TW200812622A - Processes for preparing water-soluble polyethylene glycol conjugates of macrolide immunosuppressants - Google Patents

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Jianxin Gu
Mark Ruppen
Tianmin Zhu
Mahdi B Fawzi
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Description

200812622 九、發明說明： 發明領域 本發明係關於製備巨環内酯免疫抑制劑西羅莫 5 司（雷帕黴素）、依維莫司（everolimus)、酯化西羅莫司 (CCI-779)、他克莫司（FK506)和環囊黴素（FK520)之水 溶性聚（乙二醇）綴合物的方法。 【先前技術3 發明背景 10 雷帕黴素（1)、他克莫司（FK506，2)和環囊黴素 (FK520 ’ 3)在構造上類似巨環聚縮酮(p〇lyketides)並且全部 為作用於相同細胞内受體但具有不同作用模式、在不同階 段抑制T-細胞活化的強效免疫抑制劑(R〇sen等人，，，作為細 胞功此楝測物的天然產物：親免蛋白（immunophiiins)的研 15 究’’’/叹謂.〇側./此及/.五叹/.1992,31:384〜400)。這
些巨環素具有抗菌活性並且亦可有效用於動物模式的自體 免疫性疾病包括實驗室過敏性腦脊髓炎、關節炎、動物模 式的糖尿病、MRL/lpr小白鼠模式的紅斑性狼瘡（Sle)、高 度增生性皮膚病及葡萄膜視網膜炎(uve〇re〖initis)。
2 他克莫司（FK506)R=CH2CH=CH2 3 環囊黴素(FK520)R=CH2CH3 5 200812622 雷帕黴素(rapamycin)和他克莫司（tacr〇limus)已被核准 用於預防移植的排斥作用。然而，兩種化合物均具有形成 極有限水溶性之組成物的類似問題。例如，他克莫司在水 中的>谷解度為12微克/毫升。如此的低溶解度需要一種極為 5複雜的配方。舉例而言，溶解用於靜脈注射的5毫克他克莫 司需要200毫克/毫升氫化聚氧6〇蓖麻油(HC〇_6〇)和8〇%(體 積/體積)絕對酒精作為助溶劑。雷帕黴素水中的溶解度為約 2·6微克/毫升以及具有低口服生物利用率 等人，“雷帕黴素：分佈、藥物動力學和治療範圍的研究” 10 />叹Μ觀·ί· 1995，17 : 666〜671)。雷帕黴素雖然具有治療 如免疫抑制之低劑量亦可在IC5G<50奈毫克下作為對抗各種 實質瘤的強效腫瘤生長抑制劑，但上述的特性限制其在臨 床上的應用。 聚乙二醇(PEG)和甲氧基聚乙二醇(mPEG)為具有低分 I5散性之各種分子量的直鏈或支鏈中性聚合物 (Mw/Mn<l .05)。已發現這些水/有機溶劑的可溶無毒性聚合 物可被有效應用於生物和醫藥上。一種此類的用途為結合 這些聚合物與不溶或微溶小分子治療劑而製成水溶性peg— 藥劑綴合物，此稱為聚乙二醇化。據報告有機分子的聚乙 20 二醇化可加強有機分子的水溶性以及賦予其他有益性質例 如改善血漿半衰期、改善生物分佈和降低毒性(Greenwald 等人“藉由聚乙二醇化藥物綴合物進行有效藥物輸送”， dc/vimc^/Z>t/g£)e"ver3；i^v.2003，55:217〜250;Pasut# 人“治療用途的蛋白質、肽和非肽藥物之聚乙二醇化作 6 200812622 用”，及Ppz”· 2¾狀八2004 ’ 14 · 859〜894) 〇 美國專利申請公開案US2005/0234234中已述及雷帕黴 素之脂解酶催化的乙醯化作用。此催化過程可在溫和反應 條件下從雷帕黴素產生具有極佳產率之區域特異性的雷帕 5 黴素42-酯衍生物，將其併入於此以供參照。 製造雷帕黴素或其衍生物的PEG綴合物已述於美國專 利案5,955,457、5,780,462、6,432,973和6,331,547。製造生 產聚乙二醇化CCI-779之雷帕黴素CCI-779的羥基酯已述於 美國專利案5,362,718，將其併入於此以供參照。這些專利 10 描述藉由雷帕黴素或其衍生物經由一酯鍵以化學鍵連接至 甲氧基聚乙二醇化合物如硫醇衍生物（mPEGSH)所形成的 綴合物。因而需利用溶劑萃取及層析純化法收集所欲的 PEG綴合物。藉此，在高效液態層析法(HpLC)的純化後可 製備55%產率的雷帕黴素42-峨醋酸鹽。 15 國際專利公開案W099/03860中述及利用類似的方法製 備水溶性PEG-他克莫司（FK-506)綴合物。這些方法的主要 缺點為雷帕黴素/他克莫司骨幹内由於出現多重的〇H_官能 基而使酯鍵的安排具有低選擇性。此外，其在聚乙二醇化 作用中使用碳酸氫鈉水溶液作為鹼因而產生需經過多重純 20化步驟的數種副產物故僅具有低至中等的回收率。 依維莫司的合成述於美國專利案6,440,990以及PEG-依 維莫司（II)的合成述於美國專利案6,331，547，將其併入於此 以供參照。 本技術中需要用於製備巨環内酯免疫抑制劑之水溶性 200812622 聚（乙二醇)綴合物的另類方法。 【發明内容3 發明概要 在一態樣中’提供用於製備免疫抑 5 二醇綴合物的方法。 制巨環内酯之聚 乙
在另:態樣中，提供用於製備雷帕徵素、依維莫司 酯化西羅莫司（temsirolimus)、#古社 兄莫司和環囊徽
(ascomycin)之聚乙二醇綴合物的方法。 · 本發明的其他態樣和優點進一步描述於其較佳具體實 10 施例的下列詳細說明中。 ^ 發明之詳細說明 提供一種以雷帕黴素，包括雷帕黴素、依維莫司、酯 化西羅莫司、他克莫司或環囊黴素，高產率製備聚乙二= 綴合物的有效方法。此方法包括簡易的分離步驟，其專注 15於利用脂解酶將一酯鍵安置於這些巨環内酯内，並且具有 完整的區域選擇性及極佳的聚乙二醇化綴合物產率。 此處簡稱為(PEG)的聚乙二醇為在下式末端具有羥基 的直鏈聚合物：
HO-(CH2CH20)nCH2CH2.〇H 2〇 此式可表示為HO-PEG-OH，該-PEG-代表下式無端基 的聚合物主鏈： -(CH2CH20)nCH2CH2- 200812622 聚乙二醇亦可包括單活性、烧基末端聚乙二醇，例如 甲氧基-PEG-OH(mPEGOH):
CH30(CH2CH20)nCH2CH2.〇H 其一末端為惰性曱氧基而另一端為準備進行化學改性 5 的羥基。在一具體實施例中，該活性mPEG為甲氧基-PEG-SH(mPEGSH)：
CH30(CH2CH20)nCH2CH2-SH 在另一具體實施例中，該用於相同目的活性mPEG為雙 活性HS-PEG-SH(PEGSH):
10 HS-(CH2CH20)nCH2CH2-SH 雖然聚乙二醇基本上具有不同的分子量，但是通常使 用分子量從約400至約30,000的聚合物。在一實施例中，選 擇分子量從約1，000至約30,000的聚乙二醇。在另一實施例 中’選擇分子量從約2,500至約20,000的聚乙二醇。在進一 15步的實施例中，選擇分子量從約5,000至約20,000的聚乙二 醇。熟習本技術者將可輕易地瞭解這些通式，其中η—般為 從10至1，000的整數。 此處“雷帕黴素”指雷帕黴素及可被化學或生物改性為 运帕Μ素核心之衍生物但仍具有生物活性的化合物。因 20此’“雷帕黴素”一詞包括雷帕黴素的酯、醚、碳酸酯、胺 基曱酸酉旨、將（〇ximes)、腙(hydrazones)和經胺，以及核心 9 200812622 上官能基已被改性的雷帕黴素，例如經由還原或氧化作 用。“雷帕黴素”一詞亦包括雷帕黴素之醫藥上可接受鹽 類’其可藉由含酸性或鹼性基團而形成該鹽類。 在一具體實施例中，該雷帕黴素的酯和醚為雷帕黴素 5核心之第31位置具有羥基的酯和醚；在第27位置具有羥基 的醋和醚(接著第271同的化學還原作用）；在第42位置具有羥 基的醋和特別指在第42位置具有羥基之羥烷基、羥烷 烯基、經烧芳基酯或醚的雷帕黴素。肟、腙和羥胺為雷帕 徽素核心的酮類。 10 在其他具體實施例中，31-酯和醚的雷帕黴素已述於下 列的專利中：烷基酯（美國專利案4,316,885);胺烷基酯（美 國專利案4,650,803);氟化酯（美國專利案5，1〇〇,883);醯胺 酯（美國專利案5，118,677);胺基曱酸酯（美國專利案 5，118,678、5,441，967、5,434,260、5,480,988、5,480,989和 15 5,489,680);矽烷基醚（美國專利案5，120,842);胺基酯（美國 專利案5，130,307);縮醛(美國專利案5,51，413);胺基雙酯（美 國專利案5，162,333);磺酸和硫酸酯（美國專利案 5，177,2〇3);酯（美國專利案5,221，67〇);烷氧基酯（美國專利 案5,233,036) ; 0-芳基、-烷基、_烯基和_炔基酯（美國專利 2〇 案5,258,389);碳酸酯（美國專利案5,260,300);芳基羰基和 烷氡羰基胺基曱酸酯（美國專利案5,262,423);胺基甲酸酯 (美國專利案5,302,584);羥基醋（美國專利案5,362,718);受 阻酯（美國專利案5,385,908);雜環酯（美國專利案 5,385,909); gem-雙取代酯（美國專利案5,385,910);胺基烧 10 200812622 酸酯（美國專利案5,389,639);磷醯基胺基甲酸酯（美國專利 案5,391，730);胺基甲酸胺酯（美國專利案5,463,〇48);受阻 N-氧化SI (美國專利案5,491，231);生物素酯（美國專利案 5,504,091);以及0-烷基醚（美國專利案5,665,772)。這些酯 5 和醚的製造方法述於列舉如上之專利。 在又其他具體實施例中，雷帕黴素的27_酯和醚述於美 國專利案5,256,79G。這些_和_的製造方法述於列舉如上 之專利。
在又其他具體實施例中，雷帕黴素的42•舰基、仏 10輯基、42-錢基芳基喊露於美國專利案6，物，卿； 5,665,772和5,258,389。雷帕黴素的仏減基、仏輯美、 42-減基芳基㈣露於美國專利案5,362,718。這麵^ 的製造方法述於列舉如上之專利。 酯含有莽草酸 該免疫抑制巨 内酯為具有如 在一具體實施例中，該免疫抑制巨環内 15 (shikimic)衍生環己基區域。在一實施例中， 環内酯為雷帕黴素、他克莫司或環囊黴素。 在另一具體實施例中，該免疫抑制巨環 下構造的雷帕黴素： <
其中，R為選自氫和烧基、烯基、 芳基和芳烷基；R2 11 200812622 為選自氫、羥基和-Ο-烷基；R3為氫、烷基、烯基、芳基、 芳烷基和-C(0)R31 ; R31為選自氫、烷基、烯基、芳基和芳 烷基；R4為選自氫、羥基和-〇-烷基；R5為選自氫、羥烷基、 羥浠基、羥芳基、羥芳烧基和_C(0)R51 ;以及R51為選自經 5 烧基、經稀基、經芳基和經芳烧基。 “雷帕黴素”的實施例包括，但不侷限於，雷帕黴素（美 國專利案3,929,992) ; 32-去甲基雷帕黴素；32-去甲氧基雷 帕撤素’ 41-去甲基雷帕撤素，41·去甲氧基雷帕徽素（國際 專利公開案W02004/007709) ; 7,32·經基-2·(經甲基)_2_甲基 1〇丙酸(CCI-779，美國專利案5,362,718);以及42_〇_(2_經基) 乙基雷帕彳放素(依維莫司’ RAD001，美國專利案5 665 772)。 因而此處所述的方法可用於製造免疫抑制巨環内酯的 聚乙二醇綴合物。此方法包括在脂解酶的存在下使醯化劑 與具有莽草酸衍生環己基區域的免疫抑制巨環内酯反應而 15形成醯化巨環内酯。然後在鹼的存在下使該醯化巨環内酯 與曱氧基聚（乙二醇)衍生物相反應。在一具體實施例中，該 免疫抑制巨環内酯為雷帕黴素化合物。 在一具體實施例中，一PEG-雷帕黴素綴合物具有下列 的構造：
12 200812622 其中，R1為選自氫和烷基、浠基、芳基和芳烷基；R2 為選自氫、羥基和-〇-烷基；R3為氫、烷基、烯基、芳基、 芳烷基或-C(0)R31 ; R31為選自氫、烷基、烯基、芳基和芳 烷基；R4為選自氫、羥基和-0-烷基；X為選自氧(-〇-)、-〇-烧基-0-、-0-細基-0-、-0-芳基-0_、-0-芳烧基-0-和 -0C(0)R7，R7為選自-烧基-坤基-〇、-方基和-芳烧 基-Ο- ; η為從10至1，000的整數；以及X為0或S。 在進一步的具體實施例中，一PEG-雷帕黴素綴合物具 有下列(I)的構造：
其中，η為從10至1，000的整數；以及X為〇或S。 在另一具體實施例中，一PEG-雷帕黴素綴合物具有下 列(II)的構造： 13 200812622
m 其中，X和n為如上述之定義。
在又另一具體實施例中，一PEG-雷帕黴素綴合物具有 下列（III)的構造：
其中，X和η為如上述之定義。 在又另一具體實施例中，一PEG-雷帕黴素綴合物具有 下列（IV)的構造： 14 200812622
其中，X和η為如上述之定義。 此方法亦可用於製備除了雷帕黴素化合物之外具有親 免蛋白的PEG綴合物。該親免蛋白含有類似雷帕黴素化合 5 物之42-OH官能基的莽草酸衍生環己基區域，包括但不侷限 於FK-506相關天然產品。 此處“FK-506相關天然產品”一詞指具有下列核心構造 的化合物：
10 其中，R7、R8和R9為獨立之氫或烷基以及R為乙基或烯 丙基。在一實施例中，R7、R8和R9為Me ;以及R為 -CH2CH=CH2。在另一實施例中，R7、R8和R9為Me ;以及R 為-CH2CH3。 15 200812622 此處“燒基”一詞指直鏈和支鏈的飽和脂族羥基，其具 有 1至 10個碳原子(如，C〗、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、 C4c1())，例如 1 至8個碳原子(如，Ci、c2、c3、、^、 c6、（：7或(：8) ; 1 至6個碳原子（如，q、c2、C3、c4、 5 C6)，或1至4個碳原子（如，c!、C2、C3或C4)。，，烯基，，一詞 指直鏈和支鏈烷基，其具有至少一個碳氫雙鍵及2至8個碳 原子(如，C2、C3、C4、C5、C6、C4C8)、2至6個碳原子(如， c2、c3、c4、c5或C6)或2至4個碳原子(如，c2、c3或c4)。 此處”芳基”一詞指單環或多芳族環相互融合或連接而 10使至少一部分融合或連接環形成共軛芳族系統的碳環芳族 系統。芳基的實施例包括，但不侷限於苯基、萘基、聯苯 基、蒽基(anthryl)、四氫萘基 '菲基(phenanthryl)和氫茚 (indane) 〇 “芳基烷基”一詞指被芳基取代的烷基。若該連接可構 15成一穩定化學鍵時，該烧基可位於芳基上的任何位置。 此處芳烷基一詞指具有連接至烷基上任何碳原子之芳 基的烧基。 “羥烷基”、“羥烯基”、“羥芳基，，和“羥芳烷基，，一詞指若 該連接可構成一穩定化學鍵時具有連接至烷基、烯基、芳 2〇基或芳烷基任何碳原子之-OH基的所述烷基、稀基、芳基和 芳烷基。 “鹵素’’ 一詞指Cl、Br、F或I。 在一具體實施例中，FK506相關天然產品共軛物為具 有下式(V)構造的PEG-他克莫司： —................ 16 200812622
其中，η為從10至1，000的整數；以及X為0或S。
在另一具體實施例中，該FK506相關天然產品共軛物 為具有下式(VI)構造的PEG-環囊黴素：
其中，η為從10至1,000的整數；以及X為0或S。 因此，在一具體實施例中，提供一種製造式I之水溶性 共軛物的方法，請看方案1。 17 10 200812622 方案1
其中R1、R2、R3、R4為為如上所定義。 在另一具體實施例中，依照述於方案2中的兩階段步驟 5 製造以式(I)為代表的水溶性PEG-雷帕黴素綴合物。
18 10 200812622 方案2
^ in base
(B)
其中，X為S或O; Y為離去基例如鹵素;以及為氫或甲基。
從方案1和2中可看出，雷帕黴素綴合物為酯的型式， 其中該甲氧基聚乙二醇為經由在第42位置的酯鍵連接至雷 帕黴素。與本技術之方法相比較，此處所述之活化雷帕黴 素42-酯衍生物的合成可藉由具有下列通式之活化酯（Α)經 由雷帕黴素之脂解酶催化的醯化作用而完成：
Ο Re (A) 10 其中，R6為氫或-CH3 ;以及Y為一離去基。 19 200812622 離去基的實施例包括，但不侷限於齒素和石黃酸鹽如甲 石黃酸鹽(mesylate，MsO)及對甲苯石夤酸鹽(tosylate，TsO)。 在一具體實施例中，該離去基為鹵素如I、Br、或Cl。在另 一具體實施例中，該活化酯為2-鹵醋酸的乙烯酯（r6=h)。 5 在進一步的具體實施例中，該活化酯為溴醋酸的乙烯酯。 此處亦包括技術中所習知的2-鹵酷酸之其他活化酯，例如 異丙細S旨（R =CH3)、將醋、二氯乙基或三氣乙基g旨。 此處所述方法的一項優點為以接近量產的方式進行雷 帕黴素至醯化雷帕黴素(VII)的轉化作用。該醯化雷帕黴素 10 (VII)的產率大於95%、96%、97%、98%或99%。 可利用各種的脂解酶。在一具體實施例中，該脂解酶 為微生物脂解酶，即具有催化水解作用及形成酯鍵之源自 微生物的脂解酶。微生物性脂解酶包括例如南極念珠菌 (Candida antarctica)、皴落念珠菌（Candida rugosa)、米黑毛 15 锨囷（Mucor miehei)、洋蔥假單胞菌（pseud〇ni〇nas cepacia)、螢光假單胞菌（pseucjomonas f|uorescens)、德氏根 黴囷（Rhizopus delemar)和黑麴黴菌（Aspergillus niger)。然 而，用於此處的脂解酶不需從原始來源直接分離和純化而 是藉由合成或重組或經由其他適當的方法所製備。可從市 20面購得這些酵素，再者可使用許多供應商之未純化、部分 純化、純化或固定化酵素製備物的不同商品。 在一具體實施例中，其脂解酶為取自B型南極念珠菌。 南極念珠菌脂解酶可購自市面，例如商品名稱為N〇v〇 SP43™、Novozym 43ΤΜ(Ν_ l_2tm 20 200812622 (Roche分子生物化學及BioCatalytics)。在另一具體實施例 中，該脂解酶為取自洋蒽假單胞菌。洋蔥假單胞菌可購自 市面’例如商品名稱為脂解酶pS(Amano酵素公司）。該酵素 較佳為使用其固定化型。在一具體實施例中，該固定化脂 5 解酶為脂解酶PS-C“Amano，，IITM或脂解酶ps_c “八11^110’’’(八11^110酵素公司）。在另一具體實施例中，該固 定化脂解酶為脂解酶PS-D“Amano，，FM(Amano酵素公司）。 該脂解酶係使用其有效催化量，即可在合理速率下有 效催化醯化作用的數量。熟習本技術之人士將瞭解該酵素 10的使用量為約20至約800重量％(相對於雷帕黴素戈 FK506/FK520的用量）。在一具體實施例中，該酵素的使用 量為約25至約500重量％。在另一具體實施例中，該酵素的 使用量為約50至約250重量％。在進一步的具體實施例中， 該酵素的使用量為約75至約150重量％。 15 一般為在有機溶劑内進行該反應。適合的有機溶劑包 括，但不侷限於曱苯、第三丁基甲醚(TBME)、乙醚、四氫 呋喃（THF)、乙腈（MeCN)、二氣甲烷（CH2Cl2)、氯仿 (chci3)、二異丙基醚(iPr2〇)、己烷、二噚烷(di〇xane)，或 上述/合劑的混合物。在一具體實施例中，其使用TBME。熟 20習本技術者將瞭解該溶劑的用量在開始時可有效溶解全部 或部分的起始雷帕黴素並且可在合理速率下進行該反應。 例如，溶劑如TBME的用量為至少約4重量體積（即，超過雷 帕徽素用量4倍(4X)的體積）至約1〇重量體積。在一實施例 中，該溶劑的用量為約5至8重量體積（即，超過雷帕黴素用 21 200812622 量5至8倍的體積）。 TBME可能含有可分解雷帕黴素化合物的殘餘水（例 如約0·05%)。為了減少旁枝反應，在反應中維持低量的 水分。在一具體實施例中，其使用脂解酶催化劑之標準商 5用製備物的無水ΤΒΜΕ。在另一具體實施例中，藉由加入乾 爍劑調節脂解酶溶液内的含水量而控制其水分。在又另一 具體實施例中，使用分子篩控制其水分。由於分子篩將減 缓其反應，因此必需加入更多的酵素以作為補償或利用較 長的反應時間。在一具體實施例中，使用5埃(人)的分子篩。 10然而，亦可使用其他大小的分子篩包括，但不侷限於4埃和 3埃。可從各種的市售來源取得適合的分子篩。在又另一具體 實施例中，可利用乾燥劑如MgS〇4、Na2S04控制其含水量。 在合理反應時間下足以減少無用副產物之形成的低溫 下進行該化反應。在一具體實施例中，在約2〇至約55。〇 15下進行該醯化反應。在另一具體實施例中，在約25至50。(： 下進行孩化反應。在進一步的具體實施例中，在約35至 45°C下進行該醯化反應。 在一具體實施例中，藉由在無水TBME内混合雷帕黴 素、>臭化醋酸乙烯酯和脂解_pS-C ‘‘Aman〇” IITM(丨〇〇%重量 20 /重量的雷帕黴素）進行該醯化反應。在40°C的氮氣下將該混 合物加熱約8小時或在薄膜層析法(TLC)或HPLC法的監控 下直至雷帕黴素的起始材料消失為止。在藉由過濾法移除 酵素之後’可獲得接近量產的雷帕黴素42-溴化醋酸酯。 一旦形成_鍵之後，下一步驟包括將PEG分子連接至 22 200812622 該活化雷帕黴素醋酸酯(VII)。非親核性鹼的存在下在有機 溶劑内藉由（VII)與具有通式HX-(CH2CH20)n-CH3(B)之甲 氧基聚乙烯衍生物的反應而完成聚乙二醇化作用，其中χ 和η為如上所定義。 5 此處“非親核性鹼”一詞指具有非親核性鹼之功能的化 合物。該非親核性鹼較佳為不與乙二醇化作用的其他化合 物和試劑相反應。許多非親核性鹼已為熟習本技術者所習 知。請看，例如RichardC.Larock於“综合有機轉化大全，，第 二版’ 1999。在-具體實施例中，該非親核性驗為三級胺。 10在-實施例中，該三級胺為一脂族胺。在另一實施例中， 該三級胺為-芳族胺。在進_步實施例中，該三級胺為三 烧基胺如三乙胺或二異丙基乙胺。 用於聚乙二醇化作用内的適合溶劑包括，但不偈限於 THF、MeCN、CH2Ci2、CHci3、二辦、二甲基曱醯胺(dmf) 15或上述溶劑的混合物。在—具體實施例中，使用Μ·作為 溶劑。 可利用者所習知的方法分離peg_雷帕徽 素綴合物，其包括沈殿、萃取、過濾等方法。 因此，在一具體實施例中，塑乙腈内以二異丙基乙胺 2〇處理雷帕黴素42-漠化醋酸略和mPEG硫醇（分子量〜麵)一 段預定的時間。依此，藉由將異丙醇加入反應混合物在簡 單的沈澱之後可獲得鱗的所欲咖，罐钱合物⑴。 在另〃體貝施例中’依照述於方案3中的兩階段步驟 製造以式(II)為代表的水溶性PEG_依維莫司⑷_〇㈣基) 23 200812622 乙基雷帕黴素，RAD001)綴合物。依照PEG-雷帕黴素綴合 物(I)的類似方法可製造PEG-依維莫司綴合物(II)。簡言之， 該反應係經由中間物(VIII)而進行，其獲得自與式(A)之醯 - 化劑的脂解酶-催化醯化作用而獲得。然後在上述有機溶劑 5 内之非親核性鹼的存在下與式(B)的甲氧基聚乙烯衍生物 相反應。在一實施例中，該非親核性鹼為三烷基胺。在另 一實施例中，該有機溶劑為乙腈。因而可在不需進一步純 化下製備出極佳產量和高純度的化合物II。 方案3
在另一具體實施例中，提供一種經由類似的兩步驟法 製造以式(III)、（IV)為代表之水溶性PEG-CCI-779綴合物或 其組合的方法。請看，方案4。如方案3所述，在CCI-779分 24 200812622 子第42位置之_側鏈内的其一或兩者-OH基可被脂解酶催 化之式(A)酸化劑所醯化。單醯化產物(Ιχ)和雙醯化產物(χ) 的比例可藉由調節脂解酶之數量 '乙浠11(A)之數量、反應 時間和溫度而改變。再者，利用層析法可從混合物分別分 5離出式(ΙΧ)和(χ)的化合物。然後分別利用式(IX)和(X)製備 相對應的PEG-CCI_779綴合物(III)和(IV)。或者，可將化合 物(IX)和(X)維持在混合物的狀態，而利用該混合物製造對 應的 PEG-CCI-779綴合物（III)和（iv)。 在上述有機溶劑内非親核性鹼的存在下可藉由化合物 10 (IX)和(X)與式(B)之曱氧基聚乙烯衍生物的反應製造咖 綴合物(m)和(IV)。在-實施例中，該非親核性驗為三炫基 胺。在另-實施例中，該有機溶劑為乙猜。依此，可在不 需進-步純化下分別製備出極佳產量和高純度的 (III)和(IV) 〇 15
25 20 200812622 方案4
在又另一具體實施例中，提供一種分開製造以式(v) 和(VI)為代表之水溶性PEG_他克莫司和PEG_環囊黴素綴合 5物的方法。如方案5中所述，在脂解酶的存在下藉由與式(A) 之醯化劑的醯化他克莫司（FK506)或環囊黴素(FK52〇)可獲 得具有區域特異性且極佳產量之各自的32_酯化中間物 (XI)。接著在上述非親核性鹼存在下的有機溶劑内以式(B) 之甲氧基聚乙稀衍生物處理(XI)可分別獲得極佳產量和高 10純度的式(V)之PEG-他克莫司綴合物或式(VI)之PEG_環囊 徽素綴合物。在-實施例中，該非親核性驗為三烧基胺。 在另一實施例中，該有機溶劑為乙腈。 26 200812622 方案5
此處所述的方法與美國專利案5,955,457 、6,331，547、 5,780,462和6,432,973和國際專利公開案w〇99/〇386〇中公 5開的合成法比較具有許多明顯的優點。這些優點包括在不 需純化步驟下而簡化製程以及具有較高的整體產量。此可 藉由利用脂解酶作為催化劑並且在區域特異性下引入酯鍵 而完成。此較高的產量亦歸功於其後的共軛反應中使用有 機驗如三烧基胺代替無機驗如碳酸氫鈉，其可分解起始材 10 料和產物。例如，述於美國專利案5,955,457的合成途徑在 兩次HPLC純化之後僅產生低於50%產量的42-聚乙二醇化 27 200812622 雷帕黴素，同時此處所述的 近量產的產物。 方法則可在不需純化下具有接 較佳實施例之詳細說明 下列貝^例僅作為說明而非擬作為本發明的限制。 貝％例1 -纟二由雷帕黴素42-溴化醋酸酯（νπ)製造pEG_雷帕 黴素綴合物(I)
A·製造雷帕黴素42-溴化醋酸酯(VII) 10 將無水第三丁基甲基醚(TBME)(8毫升）内的雷帕黴素 (914毫克，1毫莫耳）、溴化醋酸乙烯酯（660毫克，4毫莫耳）、 5埃分子篩（100毫克）和Novozym 435TM脂解酶（1力克）的作匕 合物在40°C的氮氣下加熱8小時。藉由過濾移除酵素’然後 以TBME清洗。濃縮該混合物然後在己烷内沈澱。藉由過濾、 15 收集雷帕黴素42-溴化醋酸酯（VII)然後在真空内乾燥°產 量：L01 克(98%)。 MS(ESI)m/e 1035(Μ·) Β·製造PEG-雷帕黴素綴合物⑴
將二異丙基乙胺（Π毫克）加入MeCN(1.5毫升）内的 20 mPEGSH(500毫克，分子量=5,000)溶液，接著加入雷帕M 28 200812622 素42-溴化醋酸酯(vil)(95毫克）。然後在室溫下將該混合物 攪拌3小時。加入2-丙醇（18毫升）然後將該混合物冷卻至 〜15°C並維持30分鐘。藉由過濾收集沈澱之聚乙二醇化雷 帕黴素，然後在真空内乾燥。產量：550毫克(95%)。 巾 NMR(400MHz，CDC13) : (5 2.84(t，2H，S-CH2-CH2)， 3·27 (s5 2H，CO;CH2-S)，3.36(s，3H，-〇CH3)，4.69(m，1H, Η·42) ; MS(MALDI/TOF)m/z 5877.47(平均分子量） 實施例2-經由依維莫司42-溴化醋酸酯(VIII)製造PEG-依維 莫司綴合物(II)
A·製造依維莫司42-溴化醋酸酯(VIII)
將無水第三丁基甲基醚(TBME)(3毫升）内的依維莫司 (250毫克，0.26毫莫耳）、溴化醋酸乙烯酯（165毫克，1毫莫 耳）、5埃分子篩（20毫克)和Novozym 435TM脂解酶(200毫克) 15 的混合物在35°C的氮氣下加熱10小時。藉由過濾移除酵 素，然後以TBME清洗。濃縮該混合物然後以己烷研磨。藉 由過濾收集依維莫司42-溴化醋酸酯(VIII)然後在真空内乾 燥。產量·· 275毫克(96%)。 MS(ESI)m/el078(M') 2〇 B ·製造PEG-依維莫司綴合物(II) 29 200812622 將二異丙基乙胺（18毫克）加入MeCN(1.5毫升)内的 mPEGSH(500毫克，分子量=5,000)溶液，接著加入依維莫 司42-溴化醋酸酯(VII)( 110毫克）。然後在室溫下將該混合物 攪拌3小時。在10分鐘内加入2-丙醇（18毫升）然後將該混合 5 物冷卻至10〜15°C並維持30分鐘。藉由過濾收集白色粉末， 然後在真空内乾燥。產量·· 530毫克(87%)。 實施例3-製造CCI-779單溴化醋酸酯（IX)和CCI-779雙溴化 醋酸酯（X)
779(7.0克，6.8毫莫耳）、溴化醋酸乙烯酯(4.0克，24.24毫莫 耳）、5埃分子篩（2.0克)和Novozym 435TM脂解酶（1.3克)的混 合物在室溫的氮氣下攪拌8小時。HPLC顯示該反應混合物 含有64%的單溴化醋酸酯、20%的雙溴化醋酸酯和12%的 15 CCI_779起始材料。藉由過濾移除酵素，然後以TBME清洗。 濃縮該混合物然後藉由矽膠層析法純化。收集較低極性分 率的雙溴化醋酸酯(Χ)(1·41 克）。MS(ESI)m/e 1317(Μ+45：Γ。 較高極性分率中含有單溴化醋酸酯(ΙΧ)(4.56克），其被分離 成白色粉末。MS(ESI)m/e 1196(Μ+45)-。 30 200812622 實施例4-製造PEG-CCI-779綴合物(III)
如實施3的製造方法將二異丙基乙胺(722毫克，5·6毫莫 耳)加入MeCN(45毫升）内的mPEGSH(20.0克，分子量=5,〇〇〇) 5 溶液，接著加入CCI-779單溴化醋酸酯（ΙΧ)(4·60克，4毫莫 耳）。然後在室溫下將該混合物攪拌4小時。在10分鐘内加 入2-丙醇(540毫升)然後將該混合物冷卻至10〜15°C並維持 30分鐘。藉由過濾收集PEG-CCI-779綴合物(III)的白色粉 末，然後在真空内乾燥。產量：20.3克(83%)。 10 實施例5-製造PEG-CCI-779綴合物(IV)
如實施3的製造方法將二異丙基乙胺（1〇1毫克，0.78毫 莫耳)加入MeCN(9毫升）内的mPEGSH(3.0克，分子量=5,000) 溶液，接著加入CCI-779雙溴化醋酸酯（X)(414毫克，0.32 15 毫莫耳）。然後在室溫下將該混合物攪拌4小時。在10分鐘 内加入2-丙醇（108毫升）然後將該混合物冷卻至1〇〜15°C並 31 200812622 維持30分鐘。收集PEG-CCI-779綴合物(IV)的白色粉末，然 後在真空内乾燥。產量：3·25克(96%)。
實施例6-經由他克莫司32-溴化醋酸酯（XI)製造PEG-他克莫
A.製造他克莫司32-溴化醋酸酯(XI)
將無水第三丁基甲基醚(ΤΒΜΕ)(0·2毫升）内的他克莫 司（10¾克）、溴化醋酸乙稀酉1(20毫克）和Novozym 435頂脂 解酶(20毫克）的混合物在40°C的氮氣下加熱12小時。藉由過 10濾移除酵素，然後以TBME清洗。使其濾過物通過矽膠墊然 後以己烷-丙酮(3 : 1)清洗。收集他克莫司32-溴化醋酸酯， 然後在真空内乾燥。產量：10.5毫克(91%)。 MS(ESI)m/e924(M') Β·製造PEG-他克莫司綴合物(V) 15 將二異丙基乙胺（1毫克）加入MeCN(0.1毫升）内的 mPEGSH(25毫克，分子量=5,000)溶液，接著加入他克莫司 32-溴化醋酸酯（5毫克）。然後在室溫下將該混合物攪拌3小 時。加入2-丙醇（1·5毫升）然後將該混合物冷卻至忉〜丨穴並 維持3 0分鐘。藉由過濾收集經沈澱peg-他克莫司綴合物(ν) 20的白色粉末’然後在真空内乾燥。產量：24毫克(80%)。 32 200812622 將此專利說明書内的全部公開資料併入於此以供參 照。本發明雖然已參考特定具體實施例作為說明，但是應 瞭解其改良物並未偏離本發明的精神。此類改良物仍屬於 本發明申請專利範圍附件的範圍内。 5 【囷式簡單說明】 (無） 【主要元件符號說明】 (無) 33

Claims (1)

  1. 200812622 十、申請專利範圍： <聚:乙二醇綴合物的 —種用於製造免疫抑制巨環内酯 方法，其包括： ⑷在脂解_存在下使贱_具有料酸衍生 %己基區域的免疫抑制巨環㈣反應而形成醯化巨環 内酯； ⑼在驗的存在下使祕化巨環_旨與曱氧基聚⑺ -醇)衍生物或硫醇末端聚(乙二醇)衍生物相反庫。 •如申請專利第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 ^為雷帕«(rapamyein)，該雷_素 域特異性地醯化。 .t申請專利範圍第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 s曰具有如下的構造：
    R為選自由氫和烧基、烯基1基和枝基所構成 之群組； V為選自由氫、祕和·〇戈基所構成之群組； R3為選自由氫、烷基、烯基、芳基、芳烷基和 所構成之群組； 34 200812622 R31為選自由氫 '烧基、烯基、芳基和芳燒基所構 成之群組； R4為選自由氫、祕彳ϋ基所構成之群組； R5為選自由氫、羥烷基、羥烯基、羥芳基、羥芳烷 基和-CXCOR51所構成之群組；以及 R51為選自由經烧基、輯基、經芳基和經芳烧基 所構成之群組。 4.如申請專利範圍第2項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯具有如下的構造··
    其中： R為選自由氫和烧基、稀基、芳基和芳燒基所構成 之群組； R2為選自由氫、羥基和烷基所構成之群組； 汉為選自由氣、烧基、稀基、芳基、芳烧基和-C(0)R31 所構成之群組； R為選自由氫、烧基、浠基、芳基和芳燒基所構 成之群纟且； R為選自由氫、羥基和烷基所構成之群組； R為選自由氫、羥烷基、羥稀基、羥芳基、羥芳烷 35 200812622 基和-C(0)R51所構成之群組；以及 R51為選自由羥烷基、羥烯基、羥芳基和羥芳烷基 所構成之群組。 5.如申請專利範圍第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 5 酯為42-0-(2-羥基）乙基雷帕黴素。 6·如申請專利範圍第2項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯為42-0-(2-羥基）乙基雷帕黴素。 7.如申請專利範圍第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯為 CCI-779。 10 8.如申請專利範圍第2項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯為 CCI-779。 9·如申請專利範圍第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酉旨為選自由他克莫司（tacrolimus)和環囊黴素(ascomycin) 所構成之群組，該他克莫司和該環囊黴素在第32位置被 15 區域特異性地醯化。 10.如申請專利範圍第1項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯具有如下的構造：
    其中： 36 200812622 R7、R8和R9為獨立之氫或烷基；以及 R為乙基或烯丙基。 1L如申請專利範圍第9項之方法，其中該免疫抑制巨環内 酯具有如下的構造：
    其中： R7、R8和R9為獨立之氫或烷基；以及 R為乙基或烯丙基。 12.—種製造選自由式I、式II、式III、式IV、式V和式VI所 10 構成之聚乙二醇化免疫抑制巨環内酯的方法：
    其中： 37 200812622 η為從10至1，000的整數； X為Ο或S ; 其中該方法包括： (a)在脂解酶的存在下使巨環内酯與醯化劑反應而 形成醯化巨環内酯，其中該醯化劑具有如下之構造：
    〇 Re (A)
    10 鲁 15 其中： R6為氫或CH3 ; Y為一離去基；以及 (b)在鹼的存在下使醯化巨環内酯與甲氧基聚（乙二 醇)衍生物反應，其中該甲氧基聚（乙二醇)衍生物具有如 下的構造： HX-(CH2CH20)n-CH3 其中： η為從10至1，000的整數；以及 X為Ο或S。 13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該脂 解酶為取自微生物包括黑麴黴菌、南極念珠菌、皺落念 珠菌、米黑毛黴菌、洋蔥假單胞菌、螢光假單胞菌或德 氏根黴菌的微生物性脂解酶。 14. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該脂 解酶為源自南極念珠菌。 38 200812622 15·如中請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該脂 $酶為固定化B型南極念珠菌（較佳為在丙烯酸樹脂上 被固定化）。 * 16·如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該脂 • 5 解酶為源自洋蔥假單胞菌的脂解酶PS。 17·如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該脂 解酶為源自洋蔥假單胞菌的固定化脂解酶PS-C，該酵素 _ 在石夕编土或在陶瓷載體上被固定化，例如Amano π™脂 解酶或脂解酶PS-D Amano ΙΤΜ酯解酶。 0 I8·如申睛專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中步驟 (a)係在選自由曱苯、第三丁基甲鱗、乙醚、四氫。夫喃、 乙腈、二氣甲烷、氯仿、己烷、二噚烷及其混合物所構 成之群組的有機溶劑内進行。 19·如申請專利範圍第丨至12項中任一項之方法，其中步驟 、15 (a)係在20至7〇。〇下進行。 摹 2〇·如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中步驟 (a)進一步包括利用分子篩。 21·如申請專利範圍第20項之方法，其中步驟(a)係在4〇它的 弟丁基甲喊内進行，遠si化劑為漠化醋酸乙烯g旨，該 2〇 脂解酶為固定化南極念珠菌B型脂解酶（較佳為在丙烯 酸樹脂上被固定化），以及該分子篩為5埃分子篩。 22·如申请專利範圍第12項之方法，其中Y為I、Br或C1。 23.如申凊專利範圍第κ12項中任一項之方法，其中該驢 化劑為漠化醋酸乙烯酿。 39 200812622 24·如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中步驟 (b)内之鹼為三級胺。 25.如申請專利範圍第24項之方法，其中該三級胺為脂族或 芳香族胺。 5 26.如申請專利範圍第24項之方法，其中該三級胺為三烷基胺。 27.如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該鹼 為二異丙基乙胺。 28·如申請專利範圍第12項之方法，其中該甲氧基聚（乙二 醇)衍生物為甲氧基聚（乙二醇)硫醇化合物。 10 29.如申請專利範圍第28項之方法，其中該甲氧基聚（乙二 醇)硫醇具有400至30,000的平均分子量。 30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該甲氧基聚（乙二 醇)硫醇具有5,000的平均分子量。 31. —種製造下列構造之聚乙二醇化雷帕黴素的方法：
    其中： η為105〜115 ; 其中該方法包括： (a)在固定化南極念珠菌Β型脂解酶(較佳為在丙稀 20 酸樹脂上被固定化）的存在下使雷帕黴素與溴化醋酸乙 40 200812622 烯酯反應而形成醯化雷帕黴素；以及 (b)在二異丙基乙胺的存在下使醯化雷帕黴素與具 有5,000平均分子量的甲氧基聚（乙二醇)硫醇反應。 32. —種製造下列構造之聚乙二醇化依維莫司（pegylated everolimus)的方法：
    其中，η為105〜115 ;以及該方法包括： (a)在固定化南極念珠菌Β型脂解酶(較佳為在丙烯 酸樹脂上被固定化）的存在下使依維莫司與溴化醋酸乙 10 烯酯反應而形成醯化依維莫司；以及
    (b)在二異丙基乙胺的存在下使醯化依維莫司與具 有5,000平均分子量的曱氧基聚（乙二醇)硫醇反應。 33. —種製造下列構造之聚乙二醇化CCI-779的方法： 0
    15 或 41
    其中，η為105〜115 ;以及該方法包括： (a) 在固定化南極念珠菌Β型脂解酶(較佳為在丙稀 酸樹脂上被固定化）的存在下使CCI-779與溴化醋酸乙 烯酯反應而形成單醯化或雙醯化CCI-779;以及 (b) 在二異丙基乙胺的存在下使醯化CCI-779與具有 5,000平均分子量的甲氧基聚（乙二醇)硫醇反應。 34.—種製造下列構造之聚乙二醇化他克莫司的方法：
    其中，η為105〜115 ;以及該方法包括： (a)在固定化南極念珠菌Β型脂解酶(較佳為在丙稀 酸樹脂上被固定化）的存在下使他克莫司與溴化醋酸乙 烯酯反應而形成醯化他克莫司；以及 (b)在二異丙基乙胺的存在下使醯化他克莫司與具 200812622 有5,000平均分子量的曱氧基聚（乙二醇)硫醇反應。 35.—種製造下列構造之聚乙二醇化他克莫司的方法： %
    其中，η為從105〜115的整數；以及該方法包括： (a) 在固定化南極念珠菌Β型脂解酶(較佳為在丙烯 酸樹脂上被固定化)的存在下使他克莫司與溴化醋酸乙 烯酯反應而形成醯化他克莫司；以及 (b) 在二異丙基乙胺的存在下使醯化他克莫司與具 有5,000平均分子量的曱氧基聚（乙二醇)硫醇反應。
    36. —種藉由申請專利範圍第1至35項中任一項之方法所製 造的產品。 43 200812622 七、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：
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