，將混合 物刀離為非對映異構體鹽且將經分離鹽轉化為游離化合 物亦可藉由分顧法經由對掌性高壓液相層析管柱來分離 ' 對映異構體形式。 . /本發明之方法中，術語"治療有效量"意収以顯示有 ⑥義之患者效益’亦即治癒與P-類殿粉胜肽有關之病狀的 〇 彳法之每-活性成份的總量。當應用於單獨投與之個別活 性成份時，該術語係指該單獨成份。當應用於組合時，該 術⑺係^產生治療效應之活性成份的組合量，而不論為組 合、連續或為同時投與。如本文及申請專利範圍中所用之 術語"治療"意謂預防、延緩、抑制或改善與卜類澱粉胜肽 有關之疾病。 在本發明之又一實施例中，式J化合物可與用於治療/預 ❹ 防/抑制或改善式I化合物對其有狀疾病或絲的其他藥 物組合使用。該等其他藥物可以為此目的所常用之途徑及 4與本發明之化合物同時或相繼投與。當式此合物與— 或多種其他藥物同時使用時，除式I化合物外還含有該等 _之醫藥組合物為較㈣。因A，本發明之醫藥組：物 包括彼等除式I化合物外亦含有-或多種其他活性成份之 組合物。可與（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟_4(124_ 口惡二唾-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5_三氟戊酿胺組合（分開 投與或以同一醫藥組合物投與）以治療阿茲海默氏病之其 135297.doc 200927099 他活性成份之實例包括（但不限於）：為膽鹼酯酶抑制劑之 藥物種類，例如多奈略齊（donepezil，Aricept®)、雷斯替 明（rivastigmine，Exelon®)、加蘭他敏（galantamine， Reminyl®，現在的Razadyne®);為NMDA拮抗劑之諸如美 金剛胺（memantine，Namenda®)及PDE4抑制劑之諸如西洛 ' 司特（cilomilast，Ariflo®)之其他藥物；NSAID種類，諸如 R-氟比洛芬（flurbiprofen，Flurizan®);降膽固醇士他汀藥 物，諸如普伐他汀（pravastatin)、斯伐他汀（simvastatin)及 G 阿托伐他汀（atorvastatin);抗類澱粉及抗Αβ免疫療法；抑 制Αβ聚集之化合物，諸如鯊肌醇（scylloinositol)及氣蛾經 喹（clioquinol);抑制或改變Αβ生成或加工之其他化合物， 諸如γ-分泌酶抑制劑、β-分泌酶抑制劑、γ-分泌酶調節 劑、Αβ調節劑及GSK-3抑制劑；調節Αβ轉換之化合物，諸 如ΡΑΙ-1抑制劑；調節τ磷酸化之化合物，諸如GSK-3及 CDK-5抑制劑；PPARy促效劑，諸如羅格列酮（rosiglitazone); 調節τ或磷光體-τ轉換或低聚合之化合物，諸如HSP90抑制 ® 劑、HDAC抑制劑及抗τ免疫療法；及穩定或與微管結合之 化合物，諸如紫杉炫> (taxane)衍生物及埃坡黴素 (epothilone)衍生物；及調節線粒體功能之化合物，諸如地 • 美伴（Dimebon)。 在癌症之治療中，本發明之化合物可與已知抗癌劑或治 療一起使用。該等藥劑及治療包括細胞毒性/細胞生長抑 制劑、雄激素受體調節劑、雌激素受體調節劑、類視色素 受體調節劑、異戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑、血管生成抑 135297.doc •14- 200927099 制劑、干擾細胞週期檢查點之藥劑及放射療法。此外，本 發明之化合物可能適用於治療諸如狼瘡之免疫性病症。 當與本發明之化合物組合應用時，以上治療劑（例如）可 以（適 ^時）《醫師桌上手冊（physician，s Desk Reference(PDR))》 中所指示或另外一般熟習此項技術者所確定之彼等量使 用。 然而’應瞭解實際上投與之化合物的量由醫師根據相關 情況確定，該等相關情況包括待治療之病狀、待投與之化 合物選擇、所選投藥途徑、個體患者之年齡、體重及反 應，及患者症狀之嚴重性。 一般反應流程 可以熟習有機合成之技術者所熟知的許多不同方式製備 本發明之化合物。式〗化合物可藉由以下反應流程中所 述之方法製備。所述程序之合理變化以及對熟習此項技術 者顯而易見之合成方法意欲屬於本發明之範疇。 反應流程1

❹ 在反應流程1中所示之一種製備方法中，以大體上對映 異構純形式使用之起始式π之（α-胺基）乙醯胺可藉由熟知 文獻程序製備，諸如使用反應流程3中所述將三氟丁搭轉 135297.doc -15- 200927099

化為式II之（α-胺基）乙醯胺之不對稱斯特雷克爾合成法 (Strecker synthesis method)，或者由（R)-5,5,5-三氟正绳胺 酸（參見 I. Ojima，J. Org· Chem. (1989) 54: 4511-4522)及反 應流程4中所述之方法、接著進行醢胺製備之一般程序 (R. C. Larock" Comprehensive Organic Transformations, VCH * Publishers, New York，1989，第 972-976 頁）而製備。將式 II 之（α-胺基）乙醯胺用合適鹼處理且在諸如CH2C12之合適非 質子性溶劑中在約室溫下用對氣磺醯氯磺醯化以得到式III Ο 之（α-磺醯胺基）乙醯胺。合適鹼包括三乙胺、二異丙基 胺、吡啶及其類似物。 如下將式III之化合物轉化為式I之磺醯胺：在鹼存在 下、在合適非質子性溶劑中、在加熱或不加熱之情況下使 式III之（α-磺醯胺基）乙醯胺與式IV之氟苄基噁二唑烷基化 劑反應。式IV之氟苄基噁二唑可易於藉由此項技術中熟知 之方法（其中X為離去基）及藉由反應流程6中所述之方法製 備。用於此烷基化作用之合適鹼包括諸如碳酸鉀及碳酸铯 ® 之無機鹼。較佳溶劑包括DMF及乙腈。反應之溫度範圍通 常為 20°C 至 l〇〇°C。 反應流程2

在反應流程2所示之另一種製備方法中，如下製備式I之 135297.doc -16- 200927099

1,2,4-噁二唑化合物：在鹼存在下在合適溶劑中用式VI之 2-氰基-4-氟苄基衍生物（其中X為離去基）烷基化式III之化 合物以產生式VII之腈。隨後由式VII之腈化合物使用熟習 此項技術者熟知之方法製備所要之式I化合物（參考：Joule， 專 k ·> Heterocyclic Chemistry，第 3 版，Chapman & Hall，London (1995) 452-456及其中所引用之參考文獻）。 舉例而言，式VII之腈與胲在諸如甲醇或乙醇之醇溶劑 中、在高達回流之溫度下反應提供中間體醯胺肟，之後將 該中間體在諸如三氟乙酸或醚合三氟化硼之酸來源存在 下、在諸如CH2C12、乙腈、四氫呋喃及其類似物之惰性有 機溶劑中、用原甲酸酯（諸如原甲酸三乙酯或原曱酸三曱 酯）處理以提供式I之1,2,4-噁二唑。 反應流程3

反應流程3描述式II之（α-胺基）乙醯胺的製備：以市售三 135297.doc 17 200927099 氟丁醛及（R)-a-曱基苄胺開始，在斯特雷克爾條件下，以 乙酸及諸如氰化鈉、氰化鉀或氰化三甲基矽烷之氰化物來 源，在諸如甲醇之合適溶劑中，以得到呈非對映異構體混 合物之式VIII胺基腈。起始三氟丁醛亦可藉由氧化三氟丁 醇而製備。式VIII之猜如下水解為相應式lx之酿胺：以硫 酸及中和反應’之後酸化且以合適溶劑（諸如甲醇、異丙 • 醇、乙酸乙酯、曱基第三丁基醚或其混合物）再結晶，以 得到呈>99%非對映異構過量的式X之醯胺。隨後可在諸如 © 氫氧化鈀或鈀/碳之合適催化劑存在下、藉由氫化作用移 除苄基以得到式II之胺基醯胺，可用對氣磺醯氣將式„之 胺基醯胺磺醯化得到式III之磺醯胺。 反應流程4

XIII XIV H

在另一製備方法中，如反應流程4中所示，可使用酶促 過程、由5,5,5-三氟-2-側氧基戊酸起始、立體選擇性地產 生式Π之（a-胺基）乙醯胺。式XIV之（R)-5,5,5-三氟正纈胺 酸可由式XIII之化合物、使用市售（R)-胺基轉移酶、藉由 熟習此項技術者熟知之方法、以大體上對映異構純形式製 備。在替代方法中，該酶促過程可使用市售（R)-胺基酸脫 氫酶進行。使用以下所述方法及熟習此項技術者熟知之方 法執行酶促過程。式XIV之（R)-5,5,5-三氟正纈胺酸至式π 135297.doc • 18- 200927099 之化合物的轉化可使用此項技術中熟知之醯胺製備一般程 序進行。 反應流程5

1)NBS/AIBN

2)(Et0)2P(0)H

Via

CN 如反應流程5中所示，可藉由在諸如二氣甲烷、二氣乙 烷或四氣化碳之合適溶劑中、使用諸如AIBN之引發劑、 用N-溴代丁二醯亞胺溴化市售之2-氟-4-氰基甲苯來製備式 Via之苄基溴。溴化反應以高產量進行且若需要，則可易 於藉由熟習此項技術者熟知之方法將式Via化合物轉化為 式VI化合物（其中X為離去基）。 反應流程6

作為在以上反應流程2中所述獲得式I之磺醯胺噁二唑的 線型工序中使用式VI化合物之替代，反應流程6顯示用於 反應流程1中所描述之彙聚式路線的式以化合物之製備。 在室溫下、在醇溶劑中、用胲處理市售2_氟_4_氰基甲笨得 135297.doc 19- 200927099 到式χι之粗醯胺肟，其可直接用於隨後反應。藉由用醚合 二I化蝴及原甲酸三乙酿處理來環化式XI之醯胺厢得到式 XII之噁二唑’以兩步計產率超過9〇g/q。作為使用三氟化蝴 之替代’亦可藉由使用三氟乙酸作為酸來源而乾淨利索地 完成環化。在諸如二氣甲烷、二氯乙烷或四氣化碳之合適 溶劑中、使用諸如AIBN之引發劑、用N-溴代丁二醯亞胺 溴化得到式IVa之單溴代噁二唑化合物。若希望避免一漠 化物與二溴化物之可能混合物，則可將式χι化合物之甲苯 曱酿基官能基用N-溴代丁二醯亞胺及AIBN有意過溴化以 得到相應的二溴化物’隨後可由亞磷酸二乙酯還原該二溴 化物以得到式Via之一溴化物，產率超過90%。可在不分 離二溴化物之情況下以一鍋完成二溴化作用及還原，總產 率超過90%。或者’式iVa化合物亦可如下製備：以式χπ 化合物、用過量溴酸鈉及亞硫酸氫鈉、在合適的兩相溶劑 系統（諸如乙酸乙酯/水、二氣甲烷/水、乙酸丁酯/水、三 氟甲苯/水及其類似物）中以得到一溴化物中間鱧與二溴化 物中間體之混合物，用磷酸二乙酯/二異丙基胺就地還原 該混合物以得到式IVa之一溴化物》若需要’則可易於藉 由熟習此項技術者熟知之方法將式IVa化合物轉化為式Ιν 化合物（其中X為離去基）„ 在另一實施例中’本發明包括包含式〗化合物以及醫藥 佐劑、載劑或稀釋劑之醫藥組合物。 在又一實施例中’本發明係關於一種治療有此需要之哺 乳動物對β-類澱粉胜肽之抑制有反應之病症的方法，其包 135297.doc -20· 200927099 含向該哺乳動物投與治療有效量之式！化合物或其溶劑合 物或水合物。 在又一實施例中，本發明係關於一種治療、減輕或延緩 有此需要之患者阿茲海默氏病、腦類澱粉血管病變、系統 性類殿粉變性、荷蘭型遺傳性腦出血併發類澱粉變性病、 多發梗塞性癡呆、輕度認知障礙及唐氏症候群發作之方 法’其包含向該患者投與治療有效量之式ί化合物或其溶 劑合物或水合物。 對於治療用途而言，式I之藥理學活性化合物通常以醫 藥組合物形式投與，該醫藥組合物包含使用標準及習知技 術與固體或液體醫藥學上可接受之載劑及視情況醫藥學上 可接受之佐劑及賦形劑結合的作為主要活性成份之至少一 種該化合物。 醫藥組合物包括用於口服、非經腸（包括皮下、肌肉 内、皮内及靜脈内）、經皮、舌下、支氣管或經鼻投藥之 合適劑型。因此，若使用固幾載劑，則可將製劑壓片、以 粉末或小球形式置於硬明膠膠囊中或可呈喉錠或口含旋形 式。固體載劑可含有習知之賦形劑，諸如黏合劑、填充 劑、鍵劑湖滑劑、崩解劑、濕满劑及其類似物。若需要， 則可藉由習知方法薄膜塗佈錠劑。口服製劑包括由明膠製 成之配合插入式（push-fit)膠囊以及由明膠及諸如甘油或山 梨糖醇之塗層製成的定標（scaled)軟膠囊。配合插入膠囊 可含有與填充劑或諸如乳糖或澱粉之黏合劑、諸如滑石或 硬脂酸鎂之潤滑劑及視情況之穩定劑混合的活性成份。在 135297.doc 21 200927099 軟膠囊中，活性化合物可在有或無穩定劑存在下溶解或懸 浮於合適液體，諸如脂肪油、液體或液態聚乙二醇。若使 用液體載劑’則製劑可呈糖漿、乳液、軟明膠膠囊、注射 用無函媒劑、水性或非水性液體懸浮液形式，或可為在使 用之前用水或其他合適媒劑復水之乾產品。液體藥劑可含 有習知添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、濕潤劑、非水性媒 劑（包括可食用油）、防腐劑以及調味劑及/或著色劑。對於 非經腸投藥而言，儘管可使用生理食鹽水溶液、葡萄糖溶 液及其類似物，但媒劑通常至少大部分包含無菌水。亦可 使用可注射懸浮液，在此情況下可使用習知懸浮劑。亦可 將習知防腐劑、緩衝劑及其類似物添加至非經腸劑型中。 對於局部或經鼻投藥而言，在調配物中使用適於待滲透之 特定障壁之滲透劑或滲透藥劑。一般在此項技術中已知該 等滲透劑。醫藥組合物係藉由適於所要製劑之習知方法而 製備，該製劑含有適當量之活性成份，即本發明之式^匕 合物。參元’例如，Remhtgtonls Pharmaceuticai ㈣啊， Mack Publishing Company，East〇n，PA，第 17版，1985。 達成治療效應之式〗化合物的劑量不僅視患者之年齡、 體重及性別以及投藥模式等因素而^，而且視所要A爲抑制 程度及式I化合物對特定相關病症或疾病之效能而定。亦 涵蓋式I化合物之治療及劑量可以單位劑型投與且該單位 劑型將由熟習此項技術者作相應調整以反映相對的活性水 平。關於待使用之特定劑量（及每日投與之次數）的決定係 在醫巾之判斷範圍内’且可藉由針對本發明之特定情況滴 135297.doc -22- 200927099 定劑量以產生所要治療效應而改變。

當非經腸投與時，對於遭受或可能遭受如本文所述與Αβ 胜肽生成相關之任何病狀的哺乳動物（包括人）而言，式地 合物或其醫藥組合物之合適劑量、通常日劑量為約〇 〇ι 叫/kg至約丨0 mg/kg且較佳為約〇」至2。對於口服投 ’ 藥而言，劑量可在每公斤體重約0.01至約20 mg且較佳(M . 至10 "^之範圍内。活性成份較佳以相等劑量每日投與1至 4次。然而’通常投與小劑量，且將劑量逐漸增加直至確 〇 冑對於受治療宿主之最佳劑量。根據良好臨床實踐，較佳 以產生有效的抗類澱粉效應而不導致任何有害或不良副作 用之濃度水平投與本化合物。然而，應瞭解實際上投與之 化合物的量由醫師根據相關情況確定，該等相關情況包括 待治療之病狀、待投與之化合物的選擇、所選投藥途徑、 個體患者之年齡、體重及反應，及患者症狀之嚴重性。 生物資料 PXR轉活化 〇 < 孕烷X受體（Pregnane X receptor，PXR)為主要負責誘導 細胞色素P450(CYP)3A4之核激素受體，該細胞色素 P450(CYP)3A4在代謝許多臨床處方藥物中具有重要作 用。熟知CYP3A4之誘導可藉由增加共投與之CYP3a4受質 之代謝清除而導致藥物與藥物相互作用（Bertilsson，G.等 人 ’ Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1998) 95: 12208-12213 ; Lehmann, J.M.等人，J· Clin. Invest. (1998) 102: 1016-1023)或可因自體誘導（autoinduction)而導致藥物暴露損 135297.doc -23- 200927099 失。表徵發現或開發藥物候選者之誘導潛能已成為整個製 藥工業中之重要篩選手段。使用PXR轉活化檢定來評定 CYP3A4之誘導潛能，且使用HepG2細胞之細胞毒性檢定 來監控歸因於細胞毒性之檢定干擾。 所用細胞培養基為 DMEM。Lipofectamine 2000、PBS、 • 胰蛋白酶-EDTA(0.25%)及青黴素-鏈黴素係購自 • GIBCO/Invitrogen(Carlsbad，CA)。熱滅活胎牛血清（FBS) 係購自Sigma(St. Louis，MO)。木炭/葡聚糖處理之胎牛血 Ο 清（FBS)係購自 Hyclone(Logan，UT)。HepG2 細胞係獲自 ATCC(Manassas, VA)。人類PXR-pcDNA3及含有 CYP3A4啟 動子之螢光素酶報告體CYP3A-Luc產於Bristol-Myers Squibb。黑色標準 384孑匕板係構自 BD Biosciences (Lexington, KY)。螢光素酶受質（Steady-Glo)係賭自 Promega(Madison， WI)。對照化合物利福平（rifampicin)係購自Sigma(St. Louis, MO)。 在T175燒瓶中使用含有10% FBS之DMEM進行HepG2細 e 胞之培養。轉染混合物含有1 pg/mL PXR-PCDNA3質體 DNA、20 pg/mL Cyp3A-Luc 質體DNA、90 pL/mL Lipofectamine 2000 • 及無血清培養基。在室溫下培養20分鐘之後，將轉染混合 • 物（每燒瓶1 mL)施加於新鮮培養基（每燒瓶20 mL)中之細 胞，且在37°C(5% C02)下培養燒瓶隔夜。 用PBS洗滌每一燒瓶中之細胞且添加4 mL肤蛋白酶-EDTA(0.25%)且在室溫下培養一分鐘。隨後吸出胰蛋白酶 且在室溫下再培養燒瓶5分鐘。隨後用力敲打燒瓶以散開 135297.doc -24- 200927099 細胞聚集體。添加l〇 mL含有5%木炭/葡聚糖處理之FBS的 DMEM之後，將全部混合物轉移至錐形管。經由1 mL吸管 尖吸取而進一步解聚懸浮液中之細胞群。隨後將細胞計數 且稀釋於培養基中至3.OxlO5個細胞/毫升。將50 μί細胞混 合物添加至含有0.25 pL溶解於100% DMSO中之測試化合 物的黑色標準384孔板之每一孔。在37°C(5% C02)下培養 . 板隔夜，之後向每一孔添加25 μΐ螢光素酶受質（Steady-

Glo, Promega)。15 分鐘之後，在 Viewlux(Perkin Elmer)板 © 閱讀器上對板進行讀數。 將一種熟知之PXR促效劑利福平（1 〇 μΜ)包括於每一板 中作為内部標準及陽性對照。隨後將數據表示成百分比活 化（％Act)，其中總信號為1 〇 μΜ利福平之信號且空白信號 為DMSO媒劑之信號。 %Act 化合物信號-空白信號 總信號-空白信號 xlOO% 在10種濃度（50 μΜ-2.5 nM，1:3連續稀釋）下測試化合 物，且使用XL-Fit(IDBS，Inc.)進行曲線擬合。報告出現 2〇%及60%活化之化合物濃度（分別為EC2GA及EC6GA)。 人類孕烷X受體主要負責誘導CYP3A4以及CYP2B6、 CYP2C8/9、諸如UGT之第2階段酶及諸如P-gp、MRP2及 OATP2之數種轉運體。以上測試證明在hPXR轉活化檢定 中（2R)-2-[[(4-氣笨基）磺醯基][[2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基） 苯基]曱基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺具有6.9 μΜ之EC2GA(在 135297.doc -25- 200927099 10 μΜ下20%之利福平反應）及大於16.7 μΜ之EC6QA(在10 μΜ下60°/。之利福平反應）。該等結果表明（2R)-2-[[(4-氣苯 基）磺醯基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5 -三氟i戊醯胺可能具有經由活化hPXR而成為人類 CYP3A4之誘導劑的潛能。

Fa2N-4細胞中細胞色素P450之誘導 - 使用Fa2N-4細胞株活體外評估（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯 基][[2-氟-4-( 1,2,4-噁二唑-3-基）苯基]曱基]胺基]-5,5,5-三 Ο 氟戊醯胺誘導CYP3A4 mRNA之能力。Fa2N-4細胞為使用 猴病毒40(SV40)T抗原作為永生化基因產生，同時保留數 種CYP同功異型物（isoform)(包括CYP3 A4)之基礎表現及可 誘導性之永生化人類肝細胞株。Fa2N-4細胞及MFE Support Media F 係由 XenoTech，LLC(Lenexa，Kansas)提 供。 將Fa2N-4細胞以0.67x106個細胞/孔之接種密度提供於12 孔、膠原蛋白塗佈之板上。在接收細胞後，改變培養基且 ❹ 使細胞維持於加濕、供應C02之恆溫箱中隔夜。在此適應 期之後，在光學顯微鏡下檢測細胞且確定細胞形態是否正 常及是否適於使用。在治療時期中，每日目測檢查細胞； • 根據需要記錄細胞形態、長滿（confluency)及歸因於測試 物品之毒性徵兆。用4種濃度（最終培養中〇.5、2、8及20 μΜ)之（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]·5,5,5-三氟戊醯胺及溶劑媒劑對照 (0·1% DMSO)進行三重覆處理細胞培養物。使用利福平（1〇 135297.doc -26- 200927099 μΜ)( —種原型（prototypicai)CYP3A4誘導劑）作為陽性對 照。將Fa2N-4細胞暴露於測試物品總計3日。每日將培養 基用含有測試物品之新鮮培養基置換。暴露總計約72小時 之後，吸出培養基且將細胞用温熱的磷酸鹽緩衝生理食鹽 水溶液洗務一次’之後添加細胞溶解緩衝液（Qiagen， Valencia, CA) 〇 在Fa2N-4永生化人類肝細胞中檢測（2R)-2-[[(4-氣苯基） 磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-© 5,5,5-三氟戊醯胺誘導CYP3A4 mRNA表現之能力。用利福

平（10 μΜ)處理Fa2N-4肝細胞3日引起細胞CYP3A4 mRNA 表現顯著（12倍）增加’指示細胞功能正常。用（2尺)_2-[[(4-氯苯基）績醯基][[2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺 基]-5,5,5-三氟戊酿胺培養肝細胞3曰導致CYP3A4 mRNA表 現濃度依賴性增加’在所測試之最高濃度（2〇 μΜ)下達到 超過媒劑對照組2.6倍。此誘導量值等於利福平所引起之 誘導反應的22%，表明（2R)-2-[[(4·氣苯基）磺醯基][[2_氟_ β 4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5_三氟戊酿胺在 大於20 μΜ之濃度下可適度誘導<：γρ3Α4。在較低滚度之 (2R)-2-[[(4-氣苯基）續醯基][[2-氟-‘（up惡二„坐·3_基）苯 基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醢胺（$8.0 μΜ)下觀察到相對最 小之CYP3A4誘導（幺2-0倍）。 肝微粒艎中之代謝穩定性 小鼠、大鼠、犬、人類及獼猴肝微粒體係獲自BD Gentest(Woburn，ΜΑ)。各批數量為13隻（小鼠）、8隹 135297.doc -27- 200927099 鼠）、8隻（犬）、19人及26人（人類）及3隻（獼猴）。在3組條件 下研究肝微粒體中（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟_4_ (1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5，5,5-三氟戊醯胺之 氧化代謝。用於人類及犬之培養混合物（總體積3 mL，有 機溶劑含量0.3%)含有（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2·氟_4_ • Ο,2,4-0惡二0坐·3_基）苯基]甲基]胺基]-5,5，5-三氟戊酿胺（1 μΜ)、微粒體蛋白（1 mg/mL)、NADPH(1 mM)、Tris氣化物 緩衝液（100 mM，pH 7.4)及氣化鎂（3.3 mM)。藉由添加 〇 NADPH起始反應（進行三重覆），之後在37°C下培養50分 鐘。在0、5、10、20、30、40及50分鐘時取等分試樣（〇 25 mL)且藉由添加3倍體積乙腈中止反應。用於獼猴及大鼠之 培養混合物（總體積3 mL，有機溶劑含量0.3%)含有（2R)-2-[[(4-氣苯基）確醯基][[2-氟-4-( 1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醢胺（1 μΜ)、微粒體蛋白（〇.1 mg/mL)、NADPH(0.1 mM)、Tris 氣化物緩衝液（1〇〇 mM， pH7.4)及氣化鎂（3.3mM)。藉由添加NADPH起始反應（進 W 行三重覆），之後在37°C下培養50分鐘。在0、5、10、 20、30、40及50分鐘時取等分試樣（0.25 mL)且藉由添加3 • 倍體積乙腈中止反應。用於小鼠及獼猴之培養混合物（總 . 體積3 mL，有機溶劑含量0.3%)含有（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺 醯基Π[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺（1 μΜ)、微粒體蛋白（0.1 mg/mL)、NADPH(l 〇11^)、1^3氣化物緩衝液（10〇111]^，？117.4)及氯化鎂（3_3 mM)。藉由添加NADPH起始反應（進行二重覆），之後在 135297.doc 28 · 200927099 37 °C下培養40分鐘。在〇、5、10、15、20、30及40分鐘時 取等分試樣（0.25 mL)且藉由添加3倍體積乙腈中止反應。 對於所有研究而言，藉由LC/MS方法立刻分析樣品。在每 一時間點由（2R)-2-[[(4-氯苯基）磺酿基][[2-氟-4-(l，2,4-噁 二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺之峰面積比 * 計算母體消失之速率。 由肝微粒體數據，使用 Houston JB.，P/zarwaeo/ 1994;47:1469-1479 ; Iwatsubo 等人，PAarwaco/ 以以 ❹ （1 997) 73 :147-1 7 1 ;及 Obach 等人，·/ (1997) 283:46-58肀所述之方法，估計各物種中（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2·氟-4-(1，2,4·噁二唑-3-基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺之肝内在清除率（丨1^1>丨113沁 clearance)(CLh，int，mL/min/kg) 〇 在各種物種之NADPH-強化肝微粒體存在下測定（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺之活體外代謝速率。本發明之 ^ 化合物（211)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑- 3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺（1 μΜ)分別在小 ' 鼠、大鼠、犬、獼猴及人類微粒體存在下以每毫克蛋白 • 690、630、40、495及 32 pmol/min之速率代謝。當將（2r)_ 2- [[(4-氣苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1,2,4-噁二嗤_3_基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺消耗之速率度量為活體内清除 率時，（21〇-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑- 3- 基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺在小鼠、大鼠、 135297.doc -29- 200927099 犬、獼猴及人類中之預測活體内（血清）清除率值分別為約 87、S2、14、39及8 mL/min/kg。該等資料表明預期（2r)_ 2-[[(4-氯苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4·噁二唑_3•基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氣戊酿胺在人類中為低清除率化合物。 活艘外藥理學 早老素結合檢定 使用先前針對[3H] (2R，3S)-2-異丁基_N1_((S)_2·側氧基_ 1-(3-苯氧基苄基）氮雜環庚烷_3_基）_3-丙基丁二醯胺所述 之方法（RE987，化合物.A [Seiffert D等人，化咖丨如] and-2 are molecular targets for γ-secretase inhibitors. J. CA請.（2000) 275(44): 34086-34091])，進行以[3H] (R)-4-((N-(l-胺基_4_甲基側氧基戊_2_基）4氣苯基磺醯 胺基）甲基）-N-(2-甲氧基乙基）苯甲醯胺之放射性配體置換 檢定。執行幾次實驗以確認[3H] (R)_4_((N(1胺基_4_甲 基-1-側氧基戊-2-基）-4-氣苯基磺醯胺基）甲基甲氧 基乙基）苯甲醯胺與γ_分泌酶結合。首先，[3h] (r) 4 ((N- (1-胺基-4-甲基侧氧基戊_2_基）_4_氯苯基磺醯胺基）繫 基）Ν (2-甲氧基乙基）苯罗醯胺與來自野生型及 基因剔除纖維母細胞之膜的特異性結合顯示[3h] (r)_4-((Ν·(1 -胺基_4-甲基小側氧基戊_2基）冰氣苯基磺醯胺基） 甲基）N-(2-甲氧基乙基）苯甲醯胺與來自野生型纖維母細 胞而非基因剔除纖維母細胞之膜特異性結合且結構不同之 γ刀泌酶抑制劑競爭特異信號。其次，用幾種丫_分泌酶抑 制齊j研究[Η]⑻_4-((ν·(ι_胺基ymu氧基戊_2_基）- 135297.doc 200927099 4-氣苯基磺醯胺基）甲基）_N_(2_甲氧基乙基）苯甲醯胺結合 之藥理學。該等結果顯示如使用先前放射性配體結合檢定 與對培養細胞中Αβ形成之抑制所量測，[3H] (R)-4-((N-(l-胺基-4-甲基_1_側氧基戊_2_基）_4-氣苯基磺醯胺基）甲基 N-(2-甲氧基乙基）苯甲醯胺與THP-1膜結合之置換與分泌 酶效能存在良好相關性。 使ΤΗΡ-1細胞在含有L-楚胺醯胺（Life Technologies Inc.) 及10 μΜ β·疏基乙醇之rpmI 1640中之旋轉培養（Spinner culture)中生長為5x l〇5個細胞/毫升之細胞密度。藉由離心 收集細胞，且使含有2 X 108個細胞之小球速凍於乾冰/乙醇 中且儲存於-70°C直至使用。檢定當日，在4。〇下將細胞以 母10 mL均質化緩衝液2 X 1 〇8個細胞解凍，該緩衝液由以下 組成.含有104 μΜ 4-(2-胺基乙基）苯績醯氟鹽酸鹽、8〇 ηΜ抑肽酶（aprotinin)、2 μΜ 亮抑蛋白酶肽（leupeptin)、4 μΜ貝他定（bestatin)、1.5 μΜ 胃酶抑素 A(pepstatin A)及 1.4 μΜ E-64之蛋白酶抑制劑混合液（〇」％之蛋白酶抑制劑混合

液 Ρ8340 ’ Sigma-Aldrich，St. Louis，ΜΟ)之 50 mM HEPES(PH 7.0)。將該等細胞使用 p〇lytr〇n(Brinkman， Westbury，NY)以 18,000 rpm均質化 15秒，接著在 s〇rval RC5B離心機中在4°C以18,000 rpm離心15分鐘。將所得小 球在4 C再懸浮於緩衝液中以得到5 mg/mL之總蛋白濃度。 為用於結合檢定，將該細胞勻漿於由5〇 mM HEpES pH 7.0、0.1% CHAPSO組成之檢定緩衝液中稀釋至3〇〇 gg/mL 之濃度。於聚丙稀96孔板（Costar，Cambridge, ΜΑ)中藉由 135297.doc 31 200927099 添加200 μί細胞勻漿至50 pL含有0.75 nM放射性配體（[3H] (R)-4-((N-(l -胺基-4-曱基-1·側氧基戊-2_基）_4_氣苯基磺醯 胺基）甲基）-N-(2-甲氧基乙基）苯曱醯胺，11〇 ci/mm〇i)及 各種濃度之未標記化合物之檢定緩衝液起始檢定，且在 3 7°C下培養1小時。最終DMSO濃度為1 %。藉由經GFF玻璃 ' 纖維過〉慮器（Innotech Biosystems International, Lansing， . MI)過濾，使用Innotech細胞收集器，將結合物與游離放射 性配體分離。在4C下用每孔0.3 mL麟酸鹽緩衝生理食鹽 水（pH 7.0)洗條過渡 |§3 次且使用 Wallac 1450 Microbeta液 體閃爍計數器（PerkinElmer，Boston, ΜΑ)量測放射性。經 由對使用XLfit(IDBS，Guildford, UK)計算之IC50值進行 Cheng-Prussoff校正而導出競爭化合物之Ki值。 使用以上放射性配體結合檢定來量測化合物對γ·分泌酶 複合物之早老素標靶位點之親和力。（2R)-2-[[(4-氣苯基） 磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]曱基]胺基] 5,5,5-三氟戊醯胺引起THP-1膜中[3H] (R)-4-((N-(l-胺基_4_ ® 甲基-1-側氧基戊-2-基）-4-氣苯基磺醯胺基）甲基）·ν_(2·甲 氧基乙基）苯甲醯胺與早老素結合之劑量依賴性抑制。多 次實驗之分析得到Ki = 0.48 ηΜ±0.24 ηΜ(平均值士標準差， - η=8) 〇 對培養細胞中Αβ形成之抑制 使用 Bristol-Myers Squibb 開發之 Η4 ΑΡΡ751 SWE純系 8.20( —種穩定表現APP751之瑞典型突變體（Swedish mutant)之H4神經膠質瘤細胞株）檢定細胞中化合物之Αβ4〇 135297.doc -32- 200927099 或Αβ42抑制作用。經由每週兩次繼代以1:20稀釋使細胞維 持於對數期。對於IC5〇測定而言，將含有0.0125% BSA(Sigma A8412)之 DMEM 培養基中之 30 pL 細胞（1.5xl04 個細胞/孔）直接塗於含有0.1 μΐ^於DMSO中連續稀釋之化合 物的384孔複合板（Costar 3709)上。在5% C02中在37°C下 培養19小時之後，簡短離心板（1〇〇〇 rpm，5 min)。將每孔 • 之10叫等分試樣轉移至第二檢定板（Costar 3709)用於 Αβ40量測。藉由稀釋於含〇·2% BSA之40 m,M Tris-HCl(pH ❹ 7.4)新鮮製備抗體混合液且添加至檢定板。對於Αβ42量測 而έ ，將特異於Αβ42新抗原決定基（neoepit〇pe)之抗體 (565，Bristol-Myers Squibb 開發；與 Wallac 試劑（Perkin Elmer)結合）及特異於Αβ胜肽之N-末端序列之抗體（26D6， SIBIA/Bristol-Myers Squibb開發；與APC(Perkin Elmer)結 合）混合且將20 μΐ^該混合物添加至所培養細胞板之每一 孔’從而產生〇,8奈克/孔565及75奈克/孔26D6之最終濃 度。對於Αβ4〇量測而言，將特異於Αβ40新抗原決定基之 ❹ 抗體（TSD ’ Bristol-Myers Squibb 開發；與 Wallac 試劑 (Perkin Elmer)結合）及如上所述之26D6混合且將2〇 該混 合物添加至已預先自細胞板移出之1〇 等分試樣，從而 產生1.6奈克/孔丁80及17.5奈克/孔2606之最終濃度。用鋁 箔密封含有抗體之檢定板且在4。〇下培養隔夜。使用 Viewlux計數器（Perkin Elmer)測定信號且使用 CurveMaster(基於Excel Fit)中之曲線擬合測定IC5〇值。 (2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟_4_(1,2,4_噁二唑 _3_基） 135297.doc -33· 200927099 苯基]曱基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺有效地抑制H4-8SW細胞 中Αβ40及Αβ42之形成。多次實驗之分析得到對於Αβ40抑 制而言IC5〇=0.30 士 0.15 ηΜ(平均值土標準差，η=50)及對於 Αβ42抑制而言 IC50=0.27±0.12 ηΜ(平均值士SD，η=45)。 對培養細胞中Notch信號傳導之抑制 • 跨膜受體Notch家族之信號傳導需要γ-分泌酶活性。由 - 於對Notch信號傳導之抑制會導致不當、機理性副作用， 故使用關於Notchl-ΔΕ信號傳導之細胞檢定反篩選 ® (counterscreen)y-分泌酶抑制劑。 藉由PCR使用標準分子生物學技術產生小鼠Notchl表’現 構築體且藉由定序加以確認。此構築體係以修飾成含有N-末端20胺基酸信號序列及C-末端7X myc標籤之 pCDNA3.1+Hyg載體（Invitrogen)產生。信號序列來源於小 鼠Notchl ; 7X myc-標籤係藉由使用重疊引子產生且次選 殖至 pCDNA3.1+Hyg載體之Hindlll/Xhol位點。 小鼠Notchl-AE構築體在跨膜結構域内含有小鼠Notchl 信號序列及M1727V突變以抑制内部轉譯起始《自小鼠脾 臟快速選殖 cDNA 庫（Mouse Spleen Quick Clone cDNA library，Cl ontech)分離胺基酸 1704 至 2193之小鼠 Notchl - • ΔΕ編碼序列且次選殖至含有7X myc-標籤及信號序列之修 飾載體作為Xbal/Hindll片段。 將海拉（Hela)細胞維持於含有10% FBS(GibcoBRL)、青 黴素/鏈黴素（GibcoBRL)及2 mM L_麩胺醯胺（GibcoBRL)之 DMEM(GibcoBRL)中。使用 TransIT-HelaMONSTER(Mirus) 135297.doc -34- 200927099 根據製造商之指導瞬時轉染細胞。轉染之前16小時以每 T1 75燒瓶4x106個細胞之密度以海拉生長培養基（具有麩胺 醯胺、青黴素、鏈黴素及10%胎牛血清之DMEM(具有 HEPES之高葡萄糖）塗覆海拉細胞（ATCC)。使用 HelaMonster轉染試劑（Mirus)在生長培養基中轉染細胞， • 該生長培養基具有：6 pg小鼠Notchl-ΔΕ質體、15.6 pg載 - 劑質體（pCDNA3.1+hyg)、14.4 CBF1質體（螢光素酶報 告體）。CBF1-螢光素酶報告體構築體由SV40啟動子 © (pGL3-啟動子’ Promega)上游之CBF1結合元素之4倍（4Χ) 複本組成。使用重疊引子產生4倍（4X)CBF1結合區域而產 生CBF1-螢光素酶報告體❶將此片段次選殖至pGL3-啟動 子構築體之Nhel/Bglll位點。藉由定序確認此構築體之完 整性。將DNA備料稀釋於TE緩衝液（1 〇 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0)中用於轉染。DNA添加之後5至6小時，自 具有胰蛋白酶-EDTA之燒瓶中移出細胞且以5χ104個細胞/ 毫升之濃度再懸浮於限定培養基（具有麩胺醯胺、青黴 素、鏈黴素、0.0125%牛血清白蛋白及非必需胺基酸之 DMEM(具有HEPES之高葡萄糖））中。將細胞以每孔200 pL 之體積（1 x 104個細胞）塗於96孔黑色Clearview板（Packard) 且在37°C下培養1.5小時以使細胞黏附於該等板。最初將測 試化合物於96孔聚丙烯板上稀釋於1〇〇% DMSO中。隨後 藉由轉移至含有限定培養基之板而將DMSO化合物備料稀 釋47·6倍從而產生2.1%之DMSO濃度《將所稀釋化合物溶 液（10 μΙ〇添加至細胞板從而產生最終0.1%之DMSO濃度。 135297.doc •35- 200927099 培養隔夜。在此隔夜培養 孔添加2 5 pL填酸鹽緩衝 以相等比例混合Luc- 將含有化合物之細胞板在37°c ^ 之後’輕輕移除培養基且向每一 生理食鹽水（具有鈣及鎂）。

Screen(Applied Bi〇systems)試劑八及B且向每一孔添加5〇 叫該混合物。在室溫下培養板1Q分鐘，之後將黑底（W backing)附加於板之底部且經T〇pC〇unt(packard)讀取信 號。隨後使用非線性回歸擬合濃度反應曲線以測定ic5〇 值。 Ο

跨膜受體Notch家族之信號傳導需要γ分泌酶活性。由 於對Notch信號傳導之抑制會導致不當、機理性副作用， 故使用以上所述關於Notch 1-ΔΕ信號傳導之細胞檢定來反 篩選γ-分泌酶抑制劑。藉由（2R)_2_[[(4_氣苯基）磺醯基][[2_ 氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5 5 5•三氟戊醯 胺抑制Notchl-ΔΕ信號傳導的多次實驗分析得到 IC5q=58±23 nM(平均值±標準差，n=58)。 基於抑制Αβ40(0.3 nM)及Notch(58 nM)之細胞效能， (2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑基）笨 基]甲基]胺基]-5,5，5-二氟戊醯胺之Notch/ΑΡΡ選擇率為 193X(95% CI=163-232)。 活雄内藥理學

Αβ ELISA 使用夾心ELIS A檢定量測來自動物之Αβ物質》由於針對 個別抗體之抗原決定基的詳情確定所偵測之Αβ物質，故此 處包括該等檢定之簡要論述。小鼠及大鼠Αβ共用不同於人 135297.doc -36 - 200927099 類Αβ之共同Αβ序列。由於該等序列差異，諸如26D6之辨 識人類Αβ之Ν-末端區域的抗體與齧齒動物Αβ弱結合。同 樣地，諸如252之與齧齒動物Αβ緊密結合之抗體與人類Αβ 弱結合。開發了兩種檢定用於量測齧齒動物Αβ40 : 252-TSD及4G8-TSD。TSD-4G8檢定不僅可量測Αβ40，而且可 量測其他BACE-γ-分泌酶分裂產物（Αβί 1_40)及α-分泌酶-γ-分泌酶分裂產物（Ρ3)。表1概述本申請案及其用途中所呈 現之檢定。 Ο 抗《對 .. ...所分析之组織 所儀測之Αβ物質 252-TSD 4G8-TSD ^5^腦部 大辯ίΛ _ /"mT? Αβχ-408 a "X"之精確位置未知。儘管252辨識出Αβ之Ν-末端區域， 但未知Αβ之胺基末端截斷是否影響252結合。此不確定 性在大鼠中不太可能為一問題，因為Ν-末端截斷很罕 見。 φ 使用幾種方法驗證每一該等檢定。首先，將變化量之合 成Αβ添加至生物基質且將信號之增強與合成Αβ於緩衝溶 液中所得到之信號相比。其次，用抗Αβ抗體自生物樣品中 耗竭Αβ。第三，撿定來自用高劑量之丫_分泌酶抑制劑處理 之動物的樣品。使用來自用高劑量之γ_分泌酶抑制劑處理 之動物的樣品’經驗證檢定有效偵測外添加Αβ(>80%回收 率），在Αβ免疫耗竭之後信號極大降低（與非特異性對照組 相比’降低>80°/。），且信號降低至與檢定下限（assay fi〇or) 135297.doc -37- 200927099 接近或重疊之值。最佳化且經驗證之Αβ檢定仍含有少量不 能被抗Αβ抗體耗竭或用γ_分泌酶抑制劑處理耗竭之信號（5_ 20%之媒劑對照組^此信號不太可能為Αβ且因此稱為檢 定下限。未使用檢定下限校正每一 Αβ量測值，且因此所報 告之值可能為Αβ抑制實際量之低估值。 將Αβ40用作活體内Αβ42替代品。在生物樣品中Αβ4〇約 10倍富於Αβ42。基於培養細胞中之實驗，Αβ40為Αβ42之 良好替代品，其中Αβ40及Αβ42受到（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺 醯基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5_ 二敦戊酿胺及其他γ-分泌酶抑制劑之類似抑制。 大鼠研究 活著時（In丨ife) 每天在早晨藉由口服管飼法對雌性Harian Sprague_

Dawley大鼠（約 200-250 g)投與 4 mL/kg 99% PEG-400、1%

Tween-80之給藥媒劑。一旦研究開始時製備給藥溶液。使 用56°C下加熱及超音波處理將化合物溶解於給藥溶液中。 所有程序均依照ACUC準則進行。在C〇2安樂死之後藉由 心臟穿刺獲得末梢企樣且收集於EDTA管中。離心之後獲 得血漿。切開腦組織、稱重且冷凍於乾冰上直至分析。離 心CSF樣品以移除細胞或碎片，之後以！ ：2稀釋於BSA 中且冷凍以用於隨後分析。將組織病理樣品在處理之前置 於中性緩衝福爾馬林中。將為佔用（0CCUpanCy)所收集之樣 品塗佈於包埋基質中，且在_250C至·3(Γ(：下於2_曱基丁烧 浴中，之後於乾冰上冷凍。使用眼窩後採血獲得活著時血 135297.doc -38 - 200927099 漿樣品。 播AP40檢定

將大鼠腦（半個半球）使用Polytron以4 mL/g於PBS(pH 7.8，2% CHAPS、完全蛋白酶抑制劑（Roche))中均質化。 藉由在20,800 X g下離心30分鐘移除大碎片且將所得上清 ' 液以 1:2 稀釋於 PBS(2.5% BSA)中。將白色 Microlite II . ELISA 板（Thermo Electron)用 50 pg/mL 於 PBS 中之 TSD9S3.2抗體在37°C下培養1小時。用200从5%牛血清白 Ο 蛋白（BSA ;重量/體積，於PBS中製備）在室溫下於板震盪 器上阻斷板2小時且隨後用500微升/孔PBS(〇.〇5% Tween-20)洗滌5次。以每孔50 pL之6組平行測定加載澄清之腦勻 漿且在室溫下培養1小時。如前所述洗滌板且隨後用 1:2000 稀釋於 PBS(0.05% Tween、0.1% BSA)中之結合辣根 過氧化物酶（HRP)之252抗禮（Biosource)培養1小時。3組平 行測定僅含有252-HRP抗體且3組平行測定含有252-HRP抗 體及1 pg/mL大鼠Apl_14(Anaspec)(其競爭特異結合之抗 胃 體）；將此背景信號自總信號扣除得到特異信號。使用

Pierce Supersignal Pico Chemiluminescent受質偵測結合之 252-HRP抗體1〇分鐘且以Packard TopCount量化。以置於 每一板上之腦勻漿參考物為基準將樣品正規化。基於Αβ40 標準曲線’ LLQ為10 pg/mL且LLD為20 pg/g組織。 血漿Αβ40檢定 以TSD抗體塗佈板且如腦Αβ40檢定中洗滌。將血椠樣品 以 1:3稀釋於 PBS緩衝液（pH 7.8，0.25%諾乃（nonidet)P40、 135297.doc -39- 200927099 2.5% BSA)中。以每孔50 pL之6組平行測定加載樣品且在 室溫下培養1-2小時。使用以1:8000稀釋於PBS(0.〇5% Tween、0.1% BSA)中之4G8-生物素（Signet)偵測樣品1小 時。3組平行測定僅具有4G8-生物素抗體且3組平行測定具 有4G8-生物素抗體及1 pg/mL Αβ17-24(其競爭特異信號）且 * 藉此確定每一樣品之背景值。如上洗滌之後，用1:50,000 . 稀釋於PBS(0.050/〇 Tween、0.1% BSA)中之抗生蛋白鏈菌 素-HRP(Zymed)培養板1〇分鐘。如腦Αβ40檢定中進行偵測 © 及量化。以置於每一板上之血漿參考物為基準將樣品正規 化。基於Αβ40標準曲線，LLQ為7.5 pg/mL且LLD為23 pg/mL血漿。 CSF Αβ40檢定 以TSD抗體塗佈板且如腦Αβ40檢定中洗滌。將CSF樣品 以 1:10 稀釋於 PBS(pH 7.8，0.1% Tween_20)中。在收集 時，預先將CSF以1:2稀釋於水中之4% BSA中》以每孔50 pL之3組平行測定加載樣品且在室溫下培養1-2小時。使用 以 1:8000 稀釋於 PBS(0.05% Tween、0.1% BSA)中之 4G8-生 物素（Signet)偵測樣品1小時。因為背景較低，故不需要以 競爭胜肽對此檢定運作平行測定樣品。如血漿Αβ40檢定中 偵測且量化結合之4G8-HRP。以置於每一板上之CSF參考 物為基準將樣品正規化。基於Αβ40標準曲線，LLQ為20 pg/mL且 LLD 為 400 pg/mL CSF。 γ-分泌味佔位（site occupancy) 於低溫恆溫器上以20 μηι之厚度做腦冠狀切片，且解凍 135297.doc -40- 200927099 安裝於Superfrost Plus載玻片上。以嘴侧海馬（rostral hippocampus)之層面保存切片，每載玻片3個切片，間隔約 120 μηι，且冷凍於_2(TC直至使用。對於佔用研究而言， 將腦切片溫至室溫、乾燥、於50 mM HEPES緩衝液（PH 7·4)中培養10分鐘，隨後轉移至含有i.5 nM [3H]IN973 (Goldstein, Μ.E.等人，五叩.(2007) 323:102-108)或[3抝（尺)-4-((1^-(1-胺基-4-甲基-1-側氧基戊-2-基）-4-氣苯基磺醯胺基）甲基）_n_(2-甲氧基乙基）苯甲醯胺 之相同緩衝液且在室溫下培養10分鐘。為確定非特異性結 合’將鄰近切片於含有[3h] iN973或[3H] (R)-4-((N-(l·胺 基-4-曱基-1-側氧基戊_2_基）_4_氣苯基磺醯胺基）甲基）_N_ (2-甲氧基乙基）苯曱醯胺，但包括〇·5 μΜ之未標記γ_分泌 酶抑制劑之緩衝液中培養。培養之後，將載玻片於冰冷 PBS(pH 7.2)中洗滌3次每次2分鐘，浸潰於冰冷蒸餾水中且 用吹冷空氣之風扇乾燥。將載玻片置放於氚敏感磷光體儲 存榮幕（phosphor storage screen)(Amersham Biosciences，

Arlington Heights, IL)下且於黑暗中曝光7曰。自磷光體儲 存螢幕使用漩渦（Cycl〇ne)磷光體掃描器（Packard，Meriden， CT)及〇ptiQuant採集及分析軟體（packard)獲得影像。量測 所關注區域上之光學密度（表示為每平方毫米數位光單位） 且表示為媒劑對照組之百分比。 组織病理學方法 藉由c〇2窒息實施安樂死之後，自腹部取十二指腸近端 約3 cm長之片段，用冰冷磷酸鹽緩衝生理食鹽水沖洗且置 135297.doc -41 - 200927099 於10%緩衝福爾馬林中’之後切片。將十二指腸之組織切 片包埋於液狀石蠟中，安裝於塊體（bl〇cks)上切成進行 一重覆矢狀（sagittal)(橫穿内腔（cross_iuminai))環切片且使 用過碘酸雪夫氏鹼法（periodic acid Schiffs base meth〇d)染 色’之後進行顯微鏡評估（microsc〇pic evaluation)。所有 動物存活至進行預定驗屍為止。 急性大鼠研究 30 mg/kg單次劑量之（2R)-2-[[(4-氣苯基）績醯基][|；2-氟_ 4-(1，2,4-噁二唑_3_基）苯基]曱基]胺基]_5,5,5_三氟戊醯胺顯 著降低血漿Αβ40與腦Αβ40分別至媒劑對照組2%與16。/〇之 程度。為進一步研究大鼠中（2R)-2-[[(4-氣笨基）磺醯 基][[2-氟_4·(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5-三 氟戊醯胺之效應，以1 mg/kg、10 mg/kg及100 mg/kg投與 單次劑量之（2R)-2-[[(4-氯苯基）磺醯基][[2-氟-4-(l，2,4-噁 二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺且在2、5、 8、1 2及24小時之後收集組織用以量測血漿Αβ40、腦Αβ40 及γ-分泌酶佔位》該等量測顯示投藥後2至24小時10 mg/kg 及100 mg/kg使血漿Αβ40及腦Αβ40降低至小於基線Αβ40值 之25%。相比之下，1 mg/kg未引起腦Αβ40之統計上顯著 改變，而引起血漿Αβ40瞬時上升。詳言之，血漿Αβ40經8 小時增加至初始值之250%，之後經24小時返回至基線 值。γ-分泌酶佔位顯示，100 mg/kg劑量之後整個給藥間隔 (dosing interval)，及10 mg/kg劑量之後除24 h時間點 (88%)，腦中大於94°/。之γ-分泌酶抑制劑結合位點被佔據。 135297.doc -42- 200927099 相比之下，1 mg/kg劑量之後兩小時僅75%之腦γ-分泌酶結 合位點被佔據且經24小時占位逐漸返回至基線值。 急性大鼠研究之結果顯示，（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯 基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三 氟戊醯胺以介於1 mg/kg與10 mg/kg之間的ED50降低血漿 Αβ40、腦 Αβ40及 CSF Αβ40。 亞慢性大鼠研究 基於前一節所述之（2R)-2-[[(4-氯苯基）磺酿基][[2-氟-4-O (1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]·5,5,5-三氟戊醯胺對 大鼠腦Αβ40之效應，向大鼠投與3、10、30或100 mg/kg/d 之曰劑量。第三次劑量之後12或24小時或第四次劑量之後 5小時使動物安樂死。如表2所示藉由同一劑量組内給藥 5、12或24小時之後所獲自動物之值的線性外推而估計腦 Αβ40 AUC降低。基於此分析，Αβ40 AUC降低在3 mg/kg/d下 平均為53%且在1 〇 mg/kg/d或更高之劑量下増至大於85〇/〇。 ©在幾個時間點量測化合物含量以估計實驗開始及結束時之 化合物AUC(0-24 h)值。該等值顯示3次劑量之後化合物暴 露係在初始劑量之後暴露之2倍範圍内。來自該等大鼠之 十一 4曰腸組織之組織學5平估顯不以100 mg/kg/d給藥之1/3 • 大鼠具有輕微病變。 135297.doc -43- 200927099 表2 : 4-天大鼠研究之結果概述 研究 劑量 (mg/kg/d) 化合物PK AUC(uM*h) (ng*h/mL)血聚 第1日。結束時d 终端雎Ap40 (媒劑組之％)8 5h 12 h 24 h 雎b %Αβ AUC降低 胃腸 毒性 第1號 3 10 5200 12 6240 39% 35% 92% 49% NAD (N=3) 10 60 31200 48 24960 12% 9% 28% 85% NAD 30 169 87880 93 48360 8% 9% 13% 90% NAD 第2號 3 10 5200 13 6760 16% 34% 94% 57% NAD (N=3) 10 65 33800 55 28600 6% 4% 23% 91% NAD 30 191 99320 116 60320 6% 4% 15% 93% NAD 100 328 170560 199 103480 3% 3% 7% 96% +e a值為相對於媒劑對照組平均值表示之n=3隻動物的平均 腦Αβ40含量。 b藉由同一劑量組内給藥5、12或24 h之後所獲自動物之 值的線性外推而估計腦Αβ40 AUC降低。 c值為n=3隻動物之平均AUC(uM，h或ng*h/mL)。AUC係由 第1次劑量後5、12及24 h所獲取之樣品估計（第1號研究） 或由第1次劑量後5、12、17及24 h所獲取之樣品估計（第 2號研究）。 d值為n=3隻動物之平均AUC(uM*h或ng*h/mL)。AUC係由 第3次劑量後12及24 h及第4次劑量後5 h所獲取之樣品估 計（第1號研究）或由第3次劑量後12、17及24小時及第4 次劑量後5小時所獲取之樣品估計（第2號研究）。 e在1 /3動物中注意到杯狀細胞增生（goblet cell metaplasia)。 135297.doc -44- 200927099 NAD=未偵測到異常 亞慢性大鼠研究之結果顯示（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯 基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5-三 氟戊醯胺降低腦Αβ40而無胃腸毒性。詳言之，與誘發胃腸 毒性所需之100 mg/kg/d劑量相比，3 mg/kg/d劑量引起約 50%之腦Ap40AUC降低。 每曰一次歷時4曰給予1〇〇 mg/kg/d之（2R)-2-[[(4-氣苯基） 磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺基卜 5_，5，5-二默戊酿胺之高劑量組（在此劑量水平評估1 /3動物） 之單個動物中十二指腸近端的顯微鏡評估顯示在彼動物中 輕微的杯狀細胞增生。在給予£3〇 mg/kg之（2R)-2-[[(4-氣 苯基）磺醯基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基]胺 基]-5,5，5 -二氟1戊酿胺之大鼠中未注意到與藥物相關之十二 指腸變化。 在另一實驗中’大鼠每曰以30 mg/kg/d或300 mg/kg/d給 藥歷時4或7曰（表3)。終止時（給藥後5小時）腦Αβ4〇含量為 媒劑對照組之13。/〇且因此類似於先前用（2R)_2-[[(4-氣苯基） 磺醯基][[2-氟-4·(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]曱基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺進行之大鼠研究。在第一及第四次劑量 之後5小時化合物血漿含量類似。3〇〇 mg/kg/d劑量組中部 分大鼠（4/5)在給藥4日之後顯示胃腸毒性，但在另一處理 組中無大鼠（包括給藥7曰之動物）被偵測到胃腸毒性。 135297.doc • 45- 200927099 表3 : 第3號大鼠研究之結果概述 300 a測試N=5隻動物/劑量組/結束時間點（第4天或第7天）。 b在4/5動物中注意到杯狀細胞增生。 ❹ NAD=未偵測到異常 以上結果證實（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺酿基][[2_氟_4_ (1，2,4-噁二唑_3_基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5_三氟戊醯胺為 有效且具選擇性的γ_分泌酶抑制劑。該等結果支持（2R)_2_ [[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟_4_(124_噁二唑_3基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺作為阿茲海默氏病及其他與 類澱粉胜肽有關之病症的治療處置（therapeutic…^咖加） 之用途。

劑量a (mg/kg/d) 血漿濃度 給藥後5 h(uM) 第1曰 第4日 Hit度 給藥後5 h(uM) 第7日

以下實例為說明之目的給出且不應視為以任何方式限制 本發明，此係因為本發明之變化可能在本發明之精神範圍 内。 本申請案之化合物可以熟習有機合成技術者所熟知之許 多方法製備。可使用以下所述之方法以及合成有機化學技 術中所知之合成方法或如熟習此項技術者所瞭解之其變化 來σ成本申睛案之化合物。較佳方法包括（但不限於）彼等 下述之方法。文中所引用之所有參考文獻均以全文引用的 135297.doc -46 - 200927099 方式併入本文中。 可使用本章節中所述之反應及技術製備化合物。在適合 於所用之試劑及材料且對實現轉化適合之溶劑中進行該^ 反^。此外，在以下所述合成方法之描述中，應瞭解將所 有提出之反應條件，包括溶劑之選擇、反應氣氛、反應溫 i、實驗之持續時間及操作程序，選擇為彼反應之標準條 • 件熟$此項技術者應會容易地認識到該等標準條件。熟 習有機合成技術者應瞭解存在於分子各部分上之官能基： 〇 _所提出之試劑及反應相適合。對與反應條件相適合之 取代基的該等限制將為熟習此項技術者顯而易見，且因而 必須使用替代方法。 【實施方式】 在以下實例中，所有溫度均以攝氏度rc)給出。以 Thomas Scientific Unimelt毛細管熔點裝置記錄熔點且未校 正。以 Bruker Avance 300、Bruker Avanee 4〇〇 或汾❿以 ❾ Avance 500光譜儀記錄質磁共振（lH NMR)光譜。在所指示 溶劑中測定所有光譜，以内部標準四甲基矽烷（tms)低磁 場δ單位報導化學位移且以赫茲（Hz)報導質子間偶合常 數。多樣性圖案如下表示：s，單峰；d，雙重峰；1，三重 峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬峰；dd，兩組雙重 峰，br d，寬雙重峰，dt，兩組三重峰；br s寬單峰；dq， 兩組四重峰。以 jasco 或 丨 n Eimer FT_ IR光谱儀自4000 cm·1至400 cm·1測定使用溴化鉀（KBr)或氣 化鈉膜之紅外（IR)光譜，以16〇1 cm-丨之聚苯乙烯膜吸收為 135297.doc -47- 200927099 基準校準且以公分之倒數（cm-1)報導。以Rudolph Scientific Autopol IV旋光計於所指示溶劑中測定旋光度 [a]D;滚度以mg/mL給出。以Finnegan SSQ7000測定低解 析度質譜（MS)及表觀分子量（MH+)或（M-H)+。以Finnegan ΜAT900測定高解析度質譜。在與Water Micromass ZQ麵接 之Shimadzu LC上運作液相層析（LC)/質譜。 . 使用以下縮寫：DMF(二曱基甲醯胺）；THF(四氫呋 喃）；DMSO(二甲亞颯），Leu(白胺酸）；TFA(三氟乙酸）； Ο MTBE(甲基第三丁基謎）；DAST [三氟化（二乙胺基）硫]， HPLC(高壓液相層析）；rt(室溫）；aq.(水溶液）；AP(面積百 分比）。

製備A (R)-2-胺基·5,5,5-三氟戊醢胺鹽酸鹽 步驟A. 4,4,4-三氟丁醛

TEMPO f3c

OH

次氣酸鈉 E -►卜3匕

將二氣曱烷（4.2 L)填充至裝有機械攪拌器及冷卻浴槽之 20 L 4頸圓底燒瓶中。開始攪拌且將反應混合物冷卻至0 至-2°C。填充4,4,4-三氟丁醇（750.0 g)且將反應混合物進一 步冷卻至-5至-8°C。添加TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧 基，自由基）（9.15 g)同時維持溫度在-5至-8°C之間。將溴 化鉀之水溶液（於1.17 L水中60 g)添加至以上溶液且使溫度 維持於-5至-8°C。將NaOCl之水溶液（8.8 L，6-7 wt%，使 135297.doc -48- 200927099

用碳酸氫鈉緩衝至pH=8.5)添加至反應混合物（小心：放熱） 同時使反應混合物之溫度維持在_ 5它。類似地，過埃酸納 (NaI〇4)可取代NaOCl作為氧化劑。添加完成之後，分離二 乳甲炫I層且用·一氣甲院洗務（1><750 mL)水層。將二氣甲烧 層合併且使用無水硫酸鈉乾燥。過濾出乾燥劑，且藉由 NMR測定4,4,4-三氟丁醛之溶液的濃度。將含有標題化合 • 物之溶液不經額外處理而直接用於下一步。1H NMR (CDC13) (400 MHz) δ 2.30-2.50 (m, 2Η, CH2-CF3), 2.70- O 2.80 (m, 2H, CH2-CHO)，9·8 (s，1H，CHO)。 步驟B. 5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基）戊旗（非對映異構 髋之混合物）

TMSCN 乙酸 H2N^Ph 將R-α-曱基苄胺（528.5 g)填充至裝有機械攪拌器、冷卻 浴槽之合適容器且維持於氮氣層下。填充4,4,4_三氟丁搭 溶液（來自步驟A，550 g)，之後填充甲醇（3.3 L)。隨後將 反應混合物冷卻至約0至-3°C。經15分鐘時間逐滴添加乙 酸（冰乙酸’ 260 mL)，維持溫度約0。(：，之後添加氰化三甲 基石夕炫（5 81 mL)。類似地，可使用氰化鈉（NaCN)或氰化鉀 作為氰化物來源。使反應現合物溫至2 5至2 7 °C且授拌隔 夜。藉由TLC測定反應完成。將冷凍水（10.0 L)填充至反應 混合物且用二氣甲烷萃取該反應混合物（lx 1〇.〇 L)„用水 135297.doc -49- 200927099 (2x10.0 L)、之後用鹽水（1x5.0 L)洗滌二氯曱烷層。將二 氣甲烧層經無水硫酸鈉乾燥且減壓濃縮得到呈黏性液體狀 之標題胺基腈（非對映異構體之混合物）’平均產率90%。 !H NMR (CDC13) (400 MHz) δ 1.42 (d&m, 5H), 2.15 & 2.35 (兩個 m，每一 1H)，3.10-3.20 ( m，1H)，4.10-4.15 (m，1H)， 7.10-7.35 (m，6H)。 步驟C. 5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基）戊醯胺（非對映異 構«之混合物） e HN^Ph H2S04

h2n

將5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基）戊腈（來自步驟b之非 對映異構體粗混合物，1.10 kg)於裝有機械攪拌器、冷卻 用冰浴槽之合適容器中溶解於二氣甲烷（5.5 L)中且維持在 氮氣層下。開始攪拌且將反應混合物冷卻至〇至_5°c。經i 小時時間逐滴添加濃硫酸（1.75 L)至以上混合物，維持溫 度在0°C以下；添加完成之後獲得澄清溶液。使反應混合 物之溫度升高至25至27°(：且攪拌隔夜（12-14 11)。藉由111>1^(： 測定反應完成。將反應混合物緩慢傾倒於碎冰（約1 5 〇 kg) 上且用氨水（約25體積％)中和。分離水層且用二氣甲院萃 取（2x3.0 L)。將合併之二氯甲烷層用水（lxl2.〇 L)、之後 用鹽水（1x3.0 L)洗滌》使富含產物之有機層經硫酸鈉乾燥 且減壓濃縮得到0.85 kg(72.0%)粗標題化合物。lH NMR 135297.doc -50- 200927099 (CDC13) (400 MHz)(非對映異構體之混合物）δ 1.36 (d&m， 4H，CH3 (J=8.0 Hz & CH2之 1H)，1.90 (m，CH2之 1H)，2.15 & 2.35 (兩個 m，CH2-CF3 之每一 1H)，2,80-2.90 ( m，1H，CH-Ph)， 3.60-3.70 (m,lH,-(CONH2)CH(NH), 5.90 & 6.45 (CONH2之每一 1H ’以及其他非對映異構體之微小峰）， 7.20-7.40 (m, 6H, Ar + NH) 〇 步播D. (R)-5,5,5-三氟-2-((R)-l-苯基6基胺基）戊醯胺鹽 酸鹽 Ο

HCI,二噁烷 結晶 丨 de >99.9 % θ Φ z Cl H2N八 Ph H2NY^cf3 ο 將5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基）戊醯胺（非對映異構體 之混合物）（850 g)填充至裝有機械攪拌器及冷卻浴槽之合 適容器中。填充甲醇（2.55 L)、乙酸乙酯（1>7 l)及水（1.〇6 L)且將反應混合物冷卻至0至5它。經3〇至45分鐘之時間逐 ❹ 滴添加HC1於二噁烷中之溶液（4,5 M，i 72 L)。類似地， 可將異丙醇與甲基第三丁基醚之混合物用作溶劑，且可將 HC1水溶液或濃HC1用作HC1來源。隨後使反應混合物之溫 度升间至25至27 C且攪拌2小時。藉由TLC測定反應完成。 過濾出所沈澱之固體且用合適溶劑（諸如乙酸乙酯（l 8 l) 之後石油醚（2.5 L)、或異丙醇與甲基第三丁基醚之混合 物）洗滌濾餅。使固體在周圍溫度下於無蓋托盤中乾燥， 得到標題R-胺基醯胺（480 g，產率50%，非對映異構過量 135297.doc 51 200927099 =99.9%)。】H NMR (CDC13) (400 MHz) δ 1.73 (d，3H，CH3, J=8.0 Hz)，2.08-2.09 (m，CH2i2H)，2_20-2.40 (m，2H，CH2-CF3)，3.50-3.55 (m, 1H, CH-Ph), 4.40-4.41 (m,lH,-(CONH2)CH(NH), 7.48-7.53 (br s, 5H，Ar) o 步驟E. (R)-2-胺基-5,5,5-三氟戊醮胺鹽酸鹽

h2 Pd(OH)2 -^ nh3 ci0 h2n ❹

將（R)-5,5,5-三氟-2-((R)-1-苯基乙基胺基）-戊醯胺鹽酸鹽 (1.50 kg)隨甲醇（15.0 L)—起填充至合適壓力容器中。此後 添加水（701.0 mL)、之後添加20%氫氧化鈀/碳（225 g)。類 似地’可將鈀/碳（Pd/C)用作氫化催化劑。將容器用氮氣沖 洗3次，且隨後在60°C下將氫氣壓入容器中（3-4 kg/cm2)。 藉由HPLC監控反應是否完成。完成後，使反應混合物冷 卻至30-3 5°C且經由矽藻土（Celite)墊過濾，隨後用曱醇洗 滌。隨後減壓濃縮濾液。濃縮完成之後，用二氣甲烷（每 次洗滌2.5 L)處理剩餘反應混合物，過濾且在45。(：下乾燥 12小時’得到標題化合物（915 g，91.0% ;純度=97%)。 NMR (DMSO-d6) (400 MHz) δ 2.00 (m, 2Η, CH2), 2.30-2.40 (m，CH2-CF3 之 2H)，3.85-3.88 (m，lH，-(CONH2)CH(NH)， 7.64 & 8.11 (br s，CONH2之每一 1H), 8·44 (br s, 3H, NH3+)。13C NMR (DMSO-d6) (100.0 MHz) δ 169.57, 131.20, 128.45, 125.71, 122.97, 50.91, 29.46, 29.18, 28.89, 135297.doc -52- 200927099 28.61，23,56, 23.53。

製備B (R)-5,5,5-三氟正纗胺酸 方法A. R-轉胺酶（Biocatalytics及BMS轉胺酶） 由於0.1 Μ填酸鉀緩衝液（pH 7.5)中含有5,5,5-三氟-2-側 氧基戊酸（1〇〇 mg，0.588 mmol)、R，s-丙胺酸（200 mg， 2-244 mmol)及0.02 mM填酸《比哆醛的溶液與來自 Biocatalytics之R-轉胺酶AT-103(5 mg，44個單位）或來自蘇 雲金桿菌（5£^7/1/>?//^咖^7>«>?以）8(^16569之經選殖11-轉胺 酶（0.5 mL ’ 10個單位’ BMS轉胺酶）在30。(：下，以5 mL之 總體積’於15 mL試管中培養44 h。分別以AT-103及BMS 轉胺酶得到49%及48%之（R)-5,5,5-三氟-2-胺基戊酸反應產 率。在兩種情況下ee均為1〇〇〇/0。 藉由添加辅助酶，將丙酮酸還原為乳酸而增加產率。乳 酸脫虱酶需要NADH作為辅因子。使用甲酸脫氫酶可再生 NADH。將於〇·ι μ磷酸鉀緩衝液（pH 7.5)中含有5 5 5_三 氟-2-側氧基戊酸（100 mg，0.588 mm〇1)、D L丙胺酸（2〇〇 mg，2.244 mmol)、0.02 mM磷酸吡哆醛、甲酸鈉（68 mg， 1 mmol)、NAD(3.31 mg，5 μηιοί)、選殖自兔子肌肉之L_ 乳酸脫氫酶（Biocatalytics LDH-103，0.107 mg，15個單位） 及甲酸脫風酶（0.5 mL ’ 15個單位，選殖自巴斯德畢赤酵 母（Pichia pastoris)且表現於大腸埃希氏菌（EscheHchia 〇〇//))的溶液與來自則(^1&以^之11-轉胺酶八1'-103(5 11^’ 44個單位）或來自蘇雲金桿菌sci 6569之經選殖尺_轉胺酶 135297.doc -53- 200927099 (0·5 mL，10個單位），在30°C下，以5 mL之總體積，於15 mL試管中培養。分別以AT-103及BMS轉胺酶得到94%及 91%之（R)-5,5,5-三氟-2-胺基戊酸反應產率。在兩種情況下 ee均為 100%。 方法B. (R)-胺基酸脫氫酶（Biocatalytics及BMS) 衮序7 .·將5,5,5-三氟-2-侧氧基戊酸（60.00 g，0.353 • mol)、NH4C1(64.19 g，1.2 mol)、葡萄糖（86.4 g，0,479

mol)及水（975 mL)填充至2-L夾套反應器中。添加NaOH(10 © N ’ 36 mL)且在30°C下用磁鐵攪拌混合物以溶解固體。PH 值為約7。添加Na2C03(12.72 g，0.12 mol)，使pH值達到 約8.5。隨後將NADP(4 5 8 mg，0.60 mmol)、葡萄糖脫氫酶 (33·7 mg ’ 5277個單位，購自 Amano Enzyme Company)及 R-胺基酸脫氫酶（600 mg，D-AADH-102，購自 Biocatalytics) 以此次序添加。藉由滴加l〇 N NaOH，使反應混合物達到 pH值為9。在3 0°C下攪拌反應混合物，且藉由自pH恆定滴 定儀（pH stat)添加5 N NaOH而維持於pH 9.00。21 h之後， 〇 (1〇-5,5,5-三氟-2-胺基戊酸之溶液產量為51.1§，產率 84.7%，ee為 100%。 哀序2 將5,5,5-三氟-2-侧氧基戊酸（60.00 g，〇 353 ' mol)、NHKK64.1) g，1.2 mol)、葡萄糖（86.4 g，0.479 mol)及水（975 mL)填充至2-L夾套反應器中。添加1 〇 Ν之36 mL)且在30°C下用磁體攪拌混合物以溶解固體。ρΗ 值為約7。添加Na2C03( 12.72 g，0.12 mol)使pH值達到約 8.5。隨後將NADP(458 mg ’ 〇·6〇 mm〇l)、葡萄糖脫氫酶 135297.doc •54· 200927099 (33.7 mg，5277個單位，購自 Amano Enzyme Company)及 D-胺基酸脫氫酶（50 mL含有1500個單位之萃取物，BMS 酶）以彼次序添加。藉由逐滴添加10 N NaOH使反應混合物 達到pH值為9。在30°C下攪拌反應混合物且藉由自pH恆定 滴定儀添加5 N NaOH而維持於pH 9.00。15 h之後，（R)- 5,5,5-三氟-2-胺基戊酸之溶液產量為51.04 g，產率 . 84.6%，ee為 99.1%。

製備C Ο 心（溴甲基）-3-氟苯甲腈

CN

CN NBS, AIBN 二氣乙烷 方法A. NBS/AIBN溴化 將1，2-二氣乙烷（151 kg)隨4-氰基-2-氟甲苯（24 kg)及 AIBN(2 kg)—起填充至合適容器中。將混合物加熱至70至 O 74°c。一旦批料溫度達到70°c，就以12 kg/h之速率逐份添 加N-溴代丁二醯亞胺（47.4 kg)，維持溫度在70至74°C (重要 • 的為控制加入速率以避免放熱反應）。添加24 kg N-溴代丁 二醯亞胺之後經由GC偵測取樣混合物，且在70-74°C下加 熱反應物直至觀察到反應完成。將混合物冷卻至〇-5°C且 使其再靜置2小時。過濾混合物且用MTBE(24 kg)洗滌濾 餅。用水洗滌（3x65 kg)濾液。將有機層用硫酸鈉（10.3 kg) 乾燥6小時，過濾且用MTBE(24 kg)洗滌濾餅。減壓蒸發溶 135297.doc •55· 200927099 ❹ Ο 液，添加乙醇（12 kg)且將混合物加熱至40-45 °C，隨後緩 慢冷卻至0-5°C，同時攪拌至結晶。過濾混合物且用冷乙 醇（5 kg)洗滌濾餅。由石油醚再結晶粗固體，過濾且用石 油醚（10 kg)洗滌，得到呈奶白色固體狀之標題化合物4-(溴甲基）-3 -氟苯甲腈（21 kg，產率55%)。4 NMR (300 MHz, CDC13) 6:ppm 4.46-4.50 (m, 2 Η) 7.36 (dd, /=8.85, 1.32 Ηζ，1Η) 7.44 (dd，《7=7.91，1,32 Ηζ，1 Η) 7.52 (dd， 7=7.91, 7.16 Hz, 1 Η) « 13C NMR (75 MHz, CDCI3) 8:ppm 23.65 (d, /=4.60 Hz, 1 C) 113.76 (d, 7=9.77 Hz, 1 C) 117.09 (d, /=2.87 Hz, 1 C) 119.44 (d, *7=24.71 Hz, 1 C) 128.44 (d, 7=4.02 Hz, 1 C) 130.66-130.81 (s, 1 〇 13 0.81-131.06 (s, 1 C) 132.18 (d, 7=3.45 Hz, 1 C) 159.86 (d, /=254.03 Hz, 1C)。IR: (KBr) 3088, 3077, 3040, 2982, 2250，1571，1508, 1439, 1248 cm·1 〇 對C8H5BrFN分析計算：計算值C，44.89 ; H，2.35 ; N，6.54 ; F，8.88 ;實驗值：C，44.94 ; H，2.73 ; N， 6·56 ; F ， 8.73 。 方法B.溴酸鈉溴化 向合適反應器中添加二氣甲烷（40 L)及3-氟-4-甲基苯甲 腈（4 kg ’ 18.7 mol)，之後添加溴酸鈉於水中之溶液（溶解 於53.6 L水中之13,45 kg，89·1 mol)。將反應混合物冷卻 至約0-5°C。經2-3小時時間添加亞硫酸氫鈉之溶液（溶解於 42 L水中之9.25 kg)，同時維持10-20X：之批料溫度（反應為 放熱性）。添加完成之後，用200 W燈照射反應器且使批料 135297.doc -56- 200927099 /皿度升同至25-30 C。維持燈及溫度直至藉由HpLC測得產 物為70·75%ι除燈’停止㈣且使反應沈降15分鐘。移 出有機層且用二氣曱貌萃取剩餘水層兩次。合併有機層且 用10%硫代硫酸鈉溶液洗滌4次，隨後將有機層用鹽水（i〇 l) 洗滌且用硫酸鈉乾燥。濃縮有機層，隨後添加石油醚且蒸 乾兩次以移除所有二氣甲烧。添加石油醚（3 l)且將漿料冷 • 部至5-10°c歷時1小時。過濾漿料且用冷石油醚洗滌。在 真空烘箱中在4〇-45°c下乾燥產物得到呈奶白色固體狀之 © 標題化合物（3.2 kg，產率50.4%)。 自母液中回收標題化合物之代表性程序：將由濃縮母液獲 得之粗塊體（約36〇/〇 4-(溴甲基）·3_氟苯甲腈及約59%孿-二 溴化物）（300 g)及2當量二異丙基乙胺（基於孿_二溴化物）溶 解於乙腈（3 L)及水（50 mL)中。將反應物冷卻至〇_vc且經 3〇分鐘添加亞磷酸二乙酯（169 g，i.22 m〇1)(添加為放熱 性）。將反應物在〇-5°C下授拌60-90 min且藉由TLC監控。 ^藉由TLC監控到二漠化物已不存在時，添加水（3.3 l)且 過濾所得漿料。用水洗滌濾餅且在真空烘箱中乾燥（直至 水分含量為<1%)得到202 g(藉由HPLC測得98 ΑΡ)額外標題 化合物。

製備D 3-氟-Ν’-羥基_4_甲基苯甲脒之製備 在A氣氛下將202.0 g 3-氟-4-甲基苯曱腈，之後丨〇 [乙 醇填充至裝有機械擾拌器之合適容器。經由加料漏斗經2〇 分鐘添加胲（144 mL於水中之50%溶液）。在周圍溫度下擾 135297.doc -57- 200927099 ' 拌混合物直至HPLC分析顯示反應完成（無起始材料剩餘）。 經1小時將水（3.0 L)逐滴添加至淺黃色溶液得到稠漿料。 將漿料於冰水浴中冷卻至2。〇歷時1.5小時，過濾且在35它 下真空乾燥22小時得到呈白固體狀之標題化合物3 g > 91.60/0) 〇 ^H-NMR (CDC13, 500 MHz) δ 7.30 (m, 2Η)5 . 7.19 (m, 1Η), 4.87 (s, 2H), 2.28 (s, 3H); 13C-NMR (CDC135 . 500 MHz) δ 162.15, 160.19, 151.58, 131.82, 131.76^ 131.66, 131.62, 127.01, 126.87, 121.06, 112.69, 112.51, ❹ 14·48;(CDCb，500 MHz) δ -116.35, ·116 37,’_116 39。’ LC-MS M+H169.19。

製備E 3-(3-氣_4·甲基苯基）_i，2,4-噪二嗅之製備 方法Α·三氟化硼 將粗醯胺肟3-氟-N，-羥基-4-甲基苯甲胨（118 6 g)及原甲 酸三乙酯（292 mL，260 g，i.76 m〇1)於二氣曱烷（8〇〇 mL) 中調漿且在室溫下添加三氟化硼合乙醚（b〇r〇n tHflu〇ride diethyl etherate)(14.8 mL’ 16.6 g，0.12 m〇1)。將所得黃 色备液加熱至45 C歷時1小時且保持於室溫下丨6小時，藉 由HPLC得到60%之轉化.將溶液加熱至45。〇歷時25小 時，其轉化達到約1%之殘餘起始材料。冷卻至室溫之 後，將1 N HC1(600 mL)添加至混合物。分離各相，且用 二氣甲烷（200 mL)萃取水層。將合併之有機層經硫酸納乾 燥且在25。〇下減壓濃縮得到白色固體。在高真空下乾燥16 小時得到標題化合物（102.3 g，經兩個步驟產率為98%)。 135297.doc •58- 200927099 方法B.三氟乙酸 在N2氣氛下向裝有機械攪拌器之合適容器填充3-氟-N’-羥基-4-曱基苯曱脒（302.52 g，1.79 mol)、原甲酸三乙酯 (3 82.5 mL，341.1 g，2.3 mol)及乙腈（1512 mL)。將反應混 合物加熱至45°C且在此溫度下添加三氟乙酸（6.72 mL， * 10.08 g，87.6 mmol)。將反應混合物在60°C下再加熱90分 . 鐘，隨後冷卻至室溫。經60分鐘時間逐滴添加水（3 L)。使 漿料冷卻至4°C且在此溫度下攪拌30分鐘。過濾固體且在 © 50°C下真空乾燥12小時得到呈白色固體狀之3-(3-氟-4-曱基 苯基）-1，2,4-噁二唑（306 §，95.6%)。1^1^顯示99.8%之化 學純度。1H-NMR (CDC13, 400 ΜΗζ) δ 8.67 (s，1H)，7.71 (m， 2H)，7.23 (t，J=8 HZ, 1H)，2.28 (s，3H); 13C-NMR (CDC13, 400 MHz) δ 166.9447, 164.7258, 162.5473, 160.1066, 132.0480, 132.0077, 128.5987, 122.9910, 122.9507, 114.2568, 114.0147, 14.6902。19F-NMR (CDC13, 400 MHz) δ -115.94, -115.96。 C9H7N20之分析計算：C，60.67 ; Η，3.96 ; N，15.72。實 Ο — 驗值：C，60,54 ; Η，3.78 ; Ν，15.69。

製備F 3-(4-(溴甲基）-3-氟苯基）-1,2,4-噁二唑之製備 方法A :逐步溴化 將 AIBN(246 mg，1.5 mmol)添加至 3-(3-氟-4-甲基苯基）-1，2,4-噁二唑（5.34 g，30 mmol)、CC14(50 mL)及NBS(11.7 g， 66 mmol)之攪拌混合物中。將反應混合物在氮氣下加熱至 80°C歷時3小時，冷卻至室溫且添加50 mL飽和碳酸氫鈉溶 I35297.doc -59· 200927099 液。分離有機層且用二氯甲烷（50 mL)萃取水層。使有機 層經硫酸鈉乾燥，過濾且經旋轉蒸發器濃縮得到呈白色固 體狀之3-(4-(二溴曱基）_3_氟苯基噁二唑（9 34 g， 93%) ’在不進一步純化之情況下將其用於下一步。向2〇〇 mL圓底燒瓶填充3_(4_(二溴曱基）_3_氟苯基卜丨二，‘噁二唑 (8.37 g，25 mmol)及THF(60 mL)。將混合物冷卻至〇。〇且 經>15刀鐘逐滴添加一異丙基乙胺（3.48 g，27 mmol)，之後 添加亞磷酸二乙酯（3.7 g，26.8 mmol)。將混合物在室溫下 攪拌60分鐘且用40 mL水驟冷。用乙醚（2x80 ml)萃取水 層。將合併之有機層用20 mL飽和NH4C1水溶液及20 mL飽 和氣化鈉溶液洗滌。使有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且經旋 轉蒸發器濃縮以得到粗固體，藉由短二氧化矽墊純化該粗 固體得到3-(4-(溴甲基）·3-氟苯基）-1，2,4-噁二唑（6.03 g， 94%)。熔點 87.3°C。h-NMR (CDC13, 400 MHz) δ 8.80 (s，1H)， 7.94 (dd, 1Η), 7.87 (dd, 1H), 7.58 (t, 1H), 4.57 (s, 2H); 13C-NMR (CDC13，400 MHz) δ 166.97，166.95，165.45，162.29，159.73, 132.34, 132.30, 128.99, 128.90, 128.81, 124.04, 124.01, 115.56, 115.32, 25.22, 25.18; ,9F-NMR (CDC13, 400 MHz) δ -115.81, -115.84，-115.86。C9H6BrFN20之分析計算：C，42.05 ; H， 2.35 ; N，10.90。實驗值：c，42.17 ; H，2.17 ; N，10.63。 方法B:替代性一錢式（one_p〇t)淡化 將 3-(3-氟-4-曱基苯基）-1,2,4-嗔二吐（101.8 g’ 0,57 mol) 及N-溴代丁二醯亞胺（206 g，1.16 mol)溶解於乙腈（約1 L) 中且在室溫下添加偶氮雙異丁腈（4.2 g ’ 26 mmol)。將混 135297.doc •60- 200927099 合物加熱至70°C歷時2小時，此時HPLC顯示起始材料完全 轉化為一溴化物與二溴化物之混合物。將混合物冷卻至 〇°C且添加二異丙基乙胺（73 mL，54,2 g，0.42 mol)，同時 維持反應溫度在5°C以下。缓慢添加亞碌酸二乙醋（54.7 mL，5 8·6 g ’ 0.42 mol)且將反應混合物溫至室溫。2小時 • 之後，HPLC顯示二溴化物完全轉化為一溴化物。添加水 • (1.2 L)且過濾所得沈澱。用水（2x200 mL)洗滌且乾燥得到 3-(4-(溴甲基）-3-氟苯基）-i，2,4-噁二唑（135 g，產率92%)。 © 方法C:溴酸鈉溴化（直接分離） 將溴酸鈉（2.54 g)溶解於水（8.4 mL)中。在室溫下向此溶 液添加3-(3-氟-4-甲基苯基）-1，2,4-噁二唑（1.〇 g)於 EtOAc(12 mL)中之溶液。逐滴添加NaHS03(1.75 g)於水（17 mL)中之溶液（小心：放熱）。將混合物在室溫下攪拌2 h， 且隨後維持於冷室中隔夜。分離有機層，用1 〇% Na2S2〇3 及水洗滌’且隨後濃縮。將所得固體溶解於EtOAc(約6 mL)。緩慢添加庚烷（約30 mL)。將漿料在室溫下授拌3 ❹ h，且隨後過濾。用庚烷（15 mL)洗滌固體，隨後乾燥得到 0.74 g(51%)標題化合物：HPLC : 99.42AP。第二批回收： • 將濾液濃縮至約30 mL之體積且過濾所得漿料得到呈白色 固體狀之標題化合物0.23 g( 16%) : HPLC 97.09 AP。 方法D:溴酸鈉溴化（使用二溴化物還原之兩步程序） 在室溫下將3-(3-氟-4-曱基苯基）-1，2,4-噁二唑（20.0 g， 112.2 mmol)於二氣甲烷（200 mL)中之溶液添加至 NaBrO3(50.8 g，336.7 mmol)於水中（200 mL)之溶液。將所 135297.doc • 61 · 200927099 得兩相混合物冷卻至約Ot。逐滴添加NaHS03(35.7 g， 336.7 mmol)於水（160 mL)中之溶液以維持批料溫度在2〇。〇 以下（約1 h)。在室溫下攪拌所得紅色溶液直至藉由hplc 測得3-(3-氟-4-甲基苯基）·ι，2,4-噁二唑低於1.0 AP(約2 h)。分離有機層（底層）且用二氣曱烷（2〇〇 mL)萃取水層。 • 將合併之二氣甲烷溶液用10% Na2S203水溶液（200 mL)、 水（200 mL)及15%鹽水（200 mL)洗滌。真空濃縮之後獲得 白色固體（一溴化物與二溴化物之混合物）。將此固體溶解 〇 於濕仏〇1^(20〇1111^，1^:1.5-4%)且將溶液冷卻至_5。(：至 0 C。添加 N，N- 一 異丙基乙胺（6.0 g，8.1 mL，46.4 mmol) ’之後經15分鐘逐滴添加亞麟酸二乙酯（6.〇 g，46.1 mmol)。在_5°C至0°C下攪拌混合物直至3-(4-(二溴甲基）·3-氟苯基）-1,2,4-噁二唾小於0.5 AP(1.5-2 h)。經30 min添加 水（500 mL) ’產生白色漿料。將此漿料在室溫下攪拌ι_3 h ’且隨後過濾。用水（2x200 mL)洗滌濾餅，且隨後在 45°C下真空乾燥20 h。 C9H6BrFN20之分析計算：計算值：c，42.05 ; Η，2.35 ; Ν ’ 10.89 ; Br ’ 31.08 ; F ’ 7.39。實驗值：C，42.10 ; Η， 2.24 ; Ν，10.90 ; Br，31.18 ; F，7.00 〇 實例1 (211)-2-[[(4-氣苯基）磺醢基】[【2_氟_4-(1，2,4-噁二唑-3-基）笨 基】甲基】胺基卜5,5,5-三氟戊醮胺 步称A. 5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基）戊腈 將 NaCN(3.88 g，79.6 mmol)添加至（R)-苯乙胺（9·60 g， 135297.doc -62- 200927099 79.4 mmol)及乙酸（5.08 g，79.6 mmol)於 MeOH(15〇 mL)中 之溶液。將反應冷卻至〇°C且添加4,4,4-三氟丁搭（10.0 g， 79.6 mmol)於MeOH(50 mL)中之溶液。將反應溫至室溫且 攪拌20 h。用水（400 mL)稀釋反應且用CH2C12(3x300 mL) 萃取。使合併之有機層經Na2S04乾燥且真空濃縮以得到呈 ' 淺黃色油狀之胺基腈標題化合物（18· 1 g，89%，呈非對映 . 異構體之 4:1 混合物）：1HNMR(300]y[Hz，CD3OD)δ7.38- 7.27 (m, 5H), 4.15-4.02 (m, 1H), 3.69 (t, J=7.5 Hz, 0.22H), ❹ 3.18 (t，J=7.5 Hz, 0.78H), 2.48-2.26 (m, 1H)，2.25-2.03 (m， 1H), 2.01-1.86 (m, 2H), 1.39 (d, J=6.5 Hz, 2.34H), 1.36 (d, J=6.5 Hz, 0.66H); ESI MS m/z 257 [Ci3H15F3N2 + H] 〇 步驟B· (R)-5,5,5·三氟-2-((R)-l-苯基乙基胺基）戊醮胺鹽 酸鹽 將H2S〇4(1〇0 mL)添加至5,5,5-三氟-2-(1-苯基乙基胺基） 戊腈（18.0 g，70.31 mmol，非對映異構體之4:1混合物）於 CHsClHlOO mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應22 h，傾至 碎冰上且用NH4OH中和。用EtOAc(3x500 mL)萃取混合 物。使合併之有機層經NaJO4乾燥且真空濃縮以得到呈橘 黃色油狀之非對映異構體混合物形式的標題化合物游離驗 (18.94 g » 98%) ： JH NMR (300 MHz, CDC13) δ 7.40-7.18 (m, 5H), 6.78 (br s, 0.23H), 6.50 (br s, 0.77H), 6.00 (br s, 0.77H), 5.81 (br s, 0.23H), 3.82 (q, J=6.5 Hz, 0.23H), 3.7〇 (q, J=6.5 Hz, 0.77H), 3.14 (t, J=6.0 Hz, 0.23H), 2.86 (t, J=7.0 Hz, 0.77H), 2.35-1.86 (m, 2H), 1.84-1.64 (m, 2H), 135297.doc -63- 200927099 1.39 (d，J=6.5 Hz，0.69H)，1.35 (d，J=6.5 Hz, 2.31H); ESI MS m/z 275 [C13H17F3N20 + H]。 鹽酸鹽 將1 N HC1於Et2〇(70 mL)中之溶液添加至呈非對映異構 體混合物形式的標題化合物游離鹼（11 9 g，43·4 mm〇1)於 Et2〇/MeOH(7:1，40 mL)中之溶液。藉由加熱混合物且添 • 加Me0H(至4:1之Et2〇/MeOH最終比率）使所形成之白色沈 澱再溶解。使溶液冷卻至室溫且靜置隔夜。將標題化合物 © 之胺基醯胺鹽酸鹽分離為呈白色固體狀之單一非對映異構 體（3.11 g，23%) : NMR (300 MHz，CD3OD) δ 7.93 (br s，1Η)，7.69 (br s，1Η)，7.54-7.44 (m，5Η)，4.39 (q，J=7.〇

Hz, 1H), 3.50 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.29-2.20 (m, 2H), 2.10-2.01 (m, 2H), 2.07 (d, J=7.0 Hz, 3H); ESI MS m/z 275 [C13H17F3N2O + Η] o 步驟C. (R)_2-(4-氣苯基磺醢胺基）_5,5,5-三氟戊醯胺 將 Pd(OH)2(350 mg)及水（10 mL)添加至（R)-5,5,5-三氟·2- ❹ w ((R)-l-苯基乙基胺基）戊醯胺鹽酸鹽（3.10 g，10.0 mm〇i)於

EtOH(100 mL)中之溶液。將反應混合物在50°C下氫化（40 • psi)4 h。經由矽藻土過濾反應且真空濃縮濾液以得到呈白 色固體狀之中間體胺鹽酸鹽。將Ν,Ν-二異丙基乙胺（5.25 mL，30.0 mmol)及 4-氣苯績酿氣（2.53 g，12.0 mmol)添加 至該胺於CH2C12(100 mL)中之懸浮液。將反應在室溫下攪 拌 18 h且用 EtOAc(200 mL)稀釋，用 NaHCO3(250 niL)及鹽 水（250 mL)洗滌，經他2804乾燥且真空濃縮。藉由用 135297.doc • 64· 200927099 CHaCl2/己烧（2:1)研磨殘餘物獲得呈白色固體狀之標題化 合物（2.91 g，84%) : 4 NMR (300 MHz，CD3OD) δ 7.84 (dt, J=8.5, 2.0 Hz, 2H), 7.55 (dt, J=8.5, 2.0 Hz, 2H), 3.85 (dd, J=8.5, 5.0 Hz, 1H), 2.34-2.05 (m, 2H), 1.97-1.68 (m, 2H); ESI MS m/z 345 [CnH12ClF3N203S + H]。 步驟 D. (Λ)-2-(4氣-iV-(2-氟-4-(l，2,4-噁二唑 _3_ 基）节基） 苯基磺醢胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺 將 Cs2C03(241 mg’ 0.74 mmol)及 3-(4-溴甲基 _3_氟-节 © 基）-1,2,4-噁二唑（257 mg，0.48 mmol)添加至磺醯胺（r)_2_ (4-氣苯基績酿胺基）-5,5,5-二氣戊酿胺（130 mg，0,37 mmol)於DMF(2 mL)中之溶液。將反應在室溫下授拌2 h， 用水（50 mL)稀釋且用EtOAc(2x50 mL)萃取。將合併之有 機萃取物用水（2x50 mL)及鹽水（50 mL)洗滌且真空濃縮。 藉由管柱層析法（石夕勝，0-55% EtOAc/己烧）純化殘餘物得 到呈白色固體狀之標題噁二°坐化合物（92 mg，45%):熔點 66-68〇C ； lH NMR (500 MHz, CDC13) δ 8.77 (s, 1H), 7.9〇 鲁 (dd, J=8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J=7.5, 7.5 Hz, 1H), 7.51 (d, 7=8.5 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.66 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.51 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.39 (dd, J=8.9, 6.3 Hz, 1H), 2.25-1.82 (m, 3H), 1.54-1.47 (m, 1H); ESI MS m/z 521 [C2〇H,7CIF4N4O4S + H] + ; HPLC 98.9% (AUC)，iR=19.4 min 0 實例2 (2R)-2-[[(4-氱苯基）磺醮基】[【2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基）苯 135297.doc -65- 200927099 基】甲基】胺基]-5，5,5-三氟戊班胺 步驟A. 4-(溴甲基）-3_氟苯甲腈 將 N-溴代丁二醯亞胺（4.97 g，0.28 mol)及 AIBN(100 mg，0.61 mmol)添加至3-氟-4_甲基苯甲腈（5.0 g，0.23 mol)於100 mL四氣化碳中之溶液且使混合物回流6小時。 • 冷卻且過濾反應。用水洗滌濾液，經硫酸鎂乾燥，過濾且 * 真空移除溶劑以得到5.44 g呈奶白色固體狀之標題化合 物。H NMR顯示存在20%起始材料。標題化合物之1η © NMR (400 MHz, CDC13) ： δ 7. 54-7.30 (m, 3Η), 4.83 (s, 2H) 〇 步驟B. (R)-2-(4-氣-N-(4-氟基-2-氟苄基）苯基磺醢胺基）-5,5,5-三氟戊醢胺 將無水 Cs2C03(19.56 g’ 60 mmol)添加至（R)-2-(4-氣苯 基項酿胺基）-5,5,5-三氟戊酿胺（6.88 g，20.0 mmol)及4-(漠 甲基）-3 -氟苯曱腈（6.43 g，30 mmol)於DMF(35 mL)中之溶 液。將所得混合物在室溫下攪拌45 min且隨後用 EtOAc(200 mL)稀釋，用水（1〇〇 mLx4)洗滌且經Na2S04乾 燥。藉由Biotage(40+M管柱，於己烷中之3%至80〇/〇 EtOAc，651 mL)純化產物。獲得呈白色固體狀之標題化合 物（6.50 g，產率 68.1%)。NMR (DMSO-d6，400 ΜΗζ) δ 7.80-7.88 (m, 3Η), 7.70-7.75 (m, 2H), 7.67 (d, 2H, J=8), 7.60 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 4.99 (d, 1H, J=16), 4.68 (d, 1H, J=16), 4.14 (t, 1H, J=8), 1.99-2.17 (m, 2H), 1.80-1.94 (m, 1H), 1.40-1.56 (m, 1H) ° LC/MS M+H 478.14, 94% ° 步驟C. (2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基】丨丨2-氟-4-(1,2,4-噁二 135297.doc -66 - 200927099 唑-3-基）苯基】甲基]胺基】-5,5,5-三氟戊醯胺 將 NH2OH(於 H20 中 50%，2.6 mL，40,8 mmol)添加至 (R)-2-(4-氯-N-(4-氰基-2-氟节基）苯基磺醯胺基）·5,5,5-三 氟戊醯胺（6·5 g，13.6 mmol)於EtOH(70 mL)中之溶液。將 所得混合物在80°C在氮氣下攪拌1 h且隨後冷卻至室溫。減 壓蒸發溶劑。將殘餘物溶解於EtOAc中且用水洗滌並經 NajO4乾燥。蒸發溶劑得到白色固體，將該白色固體自 EtOAe及己烷中再結晶以得到呈白色固體狀之中間體醯胺 肟（6.93 g，定量產率）。將BF3*OEt2(0.17 mL，1.36 mmol) 添加至該中間體（R)-2-(4-氣-N-(2-氟-4-(N'-羥基甲脒基）节 基）苯基磺醯胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺（6.93 g，13.6 mmol) 及原甲酸二乙酿（6.77 mL，40.8 mmol)於二氣乙炫（30 mL) 中之混合物。將所得混合物在7〇。(：下攪拌1 h且隨後冷卻至 室溫。層析（石夕膠，biotage，40+M管柱，於己烧中之3。/〇至 80¼ EtOAc，651 mL)得到呈白色固體狀之標題化合物（4.9 g，產率 69.3%)。 將以上4.9 g產物與第二批9.8 g (2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯 基][[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑_3_基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5-三 氟戊醯胺（藉由實例1中所述之程序製備）合併。向合併之批 (14.7 g)添加異丙醇（75 mL)。使混合物回流直至幾乎完全 溶解’且隨後過濾。將濾液在室溫下攪拌16 h且過濾◦乾 燥至恒定質量之後獲得白色細晶狀固體從而得到（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][[2_氟_4_(1，2,4_噁二唑_3_基）苯基]甲 基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺（13 7 g)。iH NMR (CDC13, 500 135297.doc -67- 200927099 MHz) δ 8.77 (s, 1Η), 7.90 (dd, J=8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J=7.5, 7.5 Hz, 1H), 7.51 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.66 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.51 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.39 (dd, J=8.9, 6.3 Hz, 1H), 2.25-1.82 (m, 3H), 1.54-1.47 (m, 1H); ESI MS m/z 521 [C20H17ClF4N4O4S + H]+ » 實例3 Ο (2R)-2-丨[(4-氣苯基）磺醢基】【[2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基）苯 基]甲基】胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺 步驟人.(11)-2-(4-氣苯基磺酿胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺

Θ CI 0 4-CIPhS02CI TEA, THF 水

在室溫下向合適乾燥容器中添加（R)-2-胺基-5,5,5-三氟 戊醯胺鹽酸鹽（199.52 g，0.966 mol，1.0當量），之後添加 ❹ 4_ 氣苯磺醯氣（215.22 g，0.989 mol，1.02 當量，97% w/w%)及 1.6 L THF。經 20 min添加三乙胺（206.5 g，2.04 . m〇l ’ 2·1當量），維持鍋溫度在15-25°C，且在15-25°C下搜 拌所得白色漿料3〇 min。在20-25°C下將水（1.4 L，7 vol)添 加至反應混合物且隨後藉由真空蒸餾移除Thf( 1.4 L，7 v〇l)(蒸顧過程中使鍋溫度維持在4〇_6(rc及25〇_4〇〇 mmHg 下）。當蒸館過程完成時，經3〇 min添加1.4 l(7 vol)水’ 同時維持鋼溫度在5〇-6(TC，且在50-60°C下攪拌所得漿料 135297.doc -68 - 200927099 3〇 min且隨後冷卻至10〇c ^攪拌漿料不少於丨小時且過濾產 物。用水（每次洗滌6〇〇 mL)洗滌濾餅直至濾餅洗滌液之pH 值量測為25。在不超過7〇°C下（夾套溫度）真空乾燥濾餅直 至乾燥失重<0.5 w/w% ’得到呈白色固體狀之標題化合物 (300 g ’ 產率 91%)。NMR (DMSO-d6) (400 ΜΗζ) δ 160- ' i.90 (兩個 m，CH2之每一 1Η)，2.10-2.35 (m，CH2-CF3之 2Η), 3.85-3.88 (m，lH，-(CONH2)CH(NH)，7.13 & 7.37 (br s, CONH2之每一 1H)，7.61 (m，2H，Ar-Ha)，7_64 (m，2H，Ar_ ❹ Hb)，8.18 (d，1H，J=8.0 Hz，NH-S02)。13C NMR (DMSO-d6) (100.0 MHz) δ 171.75，140.27，137.77，131.71，129.56, 128.95, 126.22, 55.12, 30.1, 29.82, 29.53, 29.25, 25.82, 25.79 〇 步驟B.(2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醢基】[[2·氟4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]甲基】胺基】5,5,5-三氟戊醯胺

步驟B，程序1. 向合適容器填充3-(4-(溴甲基）-3-氟苯基）-1，2,4-噁二嗓 (492.14 g，1.10當量，1.914 mol)、（R)-2-(4-氣苯基磺醯胺 135297.doc -69- 200927099 * 基>5,5,5-三氟戊醯胺（600 g，〗.〇〇當量；174 m〇i)、碳酸 絶（312.22 g ’ 0.55當量；〇·98则1)、磁化四正丁基錢 (64.29 g ’ 0.10 當量；0.17 mm〇i)及乙腈（9 mL/g ; 5,4 L)。 將夾套加熱至40°C (内部38。〇。藉由HPLC監控反應直至 (R)-2-(4-氣苯基磺醯胺基）_5,5,5_三氟戊醯胺為<5 AP。使 谷器冷卻至20 C之内部溫度且添加水（5.4 L)。分離各相且 富含產物層處於頂部。廢棄底層。經18分鐘填充水（3 7 L)，且使反應在20 C下維持20 h且隨後過濾。向容器添加 & 水（6 L)且攪拌以幫助轉移黏附於攪拌器及容器壁之固體。 用沖洗反應器所用的水洗滌粗餅一次。在5〇。〇下真空托盤 乾燥粗餅。乾燥粗餅重699 g。將該餅轉移至1〇 l反應器且 填充THF(2.025 L)，之後填充胲溶液（於水中5〇%)(42.97 mL ’ 0·40當量’ 0.696 mol)。加熱反應器夾套至40〇c。藉 由HPLC監控反應直至（R)_2-(4-氣-Ν·(4-氰基-2-氟苄基）苯 基續醯胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺為<〇.4 ΑΡ。將反應冷卻至 20°C ’添加水（2 L)且將反應在2〇°C下攪拌30分鐘。分離各 9 相且用庚烧（8 L)處理有機相同時攪拌且反應物成為油狀， 隨後沈澱。使漿料在20〇C下靜置2 h，過濾反應且用庚烷（2 L)洗務濾餅。在40-50。(：下真空托盤乾燥粗濾餅且在乾燥至 <1°/。乾燥失重之後稱重為613 g。將粗產物隨MeOH(3.678 L)及MeCN(1.226 L)—起轉移回容器。將夾套加熱至 6〇°C (内部52°C )以實現完全溶解，且在彼溫度下緩慢添加 水（2.023 L) ’維持内部溫度> 50°C。當水添加完成時，經4 小時將溶液冷卻至15。(：之内部溫度同時出現結晶。再填充 135297.doc •70- 200927099 水至反應器（400 mL)且過濾反應並使母液返回容器。將母 液擾拌2分鐘以釋放容器中之任何黏附產物。用母液、之 後用庚烧（1.500 L)洗蘇粗據餅。在40-50。〇下真空托盤乾燥 產物直至乾燥失重<0.5%，得到呈發亮、奶白色固體狀之 (2R)-2_[[(4-氣苯基）磺醯基]噁二唑-3-基）苯 基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺（577 6 g，產率63 76 %)。 步驟B，程序2. 向合適容器中添加（R)-2-(4-氣苯基磺醯胺基）_5,5,5_三氟 戊醯胺（2.68 1^，7.77 111〇1，1當量）、3_(4_(溴甲基）_3_氟苯 基）-1’2,4-嗯二吐（2_00 kg，7·78 mol，1 當量）、碳酸鉋 (1·65 kg，5.06 mol，0.65 當量）、磁化四丁基録（〇29 kg， 。^则卜…當量认乙腈⑴力^七川“卜將反應加熱 至35 C直至HPLC顯示反應完成（藉由HpLC測得3_(4_(溴甲 基）-3-氟苯基）-1，2,4-噁二唑< 〇·5相對Αρ)β將反應冷卻至 15 C且添加水（10.72 L，4 L/kg)並伴隨攪拌，之後添加冰 乙酸（0.22 kg)以使反應之pH值達到<6 5。停止攪拌且分離 各相（頂層含有產物）。將甲苯（26.8kg，31 L，1〇kg/kg)， 之後鹽水溶液（20% w/w，6.39 kg , 2 L/kg)添加至富含產 物層且分離各層（頂層含有產物在約5〇。〇下真空毫 巴)蒸餾混合物直至移除乙腈。若需要則在蒸餾之後用額 外甲苯調整濃度，以確保反應器中之總體積為約i〇L/kg。 填充異丙醇（0.48 kg，0.2 L/kg)且將批料冷卻至15。〇以起始 結晶。過滤所得漿料且用冷甲苯（18 65 kg，2156 ^，8 L/kg)洗滌。在5(TC下真空托盤乾燥粗濾餅直至乾燥失重 135297.doc -71 - 200927099 <1.0 % °將乾濾餅隨異丙醇（27 34 kg，34.8 L，13 L/kg)及 胲（5〇°/o水溶液，0.05 kg，1.51 mol，0.2當量）一起添加至 100 L反應器。將混合物加熱至65。〇且藉由HPLC監控直至 (R)-2-(4·氣-Ν-(4·氰基-2-氟苄基）苯基磺醯胺基）_5,5,5_三 氟戊酿胺為<0.4 ΑΡ。隨後蒸餾（鍋溫度約50。(：，真空300毫 巴）反應物直至反應物體積為原有體積之約6〇%。填充乙腈 (5·3ό kg，2 L/kg)且使反應溫度升高至70°C以達到完全溶 解。緩慢填充水（11.26 L，4.2 L/kg)，同時維持反應溫度 >65°C °經2小時使反應冷卻至15。〇且出現結晶。過濾漿料 且用冷異丙醇水溶液洗滌（以體積計2:1之異丙醇（IPA): 水）。在真空烘箱中乾燥濾餅直至乾燥失重<1〇/。。隨後藉由 溶解於乙腈（2 L/kg，以乾燥濾餅進料量之重量計）及甲醇 (6 L/kg)使產物再結晶且隨後加熱至50°C。緩慢添加水（4 L/kg) ’維持反應溫度>50°c。經2小時使反應冷卻至15〇c。 過濾所得漿料且用甲醇：乙腈：水（6:2:4，5 L/kg)之溶液 洗滌以得到呈白色固體狀之（2R)-2-[[(4-氣苯基）績酿 基Π[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑-3-基）苯基]曱基]胺基]-5,5,5·三 氟戊醯胺（2.02 kg，產率50%)。 實例4 (2R)-2-丨[(4-氣苯基>磺醢基】【[2-氟-4-(l，2,4-噁二唑_3_基）苯 基】甲基】胺基】-5,5,5-三氟戊醮胺 步驟A. (2R)-2-【[(4-氣苯基）磺醮基】【(4-氰基-2-氟苯基）甲 基]胺基】-5,5,5-三氟戊醢胺 135297.doc -72- 200927099 1) K2C〇3 (2eq)

向反應器中填充（R)-2-(4-氣苯基磺醯胺基）_5,5,5_三氟戊 醯胺（3.444 kg)、碳酸鉀（2.774 kg)、溴化四丁基銨（0.484 kg)及4-(溴曱基）-3-氟苯甲腈（2.092 kg)。隨後填充乙酸乙

S旨（1 7.2 L)及水（3.44 L)且將批料加熱至5〇。〇直至藉由HPLC 測得反應完成（<1相對AP之起始材料）。反應通常在約丨5小 時内完成。將批料冷卻至15-2CTC且填充水（6.88 L)且分離 底層水相。填充磷酸二氫鈉之溶液（於水中0.2 M，2〇 66 L)且分離底層水相並測試pH值以確保其為<6 5。（注意： 若pH值>6.5 ’則可額外填充20.66 L 0,2 Μ磷酸二氫鈉溶液 且重複萃取及pH值量測。）隨後藉由恆容真空蒸餾交換溶 劑。將反應器置於真空（270 mmHg)下且將夾套加熱至75-80°C。一旦乙酸乙酯之蒸餾開始，就以與餾出物收集相同 之速率添加異丙醇（41.34 L)，且使總批料體積維持在恆定 水準。一旦異丙醇全部添加，就釋放真空且填充水（13 76 L) ^ 在添加水期間使批料溫度維持在約5 0 °C。隨後將批料冷卻 至15-20°C且過濾。用50% (v/v)異丙醇水溶液（4x21.0 kg) 洗務濕滤、餅且隨後在50C下真空乾燥以得到呈奶白色固想 狀之標題化合物（3.648 kg，產率78%)。lHNMR(300 Ml·lz， DMSO-d6) 6:ppm 1.42-1.55 (m} 1 Η) 1.80-1.93 (m, 1 Η) 2.00- 2·15 (m，2 Η) 4.44 (dd，《7=7.91，1.13 Hz, 1 Η) 4.68 (d, 135297.doc ·73· 200927099 、

7=17.71 Hz，1 Η) 4.99 (d，*7=17.71 Hz, 1 Η) 7.26 (s，1 Η) 7.50 (s，1 Η) 7.63-7.73 (m，4 Η) 7.78-7.87 (m，3 H)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) ppm 22.58-22.97 (m, 1 C) 29.96 (d, J=29.09 Hz, 1 C) 41.46 (d, /=5.49 Hz, 1 C), 57.86, 110.97, 111.45 (d, 7=10.43 Hz, 1 C), 117.58, 119.11 (d, • /=25.80 Hz, 1 C), 124.89, 128.53, 128.56, 129.21, 131.17, , 131.98，137.44，138.32，158.99 (d，7=247.54 Hz, 2 C),

170.25。19F NMR, (CDC13, 282 MHz) 6:-116.5, -65.9. IR O (KBr): 3443, 3342, 3210, 2955, 2245, 1699，1577, 1476, 1163 cm·1。 C19H16C1F4N303S 之分析計算：計算值：C，47.75 ; H， 3.37 ; N，8.79 ; S，6.71 ; F，15.90 ; C卜 7.41。實驗值： C，47.95 ; Η，3.31 ; N，8.67 ; S，6.72 ; F，15.59 ; Q，7.49。 步驟Β· (R)-2-(4-氯-Ν·(2-氟-4-(N’-羥基甲脒基）苄基）苯基 磺醮胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺 ❹

1)NH2OH MeOH 40-50 °C 2>水

向反應器中填充（2R)-2-[[(4-氣苯基）磺醯基][(扣氣基-2-氟苯基）甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺（399 g)及曱醇（1.6 L)，之後胲（於水中50%溶液，93 mL，1.8當量）。將混合 135297.doc • 74- 200927099 物加熱至45-50°C ’直至藉由HPLC測得反應完成（<0.15相 對AP之起始材料）。緩慢填充水（0.5 L)，維持批料溫度在 30-50°C之間。使批料靜置直至結晶開始且隨後填充水（2 7 L) °將批料冷卻至15_2〇。〇且過濾。用2:1 Me〇H :水（2 L) 洗務濾餅且隨後在5〇。〇下真空乾燥以得到呈白色固體狀之 標題化合物（415 g，產率 96%)。NMR (300 MHz， DMSO-d6) 5:ppm 1.43-1.64 (m, 1 H) 1.77-1.93 (m, 1 H) 1.93-2.17 (m, 2 H) 4.41 (dd, J=8.48, 6.03 Hz, 1 H) 4.60 (d,/=17.14 Hz, 1 H) 4.94 (d, 7=16.77 Hz, 1 H) 5.81-5.98 (m, 2 H) 7.19-7.27 (m, 1 H) 7.37-7.47 (m, 2 H) 7.52 (d, ^=4.14 Hz, 2 H) 7.64 (d, /=8.67,Hz, 2 H) 7.85 (d, J=8.85 Hz, 2 H) 9.71-9.83 (m, 1 H) » IR (KBr): 3491, 3379, 1680, 1651， 1592, 1433, 1343 。 C19Hi9C1F4N4〇4S 之分析計算：計算值：c，44.66 ; H， 3.74 ; N，10,96 ; S，6.27 ; F，14.87 ; Cl，6.94。實驗 值：C，44.90 ; Η，3·91 ; N，10.91 ; S，6.41 ; F， 15.21 ; CM，6.95。 步驟C. (2R)-2-[[(4-氯苯基）磺醢基】【[2-氟-4-(l，2,4-噁二 唑-3-基）苯基】甲基】胺基】-5,5,5-三氟戊醢胺

135297.doc -75- 200927099 向反應器中填充（R)-2-(4-氣-N-(2-氟-4-(N'-羥基甲脒基） 苄基）-苯基磺醯胺基）-5,5,5-三氟戊醯胺（246 g)，之後無水 乙腈（509 mL)、原甲酸三乙酯（12〇 mL)及三氟乙酸（7 mL)。 將溶液加熱至40-50°C，直至藉由HPLC測得反應完成 (<0.15相對八？之起始材料）。將甲醇（1481^)以單份添加， • 之後添加水（1.034 L) ’使批料維持在45-50。(：。隨後將批料 • 冷卻至I5·20。0且過濾。用2:6:5 MeCN:MeOU :水洗滌濾餅 且在50-60°C下真空托盤乾燥，得到呈白色固鱧狀之標題 © 化合物（228 g ’ 產率 9〇%)。丨H NMR，（CDC13，300 ΜΗζ) δ: 1.40-1.58 (m, 1 Η) 1.75-1.90 (m, 1 Η) 1.92-2.07 (m, 1 Η) 2.10-2.26 (m, 1 Η) 4.37 (dd, J=8.67, 6.22 Hz, 1 H) 4.48 (d, •7=15.64 Hz, 1 H) 4.64 (d，《7=15.82 Hz，1 H) 5.54 (s，1 H) 6.33 (s, 1 H) 7.44-7.54 (m, 2 H) 7.62 (t, /=7.72 Hz, 1 H) 7.68-7.76 (m，3 H) 7.85 (dd，《7=7.91，1.51 Hz，1 H) 8.76 (s， 1 H) 〇 13C NMR, (DMSO-d6, 75 MHz) δ: 170.34, 167.75, 165.80, 159.64 (d, 7=244.5 Hz, 1 C), 138.19, 137.64, ❹ 131.25 (d, /=3.75 Hz, 1C), 129.31, 129.23, 129.05 (d, 7=14.25 Hz, 1C), 126.74 (q, J=274.5 Hz, 1C), 126.91, • 126.80, 123.12 (d, /=3.75 Hz, 1C), 113.7 (d, /=24.0 Hz, 1 • C), 57.92, 41.38 (d, /=4.5 Hz, 1 C), 30.04 (d, J=30.0 Hz, 1 C)，22.90。19F NMR，（CDC13, 282 MHz) δ:-116·3, -66.5. IR (KBr): 3454，334，3286，2952，1705，1432，1325，1260, 1167, 1084, 828 cm·1。 C20H17ClF4N4O4S 之分析計算：計算值：C，46.11 ; H， 135297.doc -76- 200927099 3.29 ; N，10·71 ; S，6.15 ; F，14.58 ; α，6.80。實驗值： C，46.06 ; Η，3.24 ; Ν，10.71 ; S，6.25 ; F，14.60 ; α， 6.88。

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Claims (1)

1. 200927099 * 十、申請專利範圍·· 1. 一種化合物，其為（2R)-2-[[(4-氯苯基）磺醯基][[2-氟-4-0,2,4-噁二唑基）苯基]甲基]胺基]_5,5,5-三氟戊醯胺。 2· 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之（2R)-2-[[(4-氯苯 基）磺醯基][[2-氟-4-(1，2,4-噁二唑-3-基）苯基]曱基]胺 ‘ 基]-5,5,5-三氟戊醯胺以及醫藥學上可接受之佐劑、載劑- ' 或稀釋劑。 t 3. 一種（2R)-2-[[(4-氯苯基）磺醯基][[2-氟·4-(1，2,4-噁二嗤 〇 3·基)苯基]甲基]胺基]-5,5,5-三氟戊醯胺之用途，其係用 於製備用以治療或延緩阿茲海默氏病（Alzheimei>|s disease)、腦類澱粉血管病變、輕度認知障礙及/或唐氏 症候群（Down syndrome)發作之藥物。 4. 如請求項3之用途，其中該藥物係用於治療阿兹海默氏 病。 〇 135297.doc 200927099 七、指定代表囷： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

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