TW200920406A - EBI3, DLX5, NPTX1 and CDKN3 for target genes of lung cancer therapy and diagnosis - Google Patents

EBI3, DLX5, NPTX1 and CDKN3 for target genes of lung cancer therapy and diagnosis Download PDF

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TW200920406A
TW200920406A TW097131917A TW97131917A TW200920406A TW 200920406 A TW200920406 A TW 200920406A TW 097131917 A TW097131917 A TW 097131917A TW 97131917 A TW97131917 A TW 97131917A TW 200920406 A TW200920406 A TW 200920406A
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Yataro Daigo
Shuichi Nakatsuru
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Oncotherapy Science Inc
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Description

200920406 九、發明說明： 【相關申請案之交互參照】 本申叫案基於2007年8月24曰提申之美國臨時申請 案序號No· 60/957, 95 6及2007年10月3日提申之美國臨 時申請案序號No_ 60/977, 360主張優惠，内容完整引入於 此作為參考。 【發明所屬之技術領域】 , 本發明係關於生物科學領域，尤關於癌症研究領域、 癌症診斷及癌症療法。尤其，本發明係關於用於偵測及診 -斷肺癌之方法，及用於治療及預防肺癌之方法。又，本發 .明係關於用於篩選一藥劑以供治療及/或預防肺癌之方法。 【先前技術】 肺癌為世界上最常見的癌症死亡原因之一，且非小細 胞肺癌（NSCLC)佔了此等案例的接近r. 丁.， ’（2001 )CA Cancer j CUn，5/·. 15_36,)。由於大 !:的二c直到進展階段方被診斷出來，傾向於為致命 :斷：即便最近在多重物理療法上的進展，總體料存活 :::留在約in。甚至最先進的療程，也對於 :的作用，增加賺整體5年存活率僅1(Μ5%。雖已： 人報告許多與肺癌發生與發展_㈣傳 = , Eur JCancer 解，係-緊急議題以供發展有㊣性更加瞭 巧双0 _法及分子標 過去1〇年的期間，新開發的細胞毒性藥劑’:包括
2125-993 7-PF 6 200920406 pac1itaxe1、docetaxe 1、gemcitabine 及 vinorelbine， 已顯示能對於罹患進展的NSCLC的病患提供多種治療選擇； 然而，各新的療程相較於cisplatin為主之療法，僅能提 供適度的存活益處（Kelly, K.，s/. (2001)J Clin Oncol, ϋ· 3210-8·)。最近，分子標靶藥劑，包括抗EGFR或抗VEGF 單 株抗體 、 cetuximab(Erbitux)或 BevacizumabUvastin)’及EGFR酪胺酸激酶之小分子抑制 劑，例如 gefitinib(Iressa)及 erlotinib(Tarceva)，已
被審查及/或核准供臨床用途（Giacc〇ne, G. ⑶L 23. 3235 3242(2005)；Sridhar, S.S., Lancet Oncol. 4： 397-406(2003)；Pal, S. K. and Pegram, M. AntiCancer Drugs 16· 483-494(2005))。雖此等藥劑對於再發性nsclc 呈現T程度的活性，能接受一存活益處的病患數仍有限。 至於^斷用，數種針對肺癌之腫瘤標記，包括NSE、CEA、 CYFRA21-1及Pr〇GRp，目前已使用於臨床設定％〜如， G:A、Chen’ β·Κ. Shin);然而’其在早期檢測癌症及預測 :床後果的用處仍非常有限’主要歸因於低靈敏度及，或專 二因發現高靈敏度及專一性癌症生物標記，能幫 助b床學家診斷及監控 户瘆f畋, 疋菜心而要的。因此，新的 ^ 更八、擇丨生及有效之分子標靶藥劑及 记，為熱切被期待的。 樂J及 些證據顯示腫瘤細胞，在分化的特 各組織學類型表 纟奴表現針對 胞表面及分= 表面及/或分泌標記。由於細 蛋白質被認為是免疫機制及藥物傳遞系統較
2125-993 7-PF 200920406 容易接近的，因此鑑別此等類型的蛋白質，在開發新穎的 診斷及治療策略上是重要的初步步驟。再者，使用cDNA微 陣列技術糸統性地分析數千種基因之表現程度，提供了鑑 別參與癌症形成路徑之未知分子的一種有效方法，並且能 夠找出用於開發新病的抗癌藥物及腫瘤生物標記的候選標 把(Kikuchi, T·， et al·， 〇nc〇gene 22: 2192-2205(2003);Kikuchi, T., etal., IntJ Oncol. 28: ,799-805(2006);Kakiuchi, S., et al., Mol Cancer Res. 1 : 485-499(2003);Kakiuchi, S. , et al., Hum Mol Genet. • 13： 3029-3043(2004);Taniwaki M. , et al., Int J Oncol. .29: 567-575(2006);Yamabuki. T., et al., Int J Oncol. 28 : 1375-1384(2006))。本案發明人藉由在含27,648基 因之cDNA微陣列上，使用從1 〇 1個肺癌組織以雷射捕捉微 切片法（laser-capture microdissecticm)製備之腫瘤細胞 純群體’分析NSCLC細胞之全基因體表現輪廓，以分離用 ^ 於診斷、治療及預防NSCLC之新穎的分子標靶的企圖，已 在進行中（Kikuchi’ T., et a 1. , Oncogene 22: 2192-2205(2003);Kikuchi, T. , etal., IntJ Oncol. 28: 799-805 (2006 );Kakiuchi, S. , etal., Hum Mol Genet. 13: 3029-3043(2004);Taniwaki M. , et al., Int J Oncol. 29: 567-575(2006))。為驗證各基因產物在生物學及臨床病理 學的重要性’本案發明人已以rNa干擾（RNAi)技術實施一 巧床肺癌材料之腫瘤-組織微陣列分析組合分析（Ishikawa, Ν·， et al.， Clin Cancer Res. 10 ； 2125-9937-PF 8 200920406 8363-8370(2004);Ishikawa, N., etal., Cancer Res. 65 : 9176-9184(2005);Ishikawa, N. , etal., Cancer Sci. 97 : 737-745(2006 );Kato, T. , et a 1., Cancer Res. 65: 5638-5646(2005);Kato T, et al., Clin. Cancer Res. 13: 434-442. (2007);Furukawa, C. , etal., Cancer Res. 65 : 7102-7110(2005);Suzuki, C.， Cancer Res. 63 7038-7041(2003);Suzuki, C.， Cancer Res. 65 11314-11325(2005);Suzuki, C., etal., Mol Cancer Ther. 6: 542-551(2007);Takahashi K, et al., Cancer Res. 66: 9408-941 9 (2006);, Hayama, S. , etal., Cancer Res. 66 : 10339-10348(2006);Hayama S, et al., Cancer Res. 67: 4113-4122(2007);Yamabuki T, et al., Cancer Res. 67 : 2517-2525(2007))。 從此系統性方法，已鑑別出一些基因在某些癌症中為 過度表現。參見例如：W0 2004/31413、W0 2004/31409、 W0 2007/13665及WO/2007/13671，其内容引入於此作為參 考。在此，本案發明人注重在4個基因並進一步調查；一
Epstein-Barr 病毒誘導基因 3(EBI3)(SEQ ID NO l;GenBank登記編號：NM_005755);—分泌的糖蛋白質， distal-less homeobox 5(DLX5)(SEQ ID NO 3;GenBank 登 記編號：BC006226 ) ; eye 1 in-依存性激酶抑制劑 3(CDKN3;alias KAP1)(SEQ ID NO 5;GenBank 登記編號：
L27711);及 Neuronal pentraxin I(NPTX1)(SEQ ID NO * » 78 ; GenBank 登記編號：NM_002522. 2 或 GenBank 登記編號: 2125-9937-PF 9 200920406 NM_002522)。 EBI 3基因表現最先是在於體外經EBV轉形之B細胞 株被注意到（Devergne 0， et al. , J Virol 70: 1143-1153(1996))。EB 13 為一 IL-27 之成分，係藉由與 p28 ’ 一 IL-12 p35-相關次單元，進行雜二聚化形成（pf ianz S，et al.，Immunity 16: 779- 90(2002))。IL-27 據相信 在Th 1免疫反應起始化扮演重要角色，該起始化對於以 IFN-gamma誘導之免疫反應為必要的。另一方面，最近報告 顯示’於人類孕期中，胎盤的絨毛命滋養葉胞層細胞 (ehraWy/oi/s 發現到 EBI3 表現 - (Devergne 0, et al., Am J Pathol 159: 1 763-76(2001 )) 1 且EBI3可能調節母體-胎盤免疫關係，例如母體免疫寬容。 雖最近報告人類惡性血液病中過度表現EBI3(Larousserie, F.， et al.， Am J Pathol. 166: 1217-1228(2005)，
Niedobitek G， et al.， J Pathol 198: 310-316(2002))， , 其在此等腫瘤之功能性角色及EBI3參與人類固體腫瘤形 成，尚未被報告。
Homeobox基因為轉錄因子，在演化上歧異的物種的發 展上具基礎的重要性。Dlx基因之冗餘功能，被推論由於其 近乎完全相同的homeodomain所致，而其各自獨特的功能， 被推論由於在其他結構域中，其胺基酸序列之歧異（Liu JK， et al·’ Dev Dyn 210: 498-512(1997))。使 homeobox 基 因f活，言發生許多先天的畸形及發展出癌症（D〇wning
et al.’ Cancer Cell 2: 437-45 ( 2002 ))。DLX5 被認為一 2125-9937-PF 10 200920406 主要調節蛋白質’對於起始化參予成骨細胞分化之曝流為 為必要，且在調節哺乳動物肢發展具關鍵角色，據證明， Dlx5及Dlx6之標靶破壞或脫落，會造成骨骼及内耳的發育 異名’及顱面殘缺（R〇ble(j〇 rf, et al.，基因Dev 16: 1 089-1 0 1 ( 2002))。然而，DLX5活化在癌症形成之角色， 尚未被解明。 NPTX1為一新§忍識的“ i〇ng pentraxin” 次家族中的 一成員（Goodman)。 NPTX1基因編碼為一分泌蛋白質，具 430個胺基酸’有一n末端訊息胜肽及c末端pentraxin 結構域。NPTX1被鑑別為一大鼠蛋白質，其調控攝取突觸材 料和犬觸月蛇毋毋素，taipoxin。“long pentraxins” ， 一新認識的蛋白質的次家族，具數種結構性及功能性特 徵’可能在促進興奮性突觸形成和突觸重塑扮演一角色 (SchlirngeruKirkpatrick)。此次家族之成員’包括 Νρτχι 及ΝΡΤΧ2,均與神經原pentraxin受體（NpTXR)交互作用 (Schlimgen;Kirkpatrick;Goodman;Dodds)，且具超加成 (superadditive)穿觸形成活性。再者，該發明人已發現 到，NPTX1可用於作為肺癌之血清學的標記或預後的標記 (W02008/23840)。然而 long pentraxins”在癌症形成 的角色’及其於哺乳動物細胞之功能，尚未被解明。 CDKN3最先被鑑別為一 G1及s期雙專一性蛋白質磷解 連結’且參與細胞週期調節 75： ^91-803(1993)；Hannon, 酶’其與cdk2及/或Cdc2連< (Gyuris, J., et al., Cell 75： et al.， Proc Natl Acad Sci USA. gj
2125-9937-PF 11 200920406 1731-1735(1994))。完全活化cdk2，需要填酸化Thrl 60及 去磷酸化Thrl4及Tyrl5。結合cyclin A至cdk2抑制去磷 酸化Thrl60，但是當cycl in A降解或分離，CDKN3可以僅 去填酸化 cdk2(Poon RY and Hunter T., Science 270: 90-93(1995))· 雖先前報告顯示CDKN3於細胞週期控制 之功能性角色’其對於細胞增殖之貢獻尚未被報告。雖然 先前已在乳癌及前列腺癌中報告過CDKN3過度表現（Lee, S.W·， et al., Mol Cell Biol. 20: 1723-1732(2000))， CDKN3過度表現促進肺癌進展的機制尚不明。 另一方面，真核生物轉譯延長因子 1 delta(EF-ldelta)(SEQ ID NO 7;GenBank 登記編號： BC 009907)為延長因子-1複合體之一成分，其構成一群核 苷酸交換蛋白質’能夠結合5’〜鳥苷三磷酸（GTP)及胺基醯 基- tRNA，並造成在80S核糖體上胺基醯基-tRNA之密碼子 依存性取代’誘導蛋白質合成之胜肽鏈延長（Riis，B.，et al., Trends Biochem Sci. 1 5 : 420-424( 1 990) ；Proud, C. G. Mol Biol Rep. 1 9: 1 61-1 70( 1 994))。EF-ldelta 已被鑑別 及定性為一 cadmium-回應性原致癌基因（joseph p.，et al., J Biol Chem. 277: 6131-61 36(2002))。最近的報告指出， EF-ldelta mRNA在食道癌組織過度表現，並且與淋巴節轉 移、進展疾病階段及不良預後相關（〇gawa, K.，et al.，Br J癌症91: 282-286(2004))。因此，更為完全了解活化 EF-1路徑在癌症之.角色，可能導引開發針對癌症治療有效 的新類型抑制劑。 2125-9937-PF 12 200920406 本發明指出該技術領域之需求，針對改善組合物及方 法供：癌診斷及治療’㉟由開發參與癌症形成之路徑的分 子月匕作為或揭開供開發新賴抗癌藥物及腫瘤生 候選標靶。 刃^-己之 【發明内容】 如上所述，本發明係關於4個基因，εβι3、虬Κ、⑽ 及咖，及其在肺癌形成所㈣之角色。因此，本發明係 關於用於偵測、診斷、^療及/或預㈣癌之新m合物及 方法，及用於篩選供其使用之有用藥劑之方法。 尤其，本發明係基於發現包含特定序列之雙股分子（尤 其 ’ SEQ ID N0: 18、20、、ςι 9 51、84及85)，對於抑制肺 癌細胞生長為有效。呈艘；a 八體而δ本發明提供標靶於eBI3、
NPTXR、CDKN3 或 EF-ldelta 基 ri 夕 I α 以基因之小型干擾MA(siRNAS)。 此等雙股分子可利用於單離壯能 早離狀態或編碼於載體，並從該載 體表現。因此，本發明之一目的 7兩徒供此種雙股分子及載 體’及表現該等之寄主細胞。 於一態樣，本發明接供用#知„ 杈供用於抑制細胞生長及治療肺癌 之方法，係藉由投予本發明之雙 又机刀子或載體給一需要之 個體。此種方法包含對於一個體.早6 a 1U體杈予包含1種以上該雙股 分子或載體之組合物。 於另一態樣，本發明接你_用#、Λ Λ a奴供用於治療癌症之組合物，包 含本發明之雙股分子或載體至少1種以上。 於又另一態樣，本發明提# 一 # « 月捉伢種Φ斷或決定一個體對 於肺癌之易染病體質的方法，藉由 精田决疋一病患來源之生物
2125-9937-PF 13 200920406 =中之_、DLX5、及/或c則3之表現程 於此基因之正常控制組水平，增加該基因"種以上之表 現程度，代表該個體罹患或有發展成肺癌之風險。 又’本發明係關於發現EBI3、_、c^N3及/或 elta之高表現程度，與不佳存活率相關 明提供一種用於評量或決定串肺.之广* 本毛 忒决疋患肺癌之病患之預後的方法， i括以下步驟：偵測擇自EBI3、DU5、咖3及EF — 中1種以上基因之表現程度’與預定之參考表現程度比較， 並由其間差異，決定該病患之預後。 在初期腫瘤移除後’顯示則表現程度已有下降。因 此’本發明提供一種用於監控治療或評量診斷為肺癌之個 體之療效的方該方法包括以下步驟:決定治療前後之 則表現程度。治療後觀表現程度之降低，相關於有效 的治療。 發現肺癌病患血液中則水平上升，對於本發明為新 穎的y匕’本發明提供-種用於診斷-個體中肺癌之方 人匕括以下步驟：決定一個體來源之血液樣本中的 ♦現程度t匕較此水平與參考樣本通常為正常控制組 中之水平。樣本中之高EBI3表現程度，代表該個體羅患或 有發展成肺癌之風險。 於又態樣，本發明提供一種篩選治療及/或預防肺癌 之化合物的方法。此化合物可結合於_、DLX5、及/或 CDKN3delta 基因’或，低 EBI.3、DU5、及/或 基因 之生物活性，或降低表現邙13、DLX5、及/或CMN3基因或
2125-9937-PF 14 200920406 代理EBI3、DLX5、及/或CD〇3基因之報告基因表現。又， 抑制 CMN3 及 VRS、EF_lalfa、EF]beta、ειμ 找職或 EF-ldelta，或NPTX1及阶7〇間結合之化合物，預期會降 低肺癌症狀。尤其，抑制含EF_lgamma之胺基酸殘基”至 160之片段及CDKN3間結合之化合物，可由本發明之方法鐘 別。 於又一態樣，本發明提供用於治療及/或預防一個體中 之肺癌之方法，係藉由對一需要的個體投予一 EF_丨
大變體，具顯性抑制（d〇minant negative)作用，或編碼為 此一突變體之多核苷酸。此一 EF_ldelta突變體較佳包括 一胺基酸序列，包括一 CDKN3結合區，勿如包括所有或部 分EF-ldelta之白胺酸拉鏈之部分EF —ldeHa蛋白質（見 圖20A)。於一較佳實施形態，該EF-ldel ta突變體具有胺 基酸序列SEQ ID N0: 6卜該EF-ldelta突變體可以或具 以下通式：[R]-[D]，其中[R]為一膜傳導劑，[D；]為一多胜 肽’具胺基酸序列SEQ ID Ν0: 61。該膜傳導劑可選自： 多精胺酸；
Tat / RKKRRQRRR/SEQ ID NO: 63;
Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO： 64; Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO： 65； Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO: 66; MAP(模型兩親媒性胜肽）/ KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO: 67; 2125-9937-PF 15 200920406 K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO: 68;
Ku70 / VPMLK/SEQ ID NO: 69;
Ku70 / PMLKE/SEQ ID NO: 70;
Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO: 71; pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO: 72;
Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO: 73; SynBl / RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO: 74; ^ Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO: 75;及 HN-1 / TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO: 76 • 於又一態樣，本發明提供一抗體，結合於NPTX1片段。 此抗體具一中和活性。於一態樣，本發明提供一種治療或 預防肺癌之方法，係投予此抗體。 熟悉此項領域之人士應瞭解，本發明1種以上態樣可 符合某些目標，而1種以上其他態樣，可符合其他目標。 各目標可以對本發明每一態樣，在所有面向中不同等適 用。因此，前述目標可以在本發明任一態樣視為替代。此 等及其他本發明特色目標，將於閱讀以下詳細敘述及附圖 及實施例而更顯明。然而，應瞭解以上發明内容及以下詳 細敘述，均非限制本發明或其他本發明之選擇實施形態。 【實施方式】 雖類似或等同此述所述方法及材料可用於實施或測試 本發明實施形態，以下敘述較佳方法及材料。然而，應瞭 • · 解，本發明不限於此處敘述之特定分子、組合物、方法或 2125-993 7-PF 16 200920406 實驗步驟’因此等會依例行實驗及最適化而不同。亦應瞭 :到’用於敘述之用語係僅用來敘述特定版本或實：形 態，非意欲限制本發明範圍，且將僅由附帶之申請專利二 圍所限制。 ％ ^ 除非另外定義，所有在此使用之技術及科學用語，具 :發明所屬技術領域中具通常知識者通用瞭解之相。同： 意。然而’若有衝突，由本說明書包括之定義為準。因此， 於本發明内容，應用以下定義. 定義： 此處使用之“一 (a)”、“一 (an)” 及“該(the)”， 除非另外指明，意指“至少一”。 此處使用之用語“生物學樣本，，係指有機體整體或其 組織、細胞或成分部分(例如體液’包括但不限於血液、黏 液、淋巴液、關節液、腦脊液、唾液、羊水、羊水腾帶血 液、尿液、陰道液和精液）之副組。“生物學樣本，，尚係指 一勻漿液、抽出物、細胞培養或組織培養，係由完整有= 體或其細胞、組織或成分部分之副組，或一部或部分所製 備。最後“生物學樣本，，係指—培養基，例如#養液或凝 膠’其中-有機體已增豸，包含細胞成分，例如蛋白質或 多核苷酸。 ' 用語”多核苦酸’，、”募核苦酸，，“核苦酸，，、，，核 酸”及“核酸分子”，在此可互換地使用，意指核酸殘基 之聚合物’除非另有指明，以其通用可接受之單字母碼代 表。用語應用於核酸(核苦酸)聚合物，其中丄種以上核酸
2125-9937-PF 200920406 由酯鍵鍵結。該核酸聚合物，可由DNA、RNA或其組合構成， 且包含天然發生及非天然發生的核酸聚合物。 用語”多胜肽’’、”胜肽”及“蛋白質”，在此可互 換地使用，意指胺基酸殘基之聚合物。用語應用於胺基酸 聚合物，其中，1種以上胺基酸殘基為一經修飾殘基，或一 非天然發生之殘基，例如天然發生之胺基酸及天然發生胺 基酸聚合物之一人工化學擬似物。 基因或蛋白質 ¢:. 本發明中之核酸及基因之多胜肽序列，以如下號焉_ ' 示，但不限於此等； EBI3: SEQ ID NO: 1 及 2; DLX5: SEQ ID NO: 3 及 4; CDKN3: SEQ ID N(h 5 及 6; E.F-ldelta: SEQ ID NO: 7 及 8;
ValRS: SEQ ID NO·· 26 或 28 及 27 或 29; EF-lbeta: SEQ ID NO: 30 及 31; EF-lgamma: SEQ ID NO: 32 及 33; EF-lalfa: SEQ ID NO: 57 或 90 及 58 或 91;
Akt: SEQ ID NO: 59 及 60; NPTX1 : SEQ ID NO: 78 及 79，·及 NPTXR: SEQ ID NO: 86 及 87 再者，該序列資料係可經由以下登記編號取得。 EBI3: NM_005755; DLX5: BC006226; 2125-9937-PF 18 200920406 CDKN3: L27711; EF-ldelta: BC009907；
ValRS: NM_006295 或 BC012808; EF-lbeta: NM_001959; EF-lgamma: BC009865; EF-lalfa: NM_001402 或 NM—001958; NPm:SEQIDNO:NM_002522 4NM—002522.2;& NPTXR: SEQ ID NO: NM_014293 依照本發明一態樣，功能均等物亦被認為是上述 胜肽”。在此，蛋白質之一 “功能均等物，，為具等同 多 於該 蛋白質之生物活性的一多胜肽 即’任意保留生物學能力 之多胜肽 可使用為本發明中之此一功能均等物。此功能 均等物包括其巾！種以上胺基酸經取代、刪除、加成或插 入至天然發生之蛋白質之胺基酸序列$。或者，該多胜肽 可包括—胺基酸序列，其對對應的蛋白質序列具至少約m 同源性（亦稱為序列同 性。於其他實施形態 夕核皆酸在嚴苛條件 列0 —性）’更佳為至少約9〇%至95%同源 ，該多胜肽可由一多核苷酸編碼，該 雜交於該基因之天然發生核苷酸序 本發明之多胜肽，可在胺基酸序列、分子量、等電點、 ^在或不存在糖鏈，或形式，取決於使用於生產之細胞或 等η π ί利用之純化方法而有變異。然而，只要其在功能 人類蛋白質，即落在本發明範圍内。 °嚴可（雜交）條件，，係指在該條件下，—核酸分
2125-9937-PF 19 200920406 子將雜交於其標乾序列，通常為一核酸之複合混合物，但 檢測不到對其他序列雜交。嚴苛條件為序列依存性，且在 不同環境下不同。舫且$ + > 長序列在較南溫度專—性雜交。對於 核酸雜交之詳細指引見於Tijssen，Technigues ιη
Bioche^stry and Molecular Biology-Hybr.dization with Nucleic Probes、，，η',。. , rooes Overview of principles of ^r.dizat^n and th0 strategy 〇f ^161〇 p_s”（1 993)。-般而言，嚴苛條件選擇較在限定離子 強度pH，針對特定序列之熱溶點㈤低約5_1〇度為 _的互㈣絲探針雜交於標㈣料平衡（於限定離子 強度、PH’及核酸濃度)之溫度(當標靶序列過量，於〜， 50%的探針會於平衡佔據)。嚴苛條件亦可藉添加去安定化 劑例如甲醯胺而達到。對於選擇性或專一性雜交，陽性訊 號至少為背景值2倍’較佳背景值ig倍雜交。例示之嚴苛 雜交條件’包括以下：5〇%甲酿胺、5XSSC及1%SDS，溫 月於42C，或5xSSC、1%SDS，溫育於 及 0.1% SDS 於 50。〇洗滌。 於本發明之内容，針對離析編碼為功能等同於上述人 類蛋白質之多胜肽的DM，雜交條件可由熟悉此項技蔽之人 士例行選擇。例如，雜交可藉於68度c實施於預雜交3〇 分鐘以上’使用 “Rapid-hyb buffer” （Amersham 體 SHENCE)’添加一經標記之探針’並於68度c暖化“、時 以上。可實施以下洗滌步驟’例如於—低嚴苛條件一例 不之低嚴苛條件可包括42t:、2xsSC、G.1%SDS，M5〇
2125-9937-PF 20 200920406 C、2x SSC、0. 1 % SDS。尚度嚴苛條件較佳。例示之高度 嚴苛條件，可包括於室溫洗務3次2x SSC、〇 〇1% SDS達 20分鐘’然後於37度C於1XSSC、0.1%SDS洗務3次達20 分鐘’並於50度C於lx SSC、0. 1% SDS洗滌2次達20分 鐘。然而’有數個因子例如溫度及鹽濃度可能影響雜交嚴 苛度’熟悉技藝之人士，可適當選擇此等因子以達所要求 之嚴苛度。 一般而言’已知修飾一蛋白質中1個以上胺基酸不會 影響該蛋白質之功能。事實上，具經取代、刪除、插入及/ 或加成1個以上某個胺基酸序列之胺基酸殘基之突變或修 飾蛋白質，已知會保留原本的生物學活性（Mark et al.，
Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6(1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500(1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982))。因此，熟悉此 技藝之人士將瞭解到’對一胺基酸序列之個別的加成、刪 除、插入或取代’改變單一胺基酸或小百分比的胺基酸或 稱為“保守性修飾”’其中改變一蛋白質造成具類似功能 之蛋白質者，在本發明内容中為可接受的。 只要維持蛋白質活性，胺基酸突變之數目不特別限 定。然而’一般而言，較佳為改變胺基酸序列5%或更少。 因此，於一較佳實施形態，於此一突變體中欲突變的胺基 酸數，一般.而言為30個胺基酸或更少，較佳為20個胺基 酸或更少’更佳為1 〇個胺基酸或更少，更佳為6個胺基酸 2125-9937-PF 21 200920406 或更少，甚更佳3個胺基酸或更少。 欲突變之胺基酸殘基’較佳為突變成不同的胺基酸， 而該胺基酸側鏈性質為保守的（稱為保守性胺基酸取代之 過程）。胺基酸側鏈之性質之例為：疏水性胺基酸（A、丨、L、 M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸（R、D、N、C、E、Q、G、 Η、K、S、T)，及具以下官能基或共通之特性的側鏈者1旨 肪族側鏈（G、A、V、L、I、P);含羥基之側鏈（s、T、Y);含 硫原子之側鏈（C、Μ );含羧酸及醯胺之側鏈（D、Ν、Ε、Q ); 含鹼之側鏈（R、K、H);及含芳香族之側鏈（H、F、γ、w)。 提供功能類似胺基酸之保守性取代表，為該領域中為人周 知的。例如，以下8群各包含彼此為保守性取代之胺基酸： 1) 丙胺酸（A),甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)，谷胺酸（E); 3) 天冬醯胺酸（N)，谷醯胺（q); 4) 精胺酸（R)，離胺酸（κ); 5) 異白胺酸⑴，自胺酸（L)，甲硫胺酸（M)，綠胺酸 (V)； 6) 苯丙胺酸（F)，酪胺酸（Y)，色胺酸（w); 7) 絲胺酸（S)，異白胺酸（τ);及 8) 半胱胺酸（〇，甲硫胺酸⑷（參見例如…咖⑽，
Proteins 1984) ’ 此保守性修飾之多胜肽，包括於該蛋白質。然而不限 於此’且該蛋白質包括非保守性修飾，只要保留該蛋白質 之至少一生物活性。再者該經修鋅蛋白質不排除多形變里
2125-9937-PF 22 200920406 體、種間同源物，及由此等蛋白質之對偶基因編碼者。 又，本發明之基因包含多核*酸，其編瑪此蛋白質之 功能均等物。除了雜交，可利用基因放大方法，例如聚合 酶連鎖反應⑽）法，使用基於上述資訊的序列的合成的啟 動子，以離析編石馬為一功能性等同於該蛋白質之一多胜狀 的多核普酸。功能等同於人類基因及蛋白質之多核苦酸及 多胜肽，各正常對於原始核苷酸或胺基酸序列具一高同源 性。同同源性，一般指同源性40%以上，較佳60%以上， 更佳8G%以上，又更佳9Q%至㈣以上。特❹核普酸或多 胜肽之同源性，可由以下演算法決定：“WilburandUpman，
Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30(1983)” 。 抗碰： 此處使用之用語”抗體”，意欲包括免疫球蛋白及其 片段，專一性地對指定蛋白質或其胜肽反應。一抗體可包 括人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體、雙專一性抗體、人 類化抗體、融合於其他蛋白質或放射標記之抗體，及抗體 片& °再者’此處抗體係用於廣義，尤包含：完整單株抗體、 多株抗體、由至少2個完整抗體形成之多專一性抗體（例如 雙專一性抗體）’及抗體片段，只要該等顯示所望生物活 性° 一“抗體”代表所有類型（例如IgA、IgD、IgE、igG 及 IgM)。 本發明利用對抗EF-ldelta之CDKN3結合區之抗體 (於72-1 6 0aa位置），.以阻礙CDKN3及EF-ldelta間之結合 或父互作用。由於2基因均在肺癌中向上調控（圈16、17、
2125-993 7-PF 23 200920406 ⑽及19)’且該交互作用在肺癌細胞被決定（《 18及20)。 再者對抗NPTX1之抗體，少ώ 體在中和分泌ΝΡΤΧ1蛋白質及抑制 癌症細胞增殖有用（圖】B r m 、圃ί〇Β及〇。因此本發明抗體，對於治 療肺癌可能有用。此等抗體將由已知方法提供。依照本發 明使用之抗體之例示生產技術，將被敘述。 (〇多株抗 多株抗體較佳為藉由多次皮下㈤或腹㈣㈣ 相關抗原及佐劑，從動物得到。於本發明，抗原為ϋ 限於包含SEQIDN〇:88或89之多胜肽，或EF-ldelta之 圓3結合區，例如SEQidn〇: 6卜使用—雙功能或衍生 . T醞基嶒琥珀醯亞胺酯（經由半胱胺 酸殘基接合）、Ν -翔某 琥珀醯亞胺（經離胺酸殘基）、戊二 搭、琥轴酸酐、smR，N=C=NR，其中只及只為不^ 的烧基，將相關抗原接合至一對於欲免疫之物種為免疫原 性之蛋白質例如翁孔蟲戚血藍蛋自（keyhQie um⑽ hemocyanin，KLH)、血清白蛋白、|甲狀腺球蛋白（bovine thy⑽。bulin)或黃豆騰蛋白酶抑制劑，為有用的。 動物以抗原、免疫原性接合物或衍生物，藉由組合例 如100 meg或5 meg蛋白質岑接人从 貝次接5物（各對兔或小鼠）及3 倍體積的Freund完全佐劑’並以皮内注射該溶液於多個位 置，以免疫。i個月後，將動物以原胜肽或與一完全 佐劑之接合物量之1/5至1/10’追加皮下注射於多個位置。 於7至14天後，將動物抽血，將血清分析抗體力價。對動 物追加直到達力價高原。較佳地，將此動物以相同抗原之
2125-9937-PF 24 200920406 接合物追加免疫，但該抗原接合至一不同蛋白質及/或經由 一不同的交聯劑。 接合體亦可在重組細胞培養中以蛋白質融合體形式製 作。又，可適當使用聚集劑例如明礬，以增進免疫反應。 (ii)蕈枝抗饉： 單株抗體，從一群實質同質的抗體得到，即各抗體包 含的群體相同，例外可能天然發生小量突變。因此修飾“單 „ 株’意指該抗體非分離抗體之混合物。 例如，單株抗體可使用由Kohler G & Milstein C· Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7首先敘述之融合瘤法製作， 或由重組DMA方法（美國專利號碼4, 816, 567)製作。 於該融合瘤方法，將小鼠或其他適當的寄主動物例如 倉鼠依如上述免疫，以引出淋巴細胞，其產生或能產生專 一性結合於用於免疫之蛋白質的抗體。或者，可將淋巴細 胞於體外免疫。然後將淋巴細胞與骨髓瘤細胞使用一適當 、 的融δ劑例如聚乙一醇融合，以形成一融合瘤細胞（G〇d丨ng，
Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986))。 將因此製備之融合瘤細胞接種並生長於適當的培養 基，該培養基較佳包含1種以上物質其能抑制未融合之親 代骨髓瘤細胞生長或存活。例如，若親代骨髓瘤細胞缺乏 酵素次黃嘌呤-烏嘌呤磷醣基核苷轉移酶（hyp〇xanthine guanine phosphoribosyl transferase ， HGPRT 或 HPRT)， 則供融合瘤之培養基’一般將包括含次黃嘌呤、氨基喋呤
2125-993 7-PF 25 200920406 及胸腺嘧啶之培養基（HAT培養基），此等物質阻止HGpRT_ 欠缺細胞之生長。 較佳之骨髓瘤細胞，為有效率融合，支持選擇之抗體 生產細胞穩定高水平生產抗體，並且對培養基例如hat培 養基為敏感性者。其中，較佳之骨髓瘤細胞株，為鼠類骨 髓瘤細胞株’例如衍生自M0PC-21及MPC-11小鼠腫瘤者， 可從 Salk Institute Cell Distribution Center， San
Diego，California USA 得到，SP-2 或 X63-Ag8-653 細胞 可從 American Type Culture Collection， Manassas， V l rgl nl a, USA得到。人類骨髓瘤及小鼠-人類異骨髓瘤細 胞株亦已針對生產人類單株抗體敘etai.，j
Immunol. 1 984 Dec;133(6)：300 1-5;Brodeur et al.,
Monoclonal Anti body Production Techniques and
Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。 分析融合瘤細胞生長之培養基，檢測對抗抗原之單株 抗體生產。較佳地’以免疫沉殿或體外結合分析，來決定 由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合專一性，例如放射性 免疫分析（RIA)或酵素連結免疫吸附分析（ELISA)。 單株抗體之結合親和性，可例如藉由Munson PJ &
Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39 所 述30 Scatchard分析決定。 . 當鑑別出產生所望專一性、親和性及/或活性之抗體的 融合瘤細胞後’可將選殖體藉極限稀釋次選殖，並以標準
2125-9937-PF 26 200920406 方法使生長（Goding，M〇nocl〇nal Antib〇dies: principies and Practice， ρρ· 59_1〇3(AcademicPress， 1986))。此 用途之適當培養基，例如D_MEM或RpML_164〇培養基。此 外該融合瘤細胞可於動物體内以腹水腫瘤之形式生長。 由次選殖體分泌之單株抗體，適當地從培養基、腹水 液體或血清，以習知免疫球蛋白純化步驟分離，例如：蛋白 質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、電泳、透析，或親和層 析。 編碼為該單株抗體之DNA，可容易地離析並以習知步驟 定序（例如使用能專一性結合於編碼鼠類抗體之重及輕鏈 之基因的募核苷酸探針）。該融合瘤細胞提供較佳之該训A 來源。離析後，將DNA放入表現載體，然後轉染到寄主細 胞例如E· coli細胞、猴c〇s細胞、中國倉鼠卵巢（ch〇) ，-田胞或不會另產生免疫球蛋白蛋白質之骨髓瘤細胞内， 以在重、.且寄主細胞中合成單株抗體。在細菌中重組表現編 碼為抗體之DNA的評論文章，包括Skerra A. Cur
Immunol. 1993 Apr；5(2)：256-62 and Pluckthun A.
Immunol Rev_ 1992 Dec;130:151-88。 產生對抗EF-ldelta之CDKN3結合區（72_16〇aa位置） 之專一性抗體或抗體片段之方法，為篩選在細菌中，帶有 EF-ldelta.之CD〇3結合區（72 —16〇aa位置）之編碼免疫球 蛋白基因或其部分之表現庫。例如，完全Fab片段、Μ區 及Fv區，可使用噬菌體表現庫在細菌中表現。見例如，
ES, et al., Nature. 1 989 Oct 1 2 ； 341 (6242)：544-6；Huse 2125-9937-PF 27 200920406 WD, et al., Science. 1989 Dec 8;246(4935):1275-81; 及 McCafferty J, et al. , Nature. 1 990 Dec 6;348(6301):552_4.。師選具 EF-ldelta 之 CDKN3 結合區 (72-1 60aa位置）之庫’可鑑別與EF-ldelta之CDKN3結合 區（72-1 6Oaa位置）反應的免疫球蛋白片段。或者，可將 SCID-hu-小鼠（可從Genpharm得到）用於產生抗體或其片 段。 於另一實施形態，可從抗體噬菌體庫離析抗體或抗體 片段’該抗體嗟菌體庫使用敘述於McCaf f erty J，et a 1.，
Nature. 1990 Dec 6;348(6301 )：552-4;C1arkson T, etal., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8;及 Marks JD， et al., J MoL BioL, 222: 581-597(1991)J Mol Biol. 1991 Dec5;222(3):581-97之技術’敘述使用嗟菌體庫離析鼠類 及人類抗體。後來的出版品敘述以鏈調換（chain shuffHng) 生產高親和性（nM範圍）人類抗體（Marks JD， et al.，
Biotechnology(N Y). 1992 Ju1;1〇(7):779-83)，及重組 性感染’及體内重組’作為建構非常大嗟菌體庫之方法 (Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11 ; 21 (9): 2265-6)。因此，此等技術可作為替代傳統單株 抗體融合瘤技術，供離析單株抗體。 該DNA亦可經修飾，例如藉取代人類重及輕鏈不變結 構域之編碼序列代替同源之鼠類序列（美國專利號瑪 4, 81 6, 567jMorrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1 984 N〇V;81 (21 ):685；l-5)，或共價接合至免疫球蛋 2125-9937-PF 28 200920406 白編碼序列、全部或部分之編碼序列非免疫球蛋白多胜肽。 一般而言，此種非免疫球蛋白多胜肽係替代抗體之不 變結構域，或替代抗體之抗原組合部位之可變結構域，以 創造一嵌合二價抗體，其包含一具針對一抗原之抗原組合 部位，一另一具針對不同抗原之專一性的抗原組合部位。 (i i i)人類化抗艚： 用於人類化非人類抗體之方法，已在該技術領域被敘 述。較佳地，人類化抗體具1種以上從非人類的來源引入 的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常稱為“輸入，，殘 基，通ΐ從輪入可變結構域而來。人類化可藉取代人 類抗體之對應序列的高變異性區域序列，主要依照w丨 及共事人員之方法實施（jonesPT，eial.，Nature. 1986
May 29-Jun 4;321(6069):522-5;Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162)：323-7;Verhoeyen M, et al.，Science. 1 988 Mar 25;239(4847):1534-6)，。因此， 此種人類化’’抗體為嵌合抗體（美國專利號碼 4, 816, 567)，其中實質上少於一完整的人類可變結構域取 代成來自非人類物種之對應序列。實務上，人類化抗體通 常為將人類抗體之中，高變異區域殘基及可能一 殘基 取代成來自於嚅齒動物抗體之類似位置的殘基。 選擇人類可變結構域，包括用於製作人類化抗體之輕 鏈及重鏈，在減低抗原性方面非常重要。依照稱為“最佳 擬合（best-fit)’’方法，將嚅齒動物抗體之可變結構域之 序列，對已知人類可變結構域序列之完整已知庫篩選。最
2125-9937- PF 29 200920406 接近嗔齒動物序列之該人類序列，被接受作為針對人類化 抗體之人類框架區⑽（SimsMJ，etal•’ 随刪】Μ” AUgl5;m(4):2296_3()8;ChothiaC&LeskAMjM〇iBi〇i 順Aug 2〇;196⑷：9(n_17)。另一方法使用衍生自一輕 鏈或重鏈之特別次族群之所有人類抗體之_致序列所衍生
的特定框架區。該相同的框架可用於數種不同的人類化抗 體（Carter P，et al.，Pr〇c Natl % u s a MM
May 15;89a〇):4285_9;Presta LG, et ai > jimmun〇L 1993 Sep l;l51(5):2623-32)。 更重要者為，抗體經人類化為保留针對該抗原之高親 和及其他有利的生物學性質。為達成此目#，依昭—較佳 方法，藉由使用親代及人類化序列之三維模型，分析親代 序列及各種概念上人類化產品’製備人類化抗體 疫球蛋白模型為普通可得，且對該技術領域之人 ^ 的。電腦程式為可得的，其說明及展示選定之候M = =白序列可能的三維構造。檢查此等展示，可容分析㈣ 免疫球蛋白序列功能之殘基的可能^，即分㈣響结合 至其抗原之候選免疫球蛋白能力的殘基。以 口 擇邝殘基並組合來自接受者及輸入序列，以/ 選 特徵，例如對於標靶抗原之增 所望抗體 曰刀口的親和性。通常，古 異區域殘基直接且最實質參與影響抗原结纟。 阿又 ^1__人類抗艏： 乂作為人類化之替代選項，可產生人類抗體 則已可能產生基因轉殖動物(例如小氣），能在免疫下：不
2125-9937-PF 30 200920406 存在内生性免疫球蛋白生產下，生產完整曲目的人類抗 體。例如，已有人敘述於後合及生殖細胞變體小鼠同型合 子刪除抗體重鍵接合 賦丧。£(JH)基因，造成完全抑制内生性抗 體生產。將人類生殖細胞免疫球蛋白基因陣列轉移到此種 生殖細胞突變體小g 、主+ 士 & 』乳將造成在抗原挑戰時，生產人類抗 體。參見例如JakobovitsA，etal.，一⑴ U S A. 1 993 Mar 15 ; 90(6)：2551-5；Nature. 1 993 Mar 18;362(641 7)：255-8；Bruggemann M, etal., Year Immunol. 1 993;7:33-40;及美國專利號碼 5,591 669;5,589 369 及 5, 545, 807。 或者，噬菌體展示技術（McCafferty ;，etal·，Nature 1 990 Dec 6; 348(6301) :552-4)，可用於在體外從未經免疫 之捐出者得到之免疫球蛋白可變（v)結構域基因曲目，生產 人類抗體及抗體片段。依照此技術，抗體v結構域基因選 殖於框内（in-irame)至纖毛狀噬菌體之主要或次要包覆蛋 白質基因，例如Ml 3或fd，並在噬菌體微粒表面上，展示 成功能性抗體片段。由於該纖毛狀微粒包含噬菌體基因體 之一單股DNA副本，基於該抗體之功能性質的選擇，亦會 造成選擇編碼為展現該等性質之抗體的基因。因此該嗟菌 體模擬一些B細胞的性質。噬菌體展示，可以各種形式實 施；其評論，參見例如 Johnson KS & Chiswel 1 DJ. Cui·!* Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71。數種 V -基因區段之來源， 可用於噬菌體展示。
Clackson T, et al. , Nature. 1991 Aug 2125^9937-PF 31 200920406 1 5 ; 3 5 2 ( 6 3 3 6 ) : 6 2 4 - 8從衍生自經免疫小鼠之脾臟的小型隨 機V基因組合庫，單離抗〇xazo i〇ne抗體多樣化陣列。可 構建來自於未經免疫之人類捐出者的V基因曲目，且可基 本上使用 Marks JD，ei: al·， j m〇1 Biol. 1991 Dec 5;222(3):58卜97,或 Griffiths AD， etal·， EMBOJ. 1993
Feb ; 1 2 (2 ) : 72 5 - 3 4所述技術’離析針對一抗原多樣化陣列 之抗體（包括自體抗原）。亦參見美國專利號碼5, 565, 332 及 5, 573, 905。 人類抗體亦可在體外由經活化B細胞產生（見美國專利 號碼20 5，567，610及5，229，275)。較佳之使用SCID小鼠 產生人類抗體之方法，揭露於共有、共同未決申請案。 (v)抗饉>{段： 已有各種技術開發出來供生產抗體片段。傳統上，此 等片段經由蛋白水解消化完整抗體而得（參見例如 Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar;24(l-2):107-17；Brennan M, etal., Science. 1985 Jul 5;229(4708):81-3)。然而，此等片段現可直接由重組 寄主細胞生產。例如該抗體片段可從前述抗體噬菌體庫離 析。或者，可將Fab’ -SH片段直接從E. coli回收，並化 學偶合以形成F(ab’ ）2片段（Carter P， et al Biotechno 1 ogy (N Y)· 1992 Feb ;10(2):163-7)。依照另一 方法，可將F(ab’ ）2片段直接從重組寄主細胞培養物離 析。其他生產抗體片.段之技術，’對於熟悉技藝之人士為顯 明的。於其他實施形態，選項之抗體，為一單鏈Fv片段 2125-9937-PF 32 200920406 (scFv)。參見WO 93/1 6185;美國專利號碼5, 571，894及 5, 587, 458。該抗體片段亦可為一 “線形抗體”，例如美國 專利號碼N 〇. 5，6 41，8 7 0中所述。此線形抗體片段可為單專 一性或雙專一性。 lyi)非抗艚結合I白訾： 用語非抗體結合蛋白質或”非抗體配體，，或”抗 原結合蛋白質”可互變地意指使用非免疫球蛋白蛋白質 支架之抗體擬似物’包括adnect ins、avimers、單鏈多胜 肽結合分子，及類抗體結合肽擬似物（peptid〇mimei：ics)， 以下將更詳盡敘述。 已開發出其他以類似抗體之方式標靶且結合於標乾之 化合物。此等"抗體擬似物”使用非免疫球蛋白蛋白質支架 作為替代之針對抗體可變區域之蛋白質框架。 例如Ladner等人（美國專利號碼5, 260, 203)敘述單一 多胜肽鍵結合分子，具類似於聚集但分子分離之抗體的輕 及重鏈可變區域的結合專一性。該單鏈結合分子，包含由 一胜狀連接子連接之抗體的重及輕鏈可變區域兩者之抗原 結合位置’且將折疊成類似於該2胜肽抗體之結構。該單 鍵結合分子相較於習知抗體’展示數個優點，包括較小、 穩定性較大，且較容易改變。 Κυ 等人、Proc Matl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 ( 1 995 ))敘述依據細胞色素b562，對抗 體之替代物。Ku等人（ 1 995)產生一庫，其中細胞色素b562 之2個環隨機並被選擇以供結合胎牛血清白蛋白。該個別
2125-9937-PF 33 200920406 突變體被發現選擇性結合，類似抗BSA抗體。
Lipovsek # 乂（USPatNos. 6,818,418and7，1 1 5,396) 敘述一抗體擬似物，特色為一纖維連結蛋白（fibr〇nectin) 或類纖維連結蛋白（f i bronect i η)蛋白質支架及至少1種可 變環。以Adnectin知名的此等纖維連結蛋白（fibr〇nectin) 為主的抗體擬似物，顯現與天然或人工抗體相同的許多特 徵’包括南親和性’及針對任意經標乾配體之專一性。任 _ 何發生新或改良結合蛋白質之技術，可使用此等抗體擬似 此等纖維連結蛋白為主之抗體擬似物之結構，類似於 IgG重鏈之可變區結構。因此，此等擬似物展示與天然抗 體天生類似的抗原結合性質及親和性。再者，此等纖維連 結蛋白為主之抗體擬似物相較於抗體及抗體片段，顯現某 些優點。例如，此等抗體擬似物不依賴雙硫鍵供天然折疊 穩定性，因此在正常會破壞抗體之條件下為穩定。此外， 荨纖維連結蛋白為主之抗體擬似物結構類似於I 重 鏈，因此％隨機化及曳步（shuffling)可在體外採用，其類 似於在體内，抗體之親和性成熟。
荨人 ^Proc Natl Acad Sc i USA 96(5)·1898-1 903( 1 999))敘述一抗體擬似物，基於一 環用在隨機突變， 異體顯示與 ]iP〇c^in (Ant1calin®)〇Lip〇calins φ beta-barrel 及4個高度可變環在蛋白質末端所構成。Beste(i999)，將 ’並選擇供結，例如f 1 u〇rescein。3個變 »
1個變異體顯示
2125-9937-PF 34 200920406 類似抗flU〇rescein抗體之結合。再者，分析顯示所有的 隨機化位置為可變，代表AntlcaUn⑧為適於使用於抗體替 代物。
Antical ins®為小、單鍵胜肽，通常介於16〇及18〇殘 基間，較抗體^供數個優點，包括生產成本降低，保存穩 定性增加’免疫學反應減少。
Hamilton #乂（美國專利號碼5,770,380)敘述一合成 抗體擬似物，使用該剛性、非胜肽有機支架calixarene， 附著多重可變胜肽環作為結合位置。該胜肽環彼此均從 cal lxarene同一側幾何地突出◦由於此幾何構造，所有環 可供結合，增加對配體之結合親和性。然而，相較於其他 抗體擬似物，cal ixarene為主之抗體擬似物，不只包括胜 肽’且因此較不易受蛋白酶酵素攻擊。該支架不僅純為胜 肽、DNA或RNA，意指此抗體擬似物在極端環境條件相當安 定’且具長的生命期。再者，因此該cal ixarene為主之抗 體擬似物相當小，較不易產生免疫反應。
Murali ^ A{Cel 1 Mol Biol. 49(2):209-21 6(2003)) 敘述一方法學’供使抗體減小成更小的胜肽擬似物，稱為,, 類抗體結合胜肽擬似物”（ABiP)，亦有用於作為抗體替代 物。
Silverman 等人 iNat Bi otechnol. {2⑽D， 23: 1556-1561)敛述融合蛋白質，其為單鍵多胜狀，包括多重 ，構域，稱” a v i m e r s ”。由人類胞外受體結構域，以體外表 現子（exon)曳步及噬菌體展示形成，avimers為一類結合蛋 2125-9937-PF 35 200920406 白質，有些類似抗體之親和性及對各種標靶分子之專一 性。該得到之多結構域蛋白質’相較於單一抗原決定基結 5蛋白貝可包括多獨立結合結構域，可顯現改良之親和 性（於某些案例，為次-奈米莫耳）及專一性。額外的avimers 建構方法及使用的細節，揭露於例如美國專利申請案公開 號碼 20040175756 、 20050048512 、 20050053973 、 20050089932 及 20050221384 。 除了非免疫球蛋白蛋白質骨架，抗體性質亦在化合物 中被模擬，包括但不限於：RNA分子及非天然寡聚物（例如， 蛋白酶抑制劑、苯并二氮呼（benz〇diazepine)、嘌呤衍生 物及bet a-turn擬似物），以上所有以本發明使用為適當的。 i_vii)中和NPTX1活性之_·« . 參照本發明之一抗NPTX1抗體之用語”中和，，或用語” 中和NPTX1活性之抗體"，意指一抗體，其結合於或接觸 NPTX1 ’由於NPTX1造成抑制細胞增殖活性。由於nptxi分 泌至胞外且作為肺癌細胞增殖之必要因子，因此某些抗 N P T X1抗體可能中和此活性。 (viii)選擇抗饉或抗髏片段： 由前述方法製備之該抗體或抗體片段，可藉偵測表現 EF-ldelta之細胞例癌症細胞之CDKN3結合區之親和性 (72-1 6 0aa位置）來選擇。非專一性結合至此等細胞，以室 溫中用含3% BSA之PBS處理30分鐘而阻斷。將細胞與候 選抗體或抗體片段於室溫培養60分鐘。以PBS洗滌後，將 • » 細胞以FITC-接合2次抗體於室溫染色60分鐘，並使用螢 2125-993 7-PF 36 200920406 光計積測。或者，可使用表面共振（surface piasm〇n resonance)氛圍之生物感測器作為偵測或定量本發明抗體 或抗體片段之工具。能偵測細胞表面之EF_ldeHa之cMN3 結合區（72-1 60aa位置）的抗體或抗體片段，在本發明中被 選擇。 對於ΝΡΤΧΙ(ΒΒΟΠ)具專—性之兔多株抗體（pAbs)，藉 由以GST-融合人類NPTX1蛋白質（密碼子2〇_145: seq id N(h 88及297-430: SEQ ID N0: 89)免疫兔子而生，並使 用標準實驗步驟純化。對於人類具專一 性之小鼠單株抗體（mAb)，亦藉皮膚内以編碼人類Νρτχι 蛋白質之質體DNA，利用基因搶免疫BALB/c小鼠 (ChowdhunO。NPTX1 mAb從細胞培養物上清，以親和層析 純化。NPTX1 mAb以細胞墨點分析，使用内生表現或不表現 NPTX1之肺癌細胞株之溶解物，證明對人類Νρτχι具專一 性。 (ix)醫藥配方· 依本發明之抗體之治療配方，可藉由混合具所望純度 之一抗體及隨意之醫藥上可接受擔體、賦形劑或安定劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,
Osol，A. Ed.( 1 980))’成為凍乾配方或水溶液形式，製備 成供保存。可接受之擔體、賦形劑或安定劑，為在採用劑 量及濃度，對接受者無毒者，包括緩衝液例如··磷酸鹽、檸 檬酸鹽’及其他有機酸;抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺 酸·，保存劑（例如十八烷基二甲基节基氯化銨；六羥季銨氯
2125-9937-PF 37 200920406 基氣苯胺、陽性皂（benzeth〇ni⑽chl〇ride);苯 • 醇或节醇，對經苯甲酸燒δ旨，例如對經苯甲酸甲g旨或 對經苯甲酸丙酯;兒茶盼;間苯二齡;環己醇}戊醇;及間 :酚)’低为子I (少於肖i 〇殘基)多胜肽;蛋白質，例如血 清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙稀基 吡咯啶酮;胺基酸例如甘胺酸、谷醯胺、天冬醯胺、組胺酸、 精胺酸或離胺酸;單糖、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄 糖、甘露糖或糊精;螯合劑，例如Em;糖例如嚴糖、甘露 醇海藻糖或山梨糖醇;形成鹽之平衡離子，例如鈉;金屬 複-體(例如Zn-蛋白質複合體);及/或非離子性界面活性 劑例如τ麵tm、pl_nICSt«或聚乙二醇（PEG)。 適於皮下投予之束乾配方，敘述於聰/04801。此滚 Ϊ配方可以適當的稀釋劑重新復水成高蛋白質濃度，且該 设水之配方’可對於在此欲治療之哺乳動物以皮下投予。 此處之配方，可包合满雪i夕
Ju 3視南要夕於1種活性化合物，以 :治療特定適應症’較佳為彼此不會不利影響，具互補活 性。例如，可能希曾 — 楗供化療樂劑、細胞激素或免疫 抑制藥劑。此其他藥劑有 里取決於在配方中存在之 几4里、疾病或病症或治療類型，及上述其他因子。此等 言，使用以前使用之相同劑量及投予路徑，及約以 削採用之約1至99%劑量。 活性成分亦可捕捉在製 (c〇ace — )技術…臂人政膠囊，例如藉凝聚 明膠铺囊，及聚(曱=二例如經基曱基纖維素或 曱基曱基丙細酸醋）微膠囊，於膠體藥
2125-9937-PF 38 200920406 物傳遞系統（例如微脂體白蛋白微球體、微乳劑、奈米微 粒，及奈米膠囊）或巨乳劑。此種技術揭露於Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oso1, A. Ed.(1980)。 可製備持續釋放製備物。持續釋放製備物之適當例， 包括含該藥劑之固體疏水性聚合物之半通透基質，其中， 基質為成形物，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之例：包括 聚酯、水凝膠（例如，聚（2-羥基乙基-曱基丙烯酸酯）’或 聚（乙稀醇））、聚乳酸（P〇lylactide)(美國專利號碼 3, 773, 919)、L-谷胺酸及L-谷胺酸乙酯之共聚物、n〇ir可 解之乙稀乙I乙烯酯（noir degradable ethylene-vinyl acetate)、可降解之乳酸_甘醇酸共聚 物，例如LUPR0N DEP0T(可注射微球體，包括乳酸_甘醇酸 共聚物及柳培林（Ze吵介/ce幻，及聚 基丁酸。用於體内投予之配方 由經無菌過濾膜過濾而達成。 必需為無菌。可容易地藉 抗饉治瘘： —包含本抗體之組合物可以符合良好醫藥規範之配方、 加藥及投予。較佳地，該抗體為 c . 頰嵌合或人類化抗體 /、或抗體片段。在本發明内容供考量之因子，包括欲 治療之特定肺癌、欲治療之特定哺 庆你杜十十斗' —> 1固別病患之臨 床條件、疾病或病症之成因、藥劑投予部位、 投予排程.，及對開業,醫已知的其他因？：予方法、 效量抗體，由此等條件而決定。 又之治療有
2125-9937-PF 39 200920406 作為一般論點，單位劑量以非口 ^ 抗體，將落於每曰病患體又》台療有效量 始抗體範圍，約2至〜kg。至2〇叫-般起 a =二等推薦的抗體量，由治療裁量主宰大部 刀&擇適® Μ ϊ及排程之關鍵因子， ^ 的結果。 ，、"上點出之得到 例如，針對治療進行性及魚 高的起始劑量。為得到最有效社果取〜需要相對較 ° ，取決於該疾病或病症， 該抗體可儘可能接近第！訊號 病症招· +，十—— m表現或發生疾病或 扃症技予或在疾病或病症緩解期間投予。 該抗體可藉-適當方式投予，包括非口服、皮下、腹 腔、肺内，以及鼻腔内投予’視需要，可腹 制治療、病灶内投予。非口服灌…免疫抑 動脈内、腹腔内，或皮下投予。肌肉内、靜脈内、 此外，該抗體可適當地以脈衝灌注投 抗體下降劑量。較佳地，以注射投 使：該 -T- ,, 又1主馬靜脈内或古 下注射，部分取決於是否為短期投予或長期投予。 可额外將其他化合物，例如細胞 免疫抑制藥劑及/或細胞激素，與該抗體 予，包括共同投予、使用分離配方或單組合投 1— w i樂配方Ϊ及以 -順序連續投予，其中較佳為在一時間帶 者（或所有）活性藥劑同時發揮其生物學活性。 > 予該ΙΓΓ抗體給該病患，本發明考量以基因療法投 又予編瑪一抗體之核酸，包含表現”投予-治療
2125-9937-PF 40 200920406 有效量之一抗體”。參見例如w〇96/〇7321 ，於1 996年3 月14日公開，係關於使用基因療法產生胞内抗體。 有2種主要使核酸（隨意地包含於一載體）進入病患細 概之方A'體内及體外（ex viv〇)。針對體内傳遞，將槐後 直接注射到病患體内’通常是需要該抗體之部位。針對體 外治療，移除病患之細胞，將核酸導入此等經分離之細胞， 並將經修飾的細胞以直接方式投予給病患，或例如包裹在 少孔膜並移瘦到病患體内（參見例如美國專利號碼 4,892’538及5, 283,187)。有許多技術可供將核酸導入活 細胞。該技術取決於是否該核酸在遨命或邀冷被傳送到培 養細胞中，在所欲寄主細胞中。適於以邀♦供核酸傳送到 哺乳動物細胞之技術，包括使用微脂體電穿孔、微注射、 細胞融合、DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉澱方法等。體外通用的 傳遞基因的載體，為一反轉錄病毒。
目前較佳之邀冷核酸傳送技術，包括以病毒載體轉染 (例如腺病毒、單純庖疹丨病毒，或腺關連病毒），及脂質系 系統（供脂質媒介之基因傳送的脂質，為例如：d〇tma、⑽Μ 及DC-Chol)。於某些情形，希望將該核酸來源與標靶該標 靶細胞之一藥劑一起提供，例如專一於一細胞表現膜蛋Z 質或標靶細胞之一抗體、針對標靶細胞上之受體的配體 等。當採用微脂體時，結合於與胞吞作㈣連之細胞表面 膜蛋白質之蛋白質，可用於標乾及/或促進攝取，例如親近 一特定細胞類型之capsid蛋白質或其片段、針對經歷周期 中内化之蛋白質之抗體，及標靶胞内定位及增進胞内半生 2125-9937-PF 41 200920406 期之蛋白質。受體媒介之胞吞作用的技術敘述於例如：Wu et al.，J. Biol. Chem. 262: 4429-4432(1 987);及 Wagner et aL， Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87 : 3410-3414(1990)。 目前已知基因標記及基因療法實驗步驟，參見Anderson et al·，Science 256: 808-8 1 3 ( 1 992 )。亦參見 WO 93/25673 及此處所列參考文獻。 雙股分子： 此處使用之用語”經分離之雙股分子”，係指一抑制 表現一目標基因之核酸分子’包括例如短干擾RNA(siRNA; 例如雙股核糖核.酸（d s R N A)或小髮夾R N A (s h R N A))，及短干 擾DNA/RNA(siD/R-NA;例如DNA and RNA之雙股嵌合體 (dsD/R-NA)或 DNA 及 RNA 之小髮夹嵌合體（shD/R_NA))。 此處使用之用語” siRNA” ’係指一雙股RNA分子，其 防止標靶mRNA轉譯。將slRNA導入細胞之標準技術被使 用，以DNA為一模板，並從其轉錄成βΝΑ。該siRNA包括一 EBI3'CDKN3或EF-ldelta有義核酸序列（亦稱為“有義 股）、一 ΕβΙ3、CDKN3或EF-ldelta反義核酸序列（亦稱 為“反義股”）或兩者。該siRNA可建構成使單一轉錄物具 目標基因例如-髮夾之有義及互補反義核酸序列兩者。該 siRNA 可為 dsRNA 或 shRNA。 此處使用之用語” dsRNA”係指，兩RNA分子之建構 物’包括彼此互補序歹,j ’其經互補序列黏合以形成一雙股 腿分子。兩股之核㈣序列可不僅包括擇自目標基^列 之蛋白質編碼序列之“有義’’或”反義，，讓，尚包括擇
2125-9937-PF 42 200920406 自於目標基因非編碼區之核苷酸序列的RNA分子。 此處使用之用語’’ shRNA” ’係指具一莖環結構之 siRNA ’包括第1及第2區，彼此互補，即有義及反義股。 該等區之互補程度及方位，為足以使在該等區間發生驗基 對’該第1及第2區由一環區接合，該環係由於環區内在 核苷酸（或核苷酸類似物）欠缺鹼基對所致。shRNA之環區為 一單股區’中介於該有義及反義股，且可稱為“中介單 股”。 此處使用之用語” siD/R-NA”係指一雙股多核普酸分 子，包括RNA及DNA兩者，包括RNA及DNA之雜交體及麥 合體，防止轉譯標靶mRNA。在此，一雜交體代表由構 成之多核苷酸及RNA構成之多核苷酸彼此雜交以形成該雙 股分子；而嵌合體代表一或二股，包括可包含RNA及之 雙股分子。將siD/R_NA導入細胞内之標準技術被使用。 s1d/r-NA包括—ΕβΙ3、CD〇3或EF_ideita有義核酸序列 (亦稱為“有義股，’）、一 EBI3、CMN3或反 核酸序列(亦稱為“反義股’，）或兩者。該侧屬可建構 成使單-轉錄物具來自於目標基因例如一髮夹之有義及互 補反義核酸序列兩者。帛顧，可為* shD/R-JVA 〇 4
此處使用之用語” dsD/R_NA 物，包括姑屮艽e十 …… 1刀丁〜疋稱
匕枯彼此互補序列，1 一 A 夕 “、毛互補序列黏合以形成一雙股 夕私苷酸分子。兩股之核苷酸岸列 田皮心甘知.序列可不僅包括擇自目標基 因序列之蛋白質編石馬序列之“有義，，或，，.反義，，多核^
2125-9937-PF 43 200920406 酸序列，帛包括擇自於目標基因非編媽區之核苦酸序列的 多核苷酸。構建該dsD/R—NA之一或二個該二分子，包括 RNA及DNA兩者（嵌合分子），或該分子其中之一包括㈣， 另一分子包括DNA (雜交體雙股）。 •此處使用之用語，’ shD/R-NA” ’係指具一莖環結構之 siD/R NA由一第1及第2區構成，彼此互補，即有義及 反義股i等區之互補程度及方位，為足以使在該等區間 發生鹼基對’該第i及帛2區由一環區接合，該環係由於 環區内在核苷酸（或核苷酸類似物）欠缺鹼基對所致。 shD/R-NA之環區為一單股區，中介於該有義及反義股，且 可稱為“中介單股”。 此處使用之一 “經分離之核酸”為從其原本環境（例 如若為天然發生，則為自然環境）移出之一核酸，且以合成 方法從其自然狀態改變。於本發明，經分離之核酸例如， 包括DNA、RNA及該等之衍生物。 對抗 EBI3、CDKN3、EF-ldelta 或 NPTXR 之雙股分子， 其中，該分子雜交於標靶mRNA，藉與正常基因之單股mRNA 轉錄物關連，而降低或抑制生產EBI3、CDKM、EF_ldelta
或 EBI3 所編碼之 NPTXR 蛋白質、cd〇3、EF-ldel ta 或 NPTXR 基因，因此干擾轉譯，抑制表現該蛋白質。如此處所證實， 肺癌細胞株之EB13表現，受到dsRNA抑制（圈4D);肺癌細 胞株之CDKN3表現，受到dsRNA抑制（圖22A);肺癌細胞株 ’ NPTXR表現’受到dsRNA抑制（圈13D);肺癌細胞株之 EF-ldelta表現，受到dsRNA抑制（圈22B)。
2125-9937-PF 44 200920406 因此本發明提供經分離之雙股分子，當引入表現該基 因之細胞時’能抑制EBI3、CDKN3或EF-ldelta基因表現。 該雙股分子之標靶序列，可由下述s iRNA設計演算法設計。 EBI 3標乾序列包括例如核苷酸 SEQ ID N0: 18(位於 SEQ ID NO: 1 之 679-697nt 位置） SEQ ID NO: 20(位於 SEQ ID NO: 1 之 280-298nt 位置） CDKN3標靶序列包括例如核苷酸 SEQ ID N0: 49(位於 SEQ ID N0: 5 之 31 0-328nt 位置） EF-ldelta標靶序列包括例如核苷酸 SEQ ID N0: 51(位於 SEQ ID N0: 7 之 225-243nt 位置） NPTXR標無序列包括例如核苷酸 SEQ ID NO: 84(位於 SEQ ID N0: 86 之 1 280-1 298nt 位置） SEQ ID NO: 85(位於 SEq ID N〇: 86 之 1 393-1 41 1ηΐ 位置） 具體而言，本發明提供以下雙股分子[川至匕叩： [1] 一種經分離之雙股分早 杏道 又取刀于，當導入一細胞，抑制體 内表現EM3、CD03、EF-ldelta或NpnR及細胞增殖，該 分子由-有義股及-與該有義股互補之反義股構成，彼此 雜交以形成該雙股分子； ·
2125-993 7-PF 45 200920406 [2]如[1]之雙股分子’其中該雙股分子作用在mRNA， 配對擇自於 SEQ ID NO: 18(位於 SEQ ID NO: 1 之 679 —697ηΐ 位置）、SEQ ID NO: 20(位於 SEQ ID NO:；[之 28〇_298nt 位置）、SEQ ID NO: 49(位於 SEQ ID NO: 5 之 31〇_328nt 位置）、SEQ ID NO: 51(位於 SEQ ID NO: 7 之 225_243nt 位置）、SEQ ID NO: 84(位於 SEQ ID NO: 86 之 1280-1298nt 位置），及 SEQ ID NO: 85(位於 SEQ ID NO: 86 之 1 393-l4llnt 位置）之標靶序列； [3]如[2]之雙股分子，其中該有義股包含一序列，對 應於擇自於SEQ IDN0: 18、20、49、51、84及85之標靶 序列； [4] 如[3]之雙股分子，其中長度少於約1〇〇核苷酸； [5] 如[4]之雙股分子，其中長度少於約乃核普酸； [6] 如[5]之雙股分子，其中長度少於約5〇核苷酸； [7] 如[6]之雙股分子，其中長度少於約託核苷酸； [8] 如[7]之雙股分子，其中長度介於約η及約“核 苷酸； 如⑷之雙股分+，其中由—單一多核苷酸構成， 具該有義及反義股兩者，以-中介單股連接； ，[]如[9]之雙股分子，其中具通式 5’ _[Α]-[Β]-[α，Γ . Ί . 」3 ，[Α]為該有義股，包含一序列紫 應於擇自於SEQ τη NO: 18、20、49、51、84 及 85 之標奉
序列’ [B ]為該中人DO _ .， ）丨早胺，包括3至23個核苷酸，[A， ]1 該反義股，包含-互補於U]之序列；
2125-9937-PF 46 200920406 [11] 如[1]之雙股分子，其中由RNA構成； [12] 如[1]之雙股分子’其中由DNA及RNA兩者構成； [13] 如[12]之雙股分子’其中其中該分子為—DNA多 核苷酸及一 RNA多核苷酸之一雜交體； [14] 如[13]之雙股分子’其中該有義及該反義股，各 由DNA及RNA構成； [15] 如[12]之雙股分子’其中該分子為dna及r NA之 一嵌合體； [16] 如[15]之雙股分子’其中反義股之3，端側區， 或有義股之5’端側區及反義股3，端側區兩者，為RNA; ΠΉ如[16]之雙股分子，其中該側區由9至i3核苷 酸構成；及 [18] 如[2]之雙股分子，其中該分子包含3，突出物； [19] 種载體，表現該如[2]之雙股分子； ，[20]如[19]之載體，其中該雙股分子具通式 [][A ] ~ 3 , [ A ]為該有義股，包含_序列對 應於擇自於SEQID敗· 18、20、49、51、84及85之標乾 序列’ [B]為—中介單股，包括3至23個核普酸，[A，]為 該反義股’包含-互補於[A]之序列。 本發明之譬耶·八·^ ^ 肤刀子，將於以下更詳盡敘述。 11又5十具抑制目姆甘 方法，為已知（參/ 胞中表現能力之雙股分子的 入於此作為參考，）。，如美國專利號碼6,5G6,559，完整引 列如，用於設計s i RNA之電腦程式，可 站 徒 Ambi〇n · 得 網 站彡呈 到
2125-9937-PF 47 200920406 f inder.h
com/techl,ib/iiLyc/siRNA tm 1) 〇 該電腦程式依據以下規則選擇針對雙股分子之標靶核 苷酸序列。 選擇標fe仂f .
1·從轉錄物之AUG起始密碼子開始，往下游掃描AA 二-核苷酸序列。記錄每個“及3’鄰近19核苷酸之發生， 作為潛在si謝標挺位置。Tusehl等人建議避免設計 S1RNA至5’及3，未轉譯區（UTR)及接近啟始密碼之區（乃 驗基内）因此等可能富含調節蛋白質結合位置及UTR-結合 蛋白質及/或轉譯起始化複合體，可能干擾siRNA核酸内切 酶複合體之結合。 2_比較潛在標靶位置與適當基因體資料庫（人類、小 鼠、大鼠等），及消除任何具顯著同源於其他編碼序列的標 乾序歹〗的考量。基本上，使用BLAST，可從NCBI伺服器得 到：www.ncbi.nini. nih.gov/BLAST/⑴tschul SF et &1_，
NuCleiC Acids Res 1997 Sep 1， 25(17): 3389-402)。 3 ·選擇合格標把序列供合成。通常沿著基因長度選 擇選擇數個標乾序列以評估。 使用以上規則，設計本發明之經分離之雙股分子之標 靶序列： 針對 EBI3 基因，SEQ ID N0: 18 及 20 針對（JMN3 基因 ’ SEQ ID NO: 49 及 50 針對 EF-ldelta 基因 ’ SEQ ID NO: 51 及 52,或
2125-9937 屮 F 48 200920406 針對 NPTXR 基因，SEq ID N〇: 84 及 85。 標靶於上述標靶序列之雙股分子，各自檢查其抑制表 現該目標基因之細胞生長的能力。因此，本發明提供雙股 分子’標靶於擇自於以下族群之任一序列： 針對 EBI3 基因，SEQ ID N0: 18(位於 SEQ ID NO: 1 之 679-697nt 位置）或 20(位於 SEQ ID N〇:丨之 28〇_298nt 位置）， 針對 CMN3 基因，SEQ ID NO: 49(位於 SEQ ID NO: 5 之 31 0-328nt 位置）， 針對 EF-ldelta 基因，SEQ ID NO: 51(位於 SEQ ID NO: 7之225-243nt位置），及 針對 SEQ ID NO: 84(位於 SEQ ID NO: 86 之 1 280-1298nt 位置）或 SEQ ID NO: 85(位於 SEQ ID NO: 86 之 1 393-14Πηΐ 位置）。 本發明之雙股分子可導至一單一標靶Ebi3、cdkN3、 EF 1 de 1 ta或NPTXR基因序列或可導致多數標乾ebi3、 CDKN3、EF-ldelta 及 /或 NPTXR 基因序列。
本發明之雙股分子’標靶於上述EBI3、CDKN3、 EF-ldelta及/或NPTXR基因之標靶序列，包括經分離之多 核苷酸’其包含標靶序列及/或標靶序列之互補序列之任一 核酸序列。標把EB13基因之多核普酸，例如包括seq I d N0 · 18或20之序列及/或此等核苷酸之互補序列；標靶CDKN3基 因之多核苷酸，包括SEQ ID N0: 49的序列及/或此等核；gi 酸之互補序列。標靶EF-ldelta基因之多核苷酸，包括sEQ 2125-9937-PF 49 200920406 ID NO. 51之序列及/或此等核苷酸之互補序列；標靶NpTxR 基因之多核苷酸，包括SEQ ID NO: 84或85之序列及/或 此等核苷酸之互補序列。然而，本發明不限於此等例子， 且只要經修飾分子保留抑制表現EBI3、CDKN3、EF_ldelta 或NPTXR基因之能力，則前述核酸序列的小量修飾可接受。 在此’用語，，小量修飾”與一核酸序列一起使用時，代表 對該序列進行丨、2或數個取代、刪除、加成或插入核酸。 … 於本發明之内容，應用在核酸取代、刪除、加成及/或 插入之用語”數個”，可指3-7 ,較佳3-5，更佳3-4，又更 佳3個核酸殘基。 依照本發明，本發明之雙股分子可使用實施例利用之 方法測試能力。於下述實施例，將由具EBI3、CDKN3、 EF-ldelta或NPTXR基因之mRNA各部分的有義股或互補之 反義股構成之雙股分子，依照標準方法在體外測試降低肺 癌細胞株中生產EBI3、CDKN3、EF_ldelta或NpTXR基因之 I 能力（例如針對EBI3使用A549、針對CDKN3或EFMdelta 使用LC319)。再者例如與候選雙股分子接觸降低細胞中之 EBI3 ' CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因產物，相較於在不 存在候選分子下培養之細胞’可由rT_PCr ，使用針對 EBI3、CDKN3、EF-ldelta 或 NPTXR mRNA 之啟動子，於實 施例1、11及18項“半定量RT-PCR”彳貞測。於體外細2 系分析，減少生產EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因 之序列，可以測試在.細胞生長，抑制效果。於饉今細胞系 分析抑制細胞生長之序列’然後使用罹癌之動物例如裸小 2125-9937-PF 50 200920406 以確認減少 EBI3、 ’並降低癌症細胞生 鼠異種移殖模型測試其邀作處力， CDKN3、EF-ldelta 或 NPTXR 產物生產 長。 當該經分離之多核普酸為m或其衍生物，核苦酸序 列中之驗基“t”應取代成、’，。此處使用之用語，，互 補”係指多核苦酸之核苦酸單元間的Wats〇n々ick或 H〇〇gStejn驗基對，用語’，結合，，意指2多核苦酸間之物理 ，或化學父互作用。當該多核苷酸包括經修飾核苷酸及，或非 鱗酸二西旨鍵，此等多核普酸亦可以相同方式彼此結合。一 般而言，互補多核普酸序列在適當條件下雜交以形成適當 •之含少數或無不配對之二倍體。再者，本發明經分離之多 核苦酸之該有義股及反義股，可藉雜交形成雙股分子或髮 2環結構。於一較佳實施形態，此種二倍體每1〇乡且配對包 含不大於1的不配對。於一尤佳之實施形態，當該二倍體 之股完全互補，此二倍體不含不配對。 該多核苷酸較佳為，針對EBI3,長度小於1149核苷酸， 針對CDKN3，長度小於844核苷酸，針對EF_idelta，長度 小於1031核苷酸，及針對NPTXR，長度小於5815核苷酸。 例如該多核苷酸針對所有基因，長度小於500、2〇〇、100、 75、50或25核苷酸。本發明該經分離之多核苷酸，對於形 成對著EBI 3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因之雙股分子 或製備編碼該雙股分子之模板DNA為有用。當該多核苷酸 用於形成雙股分子，該多核苷酸可長於19核苷酸，較佳長 於21核苦酸’更佳為介於約19及25核苷酸。
2125-9937-PF 51 200920406 本發明之該雙股分子可包含丨種以上經修飾的核苷酸 及/或非磷酸二酯鍵。該技術領域中公知的化學修飾，能增 加穩定性、可得性及/或細胞攝取該雙股分子。熟悉技藝之 人士將瞭解其他類型化學修飾可導入該分子 a〇03/070744;WO2005/045037)。於一實施形態，修飾用於 提供改善對於降解之耐受性或改善攝取。此種修飾之實施 例包括但不限於硫代磷酸鍵（ph〇sph〇r〇thi〇ate linkages)、2 —〇 —曱基核糖核苷酸（尤其在一雙股分子之 該有義股上）、2’ -去氧-氟核糖核苷酸、2，__去氧-核糖 核苷酸、”萬用鹼基”核苷酸、5’ 乂―甲基核苷酸，及反 轉的去氧-鹼性殘基導入（US2〇〇6〇122i37)。 於另一實施形態’修飾可用於增強該雙股分子之穩定 !·生或增加標靶效率。此種修飾之例包括但不限於雙股分子 之2互補股間之化學交聯、一雙股分子之一股之3，或5， 末端之化學修飾、糖修飾、核鹼修飾及/或骨架修飾、2 _ 氟經修飾的核糖核苷酸及2’ --去氧-核糖核苷酸 (W0 2004/029212)。於另一實施形態，修飾可用於標乾mRN a 及/或互補雙股分子股中之互補核苷酸之親和性增加或降 低（WO2 0 0 5 / 〇 44 9 7 6)。例如一未經修飾之嘴咬核苷酸可取代 成2-硫基、5_炔基、5_甲基或5_丙炔基嘧啶。此外，一未 經修飾之嗓呤可取代成7_deza、7 —alkyi或7_alkenyi嘌 呤。於另一實施形態，當該雙股分子為具一 3，突出物之 一雙股分子，該3’ -末端核苷酸突出核苷酸，可由去氧一
核糖核苦酸取代（Elbashir SM et al.’Genes Dev 200 1 Jan 2125-9937^PF 52 200920406 1 5，15 (2): 18 8 - 2 0 0 )。更進一步之細節、公開的文件，例 如US20060234970為可得。本發明不限於此等實施例，且 可對於本發明之雙股分子採用已知化學修飾，只要最終分 子保留抑制表現目標基因之能力即可。 再者’本發明之該雙股分子可包含DNA及RNA兩者， 例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具體而言，一 DNA股及一 RNA 股之多核苷酸雜交體，或一 DNA —RNA嵌合體多核苷酸顯示 增加的穩定性。混合DNA及RNA，即一雜交體類型雙股分子， 包括一 DNA股（多核苷酸）及一 RNA股（多核苷酸），—嵌合 體類型雙股分子在包含任一或兩單股（多核苷酸）上包含 DNA及RNA兩者等，可被形成以增強該雙股分子穩定性。 - _股及一 RNA股之雜交體，可為該有義股為腿 •^紅義股為RNA，或相反，只要當引人表現該基因之細胞 =’旎抑制表現目標基因即可。較佳地，該有義股多核苷 該反義股多議為RM。又’該嵌合體類型雙 4有義及反義股均由ΜΑ & RNA所構成，或任 心基因^股任—者纟腦及腿構成，只要當弓丨入表 人 、、、田胞時，能抑制表現目標基因即可。為了货強 該雙股分早摄—兩Γ增強 w疋性，該分子較佳為包含儘可 為誘導抑制該目沪装走 此夕的DNA，而 腿，以誘導充分的表現抑制。 為—乾圍内之 作為一嵌合體類型雙股分子較佳之 一上游部分區（ 該雙股分子之 匕、即该有義或反義股之中位在 互補序列兩側之P ^ ϋλΤΑ 在払靶序列或其 )為驗。較佳地，該上游部分區代表該
2125-993 7-PF 53 200920406 側（5端），及該反義股之3’侧（3，端）。或 者=義股之5’端及/或反義股之3,端之側區，代表上 、p刀區即，於較佳實施形態，反義股之3，端侧區，或 有義股5’端之側區及反義股3,端之側區兩者，由rna構 成例如，本發明之雙股分子之嵌合體或雜交體類型包括 以下組合。 有義股： 5，_[DNA卜3， 3’ -(RNA)-[DNA]-5, :反義股， 有義股： 5，[DIU；M， 3’ -(RNA)-[DNA]-5, :反義股，及 有義股： 5’ _(RNA)-[MA]-3’ 3 —(RNA)-5’ ：反義股 &該上游部分區較佳為從該雙股分子之該有義或反義股 中，私靶序列或其互補序列之末端算起9至1 3核苷酸之結 構域。又，此種嵌合體類型雙股分子較佳之例，包括長度 19至21核苷酸之股，其中，至少該多核苷酸上游半區（該 有義股之5’側區，及反義股之3,側區）為，且另一半 抑制表現目標基因之 為DNA。於此—嵌合體類型雙股分子 作用，遠高於整個反義股為MA時（US20050004064)。
於本發明，該雙股分子可形成一髮夾，例如-短髮夹 RNA(shRNA)，短髮夾由 DNA 及 RNA(shD/R_NA)組成。該 shRNA 或 shD/R-NA 為― 之混合物，形成一
RNA序列或rNA及DNA 緊密髮夾圈，能婉p w .
b，、、二由RNA干擾使基因表現靜默。該shRNA 或 shD/R-NA 包合今·古 > ’ 3 °亥有義彳示乾序列且该反義標乾序列於一單
2125-993 7-PF 54 200920406 股上’其中該序列由一環序列分開。—般而言，該髮夾社 構由一細胞機制切斷成dsRNA或dsD/K_NA，而結6於rna_ 誘導靜默複合體⑽c)。該複合體結合於並切斷配對於 dsRNA或dsD/R-NA之標靶序列的mRNA。 由任意核苷酸序列構成之環序列，可位在該有義及反 義序列之間’以形成該髮夾環結構。因此本發明尚提供一 雙股分子，具通式5’ -[A]-[B]_[A，]_3，，其中[幻為該 有義股，包含對應於一標靶序列之序列，[B]為一中介單 股，且[A ]為該反義股，包含對[A]之互補序列。該標靶 序列可擇自於例如：針對EBI3，SEQ ID N〇: 18及2〇，針 對 CDKN3，SEQ Π) N0: 49，針對 EF-ldelta，SEQ ID N0: 51 或針對 NPTXR，SEQ ID NO: 84 及 85 。 本發明不限於此等例，[A ]中之該標無序列。可為來自 此等例之經修飾的序列，只要該雙股分子保留抑制表現被 標靶之EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因的能力即可。 該區[A]雜交於[A’ ]以形成由區[B]構成之環。該中介單 股部分[B] ’即環序列長度較佳為3至23核苷酸。該環序 列 ， 例如可 擇自於 以下序 列 (http://www.ambion.com/techlib/1;b/1:b_506.h1;ml)。再
者’ 23核苷酸構成之環序列，尚提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2 002 Jul 25, 418(6896) : 435-8, Epub 20 02 Jun 26)： , CCC、.CCACC ’ 或 CCACACC: Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26;
2125-9937-PF 55 200920406 UUCG: Lee NS et al. , Nat Biotechnol 2002 May, 2 0(5): 500-5 ; Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18， 100(4): 1639-44， Epub 2003 Feb 10;及 UUCAAGAGA: Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67 具髮夾環結構之本發明雙股分子較佳實施例，如下所 示。於以下結構，該環序列可擇自AUG、CCC、UUCG、CCACC、 CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 及 UUCAAGAGA;然而，本發明不 限於該等： CAAUGAGCCUGGGCAAGUA-[B]-UACUUGCCCAGGCUCAUUG (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 18); UCACGGAUGUCCAGCUGUU-[B]-AACAGCUGGACAUCCGUGA (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 20); UAUAGAGUCCCAAACCUUC-[B]-GAAGGUUUGGGACUCUAUA (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 49); GUGGAGAACCAGAGUCUGC-[B]-GCAGACUCUGGUUCUCCAC (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 51); GACAAUGGCUGGCACCACA-[B]-UGUGGUGCCAGCCAUUGUC (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 84);及 CAUCAAGCCUCAUGGGAUC-[B]-GAUCCCAUGAGGCUUGAUG (針 對標靶序列 SEQ ID NO: 85) 再者，為了增強該雙股分子之抑制活性，可將核苷酸 “ u”加成至標靶序列之反義股之3’端，作為3’ 突出 物。欲加成之“ u ”數，至少2，一般而言為2至10，較佳 2125-9937-PF 56 200920406 為 2至5。該加成之 “ 攻之 U 在該雙股分子之反義股之3， 形成單股。 用於氩備該雙股分子之方法，不特別限定，較佳為使 用該領域中？知的化學合成方法。依照該化學合成方法， 有義及反義單股多核苦酸係分開合成，然後經適當方法黏 合在-起以得到-雙股分子。用於黏合之特定例，包括其 中該合成之單股多核苷酸以一莫耳比混合，較佳至少約 3:7’更佳約4:6,最佳為實質等莫耳量(即莫耳比約5:5:’。 其次，將該混合物加熱至一溫度，於該溫度雙股分子分離 然後逐漸冷卻。該黏合之雙股多核普酸可以用該領域已知 的方法純化。純化方法，例如包括使用凌脂電泳之方法， 或將殘留的單股多核苦酸任意地例如以適當酵素降解而移 除。 該EBI3、CD03、EF-ldelta或NPTXR序列兩側調控序 \ 列，可相同或不同，以使得該等之表現可以獨立調控\ 以時間、空間方式進行。該雙股分子可在胞内藉由選殖 EBI3、CDKN3、EF-Idelta或NPTXR基因模板進入一含例如 來自小核RNA(snRNA)U6之KNApol m轉錄單元或人3類耵 RNA啟動子之載體而轉錄^ 、 包含本發明雙股分子之盤艚 本發明尚包括:載體’包含i種以上此處所述該雙股分 子，及一細胞，包含此種載體。本發明載體，較佳二二; 表現形式編碼本發明之雙股分子。在并，古五” „ D 可表現形 式代表當該載體導入一細胞時，將表現該分子。* 丄 。於' —較 2125-993 7-PF 57 200920406 佳實施形態’該載體包括對於表現該雙股分子必要之調控 要素。本發明之此種載體可用於生產該雙股分子或直接作 為治療癌症之活性成分。 本發明之載體生產可藉例如選殖EBI3、CDKN3、 EF-ldelta或NPTXR序列進入一表現載體而使得調控序列操 作性連結於EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR序列，以允
\ 許表現（藉轉錄DNA分子）兩股（Lee NS et al.， Nat Biotechnol 2002 May，20 (5): 500-5 )。例如反義於 mRNA 之 RNA分子，由第1啟動子轉錄（例如在經選殖之3，端 之侧的啟動子序列）’及對於mRNA為有義股之rna分子， 由第2啟動子轉錄（例如在經選殖之DNA5’端之側的啟動子 序列）。該有義及反義股在體内雜芡以產生一雙股分子建構 物，供靜默該基因。或者，各自編碼該雙股分子之該有義 及反義股之2載體建構物，利用於各自表現該有義及抗有 義股，然後形成一雙股分子建構物。再者，該經選殖的序 列可編碼為具2次結構（例如髮夾）之建構物；亦即一載體之 單一轉錄物包含該目標基因之該有義及互補反義序列。 本發明之載體亦可配備以達成穩定插入於該之標乾細 胞之基因體内（參見例如Thomas KR & Capecchi抓， 1 987，51: 503-12,敘述同源重組匣式載體）。參見例如 et al. , Science 1990, 247: 1465-8;US Patent Nos. 5’ 580’ 859; 5, 589, 466; 5, 804, 566;5, 739, 1 1 8; 5’ 736, 524; 5,679,647,;及W0 98/0472(hDNA系傳遞技術之例，包括“裸 露DNA” ，促進（bupivacaine、聚合物、胜肽_媒介）傳遞、.
2125-9937-PF 58 200920406 陽離子液體複合體，及微粒媒介（“基因搶，，）或壓力媒介 傳遞（參見例如美國專利號碼5, 922, 687)。 本發明之載體包括例如病毒或細菌載體。表現載體 例’包括減毒病毒寄主，例如痘病毒（vaccinia)或雞痘 (/〇『/ )病毒（參見例如美國專利號碼4,722,848)。 該方法涉及使用痘病毒fvaccinia)作為一載體以表現編碼 為該雙股分子之核苷酸序列。當引入表現表現該目標基因 之細胞内，該重組痘病#表現該分子，因而抑制該細胞增 殖。可使用之載體，例如：包括BaciUe CalmeUe
Guerin(BCG)°BCG 載體敘述於 stover et al.，Natufe 1991, 351: 456-60。廣泛不同的其他載體，在治療性投予及生產 該雙股分子為有用；例子包括腺及腺關連病毒載體、反轉錄 病毋載體、傷寒沙門滅（Sa/历⑽巴/ /a iyp力/)載體、去毒發 症毒素載體等。參見例如Shataetal.，Mol Med Today 2000, 6: 66-71;Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;及 Hippetal.，In viv〇 2000，14: 571_85。 使用本發明之雙股免申制或降低羞多^及治瘙癌症 之方法： 某些siRNA抑制NSCLC之能力，先前已敘述於w〇 2005/89735，引入於此作為參考。於本發明，針對Εβΐ3之 2不同dsRNA、針對CDKN3之2不同dsRfu ,及針對 EF-ldelta之2不同dsRNA，測試其抑制細胞生長之能力。 針對EBI3之2 dsRNA(圈4D)、針對CDKN3之丨dsRNA(圈 22A)、針對EF-ldeita之丨dsRNA(圖22B)或針對肝之 2125-9937-PF 59 200920406 2 dsRNA (« 13D)，有效使肺癌細胞株中該基因表現降低 與抑制細胞增殖一致。 因此，本發明提供抑制細胞生長即肺癌細胞生長之方 法’藉經由抑制表現EBI3、CD〇3或EF_ldel從或Νρτχκ， 誘導EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因官能障礙。 EBI3、CDKN3或EF-Idelta或NPTXR基因表現可藉任一前述 本發明之雙股分子或本發明之載體抑制，該雙股分子專一 地標靶ebI3、CDKN3、EF—ldelta或NpnR基因，本發明之 載體可表現任一該雙股分子。 該雙股分子及載體抑制癌化細胞之細胞生長之能力， 代表能用於治療癌症之方法。因此本發明提供治療患肺癌 之病患的方法，藉投予對著EBI3、CDKN3、EF_ldeUa或 基因之雙股分子或表現該分子之載體，不會有不利作用， 因該基因在正常器官幾乎不表現（圈 及 19)。 具體而言本發明提供以下方法[1]至[25]: [1 ] 一種用於抑制癌細胞生長及治療癌症之方法，其 中該癌細胞或該癌症表現至少丨種基因，該基因擇自於 EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR基因，該方法包括以下 步驟：投予至少1種經分離之雙股分子以抑制表現肋13、 CDKN3、EF-1及/或NPTXR在過度表現該基因之細胞中，並 抑制細胞増瘦’其中該分子由一有義股及—互補反義股構 成’彼此雜交以形成該雙股分子。 U]如[1]之方法，其中該雙股分子作用在，該
2125-9937-PF 60 200920406 mRNA配對於擇自於以下之標靶序列：SEQ ID N〇: 18 (位於 SEQ ID NO: 1 之 679-6 97nt 位置）、SEq ID no: 2〇(位於 SEQ ID NO: 1 之 280-298nt 位置）、SEQ ID N〇: 49(位於 SEQ ID NO·· 5 之 31 0-328nt 位置）、SEq ID N〇: 51 (位於
SEQ ID NO: 7 之 225-243nt 位置）SEq ID no: 84(位於 SEQ ID NO: 86 之 1 280-1 298nt 位置）’及 seq ID NO: 85(位於 SEQ ID NO: 86 之 1393-1411nt 位置）.
[3] 如[2]之方法，其中該有義股包含對應於擇自於 SEQ ID N0: 18、20、49、51、84 及 85 之一標靶序列的库 列。 [4] 如[1]之方法，其中該欲治療之癌症為肺癌； [5] 如[1]之方法，其中該肺癌為NSCLC或sclc.
[6] 如[1]之方法，其中投予多種該雙股分子； [7] 如[6]之方法，其中多種雙股分子標靶於 因； 〇J * [8] 如[3]之方法，其中該雙股分子長度少於約 苷酸； ^核 [9] 如[8]之方法，其中該雙股分子長度少於約 苷酸； & [1 0 ]如[9 ]之方法，其中該雙股分子長度少於 苷酸； 、d5〇核 [11] 如[10]之方法’其中該雙股分子長 核苦酸； 〜於約25 [12] 如[11]之方法，其中該雙股分子長 ’丨於約19
2125-9937-PF 61 200920406 及約25核苷酸； [13]如[1]之方法，其中該雙股分子由單一多核普酸 構成’該單-多核苦酸包含該有義股及該反義股兩者，以 一中介單股連接； [14]如[13]之方法，直中兮雔 电 头T該雙股分子具通式 5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’ ，並中「A1 氧兮古 # 八宁LA」為該有義股，該有義股 包含一序列，對應於擇自於SEQ ID N〇: 18、2〇、49、Η、 84及85之標乾序列，[β]爲呤巾介萤 ld」為該中"早股’包括3至23個核 苷酸，[Α’ ]為該反義股，包含一互補於[幻之序列； [15] 如[1]之方法，其中該雙股分子為一 rna; [16] 如[1]之方法，其中該雙股分子包含μα’及抓八 兩者； [17] 如[16]之方法，其中該雙股分子為一 DNA多核普 酸及一 RNA多核苷酸之雜交體；
[18] 如[17]之方法，其中該有義及該反義股多核苷 酸，各由DNA及RNA構成； [19] 如[16]之方法，其中該雙股分子為ma&rNa之 一嵌合體； [20] 如[19]之方法，其中該反義股之3，端侧區，或 有義股之5’端側區及反義股3’端側區兩者，為RNA.
[21 ]如[2 0 ]之方法’其中該側區由9至1 3核普酸構 成； [22] 如[1]之方法，其中該雙股分子包含3’ 突出物.
[23] 如[1]之方法’其中該雙股分子由一載體編碼而 2I25-9937-PF 62 200920406 成； [24]如[23]之方法 ^ , 具通式5,-⑷—⑻「’該載體編碼而成之雙股分子 ]~3’ ，其中[幻為該有義股，包 及-之標㈣列，二二卯:18、20、49、…4 酸，u’ ]為該反義it：介單股’「包括3至23個核苦 我奴包含一互補於[A]之序列.及 [25]如[1]之方法_ ^ 」之方法，其中該雙股分子包括於一組合 物，該組合物#莊#人7 〜刀以外，包括轉染增強劑及醫藥上 可接受之擔體。 本發明之方法將更詳述如下。 表現 EBI3、CDKN3、pp uι EF-idelta4NPTXK基因之細胞生 長，可藉由使該細胞接觸對著EBI3、CDKN3、EF-ldelta或 NPTXR基因之雙股分子、表現該分子之載體，或含該分子之 組合物’而受抑制。該細胞可再與一轉染劑接觸。適當轉 染劑為該技術領域中已知。用語’，抑制細胞生長，，代表該 細胞以較低速率增殖或相較於未暴露於該分子之細胞的存 活率降低。細胞生長可由該技術領域已知方法測量，例如 使用MTT細胞增殖分析。 任意種細胞之生長可依照該方法抑制，只要該細胞表 現或過度表現本發明之雙股分子之該目標基因。細胞例包 括肺癌細胞’包括NSCLC及SCLC兩者。 因此罹患或有發展成關於EBI3、CDKN3、EF_ldelta或 NPTXR疾病風險之病患，可藉投予至少1種該雙股分子、表 現至少1種該分子之至少1種載體或包含至少1種該分子 2125-9937-PF 63 200920406 之至>、1種、组合物而治療。例如肺癌病患可依照該方法治 療。癌症類型可依標準方法、依照欲診斷之特定類型腫瘤 而鑑別，癌藉由例如癌症胚㈣原咖）、gyfra、pr〇_GRp 等作為肺癌標記，或以胸部χ_光及/或痰細胞學診斷。更佳
、本發月之方法冶療之病患，以偵測於來自於該病患 之生檢中表現EBI3、CDKN3、EF_ldeIta或咖或.pcR 或免疫分析選擇。較佳地，在本發明治療前1來自於該 個體之生檢檢體以該技術領域已知方法，例如免疫組織化 學分析或RT-PCR，確認_、CDKN3、…化…或肝瓜 基因過度表現。 依照該方法抑制細胞生長，並因此治療癌症，當投予 夕種該雙肤分子（或表該雙股分子之載體或含該雙股分子 之組合物），各該分子可具不同的結構，但作用於配對 ΕΒΙ3、CDKN3、EF-ldelta及/或NPTXR之相同標靶序列的 mRNA。或者多種該雙股分子可作用在配對相同基因之不同 的標靶序列的mRNA，或作用於配對不同基因之不同的標靶 序列的mRNA。例如該方法可利用標把於EBI 3、cdKN3、 EF-ldel ta或NPTXR之雙股分子。或者，例如該方法可利用 標靶於擇自於EBI3、CDKN3、EF-ldelta及NPTXR中1或2 個以上標靶序列之雙股分子。 為了抑制細胞生長，一本發明之雙股分子可直接導入 細胞中，以一形成達成將該分子結合對應之mRNA轉錄物。 巧者，如上所述，一編碼該雙股分子之.DNA可導入細胞作 為一載體。為了將該雙股分子及載體導入該細胞，可採用 2125-9937-PF 64 200920406 轉染增強劑’例如 FuGENE(Roche diagnostics)、 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 、 〇ligofectamine(Invitrogen)!^ Nuc1eofector(Wako pure Chemicals) o 一治療視為“有效”係當其導出一臨床助益，例如於
該個體中，降低表現EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR 基因，或降低該癌症尺寸、盛行或轉移潛力。當該治療係、 預防性進行，”有效”意指其延遲或防止癌症形成或防止 或減輕癌症之一 6a床症狀。有效可以供診斷或治療特定腫 瘤類型之任意已知方法決定。 應瞭解到本發明之該雙股分子以副計量化學量 (substoichiometric amounts)降解該標靶 mRNA(EBI3、 CDKN3、EF-ldelta或NPTXR)。不希望被任何理論所限制， 因此有人相信本發明之該雙股分子係以催化方式造成降解 該“把mRNA。因此’相較於標準癌症療法，需要將顯著小 於一雙股分子傳遞到或接近癌症部位，以產生治療作用。 熟悉該技術領域之人士可輕易地決定欲對—給定個體 投予本發明之該雙股分子之有效量，藉考量例如體重、年 齡、性別、疾病類型、症狀及其他該個體條件；投予路徑. 及是否投予為局部或全身性。一般而言，本發明之該雙股 刀子之有效量’為在該癌症部位或接近該癌症部位之細胞 間濃度約1奈米莫耳濃度（nM)至約100 nM，較佳約2 nM至 ，約5 0 nM ’更佳約2. 5 nM至約10 nM。考慮到，更大量戍 更小1該雙股分子可以被投予。對於一特定情況之特定劑
2125-9937-PF 65 200920406 量’可由熟悉該技術領域之人士輕易及例行決定。 本方法可用於抑制表現EBI3、CDKN3、EF-ldelta或 NPTXR中之至少1種之癌症生長或轉移；例如肺癌，尤其 NSCLC 或 SCLC。尤其，包含 EBI3(即 SEQ ID NOs: 18 或 20)、 CDKN3(即 SEQ ID NO: 49)、EF-ldelta(即 SEQ ID NO: 51) 或NPTXR(即SEQ ID NOs : 84或85)之標靶序列的雙股分子， 對於治療肺癌尤佳。 針對治療癌症，本發明之該雙股分子組合不同於該雙 股分子之醫藥劑一起對一個體投予。或者，本發明之該雙 股为子可組合設計為治療癌症之其他治療方法一起對一個 體投予。例如本發明之該雙股分子，可以與目前採用於治 療癌症或預防癌症轉移（例如放射線療法、外科手術，及使 用化療藥劑治療，例如Cisplatin、carb〇platin、 cyclophosphamide ' 5-f1uorouraci1 ^ adriamycin ' daunorubicin或tamoxifen)之治療方法組合投予。 於該方法，該雙股分子可以裸雙股分子對該個體投 予，或與一傳遞試劑一起，或以表現該雙股分子之重組質 體或病毒載體之形式投予。 用於與該雙股分子一起投予之適當傳遞試劑，包括 Mirus Transit ΤΚ0 親 脂 試 劑；lipofectin;lip0fectamine;Cellfectin;或多陽離子 (例如多離胺酸），或微脂體。較佳之傳遞試劑為一微脂體。 微脂體·可幫助傳遞該雙股分子至一特定組織，例如視 網膜或腫瘤組織’且亦能增加該雙股分子之血液半生期。 2125-9937-PF 66 200920406 適於用在本發明之微脂體，從標準囊泡形成脂質形成，其 —般而言包括中性及或帶負電之磷脂質，及固醇例如膽固 醇。選擇脂質一般而言’係考量例如所望微脂體尺寸及微 脂體在血流中半生期。已有各種方法已知供製備微脂體， 例如敖述於 Szoka et al·，Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467;及 US Pat. Nos· 4, 235, 871;4, 501,728;4, 837, 028; 及5, 019, 369’完整揭露引入於此作為參考。
較佳地’該封入該雙股分子之微脂體包含一配體分 子，其能傳遞該微脂體至該癌症部位。配體，為結合於腫 瘤中或内皮細胞中盛行之受體者，較佳者例如結合於腫瘤 抗原或内皮細胞表面抗原之單株抗體。 更佳地，該封入該雙股分子
' ，、-工 I.多丨φ 7 SIP 結合於該結構表面之調理作用一抑制部分，以防止被單核 噬體及網狀内皮系統清除。於一實施形態，本發明之微 體可包含調理作用—抑制部分及一配體兩者。 ,用於製備本發明該微脂體之調理作用—抑制部分，一 ’親·Μ生聚合物，其結合於該微脂體膜。此 調理作用抑制部分係、“結合於 或物理性吸附… 0 心曰體膜’當其化學, 該膜，例如藉脂溶性固定子之插入至1 膜’或藉直接結合膜脂皙 ' 抑制親水性聚合物形成 Η里作用 被巨嗟體-單枝“ 護表面層’顯著降低該微㈤ 摄“： 統（“MMS”）及網狀内皮系統（“贴” λ ;美國專利號碼4,920, ，完整# I # 入於此作為參考。 π i揭路知 周理作用-抑制部分修飾之微脂體，
2125-9937-PF 67 200920406 能保留在循環中遠較未經修飾之微脂體更久。因此，此種 微脂體有時稱為“秘密行動（steal th)” 微脂體。 秘密行動微脂體已知會堆積在由多孔或，，滲漏”微循 環所供給的組織中。因此，具此微循環缺陷特徵之標乾組 織’例如固體腫瘤，將有效率地堆積此等微脂體；見Gabizon et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1988， 18: 6949-53。 此外’減少被RES攝入由於防止顯著堆積在肝及脾臟，降 低秘密行動（stealth)微脂體之毒性。因此，本發明之經調 理作用-抑制部分修飾的微脂體’可傳遞該雙股分子至腫瘤 細胞。 適於修飾微脂體之調理作用抑制部分，較佳為水溶性 I合物’具为子罝約5〇〇至約40，〇〇〇 daltons，更佳約2，000 至約20,000 daltons。此種聚合物包括：聚乙二醇（pEG)或 聚丙二醇（PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或ppG，及pEG或 PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯醯胺或聚N_乙烯基 吡咯啶酮；線狀、分支或樹突狀聚醯胺基胺；聚丙烯酸；多元 醇，例如聚乙烯醇、聚木糖醇，其中羧基或胺基經化學連 結，及神經節苷脂，例如神經節苷脂GM. sub.】。pE(J、曱 氧基PEG，或甲氧基ppG，或其衍生物之共聚物，亦為合適 的。此外該調理作用抑制聚合物可為一嵌段共聚物，為pEG 及多胺基酸、多糖、聚醯胺基胺、聚乙二胺或多核苦酸之 聚合物。該調理作用抑制聚合物亦可為中性多糖，含胺基 酸或羧酸，例如半乳，醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、 透明質酸、果膠酸、神經胺酸、褐藻酸、卡拉膠；胺化多糖
2125-9937-PF 68 200920406 或寡糖（線狀或分支）；或羧基化多糖或寡糖’例如以最終叛 基鍵結與羰基衍生物反應。 較佳地’該調理作用—抑制部分為一 PEG、PPG，或其衍 生物。經PEG或PEG-衍生物修飾的微脂體，有時稱為“ pEG 化微脂體”。 該調理作用抑制部分可藉多種已知技術結合於該微脂 體膜。例如—PEG之N_羥基琥珀醯亞胺酯可結合於一磷脂 :基乙醇胺脂溶性固定子，然後結合於一膜。同樣地，一 匍聚聚合物可經硬脂胺脂溶性固定子衍生，經由以 (CN)BH3及冷劑混合物，例如四氫呋喃及水於3〇 : 12於6 〇 度C進行還原性胺化。 表現本發明之雙股分子之載體已討論於上。此種表現 ^ 1種本發明之雙股分子之載體，亦可直接 適當的傳遞試劑投予，包括一…i =
劑;11 一一一細ln;或多：= 丄例如多離胺酸)，或微脂體。傳遞表現-本發明之雙股八 子之重組病毒載體？一政击 又瓜刀 術領域中已知以中之癌症區域之方法，為該技 本發明之該雙股分子， 症位置之任音方1 #⑴適於傳遞該雙股分子至癌 -方式，對該個體投予 基因搶、電穿孔，或其他適當的非…/雙％子可藉 適者麵臊π工 或及腸投予路徑。 適田^腸投予路徑包括口腔 通♦非口厢直腸或鼻腔傳遞。 過田非口服投予路徑包括血管内 ^ 脈輸液、動脈内注射、動 9如靜脈注射、靜 射動脈輸液和導管輪液到血管） 2125-9931 69 200920406 及組織内注射（例如腫瘤周邊腫瘤内注射 ' 網膜内注射，或 副網膜注射）；皮下注射或貯存，包括皮下輸液（例如渗透 系）；直接施用至癌症部位或附近部位，例如藉由導管或其 他放置具（例如—網膜丸粒或栓劑或含多孔、非多孔材質或 明膠狀之植入物);及吸入。較佳為注射或輸液該雙股分子 或载體，而提供在癌症部位或附近部位。 f 本發明之該雙股分子可以單一劑量或多重劑量投予。 ^輸液投予本發明之該雙股分子，該輸液可為單一持續 劑里或以多重輸液傳遞。直接注射該藥劑至組織時以癌症 部位或附近部位較佳。客 + 、 夕重主射該樂劑至組織時以癌症部 位或附近部位較佳。 熟悉該技術領域之人士，可輕易決定對m固體投 予本發明之該雙股公；夕、θ 、§1療程。例如可對該個體 技予一次該雙股分子’例如 早/主射或％存在該癌症部 位或接近該癌症部位。啖者， /者該又肊/刀子可對一個體每日 技予1或2次’期間約3至約 J ^天，更佳約7至約1〇天。 於較佳之劑量療程’該雙股分 于/主射在該癌症部位或接近 該癌症部位每天1泠盔 ，、、、 天。當一劑量療程包含多重投 予’應瞭解到對該個體投予之有效量雙股分子，可包含在 整個劑量療程中所投予之雙股分子總量。 示了以上本發明尚提供醫藥組合物 該雙股分子或編碼為該分子之盡㈣㈣ 供以下，人U子之载.體。具體而t，本發明提 供以下組合物[1]至[25].
2125-9937-PF 70 200920406 [1 ] 一種組合物’用於抑制癌細胞生長及治療癌症， 其中該癌細胞及該癌症表現擇自於EBI3、CDKN3、EF-ldel ta 或NPTXR基因中至少1種基因，該組合物包括至少j種經 分離之雙股分子，其抑制表現EBI3、CDKN3、EFMdel 或NPTXR及細胞增殖，該分子由一有義股及一其互補反義 股構成，彼此雜交以形成該雙股分子。 [2] 如[1]之組合物’其中該雙股分子作用於mRNA，該 mRNA 配對一擇自於 SEQ ID N0: 18(位於 SEQ ID NO: 1 之 679-697nt 位置）、SEQ ID NO: 20(位於 SEQ ID NO: 1 之 280-298ni;位置）、SEQ ID NO: 49(位於 SEQ ID NO: 5 之 -—328nt 位置）、SEQ ID NO: 51 (位於 SEQ ID NO: 7 之 225-243nt 位置）、SEQ ID NO: 84(位於 SEQ ID NO: 86 之 1280-1298nt 位置），及 SEQ IDN0: 85(位於 SEQ IDN0: 86 之1 393-141 1nt位置）之標靶序列。 [3] 如[2]之組合物，其中該雙股分子，其中該有義股 包含一序列對應於擇自於SEQ ID N0: 18、20、49、5卜84 及8 5之標乾序列。 [4 ]如[1 ]之紐合物，其中該欲治療之癌症為肺癌。 [5] 如[4]之組合物，其中該肺癌為NSCLC或SCLC。 [6] 如[1]之組合物，其中該組合物包含多種該雙股分 子； [7] 如[6]之組合物，其中該多種該雙股分子標靶於相 同基因。 [8 ]如[3 ]之組合物’其中該雙股分子長度少於約1 〇 〇
2125-9937胃 PF 71 200920406 核苷酸。 [9 ]如[8 1之圣 核苷酸。 、、且合物，其中該雙股分子長度少於約75 [1 0 ]如[Q 1 + Λ 核苷酸。 組合物，其中該雙股分子長度少於約50 [11]如 核苷酸。 ]之組合物，其中該雙股分子長度少於約25 [1 2 ]如「11 1 ^ 約25核苦酸。組合物’其中該雙股分子介於約19及 [13 ]如 f ] 1 苦酸構成，具該之組合物’其中該雙股分子由-單-多核 Γ1 、〜有義及反義股，以一中介單股連接。 L丄4」 如「1 ΓΛΊ Γη 3]之組合物，其中該雙股分子具通式 0 —la」~[b]、「a， Ί 0， 「 m -m ά, , [A]為該有義股，包含一序列對 應於擇自於Sp 皮 「 11 NO: 18、20、49、51、84 及 85 之標靶 序列，[B ]為却士人„ ’”〜中"單股，包括3至23個核苷酸，[a，]為 % 該反義股，包含— ° 3 互補於[A]之序列。 [5]如[1]之組合物，其中該雙股分子為一 rnA。 [16]如[1]之組合物’其中該雙股分子為dNA及/或 RNA。 [以]如[16]之組合物，其中該雙股分子為一 DNA多核 苷酸及~ RNA多核苷酸之一雜交體。 [18] 如[17]之組合物，其中該有義及該反義股多核苷 I ’各由DNA及RNA構成該有義及反義股。
[19] 如[16]之組合物’其中該雙股分子為DNA及RNA
2125-9937-PF 72 200920406 之一喪合體。 [20] 如[19]之組合物’其中反義股之3，端側區，或 有義股之5’端側區及反義股3’端側區兩者，為RNA。 [21] 如[20]之組合物，其中該側區由9至u核苦酸 構成。 [22] 如[11]之組合物，其中該雙股分子包含3，突出 物。 [3]如[1]之組合物，其中該雙股分子由—载體所編 碼’並包含於該組合物。 [24]如[23]之組合物，其中該雙股分子具通式 [][B] [A ]-3 ，[A]為該有義股，包含一序列對 應於擇自於SEQ Π) N0: 18、20、49、51、84及85之標靶 序列’ [B]為一中介單股，包括3至23個核苷酸，[a，]為 該反義股’包含一互補於[幻之序列。 [25]如[1]之組合物，其中該組合物包括一轉染增強 劑’及一醫藥上可接受之擔體。 本發明適當組合物將於以下更詳述。 本發明之該雙股分子較佳為在投予至一個體前，依照 該技術領域中已知技術，配方成醫藥組合物。本發明之醫 藥組合物，至少為無菌及無熱原。如此處所述，，’醫藥配 方包括配方供人類及獸醫用。供製備本發明醫藥組合物 之方法，落於該技術領域之範圍，例如敘述於Remingt〇n，s
Pharmaceutical Science, 17th ed. , Mack Publishing *
Company、Easton，Pa_ ( 1 985)，完整揭露納入於此作為參 2125-9937-PF 73 200920406 考0 本醬藥配方包含本發明至少丨種該雙股分子或編碼為 該雙股分子之载體（例如0.1至90重量％)，或該分子一生 理上可接受之鹽，與生理上可接受之擔體培養基混合。較 k之生理上可接受之擔體介質為水、經緩衝之水、生理鹽 水、0.4%鹽水、〇·3%甘胺酸、透明質酸等。 依照本發明，該組合物可包含多種該雙股分子，各該 分子可標靶於別13、（：1)〇3、心_1(1614及/或阶7找之相 同標乾序列或不同的標㈣列。例如該組合物可包含標# 於_、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR之雙股分子。或者， 例如該組合物可包含擇自於ΡΕβΙ3、cdkn3、及 NPTXR中1或2種以上標歡序列之雙股分子。 再者，該組合物可包含編碼為一或多數雙股分子之載 體。例如該載體可編碼i、2或數種該雙股分子。或者，該 組合物可包含多種載體， 科肢 戟菔‘碼為—不同的雙股分 于0 又’該雙股分子可以微脂體形式命. 銪目“ & 匕3在该組合物。細 使用該雙股分子治療癌症之方， 情。 ’敘述微脂體詳 个赞明之醫樂組合物尚可包括習知、 添加劑。適當醫藥賦形劑包括:安定劑樂賦形劑及/或 調節劑、緩衝液及PH調節劑。適當添加渗透壓 緩衝液（例如tromethamine鹽酸鹽）、承力 生理可相容 或_雙酿胺）或約螯合劑複合=合劑（例如刪 體（例如鈣DTPA、
2125-9937-PF 74 200920406
CaNaDTPA-雙醯胺），或選擇地，添加鈣或鈉鹽（例如氯化 鈣、抗壞血酸鈣、甘醇酸鈣或乳酸鈣）。本發明之醫藥組人 物可包裝成供液態形使用，或冷束乾燥。 針對固體組合物，可使用習知無毒固體擔體；例如醫藥 級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖 維素、葡萄糖、嚴糖、碳酸鎮等。 例如供口服投予之固體醫藥組合物，可包括上列任意 擔體及賦形劑，及1〇_95%，較佳25_75%之i種以上本發明 之雙股分子。供氣溶膠（吸入）投予之醫藥組合物，可包含 0.01—20重量％，較佳Pio重量％之i種以上本發明之雙股 分子，其封入在微脂體，如上所述，及推進劑。視需要， 尚可包括擔體；例如卵磷脂，以供經鼻腔傳遞。 除了以上，該組合物可包含其他醫藥活性成分，只要 其不抑制該雙股分子體内功能即可。例如該组合物可/包含 習知用於治療癌症之化療藥劑。
於另一實施形態，本發明尚提供使用該本發明之雙股 核酸分子，以製造治療表現EBI3、CDKN3、EF_ideita或 NPTXR之肺癌之醫藥、组合物。例如本發明係關於使用雙股核 酸分子抑制一細胞中表現擇自於EBI3、CDKN3、EF_ldelta 及NPm之基因，該分子包括—有義股及— 彼此雜交以形成該雙股核酸分子，並縣於擇自於_11} 18 20 49、51、84及85之序列’以供製造治療表 現EBI3、CDKN3、EF-Idelta或NPTXR之肺癌的醫^組合物。 或者，本發明尚提供一方法或處理，供製造醫藥組合
2125-9937-PF 75 200920406 物以治療表現EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR之肺癌， 其中該方法或處理包括以下步驟：將醫藥上或生理上可接 党之擔體與一雙股核酸分子一起配方，該雙股核酸分子抑 制表現EBI3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR於一細胞，該細 胞過度表現該基因，該分子包括一有義股及一互補的反義 股，彼此雜交以形成該雙股核酸分子作為活性成分，並標 把於擇自SEQ ID NOs: 18、20、49、5卜84及85之序列。 於另一實施形態，本發明尚提供一方法或處理，供製 造醫藥組合物以治療表現EBI3、cd〇3、EF_ldelta或nptxr 之肺癌，其中該方法或處理包括以下步驟：將一活性成分與 一醫藥上或生理上可接受之擔體，其中該活性成分為一雙 股核酸分子，該雙股核酸分子抑制表現EBI3、cDKN3、 EF-1 delta或NPTXR於一細胞，該細胞過度表現該基因，該 分子包括一有義股及一互補的反義股，彼此雜交以形成該 雙股核酸分子並標靶於擇自SEQ ID NOs: 18、20、49、51、 8 4及8 5之序列。 珍斷肺癌之方法· 表現 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 發現係 在肺癌細胞特別升高（國i、5、7、8及16)。因此’此處鑑 別之基因及其轉錄及轉譯產物，作為肺癌標記具有診斷利 用性，且藉測量於細胞樣本之EBI3、DLX5、Νρτχι、 或EF-ldelta表現，可診斷肺癌。具體而言，本發明提供 一種#，肺癌之方法’係藉決定一個體中之丨3、DLX5、 NPTX1、CDKN3或EF-ldelta表現程度。可由該方法診斷之
2125-9937-PF 76 200920406 肺癌’包括NSCLC及SCLC。A本x ^ i ^ w ί^ΓΓΛ ，NScLC ,包肺腺癌及肺鱗 狀細胞癌(SCC)，亦可由本發明診斷❹測。 =本發明，可提供檢驗—個體之條件的中間結果。 ^ , 卜貝訊組合，以協助醫師、護士或 其他開業人員診斷一個體罹Φ /疾病。或者，本發明可用 於偵測一個體來源組織中之癌 , 夂化細胞，並提供一醫師有用 資訊以供診斷該個體罹患該疾病。 具體而言，本發明提供以下方法⑴至⑴]: [1] 一種診斷肺癌之方法，芎 邊万法包括以下步驟： ()偵測於生物學樣本中編碣為ΕΒΙ3、或 EF-ldelta之胺基酸序列的基因表現程度；及 一 ⑻相較於該基因正常控制組水平，將存在該疾病下表 現程度增加做一關連。 [2] 如[1]之方法，其中該表現程度大於該正常控制組 水平至少10%。 i [3] 如[1]之方法，其中該表現程度由擇自以下方法偵 測： ' (a) 偵測包括 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 之序列的mRNA， (b) 偵測包括 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 之胺基酸序列的蛋白質，及 (c) 偵測包括 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 之胺基酸序列的蛋白質之生物活性。 [4] 如[1]之方法，其中該肺癌為NSCLC或SCLC。 * 2125-9937-PF 77 200920406 [5]如[3]之方法，其中該表 該基因之基因轉錄物而較。 “貞測雜交-探針至 [6 ]如[3 ]之方法，其中該表現程 編碼為一基因之蛋 3偵剩—抗體對抗 发白質之結合，作為該 [7] 如[1]之方沐* 士 u之表現程度。 J之方法，其中該生物學樣本 血液。 匕括生檢、痰或 其中該個體來源之生物學樣本包括 [8] 如[1]之方法 一上皮細胞。 [9 ]如[1 ]之方法 癌細胞。 其中該個體來源之生物學樣本包括 [10]如[1]之方法，其中該個體來 括-癌化上皮細胞。 玍物予樣本包 該診斷肺癌之方法將更詳述如下。 以該方法診斷之個體，較佳為一 31 y 礼動物。例示之哺 :?物包括但不限於例如:人類、非人類之靈長類、小鼠、 大乳、狗、貓、馬及牛。 =為從欲診斷之對項收集生物學樣本，以實施診 斷任思生物學材料可作為該生物學樣本，以供決定，。 要其包括ebI3、DLX5、NPTX1、c聰或EF_idejta、之目標 轉錄或轉譯產物。該生物學樣本，包括但不限於體組織I 體液’例如血液、痰及尿液。較佳地，該生物學樣本包含 一細胞群體，包含一上皮細胞，更佳為癌化上皮細胞或來 ::疑癌化之組織.的上皮細胞。再者，視需要，該細胞可 從得到之體組織及體液純化，然後用為該生物學樣本。
2125-9937-PF 78 200920406 依照本發明，該個體來源之生物學樣本中之Εβι 3 DLX5、ΝΡΤχι、CDKN3或EF_ldelta該表現程度被決定。該 表現程度可使用該技術領域中已知方法，在轉錄（核酸）產 物層級決定。例如 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 之inRNA，可使用雜交方法（例如北方雜交）之探針定量。該 偵測可於一晶片或陣列上實施。使用陣列較佳為供偵測多 種基因（例如各種癌症專一性基因），包括Εβ丨3、、
NPTX1、CDKN3或EF-ldelta之該表現程度。熟悉技藝之人 士’ 可利用 EBI3(SEQ ID NO IGenBank 登記編號： NM—005755)或 DLX5(SEQ ID NO 3;GenBank 登記編號： BC006226)或 NPTXK SEQ ID NO;78;GenBank 登記編號 NM—002522)或 CDKN3(SEQ ID NO 5;GenBank 登記編號 L27711)或 EF-ldelta(SEQ ID NO 7;GenBank 登記編號 BC009907)之序列資訊，製備此種探針。例如別13、汕託 NPTX卜CDKN3或EF-ldelta之cDNA可作為探針。視需要 該探針可以適當的標記加標記，例如染料、螢光劑及同位 素，該基因之表現程度，可以經雜交標記之強度之形 測。 又〜侦 再者，EBI3、DLX5、ΝΡΤΠ、CDKN3 或 EF-lde]十 丄τ a之轉 錄產物，可使用放大系偵測方法（例如， 」用啟動 子定量。此種啟動子尚可依據該基因可得序列資訊製備 例如實施例中使用之該啟動子（SEQ ID N〇 9及1〇、 22、34 及 35,或 36、37、80及 81)，可用於以 = 北方墨點偵測，但本發明不限於此。 5
2125-993 7-PF 79 200920406 。：體而言’用於該方法之探針或啟動子，在嚴苛、中 度嚴可或低度嚴苛條件在雜交於ΕβΙ3、DLX5、、⑶κΝ3 或” EF ldelta之mRNA。此處使用之用語，，嚴苛（雜交）條 件，係扣於此條件下，一探針或啟動子將雜交於其標靶 序列，但不會雜交於其他序列。嚴苛條件為序列依存性， 且在不同的環境下不同。較長序列之專一性雜交在較高溫 度下觀察到，相較於較短序列。一般而言，一嚴苛條件之 ί溫度，低於一特定序列在限定離子強度及PH下之熱溶點（Tm) 約5度。Tm為（在限定離子強度、pH及核酸濃度）下，互補 於該標靶序列50%之探针，在平衡下會雜交於該標靶序列之 溫度。由於該標粗序列一般而言過量，在^，5〇%的探針在 平衡下會被佔據。一般’嚴苛條件為鹽濃度少於約h 〇 Μ 納離子’通常約0.01至鋼離子（或其他鹽），於ρΗ7.〇 至8. 3’對短探針或啟動子（例如1〇至5〇核苷酸）溫度為至 ^，力30度c，對長探針或啟動子，至少約6〇度c。嚴苛條 I; 件可藉添加去安定化劑，例如曱醯胺達到。 或者，可偵測該轉譯產物供本發明之診斷。例如可決 定 ΕΒΙ3、DLX5、NPTX1 ' CD〇3 或灯―ldeita 蛋白質量。用 於決定蛋白質量作為該轉譯產物之方法，包括免疫分析方 法，其使用專一性認識該蛋白質之一抗體。該抗體可為單 株或多株。再者，該該抗體之任意片段或修飾（例如嵌合抗 體、scFv、Fab、F(ab，）2、Fv等）可用於债測，只要該片 段保留對 EBI3、DLX5、NPTX1.、CDKN3 或 EF_ldelta 蛋白質 之結合能力即可。製備此等種類抗體供偵測蛋白質之方
2125-9937-PF 80 200920406 法’為該技術領域中熟知，且可在本發日月中採用任何方法 以製備此種抗體及其均等物。 另一依據轉譯產物偵測別13、DLX5、NPTX1、CD〇3或 EF-ldelta基因之表現程度之方法，為使用對抗Εβΐ3、 DLX5、ΝΡΤΧ卜CDKN3或EF-ldelta蛋白質之抗體，經免疫 組織化學分析觀察染色強度。即，觀察到強染色，代表增 加蛋白質存在，且於相同時間EBI3、DU5、Νρτχι、cdkn3 或EF-ldelta基因之南表現程度。 又，除了該 EBI3、DLX5、ΝΡΤΧΙ、CDKN3 或 EF-ldelta 基因之表現程度，其他癌症關連基因之表現程度，例如已 知差別地在肺癌表現之基因，亦可決定以改善診斷正確性。 癌症標S己基因包括EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3或 EF-ldelta基因於一生物學樣本之表現程度，若由該對應的 癌症標記基因之控制水平增加例如1〇%、25%、或5〇%;或增 加大於1.1倍、大於丨.5倍、大於2()倍、大於5〇倍、 大於1 0. 0倍以上，可認為是增加。 、該控制水平V以與測試生物學樣本同日夺使用前面收集 並保存之來自疾病狀態（癌化或非癌化）已知之個體/多個 個體之的樣本決定。或者，該控制水平可依據分析前面決 定之來自疾病狀態為已知之個體的樣 —…-一因之表現程度，以統計:法 決定。再者’該控制水平可為-資料庫，A來自前面測定 過細胞之表現模式之資料庫。又，依照本發明一態樣，一
生物子铋本之 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 基 2125-9937-PF 81 200920406 因之表現程度，可與多重控制水 重參考樣本決定。較佳為使用從來自於類㈣制水平從多 物學樣本之έ且繃豳别 ' 1似病患來源之生 子作本之组織類型的參考 為’使用具已知疾病狀態之群體中：制：平。又較佳 咖或一㈣因之表現:二:=7、 ;技術領域中已知之任意方法得到。例如平二= 3’平均值+/~3S.D·之範圍，可作為標準值。 於本發明之内容，你Α — 已知未癌化之生物學樣本決定之 控制水平，稱A “正常控制組水平 制水平從一癌化生物學樣太ρ^ 方面，右該控 一 物學樣本決定，稱為“癌化控制水平,，。 現泡 Ϊ 助，5、NPTX1、CD〇3 或 EF~ldelt4 因之表 x相較於正常控制組水平為增加或類似於該癌化控 制水平’該個體可診斷為罹患或有發展成癌症之風險。再 =，當比較多重癌症相關之基因之表現程度，樣本及癌化 >考值之基因表現模式之類似性，代表該個體罹患或有發 展成癌症之風險。 測試生物學樣本之該表現程度與控制水平間之差異， 可常態化至控制核酸例如家管基因之表現程度，其表現程 度已知不依存於該細胞之癌化或非癌化狀態而不同。例示 之控制基因包括但不限於beta_m動蛋白、甘油駿3磷酸 鹽（酯）去氫酶，及核糖體蛋白質Pi。 g量癌症预德 之方法： 本發明係關於新穎的發現，EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及EF-1 delta表現於病患不良預後顯著相關。因此，本發
2125-9937-PF 82 200920406 種決定或評量羅患癌症尤其肺癌之預後之方法， =貞：，病患之生物學樣本中腕、du5、咖、_ 二 delta基因之表現程度；比較偵測到之表現程度 制水平；及^表現程度對控制水平之增加，作為不 良預後（不良存活率）之指標。 在此’用語”預後，'係指預期該疾病可能後果及由該案 例之天性及症狀預期能從疾病康復。因此，較不利、負面、、 不良預後，由一較低處理後存活期間或存活率所定義。反 有利或良好預後，定義為提高之處理後存活期 間或存活率。 用砰量預後”，指預測、預報或將一給定偵測測量 值與病患之癌症未來後果（例如轉為驗、可能治癒癌症、 存活等）相關連之能力。例如’決定EBI3、dlx5、肝阳、 CDKN3及/或EF_ldelta經時之表現錢，能㈣該病患後 果（例如增加或降低轉為惡性、增加或降低癌症程度，可能 治癒癌症、存活等）。 於本發明之内容，用語評量（或決定）預後，，，意欲包 3預測及可能分析癌症、進展、特定癌症再發、轉移散播 及疾病復1 |評量預後之方法，意欲在臨床上使用於決 疋關於⑺療巾斷’包括治療中介，診斷準則例如疾病階段， 及疾病！〇控，备控轉移或癌症再發。 用於本發明之病患來源之生物學樣本，可為來自該欲 評！個體之任意樣纟’只要是可在該樣本中偵測㈣EBI3、
DLX5 NPTX1、CDKN3及/或£F_ldel ta基因即可◎較佳地， 2125-9937-PF 83 200920406 該生物學樣本為一肺細胞（從肺得到之細胞）。再者，該生 物學樣本可包括體液例如痰、血液、血清或血漿。又，該 樣本可包括從一組織純化之細胞。該生物學樣本可從一病 患在各種時間點得到，包括治療前、治療中，及/或治療後。 依照本發明，顯示病患來源之生物學樣本中測量到較 尚的 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 基因表 現程度，則處理後減輕、恢復及/或存活的預後較不佳，且 不良臨床後果之可能性較高。因此依照該方法，用於比較 之"控制水平”，可為例如在一個體或一個體之群體中在任 一種治療前偵測到之EBI3、DLX5、Νρτχι、CDKN3及/或 EF-ldelta基因表現程度，治療後其顯示良好或正面癌症預 後，在此稱為”良好預後控制水平"。或者該,,控制水平"可 為例如在一個體或一個體之群體中在任一種治療前偵測到 之 EBI3、DLX5、NPTX1、CD03 及/或 EF-ldelta 基因表現
程度，其治療後顯示不佳或負面癌症預後，在此稱為”不良 預後控制水平”。該”控制水平”為來自單一參考群體之一 ^ 一表現模式，或多數表現模式。因此該控制水平可依據一 癌病患在任一種治療前偵測到之EBI3、DU5、Νρπι、⑶尺⑽ 及/或EF-ldelta基因之表現程度決定’或一病患群體其疾 病狀態（良好或不良預後）為已知。較佳地，癌症為肺癌。' 較佳為使用已知疾病狀態之病患群中之EBI3、讪Μ、 NPTX；l、CDKN3及EF-ldelta基因該表現程度的標準值。該 標準值可由該技術領域中已知任意方法得到。例•如平均值 仏2 S.D.或平均值+/- 3 S.D.之範圍可作為標準值。
2125-9937-PF 84 200920406 該控制水平可與測試生物學樣本同時決定，係使用先 别收集並保存之來自疾病狀態（良好預後或不良預後）已知 之接受任意種治療前之癌病患（控制或控制組）之樣本決 定。 或者’該控制水平可依據分析前面決定之來自控制組 樣本中之 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF_ideita 基因之 表現程度，以統計方法決定。再者，該控制水平可為一資 料庫，為來自前面測定過細胞之表現模式之資料庫。 又，依照本發明一態樣，一生物學樣本之em3、dlx5、 NPTX1、CDKN3或EF-ldelta基因之表現程度，可與多重控 制水平比較，該控制水平從多重參考樣本決^較佳為: 用從來自&類似病患來源之生物學樣本之組織類型的參考 樣本決定之控制水平。 依，、、、本發明，與一良好預後控制水平在13、 隨卜CDKN3及/或EF —ldelta基因表現程度之類似性，代 表該病患較有利㈣’及該表現程度對良好預後控制水平 之增加’代表處理後減輕、恢復、存活及/或臨床後果較不 利不良預後。另-方面，EBI3、DU5、肝τχι、⑽们或 EF-ldelta基因之表現程度對於不良職控制水平降低，代 表該病患之較有利預後，該表現程度對不良預後控制水平 之類似性，代表處理後減輕、恢復、存活及/或臨床後果較 不利、不良預後。 DLX5、NPTX1、CDKN3 及 / 當該表現程度與該控制水 於了生物學樣本中，EBI3、 或EF-ldelu基因之表現程度，
2125-9937-PF 85 200920406 平差距大於l 〇、1· 5、2. 0、5· 0 改變。 10. Ο倍以上 可認為已 測试生物學樣本之該表現程度與控制水平間之差異， 可常態化至控制多核普酸例如家管基因之表現程度，其表 現程度已知不依存於該細胞之癌化或非癌化狀態而不同： 包括編碼為beta-肌動蛋白、甘祕3 _酸鹽（醋）去氮 酶，及核糖體蛋白質P1之基因，可用於將別^此^、 隨卜CDKN3及/或EF_ldelta基因之表現程度常態化。 該表現程度可藉由偵測病患來源之生物學樣本之中的 基因轉錄物決定，使用該技術領域中已知之技術。由該方 法偵測之基因轉錄物，包括轉錄及轉譯產物，例如及 蛋白質。 例如 EBI3、DLX5、NPTX1、CMN3 及/或 EF-ldelta 基 因之轉錄產物，可由雜交偵測，例如北方墨點雜交分析， 其使用對於基因轉錄物之EBI3、DLX5、Νρτχι、⑶κΝ3及/ 或EF —ldelta基因探針。該偵測實施在晶片或陣列上。使 用陣列較佳為偵測該多種基因包括EB13、DLX5、NPTX1、 CDKN3及/或EF-ldel ta基因之表現程度。作為另一例，可 採用放大系谓測方法，例如反轉錄系聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) ’ 其使用專一於 EBI3、DLX5、Νρτχι、CDKN3 及 / 或EF-ldel ta基因之啟動子，供偵測（見實施例）。可使用 習知技術’參考 EBI3、DLX5、ΝΡΠ1、CDKN3 及 / 或 EF-ldelta 基因（各今SEQ ID NO: 1、3、5及7)之完整序列，設計並 » 製備 EBI3、DU5、ΝΡΠ1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 基因專
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一性探針或啟動子。例如實施例中使用之啟動子（SEQ ID
NOs: 9 and 10(EBI3) 、 21 及 22(DLX5) 、 82 及 83(ΝΡΤΧ1)、 34 及 35(CDKN3)、36 及 37(EF-ldelta))，可採用於以 RT-PCR 供偵測，但本發明不限於此。 具體而言，該方法使用之探針或啟動子，在嚴苛、中 度嚴苛，或低度嚴苛條件雜交於EBI3、DLX5、Νρτχι、⑽ 及/或EF-ldelta基因之mRM。此處使用之用語，，嚴苛（雜 交）條件”，係指於此條件下，一探針或啟動子將雜交於其 標把序列’但不會雜交於其他序列。嚴苛條件為序列依存 j ’且在不同的環境下不同。較長序列之專一性雜交在較 高溫度下觀察到，相較於較短序歹,】。一般而言，一嚴苛條 件之溫度’低於 特定痒万丨I ， 行疋序列在限定離子強度及ΡΗ下之熱熔 點（Tm)約5度。Tin為（在限定離子強度、ρΗ及核酸濃度）下， 互補於該標乾序列50%之探針，在平衡下會雜交於該縣序 列之溫度。由於該標靶序列一般而言過量，在π，5。%的探 針在平衡下會被佔據。_ An. , ,., 般嚴可條件為鹽濃度少於約1 〇 Μ納離子’通常約0.01il.〇M鈉離子（或其他鹽），於邱 U至8.3’對短探針或啟動子（例如1()至^核普酸）温度 為至少約30度C ’對長探針或啟動子，至少約6〇度c。嚴 苛條件可藉添加去安定化劑，例如甲醯胺達到。 或者，該轉譯產物可供評量本發明之谓測。例如可決 定EBI3、DLX5、ΝΡΤΧ1、咖或奵―1(1心蛋白質量。用 於決定蛋白質量作為該轉譯 , 芊座物之方法，包括免疫分析方
法，其使用專-性認識該EM3、DU5、Npm、⑽⑽U
2125-9937-PF 87 200920406 或EF-ideUa蛋白質之一抗體。該抗體可為單株或多株。 再者，該該抗體之任意片段或修飾（例如谈合抗體、MV、
Fab、FUb’）2、Fv等)可用於侦測，只要該片段保留對 EBI3、DLX5、ΝΡΠ卜CMN3或EF_ldeHa蛋白質之結合能 力即可。製備此等種類抗體供偵測蛋白質之方法，為該^ 術領域中熟知，且可在本發明中採用任何方法以製備此種 抗體及其均等物。 另一依據轉譯產物偵測EBI3、DU5、Νρτχι、cmn3或 EF 1 de 1 ta基因之表現程度之方法，為使用對抗別13、 • DLX5、ΝΡΤΠ、CDKN3或EF一ldelta蛋白質之抗體，經免疫 組織化學分析觀察染色強度。即，觀察到強染色，代表增 加蛋白質存在，且於相同時間ΕΒΠ、DLX5、NPTX1、CDKN3 或EF-ldelta基因之高表現程度。 再者，EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 蛋 白質已知具有細胞增殖活性。因此，EBI3、DLX5、Νρτχι、 CMN3及/或EF-ldelta基因之表現程度可使用細胞增殖活 性作為一指標來決定。例如製備表現EBI3、DLX5、ΝΡΉ1、 CDKN3及/或EF-ldel ta之細胞，並培養於一生物學樣本存 在下，然後偵測增殖速度’或測量細胞週期，或決定該生 物學樣本之細胞增殖活性、群落形成能力。 又，除了 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 基因之表現程度，其他肺癌關連基因之表現程度，例如已 知差別地在肺癌表f見之基因，亦可決定以改善評量正確 性。此其他肺細胞關連基因例，包括敘述於W0 2004/031 41 3 2125-9937-PF 88 200920406 内容納於此作為參考。 可k供除了其他供評量一個體預 此種中間結果，可以協助醫師、 、決定或評估該個體預後。本發 及 WO 2005/090603 者， 或’依照本發明， 之結果外的中間結果。 士或其他開業人員評量 得到之中間結果可與額外資 括臨床及物理條件之預後。 後 護 明 訊組合考量，以評量一個體包 依照該方法評量癌症預後之病患，較佳為一哺乳動 物’包括人類、非人類靈長類、小鼠、大氣、狗、貌、馬 及牛。 診斯癌症或JgJt癌症預拣之_ · 本發明提供一種套組，用於診斷癌症或評量癌症預 後。較佳地，該癌症為肺癌。具體而言該套組包括至少工 種樂劑’供偵測病患來源之生物學樣本中之Eg 13、DLX5、 ΝΡΤΧ1、CDKN3及/或EF-ldelta基因表現，該藥劑可擇自於 以下族群： (a) — 藥劑’供偵測 EBI3、DLX5、ΝΡΠ1、CDKN3 及 /或 EF-ldelta 基因之 mRNA; (b) — 藥劑’供偵測 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta蛋白質；及 (c) 一 藥劑’供偵測 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 /或 EF-ldel ta蛋白質之生物活性。 供偵測 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 基因之mRNA核酸的適當藥劑，包括專一性結合於或識別 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 / 或 EF-ldeltamRNA 之藥劑， 2125-9937-PF 89 200920406 例如具對於 eBI3、DLX5、nptx1、CDKN3 及/或 EF_ideitamRM 之一部分為互補之序列的募核苷酸。此等種寡核苷酸，例
如專一於 EBI3、DLX5、NPTX卜 CDKN3 及/或 EF_ldelta mRNA 之啟動子及探針。此種募核苷酸可依據該技術領域中已知 方法製備。視需要，供偵測13、DLX5、NPTX1、CDKN3及 /或EF-ldelta mRNA之藥劑，可固定化於一固體基質。又， 該套組中可包括多於1種偵測Ebi 3、DLX5、NPTX1、CDKN3 《 及/或EF-ldelta mRNA之藥劑。 另一方面，供偵測£BI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-ldelta蛋白質之適當藥劑’包括對於EBI3、DLX5、 NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelte蛋白質之抗體。該抗體可 為單株或多株。再者該抗體之任意片段或修飾（例如嵌合抗 體、scFv、Fab、F(ab’ ）2，Fv等）可作為該藥劑，只要該 片段保留對於 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 / 或 EF-ldelta 蛋白質之結合能力即可。製備此種抗體供偵測蛋白質之方 (j 法，為該技術領域中已知，且任意方法可採用在本發明以 製備此種抗體及其均等物。再者，該抗體可經由直接連結 或非直接標記技術進行標記。標記及用於標記抗體之方 法’及憤測抗體結合於其標靶之方法，為該技術領域中已 知’且任意標記及方法可用在本發明。又，大於1種供偵 測 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 / 或 EF-ldelta 蛋白質之 藥劑，可包括於該套組。 再者’該生物活性，可藉由例如測量因為在該生物學 樣本中表現 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 蛋
2125-993 7-PF 90 200920406 白質所致細胞增殖活性決定。例如該細胞在存在病患來源 之生物學樣本下培養，然後偵測增殖速度，或測量細胞週 期或決定該生物學樣本之群落形成能力、細胞增殖活性。 視需要’可將供偵測EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-ldelta mRNA之藥劑固定化在一固體基質。又，大於1 種供偵測 EBI3、DLX5、NPTX卜 CDKN3 及 /或 EF-ldelta 蛋 白質之藥劑，可包括於該套組。 該套組可包含大於1種前述藥劑。再者，該套組可包 括一固體基質及供結合一探針到EBI3、DLX5、NPTX卜CDKN3 及/或EF-ldelta基因之藥劑，或對於EBI3、DLX5、Νρτχι、 CDKN3及/或EF-ldelta蛋白質之抗體、一培養基、一容器 供培養細胞 '陽性及陰性控制藥劑’及2次抗體供偵測對 於 EBI3、DLX5、NPTX1、CMN3 及/或 EF-ldelta 蛋白質之 抗體。例如從具良好預後或不良預後之病患得到之組織樣 本，可作為有用的控制藥劑。本發明之套組，尚包括其他 材料，為市售所望及使用者立場需要的，包括緩衝液、稀 釋液、濾材、針筒，及包裝指示供使用說明（例如書面、錄 音帶、CD-ROM等）。此等藥劑及此等，可包含在經標示的容 器中。適合容器包括瓶、小瓶、試管。該容器可從各種材 料製作，例如玻璃或塑耀L。 作為本發明之實施形態，當該藥劑為對著13、 ΝΡΤΠ、CDKN3及/或EF —ldelta mRNA之一探針，該藥劑可 固定化在一固體基質，例如多孔帶，以形成至少、ι種積測 部位。多孔帶之測量或偵測區，可包括：多數位置，各包含
2125-993 7-PF 91 200920406 一核酸（探針）。測試帶可包含陰性及/或陽性控制組之位 置。或者，控制位置可位在不同於測試帶之帶上。選擇地， 不同的偵測位置可包含不同量的固定化核酸，即在第：偵 測部位較高量，在接續位置較低量。當添加測試樣本，顯 示可偵測之訊號之位置號碼，提供定量指示EBI3、DLX5、 NPTXl ' CDKN3及/或EF-ldel ta mRNA在樣本中之量。該偵 測位置可為任意適當可偵測外形，通常為棒形或散在測試 帶上寬度之點。 本發明之套組可尚包括一陽性控制組樣本或Eg I 3、 DLX5、NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelta標準樣本。本發明 之％性控制組樣本，可藉收集EB13、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或EF-ldelta陽性血液樣本製備，然後分析EBI3、 DLX5、NPTX1、CDKN3 及 / 或 E：F-ldelta 水平。或者，可將純 化 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 蛋白質或多核 苷酸加至不含 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 之血清以形成該陽性樣本或EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及 /或EF-ldelta標準。於本發明，純化KDD1可為重組蛋白 質。陽性控制組樣本之EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-ldelta水平，例如大於截止值。 肺癌的血清學診: 藉測量個體來源之血液樣本之EBI3水平，可決定發生 或對發展成表現EB13癌症之易染病體質的個體。該癌症可 ，為肺癌例如NSCLC及SCLC。又，SCLC包括肺腺癌及肺鱗狀 細胞癌（SCC)。因此’本發明涉及決定（例如測量）血液樣本
2125-9937-PF 92 200920406 中之EBI3水平。於本發明診斷肺癌之方法更包 測肺癌之方法。或者，於，恭 式或債 個"… 發明，珍斷肺癌更係指顯示- 個體中之肺癌懷疑、風險或可能性。 或者，藉測量個體來源之血液樣本之Νρτχι水 =或:發展成表現，之scc之易染病體質的個 水平於太明涉及決定(例如測量)血液樣本中之咖 發明診斷SCC之方法更包括測試或相SCC之 。或者，於本發明，診斷scc更係指顯示—個體中之 肺癌懷疑、風險或可能性。 可使用任意血液樣本供決定EBI3或Νρτχι水平，。要 1該樣本中可侦測到ΕΒΙ3^ρτχ^基因或蛋白質。較佳 壬，該血液樣本包含全血、血清，及血漿。 t ;本發明，血液樣本中之NPTX1水平，，係 才曰在板正全血中血球體積後，血液中咖3或⑽阳之濃 2熟悉此項技藝之人士，將瞭解血液中之血球體積百分 個體間差異大。例如全血中紅血球百分比，在男性及 女性非常不同。再者，個體差異不能忽略。因此’全血中 物質之外觀濃度，包含血球成分取決於血球體積差異大。 更血清中之濃度相同，針對具大量血球成分之樣本 、則疋值’會較低於具小量血球成分之樣本的測定值。因 此’為比較血液中之成分測量值，通常採將血球 以 校正後之值。 例如藉測量血液中之成分，使用從全止分離之血液細 胞得到之血清或血难你 * 月及水作為樣本，得到之測量值為已移除血
2125-993 7-PF 93 200920406 球體積之值。因此本發
+贫明之EBI3或NPTX1水平，可經當LV 血>月或血漿中之濃度測定。或者，可以、 然後’校正來自於血球 …辰度測定， 找垆籍夕η 積之效果。測量全血樣本中之血 球體積之法為已知。 π 依照該方法診斷肺癌或scc之個 且包括人類、非人類靈長類、小鼠、大為：礼動物 牛。本發明較佳個體為人類。 ’夂 於本發明’—個體 體。該病患可由本發明，斷二广之病患或健康個 坩+贫明矽斷以促進臨床決定。於 形態’本發明可應用於健康個體供篩選肺癌或scc。" :者二：提供檢驗一個體之條件的中間結果。此種中 間結果，可與額外資訊組 蒙人昌-齡, 乂協助谴師、護士或其他開 業人貝矽斷一個體罹患該 -個體來源組織中之癌化"者树明可用於僅測 Λ中之癌化細胞，並提供一醫師有用資訊以 供診斷該個體罹患該疾病。 ° 於本發明之實施形態之水平係藉測量_蛋白 貝於血液樣本中之量或濃度決定。決定Εβί 樣本之量之方法，包括免疫分析方法。 貝於血液 本發明之診斷方、;+ __ . _ 斷方法中’可除了助之血液濃度，決定 CEA或pro-GRp血液濃产 -㈣π 士 肺癌。因此，本發明提供 e斷肺癌之方法，其中當Ε 血液濃度其中之-或兩* a 或㈣或_省 次兩者，南於健康個體，偵測為肺癌。 癌胚胎抗原& ^ .. )為一吊研九的癌症包括肺癌的腫瘤 標§己。 、
2125-993 7-PF 94 200920406 pr〇-胃泌素_釋放胜肽（pr〇—GRp)為小細胞肺癌 的記:如前所述，⑽或则-GRP已用於血清學的標記 供矽斷或伯測肺癌。麸而ΓΐΓ,、 之雷姑由亡* 或pro—GRP作為肺癌標記 之靈敏度有時對於完全侦測肺癌尚不足。 診斷肺癌之靈敏度。 ⑥要改進 於本發明，提供肺癌之新穎血清學標記_。對 肺癌之診斷或债測方法之靈敏度改進，可由本發明達成 棱供—種診斷於-個體中之肺癌之方法，包括 以下步驟： 乃古包括 (a) 從欲診斷之個體收集血液樣本； (b) 決心該血液樣本中之EBI3水平. 二决定之ΕβΙ3水平及正常控制組之程 代表該個體罹患肺癌。 夂千 體中之scc之方法括，本發明提供一種診斷於-個 电 包括以下步驟： ((:)):=欲診斷之個體收集血液樣本中之ΕβΙ3水平. (b)比較步驟(a)中決定之別 千’ 度，其中血液樣本中，相h A 之程 代表該個體罹患肺癌。 '' NEBI3水平， 於較佳實施形態，當為 或摘測方法可尚包括以下步驟·，月形’本發明之診斷 ⑷決定該血液樣本中之CEA水平. ⑷比較步驟⑷中决定之㈤ 度；及 卞及正常控制組之程 2125-9937-pf 95 200920406 (f)判斷在血液樣本中，相 及高CEA纟平其中之—或兩者 其 NSCLC 。 較於正常控制組有高EBI 3 ’則代表該個體罹患肺癌尤 f B13及CEA間之組合，供偵測肺癌尤其nsclc之靈 敏度，可顯著改進。例如於下述在工作例中分析之族群， 針對肺癌之CEA陽性率約比較上，組合⑽及咖3 玲力，到64. 9 %(圈4C左分格）。於本發明”組合CEa及 EBI3係指將CEA及EBI3其中之一或兩者水平作為標記。 於該較佳實施形態’ -病患# CEA及EBI3其中之—為陽 性，可判斷具肺癌高風險。針對肺癌使用組合EBI3及cEA 作為血清學的標記為新穎的。 針對患SCC之病患之R〇c分析，決定CYFRA之截止值 為 2.0ng/ml’ 靈敏度 48 6%(37 中之 18)，專一性 2 3%(13〇 中之3·’圈4C，中上分格）。血清EBI3及CYFRA之相關係 數，不顯著（Spearman rank 相關係數：（rho)= -〇· ι ;ι 7 ;户 =〇· 481 7)，代表測量血清中2標記，可改進整體偵測scc 之靈敏度至78· 5%;針對診斷see，CYFRA單獨之靈敏度為 48. 6%(37 中之 18)，EBI3 為 54. 1%(37 中之 20)。2 腫瘤標 s己其中之一之偽陽性率，在正常自願者（控制組），為 4· 6%(13〇中之6)，雖相同控制組中CYFRA及EBI3之偽陽 性率各為2· 3%(130中之3)及2. 3°/。（130中之3;圈4C ,中下 分格）。 ϊ為see時’本發明之診斷或彳貞測方法可尚包括以下 步驟：
2125-9937-PF 96 200920406 (d) 决疋該血液樣本中之cyFRA水平； (e) 比較步驟（d)中決 工 程度；及 疋之C舰水平及正常控制組之 (f) 判斷在血液枵太士 及高WRA水平其中之’ T於正常控制組有高則 尤其scc。 或兩者，則代表該個體罹患肺癌 或者當為SCLC時，本發明 以下步驟： 發月之-斷或偵測方法可尚包括 ⑷決定該血液樣本中之咖⑽水平； (e)比較步驟中沐 之程度.及 、疋之pro-GRP水平及正常控制組 (Ό判斷在血液樣本中， „ ^ 相較於正常控制組有高EB13 及问pro-GRP水平j：中之一 癌尤其SI 、 &兩者，則代表該個體羅患肺 及ΡΓ〇 GRP間之組合，供偵測肺癌尤其SCLC 之靈敏度，可_宴； ^ ^ ‘‘ °例如於下述在工作例中分析之族 群，針對肺癌之pr〇_GRp陽性 J 1土平約b 7. 5 %。比較上，組合
Pro-GRP 及 EBI3 增加到 76 3 «/f m π . . ^. ” · 13 /d(圖4C ’右分格）。於本發 « Pro GRP及EBI3係指將pr〇_GRp及ΕβΙ3其中之 -或兩者水平作為標記。於該較佳實施形態，一病患具 Pro-GRP及EBI3其中之一 A陽u . τ ^ 马~性，可判斷具肺癌高風險。 針對肺癌使用組合EB13及nr* PF〇~GRP作為血清學的標記，為 本發明一新穎的發現。 因此，相較於依據單獨測量CM或pr〇 — GRp之結果，
2125-9937-PF 97 200920406 本發明能大大改進偵測肺癌病患之靈敏度。在改進之背 後事貫為CEA或pro-GRP-陽性病患之族群，與ebi3-陽 性病患之族群，不完全符合。 例如CEA或Pr〇-GRP測量結果之病患，測定為較標準 值具更低值（即不具肺癌）者，事實有某個百分比的病患患 有肺癌。此種病患稱為CEA—或 pr〇_GRp_偽陰性病患。藉組 合（：^或pro-GRP之決定及EBI3之決定’高於該標準值之 EBI3值之病患，可從CEA—或pr〇_GRp_偽陰性病患中發現。 即，從因為低CEA或pro-GRP血液濃度，錯誤決定為，，陰 性”之病患，本發明提供一種鑑別實際上具肺癌之病患之 方法。因此偵測肺癌病患之靈敏度，因本發明改進。一般 而言’簡單組合多重標記之決定結果’可增加偵測靈敏度， 但另-方面常造成降低專一性。然而，藉決定靈敏度及專 -性間之最佳結果’本發明已決定一特色組合，能增加偵 測靈敏度，但不妥協專一性。 i. 於本發明，為了同時考慮CEA或pr〇_GRp之測量結果， 例如可測量CEA或pro-GRP之血液濃度，並與標準值比較， 如同前述比較測量值及EBI3標準值之方法。例如已知乂， 測量CEA或pro-GRP之血液濃度，並與標準值比較。2何 CEA或pro-GRP之EUSA套組為市售可得的。敘=於又， 報告之此等方法’可用於本發明之方法供診斷或偵树肺痒* 同樣地，於本發明之實施形態，Νρτχι之 + ;〇5 MDTV1 JP fftf 係、稽測量 ΝΡΤΠ蛋白質於血液樣本中之量或漠度決定。決定沖 白質於血液樣本之量之方法，包括免疫分析方法。 蛋
2125-993 7-PF 98 200920406 本發明之診斷方法中，可除了 NPTX之血液濃度，決定 CYFRA血液濃度，以偵測scc。因此，本發明提供診斷 之方法，其中當NPTX1血液濃度或CYFRA血液濃度其中之 一或兩者，高於健康個體，偵測為scc。
Cyt〇keratin 19 片段（CYFRA 或 CYFRA 21-1)，與癌胚 L抗原（CEA)同樣為一常研究的癌症腫瘤標記。cyfra為非 小細胞肺癌中有用的標記。如前所述，CYFRA已用於血清學 的標記供診斷心貞測NSCLC1而，CYFRA作為咖標記之 靈敏度有時對於完全偵測scc，尤其早期階段，尚不足。因 此’需要改進診斷SCC之靈敏度。 於本發明，提供SCC之新穎血清學標記ΝΡΤΧ»對於SCC 之診斷或偵測方法之靈敏度改進，可由本發明達成。'即， =明提供—種診斷於一個體中4 SCC之方法，包括以下 (a) 從欲診斷之個體收集血液樣本； (b) 決定該血液樣本中之水平. m步驟⑻中決定之㈣u平及正常㈣^ 平，代表該個體罹串肺# 尺 患肺癌。或者，本發明提供-種診斷於 -個體中之see之方法，包括以下步驟： 種4於 (a )決疋從欲診斷之個 平； 體收集血液樣本中之NPTX1水 (b )比較步驟（、A+ / 中決定之Νρτχι水平 程度，其中血液樣本中於 ：制組之 吊控制組之高ΝΡΤΧ1水
2125-993 7-PF 99 200920406 平，代表該個體罹患肺癌。 於較佳實施形態，當為SCC之情形，本發明之診斷或 偵測方法可尚包括以下步驟： (d) 決定該血液樣本中之CYFRA水平； (e) 比較步驟（d)中決定之CYFRA水平及正常控制組之 程度；及 (f )判斷在血液樣本中，相較於正常控制組有高NPTX1 及高CYFRA水平其中之一或兩者，則代表該個體罹患SCC。 、 藉NPTX1及CYFRA間之組合，供偵測SCC之靈敏度， ' 可顯著改進。例如於下述在工作例中分析之族群，針對SCC • 之CYFRA陽性率約29. 4 %。比較上，組合CYFRA及NPTX1 增加到62.3 %。於本發明”組合CYFRA及NPTX”係指將 CYFRA及NPTX1其中之一或兩者水平作為標記。於該較佳實 施形態，一病患具CYFRA及NPTX1其中之一為陽性，可判 斷具SCC高風險。針對SCC使用組合NPTX1及CYFRA作為 / 血清學的標記為新穎的。 % ； 因此，相較於依據單獨測量CYFRA之結果，本發明能 大大改進偵測SCC病患之靈敏度。在改進之背後，事實為 CYFRA陽性病患之族群，與NPTX陽性病患之族群，不完全 符合。 例如CYFRA測量結果之病患，測定為較標準值具更低 值（即不具SCC)者，事實有某個百分比的病患患有SCC。此 種病患稱為CYFRA偽陰性病患。藉組合CYFRA之決定及ΝΡΠ 之決定，高於該標準值之NPTX1值之病患，可從CYFRA偽 2125-9937-PF 100 200920406 陰性病患中發現。即，從因為低CYFRA血液濃度，錯誤決 定為陰性之病患，本發明提供一種鑑別實際上具scc 之病患之方法。因此偵測scc病患之靈敏度，因本發明改 進。一般而言，簡單組合多重標記之決定結果，可增加偵 測靈敏度’但另一方面常造成降低專一性。然而，藉決定 靈敏度及專一性間之最佳結果，本發明已決定一特色組 合，能增加偵測靈敏度，但不妥協專一性。 於本發明，為了同時考慮CYFRA之測量結果，例如可 測量CYFRA血液濃度，並與標準值比較，如同前述比較測 量值及NPTX標準值之方法。例如已知如何測量cyfra之血 液濃度，並與標準值比較。又，CYFRA2 eusa套組為市售 可得的。敘述於已知報告之此等方法，可用於本發明之方 法供診斷或偵測SCC。 i, 於本發明EBI3及/或NPTX1之血液濃度標準值，可以 統計學決定。例如可測量健康個體中之咖3及/或Νρτχι 血液濃度’以統計學地決定該標準助及/或㈣]之血 液濃度。當收集到統計學上Μ群體，通常將平均值之2 或3倍標準偏差（S D )範圍内 對應於平均值+ 作“標準值。因此， 佶饰^ 人丁 J值十d x s. D.可作為標準 值。理响上所述該標準值，各包 ,. 分匕浍90/°及⑽· 7%健康個體。 S ，標準值尚可依據肺癌或s 或嶋實際血液濃度設定 ：中之EBI3及/ 準值，使偽陽^’此種方式設定標 敏度之停……小化’且從滿足能最大化偵測靈 條件選出值範圍。在此偽陽性百分比係、指，健康個
2125-9937^PF 101 200920406 體2，病患EBI3及/或ΝΡΤΧ1之血液濃度之百分比，判斷 為兩於—標準值。相反地，健康個體中，病患ΕΒΙ 3及/或 ΝΡΤΧ1之血液濃度之百分比，判斷為低於一標準值，代表專 ^即偽陽性百分比及專一性合計總是為1。偵測靈敏度 係指，在所有肺癌病患肺癌之存在已被決定之個體之群^ 中，ΕΒΙ3及/或ΝΡΤΧ1之血液濃度判斷為高於一標準值之病 患百分比。 再者，於本發明，ΕΒΙ3及/或Νρτχι濃度判斷為高於— 標準值之病患中，肺癌或see病患百分比代表陽性預測值。 另—方面，ΕΒΙ3及/或ΝΡΤΧ1濃度判斷為低於一標準值之病 患中，健康個體百分比代表陰性預測值。此等值間之關係， 整理於表1。以下顯示之關係可知，針對靈敏度、專一性、 陽性預測值及陰性預測值之值，供評量診斷肺癌或scc之 指標’取決於供判斷EBI3及/或NPTX血液濃度之水平之標 準值。 表1. EB13血液濃度 肺癌病東 健康個體 a:真陽性 b:偽陽性 陽性預測值 a/(a+b) 低 c:偽陰性 d:真陰性 陰性預測值 d/(c+d) 靈敏度 a/(a+c) 專一性 d/(b+d) 如前所述，標準值通常設定成使偽陽性比低，靈敏度 高。然而，由上述關係可明知，為偽陽性比及靈敏度間有 一取捨。即該標準值降低’偵測靈敏度增加。然而，因偽 2125-9937-PF 102 200920406 陽性比亦增加’難以滿足“低偽陽性比”條件。 卞。号慮此情 形’例如給予以下預測結果之值’在本發明被選為較佳標 準值。 偽陽性比50%以下之標準值（即專一性不小於5〇%之標 準值）。 靈敏度不小於20%之標準值。 於本發明，該標準值可使用接受者操作特徵（Receiver operating character’ROC)曲線設定。R0C 曲線為—圖形， 顯示偵測靈敏度於縱軸，偽陽性比（即” 1 —專一性，，）在橫 軸。於本發明，R0C曲線可藉繪製靈敏度及偽陽性比之改 變得到，係以連續改變EBI3及/或ΝΡΤχ之血液渡度，供決 定高/低度之該標準值後而得。 為得R0C曲線之“標準值，，為一暫時值，用於統計分 析。為得R0C曲線之“標準值，，一般而言，在—容許涵蓋 可選之標準值範圍内連續改變。例如該標準值可在經分析 之群體内，最小及最大測量ΕβΙ3及/或Νρτχι值間改變。 基於得到之R0C曲線，可從滿足以上述及條件之範圍 中選擇用於本發明之較佳標準值。或者，標準值可依據一 R0C曲線選取，該R〇c曲線係藉由將該標準值從—包括大 部分測定EBI3及/或肝TX1值之範圍内改變得到。 血液中之£BI3及/或NPTX1 ,可用任何可定量蛋白質之 方法測1。例如免疫分析、液體層析、表面電漿共振（SPK)、 質5普等可用於本發明。於質譜，蛋白質可使用適當的内 才示疋里。例如同位素標定EBI3及/或NPTX1，可作為内標。
2125-993 7-PF 103 200920406 EBI3及/或NPTX1之血液》辰度。可從灰中EBI3及/戍NPTX1 之峰部強度及内標之峰部強度決定。一般而言，基質協助 之雷射脫吸附/離子化（MALDI)方法用於蛋白質之質譜。於 一使用質譜或液體層析之分析方法，EB13尚可與其他腫瘤 標記（例如CEA或pro-GRP)同時分析。或者，於使用質譜或 液體層析之分析方法’ NPTX1尚可與其他腫瘤標記（例如 CYFRA)同時分析。 於本發明測量EBI3及/或NPTX1之較佳方法為免疫分 析。EBI3之胺基酸序列為已知（GenBank登記編號 ΝΜ_005755)。EBI3之胺基酸序列如SEQ ID N0: 2所示，編 碼EBI3之核苷酸序列cDNA如SEQ ID NO: 1所示。同樣地， NPTX1之胺基酸序列NPTX1為已知（GenBank登記編號 NP一0025 1 3)。NPTX1 之胺基酸序列 NPTX1 如 SEQ ID N0: 79 所示，編碼NPTX1之核苷酸序列CDNA如SEQ ID NO: 78所 示（GenBank登記編號·_002522)。因此該技術領域中具 通常知識者可依據EBI3或NPTX1之胺基酸序列，合成必要 免疫原以製備抗體。作為免疫原之該胜肽，可使用胜肽合 成機容易合成。該合成胜肽連結至擔蛋白質，可作為免疫 原。 鑰孔蟲戚血藍蛋白（keyhole 1 impet hemocyanin， KLH )、肌紅蛋白、白蛋白等，可作為擔體蛋白質。較佳擔 體蛋白質為KLH、牛血清白蛋白等。馬來醯亞胺苯甲醯基—N_ 氣破雜酿¥胺酯方法（以下簡稱MBS方法）等’一般而言， 用於將合成胜肽連接至擔體蛋白質。
2125-9937-PF 104 200920406 具體而言’將半胱胺酸導入該合成胜肽，將該胜肽以 MBS使用半胱胺酸之SH基，交聯至KLH。該半胱胺酸殘基 可導入到合成胜肽之N-末端或C-末端。 或者，EBI3及NPTX1可各使用EBI3之核苷酸序列 (GenBank 登記編號丽_005755)及 NpTxl(GenBank 登記 編號NM_002522)之核苷酸序列或其一部分製備。包含必要 核苷酸序列之DNA，可使用從EBI3或ΝΡΤχι_表現組織製備 之mRNA選殖。或者，可將市售可得的cDNA庫作為選殖來 源。得到之EBI3及/或NPTX1基因重組體或其片段，尚可 作為免疫原。以此方式表現之EBI3及/或Νρτχι重組體， 較佳作為免疫原供得到用於本發明之該抗體。 以此方式得到之免疫原，與適當的㈣！，並用於免疫 動物。已知佐劑包括’ Freund完全佐劑(fca)及不完全佐 劑。將免疫程序於適當間隔重複直到確認該抗體力價增 加。於本發明，對免疫動物無特定限制。具體而言，常用 於免疫之動物’例如小鼠、大鼠或兔。 當得到該抗體作為單株抗體，可使用有利於其生產之 彳於“、’許多供細胞融合之骨髓瘤細胞株為已 知，且供以高確率涂☆&人 建融5瘤之技術已為周知。因此， 鼠為得到單株抗體之所望免疫動物。 免疫_不限於體外治療。供免疫學敏化培養 之免疫勝任細胞之方法， 之抗體生產細胞，轉开q榦結 以此等方法得到 得到單株”二 轉瘦。用於轉形抗體生產細胞以 -到早株抗體之方法不限於細胞融合。例如，利用病毒感
2125-9937-PF 105 200920406 染得到可轉殖轉形體之方法為已知。 產生用於本發明之單株抗體的融合瘤，可依據其對 則及/或NP™之反應性筛選。具體而言，抗體生產細胞 先藉使用對聊3及/或ΝΡΤΧ1之結合活性，作為指標，或 作為免疫原之其結構域胜肽作為指標。將此筛選選出之陽 性選殖體，視需要副選殖。 用於本發明之單株抗體，可藉在適當條件培養建立之 融合瘤並收集產生之抗體得到。當該融合瘤^質融合 瘤，可藉以腹腔内接種至同系（syngeneic)動物，而在體内 培養。於此情巾’單株抗體以腹水液之形式收集。當使用 異質融合瘤，可使用裸小鼠作為寄主在體内培養。 除了動培養，融合瘤亦常體外培養在適當的培養環 境。例如基礎培養基，例如RpMI 164〇及臓m，一般作為 融合瘤用培養基。添加劑，例如動物血清，可添加至此等 培養基以維持該抗體生產能力至—高水平。當融合瘤在體 二培養’可以培養±清之形式收集單株抗體。培養上清可 藉由《養後攸細胞分離，或使用具中空纖維之培養器具， 一面培養一面連續收集。 /、 时於本毛明使用之單株抗體，以腹水或培養上清形式收 集單株抗體’以飽和硫酸銨沉澱並再以凝膠過濾、 換層析等純化，分雜&+ π 刀離免疫球蛋白部分。此外，若單株抗 為IgG，以蛋白晳Α斗、π Α或蛋白質G管柱親和層析之純化方法盍 有效。 馬 另 方面，為得到於本發明使用之抗體為多株抗體，
2125-9937-PF 106 200920406 從免疫後抗體力價增加之動物抽取血液’分離血清以得到 -抗血清。免疫球蛋白，係從抗血清以已知方法製備該於 本發明使用之抗體。EBI3-專-性抗體可利用組合免疫親和 層析製備，其使用EBI3及/或NPTX1作為配體及免疫球蛋 白純化。 當對抗EBI3及/或NPTX1之抗體接觸EBi3及/或 NPTX1 ’該抗體結合於該抗原性決定基（抗原決定基），為該 抗體經-抗原-抗體反應所認識者。結合抗體至抗原，可由 各種免疫分析原則偵測。免疫分析大別為異質分析方法及 同質分析方法。為維持免疫分析靈敏度及專一性至一高水 平希使用單株杬體。以各種免疫分析格式測量EB丨3及/ 或NPTX1之本發明之方法，將於此處更詳述。 首先，敘述使用異質免疫測量物質（EBI3及/或Νρτχι) 之分析方法。於異質免疫分析，需要一機制，供偵測結合 於該物質之抗體及分離後不結合於該物質之抗體。 為促進此分離，一般使用固定化藥劑。例如首先製備 已固定化認識該物質之抗體（固定化抗體）的一固相。該物 質結合於此等，且進一步與2次抗體反應。 田口相由液相分離並視需要洗滌，2次抗體依物質濃度 比例留在固相上。藉標記該2次抗體，可藉測量來自標記 之訊號，定量該物質。 任何方法可用於將該抗體結合於固相。例如抗體可物 里1"及附於疏水性材料例如聚苯乙稀。或者，抗體可化學 性結合至許多在表現具官能基之材料。再者，經以結合配
2125-9937-PF 107 200920406 體標記的抗體’可藉由使用配體之結合同伴，捕捉以於a 至一固相。組合結合配體及結合同伴，包括親和素_生物素 ^vidin-biotin)等。固相及抗體可同時關聯或在初級抗體 及該物質間反應前關連。 同樣地，該2次抗體不一定要直接標記。即，可使用 對抗該抗體之抗體，或使用結合反應例如親和素—生物素 (avidin-biotin) ’進行非直接標記。 物質於樣本中之濃度，依據使用具已知濃度物質之標 準樣本之訊號強度得到。 任意抗體可作為固定化抗體及2次抗體，供前述異質 免疫分析’只要其為—抗體，或包括其認識該物質之二抗 原結合部位之片段。因此其可為單株抗體、多株抗體，或 兩者之混合物或組合。例如單株抗體及多株抗體之組合， 為本發明中較佳組合。或者’當抗體兩者均為單株抗體， 遇識不同的抗原決定基的組合單株抗體較佳。 因為欲測量之該抗原由抗體 w机體以二明治夹持，此異質免 疫为析稱三明治方法。因為三 , —月/口方法在測置靈敏度及再 現性優異，為本發明之較佳測量原則。 競爭抑制反應原則，内w 應用於異質免疫分析。具體 而=,其為免疫分析，依墟媒 據樣本中之物質競爭性抑制物質 與已知濃度抗體間之結合之琛$ ㈣物貝 n <現象。於該樣本之物質濃度， 可由以已知濃度物質標記，並 之物質量而決定。 4與該抗體反應(或不反應)
2125-9937-PF 108 200920406 建立一競爭性反應系統。再者，以抑制反應系統分析，當 抗體與樣本中之抗原反應’之後具已知濃度之抗原反應’ 為可能的。於兩類型之反應系統’該操作性優異之反應系 統可藉設定具已知濃度之該抗原中任一者作為藥劑成分或 該抗體作為經標記的成分，該其他者作為固定化藥劑，而 建立。 、具酵素活性之 用在此等異質免 放射性同位素、螢光物質、冷光物質 物質、巨觀可見物質、磁性可見物質等， 疫分析。此等標記物質之例如下。 具酵素活性之物質： 過氧化酶、
鹼性磷解酶， 尿素酶、催化酶、 葡萄糖氧化酶、 乳酸去氫酶或 澱粉酶等 螢光物質： 異硫II酸螢光素、 四甲基姜硫敦基羅達明、 經取代真硫氰基羅達明，或 #硫氰酸二氯$嗅等 放射性同位素： 氣 1251 或 .
2125-9937-PF 109 200920406 131ι 等 其中非放射線活性標記， & ^L· rir 酵素’為女全、操作性、 靈敏度等方面有利的。醏去挪i 保作注 酸方法4 _ 酵素如5己可利用已知方法例如過碘 Θ夂方法或馬來醯亞胺方 、 及法連接於抗體或ΕΒΙ3。 作為固相’使用珠、 (|4^ ^ 合裔内壁、微粒、多孔擔體、磁 性顆粒等。使用材料例如 — 本乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯甲 本、聚丙烯、聚乙烯、平 聚乙烯虱、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、 礼膠、明膠、瓊脂、祐琏 破璃、金屬、陶瓷等可形成固相。固 體材料其中官能基化學性結合抗料，已導到該表現上述 固體材枓上者’亦為已知。已知結合方法包括化學結合例 如t - L-離胺酸或六-枢^ η & 飞戍一酪處理及物理性吸附，可應用在固相 及抗體（或抗原） -雖然從液相分離固相之步驟及洗蘇步驟，在所有此處 例不之異貝免疫分析為必要，此等步驟可輕易使用免疫層 析方法實施，其為三明治方法之變化。 具體而言，欲固定化之抗體，被固定化在能以毛細管 現象傳送樣本溶液之多孔擔體上，然後以此毛細管現象將 匕含物質（EBI3及/或NPTX1)及此處採用之經標記的抗體之 樣本混合物傳送。展開期間，物質與經標記的抗體反應， 且虽再接觸固定化抗體，會在該位置被捕捉。不與該物質 反應之該經標記的抗體通過，而不該固定化抗體捕捉。 結果’可使用仍在固定化抗體位置之經標記的抗體之 •訊號’偵測存在該物質。若該經標記的抗體事先維持在該 多孔擔體上游，所有反應可僅需滴加於該樣本溶液，並開 2125-9937-PF 110 200920406 始及完'，且可建立極簡單的反應系统。於該免疫層析方 w巨镜刀別的經標記的成分，例如有色微粒，可以组 合以建構不需特別讀取器之分析装置。 ” 再者’於該免疫層析方法，可調整該物質之偵測靈敏 度。例如’藉調整相靈敏度接近下述截止值，則當超過 截止值’可债測該前述經標記的成分。藉使用此一裝置， 可簡單判斷疋否一個體為陽性或陰性。藉採用容許巨觀區 別標記之構成，必要之檢查結果’可藉簡單應用血液樣本 至供免疫層析之裝置以得到。 各種用於調整免疫層析方法偵測靈敏度之方法，為該 技術領域中已知。例如，可將用於調整偵測靈敏度之第2 固定化抗體，放在應用樣本及固定化抗體間之位置（日本專 利申知案公開號（JP-A)H06-341989(未審查，公開之日本專 利申請案））。於該樣本中之物質，由第2固定化抗體捕捉， 而從樣本施用在第1固定化抗體供標記偵測之位置展開。 第2固定化抗體飽和後，該物質可到達位在下游之第1固 定化抗體之位置。結果，當於該樣本中所含物質濃度超過 一既定濃度，結合於經標記的抗體之該物質，可在第1固 定化抗體之位置被偵測到。 其次’敘述同質免疫分析。相反於異質免疫學分析方 法需要上述分離反應溶液之步驟，物質（EBI3及/或NPTX1) 尚可利用同質分析方法測量。同質分析方法容許偵測抗原一 抗體反應產物而不需從反應溶液分離。 * 一代表的同質分析方法為免疫沉澱反應，其中抗原性 2125-993 7-PF 111 200920406 物質藉檢查依照抗原-抗體反應產生之沉澱而定量分析。多 株抗體一般用於免疫沉澱反應。當應用單株抗體，結合於 該物質之不同的抗原決定基之多重類型單株抗體較佳被使 用。免疫學反應後之沉澱反應產物，可巨觀觀察或以光學 測量供轉換為數值資料。 該免疫學微粒凝集反應’抗原與抗體敏化微粒之凝集 用為指標，為一常用的同質分析方法。於該前述免疫沉澱 r 反應，多株抗體或組合多重類型單株抗體，亦可用於此方 法。微粒可經以抗體混合物以抗體敏化，或可將經敏化之 微粒與各抗體分開地混合而製備抗體。此方式得到之微 粒，當接觸該物質時，會形成類似基質之反應產物。該反 應產物可以微粒聚集物之形式偵測。微粒聚集物可巨觀觀 察或以光學測量供轉換為數值資料。 依據能量轉移及酵素通道化之免疫學分析方法為已知 同質免疫分析《於利用能量轉移之方法中，具捐出者/受體 I:關係之不同的光學標記，連接於多重抗體，該多重抗體認 識抗原上之鄰近抗原決定基。當發生免疫學反應，該2部 分接近及能量轉移現象發生，造成訊號例如驟冷 (wenching)或改變螢光波長。另一方面，酵素通道化利= 標記供多重抗體結合於鄰近抗原決定基，其中該標記組合 具關係之酵素，使一酵素之反應產物為另一酵素之基質。 當一免疫學反應之2部分接近，促進酵素反應；因此，其結 合可以該.酵素反應速率之改變偵測到。 於本發明，用於測量EBI3及/或NPTX1血液，*可從病
2125-9937-PF 112 200920406 患抽取之血液製備。較佳血液樣 血漿樣本，可在測量前稀釋。或者节入血/月或 且仔到之測量值可經校正以 』里 中夕'、曲择 、疋该血清濃度。例如，全血 /辰又’可藉決定相同血 校正為血清濃度。 ， <血5’體積百分比’ 建立IS佳實施形態，免疫分析包含職。本案發明人 或咖rELISA以偵測患肺癌之病患之血清則及/ 於該血液樣本中之EBI3水平 ^^^, 或NPTX1水平，然後 …考樣本相關之例如正常控制k樣本則 NPTX1水平比較。用注”丁 a^ /：3c 吊控制組水平”係指£ΒΙ3之水 平及/或™通常在未罹患肺癌或似之群體中之血液樣 本中發現之水平。參考樣本較佳為與測試樣本本質類似。 例如若測試樣本包括病患血清’參考樣本亦應為血清。從 控制及測试個體彳旱毋丨> # ^、六# 仔到之該血液樣本之_水平及/或NPTX1 欠平可同時決疋，或正常控制組水平可利用統計學方法， 依據刀析來自控制JA-隹^ λ. j^. I . 制、，且收集之樣本中之EBI3之水平及/或 NPTX得到之結果決定。 漏水平及/或ΝΡΤΧ1水平亦可用於監控治療肺癌或 ；方法測忒血液樣本從經歷治療肺癌或SCC之個 體得到。較佳地’多重測試▲液樣本從該個體在各種時間 點得到’包括治療前、中及/或後。處理後樣本之則之 水平及/或.ΝΡΤΧ1，然後與處理前樣本之則之水平及/或 NPTX1比較，或與參考樣本（例如正常控制組水平）比較。例·
2125-9937-PF 113 200920406 如若處理後EBI3水平或NPTX1水平低於處理前EBI3水平 及/或NPTX1水平，可以下治療有效之結論。同樣地，若處 理後EBI3水平及/或NPTX1水平類似於正常控制組EBI3 水平及/或NPTX1水平，可以下治療有效之結論。 有效治療為導致降低EBI3之水平及/或NPTX1或 減小該癌症於一個體中之尺寸、盛行或轉移潛力。當該治 療係預防性進行，”有效，，意指其延遲或防止肺癌（或scc) 形成或防止或減輕肺癌（或scc)之一臨床症狀。評量肺癌 (或SCC)可使用#準臨床實驗步驟。再者治療有效性，可與 任意供診斷或治療肺癌《[之已知方法決^。例如肺癌 例行以組織病理診斷，或藉症狀異常識別診斷。 I.清學診斷肺癌之奪fa · 依照本發明實施診斷肺癌之成分’可先組合並以測試 套組之形式提供。因此，本發明提供_種<貞測肺癌 包括： 0 \ (1)一免疫分析試劑，供決定血液樣本中之咖3水 及 τ’ (i i)針對EBI 3之陽性控制組樣本。 於該較佳實施形態，本發明之套組可進_步包含. “11)-免疫分析試劑，供決定血液樣 pro-GRP水平；及 r艾CEA或 (1Γ針對CEA*qpr〇—grp之陽性控制,且檨太 依妝本發明實施診斷see之成分，可先’ 套組之形式提供。固舲 丄☆ %、，且合並以測試 仏因此，本發明提供一種偵制& ^ 貞挪肺癌之套組，
2125-9937-PF 114 200920406 包括： (1)免疫分析試劑，供決定血液樣本中之Νρτχ丨水平 及 (Η)一針對ΝΡΤΧ1之陽性控制組樣本。 於該較佳實施形態，本發明之套組可進一步包含： (111)—免疫分析試劑，供決定血液樣本中之cYFRA水 平；及 (iv) 一針對CYFRA之陽性控制組樣本。 構成本發明套組之供免疫分析之藥劑，可包括對上述 各種士疫分析必要之藥劑。具體而言，供免疫分析之藥劑 包括-抗體，其認識欲測量之物質。該抗體可取決於免疫 分析之該分析格式而修飾。題A可作為本發明較佳分析格 式。於ELISA’ 一般使用，例如將第i抗體固定化於一固相 上，及一第2抗體，具一標記。 因此，用於EUSA之免疫分析試劑可包括：一第i抗 體口定化在固相擔體上。微粒或反應容器内壁可作為該 固相擔體。磁性顆粒可作為該微粒。或者，多井平盤例如 96井微平盤常作為該反應容器。供處理大量樣本之容器， 以高密度配置多於96—井微平盤之較小體積量的井者心、為 已知。於本發明，此等反應容器之内壁可作為該固相擔體。 EUSA用之免疫分析試劑，可尚包括一帛2抗體，且一 標記。供贿之第2抗體’可為一抗體，於其上直接或 間接連結-酵素。化學性連接—酵素至一抗體之方法為已 知。例如免疫球蛋白可酵素性切開以得到片段，該片段包
2125-9937-PF 115 200920406 含可變區。藉將此等片段中包含之_SS —鍵為—SH|，可附著 雙功能連接子。藉事先連接一酵素至該雙功能連接子，可 將酵素連接至該抗體片段。 或者，間接連結一酵素，可使用例如親和素—生物素結 口。藉使生物素化抗體與一酵素接觸，該酵素上已附著親 和素，即可將一酵素間接連結一抗體。此外，可將—酵素 使用-第3抗體間接連結至一第2抗體，肖第3抗體 f 識第2抗體之一酵素標定抗體。例如上述例示之酵素^作 為標記該抗體之酵素。 本發明之套組包括—針對EBI3之陽性控制組。—針對 EBI3之陽性控制組包括’已事先決定濃度之ebi3。較佳濃 度例如在本發明測試方法中設定成該標準值之濃度。或 者，可組合具較高濃度之一陽性控制組。於本發明針對Ε β j 3 之陽性控制組，可額外包含CEA及/或pro-GRP，其已事先 決疋/辰度。一包含EBI3、CEA及/或pr〇_GRp之陽性控制組 較佳作為本發明之陽性控制組。 口此，本發明提供一陽性控制組，供偵測肺癌，包括 EBI3及CEA及/或pr〇_GRp，濃度為高於正常值。或者，本 毛明係關於使用_金液樣本，包括ΕβΙ3及⑽及/或 pro-GRP濃度為高於正常值，以產生—陽性控制組供偵測肺 癌。已知CEA及/或pr〇_GRp可作為肺癌之指標；然而， EBI3P可作為肺癌之指標，為本發明之新穎發；見。因此，除 了 CEA及/或pr〇_GRp包括Ey3之陽性控制組為新穎的。 本發明之陽性控制組，可藉添加cea及/或— G卯及Mu
2125-9937-PF 116 200920406 濃度為高於標準值至止液樣本而
Pro-GRP及Εβί3濃度 、 ，匕3CEA及/或 之陽性控制組。“门、準值之血清較佳作為本發明 或者，本發明之套 組。針對ΝΡΤχι ^針對ΝΡΤΧ1之—陽性控制 ρτχι之％性控制組，包 , 度。較佳濃度例如在本發明測已事先決定濃 濃度。或者，可該標準值之 明針特m之陽：漢度之一陽性控制級。於本發 決定濃产 人㈣組’可額外包含CYFRA，其已事先 -包含軸及心舰之陽性控制 為本發明之陽性控制叙，供债測SCC。 本發明之陽性控制絚較佳為液體形式。於本發明，使 用血液樣本作為样* m 个货’使 體形式。或者’，以既^此作為控制組之樣本，亦需為液 制組，可製備測二在使用時溶解一乾燥陽性控 &備測成浪度之控制組。藉包裝-乾燥陽性控制 組 '需要溶解其量之浠興 ..m ^ f 使用者可只要混合即得到必要 = 為陽性控制組_或，1可為天然來源 3叮:’、、一重組蛋白質。不僅陽性控制組，陰性控 制組亦可組合於該本發明之套組。陽性控制& 用於驗證免疫分析之結果為正碟。 控制 抗肺癌化厶t 於本發明之内容’通過該篩選方法欲篩選之藥劑，可 為4 化s物或包括數種化合物之組合物。再者，依照本 發明師選方法，暴露在細胞或，白質之測試劑可為一單— 化合物或化合物組合。當使用化合物組合於該方法，=化
2125-9937-PF 117 200920406 «物可依序接觸或同時接觸。 任意測試劑，例如細胞萃取物、細胞培養上清、微生 發：產4勿、海洋生物之萃取物、楂物萃取物、純化或粗 蛋白貝胜肽、非胜肽化合物、合成微分子化合物(包括核 酸建構物’例如反義驗、s疆、Rib〇zymes，及apt_r /.
及天然化合物’可用於本發明之_選方法。本發明之 測5式劑亦可使用該技術領域已知之任意多種組合庫方法得 到’包括⑴生物學庫⑺空間可尋址之平行固相或溶液相 庫’（3)需要反摺績（dec〇nv〇lu1;i〇n)之合成庫方 法；（4) ‘‘一株一化合物，，庫方法，及（5)使用親和層析選擇 之合成庫方法。使用親和層析選擇之該生物學庫方法受限 於胜肽庫，該其他4方法可用在胜肽、非胜肽募聚物或化 合物小分子庫（Lam，AntiCancer Drug Des 1997， 12. 1 45-67)。合成分子庫之方法例，為該技術領域已知（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90： 6909-13；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1 994， 91: 1 1422-6;Zuckermann et al., J Med Chem 37： 2678-85, 1 994;Cho et al., Science 1 993, 26 1: 1 303-5；Carel1 et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061；Gallop et al., J Med Chem 1994，37: 1233-51)。化合物庫可為溶 液（見 Houghten，Bio/Techniques 1 992，13: 412-21)或在 珠（bead)上（Lam, Nature 1991， 354: 82-4)、晶片（Fodor， Nature 1 993, 364: 555-6)、細菌（美國專利號碼 2125-9937-PF 118 200920406 5, 223, 409)、孢子（美國專利號碼 5, 571，698; 5, 403, 484, 及 5,223,409)、質體（〇111161&1.，？；1*〇。1^1:1八。3(18。1118人 1 992，89: 1865-9)或噬菌體（Scott and Smith，Science 1 990， 249: 386-90;Devlin, Science 1 990, 249: 404-6;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1 990, 87: 6378-82;Felici, J Mol Biol 1991，222: 301-1 0;美國專 利申請案 2002103360)。
一化合物’其中部分化合物結構藉該篩選方法篩選 者’經加成、刪除及/或取代轉變者，包括於本發明之篩選 方法得到之藥劑。 再者’當篩選到之測試劑為一蛋白質，為得到編碼該 蛋白質之DNA’可決定全體蛋白質之胺基酸序列以推論蛋白 質之編碼核酸序列，或分析得到蛋白質之部分胺基酸序 列，以依據該序列製備一寡DNA作為探針，以該探針筛選 cDNA庫以得到一編碼該蛋白質之DNA 。得到之dm確認其 製備測試劑之有用纟’該測試劑為供治療或預防癌症之一 候選者。 有用於此處所述篩選之測 地結合於 EBI3、DLX5、NPTX1、 或其部分胜肽，該部分胜肽在 物活性。 试劑，尚可為抗體，其專一 CDKN3 或 EF_ldelta 蛋白質 體内欠缺原始蛋白質之該生 已周知’以下，提供 選方;去之額外指南。 雖建構測試劑庫為該技術領域中 .識別測試劑及構建此種藥劑庫供該篩 分子模部：
2125-9937-PF 119 200920406 建構測試劑庫，由對於 下知識而促進：纟已知具尋 找化合物之分子結構之性 質及/或欲抑制該標靶分子即 EBI3 ' DLX5 ' NPTXl ^ ptifmq « τ, CDKN3及EF，eHa之分子結構，相 步師選適合供進一步評仕夕^ , >'試劑之方法，為電腦模型化 測式劑及其標靶間之交互作用。 電腦模型化技術允許被選擇之分子三維原子結構可見 化’且合理設計將與該分子交互作用之新化合物。該三維
建構通常取決於被選擇之分子 ^ 于之X光、晶緣圖分析或NMR “象貝料。該釦子動態需要力場資料。該電腦繪圖系統能 預測-新化合物將如何結合至該標靶分子，且能容許實驗 性操作該化合物結構結構及標靶分子α $寻完美的結合專一 !生。當在其中之一或兩者進行小改變時，預測該分子-化合 物父互作用需要分子力學軟體及強力運算電腦，通常連接 使用者親和性，在分子設計程式與使用者間具選單驅動的 界面。 上述分子模型化系統例’ 一般而言包括CHARMm及 QUANTA 程式、p〇lygen Corporation, Waltham, Mass 。 CHARMin實施能量極小化及分子動力學功能。qUANTA實施構 建、綠圖模型化及分子結構分析。QUANTA允許互動構建、 修飾、可見化及分析彼此分子行為。 已有一些文章評論與特定蛋白質互動之藥物電腦模型 化’例如 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1.988， 97: 1 59-66; Ripka, New Scientist 1 988, 54-8；McKin1 ay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 2125-9937-PF 120 200920406 1989, 29: lll-22;Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1 989, 291 : 1 89-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1 989, 236: 1 25-40，141-62;及關於核酸成分之模型受體，Askew et al.，J Am Chem Soc 1 989， 1 1 1 : 1 082-90。 其他篩選及繪示化學品之電腦程式，可從例如 BioDesign, Inc·, Pasadena, Calif., Al1 el ix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc.，
Cambridge, Ontario 公司得到。參見例如 j)esJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et a 1. , J Computer Chem 1 992, 13: 505-24;Meng et al., Proteins 1 993, 1 7： 266-78;Sh〇ichet et al.， Science 1993’ 259: 1445—5〇。 -旦鑑別出-推定的抑制劑，可採組合化學技術，依 據該鑑別出之推定抑制劑之化擧έ士错 中」川及亿子結構，或下述細節，以構 建任意數的變異體。撂钊丄， 到之推疋的抑制劑庫，或"測試劑|·， 使用本發明之方、;^兹、联 璉，以鑑別治療或預防肺癌之測試劑。 (11)组合化學令祝二 蜊 可產生測試劑之組合庫作為合 分，其涉及已知抑制劑中存在之核社饉物°又相式之一部 許該庫維持在合理的尺十 核、·、°構之知識。此方法允 八寸’有助高產出I益、gg 合成構成該庫之分子的所有 、。或者，藉 聚合性分子庫。後 可構建簡S、尤其短、 胜肽之庫。此胜肽庫可勺 為長度β胺基酸之所有 類型之座避^ 母種6胺基酸序列之姐X, 颊尘之犀·稱為線形組合化學庫 文斤幻之排列。此 製備組合化學庫 為該技術領域所周知， . 2J25-9937-PF 且可以化學或 121 200920406 生物學合成其中之一產生。組合化學庫包括但不限於胜肽 庫（參見例如美國專利 5,010，l75;Furka，Int j pept pr〇t
Res 1 991, 37: 487-93; Houghten et al. , Nature 1 991, 354: 8 4 - 6 )。其他產生化學多樣性庫之化學品亦可使用。此種化 學品包括但不限於：胜肽（例如PCT公開號碼w〇 91/19735)、編碼之胜肽（例如w〇 93/20242)、隨機生物募 聚物（例如W0 92/00091 )、苯并二氮呼（例如美國專利 5’ 288, 514)、diversomers例如尿囊素、苯并二氮呼及二胜 ¢.
肽（DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1 993， 90:6909-1 3)、vinylogous 多胜肽（Hagihara et al.，J
Amei· Chem Soc 1 992，1 1 4: 65 68)、具葡萄糖支架之非胜 肽胜肽擬似物（Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1 992， 114: 9217-8)、小化合物庫之類似有機合成物（chen et a 1.， J. Amer Chem Soc 1 994，1 1 6: 2661 )、寡胺基曱酸醋（Cho et al.，Science 1 993，261: 1303)，及 /或肽膦酸醋 (Campbel 1 et al.，J Org Chem 1994，59: 658)、核酸庫 (見 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement;Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 1 989, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, USA)、胜肽核酸庫（參見例如美國 專利5, 539，083)、抗體庫（參見例如Vaughan et a 1., Nature Bio 技術 1 996， 14(3): 309-14 and PCT/US96/1 0287)、碳水化合物庫（參見例如Liang et al.， Science 1996，274: 1520-22;美國專利 5,593, 853)，及小 2125-9937-PF 122 200920406 有機分子庫（參見例如苯并二氮呼，GordonEM. CurrOpin
Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31·;isoprenoids 、美 國專利5,569,588;嗟院_ (thiazolidinone)及甲唑烧酮 (metathiazanone)、美國專利 5,549，974;pyrrolidines，US Patents 5,525,735及5,519，134;嗎啉化合物，美國專利 5, 506, 337;苯并二氮呼、5, 288, 514 等）。 (iii)噬菌體展示： 另一方法使用重組嗟菌體以產生庫。使用“噬菌體方 法” （Scott & Smith， Science 1990， 249: 386-90;Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1 990, 87： 6378-82; Devi in et a 1.，Science 1990，249: 404-6)，可製作非常大的庫 (例如1 06 -1 08 chemical entities)。第2方法使用初期
化學方法 ’ Geysen 方法（Geysen et al.， Molecular Immunology 1 986， 23: 709-15;Geysen et al., J
Immunologic Methods 1987， 102: 259-74);及 Fodor et al 之方法（Science 1991， 251: 767-73)為例。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988,
Volume #5, Abstract FR:013;Furka, Int J Peptide
Protein Res 1991’ 37: 487-93)、Houghten(美國專利 4, 631，211)及 Rutter et al.(美國專利 5, 〇1〇, 175)敘述方 法，以產生胜肽混合物，其能經測試作為協同劑或拮抗劑。 製備組合庫之裝置為市售可得的（參見例如357 MPS， 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony Rainin, Woburn, ΜΑ, 433A Applied BioSystems, Foster 2125-9937-PF 123 200920406
City, CA，9050 Plus, Millipore，Bedford，ΜΑ)。此外， 有許多組合庫本身為市售可得的（參見例如ComGenex， Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, M0, 3D Pharmaceuticals > Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 等）° 英得 EBIUJ5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 鈷厶 化合物： 於本發明’過度表現EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及 EF-1 de 1 ta在肺癌偵測到，在正常器官無表現（圈1、5、7、 16 及 19)。因此，使用 EBI3、DLX5、CDKN3 及/或 EF-ldelta 基因、由該基因編碼之蛋白質，本發明提供一種篩選方法， 篩選結合於 、DLX5、NPTX卜 CDKN3 及/或 EF-ldelta 之化合物。由於表現EBI3、DLX5、NPTX卜CDKN3及EF-ldelta 於肺癌，結合於 £BI3、DLX5、NPTX卜 CDKN3 及/或 EF-ldelta 之化D物，預期抑制肺癌細胞之增殖，因此供治療或預防 肺癌為有用。因此，本發明尚提供-方法，供篩選一化合 物其抑制肺癌細胞之增殖，及一方法供篩選一化合物供治 療或預防肺癌’使用EBI3、DLX5、ΝΡΠ1、CDKN3及/或 1 ta夕胜肽。尤其，此篩選方法之實施形態包括以 下步驟： /a)使-測試化合物接觸EBI3、DLX5NpTxl、CDKN3 及/或EF-1 (ieita之多核苷酸編碼之多胜肽； 貞’則該多胜p及該測試化合物間的結合活性；及 (C)選擇結合於該多胜肽之化合物。
2125-9937-PF 124 200920406 本發明之方法將於以下更詳述。 用於碑選之 EBI3、DLX5、ΝΡΤΠ、CDKN3 及 / 或 EF-ldelta 多胜肽’可為-重組多胜肽或-蛋白f，其來自於天然或 P刀該胜肽。右人與一測試化合物接觸之該多胜肽，可為 例如經純化之多胜肽、可溶之蛋白質、結合於一擔體或與 其他多胜肽融合之融合蛋白質形式。 作為例如使用EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-1 delta 多胜肽篩選結合於該 EBI3、DLX5、Νρτχι、CDKN3 及/或EF-ldelta多胜肽蛋白質之一方法，可使用該技術領 域中具通常知識者周知之許多方法。此篩選可藉例如免疫 沉澱方法具體以如下方法實施。藉插入該基因至一供外來 基因之表現載體，例如 pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3. ；l、pCAGGS 及 pCD8 ’ 編碼 EBI3、DLX5、ΝΡΤΧΙ、CDKN3 及/或 EF-ldelta 多胜肽基因表現於寄主（例如動物）細胞等。 用於該表現之啟動子’可為通用之任意啟動子，包括 例如：SV40 早期啟動子（Rigby in Williamson(ed.)， Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))、EF-alpha 啟動子（Kim et al.，Gene 91: 21 7-23(1 990))、CAG 啟動子（Niwa et al.，Gene 108: 193(1991 )) ' RSV LTR 啟動子（Cul len，Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)) 、 SR alpha 啟動子 (Takebe et al. ， Mol Cell Biol 8: 466(1988)) 、 CMV 即 刻早期啟動子（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987))、SV40 晚期啟動子（Gheysen and Fiers， 2125-9937-PF 125 200920406 J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、腺病毒晚期啟動子
(Kaufman et al·， Mol Cell Biol 9: 946(1989)) 、 HSV TK 啟動子等。 將基因導入寄主細胞以表現一外來基因，可依照任意 方法實施，例如電穿孔方法（Chu et al.，Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987))、填酸Ί弓方法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52( 1 987))、DEAE 葡聚糖方法（Lopata ct al., Nucleic Acids Res 12; 5707-17C1984);Sussinan and Milman，Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984))、Lipofectin 方法（Deri jard B.，Cell 76: 1025-37( 1 994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993): Rabindran et al., Science 259: 230-4( 1 993))等。 EBI3、DLX5、CDKN3及/或EF-ldelta基因編碼之該多 胜肽，可以融合蛋白質之形式表現，該融合蛋白質包括一 單株抗體之認識部位（抗原決定基），係藉導入其專一性已 知之單株抗體之該抗原決定基在該多胜肽N_或C-末端。 可使用市售可知·的抗原決定基-抗體系統（EXperjmentai
Medicine 13 : 85-90(1995))。藉使用其多重選殖位置能表 現與例如beta-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白質、谷胱甘肽 S-轉移酶、綠螢光蛋白質（GFp)等之融合蛋白質之載體，為 市售可得的。又，亦有人報告：藉僅導入由數個至一打胺基 酸構成之小抗原決定基所製備融合蛋白質，不會因為融合 改變 EBI3、DLX5、ΝΡΠ1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 多胜肽 性質。抗原決定基例如聚組胺酸（His_tag)、流感病毒凝集
2125-9937-PF 126 200920406 素 HA、人類 c-myc、FLAG、皰疹性 口腔炎（Vesicular stomat i t i s)病毒糖蛋白質（vsV-GP)、T7基因10蛋白質 (T7-tag)'人類單純皰疹病毒（Simpie herpes virus)糖蛋 白質（HSV-tag)、E-tag(單株噬菌體上之一抗原決定基） 等，及認識此等之單株抗體，可使用為該抗原決定基_抗體 系統’供篩選結合於EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-ldelta 多胜肽之蛋白質（Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。 於免疫沉澱，免疫複合體藉添加此等抗體至細胞溶解 物而形成，該細胞溶解物使用適當洗滌劑製備。該免疫複 合體，由 EBI3、DLX5、ΝΡΤΠ、CDKN3 及/或 EF-ldelta 多 胜肽、具與該多胜肽結合能力之多胜肽，及一抗體構成。 免疫沉澱除了對著以上抗原決定基之抗體以外，亦可使用 對著 EBI3 ' DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 多胜肽
之抗體實施，該抗體可如上述製備。當該抗體為一小鼠IgG 抗體，可將一免疫複合體藉例如蛋白質A sephar〇se或蛋 白質 G sepharose 沉澱。若該 EBI3、DU5、Νρτχι、CD〇3 及/或EF-ldelta基因編碼之多胜肽，係製備為抗原決定基 例如GST之融合蛋白質，可以如同使用對著ΕβΙ3、DLX5、 ΝΡΤΧΙ、CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽之抗體，使用專一 地結合於此等抗原決定基之物質，例如谷胱甘肽Sephar〇se 4B，形成一免疫複合體。 免疫沉殿可依照例如於該文獻之方法實施（Harl〇w and
Lane， Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor 2125-9937-PF 127 200920406
Laboratory publications， New Y〇rk(1988))。 SDS-PAGE通常用於分析免疫沉澱蛋白質，且結合之蛋 白質可使用具適當濃度之凝膠，藉蛋白質分子量分析。因 為結合於 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 /或 EF-ldelta 多 胜狀之蛋白質’難以藉通常染色方法例如C〇omass i e染色 或銀染色偵測’針對蛋白質之偵測靈敏度，可藉將細胞培 養在包含放射線活性同位素，”s_甲硫胺酸或3$_半胱胺酸 (cystein)之培養基，標記於該細胞之蛋白質，並偵測蛋白 質。該標靶蛋白質可從SDS-聚丙烯醯胺凝膠直接純化，且 其序列當蛋白質之分子量已明瞭時，可以被決定。 使用該多胜肽篩選結合於EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或EF-ldelta多胜肽之方法，例如西方-西方墨點分析 (Skolnik et al.，Cell 65·· 83-90( 1 991 ))可使用。具體 而言，結合於 EBI3、DLX5、ΝΡΤΠ、CDKN3 及/或 £F-ldelta 多胜肽之蛋白質，可藉從培養之細胞製備cDNA庫而得（例 如 LC176 、 LC319 、 A549 、 NCI-H23 、 NCI-H226 、 NCI-H522 、 PC3、PC9、PC14、SK-LU-1、EBC-1、RERF-LC-AI、SK-MES-1、 SW900及SW1573)，該培養之細胞預期表現一蛋白質，該蛋 白質結合於EBI3、DLX5、CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽， 使用：一嗟菌體載體（例如ZAP) ’表現該蛋白質在LB-竣脂 上’固定該表現之蛋白質在一過濾膜上，使經純化且經標 記的 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 多胜肽 與以上過濾膜反應，並依照該標記，偵測表現結合於EB丨3、 DLX5、NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽之蛋白質之 2125-9937-PF 128 200920406 菌斑。本發明之多胜肽可利用生物素及親和素間之結合標 記’或利用專一地結合於EBI3、DLX5、CDKN3及/或EF-ldelta 多胜肽’或融合於EBI3、DLX5、NPTX卜CD03及/或EF-ldelta 多胜肽，或融合於該抗體標記之一胜肽或多胜肽（例如 GST)。使用放射線同位素或螢光等之方法亦可使用。 或者’於本發明篩選方法另一實施形態，可使用2雜 交體系統’其利用細胞（“ MATCHMAKER 2-雜交體系統，，、” 哺乳動物^1人1'(：111^]^1?2-雜交體分析套組，，、，，1^1[(：關^心 卜雜交體系統”（Clontech); “HybriZAP 2-雜交體載體系 統’’（Stratagene);參考文獻 “DaltonandTreisman，Cell 68: 597-612(1992)» Fie1ds and Sterng1anz, Trends Genet 10: 286-92(1994)” ）。 於該2-雜交體系統，本發明之多胜肽融合於SRF—結合 區或GAL4-結合區，並表現於酵母細胞内。cDNA庫從預期 表現結合至本發明之多胜肽之蛋白質的細胞製備，使得當 此庫表現時，融合於VP16或GAU轉錄活化區。然後將此 cDNA庫導入以上酵母細胞，並將來自此庫之cDNA從偵測為 陽性之選殖體離析（當結合至本發明多胜肽之蛋白質表現 於酵母細胞，兩者之結合活化一報告基因，使陽性選殖體 可偵測到）。由該CDNA編碼之蛋白質，可將上述經分離之 cDNA導入E· c〇li並表現該蛋白質以製備。作為一報告基 因，除了 HIS3基因，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、 CAT基因、螢光素酶（luciferase)基因等。
結合於 EBI3、DLX5、NPTn、CD〇3 及/或 EF_ldeih 2125-9937-PF 129 200920406 基因編碼之該多胜肽的化合物，尚可 伏·用親和層析篩選。 本心明之夕胜狀，可固定化在親和性管柱之擔體上， 並將測試化合物’包含能結合至本發明之多胜肽：蛋白質 者，施用在該管柱。此處之測試化 」馮例如細胞萃
取物、細胞溶解物等。載入測試化合物後，洗務該管柱， 並製備結合於本發明之多胜肽之化合物。當該測試化合物 為—蛋白質’分析得到蛋白質之ΝΡΤΧ1之胺基酸序列依 據該序列合成寡DNA，並使用及寡DNA作為探針篩選cDna 庫，以得到編碼該蛋白質之Dna。 使用表面電聚共振現象之生物感測器，可作為偵測或 定量結合於本發明化合物之方法。當使用此一生物感測 器，本發明之多胜肽及測試化合物間之交互作用，可即時 觀察作為表面電漿共振訊號，僅使用小量多胜肽且不必標 記（例如BIAcore，Pharmacia)。因此，能使用生物感測器 例如BIAcore評估本發明之多胜肽及測試化合物間之結合。 該篩選方法，供篩選結合於當該固定化EB13、DLX5、 NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽暴露於合成化學化 合物或天然物質庫或隨機噬菌體胜肽展示庫，及使用高產 出量依據組合化學技術之該篩選方法（Wrighton et al.， Science 273: 458-64(1996);Verdine, Nature 384: ll-1 3( 1 996 );Hogan，Nature 384: 1 7-9(1 996))，以不僅 離析蛋白質亦離析結合於該EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及 /或EF-ldelta蛋白質（包括協同劑及拮抗劑）化學化合物 ♦ . 之方法，為該技術領域中所周知。 2125-9937-PF 130 200920406 、DLX5、NPTXl· rmR » /成 EF-ldelta 之 化合物： 於本發明，EBI3、DLX5、NPTX1、CMN3 及 EF-ldelta 蛋 白質具促進細胞肺癌細胞之增殖之活性（圈4D、6D、1 〇A、 10B、22A及22B)、細胞侵犯活性（圈23A)、胞外分泌（圈 1C and 7D)、磷解酶活性（圖21A)及Akt磷酸化（圈23D)。 使用此等生物學活性，本發明提供一方法供篩選一化合物 f 其抑制肺癌細胞之增殖，及一方法供篩選一化合物供治療 I. 或預防肺癌。因此，本發明提供一種篩選方法，供篩選供 治療或預防肺癌之化合物’使用編碼為EBI3、DLX5、NPTX1、 CDKN3及/或EF-ldelta基因之該多胜肽，包括以下步驟： (a) 使一測試化合物接觸 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或EF-ldelta之多核苷酸編碼之多胜肽； (b) 偵測步驟（a)之多胜肽之生物活性；及 (c) 選擇相較於不存在該測試化合物時偵測到之該多 ::胜肽生物活性，抑制£BI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及/或 EF-ldelta之多核苦酸編碼之多胜肽之生物活性的測試化 合物。 本發明之方法將於以下更詳述。 任意多胜肽可用於篩選，只要其包括Εβΐ3、讥乂5、 NPTX1、CDKN3及/或EF — ldeIta蛋白質之生物活性即可。 此種生物活性，包括EBI3、DLX5、NPTXi、cmn3及/或 EF-ldelta蛋白質之細胞—增殖活性。例如可使用肋13、 DLX5、NPm、CDKN3及/或EF-ldelta蛋自質，並可使用.
2125-993 7-PF 131 200920406 此種多胜肽可由細胞内 此等蛋白質之多胜肽功能均等物 生性或外生性表現。 以此篩選離析之化合物，為-候選者，作為觀、 ㈣、NPm、c函*/或EF]delta基因編碼之該多胜肚 之拮抗劑。用語”拮抗劑”係指，藉結合，而抑制該多胜 肽功能之分子。該用語亦係指降低或抑制編碼Εβι 3、讥Μ、 NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelta之基因表現之分子。又，以 此篩選離析之化合物，為一候選者，作為抑制EBI 3、汕U、 ΝΡΤΠ、CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽與分子（包括dna及 蛋白質）之禮痄交互作用之化合物。 當欲於該方法中偵測之生物活性為細胞增殖，可藉例 如製備細胞，其表現EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及8/或 EF-ldelta多胜肽，培養該細胞於存在測試化合物下，並 決定細胞增殖速度，測量細胞週期等，並測量群落形成活 性，例如顯示於圈4D、6D、10A、1〇Β、22Α及22B,以偵測。
相較於未經化合物處理之細胞，一化合物降低表現Εβΐ3、 DLX5、NPTX卜CDKN3及/或EF-ldelta多胜肽之細胞之增 殖速度，且相對於未表現或少量表現該等多胜肽之細胞， 維持速度者，被選擇作為候選化合物供治療或預防肺癌。 當本方法欲偵測之生物活性為細胞侵犯活性，可藉例 如製備細胞，其表現CDKN3多胜肽’並決定侵犯細胞量， 以matr igel侵入分析測量，例如顯示於圖23A。相較於未 經化合物處理之細，胞，一化合物降低表現CMN3多胜肽之 細胞mvation，且相對於未表現或少量表現⑶KN3多胜肽
2125-9937-PF 132 200920406 之細胞，維持量者，被選擇作為候選化合物供治 肺癌。 〜识防 當該方法欲偵測之生物活性為胞外分泌，可藉例如 襟細胞，其表現EBI3或NPTX1多胜肽，於存在一測試化人 物下料該細胞，並決定該等多胜肽之蛋白質分泌於培ς 基之1，以ELISA測量，例如顯示於圈lc及7D。相較於未 經化合物處理之細胞，一化合物降低表現Εβΐ3或肝打1多 胜肽之細胞之分泌蛋白質量，且相對於未表現或少量表= NPTXi多胜肽之細胞，維持量者，被選擇作為候選化合物供 治療或預防肺癌。 " 當該方法欲偵測之生物活性為磷解酶活性，可藉例如 使CDKN3多胜肽或其功能均等物於存在一測試化合物下， 接觸EF-ldelta多胜肽或其功能均等物，並決定，恤… 多胜肽之璘酸化水平，例如以西方墨點測量，顯示於圈 2iA。相較於未經化合物處理之細胞，一化合物降低 Udeita彡胜肽之細胞之磷酸化水平’被選擇作為候選 化合物供治療或預防肺癌。於該較佳方法，該EF_ideita多 胜肽之磷酸化水平偵測，係藉磷酸_絲胺酸之測量。 當該方法欲偵測之生物活性為Akt磷酸化，可藉例如 f備細胞’其表現CDKN3多胜狀’並決定m鱗酸化水 平’以西方墨點測量’例如顯示於圈2汕。相較於未經化合 物處理之細胞’-化合物降低表現cdkn3多胜肽之細胞之 似碟酸化水平’且相對於未表現或少量表現CDKN3多胜 肽之細胞，維持量者’被選擇作為候選化合物供治療或預
2125-993 7-PF 133 200920406 防肺癌。 例如已確認EF-ldelta在肺癌細胞中鱼, τ與CDKN3共同表 現’且可能為體内CDKN3磷解酶之生理美暂 狂泰貝，顯示CDKN3 可能經由EF-1 delta之去磷酸化具肺腫瘤生具 /困王長促進功能（圖 20-21)。因此，經由抑制CDKN3功能而抑制EF_ide丨^去 填酸化之化合物’預期抑制肺癌細胞之增 曰XI* 囚此在治療
或預防肺癌’包括NSCLC或SCLC，為有用。因此，本發明 尚提供一方法，供_選一化合*，其抑制肺癌細胞之增^， 及一方法’供篩選一化合物，供治療戋箱狀昧广 口 q /口席4預防肺癌，包括nsclc 及/或SCLC。 更具體而s ’該方法包括以下步驟. (a) 使一候選化合物與過度表現CD〇3之細胞接觸； (b) 測量EF-1 delta之磷酸化水平；及 (。)選擇相較於控制組，降低去磷酸化之候選化合物。 較佳地’ EF-Idelta磷酸化及去填酸化，可藉決定 EF-ldelta分子量偵測。決定蛋白質分子量之方法為周知 的。例如藉使用以下實施例部分所述西方墨點分析，可由 增加及降低分子量分別倘測磷酸化及去磷酸化。或者， EF—他⑴磷酸化水平’尚可藉使用㈣«化EF-ldelta 之抗體的免疫學技術評估。例如認識EF，eita上磷酸化 絲胺酸之抗體，或pan，酸專—性抗體，可用在此種用途。 於車父佳之貫施形雖，欲k '欲比較之控制水平可為EF-ldelta之 填酸化水平’於不存在候選化合物下於相同測試條件之條 件（存在該候選化合物）偵測到者。
2125-9937-PF 134 200920406 或者，於本發明，顯示Akt磷酸化（Ser473)由於⑶κ⑽ 過度表現而增強（圖23)。因此，經由抑制CMN3功能而降 低Akt磷酸化之化合物，亦預期抑制肺癌細胞之增殖，且 供治療或預防肺癌包括NSCLc&/4 SCLC，為有用。因此， 本發明尚提供-方& ’供篩選一化合物，其抑制肺癌細胞 之增殖，及-方法’供篩選_化合物供治療或預防肺癌包 括 NSCLC 及/或 SCLC。 更具體而§，該方法包括以下步驟： (a) 使一候選化合物與過度表現C])KN3之細胞接觸； (b) 測量Akt Ser473之鱗酸化；及 (c) 選擇相較於控制組，降低磷酸化之候選化合物。 於較佳之實施形態，本發明之方法選擇之測試化合 物’可再篩選以評估其治療效果。 較佳地，Akt之磷酸化水平，可在胺基酸序列S£：qid N〇: 6〇之473絲胺酸殘基債測，其由seq id n〇: 59(ΝΡ_0〇1〇14431 )核苷酸序列編碼D Akt磷酸化偵測方 :’可使用該技術領域中周知者。例如可使用敘述於以下 實施例部分之西方墨點分析。 於本發明之内容’可將Akt及CDKN3於存在磷酸鹽（醋 捐出者_如ATP溫育，以提供適於以CDKN3磷酸化Ah之 條件。適於以CMN3磷酸化Akt之條件，尚包括培養表現 CDKN3及Akt之細胞。例如該細胞可為—轉形體細胞，庇護 -表現載體’該表現載體包含一.多核苷酸，編碼該多胜肽。 溫育後，可利用認識磷酸化A k t之抗體，傾測磷酸化水平。 2125-9937-PF 135 200920406 於較佳之實施形態，欲比較 <控制水平，可為在Akt之碰 酸化水平，於不存在候選 磷 ^ +斗 σ物下於相同測試條件之條件 (存在該候選化合物）偵測到者。 偵測磷酸化Akt之前，可M A1 了將Akt從其他要素或Akt表 現細胞細胞溶解物分離。例 例如了使用電泳從其餘成分分離 或者可使Akt接觸具抗Akt &體之擔體接觸，以 捕捉Akt。當使用該經標記㈣酸鹽（自旨）捐丨者，似碟酸 化水平可藉追蹤該標記以偵測。 识列。例如當放射線標定ATp (例 如32p-atp)用為磷酸鹽（酯）指屮 、啦出者’分離之Akt之放射線活 性，相關於Akt磷酸化水平。忐去 * lL ^ ,上 払十。或者，專一地認識磷酸化Akt 而不認識㈣酸化Akt之-抗體，可用則貞㈣酸化Akt。 較佳地，該抗體認識磷酸化Akt於Ser_473殘基。 供製備對一給定蛋白質之多胜肽功能性均等物之方法 為該技術領域所周知，包括導入突變至該蛋白質之已知方 法。一般而言，已知修飾一蛋白質中丨個以上胺基酸不會 衫響該蛋白質之功旎。（Mark DF ei a/.，Proc Nat 1 Acad Sci USA 1 984, 8 1: 5662-6 ； Zol 1 er MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1 982, 1 0： 6487-500 ； Wang A et aL, Science 1 984, 224.1431-3;Da 1 badie-McFar1 and G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982，79: 6409-1 3)。事實上，具經 取代、刪除、插入及/或加成1個以上某個胺基酸序列之胺 基酸殘基之突變或修飾蛋白質，已知會保留原本的生物學 活性（Mark et al.， Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6(1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 2125-9937-PF 136 200920406 1 0:6487-500 ( 1 982 )；Da 1 badie-McFar1 and et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-1 3( 1 982))。因此，熟悉此 技藝之人士將瞭解到，對一胺基酸序列之個別的加成、刪 除、插入或取代’改變單一胺基酸或小百分比的胺基酸或 稱為“保守性修飾” ’其中改變一蛋白質造成具類似功能 之蛋白質者，在本發明内容中為經考量。 例如該技術領域中具有通常知識者可製備對EBI 3、 DLX5、NPTX1、CDKN3、EF-1 del ta 及 /或 Akt 蛋白質之多胜 肽功能性均等物，藉導入一適當突變於此等蛋白質其中之 一之該fe基酸序列’使用例如點突變（Hashimoto-Gotoh eί a/_， Gene 152:271-5(1995);Zoller and Smith,Methods Enzymol 100： 468-500(1983);Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441-56(1984);Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67(1987);Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92(1985);Kunkel TA, et al. , Methods
Enzymol. 1991;204:125-39.)。本發明之多胜肽包括 EBI3、 DLX5、NPTX1、CDKN3、EF-ldelta 及 / 或 Akt 之胺基酸序列， 其中1種以上胺基酸經突變，得到之突變多胜肽為EB〗3、 DLX5、NPTX1、CDKN3、EF-ldelta 及 / 或 Akt 各自之功能性 均等物。只要維持蛋白質活性，胺基酸突變之數目不特別 限定。然而’一般而言，較佳為改變胺基酸序列5%或更少。 因此’於一較佳實施形態，於此一突變體中欲突變的胺基 酸數’一般而言為30個胺基酸或更少，較佳為20個胺基 酸或更少’更佳為1 〇個胺基酸或更少，更佳為5-6個胺基
2125-9937-PF 137 200920406 酸或更少，甚更佳3個胺基酸。 欲突變之胺基酸殘基，較佳為突變成不同的胺基酸， 而該胺基酸側鏈性質為保守的（稱為保守性胺基酸取代之 過程）。胺基酸側鏈之性質之例為：疏水性胺基酸（a、丨凡、 Μ ?、？、评、¥、'\〇、親水性胺基酸（[1)、？^、〇、^、[〇、 Η Κ、s、Τ)，及具以下官能基或共通之特性的側鏈者：脂 肪族側鏈（G、A、V、L、U);含經基之侧鍵（s、t、γ);含 硫原子之側鏈（C、Μ);含羧酸及醯胺之側鏈（D、Ν、ε、卩）； 3驗之側鏈（R、κ、Η);及含芳香族之側鏈（η、F、γ、％)。 注意：括弧内字母代表胺基酸之單字母碼。提供功能類似胺 基酸之保守性取代表，為該領域中為人周知的。例如，以 下8群各包含彼此為保守性取代之胺基酸： 1) 丙胺酸（A)、甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)、谷胺酸（E); 3) 天冬醯胺酸（N)、谷醯胺（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（K); 5) 異白胺酸（I)、白胺酸（L)、甲硫胺酸（M)、纈胺酸（v); 6) 苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（w); Ό絲胺酸（S)、異白胺酸（T);及 8)半胱胺酸（C)、甲硫胺酸（M)(參見例如Creight〇n， Proteins 1984) 此保守性修飾之多胜肽，包括於該EBI3、DLX5、Νρτχι、 ρΚΝ3、EF-ldelta或Akt蛋白質。然而本發明不限於此， 且該 EBI3、DLX5、NPTX 卜 CDKN3、EF_ldelta 或’Akt 蛋白 2125-9937-PF 138 200920406 質包括非保守性修飾’只要保留該原始蛋白質之結合活性 即可。再者該經修飾蛋白質不排除多形變異體、種間同源 物，及由此等蛋白質之對偶基因編碼者。 1種以上胺基酸殘基加成至EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、 EF-1 delta或Akt之胺基酸序列之多胜肽例，為一融合蛋白 質’各包含 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、EF-ldelta 或 Akt。 因此’融合蛋白質，妒融合EBI3、DLX5、Νρτχι、CMN3、 〆 EF-1 delta或Akt and其他胜肽或蛋白質者，包括於本發明。 融合蛋白質可藉該技術領域中具通常知識者周知的技術， 例如藉連結編碼 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、E：F-ldelta 或Akt之DNA及編碼其他胜肽或蛋白質之dna，使得框架 配合，將融合DNA插入一表現載體，並表現其於一寄主中 以製備。融合於本發明蛋白質之該胜肽或蛋白質不限。 已知可作為融合於EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、 EF-ldelta或Akt蛋白質之胜肽的胜肽，包括例如 I FLAG(Hopp TP et al. , BioTechnology 1988 6: 1204-10) ' 6xHis包含6個His(組胺酸）殘基、1〇xHis、流感病毒凝 集素（HA)、人類c-myc片段，VSP-GP片段、pl8HIV片段、 T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T 抗原片段、icktag、 alpha-tubul in片段、β-tag、蛋白質c片段等。可融合於 本發明蛋白質之蛋白質例’包括GST(谷胱甘肽_s—轉移 酶）、流感病毒凝集素（HA)、免疫球蛋白不變區、beta -半 乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白質）等。 融合蛋白質，可藉融合市售可得的DNA、編碼上述融合 2125-9937-PF 139 200920406 胜肽或蛋白質，及編碼 EBI3、DLX5、Νρτχι、CD〇3、EF_ldel ta 或Akt蛋白質之DNA ’並表現該製備之融合DNA，以製備。 另一該技術領域中已知方法，為離析功能性均等多胜 肽，涉及例如雜交技術（Sambr〇〇k以，分子n〇ning 2nd ed. 9.47-9.58’ Cold Spring Harbor Lab. Press(1989))。 热悉該技術領域之人士可輕易地離析一 DNA，其與丨3、 DU5、NPTX1、CDKN3、£F-ldel ta 或 Akt 具高同源性，並從 該經分離之 DNA 離析 EBI3、DLX5、Νρτπ、CD〇3、EF_ldel 從 或Akt之多胜肽功能性均等物。本之 叫編碼、雜交於一部分或全部編碼則、DLX^ CDKN3、EF-ldelta《Akt之ΜΑ彳列且功能性均等於 DLX5 NPTX1、CDKN3、EF-ldelta 或 Akt 者。此等多 胜肽’包括哺乳動物同源物，對應於人類來源之蛋白質(例 如猴、大鼠、兔及牛基因編碼之多胜肽）。於從對物離析高 度同源於編碼謝3、DLX5、Npm、⑶KN3、ef —他…或
Akt之DNA # CDNA時，尤佳為使用前列腺癌之組織。 為了供離析編碼為功能均等於人_謝3、舰、 N P T X1、C D K N 3、F F ~ "Μ 1 + 二 # , deHa或Akt蛋白質之DNA之雜交條 \雜技術領域中具通常知識者例行選擇。用語，，嚴 可（雜交）條侔”总。 序列m 核酸分子將雜交^其標把 t為核酸之複合體混合物， 列雜交。嚴苦紘放* — 彳〜/、/、他斤 較長序料Γ 存性，且在不同的環境不同。 南，可I ·τ·.於較命溫度雜交。關於核酸雜交之詳細指 ^^en, Technology ,, Bi〇Chemistry and
2125-9937-PF 140 200920406
Molecular Biology——Hybridization with Nucleic Pr〇beS、 0verview of Principles of Hybridization and the strategy 〇f Nuclear acid assays”（ 1 993)。於本發 明之内容，適當的雜交條件可由該技術領域中具通常知識 者例行選擇。 一般而s，嚴苛條件選擇較在限定離子強度pH，針對 特定序列之熱熔點（Tm)低約5—10度c。Τιη為5〇%的互補於 標靶探針雜交於標靶序列達平衡（於限定離子強度、ρΗ，及 核酸濃度）之溫度（當標乾序列過量，於Tm，50%的探針於 平衡會被佔據）。嚴苛條件亦可藉添加去安定化劑例如甲酿 胺而達到。對於選擇性或專—性雜交，陽性訊號至少為背 景值2倍，較佳背景值10倍雜交。 例不之嚴苛雜交條件’包括以下：5Q%甲酿胺、议 及1%撕，溫育於42°C，或SSC、1% SDS ’溫育於65 °C ’以0.2x SSC及〇1%撕於5(rc洗務。適當雜交條件 可包括使用 tlRapid-hyb buffer^ (Amersham UFE SCIENCE)在68度C箱蝕-qn八妙· 又C預雜父30分鐘以上，添加經標記 針，並於68度c加溫】小時以上。 铼 該加溫步驟，可於例如低嚴苛條件下實施 ^ =2 ^ ,J. -Γ M ^ 1列不 包括例如 42°c、2x SSC、Q.1% SDS， 佳50C，2x SSC，Q.1%娜。或者例示之高度嚴苛 包括，例如2XSSC、0.01%SDS中洗蘇3次，於室: 分鐘，錢於1XSSC、Q.1%SDS洗務3次，於3? /皿 分鐘’並於1XSSC、W於度C洗條2次2〇又八/3
2125-9937-PF 141 200920406 然而’數因子例如溫度及鹽濃度可影響雜交嚴苛，且該技 術領域中具有通常知識者可適當選擇該等因子以達所需嚴 苛度。 較佳地’該功能性均等多胜肽具胺基酸序列，與此處 揭示之天然 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、EF-ldelta 或 Akt 序列有至少約80%同源性（亦稱為序列同一性），更佳至少 約 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同源性。多胜肽 同源性，可依照 “Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80： 726-30( 1 983)»演算法決定。於其他實施形態， 該功能均等多胜肽，可由一多核苷酸所編碼，豸多核苷酸 在嚴苛條件（定義如下）雜交於編碼此一功能均等物多胜肽 之多核苷酸。 取代雜交，基因放大方法例如聚合酶連鎖反應（pcR)方 法，可用於離析編碼為 EBI3、DLX5、NpTxl、CD〇3、EF_idd^ 或Akt多胜肽功能性均等物之DNA，係使用一啟動子，其依 據 EBI3、DU5、ΝΡΤΠ、CDKN3、EF-ldelta 或 Akt 序列資 訊合成。 有用於本發明内容之EBI3、DLX5、nptxi'cdkn3、 M-ldeUa或Akt功能均等物，可在胺基酸序列、分子量、 等電點、存在或*存在糖鏈或形式有所以，取決於用於 生產其之細胞或寄主或利用之純化方法而定。#， ebI3、DLX5、nptx1、CDKN3、 ......為 iaelta或Akt多胜肽任 一者之功能均等物，气在本發明範圍内。 此處定義之”抑制該生物活性' 較佳為，相較於不存
2125-993 7-PF 142 200920406 在該化合物，抑制 EBI3、DLX5、NPTXl、CMN3 及 / 或 EF-ldelta 生物活性至少1〇%，更佳為抑制至少25%、5〇%或75%，最佳 抑制9 0 %。 DLX5、.JPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 之化合物^_ 於本發明’以siRNA降低表現EBI3、DLX5、NPTX1、 CDKN3及/或EF-ldel ta，造成抑制癌症細胞增殖（圈4D、6D、 10A、10B、22A及22B)。因此，本發明提供一種篩選方法， 供筛選一化合物，其抑制該表現EBI3、DLX5、NPTX卜CDKN3 及/或EF-ldelta。一化合物，其抑制該表現EBI3、DLX5、 NPTX1、CDKN3及/或EF-ldelta ，預期抑制肺癌細胞之增 殖，且因此供治療或預防肺癌有用。因此，本發明尚提供 一方法供篩選一化合物’其抑制肺癌細胞之增殖，及一方 法供篩選一化合物，供治療或預防肺癌。於本發明之内容， 此種篩選可包括例如以下步驟： (a) 使一測試化合物接觸表現eb丨3、DLX5、Νρτχι、CDKN3 及/或EF-1 de 1 ta之細胞；及 (b) 選擇相較於一控制組，降低ebI3、DLX5、NPTX1、 CDKN3及/或EF-ldelta表現程度之候選化合物。 本發明之方法將於以下更詳述。 表現 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta 之 細胞’包括例如從肺癌建立之細胞株；此種細胞可用於以上 本發明篩選（例如 A427、LC176、LC319、A549、 NCI-H23, NCI-H1317、NCI-H1 666、NCI-H1781、NCI-H226、
2125-993 7-PF 143 200920406 NCI-H522、PC3、PC9、PC14、EBC01、LU61、NCI-H520、 NCI-H1703 、NCI-H2170 、NCI-H647 、LX1 、DMS114 、DMS273 、 SBC-3 、 SBC-5 、 SK-LU-1 、 EBC-1 、 RERF-LC-AI 、 SK-MES-1 、 SW900，及SW1573)。該表現程度可由該技術領域中具有通 常知識者周知方法估算，例如rT — PCr、北方墨點法分析、 西方墨點法分析、免疫染色及流動細胞計數分析。此處定 義之''降低表現程度”，較佳，為相較於不存在該化合物， 降低 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及 /或 EF-ldelta 表現程 度至少10%，更佳降低至少25%、50%或75%水平，最佳95〇/〇。 此處化合物包括化學化合物、雙股核苷酸等。製備該雙股 核苷酸已於前述。於該篩選方法，降低EBI3、DLX5、肝TXb CDKN3及/或EF-ldelta之表現程度之化合物，選為候選化 合物，供治療或預防肺癌。 或者，本發明篩選方法可包括以下步驟： (a)使一候選化合物接觸一細胞，其中已引入一載體， 該載體包括 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EFMdelta 之轉錄調控區及-報告基因’其在該轉錄調控區控制下表 現； (b) 測量該報告基因之表現或活性；及 (c) 選擇降低該報告基因之表現或活性之候選化合物。 適當報告基因及寄主細胞為該技術領域中周知。例如 報告基因，有螢光素酶(luciferase)、綠螢光蛋白質 (㈣、心。湖asp•紅營光蛋白f〇)sRed)、氯絲菌素、、 乙醯基轉移_)、〗acZ * beta_葡萄畴路酸躇嶋，
2125-9937-PF 144 200920406 寄主細胞有C0S7、HEK293、HeU等。用# ^ & 用於師選所必要之報 告基因建構物，可藉連接報告基因 u 斤列至 ΕΒΙ3、DLX5、 NPTX1、CDKN3 及 / 或；Ejp-ldelta 之轉 心辩錄調控區以製備。在此 EBI3、DLX5、ΝΡΠ1、CDKN3 及/或 EF 1 + 4 W-ldelta之轉錄調控區 為在起始密碼子至少5_上游之區，較佳上游⑽ 更佳5_或l_Qbp。包含此轉錄調控區之核苦酸區段， 可從基因體庫離析，或ώ PCR放大。用於篩選所必要之報 告基因建構物，可藉連接報告基因序列至此等任一者基因 中之轉錄調控區以製備。鑑別轉錄調控區之方法，及分析 實驗步驟，為周知（Molecular Cl〇ning tMrd editi〇n chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory
Press) 〇 將包含該報告基因建構物之載體感染寄主細胞，並以 該技術領域中周知方法，偵測該報告基因之表現或活性（例 如使用冷光儀、吸附分光光度計、流動細胞計數器等）。此 處疋義之降低該表現或活性"’較佳，為相較於不存在該 化合物’降低報告基因表現或活性至少1 〇%，更佳降低至少 25°/。、50%或 75%水平，最佳 95%。 篩遘一伥舍物，其降低 CDKN3 輿 VRS、EF-1a1i3ha EF-lgamm孕或 EF-ldel ta 間之結合，或 NPTX1 及 NPTXR B9 之 結合： 於本發明’ CDKN3(SEQ ID NO 5;GenBank登記編號： L2771 1 )與 Valy 卜 tRNA 合成酶（vrs)(SEQ ID NO 26 或 28;GenBank 登記編號：NM—006295 或 BC012808)或 2125-9937-PF 145 200920406 EF-lbeta(SEQ ID NO 30;GenBank 登記編號：NM—001 959) 或 EF-lgamma(SEQ ID NO 7;GenBank 登記編號：BC009907) 或 EF-ldelta(SEQ ID NO 32;GenBank 登記編號：BC009865) 間之交互作用’以免疫沉澱顯示（圈i8A)，或NPTX1及nptxr 間之交互作用’顯示於圈15B。又，CDKN3結合於對應於 EF-lgamma(SEQ IDN0: 48)之 72 至 160 胺基酸之區（圈 21B 及 21C)。此外’CDKN3 去碗酸化 EF-ldelta(圈 20D 及 21A)。 因此’本發明提供一種篩選方法，供篩選一化合物，其抑 制CDKN3及交互作用同伴間之結合，該交互作用同伴擇自 於 VRS、EF-lalpha、EF-lbeta、EF-lgamma，及 EF-ldelta 或介於NPTX1及NPTXR間之結合。一化合物，其抑制CDKN3 及交互作用同伴間之結合，或介於Νρτχι及NpTXR間之結 合’預期抑制肺癌細胞之增殖，因此供治療或預防肺癌有 用。因此，本發明尚提供一方法供篩選一化合物其抑制肺 癌細胞之增殖，及一方法供篩選一化合物供治療或預防肺 癌。 更具體而言，該方法包括以下步驟： (a)使CDKN3多胜肽或其功能均等物，於存在一測試化 合物下，接觸一交互作用同伴，其中該交互作用同伴擇自 於VRS多胜肽、EF-lalpha多胜肽、EF-lbeta多胜肽、 EF-lgamma多胜肽、EF_ldelta多胜肽及其功能均等物； (b )谓測該多胜肽間之結合；及 (c)選擇抑制該多胜肽間之結合之測試化合物；或 (a)使NPTX1多胜肽或其功能均等物，於存在一测試化
2125-9937-PF 146 200920406 合物下，接觸一交互作用NPTXR多胜狀或其功能均等物. (b)偵測該多胜肽間之結合；及 ’ (C)選擇抑制該多胜肽間之結合之測試化合物。 於本發明，，，交互作用同伴，，係指-物質或化合物， 其涉及CDKN3之生物活性。因此 口此，例如當CDKN3需要一多 胜肽以表現其功能，該多胜狀可為“交互作用同伴，，。一 般而言，圓3及該交互作用同伴彼此結合以維持功能。於 較佳之實施形態，交互作用同伴為多胜肽。在此揭露CMN3 與VRS乡胜肽、EF]alpha多胜肤、㈣心多胜狀、 EF-lg_a多胜肽、EF_ldelta多胜肽交互作用。因此， 此等分子及功能均等物為較佳交互作用同伴。在此，例如 父互：用同伴功能均等物’，包括_多胜肽，其具均等 於該父互作用同伴之生物活性。 即保留此種交互作用同伴至少1種生物活性之任音多 胜肽，可作為於本發明之功能均等物。例，交互作用料 之功能均等物保留促進細胞增殖活性。此外，交互作用同 伴生物活性，包含CDKN3結合活性及/或贈3-媒介之細胞 遷移或增殖。交互作用同伴功能均等物，包括此等交互作 用同伴蛋白質於天«生胺基酸序列其中丨種以上胺基酸 經取代、刪除、或插入。 此處使用之用語” p p Λ y 1 gamma多胜肽功能均等物”， :私該夕胜肽，其包括CDKN3結合結構域之(_ η N〇: 48) :气基I序列。同樣地，用語’’ c则3多胜肽功能’ 係指該多胜肽，其包括VWF—lbetuEF_lga麵或
2125-993 7-PF 147 200920406 EF-1 de 11a結合結構域之 '〜 νκύ 取 EF-lbeta或EF-lgamma多胜肽之功能均等物”係才匕該夕胜 肽，其包括CDKN3結合結構域之胺基酸序列。 本發明之方法以下更詳述。 作為一篩選方法供篩選化合物其抑制CDKN3及VRS、 EF-lbeta、EF-lgaffima 或 EF-ldelta 間之結合或介於 Νρτχι 及NPTXR間之結合，許多該技術領域中周知方法可使用。 此篩選可以體外分析系統實施。更具體而言，首先將CM — 或NPTX1多胜肽結合至一支持體，將VRS、Εί? 、 EF-lgamma^ EF-ldelta多胜肽或NPTXR與一測試化合物 一同添加。其次，溫育此混合物，洗滌，偵測及/或測量結 合於此支持體之 VRS、EF-lbeta、EF-lgamma、EF-ldeita 多 胜肽或NPTXR。有望之候選化合物可降低VRS、從、
EF-lgamma、EF-ldelta多胜肽或NPTXR偵測量。相反地， VRS EF-lbeta、EF-lgamma、ef-ldelta 多胜肽或 NPTXR 可能結合於一支持體’且可添加CDKN3多胜肽或ΝΡΤΧ1。 此處’ CDKN3或ΝΡΤΧ1及VRS、、 EF-ldelta或NPTXR多胜肽’不僅可製備天然蛋白質，亦 可以基因重組技術製備作為重組蛋白質。該天然蛋白質可 利用例如親和層析製備。另—方面，^組蛋白質可藉谇養 經以編物⑽肩、EF-lbeta 鲁lga_、EF、ldel^ NPTX1或nptxR之嶋轉形之細胞，以表現此處蛋白質並且 回收之。
可用於結合蛋白質之支持體例，包括不可溶之多糖’ 2125-9937-PF 148 200920406 例如瓊脂、纖維素及葡聚糖；及合成樹脂，例如聚丙烯醯 胺、聚苯乙烯及矽酮；較佳為以上材料製備之市售珠及板 (例如多井板、生物感測器晶片等）。當使用珠，可充填在 管柱中。或者，使用磁性珠亦為該技術領域中已知，能經 磁性輕易地離析結合在珠上的蛋白質。 、’、《 5蛋白質至一支持體，可依照例行方法，例如化學 結合及物理吸附。或者，可將一蛋白質經由專一地認識該 蛋白質之抗體結合於一支持體。又，結合蛋白質至一支持 體’亦可利用親和素及生物素。蛋白質間之結合，實施於 緩衝液中’❹但不限於磷酸緩衝液及Tris緩衝液，只要 該緩衝液不會抑制該蛋白質間之結合即可。 於本發明，使用該表面電衆共振現象之生物感測器可 作為偵測或定量已結合蛋白質之方法。當使用此一生物感 測益，該蛋白質間之交互作用’可即時觀察作為表面電漿 共振訊號，僅使用小量多胜肽且不必標記（例如βΐΑ⑽，
Pharmacia)。因此，能柹用迕榀、，
此使用生物感測器例如B
CDKN3 及 VRS、EIMbeta、EF gd_a 或 EF-ldelta 間或介 於NPTX1及NPTXR間之結合。 門飞’丨 或者，CDKN3、VRS、EF_lb ta EF-igamnm 或 EF_ld lt NPTX1或NPTXR可經標呓， 多胜肽之標記，可用於偵 一 . 具體而s ’預標記該多胜肽之—後， 於存在一測試化合物下，使奴 肽，炒德j狢接 、不的多胜肽接觸其他多胜 肽'後洗·條後，依照該標記偵測 肽。標記物質例如放射線、〜里'，!結合的之多胜 射線冋位素(例如3H、“C、，、，、“S、
2125-9937-PF 149 】3】 200920406 I)、酵素（例如鹼性磷 ^解_、辣根過氧化# (horseradish peroxidase) > b-主 她叶 m 丰礼糖奋酶、b-葡萄糖苷 扭）、螢光物質（例如異辟羞 .+,. 兵硫氰酸螢光素（fluorescein isothioSyanete ， FITC)、 羅丹明（rhod⑽ine))，及生物 素/親合素，可用在本方法 蛋白貝。當蛋白質經放射 線同位素標記’偵測或測量可葬该科网_、 里」精液體閃爍分析實施。或者，
經酵素標記之蛋白質，可M 、 藉添加該酵素之基質，偵測基因 之酵素變化，例如產生顏色， 以及附计，以偵測或測量。
再者，若使用螢光物質作A^ A 、馬標s己’結合之蛋白質可使用螢
光计偵測或測量D 再者 CDKN3 與 VRS、EF-lbeta、FP 1 ^ n iDeta、EF-lgamma 或 EF-idelta 間之結合，或NPTXi及NPTO間之結合，可使用對抗CD〇3,
EF lbeta、EF-lgamma、EF-ldelta、NPTXl 或 NPTXR 之抗體偵測或測量。例如使固定化在一支持體上之。剛 多胜肽或™多胜肽接觸-測試化合物m beta EF lgamma 或 EF_ldelta 多胜肽或 多胜 月後/皿月此合物，並洗滌，偵測或測量可使用對抗Ms、 EF lbeta EF-lgamma或EF_ldelta多胜肽或肝丁找多胜
肽之—抗體實施。 或者，VRS、EF-lbeta、EF-lgaroma、EF-ldelta 多胜 Mpm多胜& τ固定化在一支持體上，並使用對抗 CDKN3或ΝΡΤΧ1之一抗體作為該抗體。若使用一抗體於該筛 k該柷體杈佳為經上述標記物質其中之一標記，且依據 該^ D己物貝偵測或測量。或者，對抗cdkn3、vrs、EF_lbeta、
2125-9937-PF 150 200920406 EF-lgamma、EF-ldelta、NPTXl 或 NPTXR 多胜肽之該抗體 可作為一初級抗體’被一 2次抗體偵測，該2次抗體以一 標記物質標記。再者，本發明篩選中，結合於該蛋白質之 抗體，可使用蛋白質G或蛋白質A管柱偵測或測量。 或者，於本發明篩選方法另一實施形態，可使用2雜 交體系統’其利用細胞（“ MATCHMAKER 2-雜交體系統”、，， 哺乳動物MATCHMAKER 2-雜交體分析套組”、” MATCHMAKER 1-雜交體系統”（Clontech); “HybriZAP 2-雜交體載體系 統’’（Stratagene);參考文獻 “DaltonandTreisman，Cell 68 : 597-612( 1 992) 、 Fields and Sternglanz, Trends
Genet 10: 286-92(1994)” ）。 於該2-雜交體系統’例如CDKN3多胜肽或NPTX1多 胜肽融合於SRF-結合區或GAL4-結合區，並表現於酵母細 胞内。結合於 CDKN3 多胜狀之 vrs、EF-lbeta、EF-lgamina 或EF-ldelta多胜肽或結合於NPTX1多胜肽之NPTXR多 胜肽’於存在一測試化合物下’融合於VP16或GAL4轉錄 活化區，且表現於該酵母細胞中。或者，CDKN3多胜肽或 NPTX1多胜肽可融合於該SRF—結合區或gAL4_結合區，且 VRS、EF-lbeta、EF-lgamma、EF-ldelta 多胜肽或 NPTXR 多 胜肽可融合於該VP16或GAL4轉錄活化區。2者之結合活化 報告基因，使陽性選殖體可檢測。作為一報告基因，除ΗI § 3 基因以外’可使用例如Ade2基因、lacz基因、CAT基因、 螢光素酶基因等可使用。 又，若使用CDKN3及EF-lgamma，本發明篩選方法藉使 2125-9937-PF 15] 200920406 用抗碟酸-絲胺酸抗體偵測ef- 1 gamma磷酸化水平。 進一步篩遷供治療或_預防肺痛之化合物： 於本發明，揭露抑制以下事件1種以上，降低肺癌包 括NSCLC及SCLC細胞增瘦。 -表現 EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3 及/或 EF-ldelta， _ EBI3、DLX5、NPTX1、C：DKN3 及 /或 £F-ldelta 生物活 性，及 -CDKN3 及 EF-lalpha、EF-lbeta、EF_lga_a 及/或 EF-1 de 1 ta間之交互作用 因此篩選測試化合物，其抑制以上事件中至少丨種， 可鑑別具治療或預防肺癌潛力之候選化合物。具治療或預 防肺癌潛力之候選化合物，可藉帛2筛選及/或進一步筛 選’以鑑別癌症之治療藥劑。 EF-ldelta $ y · · 此處揭露蛋白質之顯性抑制（—i職t negative)突變 可用於治療或預防肺癌。例如本發明提供方法，供治 體 療或預防於—個體之肺癌，藉投予具顯性抑制作用之— EF—ldelta突變體’編碼此一突變體之多核苷酸。該 EF —突變體可包括—胺基酸序列，其包括-圓3 結合區例如—部分EF_ldelta蛋白質，並包括 之一部分白胺酸拉鏈（見圖20A) 具SEQ ID N0 · 61之胺基酸序列 位置 90-108。 該EF-ldel ta突變體可 對應於SEQ ID N0: 8之 包括序列 本發明尚提供一多胜肽
2125-9937-PF 152 200920406 ENQSLRGVV詞QAISKL⑽IDNQ: 61);或多胜肽之一胺基 酸序列，功能性均等於該多胜肽’其中該多胜狀欠缺_ D NO: 8構成之胜肽之生物學功能。於—較佳實施形態，欲刪 除之該生物學功能為促進細胞肺癌細胞之增殖之活性。本 發明之多胜肽長度’可小於全長EF__ldeHa(SEQ id n〇: 8:281殘基）一般而言，本發明多胜肽可小於2〇〇胺基酸 殘基，較佳小於1〇〇胺基酸殘基，更佳1〇_5〇或8_3〇胺 基酸殘基。 、 本發明之多胜肽包括經修飾的多胜肽。於本發明，用 語，，經修飾” ’意指例如結合其他物質。因此，於本發明， 本發明之多胜a T帛包括其他物質例如細胞膜通透性物 質。該其他物質包括有機化合物，例如胜狀、脂質、糖類 及各種天然發生或合成聚合物。本發明之多胜肽可具任意 修飾，只要該多胜肽保留抑制結合EF_ldeHa至CMN3之 所望活性。於一些實施形態，該抑制性多胜肽可直接與 (' EF-ldelta競爭結合至CDKN3。修飾尚可對本發明之多胜肽 提供額外功能。額外功能之例，包括標靶能力、傳遞能力， 及安定化。 於一些較佳之實施形態，該EF_ldelta突變體可連結 一膜傳導劑。已有數種胜肽序列定性具能力轉位進入活細 胞，且能用於於本發明之用途。此種膜傳導劑（通常為胜肽） 文限於内化於活細胞後其到達細胞質及/或核隔間之能 力。可彳于到傳導樂劑之蛋今質例，包括HIV Tat transactlvat〇rl，2、你以仙叹3“以轉錄因子
2125-9937-PF 153 200920406
Antennapedia3。此外可使用具傳導活性之非天然胜肽。此 等胜狀一般為小胜肽，已知其膜交互作用性質，測試供轉 位。K-纖維母細胞生長因子（FGF)之該分泌訊號序列内之疏 水區蛇毋素（venom t：oxin)inastoparan(transportan)13， 及Buf or in 114(—兩生動物抗微生物胜肽），顯示作為傳導 藥劑為有用。有用於本發明之傳導藥劑評論，見J〇li〇1：以 a人 Ce"万/σ/0《，6:189_96(2〇〇4)。 EF-ldelta突變體可具通式： [R]-[D] 其中[R]為一膜傳導劑，[D]為一多胜肽，具Νρτχι之 胺基酸序列SEQ ID N0: 61。於該通式，[R]及[D]可直接連 結或通過連結子間接連接。具多數官能基之胜肽或化合物 可作為連接子。具體而言，胺基酸序列_GGG_可作為連接 子。或者’該膜傳導劑具ΝΡΤχι之胺基酸序列SEq ID no: 61 之該多胜肽可結合於該微型微粒表面。於本發明，[R]可與 [D]任意區連結。例如[R]可與[1}]之N_末端或c_末端連結， 或構成[D]之胺基酸殘基之側鏈連結。再者，可將多個[R] 刀子與一分子[D]連結。於一些實施形態，多個分子[R]， 可與[D]之不同部位連結。於另一實施形態，[D]可經連結 在一起之一些[R]修飾。 該膜傳導劑可從以下族群選擇； [多精胺酸];Matsushita，M. 厶 JNeurosci. 21， 6000-7(2003).
[Tat / RKKRRQRRr](seq id NO: 63)Frankel, A. <3/ 2125-9937-PF 154 200920406
Cell 55,1189-93(1988).
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88(1988).
[Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO: 64) Deross i, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50(1994). " [Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO: ' 65) i ' Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50(2000).
[Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO: 66)
Pooga, M. et aL FASEB J. 1 2, 67-77(1 998).
[MAP(模型兩親媒性胜肽）/ KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO: 67) / Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, i / 127-39(1998).
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Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003).
[Ku70 / PMLKE](SEQ ID NO: 70) 2125-993 7-PF 155 200920406
Sawada, M. et a 1. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003).
[Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO: 71)
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90(2002).
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Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6(2001).
[SynBl / RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO: 74)
Roussel 1e, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86(2000).
[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO: 75)
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65(2002).
[HN-1 / TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO： 76)
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6(2000)
於本發明’構成該多精胺酸之精胺酸殘基數不限。於 一.些較佳之貫施形態’例如5至2 0連續精胺酸殘基。於一 較佳貫施形態’該多精胺酸之精胺酸殘基數，為1丨（SEq j D
2125-9937-PF 156 200920406 NO: 77) 〇 此處使用之用語” EF_ldelta之顯性抑制片段，，，係 指EF-ldelta之一突變形，能與CD〇3複合。因此，顯性 抑制片段非功能性均等於全丨㈣化…多胜肽。較佳之 顯性抑制片段包括一 CDKN3結合區，例如一部分EF_ldelta 蛋白貝並包括EF-ldelta之一部分白胺酸拉鏈。 於另—實施形態，本發明提供一多胜肽之使用，具序 列enqslrGVV_⑷SKL(SEQ ID NQ: 61);功能性均等於該 夕胜肽之多胜肽；或多核苷酸，編碼該等多胜肽，以製造 醫藥組合物供治療或預防肺癌，其中該多胜肽欠缺SEQ ID NO: 8構成之胜肽之生物學功能。又，於另一實施形態，本 發明尚提供一藥劑，供治療及預防肺癌其中之一或兩者， 包括一多胜狀作為活性成分，其包括序列 ENQSLRGVVQELQQAISKL(SEQ ID N0: 61);功能性均等於該多 胜肽之一多胜肽；或多核苷酸，編碼該等多胜肽，其中該多 胜肽欠缺SEQ ID N0: 8構成之胜肽之生物學功能。或者， 本發明尚提供一種醫藥組合物，供治療或預防肺癌，包括 一多胜肽，由序列 enqslrgvvqelqqaiskl(seq ID N〇: 61) 構成；或功能性均等於該多胜肽之一多胜肽；及一醫藥上可 接受之擔體’其中該多胜肽欠缺SEQ Π) N0: 8構成之胜狀 之生物學功能。 熟悉該技術領域之人士可輕易地對一既定個體，藉考 慮例如體重、年紀、性別、疾病類型、症狀及其他個體條 件；投予路徑；及投予為局部或全身性等因子，決定投予本 2125-9937-PF 157 200920406 發明多胜肽之有效量。 雖劑量會依照症狀而不同，供治療或預防NSCLC之抗 體或其片段劑量例，當口服投予至正常成人（體重6〇 4), 每曰約〇· 1 mg至約1〇〇 mg，較佳每日約L 〇 mg至約5〇即, 更佳母日約1. 0 mg至約2 0 mg。 當非口服投予，以注射至正常成人（體重60 kg)，雖依 照病患條件、疾病症狀及投予方法，會有一些差異，靜脈 内注射每日—劑約〇. 〇1 mg至約3〇 mg，較佳每日約1至 約20 mg ’更佳每曰約0· 1至約10 mg，為便利的。又， 若其他動物’可轉換投予量為體重60 kg。 應瞭解，可投予較多或較少量該胜肽。對特定情形需 要的精確劑量，可由該技術領域中具通常知識者輕易及2 行決定。
本發明更提供一方法或處理，供製造一醫藥組合物， 以供治療表現EF-ldelta之肺癌’其中該方法或處理包括： 犯合一活性成分與一醫藥上或生理上可接受之擔體之步 驟/、中該活性成分為一多胜肽，包括序列 ENQSLRW(m_ISKL(SEQ ID NQ: 61);或功能性均等 多胜肽之一多胜肽。 、 本發明態樣敘述於以下音竑如 # τ立η ™ ^卜貝施例，並不意欲限制申請專 利範圍中所述本發明範圍。 除非另外疋義，所有此處使用之技術及科學用語，與 本發明所屬技術領蝻>、s # t '、 •貝域之通常知識者所瞭解之通用意義相 同。雖類似或均等於此虎祕、+、+丄 . 寸仏此處所迷方法及材料可使用於該實施
2125-9937-PF 158 200920406 或測試本發明，以下敘述適 本發明將於以下貫施例 請專利範圍中所述本發明範 當方法及材料。 進步敘述，並不意欲限制申 圍。 •實施例 並不意欲限制申 本發明將於以下實施例進—+ 、 少救述 請專利範圍中所述本發明範圍。 第I部分：EBI3相關實驗 [實施例1 ] 一般方法 入細胞株及组織樣本 用於此研究之23個人類腧旗‘ 貝肺癌細胞株，包括9種腺癌 (ADC;A427, A549、LC319、Pc~3、Pr ο l 心 PC-9、 PC-14、 NCI-H1373 、 nCI-_6 * NCI-H1m)、2 種腺鱗“（Ase;Nei_H22u ΝΠ-H647)、7 種 SCC⑽CM、LU61、nc卜H52〇、nci_h17〇3、 NCI-H2170、RERF-LC-AI，及 SK一㈣ς !、 久M MLS-1)、1種大細胞癌 (LX1)，及 4 種小細胞肺癌（SCLC; DMS114、DMS273、SBC-3，
及SBC-5)。所有細胞在補充1〇% Fcs之適當培養養基中生 長成單層，並維持在37度C、潮濕空氣、5% c；〇2中。人類 小呼吸道上皮細胞（SAEC)作為控制組，生長在得自Cambrex
Bioscience，Inc_ (East Rutherford, NJ)之最適化培養（小 呼吸道生長培養基）。初期肺癌樣本早先以告知後同意取得 (Yamabuki T, et al., Int J Oncol 28: 1375-84(2006),
Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205(2003),
Taniwaki M, et al·， Int J Oncol 29: 567-75(2006))。
臨床階段係依照 International Union Against Cancer TNM 2125-9937-PF 159 200920406 分類判斷（Sobin L, et a 1. , 6th ed. New York: Wiley-Liss;(2002))。總共 423 個初期 NSCLC(I-ΠΙΑ 階段） 福馬林固定樣本包括271 ADC、110 SCC、28 LCC、14 ASC 及鄰近正常肺组織’早先在Sai tama癌症中心（Sai tama, Japan)由經歷手術之病患，與臨床病理資料一同取得。此 研究及提及之所有使用臨床材料，由個體制度倫理委員會 核准。 之·血清樣本 血用樣本’以告知後同意’從1 2 〇位健康控制組個體 (96名男性及24名女性；年紀中位值51. 6，範圍27〜6〇歲） 及63位患慢性阻塞肺病（c〇pD)之非腫瘤肺疾病病患（53名 男性及1 〇名女性；年紀中位值67· 〇，範圍54至73歲）得 至J所有此等C0PD病患為目前及/或以前曾吸煙者[平均值 ( + /-1 SD)包-年指標（ργ!)， 每天消耗之香煙包數（每包： '為 70.0 +/- 42.7;PYI 定義為： 2 0根香煙）乘年數]。血清樣本， 亦線矣知你田矣.似 r\ r π… .
得’並保存在—150度c。 义半定量反轉錄-PCR
2125-9937-PF 160 200920406 將來自各樣本之總共3 micro g mRNA，使用隨機啟動 子及 Superscript IKInvitrogen，Carlsbad，CA)反轉錄 為早股 cDNA(R〇che Diagnostics, Basel, Switzerland)。 半定量反轉錄-PCR(RT-PCR)實驗，係以專一於EBI3或beta-肌動蛋白（ACTB)專一性啟動子之下列套合成啟動子實施， 作為内部控制： EBI3、 5’ -TGTTCTCCATGGCTCCCTAC-3’ （SEQ IDNo: 9) 及 5’ -AGCTCCCTGACGCTTGTAAC-3’ （SEQ ID No: 10); ACTB、5’ -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，（SEQIDNo:ll) 及 5’ -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3， （SEQ ID No: 12)。 PCR以週期數最適化，以確保產物強度位在放大之線性 相。 4.北方墨點分析
涵蓋16組織之人類多重組織墨點（BD Bi〇sciences，
Palo Alto, CA)雜交於一 [aipha-32p]—dCTP-標記、EBI3 之404-bp PCR產物，其製備作為探針，並使用啟動子 5’ -TGTTCTCCATGGCTCCCTAC-3’ （SEQ Π) No: 13)及 5’ -CTACTTGCCCAGGCTCATTG-3， （SEQ Π) No: 14)。 預雜交、雜交，及洗滌，係依照製造商說明書進行。 該等墨點於-80度C以加強篩經放射能照相於7天。 5.免疫細胞化學分析
Dickinson Labware， 將細胞平攤在蓋玻片（Bect〇n
2125-9937-PF 161 200920406
Franklin Lakes, NJ)，以 4%三聚甲醛固定，並以 0. 1% Triton X-l 〇〇於PBS，於室溫通透3分鐘。非專一結合以 Cas 阻斷（ZYMED, San Francisco, CA)在室温阻斷 10 分鐘。 然後將細胞在室溫與以包含3% BSA之PBS稀釋之初級抗體 一起溫育60分鐘。以PBS洗滌後，將細胞以Alexa488-結 合2次抗體（Invitrogen)於室溫染色60分鐘。以PBS再洗 滌後，將各樣本安放在包含4’ ，6-二f脒基-2-笨基吲哚之
Vectashield(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ’並以光譜共焦掃描系統使可見化（TSC SP2 AOBS;Leica
Microsystems, Wetzlar， Germany)。 艮免疫组織化學及组織微陣列 為了調查包埋在石蠟塊之臨床樣本中之EBI3蛋白 質，將切片以如下方式染色。簡言之，將3· 3 mg/mL山羊
多株抗人類 EBI3 抗體（Santa Cruz BioTechnology， Santa Cruz’ CA)在阻斷内生性過氧化酶及蛋白質後加至各 載玻片，並將切片與作為2次抗體之HRP標定抗山羊j gG
[Histofine Simple stain MAX P〇(G), Nichirei， Tokyo’
Japan] —起溫育。加入基質_發色體，並將樣本以蘇木素對 比染色。腫瘤組織微陣列，以另外敘述之福馬林固定的423 個初期肺癌建構（Chin SF， et al.，M〇1 path〇i 56: 275-9(2003), Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol 12: 27-34(2003), Callagy G, et al., J Path〇l 205： 388_96(2〇〇5))。用於取樣之組織區，係依據與該對應的 膽-染色過的切片排放在一载玻片上的可見排列選擇。從
2125-9937-PF 162 200920406 捐出者腫瘤塊取出《3、4或5個組織核（直徑〇6国深度 3 - 4 mm) ’以一組織微陣列儀放進接受者石蠟塊（Beecher
Instrumeni s’ Sun Prai r 1 e，Π )。針對各個案，戳刺正常 組織之核，將得到之微陣列塊之5-micro m切片，用於免 疫、，且織化學分析。3名獨立的調查員半定量地評量eb 13陽 性，他們對於先前報告的臨床病理資料並不知道（Suzuki c， et al., Cancer Res 65: 11314-25(2005), ishikawa N, et al·’ Clin Cancer Res 10: 8363-70(2004), Kato T’ et al·, Cancer Res 65： 5638-46(2005), Hayama S, et al.,
Cancer· Res 67: 4113_22(2〇〇7))。EM3 染色強度使用以下 準則評估：強陽性（分數2 + )、棕染色>50%腫瘤細胞完全 模糊細胞質；弱陽性（1 + )，任意較小程度之棕染色，腫瘤細 胞質可觀察到；及沒有（分數〇)’在腫瘤細胞無可察覺之染 色。僅於評論者獨立定義於此之案例，接受為強陽性。 乙统計分析 統計分析使用Statview統計程式進行（SAS，Cary, NC)。腫瘤-專一性存活曲線，從手術日計算至關於nsclc 死亡k間或最後追縱觀察。Kaplan-Meier曲線，針對各相 關變數及針對EBI 3表現計算；病患次族群存活時間之差 異，使用Log-rank檢定分析。單變量及多變量分析，使用 Cox比例危害迴歸模型，決定臨床病理學變數及癌症相關 死亡率間的關連。首先，死亡與可能之預後因子間的關連， 包括年紀、性別、病理性腫瘤分類，及病理節分類，每次 考慮一因子’並分析。第二，將多變量C〇x分析應用在朝
2125-9937-PF 163 200920406 後（逐步）程序，其永遠迫使強E B丨3身；® 、、仗5$ 表現進入模型，與任惫 及所有滿足P值<〇· 05進入水平之變 ^ " 又双起。當該模型 持續加入因子’獨立因子不會超過p < 〇 〇5跳出水平。
8. ELISA EBI3之血清水平以ELISA系統測量，其已原始建構。 首先將專-於EBI3之山羊多株抗體，加i 96_井微平盤 (Nunc，Roskilde，Denmark)作為捕捉抗體，並於室溫溫育 2小時。洗去任意未結合抗體後，將5% BSA加至井中，並 於4度C溫育16小時供阻斷。洗滌後，將3倍稀釋之血清 加至井中’於室溫溫育2小時。洗去任意未結合抗體後， 將專一於EBI3之使用生物素標記套組—NH2(d〇jind〇,
Kumamoto，Japan)之生物素化多株抗體，加至井中作為偵 測抗體，於室溫溫育2小時。洗去任意未結合抗體_酵素藥 劑後，將HRP-#親合素加至井中，並溫育2〇分鐘。洗滌後， 將基質溶液（R&D System, lnc_，Minneapolis，MN)加至井 中，並反應30分鐘。該反應藉添加100 micr〇 L 2N硫酸 停止。以光度計，在波長450 nm決定色度，參考波長為 5 70 nm。血清中之CEA水平，以市售可得的酵素測試套組 (Hope Laboratories，Belmont, CA)，依照供應商建議， 以ELISA測量。血清中之pr〇GRp水平，以市售可得的酵素 測試套組（TFB，Tokyo, Japan)依照製造商實驗步驟，以 ELISA測量。腫瘤組及健康控制組間之ebI3、CEA及Pr〇GRP 水平差異’以Mann-Whi tney U測試分析。EBI3、CEA及
ProGRP之水平，以接受者定性（R0C)曲線分析，以決定具最 2125-993 7-PF 164 200920406 適診斷正確性及可能比例之截止水平。EBI3及CEA/ProGRP 間的相關係數，以Spearman rank相關計算。顯著，定義 為 P < 0. 05。 夕.RNA干擾分析 將小型干擾 RNA(siRNA)二倍體（Dharmacon， Inc.， Lafayette, C0)(600 pM) ’ 使用 30 micro 1 Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad, CA)，依照製造商實驗步驟， 轉染到NSCLC細胞株A549及LC31 9。將經轉染之細胞培養 7天，細胞存活性以3-(4,5-二曱基嗟吐-2-基）-2,5-二苯 基四唾錄 >臭（MTT)分析（細胞計數套組-g溶液；j)〇jindo
Laboratories, Kumanoto，Japan)評估。為了確認抑制 EB13 表現’以專一於上述EB13之合成啟動子實施半定量 RT-PCR。針對RNAi之該合成寡核苷酸序列如下： 控制 l(On-Target plus;Dharmacon，Inc. ;po〇l 〇f 5’ -UGGUUUACAUGUCGACUAA-3’（RNA，對應於 SEQIDN0: 53); 5’ -UGGUUUACAUGUUUUCUGA-3’（RNA，對應於 SEQ ID NO: 54); 5’ -UGGUUUACAUGUUUUCCUA-3’（RNA，對應於 SEQ ID NO: 55);
5’ -UGGUUUACAUGUUGUGUGA-3’（RNA，對應於 SEQ ID NO： 56))； 控制 2(螢光酶素（Luciferase)/LUC: Photinus pyralis 1 uc i f erase 基因）， 2125-9937-PF 165 200920406 5’ -NNCGUACGCGGAAUACUUCGA-3’ （RNA，對應於 SEQ ID No: 16); 對著 EBI3-1 之 siRNA(si-仰Λ?-#1)， 5’ -UACUUGCCCAGGCUCAUUGUU-3， （SEQ ID NO: 17) 5’ -CAATGAGCCTGGGCAAGTA-3’ 作為 si-從/<?-# 1 之標 靶序列（SEQ ID NO: 18); si-EBI3-t2, 5’ -AACAGCUGGACAUCCGUGAUU-3’ （SEQ ID NO: 19) f 5’ -TCACGGATGTCCAGCTGTT-3’ 作為 s i之標 靶序列（SEQ ID NO: 20) 表現EBI3之COS-7轉染« 穩定表現EB13之轉染體，依照標準實驗步驟建立。EBI 3完 整 編碼區 ， 使用啟 動子組 (5’ -CCGCTCGAGGGAATTCCAGCCATGACCCCGCAGCTT-3’ 及 5’ -TGCTCTAGAGCACTTGCCCAGGCTCATTGTGGC-3’ ） ， 以 RT-PCR放大。將產物以价oRI及消化，選殖於 pcDNA3.1-myc/His A( + )載體（Invitrogen)之適當位置，該 載體包含c-myc-His抗原決定基序列（LDEESILKQEHHHHHH) 作為EBI3蛋白質之C00H末端。使用FuGENE 6轉染藥劑 (Roche Diagnostics, Basel, Switherland)，依照製造商 實驗步驟，吾人以表現EBI3(pcDNA3. l-EBI3-myc/His)之質 體或假質體（pcDNA3. 1-myc/His)，轉染不表現内生性EBI3 之C 0 S - 7細胞。將經轉染之細胞培養在包含1 0 % F B S及 genet i c i η (0. 4mg/m 1)之DMEM 14天；然後將5 0個別的群落 2125-9937-PF 166 200920406 以胰蛋白酶消化並以極限稀釋分析篩選穩定的轉染體。表 現EBI3在各選殖體，以西方墨點及免疫染色決定。 /人MTT及群落形成分析 將能穩定表現EBI3C0S-7轉染體，接種到6井平盤（ιχιο4 細胞/井）’並維持在包含10% FCS及0. 4 mg/mi geneticin 之培養基。120小時後，細胞增殖以MTT分析使用細胞計 數套組分析（Wako，Osaka，Japan)。將群落染色並同時計 數。所有實驗進行3重複。 f '' [實施例2]肺癌及正常组織之EBI3表現 為了鑑別能應用於早期偵測癌症存在之新穎分子，並 依據該癌症細胞生物學特性開發新穎之治療法，使用cDNA 微陣列實施1 〇 1肺癌之基因體規模的表現概況分析 (Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205(2003),
Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75(2006), Kikuchi T, et al., Int J Oncol 28: 799-805(2006), Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1: 485-99(2003), 、；
Kakiuchi S, et al. , Hum Mol Genet 1 3: 3 0 2 9-43 (2 0 04)) 〇 在篩選之32, 256基因中’在檢驗之肺癌樣本大多數中，癌 症細胞鑑別EB13轉錄物提高表現（3倍以上）。過度表現藉 半定量RT-PCR實驗’於15肺癌組織中之11、23肺癌細胞 株之12 (圈1A)中確認。實施免疫螢光分析以檢查肺癌細胞 内之内生性E BI 3之次細胞定位。在腫瘤細胞質偵測到 EBI3，LC319及NCI - H1373細胞中具顆粒外觀、高水平，其 中EBI3轉錄物以半定量rt-PCR實驗（圖1A)偵測到，‘但 2125-9937-PF 167 200920406 NCI-H2170 細胞及及 BEAS-M 到，兩者顯示無表現EBI3。 結合於EBI3C圈1B)。 細胞來源之支氣管上皮未偵測 該結果亦指出’該抗體專—地 ，因為必則碍-分泌蛋白質，吾人亦以eusa評估培 養EBI3之上清水平，並確認EBI3由LC319及pci4分泌: 而NCI-H2170或BEAS-2B未偵測到分泌EM3(圈lc)。 使用EBI3 cDNA片段作為探針之北方墨點分析，_ 一 1.3 kb之轉錄物，其僅在胎盤高度表現，且轉錄物幾乎 不在其他正常組織彳貞測到（圖1D)。該表現EBI3蛋白質， 亦以專-於EBI3之多株抗體，在5種正常組織偵測（肝、 心、腎、肺’及胎盤），及肺癌組織。ΕβΙ3染色主要在腫瘤 細胞質，及胎盤之合體滋養層（syncyti〇tr〇ph〇Mast)及細 胞滋養層（Cytotrophblast)觀察到，但於其他4種正常組 織未偵測到（圈1Ε^ΕΒΙ3蛋白質肺癌之表現程度，高於在 胎盤者。 [實施例3]EBI3表現舆NSCLC病患之不良預後間的關連 為了調查EBI3在肺癌形成之生物學及臨床病理學顯著 性，在組織微陣列實施免疫組織化學染色，該組織微陣列 包含從經歷了手術切除治療之423 NSCLC案例得到之組織 切片。以專一於EBI3之多株抗體偵測到eBI3染色，主要 在腫瘤細胞質觀察到，但在正常肺細胞未觀察到（圈2 a )。 EB13表現模式，在該組織陣列，分類為：無（分數〇)至弱/ 強陽性（分數1+至2 + > 423 NSCLC中，21〇(49 6%)案例（分 數2 + )’EBl3強染色，1 59(37.6%)案例（分數1 + )弱染色，
2125-9937-PF 168 200920406 54例未染色（12. 8%)(分數〇)(表2A)。然後，EBI3表現 相關性（強陽性對弱陽性/無），發現與以下顯著相關：性別 (男性較高；P < 〇· 000 1 ，費雪精確檢定）、組織學類型（非 ADC較高；p = 0. 〇〇〇4 ’費雪精確檢定）、腫瘤尺寸（較高於 pT2M;P = 〇. 〇〇〇9，費雪精確檢定），及淋巴節轉移（較高 於ρΝ1-2;Ρ = 0.0039 ’費雪精確檢定）（表2A)。NSCLC病患 之存活時間中位值，依照EB13較高表現程度，顯著較短（p =〇· 0011，Log-rank檢定；圈2B)。此外，實施單變量分析 以評估病患預後與數種因子間之關連，因子包括年紀、性 別、腫瘤病理階段（腫瘤尺寸；Π對T2-4)、病理節階段（節 狀態；N0對Nl ' N2)、組織學（ADC對其他組織學類型）， 及EB13狀態（分數〇、1 +對分數2 +)。所有該等變因，顯 著相關於不良預後。多變量分析使用一 C〇x比例危害模型， 決定EBI3(P = 0.0435)及其他3個因子（年紀、病理學腫瘤 階段’及病理節階段），針對經手術治療之NSCLC病患，為 獨立預後因子（表2B)。 表2A. NSCLC組織之EBI3-陽性舆病患特性間之關連(n = 423) ΕΒΙ3表現 ^ 尸―值、 合計~S表現 弱表現~^表現 強對弱或 無 n=423 n=210 11=159 n=54 性別 女 132 46 57 29 15. 958〈0.0001 木 男 291 164 102 25 2125-993 7-PF 169 200920406 年紀(歲) >=65 211 107 72 32 0.116 NS <65 212 103 87 22 T因子 T1 136 51 58 27 11.124 0. 0009^ T2+T3+T4 287 159 101 27 N因子 NO 264 120 107 37 4. 499 0. 0339* N1+N2 159 90 52 17 組織學類型 ADC 272 117 110 45 12.674 0. 0004* 非ADC 151 93 49 9 β < 0.05(費雪精確檢定） NS:不顯著 ADC:腺癌 非ADC:鱗狀細胞癌+大細胞癌及腺鱗狀細胞癌 表2B. NSCLC病患之預後因子之Cox氏比例危害模型分析 變量 危害比例 95% CI 不利/有利 户-值 單變量分析 EBI3 1.617 1.208-2.164 陽性/陰性 0.0012* 年紀（歲） 1.492 1.116-1.994 >=65 / 65 > 0. 007* 性別 1.669 1.193-2. 334 男/女 0. 0028* pT因子 2.761 1.895-4.023 Τ2+Τ3+Τ4 / Τ1 <0.0001* ρΝ因子 2.389 1.791 - 3· 185 Ν1+Ν2 / Ν0 <0.0001* 組織學類型 1.390 1.040-1.858 非ADC/ADC 0. 026* 多變量分析 ΕΒΙ3 1.361 1:009-1.835 陽性/陰性 0. 0435* 2125-9937-PF 170 200920406
年紀（歲） 1.678 1.245-2.261 >=65 / 65 > 0.0007* 性別 1.398 0. 967-2. 021 男/女 NS pT因子 2.075 1.403-3.067 Τ2+Τ3+Τ4 / Τ1 0.0003* ρΝ因子 2.313 1.712 - 3.125 Ν1+Ν2 / Ν0 <0.0001* 組織學類型 0.921 0. 670-1.266 非adc/adc NS ADC,腺癌 非ADC:鱗狀細胞癌+大-細胞癌及腺鱗狀細胞癌 NS:不顯著 ^ < 0. 05 [實施例4]患肺癌之病患之EBI 3血清水平
由於EB13編瑪一分泌蛋白質，吾人調查是否eb I 3蛋 白質分泌到患肺癌病患之血清中。從301肺癌病患中大多 數’ EL ISA實驗偵測到血清樣本中之eb I 3蛋白質。肺癌病 患中，EBI3血清水平之平均值（± 1SD)，為18. 〇 ± 16· 4單 元/mL。相對地’ 134健康個體之EBI3血清水平之平均值（土 1SD)，為4.4 ± 4.7單元/mL，且C0PD之63病患，其為目 前及/或曾為抽煙者，為5·8±8.0單元/mL。血清EBI3蛋 白質水平，在肺癌病患顯著高於健康捐出者或c〇pD病患（户 0.000 1，Mann-Whitney U檢定）；健康個體與⑶pD病患 之差異不顯著（户=0·16〇)。依照肺癌組織學類型，178腺 癌病患中，ΕΒΙ3血清水平為17.8 ± 154單元/mL，41 scc 病患中，19.9±16.9單元/111]1，82%1^病患中，176± 18·1單元/mL(圈3A);3種組織學類型間之差異不顯著。本 ㈣明人然後評估水平〇13及資訊可得之肺癌病患臨床階 ]之關係即便在早期階段之腫瘤，偵測到高水平血清 EBI3(囷3B)。使用此等3〇1癌症病患及134健康控制級
2125-9937-PF 171 200920406 J出之R〇C曲線（圈4A，左分褡），設定此分析中之截止水 + α揭1供針對EB13最適診斷正確性及可能比例（最小偽 陰性及偽陽性結果）[即15.4單元/mL ，靈敏度45.2%(136/ Q Q 1 Λ ,直— 寻—性of 97. 8%( 131 / 134)]。依照腫瘤組織學， ^ ΕΒΙ3~陽性案例比例為針對NSCLC， 47. 9%(105/ 219)，及針對 SCLC , 37. 8%(31/ 82)。血清 ΕΒΙ3-陽性案 例比例為’針對copD ，3.2%(2 /63)。使用來自NSCLC病 患之血清樣本’以配對手術前及手術後（術後2個月）實施 ELISA貫驗’以監控相同病患之血清EBI3水平。血清EBI3 濃度’在初期腫瘤切除後，戲劇性地降低（圈4A，方分#)。 本案發明人又比較在相同組的6 NSCLC案例，血清EBI 3值 與初期腫瘤EB13表現程度，該等之血清在手術前已收集（3 位病患患EBI3-陽性腫瘤，3位患^^13_陰性腫瘤）。血清 EBI3水平顯示與初期腫瘤EBI3表現程度有良好相關性（圖 4B)。該結果獨立地支持血清EB丨3作為生物標記以早期偵 測癌症及用於監控該疾病復發之高專一性及高潑力。 [實施例5]组合分析EBI3及CEA/CYFRA/ProGRP作為腫 瘤標記 為了評估血清EB13水平作為腫瘤偵測生物標記之臨 床有用性，於來自癌症病患及控制組個體之同組血清樣 本，以EL ISA測量2種習知腫瘤標記（針對ADC病患，CEa， 針對SCC病患，CYFRA，及針對SCLC病患，pr〇GRP)之血清 水平。ROC分析決定供NSCLC偵測之CEA截止值，為2 2 ng/mL [靈敏度 36.0%(64 of 178)，專一性 97.5%(115 of 2125-9937-PF 172 200920406 118);圖4C，左頂分格；]。血清EBI3及CEA值間之相關係 數’不顯著（Spearman rank相關係數：（rho)= 〇. 〇63 ;户 =〇· 4016) ’代表測量血清中之2種標記兩者，可改進整體 靈敏度供偵測ADC達65. 7%(117 of 178);針對診斷ADC， CEA單獨靈敏度為36. 〇%(64/i78)，EBI3單獨靈敏度為 46· 1%(82/205)。正常自願者（控制組）之2種腫瘤標記其中 之一偽陽性率’為5. 1%(6/118)，雖CEA及EBI3兩者其中 之一偽陽性率在相同控制組，為2. 5%(3/118)及2. 5%(3/118; 圈4C，左下分格）。患scc之病患的R〇c分析，決定cyfra 截止值’為2. 0 ng/ml、靈敏度48. 6% (18/ 37)，專一性 2. 3%(3/ 130;圖4C，中頂分格）。血清EBI3及CYFRA間之 相關係數不顯著（Spearman rank相關係數：（rho) = -0· 117;/5 =： 〇· 4817)，代表測量血清中之2種標記兩者， 可改進整體靈敏度供偵測SCC達78. 5%;針對診斷SCC， CYFRA單獨靈敏度為48. 6%(18/ ’ EBI3單獨靈敏度為 54· 1%( 20/ 37)。正常自願者（控制組）之2種腫瘤標記其中 之一偽陽性率，為4· 6%(6/130)，雖CYFRA及EBI3兩者其 中之一偽陽性率在相同控制組，為2.3%(3/13〇)及2.3%(3/ 1 30 ;围4C，中下分格）。患SCLC之病患的R〇c分析，決定
ProGRP 截止值’為 39. 5 pg/mL，靈敏度 64.6%(53/ 82)， 專一性97. 4%(3 /116 ;圖4C，右頂分格）。血清EBI3及
ProGRP值間之相關係數不顯著（知⑶口抓rank相關係數. (rho)= 〇. 〇74;P = 〇· 50 75 )，亦代表測量血清中之2種 標記兩者，可改進整體靈敏度供偵測SCLC達74.4%(6ι/
2125-9937-PF 173 200920406 82);針對診斷SCLC，Pr〇GRp單獨靈敏度為％ 6%(53 /⑻， EBU單獨靈敏度為37·δ%⑶。f 82)。正f自願者（控制組） 之2種腫瘤標記其中之一偽陽性率，為5·2%(6川6)，雖 ProGKP及ΕΒΙ3兩者其中之—偽陽性率在相同控制組，為 2·6%(3/ 116)及 2.6%(3/ 116;圖 4C,右下分格）。 [實施例6]以對抗EBI3isiRNA抑制肺癌細胞生長 為了評量是否向上調控腕在肺癌細胞生長或存活扮 演一角色，吾人評估s舰，及2種不同的控制以題（針 對〇N_Target及LUC iSlRNA),抑制内生性Εβΐ3表現。 以能降低表現則之以siRNA處理 細胞制或㈣_ •造成MTT及衫形成分析測量 ，顯著抑制細胞存活性及群落數（圈4D)。此結果顯示向上 «周控E B13相關於癌症細胞生長或存活。 [實施例7] EB13之生長促進效果 為了揭露EBI3於腫瘤形成之潛在角色，吾人製備設計 表現則之質體（pcDNA3·卜EBI3_myc/His/將此質^或 假質體轉染到C0S-7細胞内’並建立表現EBU之穩定選殖 體。使用抗EBI3抗體以免疫化學化學染色確認到細胞質 中，EBI3蛋白質之表現（資料未顯示）。為了決定在 哺乳動物細胞生長之效果。本案發明人對於穩定表現則 之C0S-7-來源轉染體，實施一群落形成分析。本案發明人 建立2個獨立C0S_7細胞株，其外生表現 EBI3(C0S-7-EBI3_#1及_#2;05 4E，頂分格），並比較其生長 與經假載體（⑽-7 —假-M1及_M2)轉染之控制細▲之生長。2
2125-9937-PF 174 200920406 個COS-7-EBI3細胞生長均依照ΕβΙ3表現程度，顯著促進 圖4E，下分格）。在C0S7-EBI3細胞亦有明顯趨勢形成大 於該控制細胞之群落（圖4E，下分格）。依照siRNA分析之結 果，此等資料強力顯示EBI3在於該腫瘤生長及/或存活扮 演顯著角色。 分析及封論： 雖然近來在腫瘤診斷影像化、組合化療及放射線療法 的進展，最近十年在肺癌病患之預後及生活品質只有小進 步。因此，急需開發新穎之診斷生物標記，供早期偵測癌 症，及作為對個別病患較佳之輔助治療。使用包含大於 32’ 256基因之cDNA微陣列，以雷射微切片後之癌症細胞富 化後，貫施1 ο 1肺癌之基因體規模的表現概況分析（K i kuch i T, et al., Oncogene 22： 2192-205(2003), Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75(2006), Kikuchi T, et al. , Int J Oncol 28: 799-805(2006 ), Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1： 485-99(2003), Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 13: 3029-43(2004))。經此分析，瞭解數 個基因具潛力作為開發新穎診斷標記、治療藥物及/或免疫 療法之候選者（Suzuki C， et al.， Cancer Res 65: 11314-25(2005), IshikawaN, etal., C1in Cancer Res 1 0: 8363-70(20 04), Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46(2005), Hayaraa S, et al., Cancer Res 67: 4113-22(2007))。 其中，編碼推定的腫瘤專一穿膜或分泌蛋白質之基 2125-9937-PF 175 200920406 因，認為具顯著優識。因其呈現在細胞表面或在該胞外空 間内’及/或血清中，使其能輕易接近作為分子標記，及治 療標乾。於本發明之内容，一此種基因，顧，編碼一分 泌蛋白質，藉組織微陣列及F丨了 ς 又丨平幻及檢查蛋白質表現狀態， 供評估做為肺癌診斷預後生物標記之有用性。 EBI3，藉Epstein-Barr病毒感染，誘導在B淋巴細 胞表現而鑑別 〇)evergne 〇， et al·, j Vir〇1 7〇: 1 1 43-1 1 53( 1 996))。& 34-kDa 冑蛋白質為一造也素 (hematopoietic受體家族成員，相關於次單 元，且顯示在調節細胞_媒介免疫反應扮演一角色。 EBI3為一 34-kDa糖蛋白質’其首次敘述，為體外在 ebv-不朽化满e球母細胞（iymphoblastoid)細胞株強表現 (Devergne 0， et al.， J Virol 70: 1143-1153(1996))。 隶近研九揭路，E B13形成一新穎的細胞介素，稱i [ _ 2 7， 喜藉與p28, 一 IL-12P35-關連次單元，形成異二聚體， 並在起始化Thi免疫反應扮演重要角色（PflanzS，etal.，
Immunity 16: 779- 90 (2002))。相反地，最近報告已指出， EBI3可能與IL-12 alpha形成IL-35，並調整免疫反應至 免疫抑制，係藉與調控T(Treg)細胞反應（Niedbala W，et al. > Eur J Immunol 37： 1 -9(2007), Collison LW, et al., Nature 450: 566-9 (2007 ))。再者，已有人報告，在人類 懷孕期間，在胎盤絨毛表現EBI3，代表EBI3可在母體及胎 盤間調整免疫反應’例如母體免疫寬容（Devergne 0，et al. Am J Pathol 159: 1763-76(2001))。 . 2125-9937-PF 176 200920406 於本發明之内容，從肺癌病患之組織樣本中，發現高 水平的EBI3蛋白質表現。一致地，亦證明以抑制内 生表現EBI3 ’造成肺癌細胞存活性顯著降低，而表現外生 EBI3之哺乳動物細胞，顯示顯著生長促進。雖Εβΐ3於肺癌 症形成之詳細功能未知’該結果暗示咖表現能促進該癌 症細胞增殖/存活。 间水平EBI3蛋白質，亦在肺癌病患血清樣本中發現 到。因用於此研究之血清樣本之一半，係來自患早期癌症 之病患，因此EBI3應有用於診斷，即使早期癌症。為了檢 查應用EBI3作為診斷工具之可行性，將則血清水平， 與CEA、CYFRA或ProGRP' 3種NSCLC之習知診斷標記及sclc 之血清水平比&，針對診斷靈敏度及專一性之觀點比較。 分析組合2者標記⑽3 +⑽、刪+ CYFRu Εβΐ3 + ProGRP)增加針對肺癌靈敏度至約65 _㈣及 SCLC)，顯著高於CEA或Pr〇GRp單獨時，5%至π健康自 願者錯誤診斷為陽性。g卩彳φ、社 . 主 ^〖生即便進一步驗證，需使用更大組血 ,月樣本’>函蓋各種臨床階段，但目前顯示的資料，已足夠 顯示ΕΒΠ本身作為肺癌血清/組織化學之生物標記之 潛力。 結响為：EBI 3在此鏗別作為有潛力之生物標記供肺癌 病患之血清診斷及免疫組織化學預測預後。此分子亦為可 能供發展療法，例如抗體療法、八 J刀子化合物，及癌症疫 苗之候選者。 第11部分：DLX5相關實驗
2125-9937-PF 177 200920406 [實施例7] —般方法 1.肺癌細胞株及組織樣本 用於此研究之人類肺癌細胞株，如下：肺腺癌 (ADC;A427， A549 、 LC319 、 PC-3 、 pc-9 ，及 NCI-H1373). 細支氣管肺泡癌癌（BAC、 NCI-H1781;肺鱗狀細胞癌 (SCC)RERF-LC-AI 、 SK-MES-1 、 EBC-1 、 LU61 、 NCI-H520 、 NCI-H1 70 3 及 NCI-H2170、肺腺鱗狀癌（asc)、NCI-H226 及
NCI-H647;肺大細胞癌（LCC)、LX1;及小細胞肺癌 (SCLC;DMS114、DMS273、SBC-3’ 及 SBC —5)。所有細胞在補 充10% FCS之適當培養養基中生長成單層，並維持在π度 C、潮濕空氣、5% CCh中。人類小呼吸道上皮細胞⑺仏㈠作 為控市彳組，生長在購自Cambrex Bi〇seienee> Inc.aalkersvme，MD)之最適化培養（SAGM)。14個初期 NSCLC(7個ADC，7個SCC)樣本，如前述以書面告知後同意 取得（Kato T，et al.，Cancer Res 65: 5638-46(2005))。 總共369個NSCLC及鄰近正常肺組織樣本供免疫染色在組 織微陣列上，早先在Saitama癌症中心（Saitama，了叩抓） 由經歷手術之病患，與臨床病理資料一同取得。此研究及 所有使用臨床材料，由制度研究倫理委員會核准。
2.半定量RT-PCR 從培養細胞臨床組織使用TRIz〇1藥劑（Ufe Technologies, lnc·，Gaithersburg，〇)，依照製造商實 驗步驟萃取總RNA。將萃取的RNA及正常人類組織聚 (a)rna，以 DNase I 處理（Nipp〇n Gene，T〇ky〇, japan)，
2125-9937-PF 178 200920406 並使用寡（dT)啟動子及 Superscript II 反轉錄酶 (Invitrogen，Carlsbad, CA)進行反轉錄。半定量 RT-PCR 實驗，係以專一於DLX5之啟動子或ACTB專一性啟動子之 下列啟動子實施，作為内部控制： DLX5, 5， -CTCGCTCAGCCACCACCCTCAT-3’ （SEQ ID N0: 21) 及 5’ -AGTTGAGGTCATAGATTTCAAGGCAC-3’ （SEQ ID NO: 22) ; ACTB, 5’ -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’ （SEQ ID NO: 11)及 5’ -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3， （SEQ ID NO: 12). PCR反應以週期數最適化，以確保產物強度位在放大之 對數相。 «?.北方墨點分析 將人類多重-組織墨點（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)雜交於DLX5之32P標定PCR產物。該DLX5 之cDNA探針，係使用上述啟動子，以RT-PCR製備。預雜 交、雜交，及洗滌，係依照製造商說明書進行。該等墨點 於室溫以加強BAS篩（BIO-RAD, Hercules，CA)經放射能照 相3 0小時。 次抗DLX5抗體 表現DLX5全長片段、DLX5在NH2末端含His-標籤抗 原決定基之質體，使用pET28載體製備（Novagen, Madison, WI)。將此重組胜肽表現於 Escherichia col i，BL21 2125-9937-PF 179 200920406 codon-plus 品系（Stratagene， LaJolla， CA)，並使用 TALON樹脂（BD Bioscience)依照供應商實驗步驟純化。將 從SDS-PAGE凝膠萃取的蛋白質，接種到兔；將免疫血清， 依照標準方法學，在親和性管柱上純化。經親和性純化之 抗DLX5抗體，用于免疫組織化學研究。該抗體專—於 DLX5 ’使用來自細胞株之溶解物在西方墨點上確認，該細 胞株已以DLX5表現載體轉染’並以内生性表現或不表現 DLX5之細胞株免疫細胞化學染色。 孓免疫細胞化學 將SBC-5接種在蓋玻片’將細胞以4%甲醯胺固定，並 以冷甲醇丙酮（50:50)，於室温通透5分鐘。以PBS洗膝1 次後’將該細胞與抗DLX5抗體一起在室溫溫育1小時。再 與Alexa488接合山羊抗兔抗體（分子pr〇bes)(l : 1〇〇〇 稀釋）於黑暗中一起溫育1小時。影像以共焦顯微鏡捕捉 (TCS SP2-A0BS， Leica Microsystems)。 艮免疫组織化學及组織微陣列分析 為了調查臨床樣本中之DLX5蛋白質存在，將組織切片 以 ENVISI0N+ 套組 /HRP(Dak〇Cyt〇niati〇n， Glostrup,
Denmark)染色。阻斷内生性過氧化酶及蛋白質後，加入經 親和性純化之抗DLX5抗體，並將各切片與作為2次抗體之 HRP標定抗兔I gG —起溫育。加入基質-發色體，並將樣本 以廣木素對比染色。 簡吕之，將3. 3 mg/mL山羊多株抗人類^ 3抗體
(Santa Cruz BioTechnology，Santa Cruz，CA)在阻斷内 2125-993 7-PF 180 200920406 生性過氧化酶及蛋白質後加至各載玻片，並將切片與作為2 次抗體之HRP標定抗山羊[Histofine Simple stain MAX P0(G)，Nichirei，Tokyo, Japan]— 起溫育。腫瘤組 織微陣列如另外公開地，以福馬林固定的nsclc建構 (Ishikawa N, et a 1. , Clin Cancer Res 10· 83 6 3-70 (2004))。用於取樣之組織區，係依據與該對應的 H&E-染色過的切片排放在一載玻片上的可見排列選擇。從 捐出者腫瘤塊取出之3、4或5個組織核（直徑〇 · β mm .高 度 3 - 4 mm)，以一組織微陣列儀放進接受者石蠟塊 (Beecher Instruments, Sim Prairie，WI)。針對各個案， 戳刺正常組織之核。將得到之微陣列塊之5_micr〇 m切 片，用於免疫組織化學分析。3名獨立的調查員半定量地評 量DLX5陽性，他們對於先前報告的臨床追蹤資料並不知 道。記錄之染色強度使用以下準則評估：沒有（分數〇)、弱 陽性（1 + )或強陽性（分數2 + )。僅於所有評論者定義於強陽 性（2 + )之案例’接受為強陽性。 7.统計分析 所有統計分析使用統計分析程式進行（StatView， version 5.0;SAS Institute， Inc. Cary， Nc， usa)。然 後，檢查其表現程度與及臨床病理學變量例如年紀、性別、 病理TNM階段，及組織學類型間之相關。強DU5免疫反 應活性，使用費雪精確檢定，評估與臨床病理學變量之關 聯。單變量及多變量分析’使用c〇x t匕例危害迴歸模型， 決定臨床病理學變數及癌症相關死亡·率間的關連。首先，
2125-9937-PF 181 200920406 死亡與可能之預後因子間的關連，包括年紀、性別、組織 學類型、PT-分類’及pN—分類’每次考慮'一因子，並分析。 第二，將多變量Cox分析應用在朝後（逐步）程序，其永遠 迫使強DLX5表現進入模型，與任意及所有滿足p值〇f < 0. 0 5進入水平之蠻數—被。杏# > , ^ 起虽該模型持續加入因子，獨立 因子不會超過P < 〇.〇5跳出水平。 & RNA干擾分析
δ又计產生s 1 RNAs於哺乳動物細胞之載體系RM干擾 (RNAi)系統，PS1H1BX3· 0 先前已建立（Suzuki c，et al.， Cancer Res 63: 7038-41 (2003))。使用 30 L 之
Lipofectamine 2000(lnvitr〇gen)、 1〇 micr〇 g dlX5-專 一性siRNA-表現載體，轉染到SBC-5及NCI-H1781細胞 株’該細胞株内生性過度表現DLX5。將經轉染之細胞於存 在適當濃度之861^1:丨(^11(0418)培養7天，以三重複1〇1'分 析’利用Giemsa染色計數群落數及活細胞數。針對RNAi 之合成募核苷酸之標靶序列如下： 控制組1 (EGFP :增強律螢光蛋白質基因，為水母 {Aequorea vi ctori a)QY? 之突 變體) ， 5， -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3， （SEQ ID NO: 23); 控制組 2(Scramble: 葉綠體小眼蟲 基因，編碼為 5S 及 16S rRNAs)， 5， -GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3， （SEQ ID NO: 16); siRNA-DLX5-#1， 5’ -CCAGCCAGAGAAAGAAGTG-3，； siRNA-DLX5-#2， 5， -GTGCAGCCAGCTCAATCAA-3，。 2125-9937-PF 182 200920406 為了驗證本RNA i系統，在此分析中，確認於該細胞株 係以功能性siRNA下調DLX5表現，而非藉控制或無效用 siRNA 。 [實施例8]於肺癌及正常组織表現j)LX5基因 為了鑑別標粗分子供開發肺癌之新穎治療藥劑及/或 生物標記，首先以篩選cDNA微陣列，篩選針對分析之8 6 NSCLC或15 SCLC中大於50%者，基因顯示5倍以上表現者 (Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205;Taniwaki M， et al, Int J Oncol. 2006 Sep；29(3):567-75； Kakxuchi S, et al. Mol Cancer Kes· 2003 May;l(7):485-99)。在篩選之 27,648 基因中， DLX5基因被鑑別在多數肺癌中過度表現，且以半定量 RT-PCR實驗，在14例中9例額外之NSCLC案例（2/ 7 adc 及所有7SCC)(圈5八）及23中之1〇例肺癌細胞株，確認其 過度表現’而其在源自iLt SAEC細胞之支氣管上皮，幾乎 檢測不到（圖5B)。為了衫該内生性祕於肺癌細胞之次 細胞定位，專-於人類DLX5之兔多株抗體，被接著產生， 並發現在SBC-5個細胞核強举洛 .^ ^ 0〜涵木色，在細胞質若弱染色（圈 5C)。使用DLX5 cDNA作為探針之μ ~休訂之北方墨點分析，僅在所檢 查之2 3組織中’僅在胎盤對庳 耵愿於1· 8-kb轉錄物，鑑別到 一強訊號（圖5D)。再者，將5下〜*处, 于ϋ正常組織（心、肝、腎、肺 及胎盤）之DLX5蛋白質表現鱼 ”在肺癌之表現，使用抗DLX5 多株抗體以免疫組織化學分把 析比較。依照北方分析之結 果’在胎盤及肺癌觀察到DLxr本τη , ^ · 表現，但其他4個正常組織
2125-9937-PF 183 200920406 幾乎偵測不到（圈6A)。 [實施例9]DLX5表現舆NSCLC病患之不良預後間的關連 為了驗證DLX5在臨床病理學顯著性，將DLX5蛋白質 表現額外藉組織微陣列檢查，該組織微陣列包含從經歷了 手術切除治療之369病患之肺癌組織。DU5表現模式， 在該，.且織陣列，分類為：無/弱（分數〇〜)至強（2 +)(圖 6B)。陽性染色在234 ADC腫瘤中191例（8i.6%)、95scc腫 瘤中之80例（84· 2%)、27 LCC腫瘤之24例（88. 9%)，及13 ASC腫瘤之10例（76.9%)發現。DU5表現（強陽性對弱陽 性/無）與各種臨床病理學參數間的相關，接著被檢查，並 發現與PT分類顯著相關（較大腫瘤較高；p = 〇. 〇〇53，費雪 精確檢定）（表3A)。 '
檢查之369 NSCLC案例中，160案例巾町5強染色 (43.4%;分數2 + )，弱染色於145案例（39 3%;分數1 + )， 未染色於64案例（17.3%;分數〇)(細節顯示於表3幻。 NSCLC病患其腫瘤呈強DU5表現者，相較於無/弱汕π 表現者，顯示較短之腫瘤專一存活期間（ρ = 〇.⑽托，
Log-rank檢定；圖6C)。亦應用單變量分析，以評估病患預 後及其他因子，包括年紀（<65對65> =)、性別（女對/)、、 組織學類型UDC對非ADC)、pT分類（了丨對τ2、τ3“）、 ρΝ分類（NO對Nl、Ν2)，及DU5狀態（0、Η對 相關。 ' 該等參數中，祕狀態（Ρ = ◦·_)、_ =
0·0028 )、男（Ρ = 0.001)、非舰組織學分類（ρ= 〇.、 2125-9937-PF 184 200920406 進展ρΤ階段（P<0.0001)，及進展pN階段（P< 0.0 0 0 1 )， 顯著相關於不良預後（表3B)。預後因子之多變量分析中， 強DLX5表現、較年長、較高pT階段，較高pN階段，係 代表獨立預後因子（各為P = 0.0415、0.0007、0.0004及 <0. 000 1 ;表 3B). 表3A. NSCLC组織之DLX5-陽性與病患特性間之關連(η = 369) 合計 DLX5 強 DLX5 弱 DLX5 Ρ-值強對 弱/無 陽性 陽性 無 η = 369 η = 160 η = 145 η = 64 性別 男 255 109 99 47 NS 女 114 51 46 17 年紀(歲） >65 189 90 64 35 NS >=65 180 70 81 29 組織學類型 ADC 234 96 95 43 NS* see 95 44 36 15 其他 40 20 14 6 pT因子 T1 121 40 59 22 0.0053** T2-T4 248 120 86 42 pN因子 N0 226 90 97 39 NS N1+N2 143 70 48 25
ADC:腺癌；SCC:鱗狀細胞癌 其他：大細胞癌（LCC)+腺鱗狀細胞癌（ASC) *ADC 對非 ADC < 0.05(費雪精確檢定） NS:不顯著 2125-9937-PF 185 200920406 表3B. NSCLC病患之預後因子之Cox氏比例危害模型分析 變量 危害比例 95% CI 不利/有利 P-值 單變量分析 DLX5 1.517 1.136-2. 026 強（+)/ 弱（+)或（-) 0. 0048* 年紀（歲） 1.665 1.192-2. 324 65>= / <65 0. 0028* 性別 1.62 1.157-2. 269 男/女 0.001* 組織學類型 1.466 1.096-1.963 非 ADC / ADC1 0.01* pT因子 2.699 1.867-3. 902 Τ2+Τ3+Τ4 / Τ1 <0.0001* ρΝ因子 2.674 1.999-3. 576 Ν1+Ν2 / Ν0 〈0.0001* 變量 危害比例 95% CI 不利/有利 P-值 多變量分析 DLX5 1.354 1.012-1.811 強（+ /弱（+)或（_) 0.0415* 年紀（歲） 1.674 1.244-2. 254 65>= / <65 0. 0007* 性別 1.387 0. 960-2. 004 男/女 NS 組織學類型 1.099 0.799-1.512 非 ADC / ADC NS pT因子 2.206 1.357-2.912 T2+T3+T4 / T1 0. 0004* ρΝ因子 2.536 1.879-3.421 N1+N2 / N0 <0.0001* ]ADC:腺癌 *P < 0. 05 NS:不顯著 [實施例 10]以對抗DLX5之專一性siRNA抑制NSCLC細胞 生長 為了評量是否DLX5對肺癌細胞生長或存活為必要，吾 人建構質體以表現對抗DLX5之siRNA(si-DLX5-#l and -#2)，及2種控制質體（針對EGFP及Scramble之siRNA)， 並轉染到肺癌細胞株，SBC-5及 NCI-H1781。經轉染 si-DLX5-#2之細胞中之mRNA水平，相較於以2控制siRNAs 或si-DLX5-#1中.其中之一轉染者，顯著降低。該顯著降低， 2125-9937-PF 186 200920406 DLX5之向上 之代表性資 、MTT刀析/則夏群落數及活細胞數觀察，顯示 凋控係有關於癌症細胞之生長或存活(SBC-5 料，顯示於圖6D)。 討論： 雖然近來在癌症療法之分子標乾藥物已有進展，對於 可得治療顯示良好反應之病患仍非常受嶋aiK etal、 = 症Η14 — 27(謂））。因此，急需發展新的抗 癌症㈣’能高度專-於惡性細胞’❿有極小或無不利反 應。朝此方向。本案發明人已追求一策略，識別供開發新 藥之良好5子標乾如下；i )依據cDM微陣列分析篩選癌症 細胞中之上調基因;2)使用RNAi系統調查失去作用之表 型，亚定義蛋白質之生物學功能；及3)在組織微陣列上之數 百臨床樣本’冑行系統化分析蛋白質表現。採此方式，在 a·月 DLX5， distal-1 ess homeobox 蛋白質家族之一 員，經常在大多數臨床肺癌症樣本及細胞株過度表現，且 此基因產物對於肺癌細胞存活/生長為必要。 脊椎動物Dlx基因，編碼為包含h〇me〇b〇x-轉錄因子之 家族，關於對於DrosophilaDista卜less(Dll)基因產物之 序列’構成功能多樣化旁系同源（仰rahg)之一例。至今調 查的所有脊椎動物，具至少6個D丨χ基因，其一般而言配 置成3個雙基因簇集：dixi/d1x2、Dlx5/Dlx6，及
Dlx3/Dlx4(Dlx7)(24，28-30 ) °Dlx5 蛋白質首先在早期胚 胎發育期間表現於小鼠胚胎之前區（Sime〇ne A，et al.,
Proc Natl Acad Sci U S A 91: 2250-4( 1 994))。已有人 2125-9937-PF 187 200920406 同15子1}1又5/0116雙-擊倒（(1〇111)16 1111〇〇11〇111;)小 既颁不为離（sp 1 i t)手/足畸形（SHFM)表型，一異質肢病 症，特徵為缺中指及類似爪的末端，顯示DLX5基因為哺乳 動物肢發育之關鍵調控因子（Merlo GR，et al·，Genesis 33: 1(2002))。事貫上，DLX5顯示為一主控調控轉錄因 子，對於起始參與哺乳動物中成骨細胞分化之瀑流為必要 (Lee JY, et al., Mol Cells 22： 182-8(2006), Ry〇〇 HM,
et al.’ Mol Endocrinol 11: 1681-94(1997))。 於本研究，證明DLX5基因在肺癌時常過度表現，且可 ^於肺癌發展/進展扮演重要角&。於本研究，“腿使肺 癌、”田胞中之DLX5表現擊倒造成抑制細胞生長。又，本組織 微陣列之實驗臨床病理學證據，顯示具DU5_強陽性腫瘤之 NSCLC病患，較帶有DLX5 —弱陽性/陰性腫瘤者，具較短的 癌症專-性存活期間。心及動分析得到之結果強力顯 不’贿可能為一重要生長因子，且與肺癌細胞之更為惡 性的表型相關連。因為DLX5蛋白f主要存在於細胞核且包 括一同源結構區觸/Λ)，其應於該轉錄調控拾演 重要角色，且直接或間接轉活化肺癌細胞中之許多下游基 因。再者’ DLX5路徑之調查’可能有助更瞭解肺癌形成之 致癌基因活化機轉。由力DLX5在任何正常成人組織不表 現’除了胎盤，因此選擇性抑制DU5活性，可能為一有望 之治編，其預期會對抗癌症具一有力生物活性，且帶 來不良作用之風險極小化。 總結之 DU5基因顯示於肺癌生長/進展，具有重要
2125-993 7-PF 188 200920406 角色。在切除樣品中DLX5過度表現，可作為應用佐劑療法 對可犯預後不良之病患的有用指標。此外，此處的資料強 力顯不，設計專一地標靶DLX5之新抗癌藥物及癌症疫苗供 人類癌症治療，為有潛力的。 第JU.部分：NPTX]相Μ會路 [實施例11] 一般方法 /.細胞株及組織樣本 用於此研究之2 3個人類肺癌細胞株，包括9種腺癌 (ADC;Α427，Α549、LC319'PC-3、PC-9、PC-14、NCI-H1373、 NCI-H1 666 及 NCI-H1781)、9 種鱗狀細胞癌（SCC;EBC—!、 LU61 、 NCI-H226 、 NCI-H520 、 NCI-H647 、 NCI-H1703 、 NCI-H2170、RERF-LC-AI，及 SK-MES-1)、1 種大細胞癌 (LX1 ;LX1)，及 4 種小細胞肺癌（SCLC;DMSU4、DMS273、 SBC-3 ’及SBC-5)。所有細胞在補充FCS之適當培養養 基中生長成單層’並維持在37度C、潮濕空氣、5% c〇2中。 人類小呼吸道上皮細胞（SAEC)作為控制組，生長在購自 Cambrex Bi〇science，Inc.(WalkersviUe，MD)之最適化 培養（SAGM) °初期肺癌組織樣本早先以告知後同意取得 (Kikuchi 2003;Taniwaki 2006)。總共 374 個初期 NSCLC 福馬林固定樣本包括238 ADC、95 SCC、28 LCC，及13 ASC， 及鄰近正常肺組織’早先在Saitama癌症中心（Saitama， Japan)由經歷手術之病患，與臨床病理資料一同取得。此 研究及提及之所有使用臨床材料，由個體制度倫理委員會 才X准13例SCLC’從在廣島大學（Hir〇shima，japan)經歷
2125-993 7-PF 189 200920406 屍肢解剖之個體得到。腫瘤樣本之組織學分類，依據WH0 準則如…WI))。NSCLC樣本及來自死後材料之5組織 ( 肝肺、腎及腎上腺）（患ADC之2個體），亦由廣島 大學传到。此研究及提及之所有使用臨床材料，由個體制 度倫理委員會核准。 之·血清樣本 .血清樣本，以告知後同意，從102位健康控制組個體（84名 男性及18名女性；年紀中位值49.0 +/- 7.46 SD，範圍31〜 6〇歲）及80位患慢性阻塞肺病（c〇pD)之非腫瘤肺疾病病 患，他們登記為日本個人化醫藥計晝（Bi〇Bank Japan)或被 廣島大學醫院許可（68名男性及12名女性；年紀中位值 、· 4 +/ 5’ 92 SD，範圍54至73歲）得到。所有此等病患 為目前及/或以前曾吸煙者[平均值（+ /_1 SD)包-年指標 (PYI)，為64.2 +/- 41·6;ΡΥΙ定義為：每天消耗之香煙包 數（每包20根香煙）乘年數]。健康個體在完全血球細胞計 數、C-反應性蛋白質（CRP)、紅血球沉降率、肝功能測試、 腎功能測試、尿液分析、糞便檢查、胸部X光或心電圖， 無異g。血清樣本，亦經告知後同意，從2 2 3位廣島大學 醫院及神奈川癌症中心醫院承認肺癌之病患，及登記為曰 本個人化醫藥計晝（BioBank Japan)—部分之患肺癌之1〇6 位病患得到（227男性及102女性；年紀中位值66.6+/-11 · 2 SD，範圍30-8 6 )。樣本依據以下準則選供研究：（a) 病患係新診斷，先前未經治療，且（b)及腫瘤病理學上診斷 為肺癌（I - IV階段）。此等329案例包括：1 8 5 ADC、 51 2125-9937-PF 190 200920406 SCC，及93 SCLC。臨床病理學記錄完全書面化。血清在診 斷時取得，並保存在-80度C。 «?·半定量RT-PCR分析 從培養細胞及臨床組織使用 T r i ζ ο 1 藥劑（L i f e Technologies, Inc. , Gaithersburg, MD)，依照製造商實 驗步驟萃取總RNA。將萃取的 RNA及正常人類組織聚 (A)RNA，以 DNase I 處理（Roche Diagnostics，Basel, Switzerland)，並使用寡（dT)!2_!8 啟動子及 Superscript Π 反轉錄酶（Life Technologies, Inc.)進行反轉錄。半定量 RT-PCR 實驗，係以 NPTX1基因專一性故郭+ (5’ -GTTGGGGACCGGAGGTAAA-3’ & 5 -AAACCACGACTTCGTCAAGC-3 )或 beta-肌動蛋白（ 專一性啟動子（5， -ATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3，及 5’ -CTGCGCAAGTTAGGTTTTGT-3’ ）實施，作為内部控制。所 有 PCR 反應涉及：於 GeneAmp PCR 系統 97〇〇(Applied Biosystems，Foster City，CA)，於 94 度 C 起始變性 2 分 鐘後，接著22(針對^以）或35週期（針對，7i7) 94度C3〇 秒、54或60度C 30秒，及72度C 60秒。 么北方墨點分析 將人類多重-組織墨點（BD Biosciences Clcmtech ?alo A1 to, CA)雜交於32P標定PCR產物。該之pcr產物， 使用與上述相同啟動子’以RT-PCR製備作為探針。預雜交、 雜交，及洗滌，係依照製造商說明書進行。兮笙里机 曰疋幻 通寺墨點於〇 度C以加強BAS篩經放射能照相1週。 . 2125-9937-PF 191 200920406 孓製備抗NPTX1抗艘 專一於ΝΡΤΧΙ(ΒΒΟΠ)之兔多株抗體（pAbs)，藉由以GST-融 合人類NPTX1蛋白質（密碼子20-145及297-430)免疫 兔’並使用標準實驗步驟純化。專一於人類 NPTX1 (mAb-75-l )之小鼠單株抗體（mAb)，亦以使用基因槍 以編碼人類NPTX1蛋白質之質體DNA編碼皮下免疫 BALB/c小鼠（Chowdhury)以產生。NPTX1 mAb，從細胞培養 • 上清經親和層析純化。N，使用肺癌細胞株之溶解物以西方 墨點分析證明PTX1 mAb專一於人類NPTX1，該肺癌細胞株 内生性表現NPTX1或不表現。 反西方墨點 將細胞以放射線免疫沉澱分析緩衝液溶解[5〇 mm〇1/L Tris-HCl(pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% -去氧-chorate-Na，0. 1% SDS]，該緩衝液包含蛋白酶抑制 劑 Cocktail Set III(Calbiochem， Darmstadt, Germany)。 將蛋白質樣本以SDS-聚丙烯醯胺凝谬分離，並電點墨至 Hybond-ECL 硝基纖維素膜上（GE Healthcare Bio-Sciences，Piscataway，NJ)。將墨點與小鼠單株抗 NPTX1抗體（mAb-75-l)—起溫育。抗原-抗體複合體，使用 接合於辣根過氧化酶之2次抗體偵測到（GE Healthcare Bio_Sciences)。蛋白質帶’藉增強化化學冷光西方墨點偵 測藥劑可見化（GE Healthcare Bio-Sciences)。 7·免疫榮光分析
將細胞攤在蓋玻片上（Bectcm Dickinson Labware， 2125-9937-PF 192 200920406
Frankl in Lakes，NJ)，以4%三聚甲醛固定，並以以0.1% Tri ton X-1 〇〇於PBS於室溫通透3分鐘。非專一結合，以 CAS 阻斷（ZYMED，South San Francisco, California)於室 溫阻斷1 0分鐘。然後將細胞於室溫與以包含3% BSA之PBS 稀釋之針對人類NPTX1抗體（mAb-75-l)，於室溫溫育60 为鐘。以P B S洗蘇後’將細胞以a 1 e X a F1 u 〇 r 4 8 8 ·~接合2 次抗體（分子Probes)於室溫染色60分鐘。以PBS再洗一 次後’將各樣本安裝包含4,，6’ -二脒-2,-苯基indolen二 鹽酉夂鹽（DAPI)之 Vectashield (Vector Laboratories, Inc, Burlingame，CA)，以光譜共焦掃描系統可見化（TSC SP2 AOBS: Leica Microsystems, Wetzlar， Germany)。 & 免疫組織化學及组織微陣列 為了調查包埋在石蠟塊之臨床樣本中之ΝρΤχ 1蛋白質，將 切片以如下方式染色。簡言之，將1〇〇 mg/ml小鼠單株抗 人類NPTX1抗體（mAb-75-1)在阻斷内生性過氧化酶及蛋 白質後加入。將切片與作為2次抗體之HRP標定抗小鼠IgG 一起溫育。加入基質-發色體，並將樣本以廣木素對比染色。 腫瘤組織微陣列，以另外敘述（Callagy, 2〇〇3，
Chin)之福馬林固定的387個初期肺癌建構（374 NSCLC及 13 SCLC)。用於取樣之組織區，係依據與該對應的H&E一染 色過的切片排放在一載玻片上的可見排列選擇。從捐出者 腫瘤塊取出之3、4或5個組織核（直徑〇 6顏；高度3_ 4 _)，以一組織微陣列儀放進接受者石蠟塊（Beecher InStruments’ SunPrairie，WI)。針對各個案，戳刺正常
2125-9937-PF 193 200920406 組織之核’將得到之微陣列塊之5_mi cr〇 m切片，用於免 疫組織化學分析。3名獨立的調查員半定量地評量nptxi陽 性’他們對於先前報告的臨床病理資料並不知道。Νρτχ 1染 色強度使用以下準則評估··強陽性（分數2 + )、暗棕染色 >50%腫瘤細胞完全模糊細胞質；弱陽性（1 + )，任意較小程 度之棕染色’腫瘤細胞質可觀察到；及沒有（分數⑸，在腫 瘤細胞無可察覺之染色。僅於評論者獨立定義於此之案 例，接受為強陽性。 &統計分析 統計分析使用StatView統計程式進行（SAS，Cary，NC)。 臨床病理學變量及NPTX1陽性間之關連，以費雪精確檢定 較腫瘤專性存活，以Kap 1 an-Meier曲線評估，針對 2私群間之差異，使用L〇g_rank檢定分析。與預後相關連 風險因子，使用Cox比例危害迴歸模型，以步降程序評 估。比例危害假設，經檢驗並滿足；僅於單變量分析中具 統計上顯著結果之該等變量，包括於多變量分析。從此模 型中移動變量之準貝，卜為可能比例統計，係依據最大部分 可能估計而來（針對移除，預設户值〇〇5)。
10 .ELISA TX1之血π水平以EL丨SA系統測量，其已原始建構。首 ^將專一於ΝΡΤΧ1之小鼠單株抗體; 4 mg/mi)， 母井加100 ml，加至96_井微平盤（Nunc Maxis〇^
BiQscience’ Inc’ NaperviUe，⑴作為捕捉抗體，並於 室溫溫育2小時。於室溫’，以pBST (包含ι%牛血清白蛋
2125-9937-PF 194 200920406 白（BSA)及 0.05% Tween PBSV丰 工立土 z丄入 ween 先去任意未結合抗體後，將 5% BSA每井加20G „U，並於室溫溫育2小時供阻斷。洗務 後’將3倍稀釋之血清加至井中，於室溫溫育2小時。洗3 次後’將於PBS中稀釋3倍之洗清及1%脱以每井1〇〇以 加至井中，並於室溫溫育2小時。洗去任意未結合物質後， 將使用生物素標記套組_NH2(D〇JIND〇, Kumam〇t〇, japan) 生物素化之專一於ΝΡΤΧ1之兔多株抗體（ΒΒ〇ΐ7; 〇 〇ι mg/ml)，以每井100 ml添加至井中作為偵測抗體，並於 至灌· ’皿月2小日守。洗3次除去任何未結合抗體—酵素藥劑 後’將鏈親合素-辣根過氧化酶（SAv_HRp)加至井中，並溫 育20分鐘。洗次後，將基質溶液以每井1〇〇 ml (R&D Systems， Inc·，Minneapolis，MN)加至井中，並容許反應go分鐘。 該反應藉加入50 ml之2 N硫酸中止。以光度計，在波長 450 nm決定色度’參考波長為57〇 nm。 血清中之CEA水平，以市售可得的酵素測試套組（H〇pe
Laboratories, Belmont, CA)，依照供應商建議，以 ELISA 測量。血清中之CYFRA水平，以市售可得的酵素測試套組 (DRG International Inc USA, Mountainside, NJ)依照製 造商實驗步驟，以ELISA測量。血清中之pr〇GRP水平，以 市售可得的酵素測試套組（TFB，Tokyo, Japan)依照製造商 實驗步驟，以ELISA測量。腫瘤組及健康控制組間之NPTX1、 CEA 、CYFRA 及 ProGRP 水平差異’以 Mann-Whitney U 測 試分析。NPTX1、CEA 、CYFRA及ProGRP之水平，以接受者 定性（R0C)曲線分析，以決定具最適診斷正確性及可能比例 2125-9937-PF 195 200920406 之截止水平。NPTX1及CEA間的相關係數，以Spearman rank 相關計算。顯著，定義為P〈 0. 05。 /人RNA干擾分析 如前所述，載體系RNA干擾（RNAi)系統’ psiHlBX3. 0，導 引合成 siRNA於哺乳動物細胞，先前已建立（Suzuki, 2003)。在此，將10 micro g的siRNA -表現載體使用30 micro L 的 Li pof ectamine 2000 (Invi trogen)，轉染到 NSCLC 細 胞株A549，及一 SCLC細胞株SBC-5，該等過度表現NPTX1。 將經轉染的細胞於存在適當濃度geneticin (G418)下培養 5天’之後以三重複MTT分析，利用G i emsa染色計數群落 數及活細胞數；簡言之’將細胞計數套組-8溶液（D〇j IND0) 以濃度1/10體積加至各培養皿，將平盤在37度C再溫育2 小時。以 Microplate Reader 550 (BIO-RAD，Hercules, CA) 測量450 nm之吸光。為了確認抑制，灯/ mRNA表現，以 合成之#/7X/-specific啟動子，實施半定量 RT_PCR實 驗。針對RNA i之該合成募核苷酸之標乾序列如下：控制組1 (Luciferase, LUC: 处/-377.5螢光素酶基因）， 5 -CGTACGCGGAATACTTCGA-3’ ；控制組 2 (Scramble, SCR: 葉綠體方叹/⑽sgrscih.s基因，編碼為5S及16S rRNAs)、 NPTX1 siRNA-Ι 5，-GCGCGCTTTGTAGGAnCG-3, {si-NPTXl-l) 5 -CTCGGGCAAACTTTGCAAT-3, ; NPTX1 siRNA-2 (si-yV/T/i-2)、5，—ggtgaaGAAGAGCCTGCCA-3，。 /之.細胞生長分析 將N P T X1之完整編碼序列 轉瘦到PcDNA3. 1 myc-His質體
2125-9937-PF 196 200920406 載體（Invitrogen，Carlsbad, California)之適當部位。 將以表現myc-His加標籤NPTX1之質體或假質體轉染之 C0S-7細胞’於存在適當濃度genei；icin (G418)，生長在 包含1 0 % F C S之D Μ E Μ 8天。以Μ T T分析評估細胞存活性； 簡言之’將細胞計數套組-8溶液（D0JIND0)以濃度1/10 體積加至各培養皿，將平盤在3 7度C再溫育2小時。以
Microplate Reader 550 (BIO-RAD，Hercules，CA)測量 450 . nm之吸光作為參考。 /«?· Matrigel侵入分析 將以表現人類NPTX1之pcDNA3.1-myc/His質體或假質體 轉染之NIH-3T3細胞，於包含10% FCS之DMEM生長至接近 會合。以胰蛋白酶收集細胞，於DMEM中洗滌而不加血清或 蛋白質酶抑制劑，並以濃度lxl 〇5 ^胞/ml懸浮於DMEM。製 備細胞懸浮液前，將Matrigel基質乾層（Beeton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ)以 DMEM 室溫復水 2 小時。 將包含10%FCS之DMEM(0.75ml)，加至24-井Matrigel 侵入腔室之各下部腔室，並將〇. 5 ml (5 x l〇4細胞）之細 胞懸浮液’加至各上層腔室之插入物。將插入物之盤，於 37度C溫育22小時。將此等腔室溫育後；依照供應商指 示’固定經由Matrigel入侵之細胞，以Giemsa染色 (Becton Dickinson Labware) ° [實施例12]於肺踵瘤及正常组織表現NPTXl 為了研究新穎標靶分子供開發肺癌之治療藥劑及/或 生物標記，首先篩選CDNA微陣列，篩選分析之1 〇 1肺癌樣 2125-9937-PF 197 200920406 本中一半以上，在癌症細胞水平高於正常細胞3倍以上者 (Kikuchi， 2003， 2006， Kakiuchi， 2004， Taniwaki)。在 篩選之27, 648基因中，基因被鑑別在多數肺癌中過 度表現，且以半定量RT —PCR實驗，在15例中1〇例額外之 肺癌組織及23中之1 7例肺癌細胞株，確認其過度表現（圈 7义上及下分格）。接著產生專一於人類Νρτχι之小鼠單株 抗體，並以西方墨點分析在4肺癌細胞株（3Νρτπ_陽性細 胞：NCI-Η226 ' NCI-H520，及 SBC-5 對 1 ΝΡΤΧ1-陰性株、 NCI-H2170)及小呼吸道上皮來源細胞（SAEC)，確認表現 為内生性NPTX1蛋白質（圓7方）。 實施免疫螢光分析，以檢查内生性Νρτχι在此等4肺 癌細胞株中之次細胞定位。ΝΡΤΧ1在腫瘤細胞細胞質偵測 到’具顆粒狀、高水平於NCI-H226細胞，低水平於nci_H52〇 及SBC-5個細胞，但不在NCI—H217〇細胞偵測到，與西方 墨點結果符合（圖7〇。因為ΝΡΤχι為一分泌蛋白質 (Schlimgen)，應用ELISA方法以檢查其是否存在此等肺癌 細胞株之培養基中。NPTX1蛋白質，在NCI_H226、NCI —H52〇 及SBC-5個細胞偵測到，在NCI-H217()細胞之培養基未偵 測到（圈7/〇。西方墨點法於該細胞溶解物之Νρτχι可偵測 量，及ELISA偵測該培養基，顯示與RT_pcR偵測到之 vV/T//，有良好相關性，代表該抗體專一地結合於Νρτχι蛋 白質。 使用人類cDNA作為探針之北方墨點分析，偵測 到一非常弱6_5-kb帶，僅於腦及腎上腺表現·；其他組織未 2125-9937-PF 198 200920406 觀祭到表現（圖8幻。該表現ΝΡΤχι蛋白質，亦以專—、 NPTX1之單株抗體，在5正常組織（肝、心、腎 '肺，腎上 腺）及肺ADC組織偵測到。Npm $色，主要在腫瘤細二細 胞質及腎上腺之細胞（皮質)偵測到’在正常細胞未偵測到 (圈8幻。嶋蛋白質於肺癌之表現程度，顯著高於在腎 上腺之表現程度。 [實施例13] ΝΡΤΧ1表現舆不良預後間的關連 .為了驗證ΝΡΤΧ1在生物學及臨床病理學顯著性，將 ΝΡΤΧ1蛋白質表現藉组織微陣列檢查，該組織微陣列包含來 自374 NSCLC病患之初級NSCLC組織，及來自13病患之sclc 組織。針對ΝΡΤΧ1之陽性細胞質染色在561%之手術切除 NSCLC (21 0/374)及 69.2% 之 SCLC (9/13)觀察到，而未染 色在任意檢查之正常肺組織觀察到（圖8 Γ)。然後檢查其陽 性染色與各種臨床病理學參數在374 NSCLC病患中之關 連。ΝΡΤΧ1表現模式’於該組織陣列分類，範圍從：無（分 數0)至弱/強陽性（分數1 +〜2 +)(圈8 Α頂分格；見方 法）。 檢查之374 NSCLC案例中，NPTX1強染色於139 (37. 1%;分數20、弱染色於71 (19.0%;分數1 + )，且不 染色於164案例（43· 9%;分數0)(表1A)。於本研究，腫 瘤尺寸（pT2-4對ρΤι;尸< 0· 〇〇〇1 ’費雪精確檢定）及淋巴 節轉移（ρΝι-2對pN。；尸=0· 0044 ，費雪精確檢定）顯著相 關於NPTX1狀態（表1B)。Kaplan-Mei er分析顯示：具強 NPTX1染色（分數d 2 + )之病患存活時間，顯著短於具無/ 2125-9937-PF 199 200920406 弱NPTX1染色（分數d 0， 1 + )之NSCLC病患（户< 0· 00 0 1 ，Log-rank檢定；圖7"分潜）。預後因子之多 變量分析中，PT階段、pN階段，及強NPTX1陽性，顯 示為獨立預後因子（表1万）。 表1A. NSCLC组織之NPTX1-陽性舆病患特性間之關連（n=374) 合計 η = 374 ΝΡΤΧ1 強陽性 η = 139 ΝΡΤΧ1 弱陽性 η = 71 ΝΡΤΧ1 無 η =164 户-值強 對弱/無 性別 男 259 104 47 108 NS 女 115 35 24 56 年紀（歲） <65 188 72 35 81 >=65 186 67 36 83 NS 組織學類型 ADC 238 93 38 107 see 95 26 24 45 NS 其他 41 20 9 12 PT因子 Τ1 125 27 26 72 〈0. 0001** Τ2-Τ4 249 107 45 92 ρΝ因子 NO 229 72 44 113 0. 0044*氺 N1+N2 145 67 27 51
ADC:腺癌；SCC:鱗狀細胞癌 其他：大細胞癌（LCC)+腺鱗狀細胞癌（ASC) *ADC 對非 ADC **户< 0.05 (費雪精確檢定） NS:不顯著 2125-9937-PF 200 200920406 表IB. NSCLC病患之預後因子之Cox氏比例危害模型分析 變量 單變量分析 危害比例 95% CI 不利/有利 户-值 NPTX1 2.224 1.672-2.958 強（2+) / 弱（1+)或（-)<0.0001* 年紀（歲） 1.329 0.998-1.770 65 >= / < 65 NS 性別 1.750 1.256-2.440 男/女 0.001* 組織學類型 1.474 1.106-1.965 非 ADC / ADC1 0.0081* pT因子 2.667 1.860-3. 822 Τ2-Τ4 / Τ1 <0.0001 氺 ρΝ因子 2.565 1.928-3.414 Ν1+Ν2 / Ν0 <0.0001* 變量 多變量分析 危害比例 95% CI 不利/有利 尸-值 NPTX1 1.898 1.412-2. 552 強（2+) / 弱（1+)或（-）<0. 0001* 性別 1.331 0.922-1.921 男/女 NS 組織學類型 1.248 0.907-1.717 非 ADC / ADC1 NS pT因子 1.910 1.309-2. 789 Τ2-Τ4 / Τ1 0. 0008* ρΝ因子 2.236 1.674-2. 986 Ν1+Ν2 / Ν0 <0.0001 木 ADC,腺癌 ^ < 0. 05 NS,不顯著 [實施例14]肺癌病患之NPTX1血清水平 因為NPTX1編碼為一分泌蛋白質，吾人調查是否NPTX1 蛋白質分泌到患肺癌病患之血清中。從3 2 9肺癌病患中大 多數，ELISA實驗偵測到血清樣本中之NPTX1 ; NPTX1於肺 癌病患之血清水平為1.36 +/- 1.60 ng/ml (平均值+ /-1SD)，該等於健康個體為 0. 59 +/- 0. 44 ng/ml (The difference was 顯著 with 户-值 of〈0· 001’Mann-Whitney U檢定；圖9/)。依照肺癌組織學類型，ADC病患中之NPTX1 2125-993 7-PF 201 200920406 血清水平為1.41 +/- 1.27 ng/ml ’ SCC病患中為1·09+/_ 〇·95 ng/ml，SCLC 病患中為 1.42 +/- 2.33 ng/ml;組織 學類型差異不顯著。良性肺疾病C〇pd病患中，NPTX1血清 水平為0. 67 +/- 〇. 48 ng/ml。肺癌病患之ΝρΤχι血清水平， 顯著高於在正常自願者及C0PD病患（戶<〇〇〇〇1)。
高水平血清NPTX1，即便早期階段腫瘤之病患中，亦 偵測到。再者，N P T X1水平，在患局部進展肺癌（階段！丨〗β) 或遠距器官轉移（階段IV或ED)之病患之血清中，顯著多 於在較早期階段疾病（階段卜ΠΙΑ或LD)(圖9B)。使用以 此等329癌症病患及1〇2健康控制繪製之接受者操作特 徵（R0C)曲線，設定此分析中之截止水平，以提供針對 NPTX1之敢適珍斷正確性及可能比例，即針對Νρτχι，1 μ ng/ml (針對 NSCLC，靈敏度 41.5% ，針對 ADC ,44.3% ， 針對 SCC ，29.4% ，針對 SCLC ，31.2%)及專一性961% ， 針對NSCLC)。於患C0PD之80病患，7 (8. 8%)具陽性NPTX1 水平。然後實施EL ISA實驗，使用來自4 NSCLC病串之配 對術刖及術後（手術後2個月）血清樣本，以監控相同病患 中之NPTX1血清水平。血清NPTX1濃度，在初期腫瘤切除 後，戲劇性地降低（圖9C)。本案發明人又比較在相同組的 12 NSCLC案例，血清NPTX1值與初期腫瘤nptxi表現程度， 該等之血清在手術前已收集（6位病患患Νρτχι陽性腫瘤，e 位患NPTX1-陰性腫瘤） 血清NPTX1水平顯示與初期腫瘤 NPTX1表現程度有良好相關性（圖9D)。該結果獨立地支持 血清NPTX1作為生物標記以早期偵測癌症及用於監控該疾 2125-9937-PF 202 200920406 病復發之高專一性及高潛力。 [實施例15]組合分析NPTXl CEA、CYFRA及proGRP作為 腫瘸標記 為了評估血清N P T X1水平作為腫瘤偵測生物標記之臨 床有用性’於來自癌症病患及控制組個體之同組血清樣 本’以EL ISA測量2種習知腫瘤標記（針對adc病患，CEA， 針對SCC病患，CYFRA，及針對SCLC病患，ProGRP)之血清 水平。设定由R0C分析決定之本分析之截止水平，以得最 適診斷正確性及可能比例：針對CEA，妒2· 5 ng/ml (針對 ADC’ 靈敏度 38_ 4%’ 專一性 98. 0%)、CYFRA 妒 2. 0 ng/mi (針 對 SCC，靈敏度 29. 4°/。，專一性 98· 〇% f〇r)，及奸〇GRp 令 46. 0 pg/ml (針對 SCLC ’ 靈敏度 62. 4%，專一性 99 〇% for)。血清NPTX1及CEA值間之相關係數不顯著 (Spearman rank 相關係數：p = 〇· 1〇9，户=〇 "Μ)。 測量血清中之NPTX1及⑽兩者，可改進整體靈敏度 供備測胤達64.9%。正常自願者（控制組）之2種腫瘤標記 其中之一偽陽性率，為4. 9%。血、青Νρτχι 田 血/月ΝΡΤΧ1及CYFRA間之 相關係數不顯著（Spear_⑽相關係數：卜◦. 户 =〇.9242 )。測量血清中之ΝΡΤχ1及CYFRA兩者，可改進等 體靈敏度供偵測肺[病患魏3%。正常自願者(控制幻 之2種腫瘤標記其中之一偽陽性 卞句a.y/o。血清 Νρτ 及proGRP值間之相關係數 n , 叇者（SPearman rank 相 數nmn闕。測量血清中 相關係
兩者，可改進致俨雷鉍声•徂佔 及ProGRP 、谓測肺·病患達72. 〇%。正
2125-9937-PF 203 200920406 常自願者（控制組）之2種腫瘤標記其中之一偽陽性率，為 4.9%。 [實施例16] NPTX1在肺癌細胞之自髖分泌生長促進作用 為了評量向上調控NPTX1是否在肺癌細胞生長或存活 扮演一角色，設計質體’並構建以表現對抗,之s丨RNA (si-MTTi-l，-2)，以及2不同的控制質體（針對螢光素酶 (LUC)及 Scramble (SCR)i siRNA)，並轉染到 A549 and SBC-5個細胞，以抑制表現内生性粆7//。經轉染si_好厂之 之細胞，似^/7 #廯瘦於2控制siRNA中任一者轉染 之、、田I (圖1 〇尤項分格）；s卜#灯7廢示，势於爪 表現幾乎無抑制作用。依照其在基因表現程度之抑制作 用τ專木之s 1 -介户77/-之造竑群落—形成及MTT分析測量中， 顯著降低群落數及細胞存活性’但以2控制μ或 mPTXH未觀察到此作帛飞分洛 為進一步揭示NPTXi於腫瘤形成之潛在角色，本案發 明人製備設計表現NPTX1 (peDNA3_m寧/仏）之質 體或假载體。將此等質體繼轉染到cos_7細胞内，里中 =貞測到NPm表現’並實施群落—形成及Μττ分析。細胞 存活性在包含以NPTX1 cDNA兮古莫 有義股轉染之C0S-7細胞的 :，著增加，相較於以假载體轉染之…圖则。 體（A D人°周查疋否經親和性純化之抗NPTX1單株抗 體（mAb-75-l)能抑制培養在 朐峰具 卞你匕3 ΝρΠΐ之培養基C0S-7細 生長。如預期地，添加Νρτ 濃声之兮α 斤致之生長增強，被5 0 ηΜ 辰度之戎抗ΝΡΤΧ1抗體中和，且 且L0S-7細胞存活性，變得
2125-993 7-PF 204 200920406 幾乎均等於在#NPTX1T培養之細胞（圖i〇b)。接著，使用 重組咖蛋白質’實施自泌分析。為了調查是否分泌的 NPm能影響細胞生長，將cos_7細胞與Npm —起以終濃 度〇_ι ηΜ〜i ηΜ培養於該培養基。將⑶s_7細胞血隱^ 一起溫育，卩MTT A析顯示，相較於控制组以劑量依存方 式增強細胞生長（圖l〇C)。 此等結果顯示NPTX1之生長促進作用，可能經由在表
^ C0S-7之細胞將阶了^結合至一或多受體，而媒介。其 次，吾人調查是否抗NPTX1抗體（5〇nM)能抑制培養在包含 NPTX1之培養基c〇s_7細胞生長。如預期地，添加所 致之生長增強，被50 nM濃度之該抗Νρτχι抗體中和，且 C0S-7細胞存活性，變得幾乎均等於在無Νρτχι下培養之細 胞（圖10C)。此等結果顯示ΝΡΤΧ1之生長促進作用，可能 經由在表現cos — 7之細胞將Νρτχι結合至一或多受體，而 媒介。 其次’吾人調查抗ΝΡΤΧ1抗體在ΝΡΤΧ卜陽性肺癌細胞 株 SBC-5 及 Α549，及 ΝΡΤΓΧ卜陰性 SBC-3 及 NCI-Η2170 細胞 生長之作用。SBC-5及Α549兩者之生長，均以劑量依存方 式’藉添加抗NPTX1單株抗體（25或50 nM; mAb-75-l)至 培養基中而抑制（SBC-5:戶=〇. 012; A549: 25或50 nM户 =〇· 027及户=〇. 0 003;各為配對卜測試），而NPTX卜非表 現SBC —3細胞’不受影響（圖10D)。此等資料顯示NPTX1作 為自泌/旁分泌生長因子，供肺癌細胞之增殖，且可作為抗 體系療法之一有潛力免疫治療標靶。
2125-9937-PF 205 200920406 [實施例17]藉由NPTX1活化細胞侵入 由於組織微陣列上之免疫組織化學分析已顯示：患具 NPTX1強-陽性腫瘤之NSCLC病患’相較於具NPTX1-弱陽性 或一陰性腫瘤之NSCLC病患癌症專一性存活期間較短，NPTX1 於細胞知入之可能角色，使用Matr ige 1分析，使用NIH-3T3 細胞檢驗。轉染NPTX1 cDNA進入NIH-3T3細胞，相較於以 假載體轉染之細胞，顯著增強其經Matrigei之侵入活性（圈 11)。 [實施例18]抗NPTX1單株抗艘於放冷抑制肺癌細胞生長 本發明進一步調查小鼠模型中，該抗Νρτχι抗體之禮 戌腫瘤抑制作用’作為治療藥劑。本案發明人將α549細胞 矛夕殖到7週大雌baLB/c裸小鼠（/?£///?")之皮下，並將300 micro g/體重之經親和性純化之抗NPTX1單株抗體 (mAb-75-1)或正常小鼠IgG (控制）進入該腫瘤，每週2 次，持續30天。該抗NPTX1單株抗體（mAb-75-l)造成A549 肺癌顯著抑制生長，而相同劑量之正常小鼠丨gG不影響腫 瘤生長（户=〇_ 〇16，以各配對力測試；圈12，頂分格）。使 用切除腫瘤之冷凍切片之HE染色，偵測到，於抗Νρτχι抗 體處理之腫瘤組織，顯著f i br〇ma1：丨c改變，及降低活癌症 細胞（圖12,下分格）。此等結果一起顯示：該抗Νρτχι單株 抗體（mAb-75-l)於邀命及邀巧势癌症細胞具生長抑制作 用。 [實施例19]於生長促進路徑，nptxr作為針對ΝΡΤΧ1之受 艘
2125-993 7-PF 206 200920406 一已知NPTX1受體，NPTXR，已顯示在運送突觸前蛇毒 蛋白taip〇xin到突觸扮演一角色，其可能代表一新穎的神 經原攝入路徑，參與廓清突觸殘餘物（KirkpatrickLL，d al.’ J Biol Chem 278: 17786-92 (2000), Dodds DC, et al. , J Biol Chem 272(34): 21488-94 ( 1 997))。為了調 查是否基因表現在肺癌中並負責生長促進作用，本 案發明人以半定量RT-PCR實驗分析肺癌細胞株及臨床組 織中之价表現。在肺癌樣本以相當高水平表現， 但在正常肺並沒有（圖7幻。#/?77左之該表現模式顯示此等 腫瘤與表現之良好一致性。如上述Νρτχι之自泌生 長促進作用檢驗C0S-7細胞，以半定量RT_pcR分析及免疫 細胞化學分析，確認内生性表現NPTXR (資料未顯示）。資 料顯示NPTX1可能經由與NPTXR於肺癌細胞之交互作用， 媒介其生長促進作用。 為了調查在C0S-7及肺癌細胞，結合ΝΡΤΧ1至内生性 NPTXR，使用使用内生性表現NPTXR之c〇S-7及肺癌sbc_5 個細胞，並以NPTX1-表現載體轉染實施受體-配體結合分 析。確認到此等細胞上，分泌外生性Νρτχι於該培養基， 並以流體細胞計數計分析，偵測到結合Νρτχι於該表現細 胞（C0S-7之代表性資料顯示於圖15Α)。亦觀察到：分泌 ΝΡΤΧ1及内生性NPTXR在此等2細胞株（c〇S-7及SBC-5個 細胞）之表現，為共定位化（圖13Α)。為了確認Νρτχι對 C0S-7及SBC-5個細胞之專一性交互作用，吾人加入剝奪緩 衝液（甘胺酸l〇〇mM，50 0mM NaCl，pH 2.5) ’於其培養基，
2125-9937-PF 207 200920406 以移除抗ΝΡΤΧ1及抗NPTXR抗體作為初級抗體結合於該細 胞表面。甘胺酸治療後，N P T X1及N P T X R在該細胞之表面 未偵測到，代表NPTX1對於NPTXR在細胞表面之交互作用 (圖13B及13C)。為了檢查NPTX1及NPTXR間之直接關連， 本案發明人等暫時表現myc/His加標籤 NPTX1於C0S-7或 SBC-5個細胞。將細胞溶解物，以抗myc或抗NPTXR抗體 . 免疫沉澱，並使用抗NPTXR或抗myc抗體供西方墨點分 析。發現到：共沉澱NPTX1及NPTXR (圖15B)。此等結果確 f 認評1义1及NPTXR間之交互作用，暗示存在NPTX1/NPTXR複 合體。 使用設計為表現對抗之siRNA(si-A7T/y?-/及 的#邀，檢驗了： NPTX卜受體交互作用在肺癌 形成之生物學顯著性。涔此等質體其中之一轉染到A549或 SBC-5個細胞内，相較於包含該2控制siRNA中任一者之細 胞，抑制表現内生性受體（圖1 3D， 潰分# )。依照此降低表 , 現受體，A549及SBC-5個細胞顯示顯著降低細胞存活性及 κ 群落數（圖13D，户及万分#)。此等結果強力支持NPTX1藉 與NPTXR交互作用，可能在肺癌發展/進展，扮演非常顯著 角色。 [實施例 20] NPTX1舆NPTXR結合後之内化 為了決定該機轉涉及該調控NPTX1/NPTXR訊號，本案 發明人檢查當細胞暴露於分泌NPTX1時，以共焦顯微鏡觀 察NPTX1及NPTXR之次細胞分布，NPTX1/NPTXR是否内化。 將接受者C0S-7或SBC-5個細胞，在培養基中，於37 °C在 2125-993 7-PF 208 200920406 蓋玻片上生長隔夜。並收集經NPTX1載體轉染之捐出者 C0S-7或SBC-5個細胞之上清。然後，將接受者⑶s_7或 SBC-5個細胞與捐出者細胞上清，一起溫育3小時。本案發 明人等以免疫細胞化學偵測到結合Νρτχι至該等細胞表面 (圖14Α及14Β)。亦觀察到··内生性Νρτχι及内生性Νρτ找 在此等2細胞株表面共定位化（資料未顯示）。然後，在膜 可通透條件下實施免疫細胞化學，且吾人俄測到内化之外 生性νρ™ (圖14Α及14Β)。於以來自捐出者題卜轉染 (/)C0S-7細胞之條件化培養基處理接受者c〇s —7細胞ι或 3一 J %後以西方墨點使用抗_抗體偵測到νρτχι。顯 示：接受#咖-7細胞明間依存性方式，攝取條件化培養 基中來自於捐出者™-轉染⑺⑶S-7細胞的分泌 麗】⑽所有分析以盲目試驗進行，實驗人員不知 治療條件。 討論： 即使腫瘤診斷影像化、組人 σ化療、現代外科手術技術， 及放射線療法有所進步，對 大。Ρ刀患肺癌之病患，在最近 10年對於其預後及生活品 負的進步报小。事實上，2/3之 病患在後階段診斷，已鉦法 _ ,,,, ΝςΓΤΓ ，、進仃根治的手術療。對於後階 •k的NSCLC ’新的化療療鞋4电
.^ ^ , ’、效果已改進，但後階段NSCLC 之存活中位值，以習知化療， οηπ·, η ~ 8 個月（Breathnach 1，Hanna 2004)。 症 因此，目前急需開發實 及新類型藥物，標靶於 用診斷生物標記供早期偵測癌 對於癌症細胞惡性本質為重’要
2125-9937-PF 209 200920406
的專一性細胞訊號。如上所討論，使用使用包含27,648基 因之cDNA微陣列’將雷射微切除之癌症細胞富化後，進行 101肺癌之基因體範圍表現概況分析。由該分析，鑑別出數 種基因可：有潛力之良好候選人，供開發新穎的診斷標 /α療藥物’及/或免疫療法。其中’編碼推定的腫瘤專 )·生穿膜/分必蛋白質之基因，被認為具顯著優點，因其位 在細胞表面或在胞外空間内，及/或血清中，使其能容易被 接近以作為分子標記及治療標靶。 於本發明之内容，編碼—分泌蛋白質之，被鑑別 出作為潛在標靶供開發新工具，以診斷及治療肺癌。NPTX1 為一新認識之“long pentraxin” （Goodman)之次家族一 員。nptxi媒介攝取突觸巨分子，並於發育及成人腦部，涉 及突觸形成及突觸成形兩者（Breathnach, 〇. s，et al,，了
Clin Oncol. 1 9:1 734-1 742 (2001 ))。然而，NPTXI 與癌症 开> 成間之關連’未曾被敘述過。 在此’ NPTX1蛋白質顯示在大多數肺癌樣本中表現’ 而在正常組織中鮮少表現。再者，較高之Νρτχι表現程度 與較短之癌症專一性存活期間有關。因此，誘導外生性表 現ΝΡΤΧ1 ’增強C0S-7細胞及NIH-3T3細胞之生長/侵入活 性。分泌ΝΡΤΧ1可作為自泌/旁分泌細胞生長/侵入因子。 ΝΡΤΧ1先前已鑑別結合於神經元pentraxin受體（nptxr) (Goodman, AR, et al., Cytokine Grouwth Factors Rev. Aug; 7(2): 1 92-202( 1 996 ))。然而，當以半定量 RT-PCR 分 析肺癌細胞株及癌症組織中，NPTXR之mRNA表現， 2125-9937-PF 210 200920406 ^表㈣式，並非完全舆腑(諸未_)。雖此 km㈣細胞中之NPm受體 解明，鑛禮_之織果，明白顯示過度表現 /具X1’可能為—自泌/旁分泌生長因+，相關於癌症細胞 長及知人’誘導肺癌細胞之高度惡性表型。再者，該資 料^明NPTX1作為分子標靶供肺癌治療之潛力。 • 、，有趣地，缺氧誘導顯著增加肺癌細胞中之Νρτχι表現 :(資料未顯示)。臨床研究已清楚地顯示:於腫瘤病灶中：低 :〇2 :力’為不佳後果之-獨立預後指標，並且相關於增 fel、a療，立之遇距轉移之風險（46—48)。缺氧在腫瘤細 ’舌k入及轉移扮演重要角色。可能增加腫瘤細胞於 '乳條件下存活之一系列基因及蛋白質，包括血管内皮生 =子（觸）、類胰島素生長因子、可誘導之氧化氮合成 、血J板何生内皮生長因子、葡萄糖輸送子卜紅血球生 、素及氧化氮合成酶基因，係由缺氧可誘導因子_la (49-52)所調節。复#台 ^ ，、他L床研究，已顯示固體腫瘤減少之缺 广放射線療法之結果。因此’此處資料顯示標靶於 可作為有望之治療策略，供治療侵入、轉移及放射線 耐受性缺氧肺癌。 方面亦發現到：高ΝΡΤΧ1水平蛋白質存在於來自 癌病心之血清樣本。血清標記可應用於不同的診斷：早期 偵測癌症、預接沾3^ 、預測、治療效果之監控，及監視疾病再發。 :處之研究顯示:高Νρτχι水平血清，即便在患早期階段腫 瘤之病患，亦I伯 偵測到。再者，ΝΡΤΧ1血清濃度，在初期
2125-9937-PF 211 200920406 腫瘤手術切除戲劇地降低。再者，Ν Ρ Τ X1水平血清，於相 同病患初期腫瘤組織中，顯示與NPTX1水平表現顯示良好 相關性。 為了驗證應用NPTX1作為診斷工具之可行性，將NPTX1 血清水平與CEA、CYFRA及proGRP ’針對ADC、SCC及SCLC 之一習知診斷標記之水平，以靈敏度及診斷專一性比較。 . 組合分析 2 者標記 （NPTX1+CEA、ΝΡΤΠ+CYFRA 或 NPTXl+proGRP)，將靈敏度針對肺癌（ADC、SCC或SCLC)增 加至約64-72%，高於CEA'CYFRA或proGRP單獨時，而5-6% 之健康自願者錯誤診斷為陽性。即便進一步驗證，需使用 更大組血清樣本，涵蓋各種臨床階段，但目前顯示的資料， 已足夠顯示NPTX1作為血清生物標記應針對診斷早期階段 肺癌、監控治療效用，及監視疾病再發，為有用。 結論上，NPTX1在大多數肺癌為過度表現，且其血清 水平在大比例之病患血清為提高的。NPTX1，與其他腫瘤標 記組合，能顯著改善癌症診斷靈敏度，而其可用在初步診 斷，作為一免疫組織化學標記供鑑別可能會受益於早期全 身性治療之病患。因為向上調控NPTX1為一常見且重要的 肺癌形成特性，標靶於NPTX1可能為一新策略供專一於肺 癌抗癌藥物。 第IV部分：CMN3及EF-ldelta相關實驗 [實施例18] —般方法 /. 細胞株及臨床組織樣本 用於本研究之1 5人類肺癌細胞株，如下：1 5 NSCLC、 2125-9937-PF 212 200920406 LC176 、 LC319 、 A549 、 NCI-H23 、 NCI-H226 、 NCI-H522 、 PC3、PC9、PC14、SK-LU-1、EBC-1、RERF-LC-AI、SK-MES-1、 SW9 00 ’及SW1 5 73。所有細胞在補充i〇% FCS之適當培養養 基中生長成單層’並維持在37度C、潮濕空氣、5% C〇2中。 人類小呼吸道上皮細胞（SAEC)作為控制組，生長在得自
Cambrex Bioscience’ Inc. (Walkersville, MD)之最適化 培養基（SAGM)。初級NSCLC，包括7ADCs，及7SCC，由另外 叙述者得到（Kikuchi ei al.，2003)。合計385個初級 NSCLC之福馬林固定樣本’包括243ADC、102SCX、28IXC、 12腺鱗狀癌（ASC)’及鄰近正常肺組織，早先在Saitama癌 症中心（Saitama，Japan)由經歷手術之病患，與臨床病理 資料一同取得。來自死後材料（患SCC之2個體）之NSCLC 樣本及5組織（心、肝、肺、腎，及胃），亦從廣島大學得 到。此研究及提及之所有使用臨床材料，由個體制度倫理 委員會核准。 么半定董RT-PCR分析 從培養細胞臨床組織使用TRIzol藥劑（Life Technologies，lnc.)，依照製造商實驗步驟萃取總RNA。 將萃取的RNA及正常人類組織聚（A)RNA，以DNase I處理 (NipponGene)，並使用寡（dT) 20 啟動子及 SuperScript π 反轉錄酶（Invitrogen)進行反轉錄。半定量RT_pcR實驗， 係以專一於beta-肌動蛋白（ACTB)之啟動子實施，作為内 部控制：
CDKN3， 5’ -GTGAATTGTTCTCAGTTTCTCGG-3， （SEQ ID 2125-9937-PF 2Ή 200920406 NP: 34)，及 5， -TCTCTTGATGATAGATGTGCAGC_3’ (SEQ ID NP: 35); EF-1delta， 5， -TGGCTACAAACTTCCTAGCACAT-3’ (SEQ ID NP: 36)，及 5， -CTCCACCACACACTGAATCTGTA-3’ (SEQ ID NP: - 37);
ValRS， 5， -TAAGCATCACGCGAGCCGTG-3’ (SEQ ID NP: 38) ，及 5’ -GGATGGAGCAGCAGCGATCAGAA-3’ (SEQ ID NP: 39) ; EF-lalphal, 5’ -AGACTGGTTAATGATAACAATGC-3’ (SEQ ID NP: 40)，及 5， -GGTCTCAAAATTCTGTGACAAAT-3’ (SEQ ID NP: 41); EF-lbeta， 5’ -CAGAAGCATTCAAGCAGACG-3’ (SEQ ID NP:42)，及 5’ -ATGCCATGATCCAGGATGGA-3’ （SEQIDNP: 43); EF-lgamma, 5， -GGTGGACTACGAGTCATACACAT-3’ (SEQ ID NP: 44)，及 5， -CAGTTTCCTTTAATGACCCCC-3’ (SEQ ID NP: 45); CDK1， 5’ -AGCCTAGCATCCCATGTCAA-3， (SEQ ID NP: 46) ，及 5， -GAAGACGAAGTACAGCTGAAG-3， (SEQ ID NP: 47) ; * 2125-9937-PF 214 200920406 ACTB， 5， -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’ (SEQ ID NP： 11) ，及 5’ -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3， (SEQ ID NP： 12) 。 PCR反應以週期數最適化，以確保產物強度位在放大 之對數相。 «?·北方墨點分析 將人類多重-組織墨點（BD B i osc i ences C1 ontech)雜 父於CDKN3之32P標定PCR產物。預雜交、雜交，及洗蘇， 係依照製造商說明書進行。該等墨點於-80度C以加強BAS 篩經放射能照相7天。 4.西方墨點分析 將細胞以RIPA緩衝液溶解[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mM NaCl，1% NP40，0.5% -去氧-chorate-Na， 0.1% SDS] ’該緩衝液包含蛋白酶抑制劑Cocktai 1 Set ΠΙ(蛋白酶抑制劑 Cocktail Set III; CALBIOCHEM)。將蛋 白質樣本以SDS-聚丙稀醯胺凝膠分離，並電點墨至 Hybond-ECL 硝基纖維素膜上（GE Healthcare Bio-Sciences)。將墨點與小鼠單株抗CDKN3 (KAP)抗體 (BD Bioscience Pharmingen)、兔多株抗 EF-ldelta 抗體 (NOVUS Biological s)、小鼠單株抗 EF-1 alpha 抗體（Up 狀 悲）、兔多株抗 Akt 抗體（Cell signaling technology, Inc.)，兔多株抗 phospho-Akt (Ser473)抗體（Santa Cruz Bio technology, Inc·)、小鼠單株抗beta-肌動蛋白抗體 (SIGMA)、小鼠單株抗Flag抗體（SIGMA)、兔多株抗c-Myc 2125-993 7-PF 215 200920406 抗體（Santa Cruz Bio technology, Inc·)或大鼠單株抗 HA 抗體（Roche Diagnostics Corporation)— 起溢育。抗原- 抗體複合體，使用接合於辣根過氧化酶之2次抗體偵測到 (GE Healthcare Bio-Sciences)。蛋白質帶，如前所述（Ka to et al _，2005; Suzuki etal.，2005)，藉 ECL 西方墨點 偵測藥劑可見化（GE Healthcare Bio-Sciences)。小鼠單 株抗 CDKN3 (KAP)抗體（BD Bioscience Pharmingen)及兔 多株抗EF-1 de 1 ta抗體（N0VUS Biο 1 〇gica 1 s)，藉西方墨點 分析，使用表現或不表現内生性蛋白質之NSCLC細胞之溶 解物，各別證實專一於人類CDKN3及EF_ldelta (見圈 19A)。 5.免疫组織化學及組織擻陣列 為了 s周查臨床樣本中之CDKN3或EF-ldeHa蛋白質， 將切片以如下方式染色：ENVISI0N+套組/辣根過氧化酶
(HRP) (DakoCytomation)。簡言之，將抗 CDKN3 抗體（BD Bioscience Pharmingen)或抗 EF-ldelta 抗體（N0VUS
Biol ogicals)在阻斷内生性過氧化酶及蛋白質後加入，並 將該切片與作為2次抗體之HRP標定抗小鼠或兔IgG 一起 溫育。加入基質-發色體，並將樣本以雇木素對比染色。 腫瘤組織微陣列，如先前敘述（Chin, s. F.，et al Mol. Pathol. 56: 275-279 (2003); Callagy, G., et al., Mol. Pathol. 12： 27-34 (2003)； Callagy, G., et al., J. Pathol. 205: 388-396 (2005 ))地建構。用於取樣之組 織區’係依據與該對應的-染色過的切片排放在—載玻
2125-9937-PF 216 200920406 按見排列選擇。從捐出者腫瘤塊取出之個 =核^ U_;高度3— 4_)，以一組織微陣列儀放 匕妾交者㈣塊（Beecher Instru_ts)。針對各個案，戮 刺正常組織之核’將得到之微陣列塊之5—Μ”。m切片， 詩免疫組織化學分析。3名獨立的調查貢依照染色強度評 里CDKN3或EF_ldelta陽性，他們對於臨床追縱資料並不 知道。僅料論者獨立定義於此之案例，接受為陽性。 反統計分析 6使用偶發表（contingency table)，以組織微陣列分析 決定介於臨床病理學變量例如年紀、性別、腫瘤尺寸 及淋巴節轉移（ρΝ)，與cd〇3及/或EF_ldeHa陽性間之 相關11。腫瘤專一性存活曲線，係從手術日至關於 死亡之日或至最後追蹤觀察之日計算。Kaplan_Meier曲 線，針對各相關變量，及針對CMN3及/或EF_ideih表現 汁·η*關連於預後之風險因子，使用C〇X比例危害迴歸模 型，及降低步驟評估。比例危害假設，經檢查及滿足；僅單 變i分析中統计顯著結果之該等變量，包括在多變量分析 中。移除一變量之準則’為可能比例統計，其係依據最大 部分可能估算值（針對從模型移除，預設p值0. 05)。 Γ· RNA干擾分析 如前所述’載體系RNA干擾（RNAi)系統，psiHlBX3. 0， 導引合成siRNA於哺乳動物細胞，先前已建立（suzuki, c.，
Cancer Res. 63: 7038-7041 (2003 ))。在此，將 1〇 micro
g 的 siRNA-表現載體使用 30 micro L 的 Lipofectamine 2000 2125-9937-PF 217 200920406 (I nv i trogen)，轉染到NSCLC細胞株。將經轉染的細胞於 存在適當濃度geneticin (G418)下培養5天，之後以三重 複MTT分析，利用Gi emsa染色計數群落數及活細胞數。針 對RNAi之該合成募核苷酸之標靶序列如下 控制組 1 (EGFP:水母pycz^r/5)GFP 之突 變體）、 5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’ （SEQ ID N0: 23); 控制組 2 (Luciferase: Photinus pyralis 螢光素酶 基因）、 5’ -CGTACGCGGAATACTTCGA-3， (SEQ ID NO: 15); 控制 3 (Scramble:葉綠體 Euglena gracilis 基因， 編碼為5 S及16 S r R N A)、 5’ -GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’ (SEQ ID NO: 16); siRNA-CDKN3-A (si-A), 5, -TATAGAGTCCCAAACCTTC-3’ (SEQ ID NO: 49); siRNA-CDKN3-B (si-B), 5’ -TACACTGCTATGGAGGACT-3, (SEQ ID NO: 50); siRNA-EF-ldelta-1 (si-1), 5’ -GTGGAGAACCAGAGTCTGC-3, (SEQ ID NO: 51); siRNA-EF-ldelta-2 (si-2), 5, -CATCCAGAAATCCCTGGCT-3, (SEQ ID NO: 52)。 為了驗證立即的RNAi系統，各別控制siRNA (EGFP， Luci f erase及Scrambl e)起初使用半定量 RT-PCR確認降 低表現對應目標基因，該對應目標基因經暫時轉染進又 2125-993 7-PF 218 200920406 COS-7 細胞。Si-CDKN3S 及 si-EF-ldeltas 向 ^ T 调控 CDKN3 及EF-1 delta表現，但非控制組，以供此分如 广ϋ 77析使用之該細 胞株以半定量RT-PCR確認。 反免疫组織化學及组織微陣列
為了調查臨床樣本中之CDKN3或EF-ldelta蛋白所 將切片以如下方式染色：ENVISI0N+套組/辣根過氧Z酶 (HRP) (DakoCytomatmn)。簡言之，將抗 CDKN3 抗體（汕 Bi〇SCience Pharmingen)或抗 EF_ldelta 抗體（n〇vus Biologi cals)在阻斷内生性過氧化酶及蛋白質後加入，並 將該切片與作為2次抗體之HRP標定抗小鼠或兔丨扣一起 溫育。加入基質-發色體，並將樣本以廣木素對比染色。 腫瘤組織微陣列，如先前敘述（Chin et al.，2川3; Callagy et al.，2003, 2005 )地建構。用於取樣之組織區， 係依據舆該對應的H&E-染色過的切片排放在—載玻片上的 可見排列選擇。從捐出者腫瘤塊取出之3、4或5個組織核 (直徑0.6 mm;高度3_ 4 mm)，以—組織微陣列儀放進接受 者石蝶塊（Beecher· Instruments)。針對各個案，戰刺正常 組織之核，將得到之微陣列塊之5_micr〇 m切片，用於免 疫組織化學分析。3名獨立的調查員依照染色強度評量 CDKN3或EF-ldelta為無或陽性，他們對於臨床追蹤資料並 不知道。CDKN3或EF-ldelta染色強度，使用以下準則評估： 強陽性（2 + )、於大於50%腫瘤細胞完全模糊細胞質暗棕染 色；弱陽性（1 + )，在腫瘤細胞細胞質觀察到較少程度棕染 色，無（分數〇 )，在腫瘤細胞無可察覺之染色。僅於評論 2125-9937-PF 219 200920406 者獨立定義於此之案例，接受為陽性。 久统計分析 使用偶發表（cont jngency tab工e)，以組織微陣列分析 決定介於臨床病理學變量例如年紀、性別、腫瘤尺寸⑽ 及淋巴節轉移（pN)，與咖3及/或EF_ldelta陽性間之 相關性。腫瘤專一性存活曲線，係從手術日至關於nsclc 死亡之日或至最後追蹤觀察之日計算。Κ^ΐ3η — 曲 線，針對各相關變量，及針對CDKN3及/或EF_ldeHa表現 計算；存活時間在病患次群組間之差異，使用[叩―檢 定分析。關連於預後之風險因子，使用比例危害迴歸 模型’及降低（s tep-down )步驟評估。比例危害假設，經檢 查及滿足；僅單變量分析中統計顯著結果之該等變量，包括 在多變置分析中。移除一變量之準則，為可能比例統計， 其係依據最大部分可能估算值（針對從模型移除，預設p值 0.05)。 /夕· Matrigel侵入分析 使用 FuGENE 6 轉染藥劑（Roche Diagnostics)，依照 製造商指示，將NIH-3T3細胞以表現o/y灯之質體或假質 體轉染。將經轉染之細胞收集，並懸浮在無FCS之DMEM中。 製備細胞懸浮液前’將Matrigel基質乾燥質（Becton Dickinson Labware)，以DMEM於室溫復水2 小時。然後， 將包含10% FCS之DMEM，加至24-井Matrigel侵入腔室 之各下部腔室’並將細胞懸浮液，加至各上層腔室之插入 物。將插入物之盤，於37度C溫育22小時。將此等腔室 2125-9937-PF 220 200920406 溫月後’依知、供應商指示，固定經由Matr ige 1入侵之細胞， 以Giemsa染色。 合成之細胞-可通透胜肽 將對應於一部分EF-1 delta蛋白質之19-胺基酸胜肽 序列’該一部分EF-ldelta蛋白質包含CDKN3可能結合位 置’共價連結其NH2末端至一膜傳導11多精胺酸序列（11R; refs. Futaki et al·， Hayama et al.， 2006， 2007)。合 成 5 種細胞可通透胜肽：11R-EF-Idelta73-91， RRRRRRRRRRR-GGG-TSGDHGELVVRIASLEVEN; 11R- EF-ldelta 9 0- 1 08 , RRRRRRRRRRR-GGG-ENQSLRGVVQELQQAISKL; 1 lR-EF-ldeltai〇8-i26, RRRRRRRRRRR-GGG-LEARLNVLEKSSPGHRATA; 1 lR_EF~ldeltai25-i43, RRRRRRRRRRR-GGG-TAPQTQHVSPMRQVEPPAK; 11R-EF-1 de 1 tai42-ie。， RRRRRRRRRRR-GGG-AKKPATPAEDDEDDDIDLF。胜肽以製備性逆 相高壓液體層析純化。將LC31 9細胞與該11R胜肽，於濃 度2.5、5.0及7.5 micro Μ，一起溫育5天。將培養基每 48小時在各胜肽適當濃度更換，並且在治療後5天，以ΜΤΤ 分析評量細胞存活性。
/么免疫沉澱及CDKN3關連蛋白質之MALDI-TOF-MS 將來自肺癌細胞株LC31 9之細胞萃取物，於4度C與 10 0 micro L之蛋白質G-瓊脂珠，於最終體積2 ml免疫 沉澱緩衝液[〇. 5% NP-40 ' 50 mM Tris-HCl、15 0 mM NaCl] 2125-9937-PF 221 200920406 中，於存在蛋白酶抑制劑下，如、B7古! 们d卜一起溫育1小時。於1 0 00 rpm 於4度C離心5分鐘後，將μ生 段將上清於4度C與抗CDKN3單株 抗體或正常小鼠I gG —钯、、ra古0 , „士 t ^皿月2小時。然後將該珠以5 〇 〇 〇 rpm離心2 min收集，並曰^ 卫·且以1 m 1各免疫沉澱缓衝液洗滌 6次。將洗後之珠再懸浮於5〇 micr〇 L Uemmii樣本緩衝 液’並沸騰5min’將蛋白f以5_1Q%SDspAGE凝膠⑻〇 RAD)分離。電泳後，將凝膠以銀染色。將以抗⑽N3單株 抗體在萃取物免疫沉澱中專_地發現蛋白質帶切下，並用 於基質輔助雷射胺R/4 / ^ 对脫附/離心化時間飛行質譜 (MAUH-T0F-MS)分析（AXIMA_CFR pius， a·则 BIOTECH)。 /«?·磷解酶分析 針對磷解酶處理，將細胞萃取物與λ _磷解酶 England B1〇labs)在磷解酶緩衝液中一起溫育或緩衝液單 獨於37度C溫育1小時，並接著用於免疫墨點。 [實施例19]肺腫瘤及正常组織中之⑶以^表現 為了研究新穎標革巴分子供開發肺癌之治療藥劑及/或 生物標記’首先_cDNA微陣列，筛選分析之m肺癌樣 本中大於50% ’在癌症細胞水平高於正常細胞3倍以上者。 在篩&之27, 648基因中’編碼cycl丄n—依存性激酶抑制劑 3 (CMN3)之基因被鑑別在多數肺癌中過度表S，且增加 CDKN3表現，在14例中12例（6/7腺癌（ADC)，及6 / 7鱗 狀細胞癌⑽）額外之NSCLC帛例確認（圓16a)。有趣 地，在腦轉移及進展之初期肺腫瘤（腺癌，AD〇，相較於早
2125-9937-PF 222 200920406 期階段之初期肺腫瘤，觀察到遠高的CMN3表現模式（圈 16B)。以cDNA作為探針，北方墨點cdkn3，於檢查之μ正 苇類、、且織蠢別一強訊號，其對應於〇. 9 - kb轉錄物於睪 丸及一非常弱訊號於胸腺、結腸癌、胃癌，及骨髓（圈 16C)。該表現CDKN3蛋白質’亦以抗CD〇3抗體在6個 正常組織（心 '肝、腎、肺、結腸及睪丸）中偵測到，發現 -CMN3在睪丸（主要在初級精母細胞之細胞質）及肺癌大量 f —表現，但在其餘正常組織幾乎偵測不到表現（圈ι7Α)。 [實施例20] CDKN3過度表現舆不良預後之關連 為了調查CDKN3在NSCLC形成之生物學及臨床病理學 顯著性，CDKN3蛋白質表現以組織微陣列檢驗，該組織微 車歹〗匕3末自385病患之NSCLC組織，及來自15病患之scLC 組織。針對CDKN3 (細胞質及核）之陽性染色，在65,7%之 手術切除 NSCLC (253/385 )，及 80.0%之 SCLC (12/15)觀察 到，但在檢查之正常肺組織細胞未觀察到（圈丨7B)。然後， ί丨 k查385 NSCLC病患中，陽性染色與各種臨床病理學參數 之相關性。SCLC之樣本尺寸太小，以致不能進一步評估。 性別（男性較高；P = 0. 0054，費雪精確檢定）、組織學分 類（在非ADC較高；P < 0 0001費雪精確檢定），及pN階 段（在N1、N2較高；Ρ=0·0057’費雪精確檢定），與CDKN3 陽性顯著相關（表4A)。NSCLC其腫瘤顯示CDKN3陽性染色 者，相較於無CDKN3表現之病患，病患之存活時間較短（p〈 0.0 00 1’ Log-rank檢定）（圓17C)。藉單變量分析。較年 長（>-65)、男性、非ADC組織學分類、進展之ρτ階段、 2125-9937-PF 223 200920406 進展之pN階段，及CDKN3陽性，與NSCLC病患中不良之 腫瘤專一性存活顯著相關（表4B)。於預後因子多變量分 析，較年長、進展之pT階段、進展之pN階段，及CDKN3 陽性，代表獨立預後因子（表4B)。 表4A. NSCLC组織之CDKN3-陽性舆病患特性間之關連 合計 η = 385 CDKN3 陽性 η =253 CDKN3 陰性 η =132 户-值強/弱對陰 性 性別 男 264 186 78 0· 0054* 女 121 67 54 年紀（歲） <65 188 129 59 0.2828 >=65 197 124 73 組織學類型 ADC 243 140 103 SCC 102 80 22 <0.0001*，** 其他 40 33 7 pT因子 Τ1+Τ2 274 176 98 0. 3463 Τ3+Τ4 111 77 34 pN因子 NO 237 143 94 0. 0057* N1+N2 148 110 38 ADC:腺癌；SCC:鱗狀細胞癌 其他：大細胞癌+腺鱗狀細胞癌 *户< 0·05 (費雪精確檢定） 氺氺ADC對非ADC組織學 2125-9937-PF 224 200920406 表4B. NSCLC病患之預後因子之Cox氏比例危害模型分析 變量 危害比例 95% CI 不利 /有利 尸-值 單變量分析 CDKN3 2. 121 1.488-3. 025 強（+)或弱（+) / (-) <0. 0001* 年紀（歲） 1.425 1.060-1.918 65 >- / < 65 0.0192* 性別 1.626 1. 164-2.273 男/女 0. 0044$ 組織學類型 1.438 1.072-1.929 非 ADC / ADC1 0.0153* pT因子 1.913 1.413-2. 590 Τ3+Τ4 / Τ1+Τ2 <0.0001* ρΝ因子 2.420 1.805-3.243 Ν1+Ν2 / Ν0 <0.0001* 多變量分析 CDKN3 1.897 1.313-2. 742 強（+)或弱（+)/(-) 0.0007* 年紀（歲） 1.797 1.327-2.433 65 >= / < 65 0. 0002* 性別 1.357 0. 938-1.963 男/女 0. 1053 組織學類型 0.993 0.713-1.383 非 ADC / ADC1 0. 9680 pT因子 1.895 1.389-2. 584 T3+T4 / T1+T2 <0.0001 木 ρΝ因子 2. 284 1.690-3. 086 N1+N2 / N0 <0.0001* kDC:腺癌 ^ < 0. 05 [實施例 21]鑑別 EF-lbeta-gamma-delta/ValRS 作為舆 CDKN3交互作用之新穎分子 為了解明CDKN3於癌症形成之功能，考慮在肺癌細胞 中，會與CDKN3交互作用之蛋白質。將來自LC319細胞之 細胞萃取物，與抗CDKN3單株抗體或小鼠I gG (陰性控制） 進行免疫沉澱。以SDS-PAGE分離後，將蛋白質複合體以銀 染色。140-, 50-，31-，及2 5-kDa之蛋白質帶，在以抗CDKN3 2125-9937-PF 225 200920406 抗體之免疫沉殿物中發現，但以小鼠lgG…物中未發 現者’切下’以騰蛋白酶消化，並用於質譜分析。來自於 14。-，50、31-，及25 —kDa帶之胜肽。各配合於以下序列： valyHRNA合成酶（valyi—谓八合成酶，μ脱 140—kDa)、真核生物轉譯延長时1 g_ (EF-lga_a; 5〇 —_)、真核生物轉譯延長因+ 1 deUa (EF-ldelta; 31-kDa)、真核生物轉譯延長因子lbeta(EF_ibeta;25_kDa) (圖 18A)。 、此等4蛋白貝包括：延長因子_ i之鳥嘌呤—核苷酸交 換複口體其負貝蛋白質合成。為了調查延長因子—1之鳥 嗓呤-核苦酸交換複合體及其在NSCLC細胞中之相關分子之 成刀表現杈式，以半定量RT_pcR實驗分析vaiRS、 ldelta EF lalpha卜 EF-lbeta、EF-lgamma，及 CDK1 之 祕表現。肺癌中，〇助表現模式，非常類似，他⑽ 之表現Μ < (圈18B) °進-步以西方墨點分析確認：cmn3 及jF-ldelta蛋白質在肺癌細胞株中共同活化（圓i9a)。 先前的報告證實EF-ldelta於哺乳動物細胞之致癌潛力 (Joseph, P. , et al., J Biol Chem. 277: 61 31-61 36 (2002))。 從此等發現：調查在癌症細胞中，CDKN3對EF_ldelta 之功能關連性。内生性CDKN3及EF_ldeUa之同源交互作 用，以免疫沉澱貫驗，在LC319細胞中檢查，其中此等2 土口大里表現（圖20A)。其次細胞定位，使用小鼠單株抗 CDKN3及兔多株抗EF_ldelta抗體，以aphidic〇iin同化
2125-9937-PF 226 200920406 之LC319細胞中，以免疫細胞化學分析調查。經由細胞週 期，主要在細皰質及核，偵測到蛋白質共定位（代表圖， 顯示於圓20B)。 [實施例22]EF-ldelta在NSCLC生長及發展之作用 為了澄清EF-ldelta在NSCLC形成之臨床病理學顯著 性EF 1 deHa蛋白質表現以組織微陣列檢驗，該組織微陣 列包含來自385病患之NSCLC組織。針對EF_ldeHa (細胞 質及核）之陽性染色，在65. 7%之手術切除Nsac (26〇/385) 觀察到（圈19B)。EF-ldelta染色在檢查之正常肺組織細胞 幾乎未觀察到。該表現刪3蛋白質，舆此等腫瘤中之 EF-ldelta表現顯著符合(p〈 〇 〇〇〇1，費雪精確檢定）。 N^LC中’ EF_ldeit^性染色，顯著關連於性別（男性較 冋’ P - 0.0004 ’費雪精確檢定）、组織學類型（非胤較 高；，費雪精確檢定），及進展之pN階段⑻、 N2較高；P = G.G141 ’ f雪精確檢定），及5年存活（卜 〇·嶋’ L〇g-rank檢定）（围19C;表5A)。於預後因子 h里分析，年紀、ρτ階段、PN階段，及EF_ld心陽 性，代表獨立預後因子（表5B)。 為了進-步評量是否EF_ldelta對肺癌細胞生長或存 活為生物學上必要，吾人建構質 貝瓶乂表現對抗 之81應（S1H〜1及―2)，及3種不同的控制質體 (針對EGFP、LUC或SCR之，廿結、, 径市J貝體 "，主 之遵），亚轉染到肺癌細胞株以 抑制表現内生十生約_。經轉染叫之細胞中之 狀-/介轉錄物量，相較於以3控制以抓八中其中之」轉
2125-9937-PF 227 200920406 染者，顯著降低（圖22B)。si-2顯示對於表現幾乎 無抑制作用。s i -1轉染，亦顯著降低以MTT分析測量群落 數及活細胞數（圖22B)。此等結果顯示 CDKN3，經由與 EF-ldelta交互作用及/或活化EF-ldelta，能促進及/或進 展 NSCLC 。 表5A. NSCLC组織之EF-ldelta -陽性舆病患特性間之關連 η 合計 EF-ldelta 陽性 =385 η = 260 EF-ldelta 陰性 η =125 户-值陽性對 陰性 性別 男 264 194 70 0. 0004* 女 121 66 55 年紀（歲） <65 188 134 54 0.1292 >=65 197 126 71 組織學類型 ADC 243 145 98 SCC 102 79 23 〈0.0001*,** 其他 40 36 4 ρΤ因子 Τ1+Τ2 260 179 81 0.1519 Τ3+Τ4 125 95 30 ρΝ因子 NO 237 149 88 0.0141* N1+N2 148 111 37 ADC，腺癌； see, 鱗狀細胞癌 其他，大細胞癌+腺鱗狀細胞癌 *尸< 0.05 (費雪精確檢定） **ADC對非ADC組織學 2125-9937-PF 228 200920406 表5B. NSCLC病患之預後因子之Cox氏比例危害模型分析 變量 危害比例 95% CI 不利 /有利 户-值 單變量分析 EF-ldelta 1.813 1.282-2.562 強（+)或弱（+) 0. 0008* 年紀（歲） 1.425 1.060-1.918 / (-) 65 >= / < 65 0.0192* 性別 1.626 1.164-2. 273 男/女 0. 0044* 組織學類型 1.438 1.072-1.929 非 ADC / ADC1 0.0153* pT因子 1.913 1.413-2.590 Τ3+Τ4 / Τ1+Τ2 <0. 0001* ρΝ因子 2.420 1.805-3. 243 Ν1+Ν2 / NO <0.0001* 多變量分析 EF-ldelta 1.589 1. 102-2.290 強（+)或弱（+) 0.0131$ / (-) 年紀（歲） 1.839 1.354-2.498 65 >= / < 65 <0. 0001* 性別 1.340 0.925-1.942 男/女 0.1222 組織學類型 1.021 0.731-1.426 非 ADC / ADC1 0. 9023 pT因子 1.838 1.348-2.505 T3+T4 / T1+T2 0.0001* ρΝ因子 2.345 1.733-3.172 N1+N2 / N0 <0.0001* Adc，腺癌 tp < 0. 05 [實施例23] CDKN3媒介EF-ldelta去磷酸化 西方墨點分析偵測到肺癌細胞中，2不同尺寸之 EF-ldelta蛋白質（圖20A)，而EF-ldelta據報告在體外絲 胺酸及蘇胺酸殘基構酸化 （MinellaO, etal., BiosciRep 3:1 1 9-27 ( 1 998 ))。為檢驗該EF-ldelta禮冷磷酸化之可 能性，吾人將過度表現的F 1 ag-HA加標籤EF-1 de 11a於存 2125-9937-PF 229 200920406 在或不存在蛋白質磷解酶，與來自c〇s_7細胞之萃取物， 一起溫育，並以西方墨點分析分析EF_ldelta蛋白質之分 子ΐ。經以磷解酶處理之該萃取物中之大部分EF_ldei忭 蛋白質之重量，小於未經處理之細胞（圖2〇c，左分格）。另 方面，加標籤EF-lbeta及Flag-HA加標籤 EF-1抑歷5蛋白質之分子量，在經磷解酶處理後不變（圈 20C,中右分格）。 再者，吾人確認EF-1 delta之磷酸化形式，在肺癌LC319 細胞存在（圖20D，左分格）。因為CDKN3編碼雙專一性蛋白 質磷解酶，吾人可檢驗肺癌細胞中，CMN3 —誘導EF_ldelta 去磷酸化。吾人將Flag-HA加標籤CDKN3-表現載體轉染到 LC319細胞。使用抗EF-ldelta抗體之西方墨點分析，顯 示内生性EF-1 de 11a以CDKN3-劑量依存性方式被去罐酸化 (圓20D，右分格）。 為了確認以CDKN3專一性去磷酸化EF-ldelta，將 Flag-HA加標籤CDKN3-表現載體及Flag-HA加標籤 EF-ldelta-表現載體，轉染到C0S-7細胞，並偵測到由於 過度表現CDKN3造成降低構酸化EF-ldelta蛋白質（圖 21A，左分格）。將EF-ldelta及CDKN3以抗Flag抗體免 疫沉澱，再以pan-磷酸專一性抗體（磷酸—絲胺酸、-蘇胺酸 或-酪胺酸）免疫墨點’顯示在EF-1 de 11a之絲胺酸殘基去 磷酸化（圖21A,右分格）。未觀察到由於過度表現CDKN3 在蘇胺酸及酪胺酸殘基作用（資料未顯示）。 [實施例24]鑑別EF-ldelta中之CDKN3-結合區 2125-9937-PF 230 200920406 接著調查此等2蛋白質之關連之生物學重要性及其作 為肺癌治療標靶之潛力。為了決定EF-ldelta中，與CDKN3 交互作用為必要之結構域，將具FLAG-HA-序列在N-及C末 端之各 EF-ldelta ’轉染到 LC319 細胞 (EF-ldelta72-1 60、EF-ldeltal6卜28卜 EF-ldelta卜160、 EF-ldelta72-281 ’ 及全長 EF-ldeltal-281;圈 21B)。以 單株抗Flag抗體免疫沉澱，顯示EF-ldelta72-160、 EF-ldeltal-160、EF-ldelta72-281，及 EF-ldeltal-281 能 與CMN3交互作用’但ef-ldeltal61-281不能（圖21B)。 此等實驗顯示於EF-ldelta ，包含白胺酸拉鏈結構之89 胺基酸多胜肽（密碼子72-1 60; SEQ ID N0: 48)，應在與 CDKN3之交互作用扮演重要角色。 [實施例25]以對抗CD〇3及EF-ldelta之siRNA抑制 NSCLC細胞生長 為了評量CDKN3是否對於肺癌細胞生長或存活為必 要，設計並構建質體，以表現對抗CDKN3之siRNA (si-A 及-B)’及3種不同的控制質體（針對EGFp、Luciferase (Lu〇 或 Scramble (SCR)之 siRNA)’ 並轉染到 LC319 細胞（圖 22A) 及A549細胞（資料未顯示）。經s丨轉染之細胞的 轉錄物置’相較於以3控制siRNA中任一者轉染之細胞， 顯著降低最多，而si_B對於⑶通表現幾乎不具抑制作 圈A.上左分格）^依照其在基因表現之抑制作用，轉 染A造成MTT及群落-形成分析測量到之細胞存活性及 群/U數降低此作用在3控制組或s 未觀察到（圓22A:
2125-9937-PF 231 200920406 右上及下分格）。 為了。平i EF-1 de 11 a是否對於肺癌細胞生長或存活為 必要，設計並構建質體，以表現對抗EF_ldeHa之siR難 (si EF 1 de 11a 1及一2 )，及3種不同的控制質體（針對 EGFP、LUC或SCR之siRNA) ’並轉染到LC319細胞以抑制 表現内生性EF-ldelta。經si-1轉染之細胞的EF — ldelta 轉錄物量，相較於以3控制siRNA中任一者轉染之細胞， 顯著降低最多（圖22B，上左分格），而si_2對於 表現幾乎不具抑制作用。轉染siq造成Mn及群落—形成 分析測量到之細胞存活性及群落數降低（圖22Β，右上及下 分格）。此等結果顯示CDKN3可能與EF_ldelta交互作用及 /或活化EF-ldelta，以促進生長及/或進展NSCLC。 [實施例26]過度表現CD〇3增加細胞侵入，並足以活 化Akt 因組織微陣列上之免疫組織化學分析，已顯示具 強-陽性腫瘤之肺癌病患，較針對CMN3之腫瘤為陰性之病 患，顯示較短癌症專一性存活期間（圓19B及19〇，實施 Matrigel侵入分析以決定是否CMN3在細胞侵入能力扮演 一角色。經Matrigel侵入經以CD〇3_表現載體轉染之 NIH-3T3細胞内’顯著增強（圈19〇，相較於經以假載體 轉柒之扰制細胞，代表CDKN3能貢獻於肺癌細胞高度惡性 表型。另一方面，EF-laipha已知關連於π] beta、gam_a、 delta及ValRS，顯示牽連於多重功能。 所认，為飞 CDKN3 反砑-ialpha、EF_lalphal 反
2125-993 7-PF 232 200920406 EF-7<9 7/^siO於NSCLC細胞之表現模式，以半定量RT_pcR 實驗分析表現 fflRNA。 EF-lalPJia2於钸癌之表現壤式，氟似於EF—】deita 23)。EF]離2 T能為一重要的人類致癌原、，表現 EF-lalphU使嚅齒動物纖維母細胞轉形並增加裸小鼠中 之腫瘤形成性（Lee，2〇〇3; Anand et al.，2〇〇2)。另一 方面，EF-lalpha可能由 節，但狀EF-lalpha如何調節作為多重功能蛋白質所知 不多（Minella et al.， 1 998)。最近之報告又指出： EF-lalPha2為Akt之一活化子，並以鮏卜及ρΐ3κ_依存性 方式’增強細胞侵入及遷入。為了決定是$ c刚3可能涉 及Akt活化，將CDKN3暫時過度表現於LC319細胞，並以 西方墨點分析決定Akt之磷酸化狀態。然後，調查磷酸化 Ser473作為Akt活化之代理標記。如顯示於圖i9D’細胞 暫％過度表現CDKN3之LC319，相較於轉染假-載體之控制 細胞，Ser473磷酸化水平增加。為了決定是否ρΐ3κ活性 對於細胞侵入時CDKN3-依存性增加為必要，吾人於存在 LY294002實施侵入分析。此等試驗險示：ρΐ3κ抑制以 LY2940G2-劑量依存性方式，顯著降低cd〇3_過度表現細胞 中之侵入程度（圖23,須分格）。另一方面’ LY294〇〇對於經 假載體轉染之控制細胞的侵入，具小的抑制作用（圖23，下 分格）。 [實施例27]以CDKN3顯性抑制胜肽抑制化(：1^細胞生長 然後，為了調查CDKN3及EF —ldeHa間之交互作用對
2125-9937-PF 233 200920406 於肺癌細胞生長或存活之功能顯著性，開發預期抑制此等2 蛋白質結合之生物活性細胞可通透胜肽。其次，合成包含 £F-ldelta密碼子73-1 60之19胺基酸序列之5不同的胜 肽（圈24A)。將此等胜肽共價連結在NH2末端至一膜傳導i丄 精月女酸殘基（11R)。評估添加511R-EF-1 de 1 ta胜肽至LC31 9 細胞培養基對生長之作用，其中以nR-EF —ldelta9HQ8胜 肽處理，造成MTT分析測量到細胞存活性顯著降低（圖24B， 頂分格）。添加UR-EF-ldelta.m至LC319細胞培養基， 以免疫沉殿實驗’降低内生性CDKN3及EF-ldelta間之複 合體形成（圈24B,下分格）。此等資料顯示： 11R-EF-Idelta9(1-Ifl8 能專一地抑制 CI)KN3&EF —ldelta 之 交互作用。 討論： 取近在鑑別及定性供癌症療法之新穎分子標靶的加 速，已著眼在開發新類型抗癌藥劑（KeUy，K.，et al,，j. Clin. Oncol· 19 : 321〇_3218 (2〇〇1))。到目前，已有許 多標靶療法針對肺癌調查中’但回應於且具治療效果之腫 瘤類型範圍仍非常受限。分子標靶藥物期待對於惡性細胞 具高專一性，而由於範圍限定之作用機轉，具極小不利作 用對於。亥目‘之方法，一有望之策略為··使用基因體範圍 表現刀析之力里，有效鑑別在癌症細胞過度表現的基因。 此外’使用組織微陣列分析數百保存臨床樣本，以供驗證 有潛力標乾蛋白質，並組合驗：技術，以高工作量筛選功 此失活效果。使用此方法，此‘顯示⑽常過度表現在
2125-993 7-PF 234 200920406 臨床肺癌樣本及細胞株，且該基因產物在肺癌細胞生長及 進展扮演不能欠缺之角色。 CDKN3 (亦稱KAP)屬於雙專一性蛋白質磷解酶之家族，起初 係鑑別為作為與ccik2或cdc2交互作用之蛋白質，代表 CDKN3可能在細胞週期調控扮演一角色（^盯^ ^ ^ 1993; Hannon et al.， 1994; Br〇wn et al·， 1999)。過 .度表現CMN3已在原位及侵入導管癌報告（Lee，& w.， f a1.’ Mo1 Cell Β1〇1· 20: 1 723-1 732 (2000 ))，然而其致 1 癌作用尚不明。 EF-ldelta，延長因子-1複合體之次單元，已知作用 為鳥嘌呤核苷酸交換因子，且負責胺基醯基tRNA至核糖體 之酵素傳遞，發現為CDKN3之新穎胞内標靶分子。胺基醯 基-tRNA在核糖體蛋白質合成中為胺基酸捐出者。tRNA分 子以胺基醯基-tRNA合成酶，以該對應的胺基酸胺基醯基 化。該胺基醯基-tRNA以延長因子—lalpha (]^_131沖3)轉 換成為三元複合體，以提供用於蛋白質合成之胺基酸立即 前驅物。延長因子-丨（EF —υ，由4不同的次單元之鳥嗓呤 -核苷酸交換複合體構成（EF-lbeta、EF-lga_a、 EF-ldelta，及 ValRS)，EF_lalpha，一 G_蛋白質，負責結 合胺基醯基 t-RNA 至核糖體（Brandsma et al.，1 995; RUs etal.，1990，Nygardetal.，1990; Motorinetal·，1988;
Motorin et al.，1991)。EF-1 beta-gamma-de1ta/Va1RS 以蛋白質激酶C (PKC)、酪蛋白激酶n (CK2)及CycHn依 存性激酶1 (CDK1)磷酸化。EF-Idelta作為EF-1複合體
2125-9937-PF 235 200920406 之成分，已知至少在哺乳動物被PKC磷酸化（Venema, R. C.， et al, J Biol Chem. 266, 11993-11998. (1991); Venema R.C., et al, J Biol Chem. 266， 12574-12580. (1991))。 另一方面’過度表現EF-ldel*ta可能轉形NIH3T3細胞 ， 並使裸小鼠中形成腫瘤，且以其反義mRNA阻斷EF-ldel ta， 會造成顯著反轉其致癌潛力（Joseph, P.，et al.，J Biol Chem. 277: 6 1 3 1 -61 36 (2002 ); Lei, Y. X. , et al.,
Teratog Carcinog Mutagen. 22: 377-383 (2002))。 另一方面’ EF-1 alpha涉及多重細胞功能，且由 EF-lbeta-gamma-delta/ValRS 調控（Minella 0，et al.， Biosci Rep· 3:1 1 9-27 (1 998))。最近的報告指出： EF-lalpha2 ’ EF-lalpha2種同分異構物中之一種，可刺激 乳癌細胞之中，細胞遷移及侵入（Amiri a, et al.，
Oncogene 26: 3027-40 (2007))，而，相對於非轉移控制 組’其過度表現於轉移大鼠乳腺癌細胞株（pencil SD， Breast Cancer Res Treat. 25: 165-74 (1993); Edmonds BT， et al·， J Cell Sci. l〇9: 2705-14 (1996))。 一先 Sii 之報 告顯示：增 加 EF-lbeta-gamma-delta/ValRS 活性，可能相關於由於 CMl 之EF-lgamma磷酸化，平行地，磷酸化EF—ldeHa可能造 成抑制ValRS’及專一性抑制聚（纈胺酸）合成（M〇nnier al·，200 1 )。另一方面，過度表現EF_ldeHa可能轉形 NIH3T3細胞，且並使裸小鼠中形成腫瘤。以其反義㈤⑽阻 斷EF-ldel ta’會造成顯著反轉其致癌潛力（Joseph et al·,
2125-9937-PF 236 200920406 20 02; Lei et al_ ’ 2002 )。另一方面，EF-laipha 涉及多 重細胞功忐，且由EF-lbeta-ga_a-delta/ValRS調控 CMinella et al·，1 998 )。最近的報告指出：EF_lalpha2， EF-lalpha2種同分異構物中之一種，可刺激乳癌細胞之 中，細胞遷移及侵入（Affiiri et al.， 2006)。再者， EF-1 a 1 pha2可能在轉移發展扮演一角色，且相對於非轉移 控制組，其過度表現於轉移大鼠乳腺癌細胞株（以此丨1 e七 al.， 1993; Edmonds et al.， 1996)。 以專一性siRNA處理此處之NSCLC細胞，以降低表現 或方以，造政生長抑制。經確認EF —丨h與 CDKN3在肺癌細胞共同表現，並為CMN3磷解酶邀痄之生 理基質，顯示CDKN3可能在肺腫瘤經去磷酸化EF_ldeHa 具一生長促進功能。由吾人之組織微陣列實驗得到之臨床 病理學證據，顯示具強CDKN3及/或EF_ldeU 一陽性腫瘤 之NSCLC病患，較針對CDKN3及EF_ldelta具陰性或弱染 色之病患，存活期間較短，暗示過度表現CDKN3及/或 EF-1 delta可能促使肺癌細胞高度惡性表型。再者，顯示可 穿膜llR-EF-ldelta.m胜肽能抑制形成CDKN3及 EF-1 de 11a功能複合體，並造成抑制癌症細胞生長。 該專一性siRNA降低表現CDKN3或EF-ldelta，造成 抑制NSCLC細胞生長。經確認EF_ldelta與CDKN3在肺癌 細胞共同表現’並為CDKN3磷解酶邀戌之生理基質，顯示 πΚΝ3可能在肺腫瘤經去磷酸化一生長促進功 月色。由吾人之組織微陣列實驗得到之臨床病理學證據，顯
2125-993 7-PF 237 200920406 示具強CDKN3及/或EF-ldelt -陽性腫瘤之NSCLC病患， 較針對CDKN3及EF-ldel ta具陰性或弱染色之病患，存活 期間較短’暗示過度表現CDKN3及/或EF-ldel ta可能促使 肺癌細胞高度惡性表型。組合本資料，顯示關連CDKN3與 EF-lbeta-gamma-delta/ValRS，能去磷酸化 EF-ldelta，並 活化腫瘤細胞之細胞功能’而造成該腫瘤生長及/或進展。
總結之，雙專一性蛋白質磷解酶，CDKN3，可能經由去 碟酸化其新發現之交互作用分子EF —ldelta，而對於肺癌生 長促進路徑扮演一重要角色。CDKN3及EF —丨心丨“在臨床作 為預後的生物標記為有用，且標靶於CDKN3之酵素活性， 或CDKN3與EF-ldelta之交互作用’應能為供開發新類型 抗癌藥物之有望治療方法。 產業利用托 如此處所證實，細胞生長由專一地標靶於EBi3、cDkn3 及/或EF-ldelta基因之雙股分子所抑制。因此，此等新穎 雙股分子’針對開發抗癌症醫藥，為有用的候選者。例= 阻斷表現£813、〇1^5、評了)[141)1^3及/或盯、1(161^蛋 白質及/或阻止其活性之㈣’可作為抗癌藥劑之治療用 途’尤其供治療肺癌之抗癌藥劑’更具體而言1治療嶋c 及SCLC之藥劑。 因助、DLX5、随^腦及之 衣兄 在肺癌相較於正堂哭& ητζ ^ r 平又於正吊态吕，顯著提高。因此， 因可便利地作為肺癌之令斷n 土 甲夂之0斷才示§己，且所編碼之 在診斷分析肺癌上具用處。 .、
2125-9937-PF 238 200920406 再者，此處所敘述之 法’對於診斷肺癌亦有用，包 括小細胞肺癌（SCLC)及非]έ A仏 .r ^ ^ 非小細胞肺癌（犯CLC)，及預測患此 寺疾病之病患不良預德。 、 ，本叙明提供可能之候選者， 供發展癌症包括肺癌之治療方法。 於—態樣’本發明係關於癸 、^現Εβ 13水平在肺癌病患相 較於正常控制組之血清中，在祖古从 為美同的。因此，該ΕΒΙ3蛋白 質作為診斷標記為有用，尤盆 尤其針對肺癌之血清學標記。使 用£ Β13血清水平作為指標，本於明接祖士、+ 尽^明挺供方法，供診斷及監 控癌症病心中之癌症治療進展。先前技術未能提供針對肺 癌之適當血清學標記。本發明之新穎血清學標言己漏，可 改進偵測肺癌之靈敏度。此外，組合ΕΒί3及cea或 pro-GRP ’有助增加偵測胰臟癌之靈敏度。 再者，EBI3、DLX5、CDKN3, NPTX1 或 EF一ldelta 多胜 肽為有用之標靶，供開發抗癌醫藥。例如，結合13、 NPTX1、CDKN3 或 EF-ldelta 或阻斷該表現 EBI3、DU5、 NPTX1、CDKN3或EF-ldelta或阻止其活性或抑制CDKN3及 EF-ldel ta間結合之藥劑，可能在作為抗癌症藥劑之治療 用途為有用’尤其供治療肺癌之抗癌藥劑。 所有在此引用之出版品、資料庫、序列、專利及專利 申請案，納入作為參考。 雖本發明已詳述並參照特定實施形態，但應瞭解，對 於該技術領域中具有通常知識者，可在不偏離本發明精神 及範圍内’作各種變化及修飾’本發明之界限設定於附帶 的申請專利範圍内。 2125-9937-PF 239 200920406 【圖式之簡單說明】 、本發明之各種態樣及應用，在考量圖式簡單說明及本 發明誶細钦述及較佳實施形態後，對於熟悉此項技藝之人 士將會顯明。 圈1:分析腫瘤組織、細胞株及正常組織中之ebi3表 現。A部分，以半定量RT_pCR分析偵測，表現肋以於η 對臨床肺癌及周邊正常肺組織樣本（琢分搭）[肺腺癌 (ADC)、肺鱗狀細胞癌（scc)，及肺小細胞肺癌（scLCh頂] 及23肺癌細胞株分朴B部分，描寫癌症細胞株及支 氣管上皮細胞中’内生性EBI3蛋白質表現及次細胞定位。 於NCI-H1373及LC319細胞株，EBI3在細胞質以顆粒外觀 染色，在NCI-H2170及支氣管上皮衍生BEAS_2B細胞株無 染色。C部分，描寫以ELISA_培養基中，來自肺癌細胞 株分泌之EBI3。於顧表現細胞株之培養基债測到分泌 EBI3。 分格D描寫16個正常成人人類組織中，⑽^轉錄物之 北方墨點分析結果。在胎盤觀察到強訊號。分格£描寫以 免疫組織化學比較正常及腫瘤組織間之ΕβΙ3蛋白質表現。 圖2描寫EBI3過度表現與NSCLC病患不良預後間之關 連。A部分代表肺癌組織及正常組織中，強、弱，及無則 表現之例。原始放大倍率、χ1〇〇 (上道）、χ2〇〇 (下道）。 分格Β描寫依照表現ΕΒΙ3，患NS(：lc之病患存活之 Kaplan-Mder 分析結果（P —_ 〇〇〇11 ’ L〇g_rank 檢定）。 圖3 ··患肺癌之病患及健康控制組或患c〇pD之非腫瘤
2125-993 7-PF 240 200920406 肺病病患中’ EL ISA決定之EBI 3血清濃度。a部分，肺y\DC、 肺SCC或SCLC病患中，血清中之EBI3分布。黑線，平均 血清水平。以下間具顯著差異：ADC病患舆健康個體/ copd 病患間（户< 0. 001 ’ Mann-Whi tney U檢定）、SCC病患與健 康個體/C0PD病患（/^〈ο.οοι)間，SCLC病患與健康/copd 個體（户< 0.001)間，而以下不具顯著差異：健康個體與 病患間（尸=0. 160)。B部分，於肺ADC、肺SCC或SCLC之 各種臨床階段，病患血清中之EB丨3分布。LD代表受限之疾 病；ED :大規模的疾病。 圖4描寫肺癌病患或手術後病患中之EBI3血清濃度、 比較EBI之R0C曲線分析與CEA (於Nsac)或pr〇 — GRp (SCLC)者，及以對抗EBI3之siRNA抑制肺癌細胞生長。a 部分’左分格代表EBI3之廳曲線分析，作為肺癌血清標 X軸.1專〖生，Y軸：靈敏度。設定截止水平以提供針 對EBI3之最適診斷正確性及可能比例（極小偽陰性及偽陽 性結果）[即U.8單元/朴A部分，右分格代表初級nsclc 刀除月!後EBI 3之血清水平。手術後血清，係於手術後2 個月得到°6部分’血清EBI3水平（U/mL)及相同Nsac 病患中’初期腫瘤組織之EBI3表現程度。c部分，冴分 格.EBI3 (監）及其他習知腫瘤標記（cea為紅色、a 綠色，及ProGRP龙λ、 汽色）之R〇c曲線分析，作為針對各肺 組織學類型之血清 乂 ‘ δ己。X轴：1-專一性；γ軸：靈敏度。 洛ΕΒ13及其他腫瘤標記之組合分析。右棒，靈敏 偽陽性兩者，代异/ : I —又及 、在肺癌各組織學類型中，使用εβ〗3及
2125-9937-PF 241 200920406 遁瘤標記中任一 （CEA、CYFRA，及ProGRP)之靈敏度或偽陽 性組合分析。 D部分描寫以對抗EB13之siRNA抑制肺癌細胞生長。 項'分洛’议半定量RT-PCR分析以si-EBI3 (#1及#2)及控 制 siRNA(si-CNT/On-Target，si-LUC/Luciferase)在 A549 細胞及LC31 9細胞之從/j表現基因擊倒作用。万分褡，.缠 S1-EBI3或控制siRNA轉染之A549細胞及LC319細胞之群
落形成與MTT分析。柱：三重複分析之相對吸光；棒：SJ)。E 部分’ 2獨立轉染體表現高水平EBI3 (COS-7-ΕΒΙ3-#1及 -#2，濟分搭），及控制組（c〇s_7_M1及咄2)，各培養三 重複；120小時後，以MTT分析及群落形成分析評量細胞 存活性（T分#)。 闽5 :代表肺腫瘤及正常組織中之dlxs表現。a部分 描寫，以半定量RT—PCR檢驗，於NSCLC (腺癌與鱗狀細胞 癌）及正常肺組織之臨床樣本表現distal_iess “此吡⑽ 5 (DU5)。b部分描寫以半定量RT_pcR分析’肺癌細胞株 中之DLX5表現。表現beta_^動蛋白（ACTB)作為定量控 制。c部分描寫以共焦顯微鏡檢驗之DLX5蛋白質次細胞分 布。D部分描寫以北方墨點分析，於正常人類組織偵測到之 DLX5表現。 固6··代表免疫組織化學評估DU5蛋白質表現，及1 過度表現與NSCLC病患不良預後之關連’及於SBC —5癌症 細胞中’以對抗DLX5之si腿抑制生長。八部分描寫= 正常人類組織及肺SCC’以免疫組織化學染色使用：多株抗
2125-9937-PF 242 200920406 DLX5抗體偵測到表現DLX5 ;以雇木素對比染色（x2〇〇)。陽 性染色顯現於胎盤（箭頭）中 (syncytiotrophoblast) 之細胞質及/或細胞核，及肺癌 細胞。B部分描寫肺癌（SCCs，X1 0〇)及正常肺（χ 1 〇〇)中，該 DLX5表現之代表例，及SCC陽性案例（Χ2〇〇)放大圖。c 部分代表依照DLX5表現程度，分析NSCLC病患中，腫瘤專 I"生存活之Kap 1 an-Mei er分析結果。J)部分，代表於sbc-5 個細胞中，以半定量RT-PCR偵測到之DLX5表現程度。以 控制 siRNA (si-EGFP 或 si-Scramble/SCR)或 Si-DLX5 治療 之效果，顯示於該頂分格。對抗DLX5之siRNA在細胞存活 性之作用，以MTT分析偵測到者，顯示於下分格。 圖7:代表肺腫瘤中2ΝΡΤΧ1表現。A部分，上带分褡 描寫以半定量RT-PCR檢驗，肺癌（丨〇 NSCLC及5 SCLC ) ( 之1 5臨床樣本及其對應正常肺組織（#)中之表現。 各單股cDNA之適當稀釋物，由臨床肺癌樣本之mRNA製備， 以β-肌動蛋白UCTS)水平表現作為定量控制。A部分，^ 部分#無蓴以半定量RT_PCR檢驗’ 23肺癌細胞株中之 靠/表現。B部分描寫以西方墨點分析4肺癌細胞株中之 NPTX1蛋白質表現。c部分描寫内生性Νρτχι蛋白質於4 肺癌細胞株之次細胞定位。NCI_H226、nci_h52〇、及sbc_5 個細胞中，NPTX1 以顆粒外觀在細胞質染色，但nci_h217〇
2125-9937-PF 243 200920406 -中 田 疋夏RT-PCR檢驗於9臨床肺癌（下分格）及μ肺癌細 胞株（頂分格）之脱m及N/w表現。 圖8 ·代表正常組織及肺癌組織中之Νρτχι表現。a部
刀個寫以北方墨點分析偵測正常人類組織之NPTX1表現。B 4刀代表代表性肺腺癌（AI)C)組織及5正常組織；心、肝、
腎、腎上腺中’免疫組織化學評估NPTX1蛋白質之結果。C '^刀代表於代表性肺腺癌ADC、肺鱗狀細胞癌（sc〇及小細 I肺癌（SCLC)中，使用於組織微陣列上之抗Νρτχι抗體（原 始放大倍率χ200)免疫組織化學染色ΝΡΤΧ1之結果。D部
分’孩分洛代表肺ADC中，強、弱及無表現Νρτχ1之例。D 部分，Τ新分#為依照ΝΡΤΧ1表現，患NSCLC之病患的腫 瘤專一性存活 KaPlan_Meier 分析（户 < 0.0001; Log-rank 檢定）。 圈9 :患肺癌之病患及健康捐出組或患c〇pD之非腫瘤 肺病病中，ELISA決定之NPTX1血清濃度。a部分描寫肺 ADC、肺SCC或SCLC病患中，血清中之ΝΡΤχι分布。以下 間具顯著差異：ADC病患與健康個體/c〇pD病患間（户〈 0.001，Mann-WhitneyU檢定）、SCC病患與健康個體/⑶抑 病患（户=0_005 )間，SCLC病患與健康/c〇pD個體（p = 0.005 1 )間。而以下不具顯著差異：健康個體與c〇抑病患 間。B部分描寫於肺癌之各種臨床階段，病患血清中之n打“ 分布。LD代表受限之疾病；ED:大規模的疾病。c部分， 病患手術前後之NPTX1血清濃度（術後2個月）。D部分，血 清NPTX1水平及相同NSCLC病患中於初期腫瘤組織之
2125-9937-PF 244 200920406 NPTX1表現程度（原始放大倍率X 100)。 圓10.代表NPm之自泌細胞生長作用“部 以對抗处mu舰抑制肺癌細胞生長。人部分之^寫 格’描寫A549 and SBC_5個細胞中，以Μ分析回： 於 sin 1 #户 TX/s (S1 —i _2)或控制 si 舰 $ (LUC 或咖） 之射 i7表現。A部分之中間分格，描寫群落-形成分析A 5 4 9 及SBC 5個細胞之群落影像，該A549及個細胞經針 對NPTX1之特定slRNA轉染或控制質體轉染。a部分之下分 格，代表以ΜΠ分析評估A549或SBC-5個細胞回應於 NPTX1 ~LUC或-SCR之存活性。所有分析實施3次， 於三份類似之井。B部分代表暫時過度表現於C0S-7細胞之 NPTX1之生長促進作用。現分搭，由西方墨點分析偵測於 C0S-7細胞之ΝΡΤΧ1奮碜表現。万分褡，以Μπ(左）及群落 形成分析（右）評估之cos_7細胞存活性。c，左分褡，Νρτχι 對哺乳動物細胞生長之自體分泌/旁分泌作用。細胞存活性 以ΜΤΤ分析計數（經Νρτχι處理之c〇s_7細胞，最終濃度〇、 〇. 1或1 nM)(左道，托雀PBS)。MTT分析評估於C0S-7細 胞（左浚户違，痄肩抗Νρτχι mAb及IgG)之培養基中，抗 NPTX1單株抗體（®Ab-75-1，· 5 0 nM)及控制IgG (正常小鼠； 50 nM)對NPTX1蛋白質活性（0、 〇. 1或1 nM)之競爭性中 和作用。才分洛'犮NPTX1單株抗體（25 nM或50 nM)以劑 置依存性方式’抑制過度表現NPTX1之肺癌A549細胞邀今 生長。各實驗進行三重複。D部分，以抗NPTX1抗體抑制 各種肺癌細胞邀今生長。mtt分析評估抗· NPTX1單株抗體
2125-993 7-PF 245 200920406 d1; 5〇 nM)對於Νρτχ卜過度表現肺癌細胞株 SBC-5 (h Q.Q12;各成對卜測試）及㈣卜非表現肺癌细 胞株、SBC-3及NCI-H2170生長之作用。各實驗進行三重複。 圈11:代表經NPTX卜表現質體轉染之哺乳動物細胞侵 入性增強。分析證明經針對人類Npm之表現質體轉染之 NIH-3T3細胞’在Matrigel基質之侵入本性。切分潜，
以西方墨點分析偵測於該NIH —3T3細胞Νρτχι之暫時表 現。r❹潜，Giemsa染色⑽0)，及經包覆Matrigel 之濾膜移動的細胞數。分析進行三次，在三相似井中。 圈12·移植到裸小鼠之抗A549細胞之抗NPTX1單株 抗體作用。現分褡，·會示每叆么次以抗Νρτχι單株抗體 (mAb-75-l; 300 micro g/體重）或正常小鼠 igG (控制 _1; 300 micro g/體重）處理之3小鼠之平均腫瘤體積，及未 經治療者（控制-2)之平均腫瘤體積。值以平均值± s.e.腫 瘤體積表示。動物每週2次以腹膜内注射各該抗體，達30 天。7分# ,，經以抗NPTX1抗體處理之HE染色腫瘤（A549) 之組織病理學檢查。以ΝΡΤχι抗體治療之3〇天後， fibromatic改變，相較於以控制處理或未經處理之腫 瘤、’且織，以抗ΝρΤχ丨抗體處理之腫瘤組織，觀察到之癌症 細胞更顯著降低。 圖13.代表ΝΡΤΧ1及NPTXR於生長促進路徑之交互作 用Α邛分’以表現ΝΡΤΧ1或NPTXR之C0S-7細胞’實施 共焦顯微鏡檢。綠：NPTX1(myc);紅：NpnRe左分#，
C〇S 7細胞以Tr iton X — 1⑽通透，並以偵測NPTX1之抗myc 2I25-9937-PF 246 200920406 抗體染色。左分袼’ C0S-7細胞以針對NPTXl (myc-tag)及 NPTXR抗體之抗體’對胞外表現染色。b部分，c，使用使 用表現或,Γ/Α之C0S-7細胞（B)及SBC-5個細胞 (C) ’實施共焦顯微鏡檢。i分潜’以NPTX1 (myc)及NPTXR 抗體將C0S-7細胞及SBC-5個細胞進行胞外表現染色。名· 分潜’貫施甘胺酸處理’以移除細胞表面上之N P T X1。D部 分’以對抗ΛΤΤΙτΡ之s i RNA ’抑制肺癌細胞生長。項分洛， 议RT-PCR分析A549及SBC-5個細胞中，回應於s卜斯灯7 (si-Ι 及 si-2)或控制 siRNA (si-LUC 及 si-SCR)之 yVT^TX/ 4獍。中間分#。，經以莩一於NPTXR之s iRNA或控制s i rnA 轉染之A549及SBC-5個細胞的群落形成分析影像。·^分 #，回應於si-#/Ti7P、W或苁MTT分析評估A549 或SBC-5個細胞之存活性。所有分析實施3次，於3相似 井。 圈14:與NPTXR結合後NPTX1之内化 A部分，B，接受者C0S-7細胞（A)或SBC-5個細胞（B) 與來自於於7T/ -轉染（/)捐出者C0S_7細胞或SBC—5個細 胞之條件化培養基一起溫育。於以捐出者之條件化培養基 處理接受者細胞3小時後，彳貞測c-myc加標籤NPTX1。绩· NPTX1。以DAPI將核可見化。U)將細胞以抗myc抗體進行 胞外表現染色，供偵測NPTX1。U)將細胞以Triton Hoo 通透化’並針對NPTX1 (myc)染色。（c)以PBS處理3 時。C部分，接受者C0S-7細胞顯示以時間依存性方式， 從經捐出者yK/TX/ -轉染（/) C0S-7細胞之條件’化典養 2125-9937-PF 247 200920406 =攝取分泌好™。以來自捐出者㈣7 -㈣⑺⑽-7 之條件化培養基處理接受者⑶s_7細胞！或3小時 傻’以西方！取μ 03【上 土”’ 用抗fflyc抗體伯測到内化之肝TX1 〇 立 $刀於來自ΝΡΤΧ卜表現C0S-7細胞之條件 晰 中以西方墨點分析偵測分泌外生性ΝΡΤΧ1蛋白 、 刀以免疫沉殿分析偵測到表現外生性ΝΡΤΧ1之 C〇S —7細胞中，結合ΝΡΤΧ1至NPTXR蛋白質。 、圖Κ卩表肺癌及腦轉移之CDKN3纟王見。a部分描寫 ^半疋里RT-PCR檢驗，NSCLC⑴之臨床樣本及對應正 吊肺、’且織（N)之CDKN3表現。B部分描寫以半定量rt-pcr 双驗早期勒級NSCLC (階段I] na)、進展初級NSCLC (階 奴11 lb IV)，及來自ADC (τ)之轉移腦腫瘤及正常肺組織 (Ν)之該臨床樣本中之CMN3表現（頂分格>pcR產物之密 度強度，以影像分析軟體定量（下分格）。c部分描寫北方墨 點分析偵測正常人類組織之CDKN3表現。 圖17:代表肺癌中之CDKN3表現，及其與Nsac病患 之不良臨床後果間之關連。A部分描寫使用小鼠單株抗 CDKN3抗體；以免疫組織化學染色，以蘇木素對比染色 (x200) ’偵測6正常人類組織及NSCLC案例之CDKN3表現。 β部分描寫使用於組織微陣列上之抗CDKN3抗體（χ1〇〇)， 代表性經手術切除之NSCLC (肺scc)及正常肺之免疫組織 化學染色結果。C ’依照CD〇3表現，患NSCLC之腫瘤專— 性存活 Ka.plan-Meier 分析（p < 0_ 000 i ，Log — rank 檢定）。 闽 18:代表鑑別 ef-lbeta、gamma、delta/ValRSf4 2125-9937-PF 248 200920406 與CDKM3交互作用之新穎分子4部分描寫篩選與cdkn3交 互作用之蛋白質。M0-、50-、3卜及25_kDa帶，以銀染色 顯示，將其在以抗CMN3單株抗體免疫沉澱之LC319細胞 之細胞溶解物可見，但以正常小鼠IgG免疫沉澱之細胞未 見者，萃取之。MALDI-T0F質譜定序胜肽序列，定義各別帶 為 VARS、EF-lgamma、EF-ldeUa、EF_lbeta。CMN3 蛋白 質以星號標記。分子量標記（inkDa)之位置，顯示在左側。 B部分描寫以半定量RT — PCR分析偵測NS(：lc細胞株中之 CDKN3、ValRS、EF-lg麵a、EF-ldelta、EF-lbeta 及其相 關分子，CDK1，之表現。
圈19:代表肺癌t之EF〜ldeita表現，及與㈣^^病 患之不良臨床後果間的關連。A部分描寫以西方墨點分析偵 測肺癌細胞株中之CDKN3及EF-ldelta蛋白質表現。B部 分描寫使用抗EF-ldelta抗體on組織微陣列（χ1〇〇)，包 括NSCLC (肺SCC)及正常肺之代表性手術切除樣本的免= 組織化學染色結果。C部分描寫NSCLC病患十，EF_ldelta 表現與不良臨床後果間之關連。顯示NSCLC病患依照 EF-ldelta表現之腫瘤專一性存活Kaplan_Meier分析= 〇· 0006，Log-rank 檢定）。 圈20:代表以CMN3去磷酸化EF-ldelta。A部分描寫 肺癌細胞中，CDOS與EF-ldel ta關連，係藉免疫沉澱内生 性CDKN3及來自LC319細胞萃取物之EF_ideHa確認。ίρ; 免疫沉澱，IB;免疫墨點。Β部分描寫各細胞週期相中，’ LC319細胞之中，内生性CDKN3 (綠）及内生性EF_ideita (紅〆 2125-9937-PF 249 200920406 共同定位。C部分描寫填酸化外生性及内生性£ f -1 d e 11 a。 將過度表現外生性EF-1 de 1 ta之COS-7細胞的萃取物（j分 #)及來自LC319細胞之該等萃取物（右分袼），以Lafflbda 蛋白質磷解酶（lambda-PPase)處理。在該細胞之經 1 a m b d a - P P a s e處理卒取物中’偵測到偏移之帶。開及閉箭 頭各代表磷酸化EF-ldelta及去磷酸化EF-ldelta。D部分 描寫LC319細胞中，以外生性過度表現的CDKN3去磷酸化 ( 内生性EF-ldeltac>CDKN3 —表現載體，被轉染到LC319細胞。 圖21··鑑別EF-ldelta中之CDKN3-結合區。a部分描 寫C0S-7細胞中之外生性EF-ldelta去磷酸化，該細胞暫 時過度表現CDKN3。將弱表現内生性CDKN3及EF-ldelta之 C0S-7細胞，以Flag-HA加標籤CDKN3-表現载體、Flag_HA 加標籤EF-ldelta-表現載體，或2表現載體兩者轉染。來 自此等細胞之全部細胞萃取物，用於以抗HA抗體進行西方 墨點分析（左分格）。斜線、開及閉箭頭’各代表CD〇3、磷 酸化E卜idelta，及去磷酸化EF-ldelta。將以抗Flag抗 體免疫沉澱之此等細胞萃取物，使用抗磷酸絲胺酸抗體免 疫墨點（右分格）。開箭頭代表磷酸化EF_ldelta。π;免疫 沉澱，IB;免疫墨點。B部分描寫EF_ldeHa之序列方案。 顯不EF-1 delta之一全長及4刪除建構物。c部分描寫以 免疫/儿焱實驗，鑑別EF__ldel1：a中結合於⑶題3 ，欠缺EF-ldel1：a中之N末端160 LC319細胞中内生性CDKN3交互 EF - ldeltal6 卜 281 建構物， EF-1 delta中之包含白胺酸拉鏈結 胺基酸多胜肽，不保留與] 作用之任何能力，顯示
2125-9937-PF 250 200920406 構之此89胺基酸多胜肽（密碼子72-16 0)，應於與CDKN3 之交互作用扮演一重要角色。IP;免疫沉澱，IB ;免疫墨 點。 圖22:繪示CDKN3或EF-ldelta對肺癌細胞生長之作 用。A左頂分格，以半定量RT-PCR，分析LC319細胞中， 回應於si-CDKN3 (si-A及-B)或控制siRNA (EGFP、螢光素 酶（LUC)或 scramble (SCR))之 CDKN3 表現。A 部分，右 頂分格’描寫以MTT分析評估回應於Si — CDKN3、-EGFR、-LUC 或-SCR，LC31 9細胞之存活性。A部分，下分格，經專一性 siRNA或控制質體轉染之LC319細胞之群落形成分析。B部 分’左頂分格描寫以半定量RT-PCR，分析LC319細胞中， 回應於 si-EF-ldelta (si-1 及-2)或控制 siRNACEGFP、螢 光素酶（LUC)或 scramble (SCR))之 EF-ldelta 表現。B 部 为’右頂分格’描寫以MTT分析評估回應於si-EF-ldelta 或控制siRNA，LC319細胞之存活性。B部分，下分格描寫 經si-EF-ldelta或控制siRNA轉染之LC319細胞之群落形 成分析結果。 圈23:證明CDKN3增加細胞侵入活性及活化Akt之能 力。A部分代表Matrigel侵入分析之結果，證明增加經假 載體或CDKN3-表現載體轉染之NIH-3T3細胞之侵入能力。 顯示經Matr i ge 1 -包覆濾膜之侵入細胞數。B部分描寫以半 定量RT-PCR分析偵測NSCLC細胞株中之狀-及 表現。c部分描寫CDKN3與EF-lalpha在肺癌 細胞中之關連’以免疫沉澱使用LC31 9細胞萃取物確認。
2125-9937-PF 251 200920406 IP; 免疫沉殿 TR . A、成W m， u，免疫墨點（左分潜）。1)部分描寫經 CDKN3™·表現載體轉毕之了門1〇 寻杀之1X319細胞中之Akt-磷酸化。來自 CDKN3表現細胞之合計蛋白質萃取物，以西方墨點分析使 用抗他、抗碟酸_Akt (Ser4?3)、抗⑽抗體或抗c —一 抗胆债測來自經假載體轉染之細胞的蛋白質萃取物，作 為控制組，b e t a - ηπ 命》tF ^ Λϊ. 肌動蛋白作為載入控制。Ε部分，將經假 載體或CDKN3-丧if恭九 ^見載體轉氷之ΝΙΗ-3Τ3細胞，與LY294002 或 DMSO (vehicle)—扣箱，、田 t 、， t預月’並用於matrigel侵入分 析，證明增加侔入台t 士 _ 此力。顯不經Matrigel包覆濾膜侵入之 細胞數。 圈24. !監別EF-ldeita巾之CMN3-結合區 A。卩刀代表一不意圖：為5個細胞可通透胜肽在其NH2末端 共偏km至一膜傳導u多精胺酸序列。顯示ef —1化1忭 中之白胺酸拉鏈結構序列’及來自EF-ldelta之5個細胞 可通透胜肽。B部分代表以Μττ分析評估回應於5個細胞 可通透胜肽之LC319細胞存活性（現分潜）。降低複合體形 成，以免疫沉澱’在LC319細胞中之内生性CDKN3及 EF ldelta蛋白質間發現，該lC319細胞經以 llR-EF-ldelta9e_1D8 胜肽處理（7分褡）。 【主要元件符號說明】 無
2125-993 7-PF 252 200920406 序列表 <110>腫瘤療法·科學股份有限公司 <120> EBI3, DLX5, NPTX1 and CDKN3 for Target Genes of Lung Cancer Therapy and Diagnosis
<130> ONC-A0714-TW <150〉 US 60/957,956 <151> 2007-08-24 <150〉 US 60/977,360 <151> 2007-10-03 <160> 91 <170〉 Patentln version 3.5 <210〉 1 <211> 1149 <212〉 DNA <2Ϊ3>人類 <400〉 1 ccgcagccat gaccccgcag cttctcctgg cccttgtcct ctgggccagc tgcccgccct 60 gcagtggaag gaaagggccc ccagcagctc tgacactgcc ccgggtgcaa tgccgagcct 120 ctcggtaccc gatcgccgtg gattgctcct ggaccctgcc gcctgctcca aactccacca 180 gccccgtgtc cttcattgcc acgtacaggc tcggcatggc tgcccggggc cacagctggc 240 cctgcctgca gcagacgcca acgtccacca gctgcaccat cacggatgtc cagctgttct 300 ccatggctcc ctacgtgctc aatgtcaccg ccgtccaccc ctggggctcc agcagcagct 360 tcgtgccttt cataacagag cacatcatca agcccgaccc tccagaaggc gtgcgcctaa 420 gccccctcgc tgagcgccag ctacaggtgc agtgggagcc tcccgggtcc tggcccttcc 480 cagagatctt ctcactgaag tactggatcc gttacaagcg tcagggagct gcgcgcttcc 540 accgggtggg gcccattgaa gccacgtcci tcatcctcag ggctgtgcgg ccccgagcca 600 ggtactacgt ccaagtggcg gctcaggacc tcacagacta cggggaactg agtgactgga 660 gtctccccgc cactgccaca atgagcctgg gcaagtagca agggcttccc gctgcctcca 720 gacagcacct gggtcctcgc caccctaagc cccgggacac ctgttggagg gcggatggga 780 tctgcctagc ctgggctgga gtccttgctt tgctgctgct gagctgccgg gcaacctcag 840 atgaccgact tttccctttg agcctcagtt tctctagctg agaaatggag atgtactact 900 ctctccttta cctttacctt taccacagtg cagggctgac tgaactgtca ctgtgagata 960 ttttttattg tttaattaga aaagaattgt tgttgggctg ggcgcagtgg atcgcacctg 1020 taatcccagt cactgggaag ccgacgtggg agggtagctt gaggccagga gctcgaaacc 1080 2125-9937-PF 1 1140 200920406 1149 agtccgggcc acacagcaag accccatctc taaaaaatta atataaatat aaaataaaaa aaaaaaaaa <210> 2 <211> 229 <212〉 PRT <213>人類 <400〉 2
Met Thr Pro Gin Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Trp Ala Ser Cys Pro 15 10 15
Pro Cys Ser Gly Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg 20 25 30
Val Gin Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro lie Ala Val Asp Cys Ser Trp 35 40 45
Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe lie Ala 50 55 60
Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu 65 70 75 80
Gin Gin Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr He Thr Asp Val Gin Leu 85 90 95
Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp 100 105 110
Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe lie Thr Glu His He He Lys 115 120 125
Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gin 130 135 140
Leu Gin Val Gin Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu lie 145 150 155 160
Phe Ser Leu Lys Tyr Trp lie Arg Tyr Lys Arg Gin Gly Ala Ala Arg 165 170 175
Phe His Arg Val Gly Pro lie Glu Ala Thr Ser Phe lie Leu Arg Ala 180 185 190 2125-9937-PF 2 200920406
Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gin Val Ala Ala Gin Asp Leu 195 200 205
Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr 210 215 220
Met Ser Leu Gly Lys 225 <210> 3 <211> 1419 <212> DNA <213>人類 <400〉 3 cggagacaga gacttcacga ctcccagtct cctcctcgcc gcggccgccg cctcctcctt ctctcctcct cctcttcctc ctcctccctc gctcccacag ccatgtctgc ttagaccaga gcagccccac agccaactag ggcagctgcc gccgccacaa cagcaaggac agccgctgcc gccgcccgtg agcgatgaca ggagtgtttg acagaagggt ccccagcatc cgatccggcg acttccaagc tccgttccag acgtccgcag ctatgcacca tccgtctcag gaatcgccaa ctttgcccga gtcttcagct accgattctg actactacag ccctacgggg ggagccccgc acggctactg ctctcctacc tcggcttcct atggcaaagc tctcaacccc taccagtatc agtatcacgg cgtgaacggc tccgccggga gctacccagc caaagcttat gccgactata gctacgctag ctcctaccac cagtacggcg gcgcctacaa ccgcgtccca agcgccacca accagccaga gaaagaagtg accgagcccg aggtgagaat ggtgaatggc aaaccaaaga aagttcgtaa acccaggact atttattcca gctttcagct ggccgcatta cagagaaggt ttcagaagac tcagtacctc gccttgccgg aacgcgccga gctggccgcc tcgctgggat tgacacaaac acaggtgaaa atctggtttc agaacaaaag atccaagatc aagaagatca tgaaaaacgg ggagatgccc ccggagcaca gtcccagctc cagcgaccca atggcgtgta actcgccgca gtctccagcg gtgtgggagc cccagggctc gtcccgctcg ctcagccacc accctcatgc ccaccctccg acctccaacc agtccccagc gtccagctac ctggagaact ctgcatcctg gtacacaagt gcagccagct caatcaattc ccacctgccg ccgccgggct ccttacagca cccgctggcg ctggcctccg ggacactcta ttagatgggc tgctctctct tactctcttt tttgggacta ctgtgttttg ctgttctaga aaatcataaa gaaaggaatt .catatgggga agttcggaaa actgaaaaag attcatgtgt aaagcttttt tttgcatgta agttattgca tttcaaaaga cccccccttt ttttacagag gacttttttt gcgcaactgt 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 2125-9937-PF 3 1260 1320 200920406 1380 1419 ggacactttc aatggtgcct tgaaatctat gacctcaact tttcaaaaga cttttttcaa tgttatttta gccatgtaaa taagtgtaga tagaggaatt aaactgtata ttctggataa ataaaattat ttcgaccatg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213〉人類 <400〉 4
Met Thr Gly Val Phe Asp Arg Arg Val Pro Ser lie Arg Ser Gly Asp 15 10 15
Phe Gin Ala Pro Phe Gin Thr Ser Ala Ala Met His His Pro Ser Gin 20 25 30
Glu Ser Pro Thr Leu Pro Glu Ser Ser Ala Thr Asp Ser Asp Tyr Tyr 35 40 45
Ser Pro Thr Gly Gly Ala Pro His Gly Tyr Cys Ser Pro Thr Ser Ala 50 55 60
Ser Tyr Gly Lys Ala Leu Asn Pro Tyr Gin Tyr Gin Tyr His Gly Val 65 70 75 80
Asn Gly Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Ala Lys Ala Tyr Ala Asp Tyr Ser 85 90 95
Tyr Ala Ser Ser Tyr His Gin Tyr Gly Gly Ala Tyr Asn Arg Val Pro 100 105 110
Ser Ala Thr Asn Gin Pro Glu Lys Glu Val Thr Glu Pro Glu Val Arg 115 120 125
Met Val Asn Gly Lys Pro Lys Lys Val Arg Lys Pro Arg Thr lie Tyr 130 135 140
Ser Ser Phe Gin Leu Ala Ala Leu Gin Arg Arg Phe Gin Lys Thr Gin 145 150 155 160
Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly Leu 165 170 175
Thr Gin Thr Gin Val Lys He Trp Phe Gin Asn Lys Arg Ser Lys lie 2125-993 7-PF 4 200920406 180 185 190
Lys Lys lie Met Lys Asn Gly Glu Met Pro Pro Glu His Ser Pro Ser 195 200 205
Me o pr p As r o 03 - I s 2 •1 c s p Tr Ti va β i-1 o pl Γ o 6 2 s 2 Π Gl 0 pr Γ 6 s Π s s 5 VI^ IX c 2 Qa 1 -_ c s u Le Γ e s OJO Γ r o c 3 s 2 Γ e s y Gl Π Gl o P1- u 5 n OA- G 2 s o H124 _d 11 s Hi 0 pl s Hi s 5 1 3 H 2
Pro Pro Thr Ser Asn Gin Ser Pro Ala Ser Ser Tyr Leu Glu Asn Ser 245 250 255
Ala Ser Trp Tyr Thr Ser Ala Ala Ser Ser He Asn Ser His Leu Pro 260 265 270
Pro Pro Gly Ser Leu Gin His Pro Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Leu 275 280 285
Tyr <210> 5 <211> 844 <212> DNA <213>人類 <400〉 5 gcacgagctg cagagggagg cggcactggt ctcgacgtgg ggcggccagc gatgaagccg 60 cccagttcaa tacaaacaag tgagtttgac tcatcagatg aagagcctat tgaagatgaa 120 cagactccaa ttcatatatc atggctatct ttgtcacgag tgaattgttc tcagtttctc 180 ggtttatgtg ctcttccagg ttgtaaattt aaagatgtta gaagaaatgt ccaaaaagat 240 acagaagaac taaagagctg tggtatacaa gacatatttg ttttctgcac cagaggggaa 300 ctgtcaaaat atagagtccc aaaccttctg gatctctacc agcaatgtgg aattatcacc 360 catcatcatc caatcgcaga tggagggact cctgacatag ccagctgctg tgaaataatg 420 gaagagctta caacctgcct taaaaattac cgaaaaacct taatacactg ctatggagga 480 cttgggagat cttgtcttgt agctgcttgt ctcctactat acctgtctga cacaatatca 540 ccagagcaag ccatagacag cctgcgagac ctaagaggat ccggggcaat acagaccatc 600 aagcaataca attatcttca tgagtttcgg gacaaattag ctgcacatct atcatcaaga 660 2125-9937-PF 5 200920406 gattcacaat caagatctgt atcaagataa aggaattcaa atagcatata tatgaccatg 720 tctgaaatgt cagttctcta gcataatttg tattgaaatg aaaccaccag tgttatcaac 780 ttgaatgtaa atgtacatgt gcagatattc ctaaagtttt attgacaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaa 844 6e <210> <211> <212> <213〉 <400> 6
Met Lys Pro Pro Ser Ser He Gin Thr Ser Glu Phe Asp Ser Ser Asp 15 10 15
Glu Glu Pro He Glu Asp Glu Gin Thr Pro lie His lie Ser Trp Leu 20 25 30
Ser Leu Ser Arg Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Gly Leu Cys Ala Leu 35 40 45
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tacgcggaga agaaggccaa gaagcctgca ctggtggcca agtcctccat cctgctggat 660 gtcaagcctt gggatgatga gacggacatg gctcagctgg aggcctgtgt gcgctctatc 720 cagctggacg ggctggtctg gggggcttcc aagctggtgc ccgtgggcta cggtatccgg 780 aagctacaga ttcagtgtgt ggtggaggac gacaaggtgg ggacagactt gctggaggag 840 gagatcacca agtttgagga gcacgtgcag agtgtcgata tcgcagcttt caacaagatc 900 tgaagcctga gtgtgtgtac gtgcgcgcgt gcgtgaggcc ctgccacgat taaagactga 960 gaccggcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa a 1031 <210> 8 <211> 281 <212> PRT <213>人類 2125-9937-PF 7 200920406 <400〉 8
Met Ala Thr Asn Phe Leu Ala His Glu Lys lie Trp Phe Asp Lys Phe 15 10 15
Lys Tyr Asp Asp Ala Glu Arg Arg Phe Tyr Glu Gin Met Asn Gly Pro 20 25 30
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Val Asp lie Ala Ala Phe Asn Lys lie 275 280 <210〉 9 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 9 tgttctccat ggctccctac 20 <210〉 10 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉 An artificially synthesized primer for PCR <400> 10 agctccctga cgcttgtaac 20 <210> 11 <211〉 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 11 gaggtgatag cattgctttc g 21 12 21
列 <210> <211〉 <212> <213〉 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 12 2125-9937-PF 9 200920406 caagtcagtg tacaggtaag c 21 <210〉 13 <211> <212〉 <213> 20 DNA 人工序列 <220> <223> 用於北方墨點法探針之人工合成引子 <400〉 13 tgttctccat ggctccctac 20 <210> 14 <211〉 <212> <213> 20 DNA 人工序列 / <220> ' <223〉 用於北方墨點法探針之人工合成引子 <400> 14 ctacttgccc aggctcattg 20 <210> 15 <211> <212> <213> 18 DNA 人工序列 <220〉 <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400〉 15
cgtacgcgga atacttcg IB ί <210> 16 <211〉 <212> <213> 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 16 gcgcgctttg taggattcg 19 <210〉 17 <211> <212〉 <213> 21 DNA 人工序列 <220〉 <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 17 2125-9937-PF 10 200920406 uacuugccca ggcucauugu u <210> 18 <211> <212〉 <213> 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400〉 18 caatgagcct gggcaagta <210> 19 <211> <212> <213> 21 DNA 人工序列 / <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 19 aacagcugga cauccgugau u <210〉 20 <211> <212> <213> 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 20 tcacggatgt ccagctgtt ί <210> 21 <211> <212> <213〉 22 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for <400> 21 ctcgctcagc caccaccctc at <210> 22 <211〉 <212> <213> 26 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for <400〉 22
2125-993 7-PF 11 200920406 agttgaggtc atagatttca aggcac <210> 23 <211> 19 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> , _ t <223〉用於s iRNA之人工合成之目標序列 <400〉 23 gaagcagcac gacttcttc 列 ah 2419DN人 <210> <211> <212> <213> <223>用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 24 ccagccagag aaagaagtg <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用於s iRNA之人工合成之目標序列 <400> 25 gtgcagccag ctcaatcaa <210> 26 <211> 4308 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 26 gcgcctgacg ggagcgtcgt gctcaggggt gtcctctcgt cctgcgtccg cgcccagcgc cccgcgcccc gcgctgttcc tcgtgagacc ggcgggcggc gagccgcgcg gcccccgggg cagtgtcgga cacggcgggc gcgcactcgc aggcggggca cggccgcccc cgccaggacc cgcaggcccg gaaacgctcc ctgtcacaaa ggggggaaca cgtgggcgcc ggctgccggg gcggcgatct tagggaacta gggtcacctg gagagccgcc caccgtctct gcccgcicga ctcctccgcc cgggccgctc ggccggtcca gccgcggccg gcgcctggct gtgaggtgga •ttcccggccc agtctgacca tctccctcca gtttttccac ttcgttcgga ccttctcata actatgtcca ccctctacgt ctcccctcac ccagatgcct tccccagcct ccgagccctc 2125-9937-PF 12 200920406 atagccgctc gctatgggga ggctggggag atctgtctcc agccaccccc gactagcagg ctggagcagg ggcccggtgg gctctgggtg tggccagcag gcctgggggg occagggggc gtcagttacg ccgacacgga gttaatacca ggactccgaa gctcggccca ggacccccag agccccttgg aggagtggct tcggctgcac gctgacctgg cggctgtcac agccttgctg gcccgccgga tctggaataa tgtgactcgc - ttccgagccg tgctaggaga agtggttcta ccaggccccg aggctcctgc cctcccaaag aaacgggaga agctagagaa attccaacag ccaggggaga agaaaccaaa accagagaag tatgacctcc caaccccacc cggggaaaag tacagccctc ggtatgtgga ggctgcctgg aagccagagt atgggcgtcc taatgtgtca tgcatcccac cccccaatgi gacaggctcc atccaggact ccctgactcg atggcaccgc ggctgtgacc atgcaggtat tgccacccag ^ cagggactga gccggcacca gctgggccgc aaggaggaga aaggtgaccg gatttaccac igggatcgag cctgtttcac catggaccct gtccggcttc acgaggaagg catcatctat accctcaact ccgccatctc tgacattgag ctgctctccg tgcctggcta caaggagaag tataaggtcc aaggctcaga tagcgacgag acaatgctgg gagatgtggc tgtagctgtg aaggggaaga acgtgatcca cccattcctg tttgtggaca tggactttgg cacaggtgct gactatgaag ttgggcagcg gcacgggctg ggtcccggat ggggaggagc ccacccccgc 540 actccct t tc ccccaccccg cctgccggcc 600 tggggggcca cggctgtggc ccagctgctg 660 agccgggcgg ctgtccttgt ccaacagtgg 720 gctgcctgtg gagcaacgct gccggccctg 780 gctgtgctgg gggccctggg cagggccctg 840 acctacttgg ccggggaggc ccccactctg 900 ctgcctttcc gatacgtcct agacccacct 960 tggtttgtca cgtgtgtccg gcagccagaa 1020 tactcaggag ccaggcctct ctctcatcag 1080 acagctgctc agctcaagaa agaggcaaag 1140 aagcagaaga tccaacagca gcagccacct 1200 agggagaaac gggatcctgg ggtcattacc 1260 aaagatgtca gtggccccat gcccgactcc 1320 tacccttggt gggagcagca gggcttcttc 1380 gcagcaaatc cccgaggtgt cttcatgatg 1440 ctgcacctgg gccatgcact caccaacgcc 1500 atgcgtgggg agaccaccct gtggaaccct 1560 gtggtggtgg agaagaagct atggcgtgag 1620 gaggcctttc tacaggaagt ctggaagtgg 1680 cagttgaaga agcttggcag ctccttggac 1740 aaactctcag cagctgtgac agaggcctti 1800 cgcagtaccc gccttgttaa ctggtcctgc 1860 gtggataaga aggagctgac aggtcgcacc 1920 gtggagttcg gggtcctcgt gtcctttgcc 1980 gaggtggtgg tggcaacaac tcggatcgag 2040 caccccaaag ataccagata ccagcacctg 2100 tctcggagcc ttcccattgt cttcgatgaa 2160 gtgaagatca cccccgcaca tgaccaaaat. 2220 gaggccatca gcatcatgga ctcccggggg 2280 2125-9937-PF 13 200920406 gccctcatca atgtgcctcc gcctttcctg ggcctgccca ggtttgaggc caggaaagcg 2340 gtgctggtgg cgctgaagga gcggggactg ttccgtggca ttgaggacaa ccccatggtg 2400 gtgccacttt gcaaccggtc gaaggacgtg gtagagcctc tgctgcggcc gcagtggtac 2460 gttcgctgcg gggagatggc ccaggctgcc agcgccgctg tgactcgggg tgacctccgc 2520 atcctgcctg aggcccatca gcgcacatgg catgcctgga tggacaacat ccgggagtgg 2580 tgcatttcca ggcagctgtg gtggggccat cgcatcccag cctactttgt cactgtcagt 2640 gacccagcgg tgccccctgg ggaggaccct gatgggcggt actgggtgag tggacgcaat 2700 gaggcggagg cccgggagaa ggcagccaag gagttcggag tgtcccctga caagatcagt 2760 ctccagcaag atgaggatgt attggatacc tggttctcct ctggcctctt ccccttatcc 2820 attttgggct ggcccaacca gtcagaagac ctgagtgtgt tctaccccgg gacactgctg 2880 gagaccggtc atgacatcct cttcttctgg gtggcccgga tggtcatgct gggcctgaag 2940 ctcacgggca ggctgccctt tagagaggtc tacctccatg ccatcgtgcg agatgctcac 3000 ggccggaaga tgagcaagtc tctaggcaat gtcatcgatc ccctggacgt catctatgga 3060 atctccctgc agggcctcca caaccagctg ctgaacagca acctggatcc cagcgaggtg 3120 gagaaggcca aagaagggca gaaagctgac ttcccagcgg ggattcctga atgtggcacc 3180 gatgctctcc ggtttggatt atgtgcctac atgtcccagg gtcgtgacat caacctggat 3240 gtgaaccgga tactgggtta ccgccacttc tgcaacaagc tctggaatgc caccaagttt 3300 gcccttcgtg gccttgggaa gggttttgtg ccctcaccca cctcccagcc cggaggccat 3360 gagagcctgg tggaccgctg gatccgcagc cgcctgacag aggctgtgag gctcagcaat 3420 caaggcttcc aggcctacga cttcccggcc gtcaccactg cccagtacag cttctggctc 3480 tatgagctct gtgatgtcta cttggagtgc ctgaaacctg tactgaatgg ggtggaccag 3540 gtggcagctg agtgtgcccg ccagaccctg tacacttgcc tggacgttgg cctgcggctg 3600 ctctcaccct tcatgccctt cgtgacggag gagctgttcc agaggctgcc ccggaggatg 3660 ccgcaagctc cccctagcct ctgtgttacc ccctacccgg agccctcaga gtgctcctgg 3720 aaggaccccg aggcagaagc cgcccttgag ctggcgctaa gcatcacgcg agccgtgcgc 3780 tccctgcggg ccgactacaa cctcacccgg atccggcctg actgtttcct ggaagtggcg 3840 gatgaggcca cgggcgccct ggcatcggcg gtgtcgggct acgtgcaggc cctggccagc 3900 gcaggtgtgg tggctgttct ggccctgggg gctcccgccc cccagggttg cgctgtggct 3960 ctggcttctg atcgctgctc catccacctg cagcttcagg ggctggtgga ccctgcacgg 4020 gagctgggca agctgcaagc caagcgagtt gaggcccagc ggcaggccca gcgtctgcgg 4080 2125-9937-PF 14 200920406 4140 4200 4260 4308 gaacgccgtg ctgcctcggg ctatcctgtc aaggtgccgc tcgaagtcca ggaggcagat gaagccaagc tccaacagac agaagcagag ctcaggaagg tggatgaggc catcgcccta ttccagaaga tgctgtgatc caccacccag cttcacccct cacccccagc ggctcaccat ggggatggca gcaataaaat at11tcccac aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210> 27 <211> 1264 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 27
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Arg Ala Leu lie Ala Ala Arg Tyr Gly Glu Ala Gly Glu Gly Pro Gly 20 25 30
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Arg Thr Pro Phe Pro Pro Pro Arg Leu Pro Ala Leu Glu Gin Gly Pro 50 55 60
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Pro Ala Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly Ser Arg Ala Ala Val Leu Val 85 90 95
Gin Gin Trp Val Ser Tyr Ala Asp Thr Glu Leu lie Pro Ala Ala Cys 100 105 110
Gly Ala Thr Leu Pro Ala Leu Gly Leu Arg Ser Ser Ala Gin Asp Pro 115 120 125
Gin Ala Val Leu Gly Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ser Pro Leu Glu Glu 130 135 140
Trp Leu Arg Leu His Thr Tyr Leu Ala Gly Glu Ala Pro Thr Leu Ala 145 150 155 160
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Asp Pro Pro Ala Arg Arg lie Trp Asn Asn Val Thr Arg Trp Phe Val 180 185 190
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Pro Ala Leu Pro Lys Thr Ala Ala Gin Leu Lys Lys Glu Ala Lys Lys 225 230 235 240
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Arg Asp Pro Gly Val lie Thr Tyr Asp Leu Pro Thr Pro Pro Gly Glu 275 280 285
Lys Lys Asp Val Ser Gly Pro Met Pro Asp Ser Tyr Ser Pro Arg Tyr 290 295 300
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Leu Val Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Phe Arg Gly lie Glu Asp Asn 645 650 655
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Lys Ser Leu Gly Asn Val lie Asp Pro Leu Asp Val He Tyr Gly He 865 870 .875 880 2125-9937-PF 18 200920406
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Gly lie Pro Glu Cys Gly Thr Asp Ala Leu Arg Phe Gly Leu Cys Ala 915 920 925
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Arg lie Arg Pro Asp Cys Phe Leu Glu Val Ala Asp Glu Ala Thr 1130 1135 1140
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gtggaaccct ggctgtgacc atgcaggtat atggcgtgag cagggactga gccggcacca ,；； ctggaagtgg aaggaggaga aaggtgaccg ctccttggac tgggatcgag cctgttttac agaggccttt gtccggcttc acgaggaagg ctggtcctgc accctcaact ccgccatctc aggtcgcacc ctgctctccg tgcctggcta gtcctttgcc tataaggtcc aaggctcaga tcggatcgag acaatgctgg gagatgtggc ccagcacctg aaggggaaga acgtgatcca cttcgatgaa tttgtggaca tggactttgg .tgaccaaaat gactatgaag ttgggcagcg ctcccggggg gccctcatca atgtgcctcc gactagcagg actagctttc ccccaccccg 360 gctctgggtg tggggggcca cggctgtggc 420 cccagggggc agccgggcgg ctgtccttgt 480 gttaatacca gctgcctgtg gagcaacgct 540 ggacccccag gctgtgctgg gggccctggg 600 tcggctgcac acctacttgg ccggggaggc 660 agccttgctg ctgcctttcc gatacgtcct 720 tgtgactcgc tggtttgtca cgtgtgtccg 780 agtggttcta tactcaggag ccaggcctct 840 cctcccaaag acagctgctc agctcaagaa 900 attccaacag aagcagaaga tccaacagca 960 accagagaag agggagaaac gggatcctgg 1020 cggggaaaag aaagatgtca gtggccccat 1080 ggctgcctgg tacccttggt gggagcagca 1140 taatgtgtca gcagcaaatc cccgaggtgt 1200 gacaggctcc ctgcacctgg gccatgcact 1260 atggcaccgc atgcgtgggg agaccaccct 1320 tgccacccag gtggtggtgg agaagaagct 1380 gctgggccgc gaggcctttc tacaggaagt 1440 gatttaccac cagttgaaga agcttggcag 1500 catggaccct aaactctcag cagctgtgac 1560 catcatctat cgcagtaccc gccttgttaa 1620 tgacattgag gtggataaga aggagctgac 1680 caaggagaag gtggagttcg gggtcctcgt 1740 tagcgacgag gaggtggtgg tggcaacaac 1800 tgtagctgtg caccccaaag ataccagata I860 cccattcctg tctcggagcc ttcccattgt 1920 cacaggtgct gtgaagatca cccccgcaca 1980 gcacgggctg gaggccatca gcatcatgga 2040 gcctttcctg ggcctgccca ggtttgaggc 2100 2125-9937-PF 21 200920406 caggaaagcg gtgctggtgg cgctgaagga ccccatggtg gtgccacttt gcaaccggtc gcagtggtac gttcgctgcg gggagatggc tgacctccgc atcctgcctg aggcccatca ccgggagtgg tgcatttcca ggcagctgtg cactgtcagt gacccagcgg tgccccctgg tggacgcaat gaggcggagg cccgggagaa caagatcagt ctccagcaag atgaggatgt ccccttatcc attttgggct ggcccaacca . gacactgctg gagaccggtc atgacatcct f " * gggcctgaag ctcacgggca ggctgccctt agatgctcac ggccggaaga tgagcaagtc catctatgga atctccctgc agggcctcca cagcgaggtg gagaaggcca aagaagggca atgtggcacc gatgctctcc ggittggatt caacctggat gtgaaccgga tactgggtta caccaagttt gcccttcgtg gccttgggaa cggaggccat gagagcctgg tggaccgctg gctcagcaat caaggcttcc aggcctacga cttctggctc tatgagctct gtgatgtcta ggtggaccag gtggcagctg agtgtgcccg cctgcggctg ctctcaccct tcatgccctt ccggaggatg ccgcaagctc cccctagcct gtgctcctgg aaggaccccg aggcagaagc agccgtgcgc tccctgcggg ccgactacaa ggaagtggcg gatgaggcca cgggcgccct cctggccagc gcaggtgtgg tggctgttct cgctgtggct ctggcttctg atcgctgctc ccctgcacgg gagctgggca agctgcaagc gcgtctgcgg gaacgccgtg ctgcctcggg gcggggactg ttccgtggca ttgaggacaa 2160 gaaggacgtg gtagagcctc tgctgcggcc 2220 ccaggctgcc agcgccgctg tgactcgggg 2280 gcgcacatgg catgcctgga tggacaacat 2340 gtggggccat cgcatcccag cctactttgt 2400 ggaggaccct gatgggcggt actgggtgag 2460 ggcagccaag gagttcggag tgtcccctga 2520 attggatacc tggttctcct ctggcctctt 2580 gtcagaagac ctgagtgtgt tctaccccgg 2640 cttcttctgg gtggcccgga tggtcatgct 2700 tagagaggtc tacctccatg ccatcgtgcg 2760 tctaggcaat gtcatcgatc ccctggacgt 2820 caaccagctg ctgaacagca acctggatcc 2880 gaaagctgac ttcccagcgg ggattcctga 2940 atgtgcctac atgtcccagg gtcgtgacat 3000 ccgccacttc tgcaacaagc tctggaatgc 3060 gggttttgtg ccctcaccca cctcccagcc 3120 gatccgcagc cgcctgacag aggctgtgag 3180 cttcccggcc gtcaccactg cccagtacag 3240 cttggagtgc ctgaaacctg tactgaatgg 3300 ccagaccctg tacacttgcc tggacgttgg 3360 cgtgacggag gagctgttcc agaggctgcc 3420 ctgtgttacc ccctacccgg agccctcaga 3480 cgcccttgag ctggcgctaa gcatcacgcg 3540 cctcacccgg atccggcctg actgtttcct 3600 ggcatcggcg gtgtcgggct acgtgcaggc 3660 ggccctgggg gctcccgccc cccagggttg 3720 catccacctg cagcttcagg ggctggtgga 3780 caagcgagtt gaggcccagc ggcaggccca · 3840 ctatcctgtc aaggtgccgc tcgaagtcca 3900 2125-9937-PF 22 200920406 3960 4020 4078 ggaggcagat gaagccaagc tccaacagac agaagcagag ctcaggaagg tggatgaggc catcgcccta ΐtccagaaga tgctgtgatc caccacccag cttcacccct cacccccagc ggctcaccat ggggatggca gcaataaaat attttcccac aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210> 29 <211> 1264 <212> PRT <213>人類 <400> 29
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Arg Ala Leu lie Ala Ala Arg Tyr Gly Glu Ala Gly Glu Gly Pro Gly 20 25 30
Trp Gly Gly Ala His Pro Arg lie Cys Leu Gin Pro Pro Pro Thr Ser 35 40 45
Arg Thr Ser Phe Pro Pro Pro Arg Leu Pro Ala Leu Glu Gin Gly Pro 50 55 60
Gly Gly Leu Trp Val Trp Gly Ala Thr Ala Val Ala Gin Leu Leu Trp 65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly Ser Arg Ala Ala Val Leu Val 85 90 95
Gin Gin Trp Val Ser Tyr Ala Asp Thr Glu Leu lie Pro Ala Ala Cys 100 105 110
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Gin Ala Val Leu Gly Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ser Pro Leu Glu Glu 130 135 140
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Asp Leu Ala Ala Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Phe Arg Tyr Val Leu 165 170 175
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Ala Ser Ala Ala Val Thr Arg Gly Asp Leu Arg lie Leu Pro Glu Ala 690 695 700
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Gly Ala Leu Ala Ser Ala Val Ser Gly Tyr Val Gin Ala Leu Ala 1145 1150 1155
Ser Ala Gly Val Val Ala Val Leu Ala Leu Gly Ala Pro Ala Pro 1160 1165 1170
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Leu Gin Ala Lys Arg Val Glu Ala Gin Arg Gin Ala Gin Arg Leu 1205 1210 1215
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Glu Val Gin Glu Ala Asp Glu Ala Lys Leu Gin Gin Thr Glu Ala 1235 1240 1245
Glu Leu Arg Lys Val Asp Glu Ala lie Ala Leu Phe Gin Lys Met 1250 1255 1260
Leu
<210> 30 <211> 1128 <212> DNA <213〉人翻 <400> 30 60 120 180 240 300 360 gccggaagtg gccccagcct cgaggccggg cgtcttcggt catctccggc gcttctaggg ctggttcccg tcatcttcgg gagccgtgga ggtacgaact taagacatgc ctattttatt aatttacttc caaacgcaac gaaaggtcca tggacaattt gtgggccatt taattcaggg cccccaattc gtacgtggag aagtgggaat gcaaaagtac tttgaccttt aaccttcggt ccggcgcggt ggagggaaac gcctccgtct ctatataagg aattttccgg tctcttcggg tcctttttcc tctcttcagc gtggggcgcc cacaatttgc gcgctctctt tctgctgctc cccagctctc ggatacagcc gacaccatgg gtttcggaga cctgaaaagc cctgccggcc 2125-993 7-PF 28 420 480 200920406 tccaggtgct caacgattac ctggcggaca agagctacat cgaggggtat gtgccatcac aagcagatgt ggcagtat11 gaagccgtgt ccagcccacc gcctgccgac ttgtgtcatg ccctacgttg gtataatcac atcaagtctt acgaaaagga aaaggccagc ctgccaggag tgaagaaagc tttgggcaaa tatggtcctg ccgatgtgga agacactaca ggaagtggag ctacagatag taaagatgat gatgacattg acctctttgg atctgatgat gaggaggaaa gtgaagaagc aaagaggcta agggaagaac gtcttgcaca atatgaatca aagaaagcca aaaaacctgc acttgttgcc aagtcttcca tcttactaga tgtgaaacct tgggatgatg agacagatat ggcgaaatta gaggagtgcg tcagaagcat tcaagcagac ggcttagtct ggggctcatc taaactagtt ccagtgggat acggaattaa gaaacttcaa atacagtgtg tagttgaaga tgataaagtt ggaacagata tgctggagga gcagatcact gcttttgagg actatgtgca gtccatggat gtggctgctt tcaacaagat ctaaaatcca tcctggatca tggcatttaa ataaaagatt gaaagattac aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210〉 31 <211> 225 <212> PRT <213>人類 <400〉 31
Met Gly Phe Gly Asp Leu Lys Ser Pro Ala Gly Leu Gin Val Leu Asn 15 10 15
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Ala Asp Val Ala Val Phe Glu Ala Val Ser Ser Pro Pro Pro Ala Asp 35 40 45
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Lys Lys Ala Lys Lys Pro Ala Leu Val Ala Lys Ser Ser lie Leu Leu 130 135 140
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Cys Val Arg Ser lie Gin Ala Asp Gly Leu Val Trp Gly Ser Ser Lys 165 170 175
Leu Val Pro Val Gly Tyr Gly He Lys Lys Leu Gin He Gin Cys Val 180 185 190
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Met Ala Ala Gly Thr Leu Tyr Thr Tyr Pro Glu Asn Trp Arg Ala Phe 15 10 15 '. Lys Ala Leu lie Ala Ala Gin Tyr Ser Gly Ala Gin Val Arg Val Leu 、 20 25 30
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Phe Leu Arg Lys Phe Pro Ala Gly Lys Val Pro Ala Phe Glu Gly Asp 50 55 60
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Glu Asn Ala Lys Glu Glu Val Arg Arg lie Leu Gly Leu Leu Asp Ala 130 135 140
Tyr Leu Lys Thr Arg Thr Phe Leu Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ala 145 150 155 160
Asp lie Thr Val Val Cys Thr Leu Leu Trp Leu Tyr Lys Gin Val Leu 165 170 175
Glu Pro Ser Phe Arg Gin Ala Phe Pro Asn Thr Asn Arg Trp Phe Leu 180 185 190
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Lys Gin Lys Pro Gin Ala Glu Arg Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ala Ala 245 250 255
Pro Ala Pro Glu Glu Glu Met Asp Glu Cys Glu Gin Ala Leu Ala Ala 260 265 270
Glu Pro Lys Ala Lys Asp Pro Phe Ala His Leu Pro Lys Ser Thr Phe 275 280 285
Val Leu Asp Glu Phe Lys Arg Lys Tyr Ser Asn Glu Asp Thr Leu Ser 290 295 3⑻
Val Ala Leu Pro Tyr Phe Trp Glu His Phe Asp Lys Asp Gly Trp Ser 305 310 315 320
Leu Trp Tyr Ser Glu Tyr Arg Phe Pro Glu Glu Leu Thr Gin Thr Phe .325 330 335 2125-9937-PF 32 200920406
Met Ser Cys Asn Leu lie Thr Gly Met Phe Gin Arg Leu Asp Lys Leu 340 345 350
Arg Lys Asn Ala Phe Ala Ser Val lie Leu Phe Gly Thr Asn Asn Ser 355 360 365
Ser Ser lie Ser Gly Val Trp Val Phe Arg Gly Gin Glu Leu Ala Phe 370 375 380
Pro Leu Ser Pro Asp Trp Gin Val Asp Tyr Glu Ser Tyr Thr Trp Arg 385 390 395 400
Lys Leu Asp Pro Gly Ser Glu Glu Thr Gin Thr Leu Val Arg Glu Tyr 405 410 415 /. Phe Ser Trp Glu Gly Ala Phe Gin His Val Gly Lys Ala Phe Asn Gin 420 425 430
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<223> An artificially synthesized primer for PCR 2125-9937-PF Λ -1 200920406 <400> 36 tggctacaaa cttcctagca cat
<210〉 37 <211> <212〉 <213> 23 DNA Λ工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 37 ctccaccaca cactgaatct gta
<210> 38 <211〉 - <212〉 <213> 20 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 38 taagcatcac gcgagccgtg
<210> 39 <211> <212> <213> 23 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 39 ggatggagca gcagcgatca gaa
、 <210〉 40 <211> <212> <213> 23 DNA 人工序列 <220〉 <223〉 An artificially synthesized primer for PCR <400〉40 agactggtta atgataacaa tgc
<210> 41 <211> <212> <213> 23 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR 34
2125-993 7-PF 200920406 <400〉 41 ggtctcaaaa ttctgtgaca aat
<210〉 42 <211〉 <212> <213> 20 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 42 cagaagcatt caagcagacg <210> 43 <211〉 - <212> <213> 20 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 43 atgccatgat ccaggatgga
<210> 44 <211> <212> <213> <220> 23 DNA 人工序列 <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 44 ggtggactac gagtcataca cat
<210> 45 <211> <212> <213> 21 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 45 cagtttcctt taatgacccc c
<210> 46 <211〉 <212〉 <213> 20 DNA 人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR
2125-993 7-PF 35 200920406 <400> 46 agcctagcat cccatgtcaa 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400〉 47 gaagacgaag tacagctgaa g 21 <210〉 48 <211> 89 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223> CDKN3-binding sequence in EF-ldelta <400〉 48
Gly Thr Ser Gly Asp His Gly Glu Leu Val Val Arg He Ala Ser Leu 15 10 15
Glu Val Glu Asn Gin Ser Leu Arg Gly Val Val Gin Glu Leu Gin Gin 20 25 30
Ala He Ser Lys Leu Glu Ala Arg Leu Asn Val Leu Glu Lys Ser Ser 35 40 45 ； Pro Gly His Arg Ala Thr Ala Pro Gin Thr Gin His Val Ser Pro Met 1 50 55 60
Arg Gin Val Glu Pro Pro Ala Lys Lys Pro Ala Thr Pro Ala Glu Asp 65 70 75 80
Asp Glu Asp Asp Asp lie Asp Leu Phe 85 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 49 2125-9937-PF 36 200920406 tatagagtcc caaaccttc <210〉 50 <211> <212> <213〉 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於S1RNA之人工合成之目標序列 <400> 50 tacactgcta tggaggact . <210〉 51 <211〉 <212> . <213〉 19 DNA 人工序列 f <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 51 gtggagaacc agagtctgc <210> 52 <211> <212> <213〉 19 DNA 人工序列 <220〉 <223> 用於S1RNA之人工合成之目標序列 <400> 52 catccagaaa tccctggct <210〉 53 ^ <211> <212> <213> 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於s 1RNA之人工合成之目標序列 <400> 53 ugguuuacau gucgacuaa <210〉 54 <211〉 <212> <213> 19 DNA 人工序列 <220> <223> 用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 54
2125-9937-PF 37 200920406 ugguuuacau guuuucuga 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>用於s iRNA之人工合成之目標序列 <400〉 55 ugguuuacau gunuuccua 19 <210〉 56 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用於s iRNA之人工合成之目標序列 <400〉 56 ugguuuacau guuguguga 19 <210> 57 <211> 3528 <212> DNA <213>人類 <400〉 57 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc 60 aaaatgggaa aggaaaagac tcatatcaac attgtcgtca ttggacacgt agattcgggc 120 aagtccacca ctactggcca tctgatctat aaatgcggtg gcatcgacaa aagaaccatt 180 gaaaaatttg agaaggaggc tgctgagatg ggaaagggct ccttcaagta tgcctgggtc 240 ttggataaac tgaaagctga gcgtgaacgt ggtatcacca ttgatatctc cttgtggaaa 300 tttgagacca gcaagtacta tgtgactatc attgatgccc caggacacag agactttatc 360 aaaaacatga ttacagggac atctcaggct gactgtgctg tcctgattgt tgctgctggt 420 gttggtgaat ttgaagctgg tatctccaag aatgggcaga cccgagagca tgcccttctg 480 gcttacacac tgggtgtgaa acaactaatt gtcggtgtta acaaaatgga ttccactgag 540 ccaccctaca gccagaagag atatgaggaa attgttaagg aagtcagcac ttacattaag 600 aaaattggct acaaccccga cacagtagca tttgtgccaa tttctggttg gaatggtgac 660 aacatgctgg agccaagtgc taacatgcct tggttcaagg gatggaaagt cacccgtaag 720 gatggcaatg ccagtggaac cacgctgctt gaggctctgg actgcatcct accaccaact 780 cgtccaactg acaagccctt gcgcctgcct ctccaggatg tctacaaaat tggtggtatt 840 2125-9937-PF 38 200920406 ggtactgttc ctgttggccg agtggagact ggtgttctca aacccggtat ggtggtcacc 900 tttgctccag tcaacgt tac aacggaagta aaatctgtcg aaatgcacca tgaagctttg 960 agtgaagctc ttcctgggga caatgtgggc ttcaatgtca agaatgtgtc tgtcaaggat 1020 gttcgtcgtg gcaacgttgc tggtgacagc aaaaatgacc caccaatgga agcagctggc 1080 ttcactgctc aggtgattat cctgaaccat ccaggccaaa taagcgccgg ctatgcccct 1140 gtattggatt gccacacggc tcacattgca tgcaagtttg ctgagctgaa ggaaaagatt 1200 gatcgccgtt ctggtaaaaa gctggaagat ggccctaaat tcttgaagtc tggtgatgct 1260 gccattgttg atatggttcc tggcaagccc atgtgtgttg agagcttctc agactatcca 1320 cctttgggtc gctttgctgt tcgtgatatg agacagacag ttgcggtggg tgtcatcaaa 1380 gcagtggaca agaaggctgc tggagctggc aaggtcacca agtctgccca gaaagctcag 1440 aaggctaaat gaatattatc cctaatacct gccaccccac tcttaatcag tggtggaaga 1500 acggtctcag aactgtttgt ttcaattggc catttaagtt tagtagtaaa agactggtta 1560 atgataacaa tgcatcgtaa aaccttcaga aggaaaggag aatgttttgt ggaccacttt 1620 ggttttcttt tttgcgtgtg gcagttttaa gttattagtt tttaaaatca gtacttttta 1680 atggaaacaa cttgaccaaa aatttgtcac agaattttga gacccattaa aaaagttaaa 1740 tgagaaacct gtgtgttcct ttggtcaaca ccgagacatt taggtgaaag acatctaatt 1800 ctggttttac gaatctggaa acttcttgaa aatgtaattc ttgagttaac acttctgggt I860 ggagaatagg gttgttttcc ccccacataa ttggaagggg aaggaatatc atttaaagct 1920 atgggagggt tgctttgatt acaacactgg agagaaatgc agcatgttgc igattgcctg 1980 tcactaaaac aggccaaaaa ctgagtcctt gtgttgcata gaaagcttca tgttgctaaa 2040 ccaatgttaa gtgaatcttt ggaaacaaaa tgtttccaaa ttactgggat gtgcatgttg 2100 aaacgtgggt taaaatgact gggcagtgaa agttgactat ttgccatgac ataagaaata 2160 agtgtagtgg ctagtgtaca ccctatgagt ggaagggtcc attttgaagt cagtggagta 2220 agctttatgc cagtttgatg gtttcacaag ttctattgag tgctattcag aataggaaca 2280 aggt tctaat agaaaaagat ggcaatttga agtagctata aaattagact aatctacatt 2340 gcttttctcc tgcagagtct aatacctttt atgctttgat aattagcagt ttgtctactt 2400 ggtcactagg aatgaaacta catggtaata ggcttaacag gtgtaatagc ccacttactc 2460 ctgaatcttt aagcatttgt gcatttgaaa aatgcttttc gcgatcttcc tgctgggatt 2520 ac^ggcatga gccactgtgc ctgacctccc atatgtaaaa gtgtctaaag gttttttttt 2580 ggttataaaa ggaaaatttt tgcttaagtt tgaaggatag gtaaaattaa aggacatgct 2640 2125-9937-PF 39 200920406 ttctgtttgt gtgatggttt ttaaaaattt tttttaagat ggagttcttg ttgcccaggc tagaatgcaa tggcaaaatc tcactgcaat ctcctcctcc tgggttcaag caattctcct acttcagcct cccaagtagc tgggattaca ggcatgtgct aatttggtgt ttttaataga gatgaggttt ttccatgttg gtcaggctgg tctcaaactc ctgaccttag gtgatcgcct cggcctccta aagtgctgga attacaggca tgagccacca tgcctggcca ggacatgtgt tcttaaggac atgctaagca ggagttaaag cagcccaaga gataaggcct cttaaagtga ctggcaatgt gtattgctca agattcaaag gtacttgaat tggccataga caagtctgta atgaagtgtt atcgttttcc ctcatctgag tctgaattag ataaaatgcc ttcccatcag ccagtgctct gaggtatcaa gtctaaattg aactagagat ttttgtcctt agtttctttg ctatctaatg tttacacaag taaatagtct aagatttgct ggatgacaga aaaaacaggt aaggccttta atagatggcc aatagatgcc ctgataatga aagttgacac ctgtaagatt taccagtaga gaattcttga catgcaagga agcaagattt aactgaaaaa ttgttcccac tggaagcagg aatgagtcag tttacttgca tatactgaga ttgagattaa cttcctgtga aacccagtgt cttagacaac tgtggcttga gcaccacctg ctggtattca ttacaaactt gctcactaca ataaatgaat tttaagcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210> 58 <211〉 462 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 58
Met Gly Lys Glu Lys Thr His lie Asn lie Val Val lie Gly His Val 15 10 15
Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu lie Tyr Lys Cys Gly 20 25 30
Gly He Asp Lys Arg Thr lie Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu 35 40 45
Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60
Ala Glu Arg Glu Arg Gly lie Thr lie Asp lie Ser Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80
Glu Thr Ser Lys Tyr Tyr Val Thr lie lie Asp Ala Pro Gly His Arg 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3528 2125-9937-PF 40 200920406 85 90 95
Asp Phe lie Lvs Asn Met lie Thr Gly Thr Ser Gin Ala Asp Cys Ala 100 105 110
Val Leu He Val Ala Ala Gly Val Gly Glu Phe Glu Ala Gly lie Ser 115 120 125
Lys Asn Gly Gin Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly 130 135 140
Val Lys Gin Leu lie Val Gly Val Asn Lys Met Asp Ser Thr Glu Pro 145 150 155 160
Pro Tyr Ser Gin Lys Arg Tyr Glu Glu He Val Lys Glu Val Ser Thr 165 170 175
Tyr He Lys Lys lie Gly Tyr Asn Pro Asp Thr Val Ala Phe Val Pro 180 185 190 lie Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Leu Glu Pro Ser Ala Asn Met 195 200 205
Pro Trp Phe Lys Gly Trp Lys Val Thr Arg Lys Asp Gly Asn Ala Ser 210 215 220
Gly Thr Thr Leu Leu Glu Ala Leu Asp Cys He Leu Pro Pro Thr Arg 225 230 235 240
Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gin Asp Val Tyr Lys lie 245 250 255
Gly Gly lie Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Val Leu 260 265 270
Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val Asn Val Thr Thr Glu 275 280 285
Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Pro 290 295 300
Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys Asp Val 305 310 315 320
Arg Arg Gly Asn Val Ala Gly Asp Ser Lys Asn Asp Pro Pro Met Glu 2125-9937-PF 41 200920406 325 330 335
Ala Ala Gly Phe Thr Ala Gin Val lie lie Leu Asn His Pro Gly Gin 340 345 350
He Ser Ala Gly Tyr Ala Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ala His lie 355 360 365
Ala Cys Lys Phe Ala Glu Leu Lys Glu Lys lie Asp Arg Arg Ser Gly 370 375 380
Lys Lys Leu Glu Asp Gly Pro Lys Phe Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ala 385 390 395 4⑻ lie Val Asp Met Val Pro Gly Lys Pro Met Cys Val Glu Ser Phe Ser 405 410 415
Asp Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gin Thr 420 425 430
Val Ala Val Gly Val lie Lys Ala Val Asp Lys Lys Ala Ala Gly Ala 435 440 445
Gly Lys Val Thr Lys Ser Ala Gin Lys Ala Gin Lys Ala Lys 450 455 460 <210> 59 <211> 2794 <212> DNA <213〉人類 <400> 59 cggcaggacc gagcgcggca ggcggctggc ccagcgcagc cagcgcggcc cgaaggacgg 60 gagcaggcgg ccgagcaccg agcgctgggc accgggcacc gagcggcggc ggcacgcgag 120 gcccggcccc gagcagcgcc cccgcccgcc gcggcctcca gcccggcccc gcccagcgcc 180 ggcccgcggg gatgcggagc ggcgggcgcc ggaggccgcg gcccggctag gcccgcgctc 240 gcgcccggac gcggcggccc gaggctgtgg ccaggccagc tgggctcggg gagcgccagc 300 ctgagaggag cgcgtgagcg tcgcgggagc ctcgggcacc atgagcgacg tggctattgt 360 gaaggagggt tggctgcaca aacgagggga gtacatcaag acctggcggc cacgctactt 420 cctcctcaag aatgatggca ccttcattgg ctacaaggag cggccgcagg atgtggacca 480 acgtgaggct cccctcaaca acttctctgt ggcgcagtgc cagctgatga agacggagcg 540 2125-9937-PF 42 200920406 gccccggccc aacaccttca tcatccgctg cctgcagtgg accactgtca tcgaacgcac 600 cttccatgtg gagactcctg aggagcggga ggagtggaca accgccatcc agactgtggc 660 tgacggcctc aagaagcagg aggaggagga gatggacttc cggtcgggct cacccagtga 720 caactcaggg gctgaagaga tggaggtgtc cctggccaag cccaagcacc gcgtgaccat 780 gaacgagttt gagtacctga agctgctggg caagggcact ttcggcaagg tgatcctggt 840 gaaggagaag gccacaggcc gctactacgc catgaagatc ctcaagaagg aagtcatcgt 900 ggccaaggac gaggtggccc acacactcac cgagaaccgc gtcctgcaga actccaggca 960 ccccttcctc acagccctga agtactcttt ccagacccac gaccgcctct gctttgtcat 1020 ggagtacgcc aacgggggcg agctgttct t ccacctgtcc cgggagcgtg tgttctccga 1080 ggaccgggcc cgcttctatg gcgctgagat tgtgtcagcc ctggactacc tgcactcgga 1140 gaagaacgtg gtgtaccggg acctcaagct ggagaacctc atgctggaca aggacgggca 1200 cattaagatc acagacttcg ggctgtgcaa ggaggggatc aaggacggtg ccaccatgaa 1260 gaccttttgc ggcacacctg agtacctggc ccccgaggtg ctggaggaca atgactacgg 1320 ccgtgcagtg gactggtggg ggctgggcgt ggtcatgtac gagatgatgt gcggtcgcct 1380 gcccttctac aaccaggacc atgagaagct ttttgagctc atcctcatgg aggagatccg 1440 cttcccgcgc acgcttggtc ccgaggccaa gtccttgctt tcagggctgc tcaagaagga 1500 ccccaagcag aggcttggcg ggggctccga ggacgccaag gagatcatgc agcatcgctt 1560 ctttgccggt atcgtgtggc agcacgtgta cgagaagaag ctcagcccac ccttcaagcc 1620 ccaggtcacg tcggagactg acaccaggta ttttgatgag gagttcacgg cccagatgat 1680 caccatcaca ccacctgacc aagatgacag catggagtgt gtggacagcg agcgcaggcc 1740 ccacttcccc cagttctcct actcggccag cggcacggcc tgaggcggcg gtggactgcg 1800 ctggacgata gcttggaggg atggagaggc ggcctcgtgc catgatctgt atttaatggt I860 ttttatttct cgggtgcatt tgagagaagc cacgctgtcc tctcgagccc agatggaaag 1920 acgtttttgt gctgtgggca gcaccctccc ccgcagcggg gtagggaaga aaactatcct 1980 gcgggtttta atttatttca tccagtttgt tctccgggtg tggcctcagc cctcagaaca 2040 atccgattca cgtagggaaa tgttaaggac ttctgcagct atgcgcaatg tggcattggg 2100 gggccgggca ggtcctgccc atgtgtcccc tcactctgtc agccagccgc cctgggctgt 2160 ctgtcaccag ctatctgtca tctctctggg gccctgggcc tcagttcaac ctggtggcac 2220 cagatgcaac ctcactatgg tatgctggcc agcaccctct cctgggggtg gcaggcacac 2280 agcagccccc cagcactaag gccgtgtctc tgaggacgtc atcggaggct gggcccctgg 2340 2125-9937-PF 43 200920406 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2794 gatgggacca gggatggggg atgggccagg gtttacccag tgggacagag gagcaaggtt taaatttgtt attgtgtatt atgttgttca aatgcatttt gggggttttt aatctttgtg acaggaaagc cctccccctt ccccttctgt gtcacagttc ttggtgactg tcccaccggg agcctccccc tcagatgatc tctccacggt agcacttgac cttttcgacg cttaaccttt ccgctgtcgc cccaggccct ccctgactcc ctgtgggggt ggccatccct gggcccctcc acgcctcctg gccagacgct gccgctgccg ctgcaccacg gcgttttttt acaacattca actttagtat ttttactatt ataatataat atggaacctt ccctccaaat tcttcaataa ' aagttgcttt tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa ' <210> 60 <211> 480
'f, <212〉PRT <213>人類 <400〉 60
Met Ser Asp Val Ala lie Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 15 10 15
Glu Tyr lie Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30
Gly Thr Phe lie Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gin Asp Val Asp Gin Arg 35 40 45
Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gin Cys Gin Leu Met Lys 50 55 60
Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe lie lie Arg Cys Leu Gin Trp 65 70 75 80
Thr Thr Val lie Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95
Glu Glu Trp Thr Thr Ala lie Gin Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110
Gin Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125
Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 2125-9937-PF 44 200920406
Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160
Phe Gly Lys Val lie Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175
Ala Met Lys lie Leu Lys Lys Glu Val lie Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190
Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gin Asn Ser Arg His Pro 195 200 205
Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gin Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220
Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240
Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 lie Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270
Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His lie 275 280 285
Lys lie Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly lie Lys Asp Gly Ala 290 295 300
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gin 340 345 350
Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu He Leu Met Glu Glu He Arg Phe 355 360 365
Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu.Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 2125-9937-PF 45 200920406
Lys Lys Asp Pro Lys Gin Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 u G1
Me yo 11 - t G4 na 6 ph 6 ph oto Ar s 5 i o H 4 Π G1 va s 5 • 1 lx H 4 Π Gl T T1 va
Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gin Val Thr Ser Glu 420 425 430
Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gin Met He Thr 435 440 445
He Thr Pro Pro Asp Gin Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460
Arg Arg Pro His Phe Pro Gin Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> An artificially synthesised dominant negative peptide <400〉 61
Glu Asn Gin Ser Leu Arg Gly Val Val Gin Glu Leu Gin Gin Ala lie 15 10 15
Ser Lys Leu <210〉 62 <211〉 33 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesised dominant negative peptide <400〉 62
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Glu Asn 15 10 15
Gin Ser Leu Arg Gly Val Val Gin Glu Leu Gin Gin Ala lie Ser Lys 2125-9937-PF 46 200920406
Leu <210〉 63 <211〉 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesised Tat sequence <400> 63
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesised Penetratin sequence <400> 64
Arg Gin He Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15 <210> 65 <211> 21 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesised Buforin II sequence <400> 65
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val His 15 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 66 <211〉 27 <212> PRT <213〉人類 <400〉 66 .
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys lie Asn Leu 2125-9937-PF 47 200920406 15 10
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys lie Leu 20 25 <210〉 67 <211> 18 <212〉PRT <213>人工序列 <220> <223〉 An artificially synthesised MAP (model amphipathic peptide) sequence <400> 67
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 15 10 15
Leu Ala <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223〉 An artificially synthesised K-FGF sequence <400〉 68
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> An artificially synthesised Ku70 sequence <400〉 69
Val Pro Met Leu Lys <210> 70 <211〉 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> 2125-9937-PF 48 200920406 <223> An artificially synthesised Ku70-PMLKE sequence <400〉 70
Pro Met Leu Lys Glu <210> 71 <211〉 28 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesised Prion sequence <400〉 71
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 15 10 15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210〉 72 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesised pVEC sequence <400> 72
Leu Leu He lie Leu Arg Arg Arg lie Arg Lys Gin Ala His Ala His 1 5 10 15 \
Ser Lys <210> 73 <211〉 21 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉 An artificially synthesised Pep-1 sequence <400> 73
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gin Pro Lys 15 10 15
Lys Lys Arg Lys Val 20 2125-9937-PF 49 200920406 <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesised SynBl sequence <400> 74
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 15 10 15
Gly Arg <210〉 75 <211> 15 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesised Pep-7 sequence <400> 75
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met V'al Ser Leu Ala Cys Gin Tyr 15 10 15 <210〉 76 <211> 12 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223〉 An artificially synthesised HN-1 sequence <400〉 76
Thr Ser Pro Leu Asn lie His Asn Gly Gin Lys Leu 1 5 10 <210〉 77 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223> An artificially synthesised poly-arginine-11 sequence <400〉 77
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 2125-9937-PF 50 200920406 <210> 78 <211> 5441 <212> DNA <213>人類 <400〉 78 agtgggggcc tgatagcgcg gcggtgtgga ccgcgcggcc gaagagcgcg gcgcccagag 60 cgcgggccgc tcgcggagcc acagcccgag ccgggtccca gccggagccg agccccagcc 120 gagccgagcc gggcccggag cgcccggtgc ccgcagccat gccggccggc cgcgccgcgc 180 gcacctgtgc gctgctcgcc ctctgcctcc tgggcgccgg ggcccaggat ttcgggccga 240 cgcgcttcat ctgcacctcg gtgcccgtgg acgccgacat gtgcgccgcg tccgtggccg 300 ccggcggcgc cgaggagctc cggagcagcg tgctgcagct ccgcgagacg gtgctgcagc 360 agaaggagac catcctgagc cagaaggaga ccatccgcga gctgaccgcc aagctgggcc 420 gctgcgagag ccagagcacg ctggaccccg gagccggcga ggcccgggcg ggcggcggcc 480 gcaagcagcc cggctcgggc aagaacacca tgggcgacct gtcccggaca ccggccgccg 540 agacgctcag ccaactcggg caaactttgc aatcgctcaa aacccgcctg gagaacctcg 600 agcagtacag ccgcctcaat tcctccagcc agaccaacag cctcaaggat ctgctgcaga 660 gcaagatcga tgagctggag aggcaggtgc tgtcccgggt gaacaccctg gaggagggca 720 aggggggccc caggaacgac accgaggaga gggtcaagat cgagaccgcc ctgacctccc 780 tgcaccagcg gatcagcgag ctcgagaaag gtcagaaaga caaccgccct ggagacaagt 840 tccagctcac attcccactg cggaccaact atatgtatgc caaggtgaag aagagcctgc 900 cagagatgta cgccttcact gtctgcatgt ggctcaagtc cagcgccacg ccaggtgtgg 960 gcacgccctt ctcctacgct gtgcccggcc aggccaacga gctggtcctc attgagtggg 1020 gcaacaaccc catggagatc ctcatcaatg acaaggtggc caagttgcct tttgtcatca 1080 atgatggcaa gtggcaccac atctgtgtca cctggaccac ccgggacggg gtctgggagg 1140 cctaccagga tggcacgcag ggtggcagtg gcgagaactt ggcgccctat caccccatca 1200 agccccaggg cgtgctggtg ctgggccagg agcaggacac tctgggtggt gggtttgatg 1260 ccacccaggc atitgigggt gagctggccc acttcaacat ctgggaccgc aagctgaccc 1320 ccggggaggt gtacaacctg gccacctgca gcaccaaggc tctgtccggc aatgtcatcg 1380 cctgggctga atcccacatc gagatctacg gaggggccac caagtggacc ttcgaggcct 1440 gtcgccagat caactgagca cggcaggcca ggctgagccc gcccgccctc gocccctgct 1500 tgtgcggcga tgatctgttt tgtgcgtctc ttctctccct tttccccagg aatgaaccga 1560 51
2125-9937-PF 200920406 ggccgtcgcc cctgcacacg cacacgcaca cagcctggtt t tgtcctcat gcacacgaag 1620 cagcccctgc tcccatctgt ccctgaggaa gccccacttc tctgtaggag cccggactct 1680 ctcaggcatg ccccattcac agctgaagtg ggtgctgcaa cgtcttgaac aaggeagaag 1740 ttggtgagag gatctgtgtg tgcgtgtcta catgtgtgtg tctacgtgtg tgcgtgcgtg 1800 gctgggggag gccttttctt tgaggacgta cctcatttcc ttctttcttc tggctttgga 1860 aaaatctcat gatgaaaatt catatt tgcc aactttgtta gctgcgtgcg tgctttgggg 1920 ttggtgcaac ctcagtacac gcatttgtct ttgtttgcaa acctttctca gagcgacata 1980 tctttatatt gatgtaataa atgtctttta gtggtttgtc aaaggccggg ggcgggggct 2040 ctctacagag aatttttatt ttgtaataga agtgaactgt ctctgaaggg tgaaggeagg 2100 ccgtcctggg atggtaccct gtgctctccc gtggaggaga ggggatggct gaggacactg 2160 gcccttaccc cagggccaga cagcatccat ccctgctgtt tgcatctgag ageageatgg 2220 ggcctgggag gtcggcctgt gtgcccagct cagetagetc tgccccagga cggccctgcc 2280 ctcgaccttc ccacctcctc agatcctgca aggctggggt ctgcccctcc cttctcacct 2340 ctggagctgt gctgcactgc ttcagcccag agggccctga gagaggagcg tgccacccac 2400 agcccgggaa gccgggcccc agcacccctc tcctttggcc teeggeagtg cagaccagag 2460 gggacctttt aaggaaagaa gccgtgtttc gatgaagacc tggccacatg gggccactgg 2520 gacttcaacc cagcccatcg gtgggaaggt cctttttggg ggcctttgac agccatatcc 2580 ctcccagcac accaggcgcc aggtgagctg gttcagaccc ctccaggggt actccagaga 2640 cctcacgtgt ggagccaggc ctggccaggg caggggcctg aaacccactc ctccatctca 2700 tggggctcac ggcctacagc agcccacaag ctgccactgg ccggcgacac tgacacctga 2760 gcagtgtcca gaaccttttt gccttttttt gttccccgtg aaaagcaaca tggacatttc 2820 cttctagtcc ttccaaggag gggagagaag tgtatgtgca tttgtgtgtg tgtgtgtgtg 2880 ttgtgtgtgt gtgtgcgcta agtgagaaag agagcaggct cgggaggccc tgcccagggt 2940 aggaggagct tcctgctttg caccatctgg tggtcgcacg ccctgagggc accccgactc 3000 tgtctccagg agtctcatca gcaaaccgct gacaagtct t tctagaaatt ctactgcact 3060 gcctggctca gctgcagctg cagacatttc tgcaggagga gcaggtgttt ctgtcttctg 3120 ttccttctag ggccacctgt ccccttaaac acaggtccac gttgtgtcaa gaacctagtg 3180 catctgtgtg tgtctgtcag tgtctctgtg tcagtgttct tgtgggtgtc tgcacggtac 3240 ccg^ccgccg ttctgcaatg catcactccc gcagaggggg gtgeagatea ggcgccgtgc 3300 tgcgcgttgt tgttcaacag tggctttttc ttagataatc gtgcttcctc agcgcccgtc 3360 2125-9937-PF 52 200920406 gggttgtggc gtgttccttg tgtgttgtgt gctgggtaag ccctccccaa ttcccacagc ccaccctcac ' ggggtgctcc gaccaccttc tctgccctga / ' ctcctggccc gctgaccttt cactgtgttg tctaatccac taatacatgc aggcagtgtt gagctgttga cttcttgctt aaacaagagt i ; cccttgaaaa aaagagatac actgcaaaga cagtgagggg gggccacctg aacctgtgtc taacct tgat ggaatcttat tgtgtaaatt gtgcaatttg agtcccaatt atccttggat ctgcagggat ctccctgggt ccgacatgtg gccgagtgcc gcccagtgtt caagtcaagg gtgttggagg acacaccaag aagcattttt tgggagccag caagagagct tccagccatc tcggagccct cctgccagca cctccggcca tgcccccgtg ggccaggtgg ctagcgaggg gcagagcaca gcicaccttc ctcacccctc agctccctcc tgccccttgc acacttggca ctttgctggc gtagttccca tttactcctt ctctctcagg taagccattt tgcttttgcc gagctggtgt cagaagctct ccgggccctc ttgataacac agtattattt atttttatga aagaaaagga tactttcagg ctccaccaaa attttgtatg ctttcttttc tcactttgtc accagccctg gtgaggagag gctggcatga ttctcaaaag catgttgggg ttggagctga cttactaagt agaagaacct tgggttacat ggcaaccaaa tgtggcttga tattcaacta acgatgggaa ttgaaaggga acaagtcatt ttgtctcatt tgccaaaaaa cttctccgtt tgcatgttcc ttcccgcacc tgcatggact ctgtgaccac ccgtgtagct aggtcaagag agagctcagt aacgtgtagg ttgagaacaa tggagtcgcc tctctagacc tgtgtaggca acgcccggtg gccccgcccc tgccgatcta gagctgtccg ttcaggacca ccccagtgct tacgcctcca ctctgaccca cccatggtgc tagggtctga gccaagcccc cccgagaaag gtcgatgaca aatctgattg atgttccctc tataaaacaa gaagataaaa ccgacagctc cctgggtgtc aggggcttag atcccacttg ctcttactgt agaagaaaaa caaacctata aattaactca acgtagaact gaaagcatgt cttttgtaga ttcccagttt ggacctgaga ccaagggggt ggttcagtca ttccagtgag accaggaggt aaaactggcc ggaatgagcc gaggatttga gtggttcaca ttaagaggat cgaagtcgtg gtttcatctc atgtattact tctgtacaca gaagagaaaa aaaaaaagcc aaaaaaaaaa aaaaaaagca tcggggtggc 3420 gccccggttc 3480 actgaaaatg 3540 ttccctctcc 3600 gcctaaagga 3660 agatctagcc 3720 cgggctgtgt 3780 ctggaccgca 3840 tgagccatcc 3900 cccctgcagc 3960 cagggccgaa 4020 tcgactccct 4080 cagccgcaaa 4140 ttgcactgaa 4200 agcactgttg 4260 cggggtggga 4320 agtcgtaagc 4380 gtttattacc 4440 acctatatct 4500 attttggaag 4560 attttctaag 4620 gtcttgtggg 4680 ctccaaagag 4740 atttatggtg 4800 atatcagttc 4860 agaatccttt 4920 ttaaacacag 4980 gtggactgaa 5040 caatact tag 5100 aaccccctat 5160 2125-9937-PF 53 200920406 5220 5280 5340 5400 5441 ggttgatatt gttataatgt atatactgta taatatgaaa gagaatcgat gtatctcact ttttcattat ttgctaacca aagctgtaca tttttcatat gatctgcagc cttttgggta tcaaatgggt caaaaccatg ggacctgcca cctcccatca gcaattctgg aaatgcacta tttctactgg tattcttgct tttttttttt ttttcatttt cttgctgaaa tgacatgaat tgttgagttt atttttaccc agtaaagagt ggagaaagac t <210> 79 <211> 432 <212〉 PRT ' <213〉人類 <400> 79
Met Pro Ala Gly Arg Ala Ala Arg Thr Cys Ala Leu Leu Ala Leu Cys f 1 5 10 15
Leu Leu Gly Ala Gly Ala Gin Asp Phe Gly Pro Thr Arg Phe lie Cys 20 25 30
Thr Ser Val Pro Val Asp Ala Asp Met Cys Ala Ala Ser Val Ala Ala 35 40 45
Gly Gly Ala Glu Glu Leu Arg Ser Ser Val Leu Gin Leu Arg Glu Thr 50 55 60
Val Leu Gin Gin Lys Glu Thr lie Leu Ser Gin Lys Glu Thr lie Arg 65 70 75 80
Glu Leu Thr Ala Lys Leu Gly Arg Cys Glu Ser Gin Ser Thr Leu Asp 85 90 95
Pro Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Gly Gly Gly Arg Lys Gin Pro Gly 100 105 110
Ser Gly Lys Asn Thr Met Gly Asp Leu Ser Arg Thr Pro Ala Ala Glu 115 120 125
Thr Leu Ser Gin Leu Gly Gin Thr Leu Gin Ser Leu Lys Thr Arg Leu 130 135 140
Glu Asn Leu Glu Gin Tyr Ser Arg Leu Asn Ser Ser Ser Gin Thr Asn 145 150 155 160
Ser Leu Lys Asp Leu Leu Gin Ser Lys lie Asp Glu Leu Glu Arg Gin 2125-9937-PF 54 200920406 165 170 175
Val Leu Ser Arg Val Asn Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Gly Pro Arg 180 185 190
Asn Asp Thr Glu Glu Arg Val Lys lie Glu Thr Ala Leu Thr Ser Leu 195 200 205
His Gin Arg He Ser Glu Leu Glu Lys Gly Gin Lys Asp Asn Arg Pro 210 215 220
Gly Asp Lys Phe Gin Leu Thr Phe Pro Leu Arg Thr Asn Tyr Met Tyr 225 230 235 240
Ala Lys Val Lys Lys Ser Leu Pro Glu Met Tyr Ala Phe Thr Val Cys 245 250 255
Met Trp Leu Lys Ser Ser Ala Thr Pro Gly Val Gly Thr Pro Phe Ser 260 265 270
Tyr Ala Val Pro Gly Gin Ala Asn Glu Leu Val Leu lie Glu Trp Gly 275 280 285
Asn Asn Pro Met Glu lie Leu lie Asn Asp Lys Val Ala Lys Leu Pro 290 295 300
Phe Val He Asn Asp Gly Lys Trp His His lie Cys Val Thr Trp Thr 305 310 315 320
Thr Arg Asp Gly Val Trp Glu Ala Tyr Gin Asp Gly Thr Gin Gly Gly 325 330 335
Ser Gly Glu Asn Leu Ala Pro Tyr His Pro lie Lys Pro Gin Gly Val 340 345 350
Leu Val Leu Gly Gin Glu Gin Asp Thr Leu Gly Gly Gly Phe Asp Ala
Thr Gin Ala Phe Val Gly Glu Leu Ala His Phe Asn lie Trp Asp Arg 370 375 380
Lys Leu Thr Pro Gly Glu Val Tyr Asn Leu Ala Thr Cys Ser Thr Lys 385 390 395 400
Ala Leu Ser Gly Asn Val lie Ala Trp Ala Glu Ser His He Glu He 2125-9937-PF 55 200920406 405 410 415
Tyr Gly Gly Ala Thr Lys Trp Thr Phe Glu Ala Cys Arg Gin lie Asn 420 425 430 8019DN人
列 <210> <211> <212> <213> <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 80 gttggggacc ggaggtaaa <210> 81 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 81 aaaccacgac ttcgtcaagc 29 oo >—- Ay
列 <210> <211> <212〉 <213〉 <220〉 <223>用於s iRNA之人工合成之目標序列 <400> 82 ctcgggcaaa ctttgcaat <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>用於siRNA之人工合成之目標序列 <400> 83 ggtgaagaag agcctgcca <210〉 <211〉 <212> <213〉
oo 11 I 49跟人 列 序 2125-9937-PF 56 200920406 <220〉 <223>用於S1RNA之人工合成之目標序列 <400〉 84 gacaatggct ggcaccaca 19 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>用於siRNA之人工合成之目標序列 <400〉 85 catcaagcct catgggatc 19 <210〉 86 <211> 5814 <212> DNA <213〉人類 <400> 86 cggccgcggc gacagctcca gctccggctc cggctccggc tccggctccg gctcccgcgc 60 ctgccccgct cggcccagcg cgcccgggct ccgcgccccg accccgccgc cgcgcctgcc 120 gggggcctcg ggcgcccccg ccgcccgcct cacgctgaag ttcctggccg tgctgctggc 180 cgcgggcatg ctggcgttcc tcggtgccgt catctgcatc atcgccagcg tgcccctggc 240 ggccagcccg gcgcgggcgc tgcccggcgg cgccgacaat gcttcggtcg cctcgggcgc 300 cgccgcgtcc ccgggcccgc agcggagcct gagcgcgctg cacggcgcgg gcggttcagc 360 cgggcccccc gcgctgcccg gggcacccgc ggccagcgcg cacccgctgc cgcccgggcc 420 cctgttcagc cgcttcctgt gcacgccgct ggctgctgcc tgcccgtcgg gggcccagca 480 gggggacgcg gcgggcgctg cgccgggcga gcgcgaagag ctgctgctgc tgcagagcac 540 ggccgagcag ctgcgccaga cggcgctgca gcaggaggcg cgcatccgcg ccgaccagga 600 caccatccgt gagctcaccg gcaagctggg ccgctgcgag agcggcctgc cgcgcggcct 660 ccagggcgcc gggccccgcc gcgacaccat ggccgacggg ccctgggact cgcctgcgct 720 cattctggag ctggaggacg ccgtgcgcgc cctgcgggac cgcatcgacc gcctggagca 780 ggagcttcca gcccgtgtga acctctcagc tgccccagcc ccagtctctg ctgtgcccac 840 cggcctacac tccaagatgg accagctgga ggggcagctg ctggcccagg tgctggcact 900 ggagaaggag cgtgtggccc tcagccacag cagccgccgg cagaggcagg aagtggaaaa 960 ggagttggac gtcctgcagg gtcgtgtggc tgagctggag cacgggtcct cagcctacag 1020 2125-993 7-PF 57 200920406 tcctccagat gccttcaaga tcagcatccc catccgtaac aactacatgt acgcccgcgt 1080 gcggaaggct ctgcccgagc tctacgcatt caccgcctgc atgtggctgc ggtccaggtc 1140 cagcggcacc ggccagggca cccccttctc ctactcagtg cccgggcagg ccaacgagat 1200 tgtactgcta gaggcgggcc atgagcccat ggagctgctg atcaacgaca aggtggccca 1260 gctgcccctg agcctgaagg acaatggctg gcaccacatc tgcatcgcct ggaccacaag 1320 ggatggccta tggtctgcct accaggacgg ggagctgcag ggctccggtg agaacctggc 1380 tgcctggcac cccatcaagc ctcatgggat ccttatcttg ggccaggagc aggataccct 1440 gggtggccgg tttgatgcca cccaggcctt tgtcggtgac attgcccagt ttaacctgtg 1500 ggaccacgcc ctgacaccag cccaggtcct gggcattgcc aactgcactg cgccactgct 1560 gggcaacgtc cttccctggg aagacaagtt ggtggaggcc tttgggggtg caacaaaggc 1620 tgccttcgat gtctgcaagg ggagggccaa ggcatgaggg gccacctcat ccagggcccc 1680 tcccttgcct gccactttgg ggacttgagg ggggtcatat tccctcctca gcctgcccac 1740 gcactggcct tccctcctgc cccactcctg gctgtgcctc ccatttcccc tcacctgtac 1800 ccacacctcc agaatgccct gccctgcgag tgtgtcccct gtccccacct gagtggggag I860 gagcgtctca agtgaacagt gggagcctgc ccacctggca ctgcactgga gttgtctctt 1920 accccaccct ccctgcccat caactgtatc tgatttcact aattttgaca gcacccccag 1980 tagggtagga ttgtgtatga gggggacccc actatctcag tggtgggggt ggccgcccgc 2040 ccccttgtcc cccatgcaac aggcccagtg gcttcccctt cagggccaca acaggctgta 2100 gaaggggatg acgaggacat cagaggttag acttaccctc ctccctcttt ccaccagctg 2160 ccagtcaagg gcagtgggat ctcgatggag cctccccccc cccccaccca tgcctccctc 2220 t tcctcctct ttcctcctct ctttgtgtgt agcggtttga atgttggttc catgcctggc 2280 ccagccccac ctcagtctcc aggacattcc tttcccagct ccagcctgga gggaagggga 2340 caaagacccc aggaggccaa agggctgcag tcaccccttg tgctcaccca tagtgatggc 2400 cactggtata gtcatcgctc tccctccatg ccaaggacag gacttggacc gcttcagcct 2460 gggctgggag cagccctaag gtagaggcct catggcccag gagaccccac ctctggcaga 2520 gccacattac ctaccctgtg catggtcctg gggcagcaag gaagaagctc agagggtggg 2580 gagaagcatg aagcagtgag cagagcactg ggtgagaggg agaagacctt ggttcctagc 2640 cagccctgct aatgtgctgt gtggccttct gtaagtccct gccctctctg ggcctggcct 2700 tcctcattcg tgagctgagg ccctcgcttt ggtcatttgc tctccagatt gggtgtgagc 2760 t tctctgtga ttccaggtgg atatgtgggg aaagctctgg tgaccctggg cttcgcaggg 2820 2125-9937-PF 58 200920406 gtagatccca ggactcggca gtggatggga tgcagccagt catgggttag ggtcagcaga 2880 gactcagagt ccagggcaag gttcaaggca gactaacctc atgcatggat tgtaaaaaac 2940 cagctccctt tggatcaacc cagcctggca cccttgcctg tctgagagtg tctcaaaggg 3000 ctgatggctt cctggtcccc ttgagtcatc accagcttcc ccaagagagt gtcagaatct 3060 taagagctga gaggccgggc acggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct 3120 gagacaggca gatcacttga ggtcaggagt tcgaagtcag cctggccaac gtggtgaaac 3180 cccatcttca ctaaaaatac aaaacttagc tggttaggtg gtgcatgcct gtagtcccag 3240 ctactcggga ggccgaggca gaagaatctc ttgaactgag gaggtggagg ttgcagtgag 3300 ccgagatcac gccattgcac tccagcctgg gcaacagagc aagactccat ctcaaaaaaa 3360 taataataat cttaaagatg agaaaagcca ccccatctgg caccacagct gcatcttgct 3420 tgtgagaaat ggggaagagt tcagggagga cacgtgacct gcacaggatc acagagcatg 3480 gggcagagcc aggactagag ctcagggcat ctgactccct cttcagtgtt cttccccctc 3540 catgttgcct gcccctgaag acctttgagt tcagtctaca cctaagcagg tagacatccg 3600 cgaggtcaga tgctttccaa catgacacct gaacatcttc ctttatgcaa cacccaaaca 3660 tcttggcatc cccaccccag gaagtgcggg gaggaggtta tgatccctgg gcgcttcggc 3720 agaatggaga gctgaggtgt ccctcccctg ctagtcacct accaggtgtc tgagcagctg 3780 catgctccct ggctcaagtg ggcactgtac cttttgcctg cctttttgtt ccctatctcc 3840 actccctgag gccacttagc ctgagacatg atgcaagagc tgcaggccgg ggggctcagt 3900 gccatggaag ctactccaag ttgcattgcc tcccgcgccc agatcctgct ttccatttcg 3960 agaacataaa tagattgccc agcccctcca gtacaatccc actggaagaa aaggcaatgg 4020 cgggcttcag ccagacctgc tgagacctag gttgccacgg taacagccaa agacatcaac 4080 ccaagtgctg ggtcaagtgt ctcatcatac tggcactgtt gctggggtga cggcagaatt 4140 cagaacttca atttcagtga cgccaagctt gatgtgtttc tgttattgtt ttgaagaagg 4200 tagctcttgt ggaggacttg ggagaaggat ggggtcttag gaaggaggtg acagcacttg 4260 catggtcact tgagcccaca cacacgctca accccaagtc ctttatgctt tgtcacagtg 4320 aagatgagac ctctgacgtc caagccttgt tcctgtgctg catcacccac tcagccttcc 4380 aaagggaaca ggaacaaatt tccccagcac cactgtttgg gtcccgcttt tcctatcttc 4440 tgctgcccct gagcacatcc aagcagacag ggaaagagga gtcagacatg gcccagtcac 4500 atcctgagct gctcctggct gataaccacg atggagcccg tgtttgtcct gccatctggc 4560 actgcactga gtgtggcaca ggcaccgtcc tgttgatctc acaacacagt tctaagttag 4620 2125-9937-PF 59 200920406 gacgttcttg gcctggtgtc tccaggggct cgtgttccga gggccagccc agggaatgtg ttcacaggag ggggagggaa tcccagctgt ccaaggggac gaagggctct gaggggagcg actgcattca ttgtgtgtcc ggactactct cctgaccccc agcatgtcaa ccttgcccct gcgtgtgtgt cctttttgtt gctccgttag aatcagctag gagttcccac cccctttccc cagggccagg tccctcccac agccaaaaaa attgctgctt tatctgccag caatcccctt gagaagaggc accctcaagg gccctctcta cagcaccctt ct tcacccct gacccctggg gttgtctgac ttctcctctc gcgtgtgtgt tttgtaaact acaggtgagg caagtgatgg tcacctgtgt agcccacagg gtccccttgg catgggccag gaaaaggaag ctccaactct atct tcccat gccaccactt caaagccctc ccacccagct ggacgcagca ggcctgagta ttattccagc tggggaaggg actgtgacat cctgttttgt gtgtgtgtat tgaatgttca aaactggggc agcccagat t agagtgccat gcttgaagtg tgaagccgtg agcttcagcc ctgagcatct tgcttggggc cttgtggcat tgcatcacct attttacaga ggacacggga gcctctcccc aacttggaaa tgcctgccac gctcacatgg tagtgcaccc acataaattg gtgtgtgtga aaataaacat acagagaggt tcaaaccaaa ctgggcacca aaggaacaga ccagggggct cttctttagc cccgagtcct caagccctgc gtggtgcccc gggaccacag tgaggaagct gacttgagcc agcactgagt ggggctccct cccagacccc gcccaggctg tactgacaac acatgagctg tctgtgtcat gctgtttact gatgtcatct gggggttacg ttgctccaga ggcagggggt cagctgcttc tcagctagag gggcagggaa accagttgct caccaacatc atttggacag gaagcccggg cagccttctg cccccctcct cccagagaag cacctcccac agtgtgagtg ccctccccag caacatgtgt ggttttgtta ctga 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5814 <210> 87 <211> 500 <212> PRT <213〉人類 <400> 87
Met Lys Phe Leu Ala Val Leu Leu Ala Ala Gly Met Leu Ala Phe Leu 15 10 15
Gly Ala Val lie Cys lie He Ala Ser Val Pro Leu Ala Ala Ser Pro 20 25 30
Ala Arg Ala Leu Pro Gly Gly Ala Asp Asn Ala Ser Val Ala Ser Gly 35 40 45 . 2125-9937-PF 60 200920406
Ala Ala Ala Ser Pro Gly Pro Gin Arg Ser Leu Ser Ala Leu His Gly 50 55 60
Ala Gly Gly Ser Ala Gly Pro Pro Ala Leu Pro Gly Ala Pro Ala Ala 65 70 75 80
Ser Ala His Pro Leu Pro Pro Gly Pro Leu Phe Ser Arg Phe Leu Cys 85 90 95
Thr Pro Leu Ala Ala Ala Cys Pro Ser Gly Ala Gin Gin Gly Asp Ala 100 105 110
Ala Gly Ala Ala Pro Gly Glu Arg Glu Glu Leu Leu Leu Leu Gin Ser 115 120 125
Thr Ala Glu Gin Leu Arg Gin Thr Ala Leu Gin Gin Glu Ala Arg lie 130 135 140
Arg Ala Asp Gin Asp Thr He Arg Glu Leu Thr Gly Lys Leu Gly Arg 145 150 155 160
Cys Glu Ser Gly Leu Pro Arg Gly Leu Gin Gly Ala Gly Pro Arg Arg 165 170 175
Asp Thr Met Ala Asp Gly Pro Trp Asp Ser Pro Ala Leu He Leu Glu 180 185 190
Leu Glu Asp Ala Val Arg Ala Leu Arg Asp Arg lie Asp Arg Leu Glu 195 200 205
Gin Glu Leu Pro Ala Arg Val Asn Leu Ser Ala Ala Pro Ala Pro Val 210 215 220
Ser Ala Val Pro Thr Gly Leu His Ser Lys Met Asp Gin Leu Glu Gly 225 230 235 240
Gin Leu Leu Ala Gin Val Leu Ala Leu Glu Lys Glu Arg Val Ala Leu 245 250 255
Ser His Ser Ser Arg Arg Gin Arg Gin Glu Val Glu Lys Glu Leu Asp 260 265 270
Val Leu Gin Gly Arg Val Ala Glu Leu Glu His Gly Ser Ser Ala Tyr 275 280 285 2125-9937-PF 61 200920406
Ser Pro Pro Asp Ala Phe Lys lie Ser He Pro lie Arg Asn Asn Tyr 290 295 300
Met Tyr Ala Arg Val Arg Lys Ala Leu Pro Glu Leu Tyr Ala Phe Thr 305 310 315 320
Ala Cys Met Trp Leu Arg Ser Arg Ser Ser Gly Thr Gly Gin Gly Thr 325 330 335
Pro Phe Ser Tyr Ser Val Pro Gly Gin Ala Asn Glu lie Val Leu Leu 340 345 350
Glu Ala Gly His Glu Pro Met Glu Leu Leu He Asn Asp Lys Val Ala 355 360 365
Gin Leu Pro Leu Ser Leu Lys Asp Asn Gly Trp His His lie Cys lie 370 375 380
Ala Trp Thr Thr Arg Asp Gly Leu Trp Ser Ala Tyr Gin Asp Gly Glu 385 390 395 400
Leu Gin Gly Ser Gly Glu Asn Leu Ala Ala Trp His Pro lie Lys Pro 405 410 415
His Gly He Leu lie Leu Gly Gin Glu Gin Asp Thr Leu Gly Gly Arg 420 425 430
Phe Asp Ala Thr Gin Ala Phe Val Gly Asp He Ala Gin Phe Asn Leu 435 440 445
Trp Asp His Ala Leu Thr Pro Ala Gin Val Leu Gly lie Ala Asn Cys 450 455 460
Thr Ala Pro Leu Leu Gly Asn Val Leu Pro Trp Glu Asp Lys Leu Val 465 470 475 480
Glu Ala Phe Gly Gly Ala Thr Lys Ala Ala Phe Asp Val Cys Lys Gly 485 490 495
Arg Ala Lys Ala 500
<210> 88 <211> 126 <212〉 PRT 2125-9937-PF 62 200920406 <213>人工序列 <220> <223> An artificially synthesized epitope peptide sequence <400> 88
Gin Asp Phe Gly Pro Thr Arg Phe lie Cys Thr Ser Val Pro Val Asp 15 10 15
Ala Asp Met Cys Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Gly Ala Glu Glu Leu 20 25 30
Arg Ser Ser Asn Val Leu Gin Leu Arg Glu Thr Val Leu Gin Gin Lys 35 40 45
Glu Thr lie Leu Ser Gin Lys Glu Thr lie Arg Glu Leu Thr Ala Lys f 50 55 60
Leu Gly Arg Cys Glu Ser Gin Ser Thr Leu Asp Pro Gly Ala Gly Glu 65 70 75 80
Ala Arg Ala Gly Gly Gly Arg Lys Gin Pro Gly Ser Gly Lys Asn Thr 85 90 95
Met Gly Asp Leu Ser Arg Thr Pro Ala Ala Glu Thr Leu Ser Gin Leu 100 105 110
Gly Gin Thr Leu Gin Ser Leu Lys Thr Arg Leu Glu Asn Leu 115 120 125 <210〉 89 <211> 134 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> An artificially synthesized epitope peptide sequence <400〉 89
Lys Val Ala Lys Leu Pro Phe Val lie Asn Asp Gly Lys Trp His His 15 10 15 lie Cys Val Thr Trp Thr Thr Arg Asp Gly Val Trp Glu Ala Tyr Gin 20 25 30
Asp Gly Thr Gin Gl.y Gly Ser Gly Glu Asn Leu Ala Pro Tyr His Pro 35 40 45 2125-9937-PF 63 200920406 lie Lys Pro Gin Gly Val Leu Val Leu Gly Gin Glu Gin Asp Thr Leu 50 55 60
Gly Gly Gly Phe Asp Ala Thr Gin Ala Phe Val Gly Glu Leu Ala His 65 70 75 80
Phe Asn He Trp Asp Arg Lys Leu Thr Pro Gly Glu Val Tyr Asn Leu 85 90 95
Ala Thr Cys Ser Thr Lys Ala Leu Ser Gly Asn Val lie Ala Trp Ala • 100 105 110
Glu Ser His lie Glu lie Tyr Gly Gly Ala Thr Lys Trp Thr Phe Glu 115 120 125
Ala Cys Arg Gin lie Asn 130 <210> 90 <211> 1841 <212> DNA <213〉人類 <400〉 90 actgcgccgc caccgtcaat aggtggaccc cctcccggag ataaaaccgc cggcgccggc 60 gccgccagtc cctctggctg agacctcggc tccggaatca ctgcagcccc cctcgccctg 120 agccagagca ccccgggtcc cgccagcccc tcacactccc agcaaaatgg gcaaggagaa 180 gacccacatc aacatcgtgg tcaicggcca cgtggactcc ggaaagtcca ccaccacggg 240 .j ccacctcatc tacaaatgcg gaggtattga caaaaggacc attgagaagt tcgagaagga 300 ggcggctgag aiggggaagg gatccticaa gtatgcctgg gtgctggaca agctgaaggc 360 ggagcgtgag cgcggcatca ccatcgacat ctccctctgg aagttcgaga ccaccaagta 420 ctacatcacc atcatcgatg cccccggcca ccgcgacttc atcaagaaca tgatcacggg 480 tacatcccag gcggactgcg cagtgctgat cgtggcggcg ggcgtgggcg agttcgaggc 540 gggcatctcc aagaatgggc agacgcggga gcatgccctg ctggcctaca cgctgggtgt 600 gaagcagctc atcgtgggcg tgaacaaaat ggactccaca gagccggcct acagcgagaa 660 gcgctacgac gagatcgtca aggaagtcag cgcctacatc aagaagatcg gctacaaccc 720 ggccaccgtg ccctttgtgc ccatctccgg ctggcacggt gacaacatgc tggagccctc 780 ccccaacatg ccgtggttca agggctggaa ggtggagcgt aaggagggca acgcaagcgg 840 cgtgtccctg ctggaggccc tggacaccat cctgcccccc acgcgcccca cggacaagcc 900 2125-9937-PF 64 200920406 cctgcgcctg ccgctgcagg acgtgtacaa gattggcggc attggcacgg tgcccgtggg 960 ccgggtggag accggcatcc tgcggccggg catggtggtg acctttgcgc cagtgaacat 1020 caccactgag gtgaagtcag tggagatgca ccacgaggct ctgagcgaag ctctgcccgg 1080 cgacaacgtc ggcttcaatg tgaagaacgt gtcggtgaag gacatccggc ggggcaacgt 1140 gtgtggggac agcaagtctg acccgccgca ggaggctgct cagttcacct cccaggtcat 1200 catcctgaac cacccggggc agattagcgc cggctactcc ccggtcatcg actgccacac 1260 agcccacatc gcctgcaagt ttgcggagct gaaggagaag attgaccggc gctctggcaa 1320 gaagctggag gacaacccca agtccctgaa gtctggagac gcggccatcg tggagatggt 1380 gccgggaaag cccatgtgtg tggagagctt ctcccagtac ccgcctctcg gccgcttcgc 1440 cgtgcgcgac atgaggcaga cggtggccgt aggcgtcatc aagaacgtgg agaagaagag 1500 cggcggcgcc ggcaaggtca ccaagtcggc gcagaaggcg cagaaggcgg gcaagtgaag 1560 cgcgggcgcc cgcggcgcga ccctccccgg cggcgccgcg ctccgaaccc cggcccggcc 1620 cccgccccgc ccccgccccg cgcgccgctc cggcgccccg cacccccgcc aggcgcatgt 1680 ctgcacctcc gcttgccaga ggccctcggt cagcgactgg atgctcgcca tcaaggtcca 1740 gtggaagttc ttcaagagga aaggcgcccc cgccccaggc ttccgcgccc agcgctcgcc 1800 acgctcagtg cccgttttac caataaactg agcgacccca g 1841 <210> 91 <211> 463 <212> PRT <213>人類 <400> 91
Met Gly Lys Glu Lys Thr His He Asn lie Val Val lie Gly His Val 15 10 15
Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu lie Tyr Lys Cys Gly 20 25 30
Gly lie Asp Lys Ai_g Thr lie Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu 35 40 45
Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60
Ala Glu Arg Glu Arg Gly lie Thr. lie Asp lie Ser Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 2125-9937-PF 65 200920406
Glu Thr Thr Lys Tyr Tyr lie Thr lie lie Asp Ala Pro Gly His Arg 85 90 95
Asp Phe lie Lys Asn Met lie Thr Gly Thr Ser Gin Ala Asp Cys Ala 100 105 110
Val Leu lie Val Ala Ala Gly Val Gly Glu Phe Glu Ala Gly lie Ser 115 120 125
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Val Lys Gin Leu lie Val Gly Val Asn Lys Met Asp Ser Thr Glu Pro 145 150 155 160
Ala Tyr Ser Glu Lys Arg Tyr Asp Glu lie Val Lys Glu Val Ser Ala 165 170 175
Tyr He Lys Lys lie Gly Tyr Asn Pro Ala Thr Val Pro Phe Val Pro 180 185 190 lie Ser Gly Trp His Gly Asp Asn Met Leu Glu Pro Ser Pro Asn Met 195 200 205
Pro Trp Phe Lys Gly Trp Lys Val Glu Arg Lys Glu Gly Asn Ala Ser 210 215 220
Gly Val Ser Leu Leu Glu Ala Leu Asp Thr lie Leu Pro Pro Thr Arg 225 230 235 240
Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gin Asp Val Tyr Lys lie 245 250 255
Gly Gly lie Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly lie Leu 260 265 270
Arg Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val Asn lie Thr Thr Glu 275 280 285
Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Pro 290 295 300
Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys Asp lie 305 310 315 320 2125-9937-PF 66 200920406
Arg Arg Gly Asn Val Cys Gly Asp Ser Lys Ser Asp Pro Pro Gin Glu 325 330 335
Ala Ala Gin Phe Thr Ser Gin Val lie lie Leu Asn His Pro Gly Gin 340 345 350 lie Ser Ala Gly Tyr Ser Pro Val lie Asp Cys His Thr Ala His lie 355 360 365
Ala Cys Lys Phe Ala Glu Leu Lys Glu Lys lie Asp Arg Arg Ser Gly 370 375 380
Lys Lys Leu Glu Asp Asn Pro Lys Ser Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ala 385 390 395 400 lie Val Glu Met Val Pro Gly Lys Pro Met Cys Val Glu Ser Phe Ser 405 410 415
Gin Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gin Thr 420 425 430
Val Ala Val Gly Val lie Lys Asn Val Glu Lys Lys Ser Gly Gly Ala 435 440 445
Gly Lys Val Thr Lys Ser Ala Gin Lys Ala Gin Lys Ala Gly Lys 450 455 460 2125-9937-PF 67

Claims (1)

  1. 200920406 十、申請專利範圍： 1 ·種經分離之雙股分子，當導入一細胞，抑制體内 腿、咖3、EF —ldelta或NPTXR的表現及細胞增殖，該 分子由—有義股及-與該有義股互補之反義股構成，彼此 雜父以形成該雙股分子。 2」如中請專利範圍項之雙股分子，其中該有義股 包含-序列，其對應於擇自於SEQ ID N〇: 18、SEQ id n〇: SEQ ID NO: 49 、 SEQ ID . 5卜 SEQ ID NO: 84 及 SEQ ID NO: 85之標靶序列。 、3一如申請專利範圍第2項之雙股分子，其中該雙股分 子為一寡核苷酸，長度為約19及約25個核苷酸。 /.如中請專利範圍第1項之雙股分子，其由-單一多 核苷酸構成’具有有義及反羲股兩者，以一中介單股連接。 如申請專利範圍第4項之雙股分子，其具有通式 [B] [A ]-3 ，[A]為該有義股，包含一序列 應於擇自於 SEQ ID N0: 18、、ζΐα μ ' 20、49、51、84 及 85 之標 $巴 序列’ [Β]為該中介單月，勹红。 早版包括3至23個核苷酸，[Α,]為 以反義股’包含—互補於[Α]之序列。 6·-種載體’表現該如申請專利範）至 股分子。 又 7 ·—種用於治療痒斥少士 ^ ^ 席L症之方法，其中該癌症表現至少；[ 種基因，該基因摆白 、 、CDKN3 、 EF-1de1ta 或 NPTXR 基因，該方法包括以下步驟 經分離之雙股分子二予專利範圍第1至4項 至^ 1種，或申請專利範圍第6項之 2125-9937-PF 200920406 載體。 8_如申請專利範圍第7項之用於治療癌症之方法，直 中欲治療之癌症為肺癌。 /、 種用於治療癌症之組合物，其中該癌症表現至少 1種基因’該基因擇自於EBi3、CDKN3、EF-ldelta或NPTXR 基因，該組合物包括申請專利範圍第1至4項經分離之雙 U之至少1種，或申請專利範圍第6項之載體。 1().如申請專利範圍第9項之用於治療癌症之組合 物，其中欲治療之癌症為肺癌。 一種用於診斷肺癌之方法，該方法包含以下步驟. ⑷藉擇自以下所構成族群之方法，決 生物學樣本中之基㈣餘度： ⑴備測由EBI3、dU5及CMN3構成之族群的祕， 所，（11)偵測由咖3、祕及⑽们構成之族群的蛋白 貝 及 ⑴丨）偵測由EBI3、DLX^CDKN3構成之族群的蛋白 質生物活性；以及 …⑻使相較於正常控制組之基因表現程度，步驟⑷中 決疋之表現程度增加，其關連至肺癌。 如巾請專利範圍第11項之方法，其中於步驟（a) 决疋之表現程度’至少高於正常控制紐水平1〇%。 如中請專利範圍第11項之方法，其中^步驟⑷ 度，係藉由偵測—抗體對擇自於_、聽 及CDKN3之蛋白質的結合。 . 2125-9937-PF 200920406 ⑷如申請專利範圍第卩項之方法，其中該 之生物學樣本包含生檢、痰、血液、胸膜滲出液或尿、、夜’、 15·種用於評量或決定患肺癌之病患之預後 法，包括以下步驟·· 、 u)偵測病患來源之生物學樣本中之基因表現程度. (b) 比較該偵測之表現程度與控制組水平；及 ’ (c) 基於(b)之比較決定病患之預後，其中該基因擇自
    於 EBI3、DLX5、CDKN3 或 EF-ldelta 所構成之族群。 16.如申請專利範圍第15項之方 /、丫，该控制組 水平為-良好預後控制水平，相較於該控制組水 程度增加，決定為不良預後。 、見 π·如申請專利範圍第15項之方法，其中心 於控制水平至少1〇%。 3為巧 18_如申請專利範圍第15項之方法，i M ii rh 6, 、中該表現程度 係藉由擇自以下所構成族群中任一項之方法決定· ⑷備測 ΕΒΙ3、ΗΧ5、（：ΜΝ^ΕίΜ(^^^κΝΑ. ⑻摘測_、DU5、_3或lldelta蛋 及 (c)偵測 EBI3、DLX5、CDKN3 哎 EF μ , 、， 生物活性。 蛋白質之 ^ a , Λ t # r琢病患來源 之生物予樣本包含生檢、痰或血液、 胸膜苓出液或尿液。 20. —種套組，用於診斷癌症 乂 <里或決定串脯态、皮 :a) —試劑，用以谓測一基因之㈣以； 心巧預後，包含擇自以下所構成族群之試劑. ' 2125^9937-PF 200920406 °式诏，用以偵測該基因編碼之蛋白質及 (C) — 4齊,|，用以須測該蛋白質之生物活性， 擇自㈣ i3、DU5、K㈣lta ^2®1· 請專利範圍第2G項之套組，其中該試谢為— 忒基口之基因轉錄物的探針。 ’、、 抗體專利範圍第20項之套組，其中該試劑為-该基因編碼之蛋白質結合。 23. —種診斷於一個种由吐广 r、個體中肺癌的方法，包含以下步驟· (a)攸欲診斷之個體提供一血液樣本； . ⑻決定該血液樣本中之腿3蛋白質含量. (C)比較步驟(b)中決定之刪含量及正… 程廣，苴中A、'右样4_丄 置及正吊控制组之 /、 ' ，相較於正常控制紐之高EBI3水平 代表該個體罹患肺癌。 门水+， 探：·、如申⑼專利施圍第23項之方法，其中該血液樣本 下所構成之族群:全血、金清及血聚。’ 25. 如申請專利範圍第23項之方 白質以免疫分析偵測。 ，、中该EBI3蛋 26. 如申請專利範圍第託項之方 為ELISA。 、 八中該免疫分析 27. 如申請專利範圍第23項之 ⑷決定該血液樣本中之㈤含量；更…下步驟： (e)比較步驟（d+ ^、疋之CEA含量及正當彡在丨 度，其中在血液樣本中 及正常拴制組之程 乂 ；正常控制組有高EBI3及高 2125-9937-PF 200920406 CEA水平其中之一 28. 如申f主真^者，則代表該個體罹患肺癌。 ΜςΓΤ Γ 月,範圍第27項之方法，龙中兮脉广 29. 如申請專利範園第23項之方法’更勺人 (d)決定該血液浐太+ 已3以下步驟： 仗铋本中之CYFRA含量； C e)比較步驟（ a 程度’其中在血液樣本一之刪含量及正常控制組之 高CYRA水平龙中之中’相較於正常控制組有高咖及 3。·如申:f專利〜兩者，則代表該個體羅患肺癌。 甲明專利槌圍第29項之方法，发士 SCC。 万法其中該肺癌為 W·如申請專利範圍第23 ⑷決定該血奸太中 更包含以下步驟： 夜铋本中之P1-0-GRP含量. ⑷比較步驟⑷中決定… ， 之程度，其中在血液樣太由^ 夂正*控d組 及咼pro-GRP水平苴中__ ^ 癌。 ^兩者，則代表該個體罹患肺 32.如申請專利範圍第3丨 SCLC。 項之方法，其中該肺癌為 33· -種用於偵測表現诎13之癌症之套纽，包含. 吾好（1) 一免疫分析試劑，用以決定血液樣本中之则含 重；及 (U) 一針對EBI3之陽性控制組樣本。 3(如申·請專利範圍第33項之套組，更包含_ (1山—免疫分析試劑，用以決定血液樣本中之CEA、 2125-9937-PF 200920406 CYFRA及/或pro_GRp含量；及 (i Ο 針對CEA、CYFRA及/或pr〇-GRP之陽性控制組 樣本。 3 5.如申請專利範圍第34項之套組，其中該陽性控制 組樣本之EBI3、CEA、CYFRA及/或pro-GRP為陽性。 36.-種診斷於—個體中肺癌之方&，包含以下步驟： U)從欲診斷之個體收集血液樣本； (b) 決定該血液樣本中之NPTX1及CYFRA含量； (c) 比較步驟（b)中決定之及cmm含量虚正 控制組之程度；及。 、承 )判斷疋否血液樣本中，相較於正 ΝΡΤΧΙ水平及高^汀^水 刹，、且之间 罹患肺癌。 ，、之一或兩者，則代表該個體 37如中請專利範圍第⑽之方法，其 細胞癌（see)。 |饰匈％狀 38·如申請專利範圍第36項 擇自於以下所構成之族群.全主-中該血液樣本 Qn 听·王血、血清及血漿。 39.—種用於偵測 套組，包含： 見NPTX1及CYFRA蛋白質之癌症 (i)—免疫分析試劑 CYFRA蛋白質含量；及 ”、、疋血液樣本中之NPTX1及 ii) 本 針對ΝΡΐΧΐ及⑽4白質之陽性控制組樣 40. 2125-9937-PF 一種用於篩選候 t化D物供治療或預防肺癌或抑 200920406 制肺癌細胞生長之方法，包含以下步驟. U)使一測試化合物與EBI3、DU5或CMN3多核苷酸 編瑪之多胜狀接觸； (b) 偵測該多胜肽及該測試化合物間的結合活性；及 (c) 選擇結合於該多胜肽之化合物。 41· -種用於薛選候選化合物供治療或預防肺癌或抑 制肺癌細胞生長之方法’包含以下步驟： U)使一測試化合物與EBI3、DU5或CD〇3多核苷酸 編碼之多胜肽接觸； (b) 偵測步驟（a)之多胜肽之生物活性·，及 (c) 選擇相較於不存在該測試化合物時偵測到之該多 胜肽生物活性，抑制ΕΒ ί 3、DLX5或cd〇3之多核普酸編碼 之多胜肽之生物活性的測試化合物。 42_如申請專利範圍第41項之方法，其中該生物活性 擇自於促進細胞增殖、細胞人侵、胞外分泌、_解酶活性 及Akt磷酸化所構成之族群。 伙如申請專利範圍第42項之方法，其中該碟解酶活 性以EF-1 delta偵測。 44. 一種用於篩選候選化人板 < π k π σ物供治療或預防肺癌或抑 制肺癌細胞生長之方法，包含以下步驟： (a)使一候選化合物愈__ ΙΒ ρητό 表現 ΕβΙ3、DLX5 或 CDKN3 之 細胞接觸，及 (b)選擇相較於在不存在測士+ *个仔杜判忒化合物時偵測到之表現 程度’降低 EB13、DLX5 或 CDKN3 > 主 — 次之表現程度的候選化合物。 2125-993 7-PF 7 200920406 45. —種用於篩選候選化合物供治療或預防肺癌或抑 制肺癌細胞生長之方法，包含以下步驟： (a) 使一候選化合物與一細胞接觸，該細胞中導入一 載=，該載體包含EBI3、DLX5或c之轉錄調控區及一 報。基因，該報告基因受到轉錄調控區控制； (b) 測量該報告基因之表現或活性；及 (c) 選擇相較於控制組’降低該報告基因之 性的候選化合物。 飞 恍-種用於篩選候選化合物供治療或預防肺 制肺癌細胞生長之方法’包含以下步驟： ⑷使CD〇3多胜肽或其功能均等物，在測試化合物 存在下，與-交互作用同伴接觸，該交互作用同 '下構成之族群:m ,胜狀、EF士丨pha多胜狀於 EF-lbeta多胜肽、EF]ga_多胜肽，，川3多 及其功能岣等物； 肽 (b) 偵測該多胜肽間之結合；及 (c) 選擇抑制此等多胜肽間結合之測試化合物。 47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中ef —u 多胜肽之功能均等物，包含seqidnq: Μ構成之多胜/ 48. 如申請專利範圍第46項之方法，其巾cd〇3多胜 肽之功旎岣等物，包含VKS多胜肽之胺基酸序列、EF_lal h 多胜肽、EF-lbeta多胜肽、EF]ga_a多胜 :a 結合結構區域。 aelta Μ…種用於篩選一化合物供治療或預防肺癌之方 2125-9937-PF 200920406 法，包含以下步驟： (a) 使一候選化合物與一過度表現之細胞接觸； (b) 測量AktSer473之磷酸化；及 (c) 選擇相較於控制組降低磷酸化之候選化合物。 5〇· —種用於篩選一化合物供治療或預防肺癌之方 法，包含以下步驟： (a) 使一 NPTX1多胜肽或其功能均等物，在存在測試 化合物，接觸NPTXR多胜肽或其功能均等物； (b) 偵測多胜肽間之結合；及 (c) 選擇抑制多胜肽間結合之測試化合物。 51·如申請專利範圍第5〇項之方法，其中該Νρτχι# 胜狀之功能均等物包含NPTXR結合結構區域。 52.如申請專利範圍第5〇項之方法，其中多胜 狀之功能均等物包含NPTX1結合結構區域。 53· —種抗體，結合至包含SEQ ID N〇: 88或⑽之多 胜肽。 54.如申請專利範圍第53項之抗體，其具中和 活性。 55· —種用於治療或預防肺癌之組合物，該組合物包 含一醫藥有效量之抗ΝΡΤΧ1抗體或其片段。 56. 如申請專利範圍第55項之組合物，其中該Νρτχι 抗體為申請專利範圍第51及52項之抗體。 57. —種治療或預防於一個體·中之肺癌之方法，包含 以下步驟：對該個體投予一抗ΝΡΤΧ1抗體或其片段。 2125-99374Ψ 9 200920406 58. 如申清專利範圍第57項之方法’其中該NPTX1抗 體為申請專利範圍第53及54項之抗體。 59. —種多胜肽，包含 ENQSLRGVVQELQQAISU 汕 N〇: 61 ;或功能均等於該多胜肽之多胜肽之胺基酸序列，其中該 多胜狀欠缺SEQ ID N0 : 8構成之胜肽之生物學功能。 6〇·如申請專利範圍第59項之多胜肽’其中該生物學 功能為細胞增殖活性。 61.如申請專利範圍第5 9項之多胜肽，其中該多胜肽 具8至3 0殘基。 62·如申請專利範圍第59項之多胜肽，其中該多胜肽 經一細胞膜通透性物質修飾。 63·如申請專利範圍第59項之多胜肽，具以下通式： [R]-[D]； 其中[R]及[D]可直接連結或通過連結子GGG間接連 接，其中[R ]代表該細胞膜通透性物質；[D ]代表一片段序列 之胺基酸序列’包含 ENQSLRGVVQELQQAISKL ID N0: 61;或 包含該片段序列之功能等同於該多胜肽之多胜肽之胺基酸 序列’其中該多胜肽欠缺SEQ ID N0: 8構成之胜肽之生物 學功能。 6 4 ·如申請專利範圍第6 3項之多胜肽，其中該細胞膜 通透性物質擇自於以下所構成族群中任一者： 多-精胺酸； Tat / RKKRRQRRR/SEQ ID NO: 63; Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO: 64; 2125-993 7-PF 200920406 Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO: 65; Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO： 66; MAP (模型兩親媒性胜肽）/ KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO: 67; K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO: 68; Ku70 / VPMLK/SEQ ID NO: 69 Ku70 / PMLKE/SEQ ID NO: 70; Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO: 71; pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO: 72; Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO: 73; SynBl / RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO: 74; Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO: 75;及 HN-1 / TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO: 76。 U 65.如申請專利範圍第64項之多胜肽，其中該多-精 胺酸為 Arg 11 (RRRRRRRRRRR/SEQ ID NO: 77)。 66. —種藥劑，供治療及預防癌症任一者或兩者，包 含申請專利範圍第5 9至6 5項之多胜肽作為活性成分。 67. 如申請專利範圍第66項之藥劑，其中該癌症為肺 癌。 68. —種用於治療或預防肺癌之方法，包含投予申請 專利範圍第5 9至6 5項之多胜肽之步驟。 6 9.如申請專利範圍第68項之方法，其中該癌症為肺 2125-993 7-PF n 200920406
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