CN111116744A - 哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用，本发明涉及哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用。本发明方法为：一、合成Ser106位点磷酸化的抗原肽；二、利用步骤一合成的抗原肽与与卵清蛋白偶联，得到免疫原，然后利用免疫原免疫动物并收集抗血清；三、将步骤二得抗血清进行纯化和鉴定，得到哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体。本发明抗体可以用于鉴定产奶动物乳腺的泌乳功能状态以及为优良产奶动物品种选育和营养调控技术的建立提供新的鉴定方法。本发明应用于蛋白质磷酸化形式的发现和抗体制备领域。

Description

哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用。
背景技术
真核翻译延长因子(eukaryotic elongation factors，eEFs)包括eEF1A、eEF1B复合体和eEF2。eEF1B复合体负责携带氨基酰tRNA进入核糖体，eEF1B复合体包括eEF1Bα、eEF1Bδ和eEF1Bγ。结合GTP型式的eEF1A能够结合并运载氨基酰tRNA进入核糖体A位点，同时GTP水解为GDP释放能量推动反应进行。eEF1Bα和eEF1Bδ均具有鸟苷交换因子(guaninenucleotide exchange factor，GEF)活性，将eEF1A-GDP转变成eEF1A-GTP型式继续发挥作用，而eEF1Bγ不具有GEF活性但能够结合细胞骨架结构并通过与eEF1Bα结合提高eEF1Bα活性。eEF1Bα在真核生物中高度保守，人、牛和鼠的eEF1Bα的分子质量均为225aa。
已有研究表明一些eEFs具有翻译以外的非经典功能，有的可以在细胞核内发挥作用。发现eEF1A参与核内tRNA向胞浆运输、细胞凋亡、N-乙酰化蛋白质降解等过程。eEF1Bδ可以通过mRNA可变剪接生成一个在细胞核内结合热休克元件的转录因子，eEF1Bγ也可以定位于细胞核，能够结合RNA聚合酶Ⅱ，以及一些基因的启动子。eEF1A、eEF1Bα和eEF1Bγ在很多肿瘤组织中高表达。尚未见eEF1Bα非经典功能的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用。
本发明哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法按以下步骤进行：一、合成氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的Ser106位点磷酸化的抗原肽；二、利用步骤一合成的抗原肽与与卵清蛋白偶联，得到免疫原，然后利用免疫原免疫动物并收集抗血清；三、将步骤二得抗血清进行纯化和鉴定，得到哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体。
本发明提取小鼠乳腺上皮细胞总RNA，扩增eEF1Bα基因，将eEF1Bα基因连接到带有Flag标签蛋白的p-CMV-Flag表达载体上，构建重组载体p-CMV-eEF1Bα-Flag。将重组载体转染细胞，利用Flag抗体进行免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质磷酸化位点质谱(MALDI-TOF/TOF)分析，发现eEF1Bα在Ser106位点发生磷酸化，没有发现其他的磷酸化位点。
本发明的有益效果：
本发明通过磷酸化蛋白质质谱分析技术鉴定，发现在乳腺组织中eEF1Bα蛋白在Ser106位点发生磷酸化，所述抗体是通过eEF1Bα蛋白的Ser106磷酸化位点及上下游保守氨基酸序列作为抗原肽免疫家兔制备得到。本发明提供的eEF1Bα磷酸化形式的抗体制备方法有助于揭示eEF1Bα蛋白的翻译延长作用以外的非经典信号转导功能以及发现促使eEF1Bα蛋白发生磷酸化作用的上游激酶，在基础研究领域得到应用。
本发明利用p-eEF1Bα抗体检测有关乳腺组织，发现p-eEF1Bα在小鼠乳腺泌乳期表达显著高于青春期和退化期。添加蛋氨酸和赖氨酸后牛乳腺上皮细胞p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平显著提高，高乳品质奶牛p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平显著高于低乳品质奶牛乳腺组织。这些数据结果提示，在生产实际中，应用这一抗体可以测定eEF1Bα调节泌乳的功能状态，因此eEF1Bα磷酸化蛋白的抗体可以用于鉴定产奶动物乳腺的泌乳功能状态以及为优良产奶动物品种选育和营养调控技术的建立提供新的鉴定方法。
附图说明
图1为具体实施方式一中获得的Ser106磷酸化位点的示意图；
图2为抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体特异性的Western blotting检测结果；
图3为不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中eEF1Bα和p-eEF1Bα表达水平的Westernblotting分析；
图4为利用ImageJ图像软件对图3不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中eEF1Bα蛋白相对含量的灰度扫描分析；
图5为利用ImageJ图像软件对图3不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中p-eEF1Bα蛋白相对含量的灰度扫描分析；
图6为添加蛋氨酸和赖氨酸后牛乳腺上皮细胞p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平；
图7为eEF1Bα载体过表达(OE)和eEF1Bα(Ser106/Ala)点突变载体过表达；
图8为Western blotting检测高乳品质荷斯坦奶牛乳腺组织(n＝3)和低乳品质奶牛乳腺组织(n＝3)中eEF1Bα和p-eEF1Bα(Ser106)表达水平变化；
图9为利用ImageJ图像软件对图8的Western blot条带进行灰度扫描定量分析的结果。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法按以下步骤进行：一、合成氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的Ser106位点磷酸化的抗原肽；二、利用步骤一合成的抗原肽与与卵清蛋白偶联，得到免疫原，然后利用免疫原免疫动物并收集抗血清；三、将步骤二得抗血清进行纯化和鉴定，得到哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体。
本实施方式的有益效果是：
本实施方式通过磷酸化蛋白质质谱分析技术鉴定，发现在乳腺组织中eEF1Bα蛋白在Ser106位点发生磷酸化，所述抗体是通过eEF1Bα蛋白的Ser106磷酸化位点及上下游保守氨基酸序列作为抗原肽免疫家兔制备得到。本实施方式提供的eEF1Bα磷酸化形式的抗体制备方法有助于揭示eEF1Bα蛋白的翻译延长作用以外的非经典信号转导功能以及发现促使eEF1Bα蛋白发生磷酸化作用的上游激酶，在基础研究领域得到应用。
本实施方式利用p-eEF1Bα抗体检测有关乳腺组织，发现p-eEF1Bα在小鼠乳腺泌乳期表达显著高于青春期和退化期。添加蛋氨酸和赖氨酸后牛乳腺上皮细胞p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平显著提高，高乳品质奶牛p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平显著高于低乳品质奶牛乳腺组织。这些数据结果提示，在生产实际中，应用这一抗体可以测定eEF1Bα调节泌乳的功能状态，因此抗eEF1Bα磷酸化蛋白的抗体可以用于鉴定产奶动物乳腺的泌乳功能状态以及为优良产奶动物品种选育和营养调控技术的建立提供新的鉴定方法。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的抗原肽以eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点为中心，N端含有7个氨基酸残基，C端含有7个氨基酸残基。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一采用单体法合成抗原肽，利用9-芴甲氧羰基保护的20种天然氨基酸合成多肽，并在合成反应中将侧链单苄基保护的磷酸化丝氨酸引入到多肽序列中，利用缩合试剂苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑/二异丙基乙胺将磷酸化丝氨酸进行连接；磷酸化丝氨酸引入的位点为eEF1Bα的第106位。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中免疫动物为免疫兔。其他与具体实施方式一至三之一相同。
本实施方式免疫的方法为：按常规方法制备佛氏完全佐剂，制备抗原肽溶液(5mg/mL)，将两者等体积混合，制备成油包水乳剂，用于第一次免疫。第一次免疫为2mL油包水乳剂注射每只家兔(总共3只)，于后足长、腹股沟和颈背部进行多点注射。按常规方法制备佛氏不完全佐剂，制备抗原肽溶液(5mg/mL)，将两者等体积混合，制备成油包水乳剂，用于第二次和第三次加强免疫。第二次加强免疫为第一次免疫三周后，第三次加强免疫为第二次加强免疫10天后。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中采用亲和色谱方法纯化抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体，其中使用步骤一合成的抗原肽偶联卵清蛋白与琼脂糖结合作为层析柱的填料。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：卵清蛋白为马来酰亚胺活化卵清蛋白。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体用于检测哺乳动物乳腺组织中eEF1Bα蛋白磷酸化形式的表达水平。
利用抗体检测p-eEF1Bα(Ser106)在不同发育与泌乳时期小鼠乳腺组织中的表达，发现在泌乳期乳腺组织中p-eEF1Bα(Ser106)高水平表达；检测添加蛋氨酸和赖氨酸后牛乳腺上皮细胞p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平，与乳合成能力变化一致；检测高低乳品质奶牛p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平变化，与乳品质变化一致。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体用来判断哺乳动物的泌乳能力。其他与具体实施方式七相同。
通过以下实施例对本发明的效果进行验证：
实施例1：在乳腺组织中eEF1Bα蛋白在Ser106位点磷酸化的发现：提取小鼠乳腺上皮细胞总RNA，扩增eEF1Bα基因，将eEF1Bα基因连接到带有Flag标签蛋白的p-CMV-Flag表达载体上，构建重组载体p-CMV-eEF1Bα-Flag。将重组载体转染细胞，利用Flag抗体进行免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质磷酸化位点质谱(MALDI-TOF/TOF)分析，发现eEF1Bα在Ser106位点发生磷酸化，没有发现其他的磷酸化位点。获得的Ser106磷酸化位点如图1所示。
本实施例哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法按以下步骤进行：一、利用Blast方法比对哺乳动物eEF1Bα蛋白在Ser106位点附近的保守序列，设计并采用多肽合成技术合成一段在eEF1Bα蛋白Ser106位点发生磷酸化的抗原肽99DDIDLFG(pS)DDEEESE113，该抗原肽Ser106位点磷酸化，在其N端含有7个氨基酸残基，在其C端含有7个氨基酸残基。将此多肽与卵清蛋白(马来酰亚胺活化卵清蛋白)偶联，制作免疫原。二、将制作的免疫原应用常规方法免疫家兔，获得抗Ser106位点磷酸化eEF1Bα(p-eEF1Bα(Ser106))的抗血清；免疫的方法为：按常规方法制备佛氏完全佐剂，制备抗原肽溶液(5mg/mL)，将两者等体积混合，制备成油包水乳剂，用于第一次免疫。第一次免疫为2mL油包水乳剂注射每只家兔(总共3只)，于后足长、腹股沟和颈背部进行多点注射。按常规方法制备佛氏不完全佐剂，制备抗原肽溶液(5mg/mL)，将两者等体积混合，制备成油包水乳剂，用于第二次和第三次加强免疫。第二次加强免疫为第一次免疫三周后，第三次加强免疫为第二次加强免疫10天后。利用亲和色谱方法纯化抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体，其中使用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联卵清蛋白与琼脂糖结合作为层析柱的填料。三、抗体特异性的鉴定。制备Ser106突变Ala的重组载体p-CMV-eEF1Bα(Ser106/Ala)-Flag。将重组载体p-CMV-eEF1Bα(Ser106/Ala)-Flag和p-CMV-eEF1Bα-Flag分别转入乳腺上皮细胞，利用Flag抗体进行Co-IP，鉴定抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体是否识别两个不同的表达蛋白，确定抗体的特异性。
本实施例构建Ser106突变Ala的重组载体p-CMV-eEF1Bα(Ser106/Ala)-Flag，将重组载体和p-CMV-eEF1Bα-Flag分别转入乳腺上皮细胞，利用Flag抗体进行Co-IP，Westernblotting分析表明抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体特异性识别Ser106位点的磷酸化，据此确定抗体的特异性。结果如图2所示，其中WT：转p-CMV-eEF1Bα-Flag表达载体的乳腺上皮细胞，S106A：转点突变载体p-CMV-eEF1Bα(Ser106/Ala)-Flag的乳腺上皮细胞，IgG为阴性对照。实验结果表明，获得的抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体能够特异性识别eEF1Bα的Ser106位点磷酸化。
图3为不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中eEF1Bα和p-eEF1Bα表达水平的Westernblotting分析结果。图4为图3中不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中eEF1Bα蛋白相对含量的灰度扫描分析；其中P为ICR小鼠青春期(puberty，P，n＝4)、L为泌乳期(lactation，L，n＝4)和DW为退化期(dry period，D，n＝4)乳腺组织，Western blotting分析eEF1Bα和p-eEF1Bα在不同时期乳腺组织中的蛋白水平。图5为图3中不同发育和泌乳期小鼠乳腺组织中p-eEF1Bα蛋白相对含量的灰度扫描分析；灰度扫描分析eEF1Bα(B)和p-eEF1Bα(C)在不同时期乳腺组织中的蛋白相对含量。图3-5表明，eEF1Bα和p-eEF1Bα在泌乳期乳腺组织中表达显著高于青春期和退化期。
图6为添加蛋氨酸和赖氨酸后牛乳腺上皮细胞p-eEF1Bα(Ser106)的表达水平；由图6可知，体外培养的牛乳腺上皮细胞分别添加蛋氨酸(Met，0.6mmol/L)和赖氨酸(Lys，0.6mmol/L)进行处理。mTOR磷酸化和SREBP-1c基因表达可以正向调节乳合成和细胞增殖。实验结果表明，两种氨基酸处理显著提高了β-酪蛋白(CSN2)合成以及促进mTOR磷酸化和SREBP-1c表达，p-eEF1Bα(Ser106)表达水平也显著提高。
图7为eEF1Bα载体过表达(OE)和eEF1Bα(Ser106/Ala)点突变载体过表达；由图7可知，eEF1Bα载体过表达(OE)和eEF1Bα(Ser106/Ala)点突变载体过表达实验表明，eEF1Bα正向调节mTOR磷酸化和SREBP-1c表达依赖于Ser106位点磷酸化。这些结果提示eEF1Bα磷酸化形式是标志乳合成能力的重要信号分子，抗p-eEF1Bα抗体可以用于营养调控技术建立的评价方法。
图8为Western blotting检测高乳品质(乳蛋白率>3.1％，乳脂率>3.5％)荷斯坦奶牛乳腺组织(High组，n＝3)和低乳品质(乳蛋白率<2.9％，乳脂率<3.2％)奶牛乳腺组织(Low组，n＝3)的eEF1Bα和p-eEF1Bα(Ser106)表达水平变化。图9为利用ImageJ图像软件对图8Western blot条带进行灰度扫描定量分析的结果，其中1为低乳品质，2为高乳品质，数据标识相同字母(a和a)表示差异不显著(p>0.05)，数据标识不同字母(a和b)表示差异显著(p<0.05)。实验结果表明，高乳品质奶牛乳腺组织p-eEF1Bα表达水平显著高于低乳品质奶牛，提示抗p-eEF1Bα抗体可以用于奶牛个体乳腺泌乳能力的检测，为优良产奶动物品种选育提供新的鉴定方法。
序列表
<110>长江大学
<120>哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 1
Asp-Asp-Ile-Asp-Leu-Phe-Gly-pSer-Asp-Asp-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu
1 5 10 15

Claims (8)

1.哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：一、合成氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的Ser106位点磷酸化的抗原肽；二、利用步骤一合成的抗原肽与与卵清蛋白偶联，得到免疫原，然后利用免疫原免疫动物并收集抗血清；三、将步骤二得抗血清进行纯化和鉴定，得到哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于步骤一中所述的抗原肽以eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点为中心，N端含有7个氨基酸残基，C端含有7个氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于步骤一采用单体法合成抗原肽，利用9-芴甲氧羰基保护的20种天然氨基酸合成多肽，并在合成反应中将侧链单苄基保护的磷酸化丝氨酸引入到多肽序列中，利用缩合试剂苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑/二异丙基乙胺将磷酸化丝氨酸进行连接；磷酸化丝氨酸引入的位点为eEF1Bα的第106位。
4.根据权利要求1所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于免疫动物为免疫兔。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于步骤三中采用亲和色谱方法纯化抗p-eEF1Bα(Ser106)抗体，其中使用步骤一合成的抗原肽偶联卵清蛋白与琼脂糖结合作为层析柱的填料。
6.根据权利要求1或5所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于卵清蛋白为马来酰亚胺活化卵清蛋白。
7.如权利要求1制备的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体用于检测哺乳动物乳腺组织中eEF1Bα蛋白磷酸化形式的表达水平。
8.根据权利要求7所述的哺乳动物eEF1Bα蛋白磷酸化Ser106位点的特异性抗体的应用，其特征在于该抗体用来判断哺乳动物的泌乳能力。
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Title
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