200837195 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用酵素性氰醇水解作用來製備（甲基 )丙烯酸烷酯之方法。 -【先前技術】 丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類，在此稱爲（甲基）丙 烯酸烷酯，主要的應用領域爲製備聚合物及其與其他可聚 合化合物形成之共聚物。 甲基丙烯酸酯類如甲基丙烯酸甲酯還是製備多種特殊 酯類之重要的起始材料，該等酯類係以甲基丙烯酸（MAA )爲基礎且藉著對應醇之轉酯作用來製成。 甲基丙烯酸甲酯（MM A )及甲基丙烯酸目前主要是以 氫氰酸及丙酮爲起始材料並透過丙酮氰醇（ACH )(其爲 核心中間體）製成。 使用ACH以外之其他原料的方法已述於相關專利文 獻且某些此等方法已實際用於量產。關於此點，現在係以 C - 4爲主之原料如異丁烯及第三丁醇當作反應物，其歷經 多個反應階段而轉變成所需之甲基丙烯酸衍生物。 以丙烯當作基本原料亦已有相當深入的硏究，其可經 由煙化（形成異丁酸）及脫氫性氧化步驟以中等產量製得 甲基丙烯酸。 已知可用丙醛或丙酸（其可得自以乙烯及C-ι單元如 一氧化碳爲起始材料之工業製程）當作基礎原料。於此等 -5- 200837195 方法中，反應係用甲醛於醛醇化反應中把就地形成之β-羥 羰基化合物脫水來形成對應之α，β-不飽和化合物。關於製 備甲基丙烯酸及其酯類之常見方法的總論可見於文獻’例 如 Weissermel， Arpe，’ Industrielle organische Chemie’’， VCH，Weinheim 1 994，4th edition，p. 3 05 ff·，或 Kirk Othmer ” Encyclopedia of Chemical Technology，’， 3rd edition，Vol. 15，p3 5 7。 以ACH爲主之技術製程可於反應第一步驟（被稱爲 醯胺化）於溫度介於約80°C到約Π 0°C之間使用高濃硫酸 (約100重量％H2S04 )來進行已爲常識。 此等製法之代表性實例爲US專利第4,529,8 1 6號， 其中該ACH醯胺化係在溫度約100°C以ACH: H2S04莫耳 比約1 : 1 · 5到1 : 1 .8之比例來進行。關於此方法之步驟 有a )醯胺化，b )轉化及c )酯化。 以上方法除了總產率不良以外，尤其在量產時會有大 量廢物及廢氣產生，此方法的缺點還有必須用到高於化學 計量之份量的硫酸。此外，還會產生焦油般、固體濃縮產 物，使得無法毫無困難地運送製程酸，必需相當困難地分 離含有硫酸銨及硫酸之製程酸（該製程酸會在硫酸連接廠 再生）。 由於上述之US專利第4,529,816號之方法會有巨大 的產量損失，所以有一些提案建議於存在水下來醯胺化並 水解A C Η，那麼至少在反應的第一步驟中該羥官能基會被 保留在分子內。 -6- 200837195 視此等提案方法係在有或無甲醇之情況下施行而定’ 此等於存在水下進行醯胺化之另類方法可能會形成2-羥基 異丁酸甲酯（=MHIB)或2-羥基異丁酸（=HIBA)。 2-羥基異丁酸爲製造甲基丙烯酸及衍生自彼之甲基丙 烯酸酯類（尤其是甲基丙烯酸甲酯）之核心中間體。 從ACH來製造2-羥基異丁酸酯類（尤其是2-羥基異 丁酸甲酯）的再一選擇係述於日本專利JP Hei_4- 1 93 845 號。於JP Hei-4-193845中，ACH係先用1.25當量硫酸於 小於0.8當量的水之存在下於低於60 °C下醯胺化，然後於 溫度高於5 5 °C下與大於1.2當量的醇類（尤其是甲醇）反 應，來製得MHIB或對應酯類。在此對於黏度-減少介質 之存在並沒有討論，該介質對該反應基質很穩定。 此製法的缺點及問題爲在工業量產時於反應末期會有 異常黏度產生。 使用並藉由脫水來把MHIB轉變成甲基丙烯酸甲酯之 一些策略已述於專利文獻中。 已知2-羥基異丁酸可用丙酮氰醇（ACH)爲起始物於 存在礦物酸下進行腈官能基的水解來製得（參見J. Brit. Chem· Soc. ( 1 93 0 ) ; Chem. Ber. 72 ( 1 939 )，800 )。 此等製法之代表性實例爲日本專利公告S ho 6 3 - 6 1 9 3 2 號，其中ACH係以兩階段製法水解以製得2-羥基異丁酸 。於此製法中，ACH先於存在0.2-1.0莫耳水及0.5-2當 量硫酸下被轉變成醯胺鹽類。即使在此步驟中，在使用少 量水及硫酸濃縮物（其爲欲得到良好產率、反應時間短及 -7- 200837195 少量製程廢酸所需）的情形下，仍會有（尤其是 反應終點日寸）反應混合物黏度過局，使得該釀胺 以攪拌的巨大難題。 當增加水的莫耳數以確保混合物有低黏度時 會大幅減緩且有副反應發生，尤其是A C Η會分 及氫氰酸反應物，它們在此等反應條件下會繼續 生轉化產物。當反應溫度升高時（根據日本專利 63 -6 1 93 2號專利說明書的問題），可能可以控制 物之黏度且對應之反應混合物由於黏度降低會變 拌，但是在此情況下即使採用中等溫度其副反應 增加，最後只達到中等產率（參見比較例）。 當製程於<5 0 °C之低溫下運作時則會發生選 ，在接近反應終點時醯胺鹽類（其於該反應條件 解）濃度增加先會導致懸浮液（難以攪拌）形成 致反應混合物固化。 於日本專利公告SHO 63_6 1 93 2號之第二步 被加到醯胺化溶液內且水解作用係在高於醯胺化 行，從醯胺化反應形成之醯胺鹽類會釋出硫酸氫 2-羥基異丁酸。 除了在反應中選擇性地製得HIBA目標產物 業製法之經濟可行性的另一項基本要素爲從反應 離及從剩餘製程酸中移出HIB A。 於日本專利JP Sho 57-131736號之分離α-氧 (=ΗIB A )之方法中，係藉由用萃取劑（其能把 在越接近 混合物難 ，反應則 裂成丙酮 反應而產 公告SH0 反應混合 得可以攪 也會大幅 擇性反應 下難以溶 且最後導 驟中，水 溫度下進 銨而形成 以外，工 基質中分 基異丁酸 2-羥基異 200837195 丁酸移到萃取劑中且把酸性硫酸銨留在水相內）處理反應 溶液（其係丙酮氰醇、硫酸及水反應進行水解後產生且含 有α-羥基異丁酸及酸性硫酸氫銨）來對付此等問題。 於此製法中，爲了增加ΗΙΒΑ萃取到有機萃取相的萃 取程度，所以在萃取前先用鹼性介質來中和硫酸（其於反 應介質中仍爲游離的）。所需的中和作用伴隨著額外使用 相當份量之胺基鹼或礦物鹼且因此會有相當份量之對應鹽 類廢物，其無法以生態上及經濟上可行之方式丟棄。 日本專利JP Sho 5 7- 1 3 1 73 6號、經由甲基丙烯醯胺氫 硫酸酯來製備MMA (反應順序：醯胺化-轉化-水解性酯化 )之製法的缺點槪述如下： a)使用以AC Η爲基礎之高莫耳數過量硫酸（於工業 製法中，每當量ACH約使用1.5-2當量硫酸）。 b )於醯胺化步驟（約損失3 -4% )及轉化步驟（約損 失5-6% )有高產率損失，最後甲基丙烯醯胺硫酸酯之最 大產率爲約9 1 %。 c )有大量廢物流以硫酸水溶液（其內溶有硫酸氫銨 及有機副產物）的形式存在。製程廢酸中會沉積出不明焦 片犬殘餘物，其需要事後處理或複雜的廢棄物處理。 曰本專利JP S ho 5 7- 1 3 1 73 6號、以羥基異丁酸爲核心 中間體來製備MMA (反應順序：醯胺化-水解-HIBA合成-MAA合成-水解性酯化）之製法的缺點槪述如下： a)使用以ACH爲基礎之低莫耳數過量硫酸（每當量 ACH約使用ι·〇當量硫酸），但有醯胺化介質之黏稠性及 200837195 可攪拌性的嚴重問題，甚至於反應混合物可能會完全固化 ;本製法所提出、以醇類（甲醇）或多種酯類來稀釋醯胺 化反應在此等反應條件下會導致ACH不完全轉化、大幅 地增加副反應或導致稀釋劑化學性地分解掉。 b )醯胺化步驟有高產率損失（約5 - 6 % )且以有機溶 劑進行的複雜萃取步驟會形成含有水及HIBA之萃取劑相 ，其必須藉由高能輸入蒸餾處理來分離出HIBA。每公斤 HIBA會有約2 kg製程酸廢物產生，其含有約34重量％水 以及 66重量％硫酸氫銨（參考日本專利公告3110-57-1 3 1 7 3 6號，實施例4 )。於硫酸接觸工廠（=S C工廠）中 高含水量廢酸溶液之再生伴隨著相當高的能量輸入，其明 顯地限制了此等S C工廠之效能。 此等製法之共同點爲從含硫酸氫銨之水性反應基質中 分離出HIBA十分複雜。含有HIBA之萃取相中含水量過 高亦使得硫酸氫銨隨之進入後續的MAA階段，導致經過 一段時間以後該MAA階段再也無法以工業量產的層級來 運作。高濃度之水性製程酸及萃取液流之再生需要高能量 輸入，更使得所提出的步驟不具經濟性且無法實際成爲既 有步驟的另一替代選項，該等既有步驟或許沒有選擇性， 但是僅需少許簡單的操作所以很適合此等目的。 EP 0 48 7 8 5 3號描述從丙酮氰醇（ACH)來製備甲基 丙烯酸之製法，其特徵在於：於第一步驟中，ACH係於中 等溫度下於存在異質水解觸媒下與水反應；於第二步驟中 ，2-羥基異丁醯胺係與甲酸甲酯或甲醇/一氧化碳反應以形 -10- 200837195 成甲醯胺及羥基異丁酸甲酯；及於第三步驟中，MHIB係 於存在異質離子交換器下用水水解來產生羥基異丁酸；且 於第四步驟中，HIBA係於水相於高溫及存在可溶性鹼金 屬鹽類下反應來脫水。甲基丙烯酸製備ex ΗIBA據稱具有 約99%之高轉化率且有或多或少之定量選擇性。所需反應 步驟之眾多及個別中間體分離之必要性，尤其是包括了各 別製程步驟於高壓下進行之必要性，使得此製法很複雜且 最終不具經濟效益。 使用及藉由脫水來轉化ΜΗΙΒ以製得甲基丙烯酸甲酯 之一些策略已述於專利文獻中。 舉例來說，於ΕΡ 0 429 800號中，ΜΗΙΒ或ΜΗΙΒ混 合物及其對應之α-或β-烷氧酯之混合物於氣相，於存在 甲醇作爲共-進料下，可用異質性觸媒來轉化，該觸媒係 由結晶鋁矽酸鹽及混合的掺雜物（其首要地含有鹼金屬元 素及其次可含有貴金屬）所組成。 ΕΡ 0 94 1 984號繼而採用一種類似的策略，其中 ΜΗΙΒ之氣相脫水作用係於存在異質觸媒（其係由磷酸鹼 金屬鹽類於Si02所組成）下ΜΜΑ合成之子步驟。然而， 此多階段製法整體很複雜、需要高壓且因此於某些步驟中 需要昂貴的設備，且僅能提供無法令人滿意的產率。 於 EP 0 429 800、EP 0 48 7 8 5 3 及 EP 0 94 1 984 號文
獻之製法，其製備（甲基）丙烯酸烷酯之核心步驟爲把氰 醇水解成羧醯胺。一般來說，含有二氧化錳之觸媒可用於 此目的。在這許多文獻之中，舉例來說可參考公告案DE -11 - 200837195 1 593 3 20。DE 1 593 3 20描述一種藉助於二氧化錳來把腈類 水解成醯胺類之製法，其採用脂族腈時可達到超過9 0 %之 產率。此製法可提供良好產率且速率很高。然而，缺點爲 觸媒的壽命很短。在連續作業時，才經過一段短暫的時間 就必須中斷作業以更換觸媒。此種操作成本很高。雖然已 採用多種方法儘量改善，但是觸媒的短暫壽命仍爲構成以 上述製法來製造（甲基）丙烯酸烷酯時的高成本因素。 此外，已知可使用酵素來從氰醇類製得羧醯胺類。適 當的酵素包括腈水合酶。此反應係於"Screening， Characterization and Application of Cyanide- resistant Nitrile Hydratases" Eng. Life. Sci. 2004, 4，No. 6 中以實 施例來說明。不過，此反應的生產率很低，所以這種製造 羧醯胺之方式至今對於（甲基）丙烯酸烷酯之製備尙無任 何量產重要性。 基於先前技術之現況，本發明因此提供一種製備（甲 基）丙烯酸烷酯之方法’其能以特別簡單且不昂貴的方式 來進行且產率很高。特別地係在提供一種製法以解決以上 特殊的問題，該製法能確保觸媒有特別長的壽命且效率高 、能量輸入低及產率損失小。 此等目標及其他更進一步的目標（其並未詳細說明’ 但是係衍生自在此討論之種種相關事宜或在引入在此討論 之種種相關事項即可得知）可用具有申請專利範圍第1項 之所有特徵之製法來達成。關於本發明方法之適當修改形 式則於附屬申請專利範圍中予以保護。 -12- 200837195 【發明內容】 本發明提供一種製備（甲基）丙烯酸烷酯之方法，其 具有一個用酵素使氰醇水解之步驟，該酵素於存在20 mM 氰離子於20°C下進行甲基丙烯腈之轉化30分鐘後其剩餘 活性爲用於同樣條件但不含氰離子之情況下‘之酵素的剩餘 活性之至少90%，如此可能可以提供一種製備（甲基）丙 烯酸烷酯之方法，其能以特別簡單且不昂貴的方式進行且 產率很高。 同時，本發明製法還有一系列更進一步的優點。有一 項是根據本發明之製法其觸媒之壽命可令人訝異地大幅延 長。此舉可令本製法特別有效率且便宜地進行，因爲在工 廠連續作業的情況下停止作業以更換觸媒的需求變得很低 。此外，用於本發明之觸媒可用簡單且不昂貴的方式取得 。再者，可用於氰醇水解反應之較佳酵素還顯現出令人驚 訝之高生產率。 此製法避免使用大量硫酸來作爲反應物。因此，本發 明製法中不會產生大量硫酸氫錢。 關於此點，副產物的形成不尋常地低。此外，尤其在 考慮到高選擇性下，還能達到極高轉化率。本發明製法之 副產物的形成量很低。 本發明製法能有效率地製備（甲基）丙烯酸烷酯。（ 甲基）丙烯酸烷酯爲衍生自（甲基）丙烯酸之酯類。術語 (甲基）丙烯酸係指甲基丙烯酸、丙烯酸及此二者之混合 -13- 200837195 物。除了丙烯酸及甲基丙烯酸（2-甲基-丙烯酸）以外，它 們還包括其含有取代基之衍生物。適當的取代基包括特別 是鹵素如氯、氟及溴，以及烷基（其可含有較佳地1到10 個，更佳地1到4個碳原子）。這些化合物包括β -甲基丙 烯酸（丁烯酸）、α，β-二甲基丙烯酸、β-乙基丙烯酸，及 β，β-二甲基丙烯酸。較佳地爲丙烯酸及甲基丙烯酸（2-甲 基丙烯酸），特佳地爲甲基丙烯酸。較佳的（甲基）丙烯 酸烷酯之醇基宜含有1到20個碳原子，更佳地爲1到1 0 個碳原子且再佳地爲1到5個碳原子。較佳的醇基尤其是 衍生自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，尤其是正丁醇及2-甲 基-1-丙醇、戊醇、己醇及2-乙基己醇，特佳地爲甲醇及 乙醇。較佳的（甲基）丙烯酸烷酯包括尤其是甲基丙烯酸 甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯及丙烯酸乙酯。 本發明之製法含有一個步驟，其係使用酵素來水解氰 醇，該酵素於存在20 mM氰離子於20 °C下進行甲基丙烯 腈之轉化3 0分鐘後其剩餘活性爲用於同樣反應條件但不 含氰離子之情況下之酵素的剩餘活性之至少9 0 %。於本發 明之較佳態樣中，於存在5 0 mM氰離子之轉化作用後的殘 餘活性爲至少6 0 %。 所用酵素的形式一般並不重要。舉例來說，該酵素可 爲含有此酵素之微生物的形式。關於此點，還可使用此等 微生物之i谷胞產物。關於此目的’較佳地係使用製造該酵 素之微生物。於本發明一特定態樣中，可使用此等微生物 之靜息細胞（resting cells )。關於此點，可使用天然微 -14- 200837195 生物或者經分離及純化之微生物。”經分離及純化之微生 物”係指以高於自然界發現之濃度存在之微生物。然而， 該酵素（其可稱爲腈水合酶）亦可以純化形式使用。 於本發明較佳具體例中，該酵素可爲源自假單胞菌屬 (Pseudomonas )之微生物。假單胞菌屬之特佳微生物包 括有緣假單胞菌（Pseudomonas marginalis)或戀臭假單 胞菌（Pseudomonas putida)。其產製的酵素可用於本發 明之特佳假單胞菌屬微生物已被寄存且寄存編號爲DSM 1 6275及 DSM 1 6276。此寄存係依布達佩斯協定於 09.03.2004 ，於 DSMZ ， Deutsche S ammlung fur
Mikroorganismen und Zellkulturen[德國微生物及細胞培養 物中心]於Brunswick進行。此等菌株特別適合用來製造本 發明所用酵素。 該等微生素或酵素可用例如以下方法製得，其中 a )能製造此種腈水合酶之微生物，特別是有緣假單 胞菌或戀臭假單胞菌之微生物，在此等酵素能於微生物中 形成之條件下醱酵， b )細胞係在其通過對數生長期後馬上採收及 c )含有該酵素之微生物（若適當，在提高細胞膜之 通透性以後），或 d )該等細胞之溶胞產物或 e )於該等微生物細胞內存在之酵素 可用已知方法分離。該等微生物較佳地係以靜息細胞 的形式分離出來。 -15- 200837195 所用的培養介質必須適當地滿 不同微生物之培養基的說明可見： "Manual of Methods for General D.C·，美國，1981)。 所用的碳源可爲糖類及碳水化 乳糖、果糖、麥芽糖、糖漿、澱粉 大豆油、葵花油、花生油及椰子油 脂酸及亞麻油酸，醇類如甘油及乙 此等物質可各別使用或以混合物形 所用氮源有利地可爲有機腈類 胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯醯胺、 ，還可組合其他含氮化合物如蛋白 芽萃、玉米浸液、大豆粉、及/或 氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨 或以混合物形式使用。 所用磷源可爲磷酸、磷酸二氫 對應之鈉鹽。 培養基一般還含有金屬鹽類如 生長所需。最後除了以上物質以外 需物質如胺基酸類及維生素類。該 加到該培養物中或者在培養期間以 培養物之P Η値係以適當的方 氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或 硫酸來控制。 足該特定菌株的需求。 於美國細菌學會之手冊 Bacteriology”（華盛頓 合物如葡萄糖、蔗糖、 及纖維素，油及脂肪如 ，脂肪酸如棕櫚酸、硬 醇，及有機酸如醋酸。 式使用。 或酸醯胺如乙腈、乙醯 異丁腈、異丁醯胺或脲 腺、酵母萃、肉萃、麥 無機化合物如硫酸銨、 。此等氮源可各別使用 鉀或磷酸氫二鉀，或其 硫酸鎂或硫酸鐵，其爲 ’可能還需使用生長必 等原料可一批次地全部 適當的方式加入。 式使用鹼性化合物如氫 者酸性化合物如磷酸或 -16- 200837195 爲了控制泡沫發生，可使用消泡劑如脂肪酸多元醇酯 類。爲了保持有氧狀態，可把含氧氣體混合物例如空氣引 入培養物中。 培養溫度一般爲10到40°C且較佳地爲1〇到30°C。 較佳地培育係持續到細胞通過對數生長期爲止。此目標通 常在1 0小時到70小時間達成。然後細胞較佳地經過採收 、清洗且用pH 6-9 (尤其是6.8-7.9 )之緩衝液收集製成 懸浮液。細胞濃度爲1-25%，特別是1.5到15% (濕重/體 積）。其通透性可透過物理性或化學性方法提高，例如以 述於 Wilms et al，J. Biotechnol·，Vol，. 86 ( 200 1 )，19-30 之方法用甲苯來處理，使得欲轉化之氰醇可滲透細胞壁且 羧醯胺可離開。 根據本發明，可使用氰醇（α-羥基腈）。此等化合物 本身已習知且係述於例如 R6mpp Chemie Lexikon，CD- ROM第二版。較佳的氰醇包括羥基乙腈、2-羥基-4-甲基 硫丁腈、α-羥基-γ-甲基硫丁腈（4-甲基硫-2-羥基丁腈） 、2-羥基丙腈（乳腈）及2-羥基-2-甲基丙腈（丙酮氰醇 )，特佳地爲丙酮氰醇。 反應溶液中欲轉化之氰醇濃度並沒有限定特定範圍。 爲了防止酶的活性受到受質抑制，該氰醇的濃度一般 係維持在〇 · 〇 2到1 0 w / W %，尤其是0.1到2 w / W %，以該 生物觸媒乾細胞重計。該受質可在反應一開始全部加入， 或者在反應期間連續地或批次地加入。 乾重係用ΜΑ 45濕度分析器（Sartorius )測量。 17- 200837195 在許多例子中，水解氰醇所需之水可用來當作溶劑。 水解所用的水可具有高純度。然而’此性質並非必要 的。所以，除了新鮮水以外’還可使用含有或多或少雜質 之自來水及製程用水。據此，也可使用水解之回收水。 當氰醇於水性反應系統之溶解度過低時，可加入助溶 劑。不過另一選擇地，此反應也可於兩相之水/有機溶劑 系統中進行。 當使用微生物細胞當作酵素活性物質時，所用細胞之 份量相對於受質之份量較佳地爲0.02到10 w/w%，以細 胞乾重計。 亦可使用習知技術將分離的酶固定，然後以此種形式 使用。 此外，水解腈時混合物中還可存在其他成份。這些成 份包括羰基化合物如醛類及酮類，尤其是那些已被用來製 備氰醇（以作爲較佳腈類）之化合物。例如，反應混合物 中可存在丙酮及/或乙醛。此詳述於例如US 4018829-A。 所加入之醛及/或酮類的純度一般並不特別重要。因此， 此等物質可含有雜質’尤其是醇類，像是甲醇、水及/或 羥基異丁酸甲酯（MHIB )。反應混合物中羰基化合物 (尤其是丙酮及/或乙醛）的份量範圍可以很寬廣。每莫 耳腈類可使用之羰基化合物份量範圍較佳地爲〇 . i _ 6莫耳 ’更佳地爲0.1 - 2莫耳。 於本發明一特定態樣中，該氰醇水解係於存在氫氰酸 或氫氰酸鹽下進行。關於此點，該氰化物之起始濃度較佳 -18- 200837195 地係在0 · 1莫耳％到3莫耳％之氰化物之範圍，較佳地爲 0 · 5到3莫耳％氰化物之範圍，以所用氰醇量爲基礎。 發生氰醇水解反應之溫度一般係在-5到50°C之範圍 ，較佳地係在0到4 0 °C之範圍，更佳地係在1 〇到3 0 °C的 範圍。 視反應溫定而定，該水解反應可於增壓或減壓下進行 。反應較佳地係在0. 1 -1 0巴的壓力下進行，更佳地係在 0.5-5巴下進行。 影響該水解反應之反應時間的因素包括所用腈類、觸 媒活性及反應溫度，此項參數涵蓋的範圍廣大。水解反應 之反應時間較佳地係在5分鐘到200小時的範圍，更佳地 係30分鐘到1 00小時的範圍，且最佳地係在2小時到50 小時的範圍。 於連續製程中，停留時間較佳地爲5分鐘到1 00小時 ，更佳地爲3 0分鐘到5 0小時，且最佳地爲2小時到1 〇 小時。 該反應可於例如固定床反應槽或於懸浮液反應槽中進 行。 如此製得之反應混合物除了所需的羧醯胺以外一般還 包含其他成份，特別是未轉化氰醇及任何使用的丙酮及/ 或乙醛。據此，可把反應混合物純化，於此過程中未轉化 的氰醇可被例如切成丙酮及氫氰酸，以再次利用此等成份 來製造氰醇。同樣情形適用於被移除之丙酮及/或乙醛。 此外，含有已純化羧醯胺之反應混合物可用離子交換 -19- 200837195 管柱移除其他成份。 關於此一目的，可使用陽離子交換器及陰離子交換器 。適合此目的之離子交換器已爲習知。舉例來說，適當的 陽離子交換器可藉著磺酸化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物製 造。鹼性的陰離子交換器包括四級銨基團，其係共價地鍵 結到苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上。 (X -羥基羧醯胺之純化特別地已於E P - A - 0 6 8 6 6 2 3中詳 細說明。 水解所用之氰醇可用任何方式取得。於本發明之製法 中，該腈（如氰醇）之純度一般而言並不重要。因此，純 化或未純化之腈類皆可用於該水解反應。例如，可用像是 酮類（尤其是丙酮）或醛類，例如乙醛、丙醛、丁醇與氫 氰酸反應以得到對應的氰醇。關於此點，特佳地是用少量 驗或胺作爲觸媒以典型的方式轉化丙酮及/或乙醛。 上述的水解反應可作爲製備（甲基）丙烯酸烷酯之中 間步驟。含有氰醇水解步驟以製備（甲基）丙烯酸及/或 (甲基）丙烯酸烷酯之製法尤其是詳述於ΕΡ-Α-0 406 676 、ΕΡ-Α-0 407 8 1 1、ΕΡ-Α-0 686 623 及 ΕΡ-Α-0 94 1 9 84 號 〇 從氰醇起始，所製得之α-羥基羧醯胺可被轉化成例如 (甲基）丙烯醯胺，其而後用甲酸烷酯（如甲酸甲酯）或 醇類來轉化成（甲基）丙烯酸烷酯，尤其是甲基丙烯酸甲 酯。如上描述之反應步驟係詳述於Ερ-Α-〇 406 676及ΕΡ_ Α-0 686 623 號。 -20- 200837195 從氰醇起始來製備（甲基）丙烯酸烷酯亦可透過α-羥 基羧酸烷酯之脫水作用達成，該α-羥基羧酸烷酯可藉著預 先將ex-羥基羧醯胺醇解或或轉酯化來製得。此反應之各別 步驟詳述於例如ΕΡ-Α-0 407 811或ΕΡ-Α-0 941 984號。 於一特定具體例中，（甲基）丙烯酸甲酯可用簡單且 不昂貴的方式從羰基化合物、氫氰酸及醇類以如下方法製 得，該方法包含以下步驟： A )藉著用至少一種羰基化合物與氫氰酸反應來形成 至少一種氰醇； B )水解該氰醇或多種氰醇以形成至少一種α_羥基羧 醯胺； C)醇解該α-羥基羧醯胺或多種α_羥基羧醯胺以製得 至少一種01_羥基羧酸烷酯； D )用（甲基）丙烯酸來把該α_羥基羧酸烷酯或多種 α-羥基羧酸烷酯轉酯化以形成至少一種（甲基）丙烯酸烷 酯及至少一種α-經基竣酸； Ε)把該α-羥基羧酸或多種α_羥基羧酸脫水以形成（ 甲基）丙烯酸。 含有步驟D )的製法特別有利。舉例來說，含有轉酯 化步驟之方法可以局產率製造（甲基）丙餘酸院酯。在與 ΕΡ-Α-094 1 984號所述之製法（其中該^羥基羧酸烷酯係 直接脫水形成（甲基）丙烯酸烷酯）比較之後，更顯得如 此。令人課異地’已發現到用（甲基）丙烯酸把α_羥基羧 酸烷酯轉酯化之額外反應步驟可讓整體有更高選擇性。在 -21 - 200837195 此，副產物的形成異常的低。再者’尤其基於其高選擇性 ，所以能達到高轉化率。本發明之製法可以便宜地進行’ 特別是僅有低能量需求。在此所用之脫水及轉酯化觸媒可 長時間使用而不會降低選擇性或活性。 步驟A)及B )已於前文詳細說明。於下一個步驟C )中，如此得到之α -羥基羧醯胺可被轉化成α -羥基羧酸 烷酯。此可藉由例如使用甲酸烷酯來達成。特別適用的是 甲酸甲酯或者甲醇與一氧化碳之混合物，此反應已於ΕΡ-Α-0407 8 1 1之實施例中作說明。 較佳者係用醇（其包括較佳1-10碳原子，更佳1-5碳 原子）藉由醇解轉換α -羥基羧醯胺。 較佳的醇類包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，尤其是正 丁醇及2-甲基-1-丙醇、戊醇、己醇、庚醇、2-乙基己醇 、辛醇、壬醇及癸醇。所用的醇類更佳地爲甲醇及/或乙 醇，特佳地爲甲醇。以羧醯胺與醇類反應來製得羧酸酯已 爲常識。 此反應可用例如鹼性觸媒來加速。此等觸媒包括均質 觸媒及異質觸媒。 均質觸媒包括鹼金屬烷氧化物及鈦、錫及鋁之有機金 屬化合物。較佳地係採用烷氧化鈦或烷氧化錫，例如四異 丙基氧化鈦或四丁氧化錫。異質觸媒包括錳氧化物、鈣氧 化物及如上所述之鹼性離子交換器。 ^ -羥基羧醯胺對醇類（例如α -羥基異丁醯胺對甲醇 )之莫耳比率本身並不重要，且較佳地係在2: 1到1: 20 -22- 200837195 之範圍。 反應溫度類似地範圍廣大，反應速率會隨著溫度增加 而提高。溫度上限一般係以所用醇類之沸點往上增加。反 應溫度較佳地係在40-3 00°C之範圍，更佳地係在1 60-240 °C之範圍。視反應溫度而定，反應可於增壓或減壓下進行 。反應較佳地係在0.5-35巴之壓力下，更佳地係在 5到 3 0巴下進行。 典型地’所形成的氨會從反應系統中排放出去，於許 多情況下反應係以沸點溫度進行。 醇解釋出的氨可輕易地回收到總製程內。舉例來說， 氨可與甲醇反應以形成氫氰酸。此反應詳述於例如EP-A-094 1 984。此外，氫氰酸可從氨及甲烷以 BMA或 Andrussow 製法製得，此等製法詳述於 Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，5th 版於 CD-ROM ，方令 ’’inorganic cyano compounds" ° 於下一個步驟D)中，該a-羥基羧酸烷酯與（甲基） 丙烯酸反應以製得（甲基）丙烯酸烷酯及a-羥基羧酸。 於本發明再一態樣中，a-羥基羧酸烷酯類可與（甲基 )丙烯酸反應。可用於此目的之（甲基）丙烯酸已爲習知 且可商業性取得。除了丙烯酸及甲基丙烯酸（2-甲基丙烯 酸）以外，還特別包括其含有取代基之衍生物。適當的取 代基包括鹵素如氯、氟及溴，以及烷基（其可含有較佳地 1到1 〇個，更佳地1到4個碳原子）。此等化合物包括 β -甲基丙烯酸（丁烯酸）、〇1，0-二甲基丙烯酸、0-乙基丙 -23- 200837195 烯酸，及β,β -二甲基丙烯酸。較佳地爲丙烯酸及甲基丙烯 酸（2 -甲基丙烯酸），特佳地爲甲基丙烯酸。 可用於此目的之心羥基羧酸烷酯爲習知’該酯之醇基 含有較佳地1到2 0個碳原子，更佳地爲1到1 〇個碳原子 且再佳地爲1到5個碳原子。較佳的醇基係衍生自甲醇、 乙醇、丙醇、丁醇，尤其是正丁醇及2-甲基-1-丙醇、戊 醇、己醇及2-乙基己醇，特佳地爲甲醇及乙醇。 轉酯化所用之α-羥基羧酸烷酯之酸基團較佳地係衍生 自（甲基）丙烯酸，其係把α-羥基羧酸脫水製得。當例如 使用甲基丙烯酸時，可採用（X-羥基異丁酸酯。當例如使用 丙烯酸時，較佳地係採用α-羥基異丙酸。 所用的α-羥基羧酸烷酯較佳地爲α-羥基丙酸甲酯、α-羥基丙酸乙酯、α-羥基異丁酸甲酯及羥基異丁酸乙酯。 除了反應物以外，反應混合物還可含有其他成份，例 如溶劑、觸媒、聚合抑制劑及水。 該烷基羥基羧酸酯與（甲基）丙烯酸之反應可用至少 一種酸或至少一種鹼來催化。關於此點，可使用均質或異 質觸媒。特別適合的酸性觸媒爲無機酸（例如硫酸或氫氯 酸）及有機酸如硫酸（尤其是對-甲苯磺酸）以及酸性陽 離子交換器。 特別適合的陽離子交換樹脂特別包括了含有磺酸之苯 乙嫌-二乙烯苯聚合物。特別適合之陽離子交換樹脂可爲 購自Rohm & Haas公司商標名Amberlyst®之產品或購自 Bayer公司商標名Lewatit®之產品。 •24- 200837195 觸媒的濃度較佳地爲1 - 3 0重量％ ’較佳地爲5到1 5 重量％，以所用α-羥基羧酸烷酯及所用（甲基）丙烯酸之 總量計。 較佳的聚合抑制劑包括吩噻嗪、第三丁基兒茶酚、氫 醌單甲醚、氫醌、4 -羥基-2,2,6,6 -四甲基哌啶氮氧自由基 (tetramethylpiperidinooxyl ) ( TEMPOL )或其混合物； 於某些情況下此等抑制劑之有效性可用氧來促進。該等聚 合抑制劑之濃度可在0.001到2.0重量％之範圍，較佳地 於0.0 1到0.2重量％之範圍，以所用α-羥基羧酸烷酯及所 用（甲基）丙烯酸之總量計。 該反應較佳地係於溫度50°C到200°C之範圍，較佳地 爲70°C到130°C，尤其是80°C到120°C，且最佳地爲90°C 到1 1 0 °C之範圍下進行。 視反應溫度而定，反應可在增壓或減壓下進行。反應 較佳地係在0.02-5巴之壓力下，尤其是0.2-3巴之壓力， 更佳地係在〇 · 3到0.5巴下進行。 (甲基）丙烯酸對α -羥基羧酸烷酯之莫耳比例較佳 地係在4 : 1到1 : 4之範圍，尤其是3 : 1到1 : 3之範圍 ，且更佳地係在2 : 1到1 : 2之範圍。 選擇性較佳地至少9 0 %，更佳地爲9 8 %。該選擇性係 定義成所形成之（甲基）丙烯酸烷酯及α -羥基羧酸之總 量對被轉化之α -羥基羧酸烷酯及（甲基）丙烯酸之總量 的比率。 於本發明特定態樣中，轉酯化可於存在水下進行。水 -25- 200837195 含量的範圍較佳地爲0.1-50重量％，更佳地爲0.5-20重量 %且最佳地爲1 -1 0重量％，以所用α -羥基羧酸烷酯之重量 計。 令人驚訝地加入少量水可讓反應之選擇性提高。雖然 加入水，不過甲醇之形成仍保持很低。當水的濃度爲1 0 到1 5重量％ (以所用α -羥基羧酸烷酯之重量計），於反 應溫度120°C且反應時間或停留時間爲5到180分鐘時較 佳地只有低於5重量％之甲醇形成。 轉酯化可批次或連續進行，較佳地爲連續製程。 轉酯化的時間視所用莫耳質量及反應溫度而定，且此 參數範圍廣大。該α -羥基羧酸烷酯以（甲基）丙烯酸來 轉酯化之反應時間較佳地係在3 0秒到1 5小時之範圍，更 佳地爲5分鐘到5小時且最佳地爲1 5分鐘到3小時。 於連續製程中，停留時間較佳地爲3 0秒到1 5小時， 更佳地爲5分鐘到5小時，且最佳地爲1 5分鐘到3小時 〇 從α -羥基異丁酸甲酯來製備甲基丙烯酸甲酯時，溫 度較佳地爲6 0到1 3 0 °C，更佳地爲8 0到1 2 0。(：且最佳地 爲9 0到1 1 0 °C。壓力範圍較佳地爲5 0到1 0 0 0毫巴，更 佳地爲3 00到800毫巴。甲基丙烯酸對α -羥基異丁酸甲 酯之莫耳比例較佳地係在2 : 1 · 1 : 2，尤其是1.5:1-1: 1 . 5之範圍。 舉例來說，轉酯化可用第i圖所示之工廠來施行。該 羥基羧酸酯（例如羥基異丁酸甲酯）係經由管線（1 )饋 -26- 200837195 入含有陽離子交換樹脂的固定床反應器（3) ° (甲基） 丙烯酸（例如2-甲基-丙烯酸）則透過管線（2 )或管線（ 1 7 )加到固定床反應器（3 )。管線（2 )可再與其他管線 例如管線（9 )及管線（1 3 )連接，如此可減少進入反應 器之進料管線之數目。不過，管線（9 ) 、（ 1 3 )及/或（ 1 7 )亦可直接連接到該固定床反應器。在前述反應條件下 ，所形成之反應混合物中除了含有甲醇及未轉化之羥基異 丁酸甲酯及甲基丙烯酸以外，還含有羥基異丁酸及甲基丙 烯酸甲酯反應產物。此反應混合物會透過管線（4 )進入 蒸餾器（5 )。於蒸餾器（5 )中，能以蒸餾物的形式得到 水、甲基丙烯酸甲酯及甲醇，其乃爲頂端產物且透過管線 (7 )饋入相分離器（8 )。甲基丙烯酸及甲醇係收集於上 層相中，其可經由管線（1 0 )從系統中移取出來。水主要 係收集在該相分離器（8 )的下層相中且透過管線（1 1 ) 從系統移出或經由管線（9 )饋入該固定床反應器（3 )中 〇 從蒸餾器底部可得到羥基異丁酸甲酯、羥基異丁酸及 甲基丙烯酸，透過管線（6 )送到第二蒸餾器（1 2 )。於 此蒸餾器中，羥丁異丁酸甲酯及甲基丙烯酸會被蒸除且透 過管線（1 3 )再回收至轉酯化作用。於蒸餾器底部存在之 羥基異丁酸會經由管線（1 4 )送至脫水反應器（1 5 )。以 此方式得到之甲基丙烯酸可經由管線（1 7 )加到如上詳述 之轉酯化反應中或經由管線（1 6 )從系統中移取出來。 於一特佳具體例中，該轉酯化反應係於蒸餾器中進行 -27- 200837195 。於此例中，該觸媒可於蒸餾器的任何區域加入。舉例來 說’觸媒可於底部區域或塔柱區域加入。不過，此等反應 劑應該要與該觸媒接觸。此外，還可在蒸餾器的各別區域 供應觸媒，於這種情況下此區域會與蒸餾器的其他區域如 底部及/或塔柱相連。此種各別安置觸媒供應區的方式較 佳。 此一較佳具體例令人訝異地能成功地增進該反應之選 擇性。關於此點，應加以強調地可於蒸餾塔內各別地調整 該反應壓力。此舉可在無需對應地提高反應時間及停留時 間的情況下讓沸點溫度維持很低。此外，反應溫度可在廣 大範圍內作變動。此可讓反應時間縮短。此外，觸媒體積 可依需要作選擇而無需考慮該塔的幾何性。此外，還可以 例如再加入其他反應劑。所有這些措施都可以提高選擇性 及生產率，且令人驚訝地還能達到加乘效果。 把該α -羥基羧酸烷酯（例如α -羥基異丁酸甲酯）饋 送到蒸餾器。此外，還把（甲基）丙烯酸（例如甲基丙烯 酸）引入該蒸餾器。該蒸餾條件較佳地係設定成只會有一 種產物經蒸飽作用排出蒸餾器，第二種產物則會留在底部 且從該處連續地移取出來。當使用低碳數的醇類（尤其是 乙醇或甲醇）時，較佳地係藉著蒸餾作用從反應混合物中 移取出該（甲基）丙烯酸烷酯。該等反應劑會循環往復地 通過觸媒區域。如此可持續地形成（甲基）丙烯酸烷酯及 α -羥基羧酸。 反應性蒸餾的較佳具體例係綱要地示於第2圖。該等 -28- 200837195 反應劑可經由一條共同管線（1 )或者各別地經由兩條管 線（1 )及（2 )來引入該蒸餾塔（3 )。該等反應劑較佳 地係經由分離管線來加入。該等反應劑可於同樣階段加入 或者於塔的任何位置加入。 反應劑之溫度可於進料器內藉著熱交換器來調整，此 目的需要之單元在第1圖中並沒有顯示。於一較佳變化中 ，該等反應劑係各別計量地供應給該塔，沸點較低的成份 係在饋入高沸點化合物之位置更低的地方計量供給。於此 等情況下，低沸點成份較佳地係以蒸氣形式加入。 於本發明，可使用含有兩或多個個別階段之多級蒸餾 塔（3 )。本發明所使用之個別級數爲盤式塔之盤的數目 或者在規則結構化塡充或不規則塡充之塔之例中則爲理論 性平板的數目。 含盤之多級蒸餾塔的實例包括例如泡罩盤式、篩盤式 、穴罩盤式（tunnel-cap tray )、閥盤式、狹縫盤式、狹 縫篩盤式、泡罩篩盤式、噴射盤式、離心盤式蒸餾塔；不 規則塡充之多級蒸餾塔有例如Raschig環式、Lessing環 式、Pall環式、Berl鞍式、Intalox鞍式；規則結構塡充 之多級蒸餾塔有例如Mellapak ( Sulzer ) ^ Rombopak (
Kuhni ) 、Montz-Pak ( Montz )，具有觸媒袋之規則結構 塡充之蒸餾塔則有例如Kata-Pak。 類似地亦可使用含有盤區域、不規則塡充區域或規則 結構塡充區域之組合的蒸餾塔。 蒸餾塔（3 )可配備有內部構件。該塔較佳地含有凝 -29- 200837195 結蒸氣之冷凝器（12)及底蒸發器（18)。 該蒸餾裝置最好含有至少一個此後稱爲反應器之區域 ，其內提供至少一種觸媒。此反應器可在該蒸餾塔內。不 過，此反應器較佳地係安置在塔（3 )外的個別區域，一 種此等較佳具體例係詳細示於第2圖。 爲了在個別反應器（8 )內進行該轉酯化反應，較佳 地係在塔內藉由收集器來收集一部份向下流動的液相且將 其送出塔外當作子液流（4 )。該收集器的位置係根據各 別成份於塔柱內濃度分佈特性來決定。該濃度分佈特性可 藉由溫度及/或回流來調節。該收集器的位置較佳地係使 得導引到塔柱外的液流能含有兩種反應劑，更佳地該等反 應劑的濃度夠高，且最佳地該酸：酯的莫耳比爲1.5:1 到1 : 1 . 5。此外，可於蒸餾塔內的不同位置提供複數個收 集器，於此種情況下移出之反應劑的份量可用來調整該莫 耳濃度比率。 還可把另一種反應劑例如水計量供應給被引導到塔外 之液流，以調整交叉-轉酯化反應中之酸/酯產物比或提高 選擇性。水可經由管線（第1圖未顯示）從外部饋入或從 相分離器（13)饋入。富含水之液流（5)之壓力可藉由 增壓器（6)例如泵來提高。 壓力增加可減少或預防液流在反應器（例如固定床反 應器）內部形成。此可讓反應物均勻流經反應器且濕潤觸 媒粒子。可把該液流導經熱交換器（7 )且調整反應溫度 。該液流可視需要被加熱或冷卻。還可以透過反應溫度調 -30- 200837195 整酯對酸產物比。 轉酯化反應係在固定床反應器（8)內之觸媒上進行 。通過反應器的流動可爲往下或往上。反應器輸出流（9 )含有產物及特定量之未轉化反應劑，反應器廢物流內多 種成份之含量將視停留時間、觸媒質量、反應溫度及反應 劑比率及水添加量而定，該輸出流（9)先通過熱交換器 (1 〇 )且調整成有利於導引到該蒸餾塔之溫度。較佳地係 把溫度設定成相當於蒸餾塔內引入該液流處之溫度。 離開反應器之液流回到塔柱的位置可在反應器進料取 出位置的上方或下方，不過較佳地係位於上方。在回流到 該塔柱以前，該液流可透過閥（1 1 )壓縮，較佳地建立與 該塔柱同樣大小之壓力。關於此點，蒸餾塔較佳地具有低 壓。此種構型提供的優點爲欲分離成份之沸點較低，因此 蒸餾可在較低溫度下進行，因而能節省能量且在熱能上較 溫和。 然後於蒸餾塔（3 )中分離出產物混合物。該低沸點 物（較佳地爲轉酯化形成之酯類）係經由頂端移除。該蒸 餾塔運作的方式較佳地係使得於固定床反應器上游添加的 水可被移出當作頂產物。於頂端移出的蒸氣流於冷凝器（ 1 2 )凝結且而後於傾析器（丨3 )分離成水相及含-產物之 酯相。水相經管線（1 5 )排放到檢驗區（w 0 r k u p )或全部 或部份經由管線（1 7 )流回反應中當作液流。含酯相之液 流可經由管線（1 4 )以回流（丨6 )部份導引回塔柱或者部 份從蒸餾器中排掉。高沸點物（較佳地爲交叉-轉酯化形 -31 - 200837195 成的酸）則成爲底流（i 9 )從管柱排出。 此一較佳具體例令人訝異地能成功地增進該反應之選 擇性。關於此點，應加以強調地可於蒸餾塔內各別地調整 該反應壓力。此可在無需對應地提高反應時間及停留時間 的情況下讓沸點溫度維持很低。此外，反應溫度可於廣大 範圍內作變動。此可讓反應時間縮短。此外，觸媒體積可 依需要作選擇而無需考慮該塔的幾何性。此外，還可例如 再加入其他反應劑。 從該反應製得之α -羥基羧酸（例如α -羥基異丁酸） 可用習知方式於進一步的步驟Ε)脫水。一般來說，該α -羥基羧酸（例如α -羥基異丁酸）係於存在金屬鹽類（例 如鹼金屬及/或鹼土金屬鹽類）下於溫度160-300 °C範圍內 ，較佳地200到240 °C的範圍內加熱，以製得該（甲基） 丙烯酸及水。適當的金屬鹽類包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、 氫氧化鈣、氫氧化鋇、氫氧化鎂、亞硫酸鈉、碳酸鈉、碳 酸鉀、碳酸緦、碳酸鎂、碳酸氫鈉、醋酸鈉、醋酸鉀及磷 酸二氫鈉。 該α -羥基羧酸之脫水作用較佳地於壓力〇 · 〇 5巴到 2.5巴，更佳地於0 · 1巴到1巴的範圍下進行。 該α-羥基羧酸之脫水作用係述於例如DE-A_ 1 76 82 53號。 如此製得的（甲基）丙烯酸可回過頭用來製造（甲基 )丙烯酸烷酯。此外，（甲基）丙烯酸爲商業產物。令人 驚訝地，用來製備（甲基）丙烯酸烷酯之製法可依此類似 -32- 200837195 地製得（甲基）丙烯酸，於這種情況下該（甲基）丙烯酸 烷酯對（甲基）丙烯酸之產物比可藉由α -羥基羧酸烷酯 轉酯化反應中水的濃度及/或反應溫度來輕易地調節。 【實施方式】 本發明將參考下文實施例來詳細說明。 實施例1 培養條件 預培養物係於玻璃管以5 ml體積，於3(TC下搖晃24 小時培養。100 ml主培養物用i ml該預培養物接種且置 於總體積1 000 ml之Erlenmeyer燒瓶於25°C下搖晃培育 42小時。 預培養物之培養某（pH 7.0) K2HPO4 7 g KH2PO4 3 g 檸檬酸鈉 0.5 g 甘油 2 g FeS〇WH20 0.004 g MgS04*7H20 0.1 g 乙醯胺 2 g 微量鹽溶液 0.1 ml 去礦物質水 力口至 1 000 ml -33- 200837195 主培養物之培養基（pH 7.0 ) K2HPO4 7 g KH2PO4 3 g 檸檬酸鈉 0.5 g 甘油 2 g FeS04-7H2〇 0.004 g MgS〇WH20 0.1 g 乙醯胺 10 g 微量鹽溶液 0.1 ml 去礦物質水 加至1 0 0 0 m 1 微量鹽溶液 EDTA， Na”2H20 15 8 mg Na2Mo〇4*2H2〇 4.7 mg ZnS04*7H2〇 7 0 mg MnS04*4H20 18 mg FeS04*7H2〇 16 mg CuS04*5H2〇 4.7 mg CoS04*6H2〇 5.2 mg 去礦物質水 加至1 0 0 0 m 1 實施例2 微生物之分離和鑑定 藉著測定於存在2 mM氰化鉀下靜息細胞之腈水合酶 活性來選出兩個菌株MA32及MA1 13。 -34- 200837195 胞度度 細寬長 M A 3 2之性質 形式 菌6-5- 桿ο 1 m m μ u, 活動力 + 鞭毛 端鞭毛數> 1 溶er 胞C 應HC 反ο酶 氏%κ肽酶酶 蘭3°基化化 格以胺氧催 長 生 下 OC 1Χ 4 於 性鹽te 用鹽鹽酸糖 糖 醇醇na 利鹽酸酸醋萄糖醇伯糖糖糖糖Co 質酸檬果基葡芽露拉露藻梨藻tra醇 受肥檸蘋苯D-麥甘阿甘菌山赤cit肌 ADH + 尿素酶 - 明膠水解 + 七葉亭水解 + 來自蔗糖之左聚糖 + 脫氮作用 + 卵磷脂酶 + 螢光性 綠膿菌色素 -35- 200837195 該細胞脂肪酸之特性爲典型的第I群假單胞桿菌。 對16S rRN A之484 bp-長之片段的分析顯示與有緣假 單胞菌之序列100%相符。 所以在考量所有數據以後，可把MA32鑑定爲有緣假 單胞菌。 -36- 200837195 質 性 之 3 11 1式 ΜΑ形 胞度度 細寬長 m m Mr Mr 8 0 0 3 菌6-5-桿ο 1 活動力 + 鞭毛 端鞭毛數> 1 容r 鹽 、科 e 1¾ 胞C 長 酸 應H{ 生性 鹽 二 反ο酶 下用鹽鹽酸糖 糖 酸戊酸 氏%κ肽酶酶IV利鹽酸酸醋萄糖醇伯糖糖胺基胺酸酸仁 蘭3°基化化 4 質酸檬果基葡芽露拉露藻醇丙酮甲尿二杏 格以胺氧催於受肥檸蘋苯D-麥甘阿甘菌肌β-α-苯馬壬D- + + + + ADH + 尿素酶 - 明膠水解 - 七葉亭水解 - 來自蔗糖之左聚糖 - 脫氮作用 - 卵磷脂酶 - 螢光性 + 綠膿菌色素 - -37- 200837195 該細胞脂肪酸之特性爲典型的第I群假單胞桿菌。 對16S rRNA之476 bp-長之片段的分析顯示與戀臭假 單胞菌之序列1〇〇%相符。 所以在考量所有數據以後，可把MA1 13鑑定爲戀臭 假單胞菌。 實施例3 氰化物對腈水合酶活性之影響 細胞如實施例1所述般生長培育’離心除去培養物之 培養基且用標準緩衝液（50 mM pH 7.5之磷酸鉀緩衝液） 再懸浮。把5 0 μΐ之此細胞懸浮液加到7 〇 〇 μ 1之標準緩衝 液（其含有0、2 1.4、5 3 · 6及1 0 7 · 1 mM氰化鉀（終濃度爲 0、20、50、100 mM氰化物））中。該反應藉著在標準緩 衝液（其與剩餘的反應溶液有相同的氰化物濃度）中加入 20 0 μΐ 200 mM之腈溶液來開頭。在這種情況下，該細胞 懸浮液之細胞濃度能使不含氰化物之混合物於2 0 °C下反應 10分鐘後會有16%之腈被轉化。在20°C下反應分鐘後 ，加入20 μΐ半濃縮磷酸來終止該反應，且藉著離心移去 該等細胞。 1 U的活性係定義成能於1分鐘內把1 pm 01甲基丙燒 腈轉變成醯胺之酶的份量。如果除了醯胺以外還會形成酸 時，那麼1 U則定義成能於1分鐘內把1 I1 m 01甲基丙嫌 腈轉變成醯胺及酸之酶的份量° 轉化作用係用HP LC分析。關於此目的’係使用 -38- 200837195
Intersil ODS-3V ( GL Sciences Inc.)管柱，所採用之移動 相爲10 mM pH 2.3之磷酸鉀及乙腈以85: 15比例混合之 混合物。流動率爲1 ml/min。係以200 nm UV來偵測。 甲基丙烯腈轉化之相對活性與氰化物濃度間的函數關 係係示於第3圖及第4圖。 實施例4 有緣假單胞菌MA32及戀臭假單胞菌MA113之靜息 細胞的丙酮氰醇轉化作用 有緣假單胞菌MA32及戀臭假單胞菌MA113係如實 施例1所述般生長培育及離心。乾重1 . 1 6 g之細胞用5 0 mM pH 8.0之磷酸鉀緩衝液稀釋且終體積爲50 ml。此外 ，還把0.02 mM 2-甲基-1-丙烷硼酸加到該反應混合物中 。把剛蒸餾過之丙酮氫醇於4 °C劇烈攪拌下連續加入’其 添加速度讓反應期間的任一時間點之濃度都不超過5 δ71。 把pH値維持在7.5。反應如實施例3般用HPLC監測。經 過1 4 0分鐘後，1 0 · 0 g腈已經全部轉變成1 0 · 7 g醯胺及 1 · 4 g 酸。 M A 1 1 3及Μ A 3 2菌株相對於時間之反應量變曲線係示 於第5圖及第6圖。 實施例5 於第2圖所示之反應性蒸餾器中，以4 8個小時的時 間供應4619 g α-羥基異丁酸甲酯（MHIB)及3516 g甲基 -39- 200837195 丙烯酸（MAA )。該反應係於溫度12(TC及壓力250毫巴 下進行。所形成的α-羥基異丁酸係從底部移出。甲基丙烯 酸甲酯（ΜΜΑ )則被蒸出。反應係於存在16重量％水（ 以α-羥基異丁酸甲酯之重量計）下進行。該反應係採用酸 性觸媒（陽離子交換器，拜耳公司之Lewatit® Κ2431)進 行。 選擇性，係定義成所形成甲基丙烯酸甲酯（MMA )及 α-羥基異丁酸（HIBA)之份量對被轉化之MHIB及MMA 之份量的比率，爲99%。 由此製法製得之α-羥基異丁酸係依照DE-A 1 7 68 25 3 所用方法來脫水。 整體選擇性爲9 8 · 5 %，其係定義成所形成MM Α之份 量對被轉化之MHIB之份量的比率。 實施例6 甲基丙烯酸甲酯係把α-羥基異丁酸甲酯脫水來製得。 此反應係依照ΕΡ-A 094 1 984所用方法進行。把20 g磷酸 二氫鈉及80 g水之混合物加到60 g矽膠中。於減壓下把 水從混合物中移除。殘餘物於1 5 0 °C下乾燥隔夜而得到觸 媒。把1 0 g得到之觸媒裝入配備有揮發器之石英管。把 石英管用烤箱加熱，該觸媒層的溫度約4 0 0 °C。把甲醇及 α-羥基異丁酸甲酯（2 : 1 )之混合物用每小時10 g的速度 連續蒸發且通過該觸媒層。該反應之選擇性’係定義成所 形成之MMA的份量對被轉化之MHIB之份量的比率，爲 -40- 200837195 8 8%。 實施例7至23 基本上係重複實施例1，惟不把水加到反應混合物中 。該反應係於表1詳細列示的條件（特別是溫度、停留時 間及反應旲耳比）下進行。該反應之選擇性，係定義成 所形成之MMA及HIBA的份量對被轉化之MHIB及MAA 之份量的比率’係類似地示於表1。 表1 實施例 反應溫度 [°C ] MHIB/MMA 莫耳比 停留時間 [分鐘] 選擇性 『％1 7 120 1 .00 28.33 93.21 8 90 1.00 42.50 95.06 9 100 1.00 42.50 94.81 10 110 1.00 42.50 94.64 11 120 1.00 42.50 90.67 12 90 1.00 85.00 95.53 13 100 1.00 85.00 94.95 14 1 10 1.00 85.00 93.55 15 120 1.00 85.00 91.78 16 90 1.00 170.00 94.83 17 100 1.00 170.00 94.06 18 90 2.0 42.50 91.61 19 100 2.0 42.50 91.73 20 90 2.0 85.00 90.63 2 1 100 2.0 85.00 90.30 22 120 0.50 28.33 92.05 23 120 0.50 42.50 92.62 【圖式簡單說明】 -41 - 200837195 第1圖顯示進行轉酯化之工廠。 第2圖顯示該反應性蒸餾之較佳具體例。 第3圖及第4圖顯示於實施例3得到之甲基丙烯腈轉 化之相對活性與氰化物濃度之函數關係。 第5圖及第6圖顯不實施例4列示之菌株μ A1 13及 MA31達到之相對於時間之反應量變曲線（pr〇file)。 【主要元件符號說明】 第1圖 (1 ):管線 (2 ):管線 (3) ··固定床反應器 (4 ):管線 (5 ):蒸餾器 (6 ):管線 (7 ) ·•管線 (8 ) ••相分離器 (9 ) ··管線 (1 0 ) ··管線 (1 1 ):管線 (12):第二蒸飽器 (1 3 ):管線 (1 4 ):管線 (1 5 ):脫水反應器 -42- 200837195 ( 16 ) :管線 ( 17 ) :管線 第 2圖 ( 1 ): 管線 ( 2 ): 管線 ( 3 )二 蒸餾塔 ( 4 )： 子液流 ( 5 ): 液流 ( 6 ) ·· 增壓裝置 ( 7 ): 熱交換器 ( 8 )： 固定床反應 ( 9 )： 輸出流 ( 10 ) :熱交換器 ( 11) :閥 ( 12 ) :冷凝器 ( 13 ) :相分離器 ( 14 ) :管線 ( 15 ) =管線 ( 16 ) :回流 ( 17 ) =管線 ( 18 ) :底蒸發器 ( 19 ) :底流 -43-