TW200904828A - K-ras and B-raf mutations and anti-EGFr antibody therapy - Google Patents

Description

200904828 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本申請案關於κ-ras突變、編碼突變κ-ras多肽之多 核苷酸及識別K-ras突變之方法。本申請案亦關於B-raf 突變 '編碼突變B-raf多肽之多核苷酸、包含該等多核苷 酸之載體及識別B-raf突變之方法。本申請案亦關於診斷 癌症之方法；及用於預測抗EGFr特異性結合劑在治療腫 瘤之有效性的方法及套組。 【先前技術】 單株抗體在癌症治療上之特定應用有賴於抗體特異性 傳送諸如經免疫增進之同型（isotype )、毒素或藥物之細 胞毒性效應功能至癌性組織之能力。另一種方法係利用單 株抗體使腫瘤細胞喪失必要之細胞外增生信號，藉此直接 影響腫瘤細胞之存活，諸如該些由生長因子透過彼之細胞 受體所媒介之信號。在此方式中一個引人注意的目標係表 皮生長因子受體（EGFr)，其與EGF及轉化生長因子ct (TGFa )結合（參見例如 Ullrich et al.，Cell 61:203-212, 1 990; Baselga et al·，Pharmacol. Ther. 6 4:1 27- 1 54, 1 994; Mendelsohn et al.，in Biologic Therapy of Cancer 607-6 2 3, Philadelphia; J. B. Lippincott Co., 1 99 5; Fan et al·， Curr. Opin. Oncol. 1 0: 6 7 - 7 3，1 9 9 8 ) 。E G F 或 T G F α 與 EGFr (分子量170 kDa之跨膜細胞表面醣蛋白）之結合引 起一連串之細胞生化事件，包括EGFr自體磷酸化及內化 200904828 ，這些事件最後造成細胞增生（參見例如Ullrich et al.， Cell 6 1:203 -2 1 2, 1 990 ) ° 有些觀察指出EGFr支持人實質腫瘤之發生及進展。 已經證實EGFr過度表現於許多類型之人實質腫瘤（參見 例如 Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989)，Mendelsohn Cancer Biology 1 :339-344 ( 1 990)，Modj tahedi and Dean Int’l J. Oncology 4:277-296 (1994))。舉例來說，EGFr 過度表現曾在特定肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腦癌、膀 胱癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌中被發現（參見例如 Modj tahedi and Dean Int’l J. Oncology 4:277-296 (1 994) )。受體量增加曾被報告與臨床預後不良有關（參見例如 Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64:1 27- 1 54， 1 994;

Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623，Philadelphia: J.B. Lippincott Co.，1 9 9 5 ; Modj tahedi et al., Int5l J. of Oncology 4:277-296, 1 994; Gullick, Br. Medical Bulletin, 47:87-98, 1991; Salomon et al., Crit.

Rev. Oncol. Hematol. 1 9:1 8 3 -23 2，1 995 )。表皮生長因子 (EGF)和轉化生長因子 a(TGF-a)均已被證實可與 EGFr結合並導致細胞增生及腫瘤生長。在許多案例中， 表面EGFr表現增加伴隨腫瘤細胞產製TGFa或EGF，表 示自體分泌生長控制與該些腫瘤進展有關（參見例如 Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64:1 27- 1 54, 1 994;

Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1 995; Modjtahedi 200904828 et a 1., Int’l J. of Oncology 4:277-296, 1 994; Salomon e t al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1 9:1 83 -2 3 2, 1 9 95 )。 因此’有些團體建議抗EGF、TGF-α及EGFr之抗體 可能可用於治療表現或過度表現EGFr之腫瘤（參見例如 Mendelsohn Cancer Cells 7:3 59 ( 1 9 89), Mendelsohn

Cancer Biology 1 :3 3 9-344 ( 1 990), Modjtahedi and Dean Int’l J. Oncology 4:277-296 ( 1 994)，Tosi et al. Int’l J. Cancer 62:643 -650 ( 1 995))。事實上，已經證實阻斷 EGF 和TGF-cx與受體結合之抗EGFr抗體似乎可以抑制腫瘤細 胞增生。然而在此同時，抗EGFr抗體似乎並不抑制EGF 及 TGF-α 非依賴性細胞生長（Modjtahedi and Dean Int’l J. Oncology 4:277-296 (1994))。 對人EGFr具特異性之單株抗體已自小鼠及大鼠中產 製，該抗體可中和EGF及TGFa與腫瘤細胞結合並可抑制 試管內配基媒介之細胞增生（參見例如Baselga et al.， Pharmacol. Ther. 64:1 27- 1 5 4，1 994; Mendelsohn et al., in Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1 995; Fan et al., Curr. Opin. Oncol. 10:67-73, 1998; Modjtahedi et al., Inti J. Oncology 4:277-2 9 6, 1 9 9 4 )。該些抗體中有些係經廣泛評估以了解它們 在異種移植鼠模型中影響腫瘤生長之能力，諸如小鼠1 08 、225 (參見例如 Aboud-Pirak et al., J. Natl. Cancer Inst. 8 0:1 605- 1 6 1 1, 1 98 8 )及 528 (參見例如 Baselga et al·，

Pharmacol. Ther. 64:1 27- 1 54, 1 994; Mendelsohn et al., in 200904828

Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co.，1995 )或大鼠 ICR16、ICR62 及 ICR64 (參見例如 Modjtahedi et al·，Inti. J. Oncology 4:277-296，1 9 9 4; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 67:247-253，1 9 9 3; Modjtahedi et al., B r. J. Cancer 67:254-261, 1 993 )單株抗體。大部份抗EGFr單株抗體當與人腫瘤細 胞一起投服時可有效預防無胸腺鼠體內之腫瘤形成（ Baselga et a 1., Pharmacol. Ther. 64:1 27-1 54， 1 9 9 4;

Modjtahedi et al.，Br. J. Cancer 67:254-26 1, 1 9 9 3 ) 〇 當 注射至帶有已形成人腫瘤異種移植物之小鼠體內時，小鼠 單株抗體225及52 8造成部份腫瘤消退，要清除腫瘤則需 要共同投服化學治療劑，諸如多柔比星（doxorubicin)或 順鉛（cisplatin ) ( Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-154, 1 9 9 4; Mendelsohn et a 1., in Biologic Therapy of Cancer pp. 6 0 7-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 1 99 5; Fan et al., Cancer Res. 53:4637-4642, 1 993;

Baselga et al., J. Natl. Cancer Inst. 8 5:1 3 2 7 - 1 3 3 3，1 993 ) 。鼠抗體變異區與人固定區連接之嵌合型225單株抗體（ C225 )展現增強之活體內抗腫瘤活性，但只有在高劑量下 (參見例如 Goldstein et al·，Clinical Cancer Res. 1:1311-1318， 1 9 9 5; Prewett et al., J. Immunother. Emphasis

Tumor Immunol. 19:419-427, 1996 )。大鼠 ICR16、 ICR62及ICR64抗體造成已形成之腫瘤消退，但無法使其 完全清除（Modjtahedi et al·, Br, J. Cancer 67:254-26 1， 200904828 1 993 )。這些結果令EGFr成爲針對EGFr表現實質腫瘤 之抗體治療的最佳目標，並導致進行以C225單株抗體治 療多種人實質癌症之人臨床試驗（參見例如Baselga et al.，Pharmacol. Ther. 64:127-1 54， 1 9 9 4; Mendelsohn et al.， Biologic Therapy of Cancer p p. 607-623,

Philadelphia: J.B. Lippincott Co.? 1 99 5; Modjtahedi et al.5 Inti. J. Oncology 4:277-296, 1 9 9 4 ) ° 生物學領域中的若干進步使產製全長人抗EGFr抗體 成爲可能。利用人免疫球蛋白基因之基因轉殖鼠（ Xenomouse™ technology, Abgenix， Inc.)，發展對人 EGFr具特異性之人抗體（參見例如 Mendez，Nature Genetics, 15:146-156, 1 997; Jakobovits，Ad v . Drug D e 1 i v . Rev.， 31(1-2):33-42, 1 9 9 8; Jakobovits， Expert Opin.

Invest. Drugs, 7(4):607-6 1 4, 1 99 8; Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 3 8 ( 1 ):1 7-23, 200 1; W098/24893; WO98/504433 )。該抗體之一，帕尼單抗（panitumumab )，係對人EGFr具δχΙΟ^Μ親和力之人IgG2單株抗體 ，其經顯示可阻斷EGF與EGFr結合、阻斷受體信號通路 及抑制試管內腫瘤細胞活化及增生（參見例如 WO 98/5 043 3;美國專利第6,23 5,8 83號）。無胸腺鼠之試 驗顯示，帕尼單抗亦具有活體內活性，其不僅預防人表皮 樣癌A43 1異種移植在無胸腺鼠體內形成，亦可清除已經 形成之大型A43 1腫瘤異種移植物（參見例如Yang et al.， Crit. Rev. Oncol. Hematol. 3 8( 1 ):1 7-23, 200 1; Yang et 200904828 al., Cancer Res. 59(6):1236-43, 1999)。帕尼單抗曾被考 慮用於治療腎癌、結直腸腺癌、前列腺癌及非小細胞鱗狀 細胞肺癌等其他癌症（參見例如美國專利公開號 2004/0033543)，正在進行該抗體之臨床試驗。美國食品 藥物管理局已經核准帕尼單抗用於治療轉移性結直腸癌之 病患。 活化EGFr至少刺激二種信號通路。在若干細胞類型 中，活化EGFr藉由刺激磷脂醯肌醇3-激酶（「PI3K」） 以防止細胞凋亡。PI3K之活化刺激分子梯瀑，其導致控 制計畫性細胞死亡之中央途徑下調（Ya〇，R.，Science 267:2003-2006, 1995)。在若干細胞類型中，活化 EGFr 透過Ras/Raf啓動MAPK梯瀑。 【發明內容】 發明摘要 在特定實施態樣中，本發明提供一種預測病患是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中，該方法包含測定K-r as突變存在或不存在於 該病患之腫瘤中，其中該K-ras突變係位於密碼子12或 密碼子1 3。在特定實施態樣中，如果K-r as突變存在，則 預測該病患將對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應。 在特定實施態樣中，本發明提供一種預測腫瘤是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中，該方法包含測定K-ras突變存在或不存在於 -9- 200904828 該腫瘤之樣本中，其中該K-r as突變係位於密碼子12或 密碼子13。在特定實施態樣中，K-ras突變存在係顯示該 腫瘤將對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應。 在特定實施態樣中，本發明提供一種預測病患是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中，該方法包含測定B-raf突變存在或不存在於 該病患之腫瘤中，其中該B-raf突變係位於密碼子600。 在特定實施態樣中，如果Β-raf突變存在，則預測該病患 將對E GFr多肽之特異性結合劑治療無反應。 在特定實施態樣中，本發明提供一種預測腫瘤是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中，該方法包含測定B -raf突變存在或不存在於 該腫瘤之樣本中，其中該B-raf突變係位於密碼子600。 在特定實施態樣中’ B-raf突變存在係顯示該腫瘤將對 EGFr多肽之特異性結合劑無反應。 在特定實施態樣中’本發明提供一種預測病患是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中’該方法包含測定K-r as突變存在或不存在於 該病患之腫瘤中，其中該Κ-ras突變係位於密碼子1 2或 密碼子1 3 ;及測定B-raf突變存在或不存在於該病患之腫 瘤中’其中該B-raf突變係位於密碼子600。在特定實施 態樣中’如果K-ras突變及B-raf突變之至少一者存在， 則預測該病患將對E G F r多肽之特異性結合劑治療無反應 -10- 200904828 在特定實施態樣中，本發明提供一種預測腫瘤是否將 對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應之方法。在特定 實施態樣中，該方法包含測定K - r a s突變存在或不存在於 該腫瘤之樣本中’其中該K-ras突變係位於密碼子1 2或 密碼子13;及測定B-raf突變存在或不存在，其中該B-raf突變係位於密碼子600。在特定實施態樣中，κ-ras突 變及B-raf突變之至少一者存在係顯示該腫瘤將對EGFr 多肽之特異性結合劑治療無反應。 本發明之詳細說明 所有此處引述之參考文獻（包括專利、專利申請案、 硏究報告、教科書及該類似物及其中引述之文獻）之尙未 納入此處之範圍係以參照方式整體納入此處。如果一或多 篇以參照方式納入之文獻中所定義之名稱與此申請案中之 名稱定義衝突，則以此申請案爲主。此處所使用之段落標 題僅供組織目的之用，不可被視爲限制所描述之題材。 定義 除非另外定義，與本發明有關所使用之科學及技術名 稱應具有該領域一般技術人士所通常了解之意義。另外， 除非上下文另外說明要求，單數名稱應包括複數及複數名 稱應包括單數。 一般來說，與此處所描述之細胞及組織培養、分子生 物及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交有關之命名及技術 -11 - 200904828 係該些在該領域中眾所周知及經常使用者。標準技術係用 於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉化（例如電 穿孔、脂質體轉染）。酵素反應及純化技術係根據廠商說 明書或如該領域所慣用或此處描述之方法進行。前述技術 及方法通常係根據該領域眾所周知之慣用方法及如本申請 案所引述及討論之各種一般性及較爲特定之參考文獻所述 進行。參見例如 Sambrook et al_ Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 2d ed.5 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ( 1 9 89))，其 以參照方式納入此處。與此處所描述之分析化學、合成有 機化學及醫學與醫藥化學有關之命名及實驗室方法與技術 係該些該領域所熟知及慣常使用者。標準技術係用於化學 合成、化學分析、醫藥製備、調合及傳送與治療病患。 在此申請案中，「或」之使用代表「及/或」除非另 外說明。在多項附屬項中，使用「或」係僅能擇一地回指 超過一項在前的獨立項或附屬項。另外，「包括（ including)」一詞以及其他形式諸如現在式（includes) 及過去式（included )之使用並無限制性。同樣的，諸如 「元件（element)」或「成份（component)」之名稱包 含包括一個單位之元件及成份和包括超過一個次單位之元 件及成份除非另外特別說明。 根據本發明之用法，下列名稱除非另外說明應被了解 具有下列意義： 「經分離之多核苷酸」及「經分離之核酸」可交換使 -12- 200904828 用，在此處使用時應指其來源（1)係與多核苷酸之所有 或部份無關，其中「經分離之多核苷酸」係在天然中發現 ，（2)係與天然中不連接之多核苷酸可操作地連接，或 (3 )在天然中非以較大序列之部份出現之基因體、cDNA 或合成性來源之多核苷酸或彼等之一些組合物。 「經分離之蛋白質」及「經分離之多肽」可交換使用 ，在此處使用時係指其來源或衍生來源（1 )與天然中發 現之蛋白質無關，（2)不含來自相同來源之其他蛋白質 ’例如不含鼠蛋白質，（3 )係由來自不同物種之細胞表 現’或（4)不在天然中出現之cDNA、重組RNA或合成 性來源之蛋白質或彼等之一些組合物。 「多肽」及「蛋白質」可交換使用，在此處係用來通 稱多肽序列之天然蛋白質、片段、肽或擬似物。因此，天 然蛋白質、片段及擬似物係該多肽屬中之種。 以「X#Y」指稱多肽序列中之突變之用法係爲該領域 所熟知，其中「#」代表以多肽之胺基酸編號所表示之突 變位置，「X」代表在野生型胺基酸序列中該位置所發現 之胺基酸，而「Υ」代表在該位置之突變胺基酸。舉例來 說，K-ras多肽之「G12S」表示野生型K-ras序列中胺基 酸編號1 2爲甘胺酸，但在突變K-ras序列中該甘胺酸被 絲胺酸取代。 「突變K-ras多肽」及「突變K-ras蛋白質」可交換 使用’係指包含至少一個K-ras突變之K-ras多肽，該突 變選自 G12S、 G12V、 G12D、 G12A、 G12C、 G13A 或 -13 - 200904828 G1 3D。特定示範性突變K-ras多肽包括但不限於對偶基因 變異體、剪接變異體、衍生變異體、取代變異體、刪除變 異體及/或插入變異體、融合多肽、直系同源物及種間同 源物。在特定實施態樣中，突變K-ras多肽在C或N端包 括額外殘基，諸如但不限於引導序列殘基、目標殘基、胺 基端甲硫胺酸殘基、離胺酸殘基、標籤殘基及/或融合蛋 白質殘基。 「突變B-raf多肽」及「突變B-raf蛋白質」可交換 使用，係指包含V600E突變之B-raf多肽。特定示範性突 變B-raf多肽包括但不限於對偶基因變異體、剪接變異體 、衍生變異體、取代變異體、刪除變異體及/或插入變異 體、融合多肽、直系同源物及種間同源物。在特定實施態 樣中，突變B-raf多肽在C或N端包括額外殘基，諸如但 不限於引導序列殘基、目標殘基、胺基端甲硫胺酸殘基、 離胺酸殘基、標籤殘基及/或融合蛋白質殘基。 此處用於物件所稱之「天然發生」係指該物件可於天 然中被發現。舉例來說，存在於可自天然來源分離之生物 體（包括病毒）內且未經實驗室或其他方式人工意圖改質 之多肽或多核苷酸序列係天然發生。 此處所稱之「可操作地連接」係指以令成份可發揮其 意圖功能之關係放置它們。控制序列與編碼序列「可操作 地連接」，係指該連接方式令該編碼序列在與該控制序列 相容之條件下達成表現。 此處所稱之「控制序列」係指多核苷酸序列，其爲它 -14 - 200904828 們所連接之編碼序列表現及處理所必須。該等控制序列之 特性依宿主生物體而異；在原核生物中，該控制序列通常 包括啓動子、核糖體結合位置及轉錄終止序列；在真核生 物中，一般來說，該控制序列包括啓動子及轉錄終止序列 。所稱之「控制序列」最少意圖包括其存在係表現及處理 所必須之所有成份，亦可包括其存在具有益處之額外成份 ，例如引導序列及融合夥伴序列。 此處所稱之「多核苷酸」係指長度至少1 0個鹼基之 聚合形式的核苷酸，不論是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸 或任一種核苷酸之改質形式。該名稱包括單股及雙股形式 之 DNA。 此處所稱之「寡核苷酸」包括藉由天然發生及非天然 發生之寡核苷酸鍵結所連接之天然發生及經改質之核苷酸 。寡核苷酸係多核苷酸之子集，其長度通常爲200個鹼基 或更短。較佳之寡核音酸長度係10至60個鹼基，最佳之 長度係 12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 至 40 個 鹼基。寡核苷酸通常爲單股，例如用於探針，但也有可能 爲雙股，例如用於建構基因突變體。本發明之寡核苷酸可 爲正義或反義之寡核苷酸。 所稱之「突變K-ras多核苷酸」、「突變K-ras寡核 苷酸」及「突變K - r a s核酸」可交換使用，其係指編碼κ _ ras多肽之多核苷酸’該K-ras多肽包含至少—個選自 G12S ' G12V、 G12D、 G12A、 G12C、 G13A 或 G13D 之 K. ras突變。 -15- 200904828 所稱之「突變B_raf多核苷酸」、「突變B-raf寡核 苷酸」及「突變B_raf核酸」可交換使用，其係指編碼B_ raf多肽之多核苷酸，該B_raf多肽包含V600E突變。 此處所稱之「天然發生之核苷酸」包括去氧核糖核苷 酸及核糖核苷酸。此處所稱之「經改質之核苷酸」包括具 有經改質或經取代之糖基及該類似物之核苷酸。此處所稱 之「寡核苷酸鍵結」包括諸如硫代磷酸酯（ phosphorothioate)、二硫代磷酸酯（phosphorodithioate) 、硒代碟酸酯（phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯（ phosphorodiselenoate )、硫代苯膦酯（phosphoroanilothioate )、苯胺隣酯（phosphoraniladate)、磷醯胺酯（ phosphoroamidate)及該類似物。參見例如 LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 1 4:908 1 ( 1 986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 1 0 6:6077 ( 1 984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 1 6:3209 ( 1 988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (19 91); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 8 7- 1 08 ( F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)) ; Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 ( 1 990)，其揭示以參照方式納入此處。如 果需要，寡核苷酸可包括供偵測之標籤。 此處所稱之「選擇性雜交」係指可偵測地及特異性地 結合。在最小化可偵測之非特異性核酸結合量之雜交及清 洗條件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段選擇性地與核酸 -16- 200904828 股雜交。高嚴格性條件可被用來達成如該領域所熟知及此 處所討論之選擇性雜交條件。一般來說，多核苷酸、寡核 苷酸及片段與目標核酸序列之間的核酸序列同源性將爲至 少80%，更典型者之同源性較佳地增加爲至少85%、90% 、9 5 %、9 6 %、9 7 %、9 8 %、9 9 % 及 1 0 0 %。二個胺基酸序列 之序列之間如果有部份或完全一致性則爲同源性。舉例來 說，8 5 %之同源性表示當二個序列以最大匹配比對時有 85%之胺基酸完全相同。最大匹配允許（被匹配之二個序 列中之任一）有間隔存在；較佳之間隔長度爲5或更少， 更佳爲2或更少。二者擇一及較佳地，當使用具有突變資 料矩陣及間隔罰分6或更高之ALIGN程式時’如果二個 蛋白質序列（或長度至少3 0個胺基酸之衍生自它們的多 肽序列）具有超過5之比對得分（標準差單位）’則它們 係此處所稱之同源性。參見Dayhoff，M.O.，in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 ( V olume 5, National Biomedical Research Foundation (1972))及該卷 補篇2第1-10頁。當使用ALIGN程式最佳化排比時’如 果該二序列或其部份之胺基酸具有高於或等於5〇%之一致 性’則它們具有更佳之同源性。此處所稱之「對應」係指 多核苷酸序列與所有或部份之參照多核苷酸序列具同源性 (也就是一致性’而非狹義地演化相關性）’或指多肽序 列與參照多肽序列具一致性。不同的是’此處所稱之「互 補」係指互補序列與所有或部份之參照多核苷酸序列具同 源性。舉例來說，核苷酸序列「TATAC」與參照序列「 -17- 200904828 TAT AC」對應，與參照序列「GT ΑΤΑ」互補。 下列名稱係用來描述二或多個多核苷酸或胺基酸序列 之間的序列關係：「參照序列」、「比較窗」、「序列一 致性」、「序列一致性百分比」及「實質一致性」。「參 照序列」係定義序列，其可用來作爲序列比較之基礎；參 照序列可以是較大序列之子集，例如序列表中全長cDNA 或基因序列之片段，或可能包含完整之cDNA或基因序列 。一般來說，參照序列之長度至少爲18個核苷酸或6個 胺基酸，或長度至少爲24個核苷酸或8個胺基酸，或長 度至少爲4 8個核苷酸或1 6個胺基酸。由於二個多核苷酸 或胺基酸序列可能各（1 )包含該二分子間之類似序列（ 也就是完整多核苷酸或胺基酸序列之部份），及（2 )可 能進一步包含該二個多核苷酸或胺基酸序列之間之相異序 列，二（或多）分子之間的序列比較通常係藉由在「比較 窗」中進行該二分子之序列比較，以識別及比較具序列相 似性之局部區域。此處所稱之「比較窗」係指至少包含 1 8個連續核苷酸位置或6個胺基酸之槪念片段，其中多 核苷酸序列或胺基酸序列係與具有至少1 8個連續核苷酸 或6個胺基酸序列之參照序列比較，且其中該多核苷酸序 列在比較窗中之部份相較於該參照序列（其不包含加入或 刪除）可包含20%或更少之加入、刪除、取代及該類似物 (意即間隔），以達到該二序列之最佳排比。藉由史密斯 (Smith )和華特曼（Waterman )之局部同源性演算法（ Adv. Appl. Math. 2:4 82 ( 1 98 1 ))、藉由尼德曼（ -18- 200904828

Needleman)和文施（Wunsch)之同源性比對演算法（】· Mol. Biol. 48:443 ( 1 970))、藉由皮爾森（Pearson)和李 普曼（Lipman)之相似性方法硏究（Proc_ Natl. Acad· Sci.(U.S.A.) 85:2444 (1988))、藉由這些演算法之電腦 化實現（威斯康辛基因學軟體包釋出版7.0中之GAP、 BESTFIT、FASTA S. TFASTA ( Genetics Computer Group, 5 7 5 Science Dr., Madison, W i s. ) 、 Geneworks 或

MacVector軟體包）、或藉由檢視進行排比比較窗之序列 最佳排比，並選擇由不同方法所產生之最佳排比（也就是 導致比較窗中最高之同源性百分比）。 「序列一致性」一詞係指在比較窗中二個多核苷酸或 胺基酸序列係相同（意即以核苷酸對核苷酸或殘基對殘基 爲基礎）。「序列一致性百分比」之計算係藉由比較比較 窗中之二個最佳比對序列，測定二序列中發生相同核酸鹼 基（例如人、丁、（：、0、11或1)或殘基之位置的數量以 求出匹配位置之數量，將匹配位置之數量除以比較窗中之 位置總數（意即窗之大小）’並將該結果乘以100以得到 序列一致性百分比。此處所稱之「實質一致性」係指多核 苷酸或胺基酸序列之特徵’其中在至少1 8個核苷酸（6 個胺基酸）位置之比較窗中’通常在至少24·48個核苷酸 (8 -1 6個胺基酸）位置之窗中’該多核苷酸或胺基酸相 較於參照序列包含具有至少85%序列一致性，較佳具有至 少9 0至9 5 %序列一致性，更佳通常具有至少9 6、9 7、9 8 或99%序列一致性之序列，其中序列一致性百分比係藉由 -19- 200904828 比較參照序列與該序列計算，在比較窗中該序列可能包括 共佔參照序列20%或更少位置之刪除或加入。參照序列可 能爲更大序列之子集。 此處使用之20個常見胺基酸及其縮寫遵照慣常用法 。參照 Immunology - A Synthesis ( 2nd Edition, E.S. Golub and D. R. Gren， Eds·， S inauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，其以參照方式納入此處。此處所稱之「 胺基酸」或「胺基酸殘基」係指天然發生之L型胺基酸或 D型胺基酸。此處使用常用的一及三個字母之胺基酸縮寫 (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (4 th ed. 2002)) 。20 個常見胺基酸之立體異構物（例如D-胺基酸）、非天然 胺基酸諸如α-，α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸或 其他非常見胺基酸亦可爲本發明之多肽的適當成份。非常 見胺基酸之實例包括4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、ε-Ν-乙醯基離胺酸、Ο-磷酸絲胺酸 、Ν-乙醯基絲胺酸、Ν-甲醯基甲硫胺酸、3 -甲基組胺酸、 5-羥基離胺酸、σ-Ν-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸及亞 胺酸（例如4-羥基脯胺酸）。在此處所使用之多肽表示 法中’左側方向根據標準用法及慣例係胺基端方向，右側 方向係羧基端方向。 同樣地，除非另外說明，單股多核苷酸序列之左側端 係5 ’端；雙股多核苷酸序列之左側方向稱爲5 ’方向。由 5 ’至3 ’加入新生RN Α轉錄物之方向稱爲轉錄方向。在 -20- 200904828 DNA股上和RNA具有相同序列且其爲該RNA轉錄物之 5 ’至5 ’端之序列區域稱爲「上游序列」。在DN A股上和 RNA具有相同序列且其爲該RNA轉錄物之3’至3’端之序 列區域稱爲「下游序列」。 當用於描述多肽時，「實質一致性」係指二個藉由諸 如使用內建間隔加權之GAP或BE STFIT程式進行最佳比 對之肽序列分享至少80%之序列一致性，較佳爲至少90% 序列一致性，更佳爲至少95、96、97或9 8%序列一致性 ，及最佳爲至少9 9 °/。序列一致性。較佳的是，非一致性之 殘基位置係因保留性胺基酸取代而不同。如此處所討論的 ，抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列中的輕微變異被視 爲包含在本發明之範圍內，唯其該胺基酸序列之變異維持 至少 7 5 %，更佳至少8 0 %、9 0 %、9 5 %及最佳9 9 %之序列 。保留性胺基酸取代係發生於其側鏈具有相關性之胺基酸 家族內之取代。經基因編碼之胺基酸通常被分成下列家族 :(1 )酸性=天冬胺酸、麩胺酸；（2 )鹼性=離胺酸、 精胺酸、組胺酸；（3 )非極性=丙胺酸、纈胺酸、白胺 酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸； 及（4 )不帶電極性=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、 半胱胺酸、絲胺酸 '蘇胺酸、酪胺酸。更佳之家族爲：絲 胺酸及蘇胺酸係脂肪族羥基家族；天冬醯胺酸及麩醯胺酸 係含醯胺家族；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係脂 肪族家族；苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸係芳香性家族及半 胱胺酸及甲硫胺酸係含硫側鏈家族。舉例來說，我們可以 -21 - 200904828 合理期待以異白胺酸或纈胺酸獨立取代白胺酸、以鞋胺酸 獨立取代天冬胺酸、以絲胺酸獨立取代蘇胺酸或以結構相 關之胺基酸類似地取代胺基酸，將不會對該形成之分子的 結合或特性產生重大影響，特別是如果該取代並未牽涉在 骨架區內之胺基酸。較佳之保留性胺基酸取代基團係：纈 胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺 酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸、半胱胺酸-甲硫 胺酸及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。 較佳之胺基酸取代係該些：（1 )降低對蛋白質溶解 之感受性者、（2 )降低對氧化之感受性者、（3 )改變形 成蛋白質複合體之結合親和性者，（4 )改變結合親和性 者及（5 )給予或修飾該類似物之其他物理化學或功能性 特性者。類似物可包括各種除天然發生肽序列以外之序列 的突變蛋白。舉例來說，單一或多重胺基酸取代（較佳爲 保留性胺基酸取代）可發生在天然發生之序列中（較佳於 形成份子間接觸之結構域以外的多肽部份）。保留性胺基 酸取代不應顯著改變母序列之結構特性（例如替代胺基酸 不應打斷母序列中之螺旋結構，或破壞其他母序列特徵之 二級結構）。習知技藝之多肽二級與三級結構之實例係描 述於 Proteins, Structures and Molecular Principles (

Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York ( 1 984)) ；Introduction to Protein Structure ( C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及 Thornton et al. Nature 3 54··1 05 ( 1 99 1 )，它們 -22- 200904828 各以參照方式納入此處。 此處所稱之「類似物」係指包含至少25個胺基酸片 段之多肽，該片段與天然發生多肽之部份胺基酸序列具有 實質一致性，且其具有該天然發生多肽之至少一項活性。 一般來說，多肽類似物包含該天然發生序列之保留性胺基 酸取代（或加入或刪除）。類似物之長度通常爲至少20 個胺基酸，較佳爲至少50個胺基酸或更長’通常可達全 長天然發生多肽之長度。 肽類似物經常被用於醫藥工業以作爲具有類似模板肽 之性質之非肽藥物。該些類型之非肽化合物被稱爲「肽模 擬物（peptide mimetics)」或「模擬肽（peptidomimetics) 」。Fauchere，J. Adv. Drug Res. 1 5:29 ( 1 986); Veber and Freidinger TINS p.3 92 ( 1 98 5 );及 Evans et al. J. Med_

Chem. 3 0:1 229 ( 1 9 8 7)，其以參照方式納入此處。這類化 合物通常由電腦化分子模擬協助發展。結構類似治療用途 肽類之肽模擬物可被用來產生相等之治療或預防效果。通 常，模擬肽的結構類似範例多肽（也就是具有生化特性或 藥理活性之多肽），諸如人抗體，但是具有一或多個可選 擇性地以該領域已知之方法被選自下列之鍵結取代之肽鍵 結：…CH2NH.....CH2S-- ' --CH2-CH2.....CH = CH--(順 式及反式）、'-COCH2—、一CH(0H)CH2- -及一CH2SO--。 以相同類型之右旋胺基酸系統性取代共同序列之一或多個 胺基酸（例如以右旋離胺酸取代左旋離胺酸）可用來產生 更穩定之肽類。此外，包含共同序列或實質上相同之共同 -23- 200904828 序列變異之限制肽類可利用該領域已知之方法產生（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 ( 1992)，以參 照方式納入此處）：例如藉由加入可形成份子內雙硫鍵以 環化該肽之內部半胱胺酸殘基。 片段或類似物之較佳胺基端及羧基端出現在靠近功能 性結構域之邊界。結構及功能性結構域可藉由比較核苷酸 及/或胺基酸序列資料與公眾或專屬序列資料庫以識別。 較佳的是，電腦化比較方法被用來識別序列模體（motif )或發生在其他已知結構及/或功能之蛋白質中之預測蛋 白質構型結構域。識別折疊成已知三維結構之蛋白質序列 之方法係爲已知（參見 Bowie et al. Science 253:164 (1991))。該些熟習該項技術者可識別根據本發明被用來 定義結構及功能結構域之序列模體及結構構型。 「特異性結合劑」一詞係指與目標特異性結合之天然 或非天然分子。特異性結合劑之實例包括但不限於蛋白質 、肽、核酸、碳水化合物、脂肪及小分子化合物。在特定 實施態樣中，特異性結合劑係抗體。在特定實施態樣中， 特異性結合劑係抗原結合區域。 「對EGFr多肽之特異性結合劑」一詞係指與EGFr 多肽之任何部份特異性結合之特異性結合劑。在特定實施 態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係對EGFr多肽之 抗體。在特定實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑 係抗原結合區域。在特定實施態樣中，對EG Fr多肽之特 異性結合劑係對EGFr之抗體。在特定實施態樣中，對 -24- 200904828 EGFr多肽之特異性結合劑係帕尼單抗。 「對突變K-ras多肽之特異性結合劑」一詞係指與突 變K-ras多肽之任何部份特異性結合之特異性結合劑。在 特定實施態樣中，對突變K-ras多肽之特異性結合劑係對 突變K-ras多肽之抗體。在特定實施態樣中，對突變K-ras多肽之特異性結合劑係抗原結合區域。 「對突變B-raf多肽之特異性結合劑」一詞係指與突 變B-raf多肽之任何部份特異性結合之特異性結合劑。在 特定實施態樣中，對突變B-raf多肽之特異性結合劑係對 突變B-raf多肽之抗體。在特定實施態樣中，對突變B-raf多肽之特異性結合劑係抗原結合區域。 「特異性結合」一詞係指特異性結合劑以相較於與非 目標結合時更高之親和性與目標結合之能力。在特定實施 態樣中，特異性結合係指以相較於對非目標之親和性至少 高出1 0、5 0、1 0 0、2 5 0、5 0 0或1 0 0 0倍之親和性與目標 結合。在特定實施態樣中，親和性係由親和性ELISA試 驗測定。在特定實施態樣中，親和性係由BI Ac ore試驗測 定。在特定實施態樣中，親和性係由動力學方法測定。在 特定實施態樣中，親和性係由平衡/溶液法測定。在特定 實施態樣中，當抗體與其識別之一或多個抗原決定區（ epitope)之間的解離常數S1 μΜ，較佳$100 nM及最佳 S 1 0 nM時，該抗體被稱爲與抗原特異性結合。 在特定實例中，「天然抗體及免疫球蛋白」通常係約 150,000道耳頓之異四聚體（heterotetrameric)糖蛋白， -25 - 200904828 其由2條相同之輕鏈（L )及2條相同之重鏈（Η )組成 。每條輕鏈係由一個共價雙硫鍵與重鏈連接，然而在不同 免疫球蛋白同型的重鏈之間’雙硫鍵結數目有所差異。每 條重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內雙硫鍵。每條重鏈具 有位於一端的一個變異結構域（VH )，其後爲數個固定 結構域。每條輕鏈具有位於一端的一個變異結構域（V L )及位於另一端的一個固定結構域；輕鏈之固定結構域係 與重鏈之第一個固定結構域對齊，而輕鏈之變異結構域係 與重鏈之變異結構域對齊。特定胺基酸殘基被認爲在輕鏈 與重鏈之變異結構域之間形成介面（Chothia et al. J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:45 92 ( 1 985); Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))。 「抗體」一詞係指完整抗體及其抗原結合片段，該抗 原結合片段與完整抗體競爭特異性結合。「其抗原結合片 段」係指完整抗體分子之一部份或片段，其中該片段保留 抗原結合功能。結合片段係由重組DNA技術產製，或藉 由酵素或化學切割完整抗體產製，諸如以木瓜酵素切割。 結合片段包括 Fab、Fab，、F(ab’）2、Fv、單鏈抗體（「 scFv」）、Fd’及Fd片段。自單株抗體產製各種片段之方 法係爲該領域之技術人士所熟知（參見例如 Pluckthun, 1 992, Immunol. Rev. 130:151-188)。除了「雙 特異性」或「雙功能性」抗體以外，抗體的每個結合部位 被認爲是相同的。當多餘之抗體降低與反受體連接之抗體 -26- 200904828 量達至少約2 0 %、4 0 %、6 0 %或8 0 %，通常高於約8 5 %、 9 Ο %、9 5 %、9 6 %、9 7 %、9 8 %或9 9 %時（如試管內競爭結 合試驗所測量），抗體實質上抑制受體與反受體之連接。 「經分離」之抗體係經過識別及自其天然環境之成份 中分離及/或回收之抗體。其天然環境中之污染成份係將 干擾抗體之診斷或治療用途之物質，可能包括酵素、荷爾 蒙及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳之實施態樣中， 抗體將被純化（1 )至高於以抗體重量計之95%，其以洛 里（Lowry )法測定，及利用旋轉杯定序儀定序末端或內 部胺基酸，或（2 )至經SDS-PAGE分析之均質性，其在 還原或非還原狀態下利用考馬斯（Coomassie )藍或較佳 之銀染色。經分離之抗體包括在重組細胞內之原位（in situ )抗體，因爲該抗體之天然環境中的至少一個成份將 不存在。然而一般來說，經分離之抗體將由至少一個純化 步驟製備。 「變異」一詞係指抗體間之變異結構域的特定部份在 序列上有廣泛不同，且被用於各特定抗體對其特定抗原之 結合及特異性之事實。然而，變異狀態並非均勻地分布在 抗體之變異結構域中。其集中在位於輕鏈及重鏈變異結構 域中三段稱爲互補決定區（CDR)或高變異區之區段中。 變異結構域之較高度保留之部份稱爲骨架（FR )。天然 重鏈及輕鏈之變異結構域各包含四個FR區，FR區大部份 採取β-摺板構型並由三個CDR連接，CDR形成連接β-摺 板結構之環’在一些案例中形成β-摺板結構之部份。在 -27- 200904828 各鏈中之CDR藉由FR區被拉靠近一起，且與來自他鏈之 CDR形成抗體之抗原結合位置（參見Kabat et al. (1991) )。固定結構域和抗體與抗原之結合並無直接關係，但是 具有多種效應功能，諸如有抗體參與之抗體依賴性細胞毒 性。 「Fv」係最小化之抗體片段，其包含完整的抗原辨識 及結合位置。在二鏈之Fv中，此區域包含由一個重鏈變 異結構域及一個輕鏈變異結構域緊密、非共價地連接之二 聚體。在單鏈之Fv中，一個重鏈變異結構域及一個輕鏈 變異結構域可藉由可塑性肽連接子共價連接，以使該輕鏈 及重鏈可以類似二鏈Fv中之「二聚體」結構連接。在此 構型中，各變異結構域之三個CDR交互作用，以定義在 VH-VL二聚體表面之抗原結合位置。總結來說，該六個 CDR令抗體具有抗原結合特異性。然而，即便是單一變 異結構域（或半個Fv，其僅包含三個抗原特異性之CDR )也具有辨識及結合抗原之能力，雖然其親和性低於完整 的結合位置。 此處所稱之「超變異區」係指抗體中負責與抗原結合 之胺基酸殘基。超變異區通常包含來自「互補決定區」或 「CDR」之胺基酸殘基（例如在輕鏈變異結構域中之殘基 24-34(Ll) 、50-62(L2)及 89-97(L3)和在重鏈變異 結構域中之殘基 31-55 ( HI) 、50-65 ( H2)及 95- 1 02 ( H3) ；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National -28- 200904828

Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))及 / 或該些來 自「超變異環」之殘基（例如在輕鏈變異結構域中之殘基 26-32 ( L1) 、 50-52 (L2)及 91-96 (L3)和在重鏈變異 結構域中之殘基 26-32 ( H1 )、5 3 -55 ( H2 )及 96-101 ( H3 ) ;Chothia and Lesk J. Mol. Biol 1 96:90 1 -9 1 7 ( 1 987))。 「骨架區」或「FR」殘基係該些除此處定義之超變異區 殘基以外之變異結構域殘基。 此處所稱之「互補決定區」或「C D R」係指免疫受體 中的一部份，其與特定配體接觸並決定其特異性。免疫受 體之CDR係該受體蛋白質最具變異性之部份，令受體具 有多變性，且在該受體之變異結構域的遠端帶有六個環， 其中該受體之二個變異結構域各提供三個環。 「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性」及「ADCC」係指 細胞媒介之反應，其中表現F c受體（F c R )之非特異性細 胞毒性細胞（例如自然殺手（N K )細胞、嗜中性球及巨 噬細胞）辨識在目標細胞上之結合抗體，因而導致該目標 細胞溶解。媒介ADCC之原始細胞（NK細胞）僅表現 FcyRIII，然而單核球表現 FcyRI、FcyRII 及 FcyRIII。造 血細胞上之Fc表現摘列於Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 ( 1991)第464頁表3中。要評估所欲 分子之ADCC活性，可進行試管內ADCC試驗，諸如美國 專利第5,5〇0,3 62或5,82 1,3 3 7號中所描述者。可用於該 試驗之效應細胞包括週邊血液單核細胞（PBMC)及自然 殺手（NK )細胞。二者擇一地（或另外地），所欲分子 -29- 200904828 之ADCC活性可於活體內評估，例如於諸如Clynes et al. PNAS ( USA) 95:652-656 ( 1988)中所揭示之動物模型。 「抗原決定區」一詞包括任何可與免疫球蛋白及/或 T細胞受體特異性結合之蛋白質決定基。抗原決定區之決 定基通常係由分子之化學活性表面集團組成，諸如胺基酸 或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特 徵。 此處所稱之「劑質」係指化學化合物、化學化合物之 混合物、生物性巨分子或從生物性材料中製得之萃取物。 此處所稱之「標記」或「經標記」係指導入可偵測之 標記，例如藉由導入經放射線標記之胺基酸，或令多肽與 可被經標示之抗生物素蛋白（avidin )(例如包含可藉由 光學或比色法偵測之螢光標記或酵素活性之抗生蛋白鏈菌 素（streptavidin ))偵測之生物素基團連接。在特定情 況下，該標記或標誌亦可具有治療作用。許多標示多肽及 醣蛋白之方法爲本技術領域所熟悉且可被使用。用於多肽 之標記實例包括但不限於下列：放射性同位素或放射性核 種（例如 3H、14C、15N、35S、9°Y、99Tc、M 、1251、 131I)、螢光標記（例如FITC、若丹明（rhodamine )、 鑭系碟光體（lanthanide phosphors ))、酵素標記（例如 辣根過氧化酶、β -半乳糖苷1酶、螢光素酶（luciferase) 、鹼性磷酸酶）、化學發光劑群、生物素基群及由二次報 告體辨識之預定多肽抗原決定區（例如白胺酸拉鍊對序列 、二次抗體之結合位置、金屬結合結構域、抗原決定區標 -30- 200904828 籤）。在一些實施態樣中’標記連接不同長度之間隔臂以 減少可能的空間阻礙。 此處所稱之「藥劑或藥物」係指當適當給予病患時可 引起所欲之治療效果之化學化合物或組成物。其它此處之 化學名稱係根據該領域之慣常用法使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms ( Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco ( 1 9 8 5 )，以參照方式納入此 處）所示範。 此處所稱之「抗腫瘤劑」係指具有抑制人腫瘤發生或 進展之功能特性之藥劑，特別是惡性（癌性）病灶，諸如 癌瘤（carcinoma )、肉瘤（sarcoma )、淋巴瘤（ lymphoma )或白血病（leukemia)。抗腫瘤劑通常具有抑 制轉移之特性。在特定實施態樣中，抗腫瘤劑係帕尼單抗 〇 此處所稱之「實質上純」係指目標物質係主要存在之 物質（也就是以莫耳爲計算單位來說，該物質含量高於組 成物中任何其他個別物質），且較佳之實質上經純化之部 份係其中該目標物質包含至少約所有存在之巨分子物質之 5 0 % (以莫耳爲計算單位）的組成物。一般來說，實質上 純組成物將包含高於約8 0 %之所有存在於該組成物中之巨 分子物質，更佳爲高於約 8 5 %、9 0 %、9 5 %、9 6、9 7、9 8 或9 9 %。最佳的是，該目標物質係經純化爲必要均質性（ 無法以慣用檢測方法檢測出組成物中之污染物質），其中 該組成物實質上由單一巨分子物質組成。 -31 - 200904828 病患一詞包括人及動物個體。 就治療目的而言，「哺乳動物」及「動物」之名稱係 指任何被分類爲哺乳動物之動物，包括人、家畜及動物θ 、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛等。較佳的是， 哺乳動物係人。 「疾病狀態」一詞係指細胞或哺乳動物整體之生理狀 態，其中細胞或身體功能、系統或器官已經發生干擾、中 斷或異常。 所稱之「治療」或「處理」係指治療處理及預防或防 止方法，其中該目標係預防或減緩（減輕）非所欲之生理 變化或異常，諸如癌症之發生或擴散。就本發明之目的而 言，有益或所欲之臨床結果包括但不限於無論是可偵測或 不可偵測之症狀減輕、疾病範圍（程度）縮小、穩定（意 即不惡化）疾病狀態、疾病進行延遲或減緩、疾病狀態改 善或緩和及緩解（不論是部份或整體）。「治療」亦可表 示延長存活，相較於未接受治療之預期存活。該些需要治 療者包括該些已經具有狀況或異常者，以及該些傾向具有 狀況或異常者，或該些其中係欲防止該狀況或異常者。 此處所稱之「有反應」係指根據R E CI S Τ (實質腫瘤 反應評估標準），病患或腫瘤在給予藥劑後顯示完全反應 或部份反應。此處所稱之「無反應」係指根據RECIST， 病患或腫瘤在給予藥劑後顯示穩定性疾病或進行性疾病。 RECIST 係描述於例如 Therasse et al., February 2000, “New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in -32- 200904828

Solid Tumors，，，J. Natl. Cancer Inst. 92(3 ): 2 05-2 1 6，該 文以參照方式整體納入此處。示範性藥劑包括對E GFr多 肽之特異性結合劑，包括但不限於抗EGFr之抗體。 「異常」係可得益自一或多種處理之任何狀況。此包 括慢性及急性異常或疾病，其包括該些令哺乳動物易發生 懷疑異常之病理狀況。此處所欲治療之異常的非限制性實 例包括良性及惡性腫瘤、白血病及淋巴惡性疾病，特別是 乳癌、直腸癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾腺癌、腎 癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰癌、前列腺癌或膀胱癌。根據 本發明，所欲治療之較佳異常係惡性腫瘤，諸如子宮頸癌 及子宮頸上皮內鱗狀及腺細胞腫瘤、腎細胞癌（RC C )、 食道腫瘤及癌衍生性細胞系。 「與EGFr多肽相關之疾病或狀況」包括下列一或多 項：由EGFr多肽造成之疾病或狀況；由EGFr多肽促成 之疾病或狀況；及與EG Fr多肽存在有關之疾病或狀況。 在特定實施態樣中，與EGFr多肽有關之疾病或狀況係癌 症。示範性癌症包括但不限於非小細胞肺癌、乳癌、結腸 癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌及前列腺癌。 「與突變K-ras多肽相關之疾病或狀況」包括下列一 或多項：由突變K-ras多肽造成之疾病或狀況；由突變K-ras多肽促成之疾病或狀況；造成突變K-ras多肽之疾病 或狀況；及與突變K-ras多肽存在有關之疾病或狀況。在 特定實施態樣中，與突變K-ras多肽相關之疾病或狀況可 能於突變K-ras多肽不存在時存在。在特定實施態樣中， -33- 200904828 與突變K-ras多肽相關之疾病或狀況可能因突變K-ras多 狀存在而惡化。在特定實施態樣中，與突變K-r as多肽相 關之疾病或狀況係癌症。示範性癌症包括但不限於非小細 胞肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌、 卵巢癌及前列腺癌。 「與突變B -raf多肽相關之疾病或狀況」包括下列一 或多項：由突變B-raf多肽造成之疾病或狀況；由突變B-raf多肽促成之疾病或狀況；造成突變B-raf多肽之疾病 或狀況；及與突變B-raf多肽存在有關之疾病或狀況。在 特定實施態樣中，與突變B-raf多肽相關之疾病或狀況可 能於該突變不存在時存在。在特定實施態樣中，與突變 B-raf多肽相關之疾病或狀況可能因突變B-raf多肽存在 而惡化β在特定實施態樣中，與突變B-raf多肽相關之疾 病或狀況係癌症。示範性癌症包括但不限於非小細胞肺癌 、乳癌、結腸癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌 及前列腺癌。 在「組合醫療」中，病患接受對目標抗原之特異性結 合劑與化學治療或抗腫瘤劑及/或放射線治療之組合物的 治療。在特定實施態樣中，該特異性結合劑係帕尼單抗。 試驗設計將藉由減少腫瘤質量及降低標準化學療法之常用 劑量之能力來評估有效性。藉由降低該化學治療劑之劑量 相關毒性，這些劑量降低將允許額外及/或延長治療。 「單一醫療」係指藉由投服無伴隨化學治療或抗腫瘤 劑之免疫療法予病患以治療疾病。在特定實施態樣中，單 -34- 200904828 一醫療包含在化學治療或抗腫瘤劑及/或放射線治療不存 在下投服帕尼單抗。 特定實施態樣 在特定實施態樣中，本發明提供診斷個體中關於一或 多個K-ras突變之疾病或狀況之方法。在特定實施態樣中 ，本發明提供診斷個體中關於一或多個B-raf突變之疾病 或狀況之方法。 在特定實施態樣中，診斷個體中關於一或多個K-ras 突變之疾病或狀況之方法包含：（a)測定來自個體之樣 本中突變K-ras多肽之存在或表現量；及（b)根據該多 肽之存在或表現量診斷關於一或多個K-ras突變之疾病或 狀況。在特定實施態樣中，診斷個體中關於一或多個κ_ ras突變之疾病或狀況之方法包含：（a)測定來自個體之 樣本中突變K-ras多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量；及（ b)根據該多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量診斷關於一或 多個K-ras突變之疾病或狀況。在特定實施態樣中，該疾 病或狀況係癌症。 在特疋貫施態樣中’診斷個體中關於一或多個K_ras 突變之疾病或狀況之方法包含：（a)測定多肽之存在或 表現量，該多肽包含至少一個選自SEQIDn〇:4、SEq ID NO： SEQ ID NO: SEQ ID NO： 10. SEQ ID N〇： !2、SEQ ID N0: 14及SEQ ID N〇:〗6之胺基酸序列；及 (Μ根據該多肽之存在或表現量診斷關於一或多個K_ras -35- 200904828 突變之疾病或狀況。在特定實施態樣中，診斷個體 一或多個K-ras突變之疾病或狀況之方法包含： 定來自個體之樣本中多核苷酸之存在或轉錄或轉譯 多核苷酸編碼至少一個選自SEQ ID NO: 4、SEQ 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 1 ID NO: 14及SEQ ID NO: 16之胺基酸序歹[J ;及（b 該多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量診斷關於一或多 ras突變之疾病或狀況。在特定實施態樣中，該疾 況係癌症。 在特定實施態樣中，本發明提供診斷個體中關 多個B-raf突變之疾病或狀況之方法。在特定實施 ，診斷個體中關於一或多個B-raf突變之疾病或狀 法包含：（a )測定來自個體之樣本中突變B-raf 存在或表現量；及（b)根據該多肽之存在或表現 關於一或多個B-raf突變之疾病或狀況。在特定實 中，診斷個體中關於一或多個B-raf突變之疾病或 方法包含：（a )測定來自個體之樣本中突變B-ra 苷酸之存在或轉錄或轉譯量；及（b)根據該多核 存在或轉錄或轉譯量診斷關於一或多個B-raf突變 或狀況。在特定實施態樣中，該疾病或狀況係癌症 在特定實施態樣中，診斷個體中關於一或多個 突變之疾病或狀況之方法包含：（a )測定來自個 本中多肽之存在或表現量，該多肽包含SEQ ID NO 胺基酸序列；及（b )根據該多肽之存在或表現量 中關於 (a )測 量，該 ID NO： 2、SEQ I )根據 病或狀 於一或 態樣中 況之方 多肽之 量診斷 施態樣 狀況之 f多核 苷酸之 之疾病 〇 B-raf 體之樣 :20之 診斷關 -36- 200904828 於一或多個B-raf突變之疾病或狀況。在特定實施態樣中 ，診斷個體中關於一或多個B_raf突變之疾病或狀況之方 法包含：（a)測定來自個體之樣本中多核苷酸之存在或 轉錄或轉譯量，該多核苷酸編碼SEQ ID NO: 20之胺基酸 序列；及（b )根據該多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量診 斷關於一或多個B-raf突變之疾病或狀況。在特定實施態 樣中，該疾病或狀況係癌症。 在特定實施態樣中，本發明提供診斷個體對疾病或狀 況的易感性之方法，該疾病或狀況係關於一或多個K-ras 突變。在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個κ_ ras突變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來 自個體之樣本中突變K-ras多肽之存在或表現量；及（b )根據該多肽之存在或表現量診斷對關於一或多個K-ras 突變之疾病或狀況的易感性。在特定實施態樣中，診斷個 體對關於一或多個K-ras突變之疾病或狀況的易感性之方 法包含：（a )測定來自個體之樣本中突變κ-ras多核苷 酸之存在或轉錄或轉譯量；及（b )根據該多核苷酸之存 在或轉錄或轉譯量診斷對關於一或多個K-ras突變之疾病 或狀況的易感性。在特定實施態樣中，該疾病或狀況係癌 症。

在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個K-ras 突變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來自 個體之樣本中多肽之存在或表現量，該多肽包含至少一個 選自 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ -37- 200904828

ID NO: 10' SEQ ID NO： 12、SEQ ID NO: 14 及 SEQ ID NO: 16之胺基酸序列；及（b)根據該多肽之存在或表現 量診斷對關於一或多個K-ras突變之疾病或狀況的易感性 。在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個K-ras突 變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來自個 體之樣本中多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量，該多核苷酸 編碼至少一個選自 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10 ' SEQ ID NO: 12 ' SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16之胺基酸序列；及（b)根據該多核 苷酸之存在或轉錄或轉譯量診斷對關於一或多個K-ras突 變之疾病或狀況的易感性。在特定實施態樣中，該疾病或 狀況係癌症。 在特定實施態樣中，本發明提供診斷個體對疾病或狀 況的易感性之方法’該疾病或狀況係關於一或多個B-raf 突變。在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個B -raf突變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來 自個體之樣本中突變B-raf多肽之存在或表現量；及（b )根據該多肽之存在或表現量診斷對關於一或多個B-raf 突變之疾病或狀況的易感性。在特定實施態樣中，診斷個 體對關於一或多個B-raf突變之疾病或狀況的易感性之方 法包含：（a )測定來自個體之樣本中突變B_raf多核苷 酸之存在或轉錄或轉譯量；及（b )根據該多核苷酸之存 在或轉錄或轉譯量診斷對關於一或多個B-raf突變之疾病 或狀況的易感性。在特定實施態樣中，該疾病或狀況係癌 -38- 200904828 症。 在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個B-raf 突變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來自 個體之樣本中多肽之存在或表現量，該多肽包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列；及（b )根據該多肽之存在或表現 量診斷對關於一或多個B-raf突變之疾病或狀況的易感性 。在特定實施態樣中，診斷個體對關於一或多個B-raf突 變之疾病或狀況的易感性之方法包含：（a )測定來自個 體之樣本中多核苷酸之存在或轉錄或轉譯量，該多核苷酸 編碼SEQ ID NO: 20之胺基酸序列；及（b )根據該多核 苷酸之存在或轉錄或轉譯量診斷對關於一或多個B-raf突 變之疾病或狀況的易感性。在特定實施態樣中，該疾病或 狀況係癌症。 在特定實施態樣中，本發明提供測定編碼突變K-ras 多肽之多核苷酸存在或不存在之方法。在特定實施態樣中 ’測定編碼突變K - r a s多肽之多核苷酸存在或不存在於樣 本中之方法包含（a)暴露樣本在探針下，該探針與編碼 突變K-ras多狀之區域之多核苷酸雜交，其中該區域包含 至少 ^'個 ^ 自 G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A 或G13D之K-ras突變，及（b)測定編碼突變K_ras多肽 之多核苷酸存在或不存在於樣本中。在特定實施態樣中， 測定突變K-r as多肽存在或不存在於樣本中之方法包含（ a)暴露樣本在探針下，該探針與編碼突變K_ras多肽之 區域之多核苷酸雜交，其中該區域包含至少一個選自 -39- 200904828 G12S、G12V、G12D、G12A > G12C、G13A 或 G13D 之 liras 突 變’及 （ b ) 測 定突變 K-ras 多 肽存在 或不存 在於樣 本中。 在特定實施態樣中，本發明提供測定編碼突變B-raf 多肽之多核苷酸存在或不存在之方法。在特定實施態樣中 ’測定編碼突變B-raf多肽之多核苷酸存在或不存在於樣 本中之方法包含（a)暴露樣本在探針下，該探針與編碼 突變B-raf多狀之區域之多核苷酸雜交，其中該區域包含 V600E突變，及（b)測定編碼突變B-raf多肽之多核苷 酸存在或不存在於樣本中。在特定實施態樣中，測定突變 B-raf多肽存在或不存在於樣本中之方法包含（a)暴露樣 本在探針下，該探針與編碼突變B-raf多肽之區域之多核 苷酸雜交，其中該區域包含V 6 0 0 E突變，及（b )測定突 變B-raf多肽存在或不存在於樣本中。 在特定實施態樣中，本發明提供在特定之個體族群中 建立突變K-ras族群檔案之方法，其包含：（a )測定至 少一個K-ras突變存在於族群中之個體的基因檔案中；及 (b )建立突變K-ras基因檔案與個體之間的關係。在該 特定實施態樣中，個體之特定特徵包括發生關於K-ras突 變之疾病或狀況的易感性。在該特定實施態樣中，個體之 特定特徵包括展現關於K-ras突變之疾病或狀況。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌症之個體 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方法，其包 含測定K-ras突變G12S存在或不存在於個體中。在特定 -40- 200904828 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方 含測定K-ras突變G12V存在或不存在於個體中 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌 對EGFr多狀之特異性結合劑之治療無反應之方 含測定K-ras突變G12D存在或不存在於個體中 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方 含測定K-ras突變G12A存在或不存在於個體中 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方 含測定K-ras突變G12C存在或不存在於個體中 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方 EGFr ίπ： 症之個體 法，其包 。在特定 EGFr 抗 症之個體 法，其包 。在特定 EGFr 抗 症之個體 法，其包 。在特定 EGFr 抗 症之個體 法，其包 。在特定 EGFr 抗 症之個體 法，其包 -41 - 200904828 含測定K-ras突變G13A存在或不存在於個體中。在特定 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗EGFr抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌症之個體 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方法，其包 含測定K-ras突變G13D存在或不存在於個體中。在特定 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗EGFr抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌症之個體 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方法，其包 含測定K-ras突變存在或不存在於個體之K-ras胺基酸12 及/或K-ras胺基酸13中。在特定實施態樣中，對EGFr 多肽之特異性結合劑係抗EGFr抗體。在該特定實施態樣 中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供偵測個體中編碼突變 K-ras多肽之多核苷酸的套組。在該特定實施態樣中，該 套組包含與編碼突變K-ras多肽之區域的多核苷酸雜交之 探針，其中該區域包含至少一個選自G12S、G12V、G12D 、G12A、G12C、G13A 或 G13D 之 K-ras 突變。在特定實 施態樣中，該套組進一步包含二或多個擴增引子。在特定 實施態樣中，該套組進一步包含偵測成份。在特定實施態 樣中，該套組進一步包含核酸採樣成份。 在特定實施態樣中，本發明提供在特定之個體族群中 建立突變B-raf族群檔案之方法，其包含：（a )測定至 -42- 200904828 少一個B-raf突變存在於族群中之個體的基因檔案中；及 (b)建立突變B-raf基因檔案與個體之間的關係。在該 特定實施態樣中，個體之特定特徵包括發生關於B-raf突 變之疾病或狀況的易感性。在該特定實施態樣中，個體之 特定特徵包括展現關於B-raf突變之疾病或狀況。 在特定實施態樣中，本發明提供預測罹患癌症之個體 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方法，其包 含測定B-raf突變V600E存在或不存在於個體中。在特定 實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑係抗EGFr抗 體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供測定罹患癌症之個體 對EGFr多肽之特異性結合劑之治療無反應之方法，其包 含測定B-raf突變存在或不存在於個體之B-raf胺基酸 6 00中。在特定實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合 劑係抗E G F r抗體。在該特定實施態樣中，該抗體係帕尼 單抗。 在特定實施態樣中，本發明提供偵測個體中編碼突變 B-raf多肽之多核苷酸的套組。在該特定實施態樣中，該 套組包含與編碼突變B-raf多肽之區域的多核苷酸雜交之 探針，其中該區域包含V600E突變。在特定實施態樣中 ，該套組進一步包含二或多個擴增引子。在特定實施態樣 中，該套組進一步包含偵測成份。在特定實施態樣中，該 套組進一步包含核酸採樣成份。 在特定實施態樣中，對EGFr多肽之特異性結合劑之 -43- 200904828 治療無反應係利用RECIST (實質腫瘤反應評估標準）測 定。根據RECIST之完全反應及部份反應均被認爲係對 EGFr多肽之特異性結合劑之治療有反應。穩定性疾病及 進行性疾病均被認爲係對EGFr多肽之特異性結合劑之治 療無反應。RECIST係爲該領域所熟知及描述於例如 Therasse e t a 1., February 2000， “New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors,” J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-2 1 6，該文以參照方式納入 此處以適用任何目的。 在特定實施態樣中，K-ras突變及/或B-raf突變係經 偵測。在特定實施態樣中，K-ras突變及/或B-raf突變係 藉由偵測該突變K-ras多核苷酸及/或該突變B-raf多核苷 酸偵測。在特定實施態樣中，K - r a s突變及/或B - r a f突變 係藉由偵測該突變K-ras多肽及/或該突變B-raf多肽偵測 〇 用於偵測多核苷酸中之突變之特定方法係爲該領域所 知。該特定示範性方法包括但不限於定序、引子延伸反應 、電泳、picogreen染色檢測、寡核苷酸連接試驗、雜交 試驗、TaqMan試驗、SNPlex試驗及描述於例如美國專利 第 5,47 0，705 、5，5 1 4,543 、5，5 80,73 2 、5,624,800、 5,807,682 > 6,759,202 > 6,756,204 ^ 6,734,296 > 6,395,486 號及美國專利公開號US2003-0190646 A1。 在特定實施態樣中，偵測多核苷酸中之突變首先係包 含擴增可能包含該突變之多核苷酸。擴增多核苷酸之特定 -44 - 200904828 方法係爲該領域中所知。該擴增產物可被用於任何 描述或該領域所知之用於偵測多核苷酸中之突變之 偵測多核苷酸中之突變之特定方法係爲該領域 該特定示範性方法包括但不限於利用對該突變多肽 性之特異性結合劑偵測。其他偵測突變多肽之方法 不限於電泳及肽定序。 偵測多核苷酸及/或多肽中之突變之特定示範 係描述於例如 Schimanski et al. (1999) Canee 5 9:5 1 69-5 1 75; Nagasaka et al. (2004) J. Clin. 22:45 84-45 96; PCT 公開號 WO 2007/00 1 8 6 8 Al;美 公開號 2005/0272083 Al ;及 Lievre et al. (2006) Res. 66: 3992-3994 ° 在特定實施態樣中，本發明提供包含一或多個 酸之微陣列，該多核苷酸編碼一或多個突變K-ras 在特定實施態樣中，本發明提供包含一或多個多核 微陣列，該多核苷酸與編碼一或多個突變K-ras多 或多個多核苷酸互補。在特定實施態樣中，本發明 含一或多個多核苷酸之微陣列，該多核苷酸編碼一 突變B - raf多肽。在特定實施態樣中，本發明提供 或多個多核苷酸之微陣列，該多核苷酸與編碼一或 變B-raf多肽之一或多個多核苷酸互補。 在特定實施態樣中，一或多個突變K-ras多核 在或不存在於二或多個細胞或組織樣本係利用微陣 檢測。在特定實施態樣中，一或多個突變K-ras多 此處所 方法。 所知。 具特異 包括但 性方法 r Res.， Oncol., 國專利 Cancer 多核苷 多肽。 苷酸之 肽之一 提供包 或多個 包含一 多個突 苷酸存 列技術 核苷酸 -45 - 200904828 在二或多個細胞或組織樣本中之量係利用微陣列技術檢測 〇 在特定實施態樣中’ 一或多個突變B-raf多核苷酸存 在或不存在於二或多個細胞或組織樣本係利用微陣列技術 檢測。在特定實施態樣中，一或多個突變B-raf多核苷酸 在二或多個細胞或組織樣本中之量係利用微陣列技術檢測 〇 在特定實施態樣中，一或多個突變K-ras多肽存在或 不存在於二或多個細胞或組織樣本係利用微陣列技術檢測 。在該特定實施態樣中，首先自細胞或組織樣本中抽取 mRNA接著轉成與微陣列雜交之cDNA。在該特定實施態 樣中，與該微陣列特異性結合之cDN A存在或不存在係該 突變K-ras多肽存在或不存在之指標。在該特定實施態樣 中，一或多個突變iC-ras多肽之表現程度係藉由定量與該 微陣列特異性結合之cDNA的量以檢測。 在特定實施態樣中，一或多個突變B-raf多肽存在或 不存在於二或多個細胞或組織樣本係利用微陣列技術檢測 。在該特定實施態樣中，首先自細胞或組織樣本中抽取 mRNA接著轉成與微陣列雜交之cDNA。在該特定實施態 樣中’與該微陣列特異性結合之cDNA存在或不存在係該 突變B-raf多肽存在或不存在之指標。在該特定實施態樣 中’ 一或多個突變B-raf多肽之表現程度係藉由定量與該 微陣列特異性結合之cDNA的量以檢測。 在特定實施態樣中，本發明提供包含一或多個對一或 -46- 200904828 多個突變K-ras多肽之特異性結合劑之微陣列。在該特定 實施態樣中，一或多個突變K-ras多肽存在或不存在於細 胞或組織中係經檢測。在該特定實施態樣中，一或多個突 變K-r as多肽在細胞或組織中之量係經檢測。 在特定實施態樣中，本發明提供包含一或多個對一或 多個突變B-raf多肽之特異性結合劑之微陣列。在該特定 實施態樣中，一或多個突變B-raf多肽存在或不存在於細 胞或組織中係經檢測。在該特定實施態樣中，一或多個突 變B-raf多肽在細胞或組織中之量係經檢測。 下列提供之實施例（包括所進行之試驗及所達成之結 果）僅用於說明目的，不應被視爲對申請專利範圍之限制 【實施方式】 實施例1 轉移性結直腸癌對帕尼單抗治療之反應 來自25名具有轉移性結直腸癌病患之腫瘤被納入帕 尼單抗（Amgen, Thousand Oaks, CA)之臨床試驗。所有 病患具有EGFr表現之轉移性結直腸癌及1%或更多之惡 性細胞，其中惡性細胞之EGFr經 DAKO EGFRPharmDX 套組（DakoCytomation，Glostrup, Denmark)之免疫組織 化學分析染色。 病患每2週接受6 mg/kg之帕尼單抗靜脈注射直到進 行至接受對奧沙利鉑（oxaliplatin )及伊立替康（ -47- 200904828 i r i η 〇 t e c a η )治療具抗性病患之第三線或第四線治療。腫 瘤反應係利用CT或MRI評估，並利用RECIST (實質腫 瘤反應評估標準）進行統計分析。RECIST提供根據腫瘤 大小鑑別完全反應 '部份反應、穩定性疾病或進行性疾病 之指南（參見例如 Therasse et al.，February 2000，“New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors,” J. Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216 )。 在2 5名病患中，4名顯示對治療之部份反應，8名顯 示穩定性疾病及1 3名顯示進行性疾病’如表1中所示。 -48- 200904828 表1 :以帕尼單抗治療之轉移性結直腸癌病患之臨床特徵。 病患號碼 年齡 性別 轉移性疾病之治療線數 腫瘤反應 最佳反應 期間（週） 1 59 Μ 4th PR 31 2 62 F 3rd PR 23 3 57 Μ 3rd SD 15 4 78 F 4th PR 24 5 63 Μ 3rd PR 15 6 71 Μ 3rd SD 32 7 60 Μ 4th SD 24 8 58 Μ 4th PD ΝΑ 9 68 Μ 4th SD 23 10 56 Μ 2nd PD ΝΑ 11 67 F 3 rd PD ΝΑ 12 54 Μ 3rd PD ΝΑ 13 65 F 4th PD ΝΑ 14 57 Μ 4th PD ΝΑ 15 62 F 4th PD ΝΑ 16 46 F 31^ PD ΝΑ 17 53 F 4th PD ΝΑ 18 67 Μ 3rd PD ΝΑ 19 61 Μ 4th PD ΝΑ 20 70 F 4th PD ΝΑ 21 63 F 3rd SD 15 22 44 Μ 4th SD 16 23 47 F 31^ PD ΝΑ 24 52 F 4th SD 16 25 53 F 4th SD 31 PR=部份反應；SD=穩定疾病；PD=進行疾病 -49- 200904828 實施例2 K-RAS、B-RAF及EGFR在轉移性結直腸癌病患中之突變 分析 要測定K-ras、B-raf及/或EGFr突變是否與轉移性結 直腸癌對帕尼單抗之反應有關，對每名病患之K-ras之外 顯子2、B-raf之外顯子15及21和EGFr之外顯子9及 20定序。 製備每名病患10微米之石蠟包埋樣本。將2微米之 切片脫鱲，以蘇木精伊紅染色及分析形態學細節。標示顯 示腫瘤組織之區域，依照 Moroni et al. Lancet Oncol. 6:279-286 ( 2005 )中所述自該組織抽取DN A。 外顯子特異性引子及定序引子係利用Primer3軟體（ http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/prxmer3_www.cgi )設計及由Invitrogen合成。K-ras之外顯子2、B-raf之 外顯子15及21和EGFr之外顯子9及20係以PCR利用 對各外顯子具特異性之引子擴增。該領域之技術人士可利 用K-ras及B-raf之基因序列設計適當引子。 野生型 K-ras多肽序列係顯示於圖 2A ( SEQ ID NO:2; Genbank 登錄號 NP-004976 )。野生型 K-ras 之 cDNA序列亦顯示於圖2A(SEQ ID NO: 1; Genbank登錄 號ΝΜ_004985 )。該基因體野生型K-ras核苷酸序列可見 於 Genbank 登錄號 NM_004985。 野生型 B-raf多肽序列係顯示於圖3B ( SEQ ID NO:18; Genbank 登錄號 NP_004324 )。野生型 B-raf 之 -50- 200904828 cDNA序列係顯示於圖3A ( SEQ ID NO: 17; Genbank登錄 號NM_0043 3 3 )。該基因體野生型B-raf核苷酸序列可見 於例如 Genbank 登錄號 NT_〇07914.14。 野生型EGFr多肽序列係顯示於例如pct公開號WO 2006/091899 A1 之圖 6C( Genbank 登錄號 AAS83109)。 野生型EGFr之cDNA序列係顯示於例如PCT公開號WO 2006/091899 A1 之圖 6A 及 6B ( Genbank 登錄號 AC006977 )。該基因體野生型EGFr核苷酸序列可見於 Genbank 登錄號 AC073324。 在20微升體積中，利用遞減PCR程式在先前描述之 條件下進行PCR以擴增來自腫瘤基因體DNA之外顯子特 異性區域。參見例如 Bardelli et al·，Science 300: 949 ( 2003 )。純化之 PCR 產物係利用 BigDye® Terminator v 3 .1 Cycle Sequencing Kit ( Applied Biosystems )定序並 在3 73 0 ABI毛細電泳系統上分析。來自第13號病患之腫 瘤組織因爲量之限制，技術上無法對所有外顯子進行突變 分析。 該分析之結果顯示於表2。 -51 - 200904828

表2 :轉移性結直腸癌之K-ras、B-raf及EGFr突變分析。 病患號碼 序列分析 最佳反應 K-ras B-raf EGFr 1 WT WT WT PR 2 G13D WT WT PR 3 G12D WT WT SD 4 WT WT WT PR 5 WT WT WT PR 6 G12V WT WT SD 7 WT V600E WT SD 8 WT WT WT PD 9 WT V600E WT SD 10 WT WT WT PD 11 G13D WT WT PD 12 WT WT WT PD 13 WT V600E WT PD 14 G12V WT WT PD 15 WT WT WT PD 16 G12V WT WT PD 17 G12D WT WT PD 18 WT V600E WT PD 19 WT WT WT PD 20 G13A WT WT PD 21 G12V WT WT SD 22 WT V600E WT SD 23 WT V600E WT PD 24 G13D WT WT SD 25 WT WT WT SD 在25個腫瘤中的10個或40%偵測到K-ras突變。6 個該些突變係位於密碼子1 2，4個係位於密碼子1 3。 在25個腫瘤中的6個或24%偵測到B-raf突變。所 -52- 200904828 有B-raf突變係位於密碼子600(先前描述之V599E突變 )。在檢測之2 5個腫瘤中未發現E G F r突變。 總結來說，總計64%之腫瘤在K-ras或B-raf中具有 突變（但沒有一個受測腫瘤具有二種突變）。在16個具 有K-ras或B-raf突變之腫瘤中只有1個或6%顯示對帕尼 單抗治療之反應。其餘15個或94%具有K-ras或B-raf突 變之腫瘤在帕尼單抗治療後顯示進行性疾病或穩定性疾病 。相反的，在9個缺乏K-ras或B-raf突變之腫瘤中有3 個或33 %顯示對帕尼單抗治療有反應。 該些資料摘列於圖1。在此試驗中，在K-ras密碼子 12或13或B-raf密碼子600之突變係與對帕尼單抗治療 無反應有關。 其他實施態樣將爲該領域之技術人士在考慮本發明所 揭示之說明及實例後而顯而易見，希望該說明及實施例僅 被視爲示範之用。 【圖式簡單說明】 圖1顯示接受抗體帕尼單抗治療之轉移性結直腸癌（ mCRC)病患之反應。「Mut+」顯示病患具有κ-ras或B-raf突變。「Mut-」顯示病患不具 K-ras或 B-raf突變。 S D代表穩定性疾病。P D代表進行性疾病。p R代表部份 反應。 圖2A至2H顯示野生型K-ras(SEQ ID NO: 1及2) 、G12S 突變 K-ras(SEQ ID NO: 3 及 4) 、G12V 突變 K- -53- 200904828 ras ( SEQ ID NO: 5 及 6 ) 、G1 2D 突變 K-ras ( NO: 7 及 8) 、G12A 突變 K-ras ( SEQ ID NO: 9 及

G12C 突變 K-ras ( SEQ ID NO: 11 及 12) 、G13 A ras ( SEQ ID NO: 13 及 14)及 G13D 突變 K-ras ( NO: 15及16 )之cDNA及胺基酸序列。 圖3A至3D顯示野生型B-raf(SEQ ID NO: )及 V600E 突變 B-raf ( SEQ ID NO: 19 及 20) _h 及胺基酸序列。

SEQ ID 1 0 )、 突變K-SEQ ID 17 及 18 匕 cDNA -54- 200904828 序列表 <110> Siena, Salvatore Bardel1i, Alberto <120> K-ras及B-raf突變及抗表皮生長因子受體(EGFr)抗體治療 <130> 6843.117-304 <150> 60/906,976 <151> 2007-03-13 <160> 20 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 1 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa <210> 2 <211> 18S <212> PRT <213>智人 <400> 2

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 15 10 15

Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80

Val Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tyr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 200904828 100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125

Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly He Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gla Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210〉 3 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 3 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa : <210> 4 ^ <211> 1S8 <212> PRT <213>智人 <400> 4

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys 15 10 15

Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 -2- 200904828

Val Phc Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tyr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125

Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly lie Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210> 5 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 5 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattetega cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgeetteta tacattagtt 480 egagaaatte gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 <210> 6 <211> 188 <212> PRT <213>智人 <400> 6

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 15 10 35

Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45 -3- 200904828

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80

Val Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tvr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 no

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Lr Va, Asp Thr Lys

Gin Ala Gin Asp Leu A,aArf Ser Tyr Gly I.e Pro Phe lie Glu Τ,γ

Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210〉 7 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 7 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa <210> 8 <211> 188 <212> PRT <213〉智人 <400> 8

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 15 10 15 -4- 200904828

Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Ala Gly Gin Glu Glu Tyr

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Val Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tyr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125

Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly He Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210> 9 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 9 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgctggcg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctUgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 1018s ^ > > > 012 3 11 Ti 11 n 2222 200904828 <400> 10

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys 15 10 15

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Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210> 11 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 11 60 120 180 240 300 360 420 480 540 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattetega cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgeetteta tacattagtt egagaaatte gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag -6- 200904828 567 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa <210> 12 <211> 188 <212> PRT <213>智人 <400〉 12

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 15 10 15

Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr He Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80

Val Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tyr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 no

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125

Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly lie Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210> 13 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 13 60 120 180 240 300 360 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtgccg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 200904828 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 <210> 14 <211> 188 <212> PRT <213>智人 <400> 14

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Lys 15 10 15

Ser Ala Leu Thr He Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp lie Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80

Val Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp lie His His Tyr 85 90 95

Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125

Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly lie Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160

Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185 <210> 15 <211> 567 <212> DNA <213>智人 <400> 15 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtgacg taggcaagag tgccttgacg 60 120 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 180 200904828 240 300 360 420 480 540 567 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa <210> 16 <211> 188 <212> PRT <213>智人 <400> 16

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Ser Ala Leu Thr lie Gin Leu lie Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30

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Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110

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Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly lie Pro Phe lie Glu Thr 130 135 140

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Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175

Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val lie Met 180 185

<210〉 17 <211> 2301 <212> DNA 9- 200904828 <213>智人 <400> 17 atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac 60 ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac 120 cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat 180 atagaggccc tattggacaa atttggtggg gagcataatc caccatcaat atatctggag 240 gcctatgaag aatacaccag caagctagat gcactccaac aaagagaaca acagttattg 300 gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt 360 acatcttctt cctcttctag cctttcagtg ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat 420 cccacagatg tggcacggag caaccccaag tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc 480 ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt 540 ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta atcccagagt gctgtgctgt ttacagaatt 600 caggatggag agaagaaacc aattggttgg gacactgata tttcctggct tactggagaa 660 gaattgcatg tggaagtgtt ggagaatgtt ccacttacaa cacacaactt tgtacgaaaa 720 acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc 780 tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt 840 gttaattatg accaacttga tttgctgttt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 900 ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact gccctaacat ctggatcatc cccttccgca 960 cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt 1020 ccaattccac agcccttccg accagcagat gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga 1080 gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140 gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt gatggaggat caaccacagg tttgtctgct 1200 accccccctg cctcattacc tggctcacta actaacgtga aagccttaca gaaatctcca 1260 ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca 1320 cttggtagac gggactcgag tgatgattgg gagattcctg atgggcagat tacagtggga 1380 caaagaattg gatctggatc atttggaaca gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg 1440 gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat 1500 gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc 1560 acaaagccac aactggctat tgttacccag tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat 1620 ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg atcaaactta tagatattgc acgacagact 1680 gcacagggca tggattactt acacgccaag tcaatcatcc acagagacct caagagtaat 1740 aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagtg 1800 aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg I860 gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa aatccataca gctttcagtc agatgtatat 1920 gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg actggacagt taccttattc aaacatcaac 1980 aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040 gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa 2100 agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca 2160 -10- 200904828 2220 2280 2301 ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa ccctccttga atcgggctgg tticcaaaca gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat ggtgcgtttc ctgtccactg a <210> 18 <211> 766 <212> PRT <213>智人 <400> 18

Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gin 1 5 10 15

Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30

Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala lie Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45

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Gin Gin Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110

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Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gin Lys Pro lie Val Arg Val Phe 145 150 155 160

Leu Pro Asn Lys Gin Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175

Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu lie Pro 180 185 190

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Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415

Gin Lys Ser Pro Gly Pro Gin Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430

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Asp Trp Glu lie Pro Asp Gly Gin lie Thr Val Gly Gin Arg lie Gly 450 455 460

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Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gin Gin Leu Gin 485 490 495

Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 lie Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gin Leu Ala lie Val 515 520 525

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Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala lie Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45

Asn lie Lys Gin Met lie Lys Leu Thr Gin Glu His lie Glu Ala Leu 50 55 60

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Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gin Gin Arg Glu 85 90 95

Gin Gin Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110

Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125

Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gin Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140

Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gin Lys Pro lie Val Arg Val Phe 145 150 155 160

Leu Pro Asn Lys Gin Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175

Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu lie Pro 180 185 190

Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg lie Gin Asp Gly Glu Lys Lys Pro lie 195 200 205

Gly Trp Asp Thr Asp lie Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 1 210 215 220

Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240

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Gin Gly Phe Arg Cys Gin Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gin Arg Cys 260 265 270

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Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro lie Pro Gin Glu Glu 290 295 300

Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala -15- 200904828 305 310 315 320

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Ser Lys Ser lie Pro lie Pro Gin Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350

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Asp Gin Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400

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Gin Lys Ser Pro Gly Pro Gin Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430

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Asp Trp Glu lie Pro Asp Gly Gin lie Thr Val Gly Gin Arg lie Gly 450 455 460

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Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 lie Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gin Leu Ala lie Val 515 520 525

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Gin Phe GIu Gin Leu Ser Gly Ser lie Leu Trp Met Ala Pro GIu Val 610 615 620 lie Arg Met Gin Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gin Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640

Ala Phe Gly lie Val Leu Tyr GIu Leu Met Thr Gly Gin Leu Pro Tyr 645 650 655

Ser Asn lie Asn Asn Arg Asp Gin lie lie Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670

Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685

Met Lys Arg Leu Met Ala GIu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp GIu Arg 690 695 700

Pro Leu Phe Pro Gin He Leu Ala Ser lie GIu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720

Leu Pro Lys lie His Arg Ser Ala Ser GIu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735

Gly Phe Gin Thr GIu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750

Thr Pro lie Gin Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765 •17-

Claims (1)

1. 200904828 十、申請專利範圍 1. 一種預測病患是否將對表皮生長因子受體（EGFr) 多肽之特異性結合劑治療無反應之方法，其包含測定K-ras突變存在或不存在於該病患之腫瘤中，其中該K-ras 突變係位於密碼子12或密碼子I3 ;且其中如果K-ras突 變存在，則預測該病患將對EGFr多肽之特異性結合劑治 療無反應。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中測定K-ras突 變存在或不存在於腫瘤中係包含擴增自該腫瘤之K-ras核 酸及對該擴增之核酸定序。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中對EGFr多肽 之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中抗EGFr抗體 係帕尼單抗（panitumumab)。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中測定K-ras突 變存在或不存在於腫瘤中係包含利用對突變K-ras多肽之 特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變K-ras多肽。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中K-ras突變係 選自 G12S 、 G12V 、 G12D 、 G12A、 G12C、 G13A 或 G13D 〇 7. —種預測腫瘤是否將對EGFr多肽之特異性結合劑 治療無反應之方法，其包含測定K-ras突變存在或不存在 於該腫瘤之樣本中，其中該K-ras突變係位於密碼子j 2 或密碼子13;且其中K-ras突變存在係顯示該腫瘤將對 200904828 EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應。 8 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中測定K-ras突 變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含擴增自該腫瘤之 K-ras核酸及對該擴增之核酸定序。 9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中對EGFr多肽 之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中抗EGFr抗體 係帕尼單抗。 1 1 .如申請專利範圍第7項之方法，其中測定K-ras 突變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含利用對突變 K-ras多肽之特異性結合劑偵測突變κ-ras多肽。 1 2 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中K - r a s突變 係選自 G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A 或 G 1 3 D。 1 3 _ —種預測病患是否將對EGFr多肽之特異性結合劑 治療無反應之方法，其包含測定B-raf突變存在或不存在 於該病患之腫瘤中，其中該B-raf突變係位於密碼子600 ;且其中如果Β-raf突變存在，則預測該病患將對EGFr 多肽之特異性結合劑治療無反應。 14.如申請專利範圍第13項之方法，其中測定B-raf 突變存在或不存在於腫瘤中係包含擴增自該腫瘤之B_raf 核酸及對該擴增之核酸定序。 1 5 ·如申請專利範圍第1 3項之方法，其中對E G F r多 肽之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 200904828 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中抗EGFr抗 體係帕尼單抗。 17. 如申請專利範圍第13項之方法，其中測定B-raf 突變存在或不存在於腫瘤中係包含利用對突變B-raf多肽 之特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變B - r a f多肽。 18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中B-raf突變 係 V600E 。 1 9 · 一種預測腫瘤是否將對EGFr多狀之特異性結合劑 治療無反應之方法，其包含測定B-raf突變存在或不存在 於該腫瘤之樣本中，其中該B - r a f突變係位於密碼子.6 0 0 ;且其中B-raf突變存在係顯示該腫瘤將對EGFr多肽之 特異性結合劑無反應。 2 〇 .如申請專利範圍第1 9項之方法，其中測定B - r a f 突變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含擴增自該腫瘤 之B-raf核酸及對該擴增之核酸定序。 2 1 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中對£ g F r多 肽之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中抗EGFr抗 體係帕尼單抗。 23. 如申請專利範圍第19項之方法，其中測定B-raf 突變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含利用對突變 B-raf多肽之特異性結合劑偵測突變B_raf多肽。 2 4 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中b - r a f突變 係 V600E 。 200904828 25.—種預測病患是否將對EGFr多肽之特異性結合劑 治療無反應之方法，其包含測定K-ras突變存在或不存在 於該病患之腫瘤中，其中該K-ras突變係位於密碼子12 或密碼子1 3 ;及測定B-raf突變存在或不存在於該病患之 腫瘤中，其中該B-raf突變係位於密碼子600;其中如果 K-ras突變及B-raf突變之至少一者存在，則預測該病患 將對EGFr多肽之特異性結合劑治療無反應。 2 6 .如申請專利範圍第2 5項之方法，其中測定κ - r a s 突變存在或不存在於腫瘤中係包含擴增自該腫瘤之K-ras 核酸及對該擴增之核酸定序；且其中測定B-raf突變存在 或不存在於腫瘤中係包含擴增自該腫瘤之B-raf核酸及對 該擴增之核酸定序。 2 7 _如申請專利範圍第2 5項之方法，其中對e G F r多 肽之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中抗EGFr抗 體係帕尼單抗。 29. 如申請專利範圍第25項之方法，其中測定K-ras 突變存在或不存在於腫瘤中係包含利用對突變K-ras多肽 之特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變K-ras多肽，且其 中測定B -raf突變存在或不存在於腫瘤中係包含利用對突 變B-raf多肽之特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變B_ raf多肽。 30. 如申請專利範圍第25項之方法，其中K-ras突變 係選自 G12S、 G12V、 G12D、 G12A、 G12C、 G13A 或 200904828 G13D，且其中B-raf突變係V600E。 3 1 . —種預測腫瘤是否將對E G F r多肽之特異性結合劑 治療無反應之方法，其包含測定K-ras突變存在或不存在 於該腫瘤之樣本中，其中該K-ras突變係位於密碼子12 或密碼子13;及測定B-raf突變存在或不存在，其中該 B-raf突變係位於密碼子600 ;且其中K-ras突變及B-raf 突變之至少一者存在係顯示該腫瘤將對EGFr多肽之特異 性結合劑治療無反應。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中測定κ - r a s 突變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含擴增自該腫瘤 之K-ras核酸及對該擴增之核酸定序；且其中測定B_raf 突變存在或不存在於該腫瘤之樣本中係包含擴增自該腫瘤 之B-raf核酸及對該擴增之核酸定序。 3 3.如申請專利範圍第3 1項之方法，其中對EGFr多 肽之特異性結合劑係抗EGFr抗體。 34.如申請專利範圍第33項之方法，其中抗EGFr抗 體係帕尼單抗。 3 5.如申請專利範圍第31項之方法，其中測定K-ras 突變存在或不存在於腫瘤中係包含利用對突變K-ras多肽 之特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變K-ras多肽’且其 中測定B-raf突變存在或不存在於腫瘤中係包含利用突變 B-raf多肽之特異性結合劑偵測腫瘤樣本中之突變B-raf 多肽。 3 6.如申請專利範圍第3 1項之方法，其中K-ras突變 -5- 200904828 係選自 G12S、 G13D ，且其中 G12V 、 G12D 、 G12A 、 G12C 、 B-raf 突變係 V600E。 G1 3 A 或