TW200825070A - Purification of mupirocin - Google Patents

Description

200825070 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於製備及純化莫匹羅星妈（mupirocin calcium)之改良方法。 【先前技術/背景】 莫匹羅星（mupirocin)是一種抗菌劑，其係藉由螢光假 單胞細菌發酵生產成假單胞菌酸 A。它有效於對抗可感染性菌株金黃色葡萄球菌 ㈣rews)及釀酿鍵球菌（uSirepiocoecws 且典型地被用作外用液。莫匹羅星的分子式為 C26H4409 (分子量=500.63);其化學名為（E)-(2S，3/M及，55> 5-[(2^，4义55>2,3-環氧-5-羥基-4-甲基己基]四氫_3,4-二 經基-(β)-甲基-2//-Π辰σ南-2_巴立酸與9-經基壬酸之醋。莫匹 羅星的化學結構如下圖：

假單胞菌酸Α之鈣鹽，莫四羅星鈣或假單胞菌酸舞提 供了較向的熱穩定性，特別是在結晶的狀態下（美國專利第 5，1 9 1，093唬）。此穩定性特別適合於牽涉到較高溫度之調 配物。 數種純化莫匹羅星及其衍生物之方法為此技藝已知 5 200825070 的。例如，US 5,1 9 1，093描述一種製備假單胞菌酸妈晶體 或其水合物的方法，其方法包含將假單胞菌酸根離子在水 溶劑中與鈣離子溶液反應，從該溶液中取得結晶假單胞菌 酸辦水合物，然後視需要移除結晶水。此方法提供一種將 莫匹羅星酸轉換成鈣鹽之簡單的手段。然而，該操作之純 化效果是有限的，且需要純的起始物以得到可接受為藥用 的產物。美國專利第3,977,943號係關於從培養液之純化， 其係使用Amberlite XAD-2聚苯乙烯樹脂色層分析且用一 系列的低分子量酸來洗提。德國專利2227739及美國專利 第4,289,703號係關於一種使用鈉鋇及甲基異丁酮（Mibk) 的純化方法。比利時專利第870,855號係關於一種方法， 其包含使用MIBK及碳酸氫鈉從發酵液中萃取莫匹羅星， 及從MIBK-正庚烷混合物結晶。美國專利第4,222,942號 係關於一種方法，包含在極性水不相溶混有機溶劑中萃 取’及在非極性溶劑中稀釋以產生結晶。美國專利第 6,254,921號係關於一種用氯化脂肪族碳氫化合物或乙酸異 丁酯的萃取及有機溶劑的蒸發的方法。 如同 US 5，191，〇93，W〇03/065975 A2 提供一種於雙相 系統中從莫匹羅星製備莫匹羅星鈣的方法，該方法係^由 使用有機羧酸鹽及將固態莫匹羅星鈣從水相分離；或^藉 由將非晶形莫匹羅星鈣從Cl-C4醇沉澱出來後再將非晶^ 產物轉換成結晶形式。 B ^ 為此技藝已知者，例如美 這些方法一般皆關於將莫 數種純化莫匹羅星酸的方法 國專利第4,222,942號（如前述）， 200825070 匹羅星在酸化/鹼的水溶液及極性水不相溶混有機溶劑（如 甲基異丁酮（MIBK)和乙酸異丁酯）中分配，接著從如 的有機洛劑結晶。根據美國專利u s· 4,289,7〇3 A，可於陡 鋇鹽被加入發酵液，然後用離心法分離帶有不可溶不=性 劑之微生物細胞，且最後以MIBK萃取該抗生素。然後用 鹼性水將該抗生素從該甲基異丁酮萃取物中移除，並將所 產生的鹼性水性萃取物以MIBK再萃取予以清洗。獲得的 粗產物施以層析術，而_種§旨衍生物係自假單胞菌=生

素錯合物製備，並以製備薄層層析術純化。經水解獲得該 純抗生物的酸的形式。 X k 一方法/步及了大體積的有害試劑，而仍然需要一種 新穎的結合純化及將莫匹羅星轉換成其㈣之製造莫匹羅 星約的方法。此種新賴的方法能導致較短的生產程序，且 就其本身而論在商業上及環境上會更有吸引力。 在匕頁技中，需要一種更有效的生產經純化之莫匹 羅星μ物（如莫匹羅星⑷製備物的方法。本文提供了此 等方法及由其生產的產物，討論如下。 【發明内容/發明概述】 一本發明係關於製備及純化莫匹羅星鈣的方法。在一具 體只例中，其方法包括將無細胞之莫匹羅星製備物（可溶鹽 或酸，較佳呈可溶赜沾 > 斗 意、7式’如假單胞菌酸鹽）吸附至固體 撐體上，將該經結合曰 莫、准生接觸含鈣溶液，自該固體 撐體上洗去不純物，及將經純化之苴沉溫3 # ώ田鱗产祕 匹羅星鈣自固體撐體 200825070 上洗提出來。同時提供了使用此等方法製備及純化之莫匹 羅星鈣之製備物。 、 /在另一具體實例中，製備無細胞莫匹羅星之製備物， 然後將假單胞菌酸鹽吸附至固體撐體上。然後將經結合之 假單胞菌酸鹽舆含約溶液接觸及在固體擇體上形成莫匹羅 生鈣。其後將不純物洗出，繼以從固體撐體上選擇性洗提 目I为子。出人意外地，在該被吸附的假單胞菌酸鹽上達 成70全對鈣的鹽交換，並在莫匹羅星及鈣之間得到正確的 分子等價。 由於在過程中選擇性的去除不純物，此方法提供了高 純化效率。 【實施方式/詳細說明】 莫匹羅星（muPir0Cin)是一種抗菌劑，其係藉由螢光假 單胞細囷⑽似//woresce似）發酵生產成假單胞菌酸 A。它有效於對抗可感染性菌株金黃色葡萄球菌 及釀膿鍵球菌 且典型地被用作外用液。莫匹羅星的分子式為 C26H4409 (分子量=500·63);其化學名為(^)-(28,3及，4及，5幻-5-[(25\3*5,45,55)-2,3_環氧-5-羥基-4_曱基己基]四氫_3,4-二羥 基_(β)_甲基-277-哌喃-2·巴豆酸與9-羥基壬酸之酯。莫匹羅 星的化學結構如下圖： 200825070

C〇2{CH2)ec〇〇H 一詞可能表示假單胞菌酸A ， 板單胞菌酸鹽或任何莫匹羅星 別有用於製備及純化莫匹羅星 用在此處，“莫匹羅星，， 莫匹羅星酸，莫匹羅星句， 衍生物。本文描述之方法特 妈0 $本申叫案中’-種用來製備莫匹羅星鈣的方法包括 吸附莫匹羅星（呈可溶鹽或 形式，較佳為可溶鹽，如假單 胞囷酸鹽）至固體撐體上，血 /、i為&水性吸附樹脂，將該經結 合的莫匹羅星接觸含鈣湓、为 麪，谷液，自該固體撐體上洗去不純物， 及將經純化之莫匹羅I^ 吳羅生鈣自固體撐體上洗提出來。 ^種方法包括吸附假單胞菌酸鹽至固體撐體上，典型 為吸附樹脂，將該經結合的假單胞菌酸鹽接觸含_溶液Γ洗 去不、屯物及將經純化之莫匹羅星鈣自固體撐體上洗提出 來。該經洗提的產物可繼以結晶而純莫匹羅星鈣以技藝已 知的方法分離出來，如記载於美國專利第5，191，093號。 ^使用一無細胞莫匹羅星製備物。該製備物藉發酵產生 莫匹羅星之螢光假單胞細菌培養物，因之得到發酵培養 液，過濾之以移除生物團（使培養液澄清）。調整該溶液之 pH值以確保全部的莫匹羅星都被去質子化，即假單胞菌酸 鹽。在吸附於固體撐體前，硫酸銨可被加入莫匹羅星製備 物中，以增加分子及吸附劑之疏水性交互作用，從而增加 树月曰結合假單胞菌酸鹽之能力。 200825070 美國專利第3 977,943 f卢；^汁制供甘 的/ 製備莫匹羅星之製備物 =方法間早而吕，在攝氏三十度下，如ncib【之 ::的勞光假單胞細菌的菌株在含玉米浸液及葡萄糖的驗 性D谷液之培養基的浸沈培養物中成長約二十四小時。數 種製備發酵培養液的方法為此技藝已知者且可適當的在此 使用。 固體才牙體可為任何能夠可逆吸附莫匹羅星酸之材料。 該固體撐體為莫匹羅星可經由疏水性交互作用與之結合的 材料而使*莫匹羅星的酸基可用以與其他試劑、化合物 或分子的某部分結纟，如鈣離子。固體撐體的另一重要的 特性為莫匹羅星與撐體的結合在熟知此技術者的選擇下是 可逆的。在特定具體實例中，該固體撐體為樹脂，及在其 他具體實例中則為疏水性吸附樹脂。合適的吸附樹脂包含但 不限於經修飾之瓊脂糖，經修飾之二氧化矽，聚苯乙烯或丙烯 酸/甲基丙烯酸材料。吸附樹脂的實例包含但不限於丙烯酸吸附 劑 XAD7HP® (Rohm & Haas)或 HP2MG® (Diaion)，及聚苯 乙烯二乙烯苯吸附劑XAD1600®，XAD4® (皆可從Rohm &

Haas 獲得）or HP40® (Diaion)。 合適的疏水性吸附樹脂包含但不限於經修飾之二氧化 石夕’聚苯乙烯或丙烯酸材料且包含例如丙烯酸吸附劑 XAD7HP(Rohm & Haas)或 HP2MG(Diaion)，及聚苯乙烯二 乙烯苯吸附劑XAD1600，XAD4。 在第一個方法中，將莫匹羅星（例如假單胞菌酸鹽或莫 匹羅星酸，較佳為假單胞菌酸鹽）吸附至固體撐體，接觸含 200825070 鈣試劑且從管才主中洗I，如&，提供一莫匹羅星鈣溶液。 在車乂佺具體貝你]中’含鈣試劑為以鈣為基的可溶鹽。舉例 各鈣忒剤包合但不限於氯化鈣，乙酸鈣，硝酸鈣及丙酸鈣。 可、用有祛/合劑（例如甲醇）進行洗提。可以用其他試劑進 订洗提，包含但不限於乙醇，異丙醇及乙腈或以上之任何 混合物’包含含水混合物。 上述方法亦包含在吸附到固體撐體上之前，添加硫酸 鈿到旲匹羅生製備物。在吸附之前添加硫酸銨以增加莫匹 羅星分子與吸附劑之間的疏水交互作用，藉此增加結合能 力:在其他的具體實例中’莫匹羅星酸之製備物為純的莫 述方法在製備經純化之莫匹羅星職有用。在特定 具體實例中’經純化之莫匹羅星❹少被純化i 5〇%;至 少65%;至少7G%;至少8()%;或至少9〇%。 使用在此敘述之方法而純化的莫匹羅 組成物用來治療哺翻榀甘/ 衣備成 ^ '、 ，/、係使用此技藝中已知的標準 技付。該組成物可依照常見荜 給病“用W r 工以製造藥劑 用(即—「醫藥組成物」），包括人類及其他哺乳 面樂組成物較佳做成呈劑量單位形式，單單勺人 特定經純化之莫匹羅星的量，或與 早匕3 型與醫藥可接受撐_ έ士 A r :二、’ ’生劑組成’典 一十,、 〇合醫樂可接受撐體」一詞夺千 $夕種適合於完成或增進莫匹羅星以 ：’、 調配材料。嗜醫藥知# ^ 糸、、且成物傳遞之 ^ β酉桌、、且成物亦可被施予常見醫筚 菌且/或可包含當导^ ^、术作，如滅 吊見佐樂，如防腐劑、安定劑、濕潤劑、乳 11 200825070 化劑、緩衝劑，及其相似物。 對人類或其他哺乳動物之適合之每日劑量可能變化 很大’依病患的狀況和其他因素而定，但可以被熟習該項 技術者用例行方法決定。作為外部施用時，每天可施用一 至四次該組成物適合的外用劑量，且較佳二到三次。該藥 劑亦可在間隔幾天沒有施用的情況下施用。適合組成物可 包括莫匹羅星從〇·〇〇1%至1〇%，少於5%，；^2%或〇 ]」〇/〇 之調配物。適合外部施用之調配物包括，例如，液體或半 液體製備物適合穿透皮膚（例如，搽劑（Hniments)、洗劑 (1〇tl〇ns卜軟膏（ointments)、乳液（creams)或糊劑（pastes))。 施用的其他形式為此技藝已知且包含在描述於此的具體實 例中。 對本發明及其諸多優點之更好的理解可以從下面的例 子獲得，提出以為說明。 實施例 實施例1

莫匹羅星在水中之無細胞溶液 藉由就其本身而言已知之方法（即與美國專利第 3’977,943號實施例i之程序一致）發酵產生莫匹羅星的勞 光假單胞細菌培養物獲得包含莫匹羅星酸之料培養液。 在室溫下’五公升含莫匹羅星之全培養發酵培養液（得自實 驗室發酵器）被調整至pH =8.3(藉添加3M Na〇H)且以144 μη金屬筛過渡，繼以超過濾（MilHpGre pe⑴⑽』則。賴_ 5)。在最終澄清培養液中，得到約鄕#在於發酵培養 12 200825070 液的莫匹羅星。視需要，含莫匹羅星之透過液藉由nf (Osmonic Desal DK membrane)濃縮。 實施例2 吸附假單胞菌酸至固體撐體且轉換成莫匹羅星鈣 A·在得自實施例1之濾液（363 ml，1.3g莫匹羅星）中 加入（NH4)2S04 (24g)。藉由加入1M NaOH調整pH至 7.5。丙烯酸吸附劑XAD7HP® (Rohm & Haas)填充於層析 管柱内（24 ml)，且將準備好的莫匹羅星溶液（呈假單胞菌酸 鹽溶液形式）加入該管柱中（1 ml/min)。該管柱用包含〇 5M (NH4)2S04 之 〇·1Μ Tris-緩衝液，pH 7.5(120 ml)洗。然後 將〇·1Μ乙酸鈣溶液（72 ml)繼以水（48 ml)加到管柱中。 莫匹羅星鈣被80%曱醇從管柱中洗提出來。在洗提液池 (pool)中獲得0.9 g莫匹羅星鈣（60 m卜產率70〇/〇)。 B. 在得自實施例1之濾液（293 ml，1 _5g莫匹羅星）中 加入（NH4)2S04 (19 g)。藉由加入1 μ NaOH調整pH至pH 7·5。將聚苯乙烯二乙烯苯吸附劑χΑ〇 1600® (R〇hm & Haas) 填充於層析管柱内（22 ml)，且將準備好的莫匹羅星溶液（呈 假單胞囷酸鹽〉谷液形式）加入該管柱中（1 ml/min)。該管柱 用包含 0.5M (NH4)2S04 之 〇·1Μ Tris-緩衝液，pH 7.5 (110 ml)沖洗。接著，將〇·1Μ乙酸鈣溶液（66爪丨）繼以水（66 ml) 加到管柱中。莫匹羅星鈣被8〇%甲醇從管柱中洗提出來。 在洗提液池中獲得1·3 g莫匹羅星鈣（55 m卜產率87%)。 C. 在得自實施例1之濾液（1035 ml，5.8 g莫匹羅星） 中加入（NH4)2S04 (68 g)。藉由加入1 μ NaOH調整pH至 13 200825070 pH 7·5。丙細酸吸附劑XAD7HP® (Rohm & Haas)填充於層 析管柱内（191 ml)，且將準備好的莫匹羅星溶液（呈假單胞 菌酸鹽溶液形式）加入該管柱中（1·9 mi/min)。該管柱用包 含 〇·5Μ (NH4)2S042 0.1M Tris-緩衝液，pH 7.5 (958 ml) 沖洗。接著，將0·1Μ乙酸妈溶液（575 ml)繼以水（573 ml) 加到管柱中。莫匹羅星鈣被60%甲醇從管柱中洗提出來。 在洗提液池中獲得5.0 g莫匹羅星鈣（21 6 ml，產率83%)。 洗提液池的一部分（54 ml，1·2 g莫匹羅星鈣）被蒸發 (90 mbar ’ 50°C)。其造成無曱醇溶液（15 ml)在室溫下帶著 授拌被允許結晶。大約二十個小時後，濾出結晶材料而其 造成之濾餅被水（10 ml)洗，且在真空盤乾燥器中乾燥（<5〇 11^31^’40。(：）。獲得1_1§具有91.4%的比活性的產物（如現 狀（‘as is，））。 D_經純化之莫匹羅星酸（丨〇g，包含94%之活性物質） 被溶於0·5Μ (NH4)2S04溶液中（1L)。藉由加入1 μ NaOH 凋1至pH 7.5。聚苯乙烯二乙烯苯吸附劑XaD4® (Rohm & Haas)被填充於層析管柱内（22 ml)，且將準備好的莫匹羅星 溶液（呈假單胞菌酸鹽溶液形式）加入該管柱中（88ml，2 ml/min)。該管柱用包含0·5Μ (Nh4)2S〇4之〇1]^磷酸鹽緩 衝液pH 7.5 (3 3 ml) ’繼以0.1M罐酸鹽緩衝液，pH 7.5(110 ml)，及最後水（66 ml)洗。〇·1Μ CaCl2溶液加到管柱中（66 ml)。剩餘的鈣被水（66 ml)繼以2〇0/〇甲醇（176 ml)洗掉。莫 匹羅星鈣被60%甲醇從管柱中洗提出來（176 ml)。在洗提 液池中獲得0·5 g莫匹羅星鈣（121 m卜產率51%)。 200825070 該洗提產物於實驗室旋轉蒸發器中在真空下被蒸發（8〇 mbar，50。〇。其濃縮且無甲醇溶液（2 5如）在室溫下帶著 搜拌被允許結晶。二十個小時後，結晶材料被滤出且其遽 餅在真空盤乾燥器中乾燥（<；50 mbar，5〇〇c)。獲得 〇 3 g 具 有92%的比活性的產物（如現狀）且熔點為125Q(：。該產品 之FT-IR光譜與參照的莫匹羅星鈣光譜相符。 當本發明就較佳具體實例方面做了描述的同時，要瞭 解’熟習此項技術者將知悉變化或修改。因此，意欲以附 加的申請專利範圍涵蓋所有如此的在本發明要求的範圍内 的等同變化。 【圖式簡單說明】 益 【主要元件符號說明】 15

Claims (1)

1. 200825070 十、申請專利範圍： 1 · 一種純化莫匹羅星鈣的方法，包括將莫匹羅星製備 物車乂佳呈可溶鹽形式，吸附至固體撐體以產生經結合的 莫匹羅生’將該經結合的莫匹羅星接觸可溶含鈣試劑以產 生莫匹羅星舞，沖洗經結合的莫匹羅星鈣，及將經純化之 莫匹羅星鈣自固體撐體上洗提出來。 2·如申請專利範圍第丨項之方法，其中莫匹羅星製備

   物係藉由發酵產生莫匹羅星之螢光假單胞細菌培養物製 備’彳于到因之產生之發酵培養液，及視需要藉由過濾使培 養液澄清。 3 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該固體撐 體為疏水性吸附樹脂。 4·如申請專利範圍第3項之方法，其中該樹脂選自由 經修飾之二氧化矽，聚苯乙烯及丙烯酸材料組成之群組。 5·如申睛專利範圍第4項之方法，其中該樹脂選自由 丙烯酸吸附劑XAD7HP及聚苯乙烯二乙烯苯吸附劑 XAD1600和XAD4組成之群組。 6.如申請專利範圍第i 3戈2項之方法，其中該莫匹羅 星鈣進一步藉由結晶純化。 7·如申請專利範圍帛1或2項之方法，其中該莫匹羅 星鈣被純化到至少50%。 8·如申請專利範圍第丨或2頊之方、土 . ^ 4 2貝之万去，其中該莫匹羅 星鈣被純化到至少65%。 其中該莫匹羅 9·如申請專利範圍第丨或2項之方法 16 200825070 星鈣被純化到至少90%。 10.如申請專利範圍第i或2項之方法，— 如硫酸錄，被加到莫匹羅星製備物中以、二種驗， 附。 赞撐體的吸 η.如申請專利範圍第1或2項之方法 可為乙酸約、氯化每、确酸辦或為丙酸約，3舞試劑 或氯化#5。 為乙酸飼 12·如申請專利範圍第丨項之方法，其中 備物呈假單胞菌酸鹽形式，护舻Μ 、羅星的製 風心式&酸銨溶液被加到 ^勿中以協助莫匹羅星對固體撐體的吸附，該固體二^ ΧΑ:或XAD16〇〇 ’該含約試劑為乙酸約 牙甲 醉的有機㈣將經純化之莫匹羅㈣洗提出來。吏用如甲 如申請專利範圍帛i項之方法 備物呈莫匹羅星酸形式，硫酸銨溶液被力到苴、、.的製 物中以協助莫匹羅星對固體& °、匹羅星製備 XAD4,w 的吸附，該固體擇體為 4’儀试劑為氯化㉟’且使用如甲醇 將經純化之莫匹羅星鈣洗提出來。 彳"J 14·如申請專利範圍第1〇 硫酸銨，被加到經純化之莫匹羅員=其中一種驗，如 體。 維生中以協助吸附至固體撐 15. 一種製備莫匹羅星鈣的方法，包括： a·將經純化之莫匹羅星， 固體撐體上； 仏呈可溶鹽形式，吸附至 b.使經吸附之莫匹羅星與含舞試劑接觸； 17 200825070 C·移除過量含鈣溶液；及 d.從固體擇體上洗提莫匹羅星約。 16·如申請專利範圍第15項之方法，其中該含鈣溶液 選自由氯化药、乙酸舞、硝酸妈及丙酸詞組成之群組。 17·如申請專利範圍第16項之方法，其中該含鈣溶液 為乙酸鈣。 18. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該含鈣溶液 為氯化妈。 19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項之方法，其 中莫匹羅星鈣係使用有機溶劑自固體撐體上洗提出來。 20·如申請專利範圍第19項之方法，其中該有機溶劑 包含甲醇。 2 1 ·如申請專利範圍第1 5至1 8項中任一項之方法，其 中該固體撐體為疏水性吸附樹脂。 2 2 ·如申明專利範圍第2丨項之方法，其中該樹脂選自 由經修飾之二氧化矽沉澱物，聚苯乙烯及丙烯酸材料組成 之群組。 23·如申請專利範圍第22項之方法，其中該樹脂選自 由丙烯酸吸附劑XAD7HP及聚苯乙烯二乙烯苯吸附劑 XAD1600和XAD4組成之群組。 24·如申請專利範圍第1 5至1 8項中任一項之方法，其 中該莫匹羅星鈣進一步藉由結晶純化。 2 5 ·如申請專利範圍第1 5至1 8項中任一項之方法，其 中該莫匹羅星鈣被純化到至少5〇%。 18 200825070 26·如申請專利範圍第15至18項中任一項之方法，其 中该莫匹羅星|弓被純化到至少65〇/〇。 27_如申請專利範圍第15至ι8項中任一項之方法，其 中该莫匹羅星舞被純化到至少9〇0/〇。 28·如申請專利範圍第15至18項中任一項之方法，其 中一種鹼，如硫酸銨，被加到經純化之莫匹羅星中以協助 吸附至固體撐體。 ^ t9·如申請專利範圍第15項之方法’其中該經純化之 莫Γ維ί呈假單胞菌酸鹽形 <，硫酸銨溶液被加到經純化 1旲匹維星中以協助莫匹羅星對固體撐體的吸附，該固體 知體為 XAD7HP 式 V Δ ΤΛ 1 /CAn 二 ，且使用如曱醇的有機溶劑 將莫匹羅星鈣洗提出來。 3 0.如申請專利範圚筮 P弟15項之方法，其中經純化之莫 匹維星呈莫匹羅星酴拟— 各 矢 tjz ^ ^ ^ ，石现酸銨溶液被加到經純化之莫 匹維生中以協助莫匹羅星 莫 為XAD4,該含舞溶液為氣化=按體的吸附，該固體撐體 劑將莫匹羅星鈣洗提出來、·弓，且使用如甲醇的有機溶 31.—種經純化之莫匹 ， 第1至3 0項中任一頂* /、係藉由如申請專利範圍 任貝之方法所製備。 十一、圈式： 19