TW200538109A - Furosemide modulators of HM74 - Google Patents

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200538109 九、發明說明： 【先前技術】 本發明之背景 [0001] G蛋白偶聯受體(GPCRS)是涉及細胞信號傳遞的整合 5 性膜蛋白。GPCRs應答各種各樣的細胞外信號，包括神 經傳遞質、激素、增味劑和光亮，並能夠傳遞信號而在細 胞内引起第二信使應答。許多治療藥物均以GPCRs為目 標，因為這些受體介導各種各樣的生理應答，包括發炎、· _ •血管舒張、心率、支氣管擴張，内分泌和蠕動。 10 [0002] 許多疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD)、牛 皮癬以及類風濕性關節炎（RA)，通常被認為具有涉及τ 輔助細胞、單核細胞巨噬細胞和嗜曙紅細胞的發炎性病 因。目前所用的皮質類固醇抗炎症療法在治療哮喘方面是 有效的’但也與新陳代謝和内分泌方面的副作用有關。對 15 於通過肺或鼻黏膜吸收的吸入型製劑，情況很可能也是如 此。目前尚缺乏令人滿意的治療RA或COPD的口服療法。 Φ [〇〇〇3] 人類單核細胞的HM74分子選殖預示HM74將是一種 趨化因子受體（Nomura等，Int Im腿n〇1 (1993) 5(10):1239-1249)。HM74主要表現在骨髓、脾臟、扁桃腺 2〇 和氣管中。HM74的配體尚未知。 [〇〇〇4] 人體細胞含有一種相關的但又是獨特的受體 HM74A。HM74和HM74A的胺基酸序列約95%是同源 的。但疋’ HM74A已被脫孤而HM74卻沒有。煙酸或尼 克酸是 HM74A 的配體（WiSe et al , j Bi〇1 chem 200538109 278:9869-9874, 2003)。煙酸是HM74的一種較差的激活 劑0 [〇〇〇5] 鼠類基因組含有HM74A基因，但不含HM74基因。 [〇〇〇6] 在某些情況之下，HM74和HM74A顯示了共調節作 5 用。本發明申請人採用了 Taqman-PCR並發現，HM74和 HM74A的表現在中性粒細胞内被TNFa誘導而上調了 50 倍，在單核細胞内被LPS或TNFa誘導而上調了 1〇至20 倍。HM74的表現在正常的人類支氣管上皮細胞内也被 • th2細胞因子、IL-4或IL-13誘導而上調了 45倍，而已 10 知Τη2細胞因子、IL-4或IL-13在哮喘的病因中是重要的 因素。ΗΜ74和ΗΜ74Α的表現在人類主要嗜曙紅細胞内 被IL-5上調。最後，在一種鼠科實驗性哮喘模型中，肺 的ΗΜ74Α表現也被上調。 [〇〇〇7] ΗΜ74和ΗΜ74Α在體内組織中有限的分佈及調節， 15 提示了 ΗΜ74和ΗΜ74Α在發炎過程例如哮喘、和 COPD中的作用。 鲁[〇〇〇8] 鑒於GPCRs在病理中所起的作用和通過調節gpcRs 的活性來治療疾病的能力，GPCR配體的發現和鑒定促進 了可用於治療GPCR活性相關疾病的新型組合藥物和方 20 法的發展。本發明發現和鑒定了涉及HM74的分子，並提 供了將此發現用於有關疾病鑒定和治療的組合藥物和方 法。 【發明内容】 本發明之概述 200538109 [0009] 本發明關於可激活HM74但不激活HM74A的分子。 [00010] 該分子具有以下的結構：

® [oooii] 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的（^-(1；18鍵浠基；可含有支鍵、雜原子或取代基、或 其組合的炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代 基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、雜原 子或取代基、或其組合的（：5<18環烷基；或其組合； ίο [00012] Q 和 X 分別是 Ο、S 或 NR ; [00013] Y是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的CrC18 • 烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的crc18 鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的cKc18 炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的 15 。3-。18芳基·，或可含有側基、橋基、雜原子或取代基 '或 其組合的05<18環烷基；或其組合，其中X和Y當X是 N時可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是可含有 支鏈和側基的C3-C18雜環、可含有支鏈和側基的C3-C18 雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的〇3<18環烷基， 200538109 或可含有支鏈和側基或c3_c18芳基；以及 [00014] 每個 Z 是 R。 [〇〇〇15] 在本發明的另一方面，彼露了鑒定HM74調節劑的一 些方法。例如，其中一種方法包括以下步驟：提供一種化 5 學基團，提供表現HM74的細胞以及確定該化學基團是否 調節HM74的信號活性，包括這種調節是否是在本發明之 致效劑存在或不存在的情況下發生。在一個相關的方面， 該化學基團可包括但不限於，肽類、抗體、致效劑、反致 放A j和t抗劑。作為一種選擇，一種已知的調節劑可用於 10 競爭性分析以鑒定其他調節劑。 [〇〇〇16]所研究的驗取代的氨茴酸或利尿續胺可激活 ΗΜ74。那些化合物在表現ΗΜ74的細胞内，例如CH〇細 胞、293細胞和L1.2細胞等人體細胞内，可引起選擇性的 對劑量反應的妈移動。未被HM74編碼序列轉化的對照細 15 胞則未顯示這種鈣反應現象。所研究的化合物還在一酵= 報導基因分析中激活HM74並在被感染的L丨·2細胞内引 # 起趨化現象。 [〇〇〇17]所研究的化合物通常是致效劑。因此，所研究的化合 物可作為候選藥物來研究。所研究的化合物還可用於鑒^ 20 激活、結合和/或調節ΗΜ74的其他分子，例如，用於競 爭性分析。 [_8]树明的另—方面包括治療組合物，這類組合物包括 核酸、抗體、多肽、致效劑、反致效劑和拮抗劑。此外， 200538109 本發明之方法還包括通過給需要治療的患者施用、二《、二 療組合物從而治療疾病和調節ΗΜ74信號活性的這颏/σ [00019] 透過參考本發明之詳細說明和附圖，本發明方， 面和其他方面將變得顯而易見。此外，本文Φ之廷些方 , u Τ Μ出了与1容 進一步詳述某些步驟或組合藥物的參考文獻。每〜Μ 文獻都以參考方式完整併於本文中，如同每麄去篇多考 引述在於本文。 本發明之詳細說明 [00020] [00021] 本發明係基於可激活ΗΜ74的分子的發現。 汶ΗΜ74編碼序列是已知的（N〇mUm等， 本發明提供了獲得、製備和使用HM74的方法。0上文）。 的已知功能活性不受到有害的影響，HM f腹74 基酸的變化是可接受的。 馬馬序列和胺 15 [〇〇〇22]錄合物調節活性且是HM74的致 是治療以炎症為特徵的疾病例如哮喘的候選藥物: [00023]統合物還可用於篩選HM74的拮抗劑。例如，讓表 見HM74的細胞接觸一種試驗化合物，然後再接觸本發明 =致放d然後，測定試驗化合物是否降低本發明之致效 :所誘‘的_移動程度，就可確認 鈣移動的影響。 [〇〇〇24^ ，疋例如致效劑和反致效劑的其他這類分析，也被認 為是屬於本發明的範圍之内。 [_5] *宜的_化合物包括氨石黃醢氨菌酸，例如，具有以 20 200538109 下結構的那些化合物：

R

NZ2 ^ [00026] 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 5 組合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的<^-€：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的（^-018炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代 基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、雜原 子或取代基、或其組合的€5-0：18環烷基；或其組合； ίο [00027] Q 和 X 分別是 Ο、S 或 NR ; [00028] Y是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的Crc18 烧基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的CrQs ® 鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的crc18 炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的 15 c3-c18芳基；或可含有侧基、橋基、雜原子或取代基、或 其組合的05<18環烷基；或其組合，其中X和Y當X是 N時可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是可含有 支鍵和側基的C3-C18雜環、可含有支鍵和侧基的C3-C18 雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的（：3<18環烷基， 或可含有支鍵和侧基或C3-C18芳基，以及 20 200538109 [00029] 每個 Z 是 R。 [00030] 在本發明的另一方面，披露了鑑定HM74調節劑的一 些方法。例如，其中一種方法包括以下步驟：提供一種化 學基團，提供表現HM74的細胞以及測定該化學基團是否 5 調節HM74的信號活性，包括這種調節是否是在本發明之 致效劑存在或不存在的情況下發生。在一個相關的方面， 該化學基團可包括但不限於，肽類、抗體、致效劑、反致 效劑和拮抗劑。作為一種選擇，一種已知的調節劑可用於 籲 競爭性分析以鑑定其他調節劑。 10 [00031] 術語“烷基”意思是直鏈或支鏈的烴基。其典型的例子 為曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、 仲丁基、戊基和己基。該烴可含有一個或一個以上不飽和 雙鍵或三鍵，例如烯烴和炔烴。 [00032] 術語“烷氧基”意思是與氧原子結合的烷基。其例子為 15 曱氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。 [00033] “芳基”是芳香烴的環。其例子包括苯基和萘基。 φ [00034] “雜原子”通常是與分子内典型原子不同的原子。因 此，烴内任何非碳或非氫原子均是雜原子。常見的生物上 可接受的雜原子包括氧、硫和氮。 20 [00035] 術語“雜芳基”指的是其一個或一個以上瑞原子被雜 原子取代的芳基。其例子為吼咬基、味唾基、σ比嘻基、嗟 吩基、吱喃基、吼喃基、ϋ密唆基、噠嗪基、吲哚基、啥琳 基、二氮雜萘基和異噁唑基。 [00036] 術語“環烷基”指的是環烴。其例子為環丙基、環丁 -11 - 200538109 基、環戍基和環己基。 [00037] “雜環基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子取代 的環烧基。其例子為σ比咯烧基、狐咬基和17瓜嗪基。 [00038] 術語“雜烷基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子 5 取代的烷基。醚是一種雜烷基。 [00039] 術語“取代的”意思是含有一個或一個以上取代基的 基本有機基團。因此，一個原子或基團可取代分子内另一 個原子或基團。典型的取代基包括鹵素、C「C8烷基、-CN、 ® -N〇2、烧氧基、經基、硫化物、硫酸鹽、績胺、胺和醯胺。 10 [00040] “支鏈的’’意思是在一個或一個以上位點含有一個或 一個以上支鏈的結構。支鏈可以是如上所定義的R基或側 基。 [00041] 術語“環”意思是一個、幾個環狀結構中的一個，或幾 個環狀結構，這幾個環狀結構中的兩個或兩個以上的環可 15 以稠合，其中一個或一個以上的環可以是芳香環，可含有 雜原子，可含有取代基或是其組合。該環可以是雙環或多 • 環。該環可含有長度不等的橋基。 [00042] “鹵素”的例子為氯、氟或溴。 [00043] 術語“側基”意思是與另一結構連接的原子或分子。因 20 此，側基可以是以上所定義的R基、烧基、鏈稀基、芳基， 環烷基等等。 [00044] 術語“橋基”指的是兩個結構之間的一個連接基。例如 可能含有雜原子、取代基、支鏈或其組合的非環烴，如烧 基、鏈烯基等等，可連接兩個環烴，例如芳基或環烷基。 -12- 200538109 橋基還可位於某環狀結構的内部，連接該環狀結構的至少 兩個原子。分子内橋基可含有〇、1、2、3、4個或更多的 原子。分子内橋基可以是直鏈的、可含有支鏈或取代基。 [00〇45] 所研究的特定化合物具有以下特點：1)當R是氳且 5 Q疋氧或硫時’則w不是氳，或者一個或兩個z基不是 氫；2)當兩個Z基、W和R是氫且Q是氧時，則X和 Y被結合在一環狀結構内。 [00046] 所研究的化合物含有某些官能團，可以衍生為本技術 領域已知的前驅藥物，例如用於提高生物可利用性。因 10 此，本發明考慮到所研究的活性化合物的變體，它們在給 藥之後被代謝為生物活性的形式。這類生物活性藥物前體 又被稱為生物上可逆的載體、潛在的藥物、給藥系統或前 驅藥物。（“Bioreversible Carriers in Drug Design” E.B. Roche，ed·，Pergamon，NY, 1987; “Prodrugs as Novel Drug 15 Delivery Systems”，Higuchi & Stella, eds·，American

Chemical Society，DC，1975) 鲁[〇〇〇47]藥物的化學改造是針對藥效學的某些特定方面，例如 如何提高必須穿越油脂障礙的極性化合物的利用率，如何 穩定通常在體内易降解的化合物等等。 2〇 [00048] 製造前驅藥物的其他原因包括生物活性藥物的毒 性、缺乏特異性、不穩定性、在吸收部位即發生代謝、吸 收太快、患者的適應性，例如味道差或注射部位疼痛，醫 生接受程度差或配方問題。 [〇〇〇49] —種常見的改造是酯化，它並不限於羧基的衍生化。 200538109 製造這㈣生物例如胺、亞胺、含硫取代基以及醯胺的化 學理論是現成的。 _5〇]對於顏，可以添加各種各樣的取代基，包括不含支 5 鍵的、環狀的或含有支鏈的烴，可以被取代、可以含有- 個或-個以上的雙鍵或三鍵，可含有環狀結構，煙的主鍵 可含有-個或-個以上雜原子，例如氮、硫或氧等等。 _51] t考慮構建該酯的R基時，應該考慮的另一因素是酶 鲁 士刀的容易程度。因此’立體帶電和構象等因素對於生物可 1〇 彻性可以是決定性的因素。例如，-個含有支鏈的烧基 可能對醋酶活性位點的可及性造成立體位阻效應，從而降 低水解的速率。這種情況既可以是不大合乎希望的，即生 物可利用性被延遲了，也可以是合乎希望的，即生物可利 用性被延長了。 Μ [〇〇〇52]在其他一些情況下，希望提高一種藥物的水溶性。可 達到此目標的取代基之例子包括丁二酸鹽、硫酸鹽、半丁 —酸鹽、鱗酸鹽、氣基酸、醋酸鹽、胺等等。 _ [00〇53]醯胺、醯亞胺、碳酸鹽、乙内醯脲等化合物中的氮原 子可以被衍生化。適合於與氮反應的基團一般包括經甲基 或經烧基，還包括驢氧烧基以及醯基。 0 [00054ί 羰基也是衍生化的位點。衍生物的例子包括席夫驗、 喔星（oxines)、縮酮、縮醛、噁唑烷、噻唑烷和稀醇§旨。 [〇〇〇55] 雖然以上所討論的衍生物含有與藥物以共價鍵連接 的取代基，一個取代基也可以其他方式與該藥物連接，例 如，氫鍵、范德瓦力、靜電力、疏水作用等等。 200538109 [00056] 衍生化的另一手段是利用那些經由非酶催化的機制 從说驅樂物上脫除的取代基。其例子包括含有以下化合物 的前驅藥物：（2-氧-1，3-二氧戊環-4-基）曱酯，曼尼希鹼、 噁唑烷、催化分子内水解的含有鹼性側鏈的酯類，以及經 5 歷分子内親核的環消除反應的酯或醯胺。對於含有苯酚、 醇和胺的藥物’環化機制為可得的。[“Prodrug Design”（前 驅藥物設計）Testa & Mayer in “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”（製藥工藝百科全書），2nd ed· 鲁 ν· 3, Swarbrick & Boylan，eds·，Marcel Dekker，2002]。 10 [00057] 因此，本發明考慮了利用已知的合成方法，用所研究 的化合物來製備任何未來的藥物，以便獲取某些化合物， 它們一旦被輸入體内將發生反應或作用從而產生某種可 調節HM74活性的化合物。 [〇〇〇58] 本文中的術語“相當的胺基酸殘基”意思是當對兩個 15 或兩個以上的序列進行排列對比分析時，這些胺基酸在蛋 白序列内基本上佔據了同樣的位置。本發明的較佳的 • HM74多肽具有一個與野生型HM74的胺基酸序列足夠地 相同的胺基酸序列。“野生型，，的意思是存在於一限定群體 内最普遍的形式或等位基因，無論是在局部的或較大的範 20 圍内。本文中所用的術語“足夠地相同，，指的是第一個胺基 酸或核苷酸序列與第二個胺基酸或核苷酸序列排列對比 時’含有足夠數量或最少數量的相同或相當的（例如，帶 有類似的側鏈）胺基酸殘基或核苷酸，從而使得第一個胺 基酸或核苷酸序列和第二個胺基酸或核苷酸序列具有共 -15- 200538109 同的結構域和/或共同的功能活性。例如，含有共同結構 域的胺基酸或核苷酸序列，若與HM74的活性至少具有 96%的同源性，即在本文中被定義為足夠地相同。 [〇〇〇59] 如同本文中互換使用的，“HM74活性”、“HM74的生 5 物活性’’或‘ΉΜ74的功能活性，，指的是在體内或體外按照 標準技術所確定的由HM74蛋白、多肽或核酸分子施加在 HM74表現細胞上的活性。HM74活性可以是一種直接活 性’例如與另一個蛋白發生的關聯或作用於其上的酶活 籲 性；也可以是一種間接活性，例如，通過該HM74與另一 ίο 個蛋白之間的相互作用而介導的細胞信號活性。在一較佳 的具體實施例中，HM74活性至少包括以下一種或幾種活 性··（i)在HM74信號途徑上與蛋白發生相互作用的能 力；（ii)與HM74配體發生相互作用的能力；（⑴）當被激 活時修改寄主細胞的能力；（iv)與本發明的分子結合時即 I5 被激活的此力，以及（v)與細胞内的目標蛋白發生相互作 用的能力。

φ [00060] 本發明之一個方面係關於在HM74被激活時顯示應 答的細胞内表現HM74。如本文中所用，術語“核酸分子” 旨在包括DNA分子（例如cDNA或基因組DNA)和RNA 20 分子（例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物所產生的DNA 或RNA的類似物。此核酸分子可以是單股的或雙股的， 但較佳的是雙股DNA。 [00061] “分離出的”核酸分子是指從核酸天然資源的其他核 酸分子中分離出的一個核酸分子。較佳的是，一個“分離 200538109 出的，，核酸不含原本天然存在於衍生出該核酸的有機體的 基因組DNA内編瑪HM74的核酸側翼的核苷酸序列（即位 於核酸5’端和3’端的序列）。該分離出的HM74核酸分 子可能含有少於約 5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0·5 kb 5 或〇· 1 kb上述的核苷酸序列；在衍生出該核酸的細胞的基 因組DNA内，這些核苷酸序列原本天然地存在於該開放 讀框核酸分子的側翼。而且，一個“分離出的”核酸分子’ 例如cDNA分子，當以重組技術的方式產生時，可基本上 ® 不含其他細胞物質或培養基；或者，當以化學方式合成 10 時，可基本上不含化學前體或其他化學物質。 [00062] 本發明之核酸分子，例如，編碼HM74的核酸分子可 採用標準的分子生物學技術和序列分離出來（Nomura 等，同上文）。利用全部或部份的HM74序列，HM74核 酸分子可採用標準的雜交和選殖技術分離出來（例如，如 15 Sambrook et al·，eds·，“Molecular Cloning: A Laboratory

Manual，” 2nd ed·，Cold Spring Harbor Laboratory Press， • Cold Spring Harbor，NY，1989 —文中所述）。 [00063] 本發明之核酸分子可按照標準的PCR放大技術、利 用cDNA、mRNA或基因組DNA作為範本和適當的低聚 2〇 核苷酸引子而加以放大。如此放大的核酸可被選殖進適當 的載體並用DNA序列分析法鑑定。此外，與HM74核苦 酸序列對應的低聚核苷酸可通過標準的合成技術製備，例 如，使用自動化DNA合成儀。 [〇〇〇64] 而且，本發明的核酸分子可以只包括核酸序列中編碼 -17- 200538109 HM74的那些部份，你丨^ H，編碼細胞外結構域和/武 …構域的片段，當配體與其結合時它將產生次、、、田胞内 細胞内變化。較佳的是，這種可檢測的細胞内變則的 在-個正常的寄主細胞被激活時所觀察‘ [_]—個編碼‘mm的生物活性部份，，的 以下步驟來製備:分_4中可編碼具有上:通過 性的多肽的那-部份，表現H 74生物活 如’通過體外重組表現)以乃心贪λ被、、扁碼部份（例 性。 表見）以及评估·4被編碼部份的活 ，^树明還進-步包括這樣的—些核酸分子：它們由妒 土因:碼的間併性而不同於所披露的™74的核苦酸片 列，從而編碼與先前所披露的腹74蛋白基本上相同的 ΗΜ74蛋白。 15 [〇〇〇67]熟悉本技術者將會理解，導致HM74胺基酸序列變化 的DNA序列多態現象，可存在於一個群體（例如人群）内。 • 由於天然的等位基因變異，這種ΗΜ74編碼序列的基因多 態現象可存在於一個群體的某些成員中。等位基因是在某 一特定基因位點出現的一組基因中的一個基因。如本文中 20 所使用的，術語“基因，，和“重組基因，，指的是包含一編碼 ΗΜ74蛋白的開放讀框的核酸分子，較佳的是哺乳動物的 ΗΜ74蛋白。如本文中所使用，術語“等位基因變異體，，指 的是出現在ΗΜ74位點或該核苷酸序列編碼的多肽的核 普酸序列。等位基因也可通過對許多不同個體中的有關基 -18- 200538109 因進行測序而加以鑑定。通過使用雜交探針來鑑定 同個體的同-基因位點，就报容易達到這—目的。= 然等位基因變異的結果且不改變腹74功能活性這^ 核普酸的任何變異和所有變異，以及所引起的·74 = 酸的多態現象或突變’均包括在本發明之範圍之内。基 [圆]$些源自其他物種的HM74蛋白_74同源 核苦酸序料同於人的HM74核㈣相， ^： 同樣的活性，對這類HM74蛋白的核酸; 具有 包括在本發明的範圍之内。對靡 進仃、、為碼，也 本發明之HM74cDNA同源物的核酸分子，可根據i = 文所披露的人的HM74核酸的同源性，利用人的伽^ ^ 其一部份作為雜化探針，並按照標準的雜 或 雜化條件下予以分離。 "技何在厫格的 [_69]如本文中所使㈣，術語“在嚴格條件下， 15 述這樣一些雜交和洗滌條件，在這些條 1枱 常保持雜交的狀態。這樣的嚴格條件是熟習丄技^者= 知的，而且可在文獻中查到，例如，Currem ρΓ〇ί〇^ =

Molecular Biology, John Wilev & 〇 )汉 Sons, Ν·Υ· (1989) 6.3.1 -6·3.6。嚴格雜化條件的一個較佳的非限制性例子 是，於約45°C在6χ氯化鈉/檸檬酸鈉（ssc)中進行雜交， 隨後於50-65 V在0.2x SSC，〇.1% s〇s中洗蘇烏 遍。較佳的S ’本發明的-個在嚴格條件下雜交為她夕4 序列或其互補序列的分離出的核酸分子，對應于一個天缺 產生的核酸分子。如本文中所使用的，“天然產生的，，核酸 -19- 20 200538109 分子指的是包含一天然產生的核苷酸序列（例如，編竭_ 天然蛋白）的RNA或DNA分子。 [00070] 除了可能存在於該群體中的HM74序列的天然產生 的等位基因變異體，熟習本技術者將會進一步理解，突織 5 可將變化導入核普酸序列’從而導致編馬後HM74中胺美 酸序列的變化，但基本上不改變HM74蛋白的生物活性= 因此，可以進行核苷酸的取代使得在“非實質性，，胺基.酸殘 基上發生胺基酸的取代。一個“非實質性，，胺基酸殘基是這 ❿ 樣一種殘基，它可從野生型的HM74序列演變而來，但其 ίο 生物活性基本上未改變。例如，各種物種HM74中未保留 或只保留一半的胺基酸殘基，對於活性可能是非實質性 的，因此很可能成為改變的目標。換言之，保留在各種物 種HM74蛋白中的胺基酸殘基，對於活性可能是實質性 的，因此不大可能成為改變的目標。 15 [00071] 相應地，本發明之另一方面係關於可編碼HM74蛋白 的核酸分子，其中對於活性是非實質性的胺基酸殘基中包 • 含了某些變化。這樣的HM74蛋白不同於已知的胺基酸序 列但保留了生物活性。在一具體實施例中，被分離出的核 酸分子包括一個可編碼蛋白的核苷酸序列，它所包括的一 2〇 個胺基酸序列，與已知的HM74胺基酸序列相比，至少 96%、97%、98%、99%或 100〇/〇相同。 [00072] 在已知HM74的核苷酸序列上取代、添加或刪除·一個 或多個核苷酸’可產生一個可編碼HM74蛋白的分離的核 酸分子，並使該被編碼蛋白内一個或多個胺基酸被取代、 -20- 200538109 添加或刪除。該HM74蛋白含有一不同於已知hM74的序 列。 [〇〇〇73]可以通過標準的技術引入各種突變，例如針對位點的 突變和PCR介導的突變。較佳的是，使保守的胺基酸在 5 —個或多個預期是非實質性的絲酸縣上取代。“保守 的胺基酸取代，’指的技縣_基被n有相似侧鏈 的胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本 技術領域内已有所定義。這些家族包括具有驗性側鏈的胺 基酸(例如賴⑯酸、精胺酸和纟且胺酸），酸性侧鍵(例如天冬 10 ⑯酸和谷胺酸）’不帶電的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬酸 月女#又酉血月女絲、月女@义、蘇胺酸、酷胺酸和半耽胺酸），非 極性側鏈'例如’丙胺酸、缚胺酸、亮胺酸、*亮胺酸、 脯月女@夂苯基丙月女酉夂、蛋胺酸和色胺酸），卜分支側鍵(例 如，蘇胺Ϊ、绳胺酸和異亮胺酸）以及芳香族側鏈(例如， 15 赂胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸和組胺酸）。因此，HM74 内個預期是非F、貝性的胺基酸殘基，最好是被另一個屬 鲁於同一側，家族的胺基酸殘基取代。作為一種替換方式， 也可以著HM74編碼序列的全部或部分隨機地引入突 變，例如通過飽和突變的方式，而且可以篩選所生成的突 20 ^體的HM74生物活性’以鑑定保留活性的突變體。在突 變之後^皮編碼的蛋白可以重組方式表達，蛋白的活性可 以被測定。 酸的例子包 -峨尿嘴cr定、 [〇〇〇74]:以用於產生所研究核酸的經變更核苦 括5-氟尿嘧啶、5_溴尿嘧啶、5_氯尿嘧啶、5 -21 - 200538109 黃。票呤、4_乙醯胞射、5伽甲基娜定、 1土甲基硫代尿苦、5-羧甲胺基甲基尿嘴咬、二 ί 、叫半乳糖Q核苷' N6·異戊烯基腺嘌呤、7 5 15 20 嘌呤：心二二基肌苷、2,2-二曱基鳥嘌呤、2-甲基腺 甲基鳥σ示呤、5-甲胺基曱基尿嘧啶、5_甲 ΐ 硫尿嘧啶、p-D_甘露糖Q核芽、5_甲氧基羰

腺ί呤=二f A基尿射' 2_硫代甲基_N6_異戊歸基 ^ ^ 羥乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q 二、2、硫代胞嘧啶、5_甲基_2_硫代尿嘧啶、2_硫代尿嗾 ;疋甲其硫代尿·定、5_甲基尿射、尿較_5,乙酸甲酉旨: 一 土 硫代尿嘧啶、3-(3-胺基_3_N_2_羧丙基）尿嘧啶以 及2，心二胺基嘌呤等。 [〇〇〇75] ^響HM74功能的—種方式是影響HM74絲達。因 此’可以操縱轉錄的水平以將HM74mRNA的含量控制在 車乂低或較高的水平，從而使細胞表面HM74的表達呈現較 低或較高的水平。實現這種操縱的一種方式是利用可調節 勺促進子。該促進子可通過例如同源重組的方式導入 HM74編碼序列附近基因組内的適當位點。 [00076]_相應地，本發明之另一個方面係關於抗HM74的抗 體。本文中所使用的術語“抗體，，指的是免疫球蛋白分子和 免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異結合抗原例 如HM74的抗原結合位點的分子。特異結合HM74的分子 是指那些結合HM74但基本上不結合樣品（例如天然含有 -22- 200538109 HM74的生物樣品）中其他分子的分子。免疫球蛋白分子的 免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab，}2片段，該兩種片段 可以通過用酶例如胃蛋白酶來處理抗體而產生。本發明提 供了可結合HM74的多株和單株抗體。本文所使用的術語 5 “單株抗體”或“單株抗體組合”指的是一群抗體分子，它們 只含有一類能夠與特定的HM74抗原決定基發生免疫反 應的個體基因型或抗原結合位點的選殖體。因此，單株抗 體組合通常只對特定的HM74蛋白抗原決定基顯示單一 籲的結合親合力。 10 [00077] 如本技術領域内所知的，還可以製備出各種其他結合 抗原的抗體類型，包括片段、嵌合體抗體，重組抗體、人 類化抗體等。 [00078] 本發明之另一方面係關於含有可編碼HM74(或其一 部分）的核酸分子的載體，較佳的是表現載體。如本文中 15 所使用的，術語“載體”指的是能夠運載與它相連接的另一 核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質體”，指的是其他 • DNA片段可以連接上去的圓形雙股DNA環。另一類型的 載體是病毒載體，其中其他的DNA片段可以連接到該病 毒的基因組内。某些載體能夠在寄主細胞内部自發地複製 20 (例如，具有細菌複製來源的細菌載體和哺乳動物附加型 載體）。其他一些載體(例如，哺乳動物非附加型載體)在被 引入寄主細胞時被整合到寄主細胞的基因組内，因此與寄 主基因組一起被複製。而且，某些載體，表現載體，能夠 指導與它們可操作地連接的基因的表達。一般而言，.用於 -23- 200538109 重組DNA技術的表現載體經常是以質體（載體）的形式存 在。但是’本發明還意在包括其他形式的表現載體，例如 起等效作用的病毒載體（例如’複製缺陷逆轉錄酶病毒、 腺病毒和腺相關病毒）。 5 [00079] 本發明之重組表現載體包括本發明之核酸，它以適人 核酸在寄主細胞内表現的形式的存在。這意味著，重組f 現載體包括以用於表現的寄主細胞為基礎所選擇的一個 或多個調控序列，該調控序列與欲表現的核酸可操作地連 _ 接。在重組表現載體内，所謂“可操作地連接，，旨在表示所 10 考慮的核苷酸序列以便於該核苷酸序列表現（例如，在— 體内轉錄/轉譯系統内或當載體被引入寄主細胞時在一寄 主細胞内表現）的方式與調控序列連接。術語“調控序列，， 意在包括啟動子、促進子以及其他表現控制元素（例如， 多聚腺苷酸化信號）。有些文獻中敘述了這類調控序列， 15 例如 Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in

Enzymology Vol. 185，Academic Press，San Diego，CA • (1990)。調控序列包括在許多種寄主細胞内指導核苷酸序 列組成性表現的調控序列（例如，組織特異性的調控序 列）°熟悉本技術者應理解表現載體的設計可取決於諸如 20 欲轉化的寄主細胞的選擇、所希望的蛋白表現水平等因 素。本發明之表現載體可導入寄主細胞，從而生產如本文 所述的由核酸編碼的蛋白或肽(例如，HM74、突變體形式 的HM74、融合蛋白等）。 1000801本發明之重組表現載體可設計用於HM74在原核或 -24- 200538109 真核細胞内的表現，例如，大腸桿菌、昆蟲細胞（使用杆 狀病毒表現載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞之類的細菌 細胞。上文提到的Goeddel —文對於適合的寄主細胞作了 進一步討論。作為一種替換方式，重組表現載體也可以在 5 體外轉錄和轉譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚 合酶。 [00081] 在另一具體實施例中’ HM74表現載體是酵母表現载 體。在釀酒酵母（S· cerevisiae)内表現的載體例子包括 鲁 pYepSecl (Baldari et al.? EMBO J. (1987) 6:229-234) - pMFa ίο (Kurjan et al·，Cell (1982) 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al·，Gene (1987) 54.113-123) ^ pYES2 (Invitrogen

Corporation，San Diego, CA)，以及 pPicZ (Invitrogen Corp·，

San Diego, CA) o [00082] 作為一種替換方式，可使用桿狀病毒表現載體使得 15 HM74可表現在昆蟲細胞裏。可表現在經培養的昆蟲鈿胞 (例如Sf9細胞）蛋白裏的桿狀病毒載體包括pAc系列 • (Smith et al·，Mol. Cell. Biol· (1983) 3:2156-2165)和 pVL 系歹，J (Lucklow et al·，Virology (1989) 170:31-39)。 [00〇83] 在另一個具體實施例中，使用了哺乳動物表現載體使 20 得本發明之核酸被表現在哺乳動物細胞裏。哺乳動物表現 載體的例子包括 pCDM8 (Seed，Nature (1987) 329:840)和 pMT2PC(Kaufmanetal”EMBOJ.(1987) 6:187]95)〇t 用於哺乳動物細胞裏時，表現載體的控制功能經常是由病 毒調控元件提供的。例如，常用的啟動子是從多瘤病毒、 -25- 200538109 腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒40衍生而來的。關於 其他原核細胞和真核細胞的適當表現系統，參閱上文提及 的Sambrook等人的論文第16章和第17章。 [00084] 對於哺乳動物細胞的穩定轉染，取決於所使用的表現 5 載體和轉染技術，已知只有一小部分細胞可以將外來的 DNA整合進基因組。為了鑒別和選擇那些整合子，通常 將編碼可選擇標記（例如對抗生素的抵抗）的基因與所研 究的基因一起導入寄主細胞。較佳的可選擇標記包括那些 * 對某些藥物例如G418、潮黴素和曱氨蝶呤等具有抗藥性 10 的可選擇標記。編碼一可選擇標記的核酸可導入寄主細胞 内那個與編碼HM74的載體相同的載體，或可導入一不同 的載體。用所導入核酸穩定地轉染的細胞可通過藥物選擇 來鑒定（例如，整合了可選擇標記基因的細胞將生存，而 其他的細胞則死亡）。 15 [00085] 與HM74結合並激活HM74的調節劑為氨磺醯氨茴 酸，又稱為利尿磺胺類化合物。 # [00086] 該分子具有以下結構：

R

-X

Qs o2s coow nz2 -26- 200538109 [〇〇〇87] 其中R是氫，或可含有支鍵、雜原子或取代基、或其 組合的烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的C 1 -C18鍵稀基；可含有支鍵、雜原子或取代基、< 其組合的C 1-C18快基；可含有側基、橋基、雜原子或取代 5 基、或其組合的C3-C1S芳基；或可含有側基、橋基、雜原 子或取代基、或其組合的C5_Ci 8環烧基；或其組合； [00088] Q和X分別是〇、S或NR ; ^ [°〇〇89] Y是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 烧基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 10 鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的Cl_c|88

炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的8 芳基；或可含有側基、橋基、雜原子或取代基、或 其組合的C5_C1S環烷基；或其組合，其中又和丫當X是 N時可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是^含^ 15 支鏈和側基的C：rCl8雜環、可含有支鏈和側基的C3、C 雜芳基，可含有支鏈和侧基的帶取代基的C3-C18環烷基 或可含有支鏈和側基或C3.C18芳基；以及 [_90] 每個Z是R。 [0_1]術语“烧氧基’’意思是與氧原子結合的院基。其例子為 2〇 甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。 ' [〇〇〇92] “芳基”是芳香烴的環。其例子包括苯基和萘基。 [〇〇〇93] “雜原子”通常是與分子内典型原子不同的原子。因 此，烴内任何非碳或非氫原子均是雜原子。常見的生物上 可接受的雜原子包括氧、硫和氮。 -27- 200538109 [00094] 術語“雜芳基”指的是其一個或一個以上碳原子被雜 原子取代的芳基。其例子為吡啶基、咪唑基、吡咯基、噻 吩基、吱喃基、11比喃基、响σ定基、σ達嗓基、吲哚基、啥淋 基、二氮雜萘基和異噁唑基。 5 [00095] 術語“環烷基”指的是環烴。其例子為環丙基、環丁 基、環戊基和環己基。 [00096] “雜環基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子取代 的環烷基。其例子為吡咯烷基、呱啶基和呱嗪基。 ® [00097] 術語“雜烷基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子 10 取代的烷基。醚是一種雜烷基。 [00098] 術語“取代的”意思是含有一個或一個以上取代基的 基本有機基團。因此，一個原子或基團可取代分子内另一 個原子或基團。典型的取代基包括鹵素、CrC8烧基、-CN、 -N〇2、烧氧基、經基、硫化物、硫酸鹽、續胺、胺和酸胺。 15 [00099] 所研究的特定化合物具有以下特點：1)當R是氫且 Q是氧或硫時，則W不是氫，或者一個或兩個Z基不是 • 氫；2)當兩個Z基、W和R是氫且Q是氧時，則X和 Y被結合在一環狀結構内。 [000100] 能夠產生生物相容的鹽的氨茴酸陽離子是鈉、鉀或銨 20 基之類的陽離子。 [000101] 所研究的氨磺醯氨茴酸可按照美國第4,406,895和 5,739,361號專利所提供的方法來製備。於是，按照本文 所講授的方法製備了亞硝酸鹽中間體，後者水解而產生所 研究的對應的羧酸。然後，該羧酸又轉化為對應的鹽。 -28- 200538109 [000102] 此類利尿磺胺化合物就是通常所稱的利尿劑。因此， 使用這類化合物來調節HM74的做法是新穎且出乎意料 的。 [000103] 所研究的利尿磺胺類化合物能激活HM74，但不能激 5 活 HM74A。 [000104] 本發明之利尿磺胺類化合物HM74調節劑，可被納入 各種適合於給藥方式的藥物組合物。這類藥物組合物通常 含有該活性成分和一種藥學上可接受的載體。如本文中所 ® 使用的，術語“藥學上可接受的載體”旨在包括適合於給藥 10 方式的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣，抗菌劑和抗 真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質和試劑用 於醫藥活性物質的做法是本技術領域内眾所周知的。除了 那些常規的介質或試劑與活性化合物不相容的情況，這類 介質和試劑在組合藥物内的使用是經過深思熟慮的。輔助 15 的活性化合物也可被納入該組合藥物内。 [000105] 本發明之藥物組合物是按照預定的給藥途徑而配製 • 的。給藥途徑的例子包括非腸道途徑，例如靜脈注射、皮 内、皮下、口腔（例如吸入）、透皮（局部），粘膜和直腸給 藥。用於非腸道途徑、皮内或皮下給藥的溶液或懸浮液可 20 包括以下組分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、 非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑； 抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯曱酸曱酯；抗氧劑，例如 抗壞血酸或亞硫酸氫納；螯合劑，例如EDTA ;緩衝劑， 例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及滲透壓調節劑，例 -29· 200538109 如氯化鈉或葡萄糖。酸度(pH)可用酸或鹼來調節，例如 HC1或NaOH。注射製劑可密封於安瓿瓶、一次性注射器 或玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶。 [〇〇〇1〇6]適合於注射用的藥物組合物包括用於即時製備無菌 注射液或分散劑的無菌水溶液（若為水溶性）或分散劑以 及無菌粉末。對於靜脈給藥方式，適合的載體包括生理鹽 水，抑菌水，Cremoph〇r EL⑧（BASF; Parsippany，NJ)或磷 酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合藥物都必須 無菌而且應具有一定的流動性以便於注射。它在製造和儲 存條件下必須是穩定的，必須加以處理以抵抗微生物例如 細菌和真菌的污染。載體可以是含有水、乙醇、多羥基化 物（例如丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等）及其適當混合 物的溶劑或分散介質。為了維持適當的流動性，可使用包 衣’例如印碟脂；若在分散劑的情況下，則可通過維持所 需的顆粒度來維持流動性；以及使用表面活化劑。為了預 防微生物的作用，可使用各種各樣的抗菌劑和抗真菌劑， 例如’對經基笨甲酸酯、氣丁醇、苯盼、抗壞血酸、硫柳 水(thimerosal)等。在許多情況下，較佳的是在該組合藥物 内加入等滲劑，例如糖、甘露醇和山梨糖醇之類的多元 醇’以及氯化鈉。可注射型組合藥物的延遲吸收，可通過 在組合藥物内加入包括延遲吸收的試劑而達到，例如加入 早硬S旨酸銘和明膠。 [〇〇〇1〇7]無菌可注射溶液的製備是將所需劑量的該活性化合 物根據品要與上述一種成分或幾種成份一起，置入一種適 200538109 當的溶劑中，隨後進行過濾滅菌。通常，分散劑的製備是 將该活性化合物加入一種無菌載體，後者含有一種基本的 分散介質以及所需的上述其他成份。對於用於製備無菌注 射液的無菌粉末，較佳的製備方法是真空乾燥法和冷束乾 5 燥法，此法從先前經滅菌過濾的溶液產生該活性成分的粉 末，再加入任何其他所需的成份。 [〇〇〇1〇8] 口服藥物組合物一般含有一種惰性稀釋劑或可食用 _ 的載體。它們可被密封在明膠膠囊内或被壓製成片劑。為 了 口服治療給藥的目的，該活性化合物可與賦形劑一起成 10 型並以片劑、鍵劑或膠囊的形式使用。口服組合藥物也可 用某種液態載體製備成糖漿或液體製劑而作為漱口液使 用，其中，液態載體中的化合物是經口腔途徑施用，或者 漱口後吐出，或者咽下。 [〇〇〇1〇9]藥學上相容的粘合劑和/或佐劑材料可作為藥物組合 15 物的組成部分加入。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以 τ任何成份或性質類似的化合物：枯合劑，例如微晶質纖 W維素、黃—或明膠；賦形劑，例如卿或乳糖；崩散劑， 例如藻酸、Primogel (羥乙酸澱粉鈉）或玉米澱粉；潤滑劑， 例如硬脂酸鎂或Sterotes ;助滑劑，例如膠體二氧化矽； 2〇 甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷、水楊酸 甲酯或橙味調味劑。 [000110]對於吸入給藥方式，該化合物可從含有適當揮發劑 (例如二氧化碳之類的氣體）的加壓容器、分配器或喷4器 以氣霧劑喷霧的形式給藥。 ' -31- 200538109 [000111]系統性給藥也可通過粘膜或透皮給藥的方式。對於粘 膜或透皮給藥，在配方中使用了克服滲透障礙的滲透劑。 這樣的滲透劑在本技術領域内是眾所周知的，例如，用於 米占膜給藥的滲透劑包括洗務劑、膽汁鹽，以及梭鏈孢酸衍 5 生物。粘膜給藥可通過使用鼻腔喷霧或拴劑來完成。對於 透皮給藥’如本技術領域内眾所周知的，可將活性化合物 配入軟膏、藥膏、凝膠或油膏。 Φ [000112]該化合物也可製成栓劑的形式（例如使用常規的栓 劑基料’如可可脂和其他甘油脂），或製成灌腸劑的形式 1〇 用於直腸灌腸。 [000113]在一具體實施例中，該活性化合物與某種防止該化合 物過快地從體内排出的載體一起製成藥劑，例如控制釋放 的劑型’包括植入體内和微膠囊給藥系統。可以使用生物 降解、生物相容性聚合物，例如乙烯一醋酸乙烯酯共聚 15 物、聚酸酐、聚甘醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。 [〇 〇 〇 114 ]製備這類藥劑的方法對於熟悉本技術者將是顯而易 春 見的。各種材料也可以通過商業途徑從Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals，Inc.等公司購得。脂質體懸浮液 (其含有與單株抗體一起靶向作用於被感染細胞的脂質體) 20 也可用作為藥學上可接受的載體。這些載體可按照為熟悉 本技術者已知的方法製備，例如，按照美國第4,522,811 號專利所述的方法製備。 [000115]為了給藥方便和劑量一致，以單位劑量的形式配製口 服或非腸道給藥的組合藥物是特別有利的。本文中所謂的 -32- 200538109 單位剤里形式指的是適合作為治療患者的單位用量且形 體上獨^單位，每個單位含有根據所需的藥物載體而算 出的預定$活性化合物，以產生所希望的治療效果。取決 $ 於疾病的類型和嚴重性，給患者輸入約1 gg/kg至15 mg/kg (例如〇1至2〇 mg/kg)的活性成份是一種可供選擇 的初始劑$，無論是一次或多次地分別給藥，還是連續地 〆主入。典型的日劑量範圍可從約1 Pg/kg至1〇〇 mg/kg或 以上，取決於以上提到的各種因素。對於幾天或更長時間 ^重複性給藥，根據具體情況，應維持治療直至出現所希 1〇 望的抑制疾病症狀的效果。但是，其他劑量的療程也可能 會有效。治療的進展情況可以容易地通過常規的技術和分 析予以監測。WO 94/04188專利披露了一示範性劑量的療 程。本發明之單位劑量的規格受制於且直接依賴於該活性 化合物的獨特性質和所欲達到的具體治療效果，以及用於 15 治療患者的這種活性化合物在配製技術方面的固有局限 性。 。 _ [000116]該藥物組合物可密封在容器、包裝袋或分配器内，並 附上使用說明。 [000117] 所研究的ΗΜ74調節劑可用於各種篩選分析和产療 20 方法(例如治療和預防）。所研究的ΗΜ74調節劑可用於筛 選其他調節ΗΜ74活性或表現的藥物或化合物，也可用於 治療其特徵為炎症的疾病。所研究的調節劑還可用於因 ΗΜ74蛋白的產生或功能不足或過度、或所產生的ΗΜ74 蛋白類型與野生型ΗΜ74蛋白相比活性下降或異常而引 -33- 200538109 起的各種情況。本發明還涉及通過本文所述的篩選試驗所 蓉定的新穎HM74調節劑及其在治療方面的應用。 [°〇〇118] 本發明提供了一種鑒定調節劑的方法（本文中又稱為 “篩選分析”）。該調節劑也就是與蛋白結合或對 5 HM74的表現或HM74的活性具有刺激或抑制作用的候選 化合物或試劑，或試驗化合物或試劑（例如肽、擬肽、小 分子化合物、抗體或其他藥物）。 [000H9] 在一具體實施例中，本發明提供了 一些分析方法，以 ^ 篩選那些可結合HM74或可調節其活性的候選化合物或 1〇 試驗化合物。因此，這些篩選分析方法可用於鑒定其他調 節HM74的利尿磺胺類化合物。這些調節劑也可用於競爭 分析法以鑒定其他調節劑，例如HM74拮抗劑。 [000120] 在一具體實施例中，分析是以細胞為基礎而進行的。 在該分析中，使一個在細胞表面表現膜結合形式HM74的 15 細胞與一試驗化合物接觸，然後測定該試驗化合物激活 HM74的能力。該細胞可以是酵母細胞或源自哺乳動物的 • 細胞。可通過以下方式來測試該試驗化合物激活HM74活 性的能力：例如，使該試驗化合物與某種放射性同位素或 酶促標記偶聯；這種偶聯使得可通過檢測與HM74形成的 2〇 複合體中或HM74所在位置上標記化合物的方式，來測定 該試驗化合物與HM74的結合。例如，可以用125i、35s、 14C或3H直接地或間接地標記試驗化合物，該放射性同位 素可通過射電輻射直接計數或通過閃爍計數而測出。或 者，該試驗化合物可用例如辣根過氧化物酶、鹼式磷酸酶 •34- 200538109 或螢光素酶等標上酶促標記，該酶促標記可通過測定某種 適宜底物向產物的轉換來檢測。在一較佳的具體實施例 中，該分析包括使一個在細胞表面表現膜結合形式HM74 的細胞與一種將HM74與試驗化合物結合的已知化合物 5 接觸，然後確定該試驗化合物在與HM74相互作用時與該 已知化合物競爭的能力。 [000121] 在另一實施例中，分析也是以細胞為基礎而進行的。 該分析包括使一個在細胞表面表現膜結合形式HM74的 • 細胞與一試驗化合物接觸，然後測定該試驗化合物調節 1〇 (例如刺激或抑制）HM74的能力。例如，可通過測定該試 驗化合物激活或抑制HM74的能力來確定該試驗化合物 調節HM74活性的能力。當激活的HM74與信號通路相關 的胞内或胞膜靶分子相互作用時，這一點可能就很清楚 了。如本文中所使用的，“靶分子”是指實際上與HM74結 15 合或相互作用的分子，例如一細胞表面表現HM74的分 子、另一細胞表面的分子、一胞外環境中的分子、一與細 φ 胞膜的内表面有關聯的分子或細胞質分子。HM74靶分子 可以是某種非HM74分子。在一個實施例中，HM74靶分 子是某種信號轉導通路的組成部分，它促進胞外信號（例 20 如由於某種化合物與HM74的結合而產生的信號）經過細 胞膜轉導進入該細胞。又如，靶分子也可以是具有催化活 性的另一個細胞間蛋白或促進下游信號分子與HM74結 合的蛋白。 [000122] 測定HM74與HM74靶分子結合或與HM74靶分子相 -35- 200538109 種測定直接結合的方法

互作用的能力，可以通過上述的— 來實現。在一較佳的實施例中，泪 !lJ定：檢測錄分子對細胞第二信使（例 甘油二酯、IP3等）的誘導，檢測該靶分子 在適當底物上的催化活性/酶活性，檢測報導基因（例如與 、編碼可檢測標諸例如螢光素酶的核酸可操作地連接的 HM74應答調節元件）的誘導，_的應答例如細胞 10 分化或細胞增殖。 剛23]纟另〆具體實施例中，本發明的分析是—種無細胞分 析，包括使HM74與-種試驗化合物接觸，並確定該試驗 化合物與HM74結合的能力。如上所述，該試驗化合物與 HM74之間的結合可直接地或間接地確定。在一較佳的具 15 體實施例中，該分析包括使HM74與本發明的一種已知化 合物和試驗化合物同時接觸，並確定該試驗化合物影響上 述已知化合物的HM74活性的能力。確定該試驗化合物與 HM74相互作用的能力，包括確定該試驗化合物與上述已 知化合物相比優先與HM74結合的能力。 20 [〇〇〇124]在另一具體實施例中，該分析是一種無細胞分析，包 括使HM74與一種試驗化合物接觸，並確定該試驗化合物 凋節（例如激活或抑制）HM74之活性的能力。確定該試驗 化合物調節HM74活性的能力，可利用上述的一種確定直 接結合的方法，通過確定被激活的HM74與HM74靶分子 -36- 200538109 結合的能力而實現。在一供選擇的具體實施例中，確定該 試驗化合物調節HM74活性的能力，可通過確定HM74 進一步調節HM74靶分子的能力來實現。例如，可按如上 所述的方法來確定該靶分子在一適當底物上的催化/酶促 5 活性。 [000125] 在另一具體實施例中，該無細胞分析包括使HM74 與一種可使HM74與一種試驗化合物結合的已知化合物 接觸，以及測定該試驗化合物與HM74相互作用的能力， • 其中’確定該試驗化合物與HM74相互作用的能力也包括 1〇 確定該HM74與HM74靶分子優先結合或優先調節HM74 把分子活性的能力。 [000126] 受體可被非配體分子激活，這些非配體分子未必抑制 配體的結合但可引起受體的結構變化，從而導致可引起活 化的G蛋白的結合，或受體的聚集、二聚化或簇合。 15 [000127] 本發明的無細胞分析既適用於玎溶形式的HM74，也 適用於膜結合形式的HM74。就包括膜結合形式HM74的 # 無細胞分析而言，使用某種增溶劑也許是可取的，可使膜 結合形式的HM74保持在溶液中。這類增溶劑的例子包括 非離子型洗滌劑，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄 20 糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基曱基葡萄糖醯胺、 癸醯基曱基葡萄糖醯胺、Triton X - 100、Triton X 一 114、Thesit⑧、異十三烷基聚乙二醇醚、3_[(3-膽醯胺基丙 基）二曱胺基>2-羥基丙磺酸鹽（CHAps〇)4 N-十二烷 基-N，N·^曱基-3_胺基_ι_丙石黃酸鹽。 -37- 200538109 [000128] 在另一具體實施例中，當HM74被表現在寄主細胞上 時，它承受了某種變化而處於一種恒定的激活狀態。改變 HM74可以使受體無需與配體結合即具有活性。使受體激 活的一種方式是改變HM74,使之在未與配體結合的情況 5 下即與〇蛋白相互作用。這種改變類似於該受體在與配 體結合時發生的構象變化，使得受體能夠結合胞内G蛋 白。WO 00/22129專利提供了這樣的一種方法。 [000129] WO 00/22129專利介紹了位於丁馗6和IC3區域的產 鲁生組成性活性的特疋胺基酸。將該特定胺基酸導入HM74 1〇 的各種方法是本技術領域中已知的，例如定點突變、次選 殖等方法。然後，被改變的HM74分子被表現在寄主細胞 内，即形成具有組成性活性的HM74。 [〇〇〇13〇]被激活的細胞於是暴露於疑為HM74致效劑、括抗 劑、反致效劑之類的分子，即可改變HM74活性的分子。 15 在用藥物開發過程中已知的方法治療與HM74代謝改變 相關的疾病過程中，這些改變G蛋白活性的分子則是革巴 φ 分子。 [ooom]在本發明上述分析方法的許多具體實施例中，可能需 要固定HM74或靶分子以促進其中任一種或兩種蛋白的 20 複合形式與非複合形式之間的分離，並便於實現分析的自 動化。試驗化合物與HM74的結合，或在候選化合物存在 或不存在的情況下HM74與靶分子之間的相互作用，可在 任何適合於容納該反應物的容器内實現。這類容器的例子 包括微孔板、試管和微離心管。在一具體實施例中，可以 -38- 200538109 提供一種融合蛋白，它增加了 _ ^力了 個結構域使得上述任一種

Louis, MO)、或谷胱甘肽衍生的微孔板上。然後，該複合 體再與試驗化合物結合，或與該試驗化合物以及未被吸附 的把分子蛋白或HM74蛋白中任一種蛋白結合，該混合物 在有利於複合體形成的條件（例如在生理鹽和值的條 件）下培養。培養完畢後，洗滌瓊脂糖珠或微孔板培養孔， 以除去任何未結合的組分，並按照如上所述的方法直接或 間接地測量複合體的形成。或者，可將該複合體從基質上 解離下來，並使用標準技術測定HM74結合或活性的水 [000132]其他將蛋白固定在基質上的技術也可用于本發明之 篩選分析中。例如，可利用生物素和鏈黴親合素蛋白的結 合使HM74固定’或使乾分子固定。生物素化的HM74 或靶分子可以用本技術領域内眾所周知的技術（例如生物 素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，從生物素 -NHS (N-羥基琥珀醯亞胺）來製備。並固定在覆有鏈黴親 合素蛋白的96孔培養皿内（Pierce Chemicals)。或者，可 與HM74或靶分子反應但不干擾HM74蛋白與靶分子結合 的抗體可在該培養皿的培養孔内衍生，未結合的無分子或 HM74被抗體結合而滯留在孔内。檢測這類複合體的方 法’除了上述用於被谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)固定的複合 -39· 200538109 體的方法以外，還包括使用易與HM74或靶分子反應的抗 體所進行的複合體免疫檢測法，以及依賴於檢測HM74或 革巴分子相關酶活性的酶聯分析。 [000133]在另一具體實施例中，HM74表現的調節劑通過以下 5 方法㈣了鑒定··使細胞與-候選化合物接觸，並測定 HM74 mRNA或蛋白在細月包中的表現。在該候選化合物存 在和不存在這兩種情況下，對HM74mRNA或蛋白的表現 水平進行了比較。然後，在上述比較的基礎上，該候選化 合物即可被鑒定為HM74表現的調節劑。例如，如果該候 1〇 選化合物存在時HM74 mRNA或蛋白的表現水平高於（統 計上顯著地高於）該候選化合物不存在時的表現水平，則 該候選化合物即可被鑒定為HM74 mRNA或蛋白表現的 刺激劑或致效劑。或者，如果該候選化合物存在時hm74 ^RNA或蛋白的表現水平低於（統計學上顯著地低於）該候 15 選化合物不存在時的表現水平，則該候選化合物即被鑒定 為HM74 mRNA或蛋白表現的的抑制劑或拮抗劑。如果 φ 在配體或致效劑存在時，或在組成性HM74内，HM74的 活性下降到基線以下，則該候選化合物即可被繁定為反致 效;=1] HM74 mRNA或蛋白在細胞内的表現水平，可通過 2〇 本文所述的檢測HM74碰财或蛋白的方法而確定。 [_134]可以製備大$的純HM74，也可確定可能的功能區域 的構象物理特徵，以用於合理的藥物設計。例如，該分子 的1C3㊣域和EC結構域都是特別值得注意的區域。一旦 哉別了某一區域的形狀和離子結構，就可以設計與這些區 200538109 域相互作用的候選藥物，

[喔35]料㈣涉及料上料選分析所鼓_賴試劑 然後在完整的細胞、動物和患者 :結構資訊的方法包括X-射i晶 建模等等。該3-D結構還可導致 及其治療用途。 、 籲[_丨36]對於與HM74的表現或活性異常相關的疾病，本發明 10 I具有風險（或S患病的）人員或已經患有該疾病的患者 提供了預防和治療的方法。這類疾病包括但不限於炎症性 疾病，例如，哮喘、慢性阻塞性肺病和類風濕性關節炎等。 [000137] 本發明的一個方面提供了一種方法，通過給患者施用 調節HM74的表現或調節至少一種HM74活性的製劑，預 15 防與HM74的表現或活性異常相關的疾病或症狀。對於因 HM74的表現或活性異常所引起或所促成的疾病，可以通 φ 過本文所述的診斷或預診斷分析方法中的一種或數種的 組合來鑒別具有風險的人員。可在以HM74異常為特徵的 症狀呈現之前即施用預防性製劑，從而可預防疾病或失 2〇 調，或者延緩其進程。取決於HM74異常的類型，可用 HM74致效劑或HM74拮抗劑對患者進行治療。根據本文 所述的篩選分析，可以確定合適的製劑。 [000138] 本發明的另一個方面涉及一些出於治療目的而調節 HM74的表現或活性的方法。本發明的調節方法涉及讓細 -41 - 200538109 胞接觸可調節與細胞連接的HM74之〜種或多種活性的 試劑。調f HM74錄的試劑可以是本文所述的試劑，例 如利尿績胺、核酸或者蛋白f、HM74蛋白的天然存在的 同源配體、肽、HM74多肽模擬物或其他小分子。在一具 5 體實施例中，該試劑能刺激HM74的一種 < 多種生# ^ 性。在另-具體實施例中，該試劑能抑制==二舌 種或多種生物學活性。這種抑制性試劑的例子包括 服74抗體。這些調節方法可以在體外實現(例如將細胞與 該試劑-起培養），也可以在體内實現(例如給患者輸入該 10 試劑）。如此，本發明提供了 一些治療方法，用於對电右 以腿74、的異常表現或異常活性為特徵之疾病或失書㈣ 患者進行冶療。在一具體實施例中，該方法涉及使用可調 節（例如上調或下調）HM74的表現或活性的試劑（例如通 過本文所述的篩選分析方法而鑒定的試劑）或各種試劑的 15 組合。 [οοο!39]在HM74被異常下調的情況下和/或在HM74活性的 • 提高很可能產生有益效果的情況下，刺激HM74的活性是 了取的。反之，在HM74被異常上調情況下和/或在HM74 活性的降低很可能產生有益效果的情況下，抑制HM74的 20 活性是可取的。 [000140]本發明將通過以下實例得到進一步說明，但它們不應 被角午釋為疋限制性的。本申請書自始至終引用的所有文 獻、專利和公開的專利申請書均係作為參考文獻引述在 此0 -42- 200538109 【實施方式】 實例1 —表現HM74的哺乳動物細胞的製備 [000141] 編碼hHM74的cDNA被選殖入一個表現載體並轉染 入哺乳動物細胞，例如CHO細胞或293細胞。 5 [000142] 為了製備過表現HM74的哺乳動物細胞，將哺乳動物 細胞接種於6孔35 mm組織培養板中（每孔3 X 1〇5個哺乳 動物細胞（美國典型培養物保藏中心（ATCC)目錄號·· CRL_1573)，每孔加2 ml含10%胎牛血清（Gibco/BRL公 • 司，目錄號：1600-044)的DMEM培養基(Gibco/BRL公 1〇 司，目錄號：11765-054)。 [000143] 然後，將細胞置於37QC的C〇2培養箱中培育，直至 細胞鋪滿50-80%。將所選殖的HM74cDNA核酸序列插入 pcDNA 3.1選殖載體中（Invitrogen公司，目錄號： V790-20)。用100 μΐ無血清F12 Ham培養基稀釋2 gg 15 DNA。另取 25 μΐ Lipofectamine 月旨質體試劑（Life

Technologies 公司，目錄號：18324-020)，用 1〇〇 μΐ 無血 修 清FI2 Ham培養基稀釋。然後將DNA溶液和

Lipofectamine溶液緩緩混合，於室溫下培養45分鐘，以 形成DNA-脂質複合體。 2〇 [000144] 將細胞用2 ml無血清F12 Ham培養基洗務一次。對 於每一份轉染反應（每塊6孔板上共6份轉染反應），分別 將0.8 ml無血清F12 Ham培養基加入含有DNA—脂質複 合體的溶液(總體積0.2毫升）中，並緩緩混勻。然後將戶斤 產生的混合物（以下稱為“轉染混合物”)覆蓋（〇.8 ml + 〇2 -43- 200538109 ml)在洗蘇過的細胞上。不加抗菌藥物。再將細胞與脂質 一 DNA複合體一起置於C02培養箱中於37°C共同’培養 16小時以發生轉染反應。 [000145] 培養結束後，保留該轉染混合物，並在細胞上覆蓋1 5 ml含10%胎牛血清的F12 Ham培養基。轉染18小時後， 吸出覆蓋在細胞上的培養基。然後用pH 2-4的 PBS(Gibco/BRL公司，目錄號：10010-023)洗滌細胞，棄 去PBS再加入含5%血清的F12 Ham培養基(“選擇培養 鲁 基，，）。轉染後72小時後，用含有4〇〇 gg/ml抗菌劑 10 Genetecin(Life Technologies 公司，目錄號·· 11811)的選擇 培養基將細胞液稀釋10倍。 實例2—致效劑分析 [000146] 為了篩選人的HM74致效劑，可將HM74以人工方式 15 偶聯在一個Gq結構上。Gq結構的激活可刺激Ca2+從細 胞内部肌質網囊泡的釋放。Ca2+被釋放進細胞質後，可用 ^ Ca2+螯合染料檢測。用螢光成像板讀數器（Fluorometric

Imaging Plate Reader )或 FLIPR® 裝置(Molecular Devices 公司）監測所產生的任何螢光變化。致效劑的活性通過螢 20 光強度的增加得到反映。 [000147] 表現HM74的CHO-K1細胞預先被設計為可表現某種 無傾向性的Gq蛋白（Gal6)。為了製備這種細胞，購買了 Gal6-偶聯的 CHO 細胞（Molecular Devices 公司的 -44- 200538109 LIVEWARE™細胞，目錄號：RD-HGA16)，並遵循實例1 的方案，使得HM74表現在這些細胞中。 [000148] 將細胞置於含10%胎牛血清、1〇〇 lU/ml青黴素 (Gibco/BRL 公司，目錄號：15140-148)、100 pg/ml 鏈黴 5 素（目錄號：15140-148，Gibco/BRL 公司）、400 pg/ml geneticin(G418)(Gibco/BRL 公司，目錄號：10131-035)和 200 pg/ml zeocin (Invitrogen 公司，目錄號：R250-05)的 F12 Ham 培養基（Gibco/BRL 公司，目錄號：11765-054) _ 内，並於37°C和5% C02的條件下維持在對數生長階段。 ίο 在進行分析前一天，使用一 96/384孔多點加樣器 (Labsystems 公司，832 型）將 CH0_K1 細胞按照 12,500 細 胞/孔接種於每孔體積為50 μΐ的384孔透明底分析板上 (Greiner/Marsh公司，目錄號：Ν58102)。將細胞置於37°C 含5%C〇2的加濕培養箱中培養(F〇rma Scientific公司3110 15 型水夾套C02培養箱）。

[000149] 製備以下儲備液·· 1 M Hepes儲備液（pH

# 7 5)(Gibco/BRL 公司，目錄號：15630-080);用 1 NNaOH

配製的25〇 mM羧苯磺胺儲備液(Sigma公司，目錄號： P8761);以及用 DMSO(Sigma 公司 D2650)配製的！ mM 2〇 Fluo 4-AM染料儲備液(Molecular Probes公司，目錄號： F1 4202)。反應緩衝液用looo 的Hank’s平衡鹽溶液 (Fisher/Mediatech 公司，目錄號：MT21023)、20mi 的 1M

Hepes儲備液以及1〇 mi的25〇 mM羧苯磺胺儲備液配 製。加樣緩衝液配製：將L6ml的1 mMFlu〇4-AM染料 -45- 200538109 儲備液與〇.32ml的普魯蘭尼克酸（pluronic acid) (Molecular Probes公司，目錄號：P6866)混合，然後與400 ml上述反應緩衝液以及4 ml胎牛血清混合。 [000150] 在進行分析前1小時，用96/384孔多點加樣器吸取 5 新製備的加樣緩衝液，按每孔50 μΐ加入384孔板中。將 細胞置於37。(：加濕培養箱中培養以達到最佳染色效果。 在即將開始分析之前，用384孔EMBLA細胞洗滌器 (Skatron公司，型號：12386)於每孔加90 μΐ反應緩衝液 洗滌細胞2次。洗滌時吸頭至少離底1〇 mm，每孔保留 10 45 μΐ緩衝液。 [000151] 將 FLIPR®II 儀器（Molecular Devices 公司）上 CCD 攝 像機（Princeton Instruments公司）的光圈刻度調到2.0，曝 光時間調到0.4秒。該攝像機是用於監測細胞板著色的精 確度。 15 [〇⑻I52] 在生理鹽缓衝液中以每孔含量約為10 μΜ的濃度條 件下，檢驗可能含有利尿磺胺類化合物的化合物庫。在加 鲁 入化合物之前10秒測量螢光的變化。加入化合物之後， 第一分鐘每秒測量一次螢光，然後，每6秒鐘曝光一次， 分析實驗總的時間為3分鐘。第1〇次掃描之後，按5 μΐ 20 等份加入100 μΜ化合物儲備液，使細胞上最終的化合物 濃度為10 μΜ。記錄最初80次掃描的螢光變化最大值， 作為致效劑活性的標準，並與以10 μΜ ATP (Sigma公司 A9〇62)誘導的螢光變化最大值進行比較。 [oooi53] 經發現，很多利尿磺胺類化合物均可激活HM74。 -46 - 200538109 實例3—拮抗劑分析 [000154] 為了篩選人的HM74致效劑，可將HM74以人工方式 偶聯在一個Gq結構上。與實例2 —樣，可用FLIPR®儀器 5 監測螢光的變化。拮抗劑的活性通過螢光強度的減小得到 反映。 [000155] 如同實例2所述，表現HM74的CHO-K1細胞預先被 設計為可表現某種無傾向性的Gq蛋白（Gal6)。將細胞置 籲 於含10%胎牛血清、100 lU/ml青黴素（Gibco/BRL公司， 10 目錄號：15140-148)、100 pg/ml鏈黴素（目錄號： 15140-148 ， Gibco/BRL 公司）、400 μδ/ιη1 geneticin(G418)(Gibco/BRL 公司，目錄號：10131-035)和 200 pg/ml zeocin (Invitrogen 公司，目錄號：R250-05)的 F12 Ham 培養基（Gibco/BRL 公司，目錄號：11765-054) 15 内，並於37°C和5% C〇2的條件下維持在對數生長階段。 在進行分析前一天，使用一 96/384孔多點加樣器 • (Labsystems 公司，832 型）將 CH0-K1 細胞按照 12,500 細 胞/孔接種於每孔體積為50 μΐ的384孔黑色透明底分析 板上（Greiner/Marsh公司，目錄號：奶81〇2)。將細胞置於 2〇 37〇C含5%C〇2的加濕培養箱中培養。

[_56]製備以下儲備液：丨M Hepes儲備液（pH 7.5)(Gibco/BRL 公司，目錄號：1563〇_〇8〇);用 i N Na〇H 配製的250 mM羧苯石黃胺儲備液(Sigma公司，目錄號： P8761);用 DMSO(Sigma 公司 D265〇)配製的 1 mM Fluo -47. 200538109 4-AM染料儲備液（Molecular Probes公司，目錄號：F 14202);以及配體或拮抗劑的儲備液。反應緩衝液用1〇〇〇 ml的Hank s平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech公司，目錄 號：]^丁21023)、2〇1111的1]^^^^儲備液以及1〇1111的 5 250 mM羧苯磺胺儲備液以及1 mM CaCl2配製配製。加樣 緩衝液配製：將80 μΐ的1 mM Fluo 4-AM染料儲備液與 16 μΐ 普魯蘭尼克酸(piur〇nic acid)(M〇lecular Pr〇bes 公 司，目錄號：P6866)混合，然後與20ml上述反應緩衝液 以及0.2 ml胎牛血清混合。 10 [000157]在進行分析前30分鐘，用96/384孔多點加樣器吸取 新製備的加樣緩衝液，按每孔3〇 μ1加入384孔板中。將 細胞置於37°C加濕培養箱中培養以達到最佳染色效果。 在即將開始分析之前，用384孔EMBLA細胞洗滌器於每 孔加100 μΐ反應緩衝液洗滌細胞3次。洗滌時吸頭至少離 15 底40 mm，每孔保留45 μΐ緩衝液。 [oooi58]用 Platemate 384 孔板移液器（Matrix 公司）吸取 5 μΐ 春 的100 μΜ拮抗劑化合物儲備液加入細胞液中。在培養過 程中，該化合物濃度約為10 μΜ。將細胞置於FLIPR®II 中，第一分鐘每秒測量一次培養板的螢光，然後，每6秒 20 鐘曝光一次，分析實驗總的時間為3分鐘。在第10次掃 描之後，加入拮抗劑或配體（10 μΜ)。每次加樣之後，384 孔板加樣頭用20 μΐ的〇·〇ι% DMSO水溶液洗滌10次。 [〇〇〇159]在用候選拮抗劑檢驗之前，可以使Μ74細胞接觸某 種已馨定的致效劑，也可以不接觸。 -48- 200538109 實例4 一受體結合分析

[〇〇〇16〇]為了製備包含HM74的細胞膜片段，在含有1 mM EDTA的磷酸鹽緩衝鹽水（1〇 ml)中培養後收集表現HM74 5 的CH0細胞系。在重新懸浮於5 ml缓衝液A(50 mM

Tris-HCl (PH 7.8)(Sigma 公司 T6791)、5 mM MgCl2 (Sigma 公司 M8266)以及 1 mM EGTA(Sigma 公司 0396)) 之前，用含有1 mM EDTA(10 ml)的磷酸鹽緩衝鹽水再洗 •務細胞3次。 ίο [000161]然後’用組織勻漿器（Polytron 公司，Kinemetica，PT 10/35型）將細胞打碎1分鐘。將所產生的勻漿用s〇rvall

Instruments公司的RC3B冷凍離心機以49,000 Xg於4°C _心20分鐘。將所產生的沉激物重新懸浮於25 ml緩衝 液A中，並重複離心步驟3次。最後一次離心之後，將 15 該沉澱物再次重新懸浮於5 ml緩衝液A中，分成若干等 份儲存於-70°C。 修[000162]用細胞膜片段並以帶放射性標記的所研究的致效劑 作為示縱劑進行受體結合分析。分析在96孔板(Beckman 儀器公司）中進行。該結合反應物為18 pg的CHO細胞製 20 劑，在放射性致效劑（0·01 nM - 25 nM)存在的條件下，在 最終體積為0.2 ml的含有0.1%牛血清白蛋白（Sigma公 司’目錄號· 34287)的缓衝液A中進行反應（參閱Im et al.， J· Biol· Chem· (2000) 275(19):14281-14286)。在室溫下培 養該反應物1小時。通過用一多通道收集器（Brandell)上 -49- 200538109 的Whatman GF/C過濾器進行過濾而終止反應。該多通道 收集器預先用0.3%聚乙烯亞胺（Sigma公司，目錄號： P3143)和0.1%牛血清白蛋白（BSA)處理1小時。將混合 物加入過濾器並培養1小時。過濾、器用1 ml pH值為7.6 5 的冰冷50 mM Tris-HCl溶液洗滌6次。對應於根據放射 性而測定的每個示縱劑濃度，特異性結合的計算，是以全 部結合與非特異性結合（背景）之間的差異為基礎的。取8 至16個濃度資料點，以確定在致效劑與受體之間的平衡 _ 狀態下實現的致效劑與受體的結合（平衡結合參數）。在一 ίο 競爭性分析試驗中，將一試驗性化合物加入該混合物，在 與受體的結合方面與放射性致效劑競爭（競爭結合值）。繪 製抑制曲線以確定對於結合的抑制達50%而所需的濃度 (IC50) 〇 15 實例5 —小分子致效劑 [000163] 如上所述，使一系列利尿續胺類分子接觸表現HM74 鲁 的細胞。對靶分子進行標記以確定是否發生與HM74的結 合。通過測定細胞洗滌後的標記程度來探測這種結合。還 通過二維凝膠電泳法分離HM74以及測定與該蛋白相關 20 的標記程度來確定這種結合。在對這種結合進行評估之 後，或獨立於這種評估，確定了候選致效劑激活HM74的 能力。FLIPR分析被用於評價當靶分子與HM74結合時胞 内的鈣動員。如此鑒定了引起鈣動員的分子。 -50- 200538109 [000164] 本發明現已說明完畢，技術人員將會知道，可以對本 文所介紹的發明内容做出各種各樣的改變和改進，而不背 離此處所介紹的本發明的精神和範圍。 [000165] 本申請書中所引用的所有文獻均以其整體而引述在 5 此0

-51 -

Claims (1)

1. 200538109 十、申請專利範圍： 1. 一種在需要治療的患者體内調節HM74信號活性或信 號傳遞的治療方法，其包括對該患者施用具有以下結構 的分子： R

   丫一Χγ^^'Ν

   /"^^coow I nz2 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組 合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的（^-(：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、 ίο 或其組合的炔基；可含有側基、橋基、雜原子或 取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的<35-(318環烷基；或其組合； ® Q和X分別是Ο、S或NR ; Y 是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 15 CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的（^-0：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代 基、或其組合的crc18炔基；可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含 有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5-C18 20 環烷基；或其組合，其中當X是N時，X和Y可 -52- 200538109 被稠合為一個或一個以上的環，其中該環是可含有 支鏈和側基的c3-c18雜環、可含有支鏈和側基的 c3-c18雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的 c3-c18環烷基，或可含有支鏈和側基或c3-c18芳 5 基；以及 每個Z是R。 2. —種鑑定HM74致效劑的方法，其包括用表現HM74的 細胞接觸潛在的致效劑，並測定在該潛在的致效劑存在 鲁 的情況下，相對於該潛在的致效劑不存在的情況，是否 ίο HM74的信號活性有所增加，其中該潛在的致效劑具有 以下結構：

   Y

   COOW 15 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組 合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的CrCu鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、 或其組合的CrC18炔基；可含有側基、橋基、雜原子或 取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的〇5-(：18環烷基；或其組合； Q和X分別是0、S或NR ; -53- 20 200538109 γ 是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 Ci_Ci8烧基；可含有支鍵、雜原子或取代基、或其 組合的（^/以鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代 基、或其組合的crc18炔基；可含有侧基、橋基、 5 雜原子或取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含 有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的c5-c18 環烷基；或其組合，其中當X是N時，X和Y可 被稠合為一個或一個以上的環，其中該環是可含有 ® 支鏈和側基的C3-C18雜環、可含有支鏈和側基的 10 c3-c18雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的 c3-c18環烷基，或可含有支鏈和側基或c3-c18芳 基；以及 每個Z是R。 3. —種鑑定HM74反致效劑的方法，其包括用表現HM74 15 的細胞接觸潛在的反致效劑，並測定在該潛在的反致效 劑存在的情況下，相對於該潛在的反致效劑不存在的情 φ 況，是否HM74的信號活性有所下降，以及在一種致效 劑存在的情況下是否有所下降，其中該潛在的反致效劑 具有以下結構·· R

   coow Y——X 〇2s -54. 20 200538109 合的可合有支鏈、⑽子或取代基、或其祖 口日>/匕1七18燒基；可合古 組合的…鏈烯基;可含:支:原子或取代基、=其 或其組合的C1_C18块基 ㈣雜原子或取代> 取代基、或其組合的C3 有側基、橋基、雜原子成 雜原子或取代基、或心日^8彳基，或可含有側基、橋基、 Q和X分別是〇、SH w C5_Cl8環絲；或其組合； Φ 10 n 原子或取代基、或其組合的 組入σ,3有支鏈、雜原子或取代基、或其 m:c；:鏈埽基;可含有支鏈、雜原子或取代 基、或其組合的c, r A # 雜原子或取代基、咬含有側基、橋基' 有側基、橋基、雜原V或取二C3;c:f;;或可/ JS, ^ A ^ ,卞及取代基、或其組合的c5-c18 15 20 成基，或其組合，其中當X是N時，Χ#σΥ可 破稠合為-個或-個以上的環，其中該環是可含有 支鏈和側^的CVC18雜環、可含有支鏈和側基的 CVCu雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的 CrCu環烷基，或可含有支鏈和侧基或芳 基；以及 每個Z是R。 —種鏗定HM74拮抗劑的方法，其包括用表現hM74的 細胞接觸潛在的拮抗劑，並測定在該潛在的拮抗劑存在 的情況下，相對於潛在的致效劑存在的情況，是否hM74 的信號活性有所下降，其中該潛在的拮抗劑具有以下結 -55- 4· 200538109 構· R γ— Q. 02s 2中R是氫’或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組 口的（Vc18烧基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 2的CVCl8鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基'、 ς: J合的crc18炔基；可含有側基、橋基、雜原子或 雜原二或其組合的C3-Cl8芳基;或可含有側基、橋基、 〇原：或取代基、或其組合叫Ci8環烷 . Q和X分別是〇、S4NR; 又八、、且口， 疋可含有支鍵、雜原子或取代其、+ Ci-C18烧基；可含有支鍵、雜原子土或取5代美且°的 J合叫。鏈称可含有支鏈、雜原；或= ς、或其組合的Cl-C18块基；可含有 样 15 雜原子或取代基、或其組合的C3_c 橋基、 有侧基、橋基、雜原子或取代基 二，或可含 環絲，·或其組合，其t 且合的c”Cl8 被稠合為一個或—個以上的環疋時’X曰和γ可 支鏈和侧基的c3_Cis _、可含、r w可含有 ㈣8雜芳基，可含有支鏈和侧二，匈基的 .5, ㈣的帶取代基的 200538109 c3-c18環烷基，或可含有支鏈和側基或c3-c18芳 基；以及 每個Z是R。 5. —種具有以下結構式的化合物：

   I nz2 COOW 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組 合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的（^/^鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、 或其組合的CrC18炔基；可含有側基、橋基、雜原子或 1〇 取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的€：5-018環烷基；或其組合； φ Q和X分別是Ο、S或NR ; Y 是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 Ci-C^烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 15 組合的心/^鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代 基、或其組合的Ci-Cu炔基；可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的c3-c18芳基；或可含 有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的c5-c18 環烷基；或其組合，其中當X是N時，X和Y可 -57- 200538109 被稠合為一個或一個以上的環，其中該環是可含有 支鏈和側基的c3-c18雜環、可含有支鏈和側基的 c3_c18雜芳基，可含有支鏈和側基的帶取代基的 c3-c18環烷基，或可含有支鏈和側基或c3-c18芳 5 基；以及 每個Z是R。 6. —種調節炎症反應的方法，其包括讓需要治療的患者接 觸一種炎症調節劑量的藥物組合物，包括具有以下結構 -式的化合物： 10 R

   COOW 〇2S nz2 ^ 其中R是氫，或可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組 合的CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 組合的<^-€18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、 15 或其組合的Ci-Cw炔基；可含有側基、橋基、雜原子或 取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的<35-<：18環烷基；或其組合； Q和X分別是0、S或NR ; Y 是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 20 CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其 -58- 4 200538109 組合的（^-C!8鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代 基、或其組合的Ci_Ci8炔基；可含有側基、橋基、 雜原子或取代基、或其組合的c3_Ci8芳基；或可含 有側基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5_Ci8 環烷基；或其組合，其中當X*N時，又和丫可 被稠合為一個或一個以上的環，其中該環是可含有 支鏈和側基的C3_Cl8_、可含有支鏈和側基的 C3-C18雜芳基’可含有支鏈和側基的帶取代基的 cvcu環院基’或可含有支鏈和側基或c3_c 基；以及 每個Z是R。

   -59- 200538109 七、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明： 無

   八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無