JP2003232790A - Ｃ−ｐｌａｃｅ１００３２３８に対するリガンドのスクリーニング方法 - Google Patents
Ｃ−ｐｌａｃｅ１００３２３８に対するリガンドのスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 オーファンＧＰＣＲ、C-PLACE1003238に対す
るリガンド（生理的リガンド、アゴニスト、インバース
アゴニスト）のスクリーニング法の提供。 【解決手段】 C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂
質二重層膜、並びにＧiファミリーに属するＧ蛋白質α
サブユニットの少なくともＧＰＣＲとの結合に関与する
領域及びグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域
を含むポリペプチドを構成要素として含む系において、
該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該サブユ
ニットを含むポリペプチドと相互作用する効果器の活性
を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴
とする、C-PLACE1003238に対するリガンドのスクリーニ
ング方法。
るリガンド（生理的リガンド、アゴニスト、インバース
アゴニスト）のスクリーニング法の提供。 【解決手段】 C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂
質二重層膜、並びにＧiファミリーに属するＧ蛋白質α
サブユニットの少なくともＧＰＣＲとの結合に関与する
領域及びグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域
を含むポリペプチドを構成要素として含む系において、
該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該サブユ
ニットを含むポリペプチドと相互作用する効果器の活性
を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴
とする、C-PLACE1003238に対するリガンドのスクリーニ
ング方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、C-PLACE1003238に
対するリガンドのスクリーニング方法及びスクリーニン
グ系に関する。詳細には、本発明は、泌尿器系組織等で
高発現するオーファンＧＰＣＲ、C-PLACE1003238とそれ
に共役するＧiファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニ
ットを構成要素として含むスクリーニング系、該スクリ
ーニング系を用いた該ＧＰＣＲに対する生理的リガン
ド、アゴニスト又はインバースアゴニストのスクリーニ
ング方法に関する。本発明はまた、上記スクリーニング
系を用いた泌尿器等における疾患の予防治療剤又は疾患
マーカーのスクリーニング方法、生体試料中の該疾患マ
ーカー量を測定することによる該疾患の診断方法に関す
る。本発明はまた、C-PLACE1003238の特定の部分アミノ
酸配列を特異的に認識する抗体に関する。
対するリガンドのスクリーニング方法及びスクリーニン
グ系に関する。詳細には、本発明は、泌尿器系組織等で
高発現するオーファンＧＰＣＲ、C-PLACE1003238とそれ
に共役するＧiファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニ
ットを構成要素として含むスクリーニング系、該スクリ
ーニング系を用いた該ＧＰＣＲに対する生理的リガン
ド、アゴニスト又はインバースアゴニストのスクリーニ
ング方法に関する。本発明はまた、上記スクリーニング
系を用いた泌尿器等における疾患の予防治療剤又は疾患
マーカーのスクリーニング方法、生体試料中の該疾患マ
ーカー量を測定することによる該疾患の診断方法に関す
る。本発明はまた、C-PLACE1003238の特定の部分アミノ
酸配列を特異的に認識する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞は外界から情報を受け取るいくつか
のシステムを持っている。その中でも代表的なものとし
て、細胞膜上にある受容体の活性化により、三量体ＧＴ
Ｐ結合性蛋白質（以下、Ｇ蛋白質）を介して細胞内に情
報を伝達する仕組みが挙げられる。このようなタイプの
受容体をＧ蛋白質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）とい
う。
のシステムを持っている。その中でも代表的なものとし
て、細胞膜上にある受容体の活性化により、三量体ＧＴ
Ｐ結合性蛋白質（以下、Ｇ蛋白質）を介して細胞内に情
報を伝達する仕組みが挙げられる。このようなタイプの
受容体をＧ蛋白質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）とい
う。
【０００３】調査によれば、既存の医薬品の約半数が細
胞膜上の受容体を介して作用を発現することがわかって
おり、中でもＧＰＣＲは特に大きな割合を占めているこ
とから、最も可能性のある創薬ターゲットとして注目さ
れている（例えば、Drews, J. Science 2000; 287:1960
-1964. Andrew D.Howard et al. Trends Pharmacol.Sc
i. 2001; 22:132-140.）。
胞膜上の受容体を介して作用を発現することがわかって
おり、中でもＧＰＣＲは特に大きな割合を占めているこ
とから、最も可能性のある創薬ターゲットとして注目さ
れている（例えば、Drews, J. Science 2000; 287:1960
-1964. Andrew D.Howard et al. Trends Pharmacol.Sc
i. 2001; 22:132-140.）。
【０００４】最近のゲノム解析研究の急速な進展に伴
い、新規なＧＰＣＲ遺伝子が次々と見出されており、ヒ
トの場合、その総数は２０００以上にものぼると推定さ
れている。その１つとして、これまでにヒト胎盤組織ｃ
ＤＮＡライブラリーからＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡ
クローンが探索された結果、新規なＧＰＣＲであるC-PL
ACE1003238が単離されている（WO 01/09322号公報）。
い、新規なＧＰＣＲ遺伝子が次々と見出されており、ヒ
トの場合、その総数は２０００以上にものぼると推定さ
れている。その１つとして、これまでにヒト胎盤組織ｃ
ＤＮＡライブラリーからＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡ
クローンが探索された結果、新規なＧＰＣＲであるC-PL
ACE1003238が単離されている（WO 01/09322号公報）。
【０００５】しかしながら、このようなＧＰＣＲの大半
はその生理的リガンドが不明（すなわち「オーファン
（＝orphan）」）であるため、そのほとんどは、これま
で創薬のターゲットとすることができなかった。近年の
コンビナトリアルケミストリー技術の進歩の成果である
充実した化合物ライブラリー群の利用と、ロボット技術
の導入等によるスクリーニングのハイスループット化に
より、リガンド探索に費やされる時間と労力は従来に比
べて軽減されてはいるものの、受容体に対する生理的リ
ガンドの同定は依然として容易ではない。前述のC-PLAC
E1003238についても、未だその生理的リガンドの同定に
は至っていない。
はその生理的リガンドが不明（すなわち「オーファン
（＝orphan）」）であるため、そのほとんどは、これま
で創薬のターゲットとすることができなかった。近年の
コンビナトリアルケミストリー技術の進歩の成果である
充実した化合物ライブラリー群の利用と、ロボット技術
の導入等によるスクリーニングのハイスループット化に
より、リガンド探索に費やされる時間と労力は従来に比
べて軽減されてはいるものの、受容体に対する生理的リ
ガンドの同定は依然として容易ではない。前述のC-PLAC
E1003238についても、未だその生理的リガンドの同定に
は至っていない。
【０００６】このような事情を考慮すれば、生理的リガ
ンドを必要としないＧＰＣＲのアゴニストやアンタゴニ
ストのスクリーニング法の開発が極めて重要である。一
般に、ＧＰＣＲは７回膜貫通型蛋白質であり、７つの疎
水性の高い膜貫通ドメインと、細胞外にそれらを繋ぐ３
つのループとＮ末端鎖、細胞内に３つのループとＣ末端
鎖を有している。このうちＣ末端部の細胞内領域および
細胞内第３ループがＧ蛋白質との会合（共役）に重要で
ある。Ｇ蛋白質はα、β及びγの３つのサブユニットか
ら構成されている。不活性な状態ではαサブユニット
（Ｇα）にはＧＤＰが結合しており、Ｇβγと共にヘテ
ロ三量体を形成している。リガンドが結合すると、ＧＰ
ＣＲはコンフォメーション変化を起こしてＧ蛋白質を活
性化する。即ち、リガンドを結合したＧＰＣＲはＧαか
らのＧＤＰの遊離を促進し、ＧαをＧＴＰ結合型（活性
化状態）に変える。ＧＴＰ結合型ＧαはＧβγから解離
し、効果器（アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ
等）に作用して、ｃＡＭＰやＣａ2+等のセカンドメッセ
ンジャーのレベルを正又は負に調節することにより、細
胞外情報を細胞内に伝達する。従って、ＧＰＣＲとこれ
に共役するＧαとを発現する細胞あるいはその細胞膜含
有画分を用いれば、該ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換
反応や効果器が仲介する反応を指標として、ＧＰＣＲの
アゴニストやインバースアゴニストをスクリーニングす
ることが可能である。
ンドを必要としないＧＰＣＲのアゴニストやアンタゴニ
ストのスクリーニング法の開発が極めて重要である。一
般に、ＧＰＣＲは７回膜貫通型蛋白質であり、７つの疎
水性の高い膜貫通ドメインと、細胞外にそれらを繋ぐ３
つのループとＮ末端鎖、細胞内に３つのループとＣ末端
鎖を有している。このうちＣ末端部の細胞内領域および
細胞内第３ループがＧ蛋白質との会合（共役）に重要で
ある。Ｇ蛋白質はα、β及びγの３つのサブユニットか
ら構成されている。不活性な状態ではαサブユニット
（Ｇα）にはＧＤＰが結合しており、Ｇβγと共にヘテ
ロ三量体を形成している。リガンドが結合すると、ＧＰ
ＣＲはコンフォメーション変化を起こしてＧ蛋白質を活
性化する。即ち、リガンドを結合したＧＰＣＲはＧαか
らのＧＤＰの遊離を促進し、ＧαをＧＴＰ結合型（活性
化状態）に変える。ＧＴＰ結合型ＧαはＧβγから解離
し、効果器（アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ
等）に作用して、ｃＡＭＰやＣａ2+等のセカンドメッセ
ンジャーのレベルを正又は負に調節することにより、細
胞外情報を細胞内に伝達する。従って、ＧＰＣＲとこれ
に共役するＧαとを発現する細胞あるいはその細胞膜含
有画分を用いれば、該ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換
反応や効果器が仲介する反応を指標として、ＧＰＣＲの
アゴニストやインバースアゴニストをスクリーニングす
ることが可能である。
【０００７】Ｇαは一次構造の相違によりＧs、Ｇi、Ｇ
q、Ｇ12の４つのファミリーに大きく分類され、それぞ
れ作用する効果器の種類やその調節様式を異にするが、
１つのＧＰＣＲは通常Ｇαのある特定のファミリーとの
み共役し得る。従って、上記のスクリーニング系の開発
のためには、目的のＧＰＣＲと共役するＧαのファミリ
ーを同定しなければならない。
q、Ｇ12の４つのファミリーに大きく分類され、それぞ
れ作用する効果器の種類やその調節様式を異にするが、
１つのＧＰＣＲは通常Ｇαのある特定のファミリーとの
み共役し得る。従って、上記のスクリーニング系の開発
のためには、目的のＧＰＣＲと共役するＧαのファミリ
ーを同定しなければならない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オーファン
ＧＰＣＲ、C-PLACE1003238と共役するＧαのファミリー
を同定し、C-PLACE1003238及び該Ｇαとを発現する細胞
あるいはその細胞膜含有画分を用いて、生理的リガンド
を必要とせずにC-PLACE1003238のアゴニスト又はインバ
ースアゴニストをスクリーニングする方法を提供するこ
とを目的とする。本発明のさらなる目的は、上記スクリ
ーニング法を用いてC-PLACE1003238を高発現する組織、
例えば、泌尿器系組織、胎盤及び扁桃における疾患の予
防及び治療に有効な薬剤を提供することである。また別
の本発明の目的は、上記疾患の疾患マーカーを同定し、
該マーカーの体内動態を調べることによる当該疾患の診
断方法を提供することである。
ＧＰＣＲ、C-PLACE1003238と共役するＧαのファミリー
を同定し、C-PLACE1003238及び該Ｇαとを発現する細胞
あるいはその細胞膜含有画分を用いて、生理的リガンド
を必要とせずにC-PLACE1003238のアゴニスト又はインバ
ースアゴニストをスクリーニングする方法を提供するこ
とを目的とする。本発明のさらなる目的は、上記スクリ
ーニング法を用いてC-PLACE1003238を高発現する組織、
例えば、泌尿器系組織、胎盤及び扁桃における疾患の予
防及び治療に有効な薬剤を提供することである。また別
の本発明の目的は、上記疾患の疾患マーカーを同定し、
該マーカーの体内動態を調べることによる当該疾患の診
断方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】通常、ＧＰＣＲはリガン
ドが結合していない状態ではＧ蛋白質を活性化できな
い。近年、β２アドレナリン受容体など、共役Ｇ蛋白質
が判明しているＧＰＣＲに関しては、ＧＰＣＲと共役Ｇ
蛋白質のＧαを融合蛋白質として発現させることによ
り、リガンド非依存的なＧ蛋白質の活性化が起こった例
が報告されている（例えば、Roland S. et al., J. Bio
l. Chem. 1998;273:5109-5116）。本発明者らは、オー
ファンＧＰＣＲにおいて同様の手法を適用すれば、共役
Ｇ蛋白質を同定できると共に、共役Ｇ蛋白質との融合に
より活性化状態となった恒常的活性化ＧＰＣＲを用いる
ことにより、リガンド非存在下においてもアゴニストの
みならずインバースアゴニストのスクリーニングが可能
となるのではないかと発想し、C-PLACE1003238と種々の
Ｇαとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベク
ターを作製し、これを動物細胞にトランスフェクトして
該動物細胞膜上にこれらの融合蛋白質を発現させた。そ
の結果、C-PLACE1003238は、Ｇiファミリーに属するＧ
αとの融合蛋白質として発現させた場合にのみＧαを恒
常的に活性化した。即ち、オーファンＧＰＣＲにおいて
も、Ｇαとの融合蛋白質として発現させることにより、
リガンドの非存在下においてもＧαを活性化し得ること
が実証されるとともに、C-PLACE1003238と共役するＧα
がＧiファミリーに属するものであることが明らかとな
った。かかる知見に基づいて、本発明者らは、C-PLACE1
003238とＧiファミリーに属するＧαとを発現する各種
動物細胞及び該動物細胞の細胞膜含有画分、あるいはC-
PLACE1003238とＧiファミリーに属するＧαとを少なく
とも人工脂質二重層膜上に含む再構成系を構築して、本
発明を完成するに至った。
ドが結合していない状態ではＧ蛋白質を活性化できな
い。近年、β２アドレナリン受容体など、共役Ｇ蛋白質
が判明しているＧＰＣＲに関しては、ＧＰＣＲと共役Ｇ
蛋白質のＧαを融合蛋白質として発現させることによ
り、リガンド非依存的なＧ蛋白質の活性化が起こった例
が報告されている（例えば、Roland S. et al., J. Bio
l. Chem. 1998;273:5109-5116）。本発明者らは、オー
ファンＧＰＣＲにおいて同様の手法を適用すれば、共役
Ｇ蛋白質を同定できると共に、共役Ｇ蛋白質との融合に
より活性化状態となった恒常的活性化ＧＰＣＲを用いる
ことにより、リガンド非存在下においてもアゴニストの
みならずインバースアゴニストのスクリーニングが可能
となるのではないかと発想し、C-PLACE1003238と種々の
Ｇαとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベク
ターを作製し、これを動物細胞にトランスフェクトして
該動物細胞膜上にこれらの融合蛋白質を発現させた。そ
の結果、C-PLACE1003238は、Ｇiファミリーに属するＧ
αとの融合蛋白質として発現させた場合にのみＧαを恒
常的に活性化した。即ち、オーファンＧＰＣＲにおいて
も、Ｇαとの融合蛋白質として発現させることにより、
リガンドの非存在下においてもＧαを活性化し得ること
が実証されるとともに、C-PLACE1003238と共役するＧα
がＧiファミリーに属するものであることが明らかとな
った。かかる知見に基づいて、本発明者らは、C-PLACE1
003238とＧiファミリーに属するＧαとを発現する各種
動物細胞及び該動物細胞の細胞膜含有画分、あるいはC-
PLACE1003238とＧiファミリーに属するＧαとを少なく
とも人工脂質二重層膜上に含む再構成系を構築して、本
発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、C-PLACE1003238に対
するリガンドのスクリーニング系であって、C-PLACE100
3238又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにＧiフ
ァミリーに属するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素と
して含むことを特徴とするスクリーニング系を提供す
る。当該スクリーニング系において、C-PLACE1003238に
対するリガンドは、該グアニンヌクレオチド結合領域で
のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該２つの領域を含むポリ
ペプチドと相互作用する効果器の活性を、被験物質の存
在下と非存在下で比較することによりスクリーニングす
ることができる。効果器の活性を指標とする場合、該サ
ブユニットを含むポリペプチドは、Ｇiファミリーに属
するＧαの効果器と相互作用するためのドメインもしく
は他のファミリーに属するＧαの効果器と相互作用する
ためのドメインをさらに含み、また、該脂質二重層膜は
いずれかのサブユニットに対応する効果器をさらに含
む。
するリガンドのスクリーニング系であって、C-PLACE100
3238又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにＧiフ
ァミリーに属するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素と
して含むことを特徴とするスクリーニング系を提供す
る。当該スクリーニング系において、C-PLACE1003238に
対するリガンドは、該グアニンヌクレオチド結合領域で
のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該２つの領域を含むポリ
ペプチドと相互作用する効果器の活性を、被験物質の存
在下と非存在下で比較することによりスクリーニングす
ることができる。効果器の活性を指標とする場合、該サ
ブユニットを含むポリペプチドは、Ｇiファミリーに属
するＧαの効果器と相互作用するためのドメインもしく
は他のファミリーに属するＧαの効果器と相互作用する
ためのドメインをさらに含み、また、該脂質二重層膜は
いずれかのサブユニットに対応する効果器をさらに含
む。
【００１１】このようなスクリーニング系の代表的な例
として、（１）C-PLACE1003238又はその均等物をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターと、Ｇiファミリーに属
するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意の
Ｇαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を
少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
発現ベクターとでトランスフェクトした宿主動物細胞、
（２）C-PLACE1003238又はその均等物と該２つのサブユ
ニット領域を含むポリペプチドとの融合蛋白質をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした
宿主動物細胞、又は（３）C-PLACE1003238又はその均等
物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフ
ェクトした、Ｇiファミリーに属するＧαを内因的に発
現する宿主動物細胞、あるいは上記のいずれかの細胞ホ
モジネート又は該細胞由来の膜画分が挙げられる。
として、（１）C-PLACE1003238又はその均等物をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターと、Ｇiファミリーに属
するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意の
Ｇαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を
少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
発現ベクターとでトランスフェクトした宿主動物細胞、
（２）C-PLACE1003238又はその均等物と該２つのサブユ
ニット領域を含むポリペプチドとの融合蛋白質をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした
宿主動物細胞、又は（３）C-PLACE1003238又はその均等
物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフ
ェクトした、Ｇiファミリーに属するＧαを内因的に発
現する宿主動物細胞、あるいは上記のいずれかの細胞ホ
モジネート又は該細胞由来の膜画分が挙げられる。
【００１２】上記のスクリーニング系及びそれを用いた
スクリーニング法によって得られるC-PLACE1003238に対
するリガンドは、泌尿器、胎盤又は扁桃における疾患の
予防及び治療に有効であると考えられる。従って、本発
明はまた、泌尿器、胎盤又は扁桃における疾患の予防及
び治療化合物のスクリーニング系及びスクリーニング方
法を提供する。本発明はさらに、当該化合物と医薬上許
容される担体とを配合することによる、当該疾患の予防
及び治療剤の製造方法を提供する。
スクリーニング法によって得られるC-PLACE1003238に対
するリガンドは、泌尿器、胎盤又は扁桃における疾患の
予防及び治療に有効であると考えられる。従って、本発
明はまた、泌尿器、胎盤又は扁桃における疾患の予防及
び治療化合物のスクリーニング系及びスクリーニング方
法を提供する。本発明はさらに、当該化合物と医薬上許
容される担体とを配合することによる、当該疾患の予防
及び治療剤の製造方法を提供する。
【００１３】同様に、上記のスクリーニング系及びそれ
を用いたスクリーニング法によってC-PLACE1003238に対
するリガンドであると認定された生体物質は、泌尿器、
胎盤又は扁桃における疾患の疾患マーカーとなり得る。
従って、本発明はまた、泌尿器、胎盤又は扁桃における
疾患のマーカー物質の同定方法を提供する。さらに本発
明は、同定された当該疾患マーカーの、泌尿器、胎盤又
は扁桃由来の生体試料中での存在量を測定することによ
る、当該疾患の診断方法を提供する。
を用いたスクリーニング法によってC-PLACE1003238に対
するリガンドであると認定された生体物質は、泌尿器、
胎盤又は扁桃における疾患の疾患マーカーとなり得る。
従って、本発明はまた、泌尿器、胎盤又は扁桃における
疾患のマーカー物質の同定方法を提供する。さらに本発
明は、同定された当該疾患マーカーの、泌尿器、胎盤又
は扁桃由来の生体試料中での存在量を測定することによ
る、当該疾患の診断方法を提供する。
【００１４】本発明はまた、C-PLACE1003238の特定の部
分アミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体を提供する。
分アミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体を提供する。
【００１５】本発明のさらなる特徴及び本発明の利点に
ついて、以下の「発明の実施の形態」においてより詳細
に説明する。
ついて、以下の「発明の実施の形態」においてより詳細
に説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明は、C-PLACE1003238に対す
るリガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リ
ガンドのスクリーニング方法を提供する。本明細書にお
いて「リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的
（即ち、「ネイティブ（＝native）」）リガンドだけで
なく、アゴニスト（即ち、受容体の生理的リガンド結合
部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やイン
バースアゴニスト（受容体のいずれかの部位に結合して
コンフォメーションを変化させ、受容体を不活性化する
物質）をも包含するものとする。
るリガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リ
ガンドのスクリーニング方法を提供する。本明細書にお
いて「リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的
（即ち、「ネイティブ（＝native）」）リガンドだけで
なく、アゴニスト（即ち、受容体の生理的リガンド結合
部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やイン
バースアゴニスト（受容体のいずれかの部位に結合して
コンフォメーションを変化させ、受容体を不活性化する
物質）をも包含するものとする。
【００１７】本発明のスクリーニング系は、C-PLACE100
3238又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにＧiフ
ァミリーに属するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドを、必須の構
成要素として少なくとも含むことを特徴とする。ここで
「C-PLACE1003238」とは、配列番号１記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチドをいい、「その均等物」とは、
該アミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が
置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列
からなり、C-PLACE1003238と同等のリガンド−受容体相
互作用を示し、且つＧiファミリーに属するＧ蛋白質α
サブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴ
Ｐ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをい
う。例えば、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒ
ト以外の哺乳動物由来のC-PLACE1003238に対応するＧＰ
ＣＲが挙げられ、これらは、哺乳動物の泌尿器系組織、
胎盤、扁桃等の組織由来の膜含有画分から、抗C-PLACE1
003238抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー
により単離することができる。あるいは、当該組織由来
のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリ
ーから、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンをプローブ
として単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター
中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細
胞培養物の膜含有画分から抗C-PLACE1003238抗体や、Hi
s-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製することもできる。また、当該均等物
は、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンを基に、部位特
異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入し
たものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ド
メイン、好ましくはさらにインバースアゴニストが結合
し得る細胞外ループ及びＮ末端鎖は高度に保存されてい
る必要があるので、このような領域には変異を導入しな
いことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、
当業者はC-PLACE1003238の特性を変化させない範囲で、
C-PLACE1003238に適宜変異を導入することができる。
3238又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにＧiフ
ァミリーに属するＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドを、必須の構
成要素として少なくとも含むことを特徴とする。ここで
「C-PLACE1003238」とは、配列番号１記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチドをいい、「その均等物」とは、
該アミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が
置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列
からなり、C-PLACE1003238と同等のリガンド−受容体相
互作用を示し、且つＧiファミリーに属するＧ蛋白質α
サブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴ
Ｐ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをい
う。例えば、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒ
ト以外の哺乳動物由来のC-PLACE1003238に対応するＧＰ
ＣＲが挙げられ、これらは、哺乳動物の泌尿器系組織、
胎盤、扁桃等の組織由来の膜含有画分から、抗C-PLACE1
003238抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー
により単離することができる。あるいは、当該組織由来
のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリ
ーから、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンをプローブ
として単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター
中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細
胞培養物の膜含有画分から抗C-PLACE1003238抗体や、Hi
s-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製することもできる。また、当該均等物
は、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンを基に、部位特
異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入し
たものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ド
メイン、好ましくはさらにインバースアゴニストが結合
し得る細胞外ループ及びＮ末端鎖は高度に保存されてい
る必要があるので、このような領域には変異を導入しな
いことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、
当業者はC-PLACE1003238の特性を変化させない範囲で、
C-PLACE1003238に適宜変異を導入することができる。
【００１８】C-PLACE1003238又はその均等物を保持する
脂質二重層膜の由来は、当該受容体ポリペプチドがC-PL
ACE1003238の本来の立体構造をとることができる限り特
に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サ
ル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有す
る画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるい
は該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞
膜画分が挙げられる。しかしながら、例えば、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール
等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の
細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法
により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実
施態様において好ましく使用され得る。
脂質二重層膜の由来は、当該受容体ポリペプチドがC-PL
ACE1003238の本来の立体構造をとることができる限り特
に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サ
ル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有す
る画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるい
は該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞
膜画分が挙げられる。しかしながら、例えば、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール
等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の
細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法
により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実
施態様において好ましく使用され得る。
【００１９】Ｇiファミリーに属するＧα（以下、Ｇiα
ともいう）の種類も特に制限はないが、好ましくはアデ
ニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を抑制するＧ
i-1α、Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzα等が挙げられ
る。本発明のＧiαを含むポリペプチドは、少なくとも
ＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧ
αのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有
することが必要である。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果
等から、ＧＰＣＲとの結合にはＣ末端の約５アミノ酸程
度の配列が重要であり、一方、グアニンヌクレオチド結
合領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同
な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ'ボックス、Ｇ
ボックス、Ｇ"ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、
並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリッ
クスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明ら
かになっている。C-PLACE1003238に対する生理的リガン
ド又はアゴニストが該受容体に結合すると、該受容体の
Ｇα活性化ドメインとＧiαのＧＰＣＲ結合領域とが相
互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、グア
ニンヌクレオチド結合領域からＧＤＰが解離して速やか
にＧＴＰを結合する。一方、インバースアゴニストが結
合すると、受容体のコンフォメーション変化によりＧα
活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα
−ＧＴＰレベルが減少する。ここで、ＧＴＰの代わりに
35Ｓ標識したＧＴＰγＳ（ＧαのＧＴＰａｓｅ活性によ
って加水分解を受けないＧＴＰアナログ）を系に添加し
ておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合し
た放射活性を測定・比較することにより、C-PLACE10032
38のアゴニスト又はインバースアゴニストをスクリーニ
ングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射
活性が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放
射活性が減少すればインバースアゴニストである。
ともいう）の種類も特に制限はないが、好ましくはアデ
ニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を抑制するＧ
i-1α、Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzα等が挙げられ
る。本発明のＧiαを含むポリペプチドは、少なくとも
ＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧ
αのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有
することが必要である。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果
等から、ＧＰＣＲとの結合にはＣ末端の約５アミノ酸程
度の配列が重要であり、一方、グアニンヌクレオチド結
合領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同
な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ'ボックス、Ｇ
ボックス、Ｇ"ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、
並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリッ
クスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明ら
かになっている。C-PLACE1003238に対する生理的リガン
ド又はアゴニストが該受容体に結合すると、該受容体の
Ｇα活性化ドメインとＧiαのＧＰＣＲ結合領域とが相
互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、グア
ニンヌクレオチド結合領域からＧＤＰが解離して速やか
にＧＴＰを結合する。一方、インバースアゴニストが結
合すると、受容体のコンフォメーション変化によりＧα
活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα
−ＧＴＰレベルが減少する。ここで、ＧＴＰの代わりに
35Ｓ標識したＧＴＰγＳ（ＧαのＧＴＰａｓｅ活性によ
って加水分解を受けないＧＴＰアナログ）を系に添加し
ておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合し
た放射活性を測定・比較することにより、C-PLACE10032
38のアゴニスト又はインバースアゴニストをスクリーニ
ングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射
活性が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放
射活性が減少すればインバースアゴニストである。
【００２０】C-PLACE1003238のリガンドの活性は、Ｇi
αを含むポリペプチドの効果器への作用を指標として測
定することもできる。この場合、本発明のスクリーニン
グ系は、C-PLACE1003238又はその均等物に加えて、さら
に効果器を含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要
がある。また、Ｇiαを含むポリペプチドは該効果器と
相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該
領域はＧiα自身の効果器相互作用領域であってもよい
し、別のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域
であってもよい。別のファミリーに属するＧαとしては
Ｇqα、Ｇsα、Ｇ12α等が挙げられる。別のファミリー
に属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋白質
の最も簡便な例としては、別のファミリーに属するＧα
のＣ末端の約５アミノ酸程度を、ＧiαのＣ末端配列で
置換したものが挙げられる。
αを含むポリペプチドの効果器への作用を指標として測
定することもできる。この場合、本発明のスクリーニン
グ系は、C-PLACE1003238又はその均等物に加えて、さら
に効果器を含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要
がある。また、Ｇiαを含むポリペプチドは該効果器と
相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該
領域はＧiα自身の効果器相互作用領域であってもよい
し、別のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域
であってもよい。別のファミリーに属するＧαとしては
Ｇqα、Ｇsα、Ｇ12α等が挙げられる。別のファミリー
に属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋白質
の最も簡便な例としては、別のファミリーに属するＧα
のＣ末端の約５アミノ酸程度を、ＧiαのＣ末端配列で
置換したものが挙げられる。
【００２１】Ｇiαを含むポリペプチドが、Ｇiα自身の
効果器相互作用領域を含む場合、使用するサブファミリ
ーに対応する効果器を適宜選択して使用する必要がある
が、Ｇi-1α、Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzαを使用す
る場合は、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含む脂
質二重層膜が用いられる。一方、Ｇiαを含むポリペプ
チドが、Ｇqαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋白
質の場合は、効果器としてホスホリパーゼＣを含む脂質
二重層膜を用いる必要がある。尚、Ｇiαを含むポリペ
プチドが、Ｇsαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋
白質の場合は、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含
む脂質二重層膜が用いられ、Ｇiαの場合とは逆に、ア
デニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガン
ド活性が評価される。
効果器相互作用領域を含む場合、使用するサブファミリ
ーに対応する効果器を適宜選択して使用する必要がある
が、Ｇi-1α、Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzαを使用す
る場合は、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含む脂
質二重層膜が用いられる。一方、Ｇiαを含むポリペプ
チドが、Ｇqαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋白
質の場合は、効果器としてホスホリパーゼＣを含む脂質
二重層膜を用いる必要がある。尚、Ｇiαを含むポリペ
プチドが、Ｇsαの効果器相互作用領域を含むキメラ蛋
白質の場合は、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含
む脂質二重層膜が用いられ、Ｇiαの場合とは逆に、ア
デニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガン
ド活性が評価される。
【００２２】効果器としてアデニル酸シクラーゼ（以
下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系において
は、Ｇiαを含むポリペプチドの効果器への作用は、Ａ
Ｃ活性を直接測定することにより評価することができ
る。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いても
よく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生
成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（
125Ｉ）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で
標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定す
る方法や、ＡＣを含む膜画分に［α-32Ｐ］ＡＴＰを添
加し、生成する［32Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で
分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、
これに限定されない。被験物質の存在下及び非存在下で
ＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が
増加すれば該被験物質はC-PLACE1003238のインバースア
ゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。
下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系において
は、Ｇiαを含むポリペプチドの効果器への作用は、Ａ
Ｃ活性を直接測定することにより評価することができ
る。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いても
よく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生
成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（
125Ｉ）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で
標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定す
る方法や、ＡＣを含む膜画分に［α-32Ｐ］ＡＴＰを添
加し、生成する［32Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で
分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、
これに限定されない。被験物質の存在下及び非存在下で
ＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が
増加すれば該被験物質はC-PLACE1003238のインバースア
ゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。
【００２３】スクリーニング系として無傷動物細胞を用
いる場合は、Ｇiαを含むポリペプチドのＡＣへの作用
は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を
［3Ｈ］アデニンで標識し、生成した［3Ｈ］ｃＡＭＰの
放射活性を測定することによっても評価することができ
る。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在
下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破
砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッ
セイを実施することにより測定することができるが、公
知の他のいかなる方法も使用することができる。
いる場合は、Ｇiαを含むポリペプチドのＡＣへの作用
は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を
［3Ｈ］アデニンで標識し、生成した［3Ｈ］ｃＡＭＰの
放射活性を測定することによっても評価することができ
る。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在
下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破
砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッ
セイを実施することにより測定することができるが、公
知の他のいかなる方法も使用することができる。
【００２４】別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応
答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝
子の発現量を測定することにより、評価する方法もあ
る。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述
するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流
にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現
カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験
物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を
破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発
現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細
胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝
子の発現量を測定することにより、評価する方法もあ
る。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述
するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流
にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現
カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験
物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を
破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発
現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細
胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
【００２５】従って、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭ
Ｐ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の
発現量）が増加すれば、該被験物質はC-PLACE1003238の
インバースアゴニストであり、減少すればアゴニストで
ある。
Ｐ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の
発現量）が増加すれば、該被験物質はC-PLACE1003238の
インバースアゴニストであり、減少すればアゴニストで
ある。
【００２６】一方、効果器としてホスホリパーゼＣ（以
下、ＰＬＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、
Ｇiαを含むポリペプチドがＧqαの効果器相互作用領域
を含むキメラ蛋白質の場合）においては、該キメラＧα
ポリペプチドの効果器への作用は、ＰＬＣ活性を直接測
定することにより評価することができる。ＰＬＣ活性
は、例えば、3Ｈ標識したホスファチジルイノシトール
−４，５−二リン酸をＰＬＣ含有膜画分に添加し、生成
するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定
することにより評価することができる。被験物質の存在
下及び非存在下でＰＬＣ活性を測定・比較し、被験物質
存在下でＰＬＣ活性が増加すれば該被験物質はC-PLACE1
003238のアゴニストであり、活性が減少すればインバー
スアゴニストである。
下、ＰＬＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、
Ｇiαを含むポリペプチドがＧqαの効果器相互作用領域
を含むキメラ蛋白質の場合）においては、該キメラＧα
ポリペプチドの効果器への作用は、ＰＬＣ活性を直接測
定することにより評価することができる。ＰＬＣ活性
は、例えば、3Ｈ標識したホスファチジルイノシトール
−４，５−二リン酸をＰＬＣ含有膜画分に添加し、生成
するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定
することにより評価することができる。被験物質の存在
下及び非存在下でＰＬＣ活性を測定・比較し、被験物質
存在下でＰＬＣ活性が増加すれば該被験物質はC-PLACE1
003238のアゴニストであり、活性が減少すればインバー
スアゴニストである。
【００２７】スクリーニング系として無傷動物細胞を用
いる場合は、Ｇiα−ＧqαキメラポリペプチドのＰＬＣ
への作用は、細胞に［3Ｈ］イノシトールを添加し、生
成した［3Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定し
たり、細胞内のＣａ2+量を測定することによっても評価
することができる。細胞内Ｃａ2+量は、被験物質の存在
下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした
後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium
-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウ
ム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定す
ることができるが、公知の他のいかなる方法を使用して
もよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装
置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙
げられる。
いる場合は、Ｇiα−ＧqαキメラポリペプチドのＰＬＣ
への作用は、細胞に［3Ｈ］イノシトールを添加し、生
成した［3Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定し
たり、細胞内のＣａ2+量を測定することによっても評価
することができる。細胞内Ｃａ2+量は、被験物質の存在
下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした
後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium
-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウ
ム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定す
ることができるが、公知の他のいかなる方法を使用して
もよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装
置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙
げられる。
【００２８】別の態様として、Ｃａ2+によりアップレギ
ュレートされるＴＰＡ（12−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−13−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の
制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定すること
により、Ｃａ2+量を評価する方法もある。ここで使用さ
れる発現ベクターについては後に詳述するが、概説する
と、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白
質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベ
クターを導入された動物細胞を、被験物質の存在下及び
非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた
抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を
用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ2+量を評
価するというものである。
ュレートされるＴＰＡ（12−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−13−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の
制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定すること
により、Ｃａ2+量を評価する方法もある。ここで使用さ
れる発現ベクターについては後に詳述するが、概説する
と、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白
質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベ
クターを導入された動物細胞を、被験物質の存在下及び
非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた
抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を
用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ2+量を評
価するというものである。
【００２９】従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ2+
量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発
現量）が増加すれば、該被験物質はC-PLACE1003238のア
ゴニストであり、減少すればインバースアゴニストであ
る。
量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発
現量）が増加すれば、該被験物質はC-PLACE1003238のア
ゴニストであり、減少すればインバースアゴニストであ
る。
【００３０】本発明のスクリーニング法に供される被験
物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であっても
よく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用
いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファー
ジディスプレイ法により作製されたランダムペプチドラ
イブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来
の天然成分等が挙げられる。
物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であっても
よく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用
いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファー
ジディスプレイ法により作製されたランダムペプチドラ
イブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来
の天然成分等が挙げられる。
【００３１】本発明のスクリーニング法のために提供さ
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系の好ましい一実施態様は、C-PL
ACE1003238又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターと、ＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿
主動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の
膜画分である。
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系の好ましい一実施態様は、C-PL
ACE1003238又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターと、ＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領
域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関
与する領域を少なくとも含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿
主動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の
膜画分である。
【００３２】「C-PLACE1003238又はその均等物をコード
するＤＮＡ」は、配列番号１記載のアミノ酸配列からな
るポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加また
は修飾されたアミノ酸配列からなり、C-PLACE1003238と
同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧiαと
共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促
進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡで
あれば特に制限はない。C-PLACE1003238 ｃＤＮＡのコ
ーディング領域（配列番号２）の他、ウシ、ブタ、サ
ル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のC-PL
ACE1003238に対応するＧＰＣＲをコードするＤＮＡ等が
例示され、これらは、哺乳動物の泌尿器系組織、胎盤、
扁桃等の組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノ
ミックライブラリーから、C-PLACE1003238のｃＤＮＡク
ローンをプローブとして単離され得る。また、当該均等
物は、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンを基に、部位
特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入
したものであってもよい。
するＤＮＡ」は、配列番号１記載のアミノ酸配列からな
るポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加また
は修飾されたアミノ酸配列からなり、C-PLACE1003238と
同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧiαと
共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促
進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡで
あれば特に制限はない。C-PLACE1003238 ｃＤＮＡのコ
ーディング領域（配列番号２）の他、ウシ、ブタ、サ
ル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のC-PL
ACE1003238に対応するＧＰＣＲをコードするＤＮＡ等が
例示され、これらは、哺乳動物の泌尿器系組織、胎盤、
扁桃等の組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノ
ミックライブラリーから、C-PLACE1003238のｃＤＮＡク
ローンをプローブとして単離され得る。また、当該均等
物は、C-PLACE1003238のｃＤＮＡクローンを基に、部位
特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入
したものであってもよい。
【００３３】Ｇiαの種類には特に制限はないが、好ま
しくはアデニル酸シクラーゼを効果器とするＧi-1α、
Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzα等が挙げられる。これ
らのＧ iα遺伝子は公知であり、容易に入手可能であ
る。Ｇiαを含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、
少なくともＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域を
コードする配列と、任意のＧαのグアニンヌクレオチド
との結合に関与する領域をコードする配列を有すること
が必要である。上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の
結果から、ＧＰＣＲ結合領域及びグアニンヌクレオチド
結合領域はよく知られており、当業者は、所望によりＧ
iαのコーディング配列の一部を欠失したフラグメント
を容易に構築することができる。
しくはアデニル酸シクラーゼを効果器とするＧi-1α、
Ｇi-2α、Ｇi-3αあるいはＧzα等が挙げられる。これ
らのＧ iα遺伝子は公知であり、容易に入手可能であ
る。Ｇiαを含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、
少なくともＧiαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域を
コードする配列と、任意のＧαのグアニンヌクレオチド
との結合に関与する領域をコードする配列を有すること
が必要である。上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の
結果から、ＧＰＣＲ結合領域及びグアニンヌクレオチド
結合領域はよく知られており、当業者は、所望によりＧ
iαのコーディング配列の一部を欠失したフラグメント
を容易に構築することができる。
【００３４】効果器としてホスホリパーゼＣを用いる本
発明のスクリーニング方法のために提供されるスクリー
ニング系においては、Ｇiαを含むポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、Ｇqαの効果器相互作用領域のコード
するヌクレオチド配列をさらに含むキメラＤＮＡである
必要がある。Ｇqαの種類としてはＧq、ＧL1α、ＧL2α
のＧ16α等が挙げられる。これらの遺伝子は公知であ
り、容易に入手可能である。また、Ｇqαの効果器相互
作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知
の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容
易にＧiα−Ｇqαキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを構
築することができる。当該キメラ蛋白質をコードするＤ
ＮＡの最も簡便な例としては、ＧqαのｃＤＮＡのＣ末
端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知
の手法を用いてＧiαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ
配列に置換したものが挙げられる。
発明のスクリーニング方法のために提供されるスクリー
ニング系においては、Ｇiαを含むポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、Ｇqαの効果器相互作用領域のコード
するヌクレオチド配列をさらに含むキメラＤＮＡである
必要がある。Ｇqαの種類としてはＧq、ＧL1α、ＧL2α
のＧ16α等が挙げられる。これらの遺伝子は公知であ
り、容易に入手可能である。また、Ｇqαの効果器相互
作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知
の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容
易にＧiα−Ｇqαキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを構
築することができる。当該キメラ蛋白質をコードするＤ
ＮＡの最も簡便な例としては、ＧqαのｃＤＮＡのＣ末
端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知
の手法を用いてＧiαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ
配列に置換したものが挙げられる。
【００３５】C-PLACE1003238又はその均等物をコードす
るＤＮＡ、及びＧiαを含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡは、宿主哺乳動物細胞内でプロモーター活性を発
揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければ
ならない。使用されるプロモーターは、哺乳動物細胞内
で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、
ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス
ＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来
ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイ
ルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモー
ター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺
伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプ
ロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクター
は、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シ
グナル、すなわちターミネーター領域を含有することが
好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間
にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限
酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切
断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ま
しい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子
（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺
伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有して
いてもよい。
るＤＮＡ、及びＧiαを含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡは、宿主哺乳動物細胞内でプロモーター活性を発
揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければ
ならない。使用されるプロモーターは、哺乳動物細胞内
で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、
ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス
ＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来
ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイ
ルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモー
ター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺
伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプ
ロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクター
は、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シ
グナル、すなわちターミネーター領域を含有することが
好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間
にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限
酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切
断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ま
しい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子
（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺
伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有して
いてもよい。
【００３６】本発明のスクリーニング系に使用されるベ
クターとしては、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイ
ルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイ
ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
クターとしては、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイ
ルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイ
ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３７】C-PLACE1003238又はその均等物をコードす
るＤＮＡと、Ｇiαを含むポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主
細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、
１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシ
ストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されても
よい。
るＤＮＡと、Ｇiαを含むポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主
細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、
１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシ
ストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されても
よい。
【００３８】宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラッ
ト、ハムスター等の哺乳動物細胞であれば特に制限はな
い。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T
3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO
等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Ver
o等のサル由来細胞、およびHeLa、293等のヒト由来細胞
などが例示される。
ト、ハムスター等の哺乳動物細胞であれば特に制限はな
い。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T
3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO
等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Ver
o等のサル由来細胞、およびHeLa、293等のヒト由来細胞
などが例示される。
【００３９】宿主細胞への遺伝子導入は、哺乳動物細胞
の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて
行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エ
レクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロイン
ジェクション法等が挙げられる。
の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて
行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エ
レクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロイン
ジェクション法等が挙げられる。
【００４０】遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、
約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ME
M）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640
培地、199培地等を用いて培養することができる。培地
のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、
通常約３０〜約４０℃である。
約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ME
M）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640
培地、199培地等を用いて培養することができる。培地
のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、
通常約３０〜約４０℃である。
【００４１】上記のようにして得られる、C-PLACE10032
38又はその均等物をコードするＤＮＡ及びＧiαを含む
ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された動物細胞
は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細
胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で
該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモ
ジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例え
ば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した
後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収す
る）単離される膜画分の形態であってもよい。
38又はその均等物をコードするＤＮＡ及びＧiαを含む
ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された動物細胞
は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細
胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で
該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモ
ジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例え
ば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した
後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収す
る）単離される膜画分の形態であってもよい。
【００４２】例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、効果
器の活性を直接測定することにより、被験物質のリガン
ド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系
は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される
膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡ
ＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ2+量（も
しくはＣａ2+応答性リポーターの発現量）を測定するこ
とにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合に
は、使用するスクリーニング系は無傷動物細胞である。
器の活性を直接測定することにより、被験物質のリガン
ド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系
は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される
膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡ
ＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ2+量（も
しくはＣａ2+応答性リポーターの発現量）を測定するこ
とにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合に
は、使用するスクリーニング系は無傷動物細胞である。
【００４３】尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答
性リポーター（効果器がアデニル酸シクラーゼの場合）
もしくはＣａ2+応答性リポーター（効果器がホスホリパ
ーゼＣの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿
主動物細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）また
はＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター
領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機
能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入され
たものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に
遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コン
センサス配列としてTGACGTCAを含む配列が挙げられる
が、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠
失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。
一方、ＴＲＥはＣａ2+の存在下に遺伝子の転写を活性化
するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTG
ACTCAを含む配列が挙げられるが、Ｃａ2+応答性を保持
する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加
を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプ
ロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモ
ーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同
様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用
いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配
列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することがで
きる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター
遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定
量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例え
ば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グル
クロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げら
れるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下
流にはターミネーター配列が配置されることがより好ま
しい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発
現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラス
ミドベクター又はウイルスベクターを使用することがで
きる。
性リポーター（効果器がアデニル酸シクラーゼの場合）
もしくはＣａ2+応答性リポーター（効果器がホスホリパ
ーゼＣの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿
主動物細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）また
はＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター
領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機
能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入され
たものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に
遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コン
センサス配列としてTGACGTCAを含む配列が挙げられる
が、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠
失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。
一方、ＴＲＥはＣａ2+の存在下に遺伝子の転写を活性化
するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTG
ACTCAを含む配列が挙げられるが、Ｃａ2+応答性を保持
する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加
を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプ
ロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモ
ーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同
様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用
いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配
列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することがで
きる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター
遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定
量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例え
ば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グル
クロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げら
れるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下
流にはターミネーター配列が配置されることがより好ま
しい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発
現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラス
ミドベクター又はウイルスベクターを使用することがで
きる。
【００４４】本発明のスクリーニング法のために提供さ
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、C-
PLACE1003238又はその均等物のＣ末端側に、ＧiαのＧ
ＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド
結合領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合
蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトラン
スフェクトした宿主動物細胞、該細胞のホモジネートま
たは該細胞由来の膜画分である。
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、C-
PLACE1003238又はその均等物のＣ末端側に、ＧiαのＧ
ＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド
結合領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合
蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトラン
スフェクトした宿主動物細胞、該細胞のホモジネートま
たは該細胞由来の膜画分である。
【００４５】C-PLACE1003238又はその均等物をコードす
るＤＮＡ、及びＧiαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧ
αのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチド
をコードするＤＮＡは、上述のようにして取得すること
ができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにし
て、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることに
より、C-PLACE1003238とＧiαを含むポリペプチドとの
融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築することができ
る。具体的には、後記実施例１で詳述されるような方法
を使用することができる。簡潔にいえば、ＰＣＲ等を用
いてC-PLACE1003238をコードするＤＮＡの終始コドンを
除去したものに、Ｇiαを含むポリペプチドをコードす
るＤＮＡを読み枠が合うように、即ちインフレームに、
ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。この際、
C-PLACE1003238のＣ末の一部を欠失させたり、C-PLACE1
003238とＧiαとの間にHisタグ等のリンカー配列を挿入
してもよい。
るＤＮＡ、及びＧiαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧ
αのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチド
をコードするＤＮＡは、上述のようにして取得すること
ができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにし
て、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることに
より、C-PLACE1003238とＧiαを含むポリペプチドとの
融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築することができ
る。具体的には、後記実施例１で詳述されるような方法
を使用することができる。簡潔にいえば、ＰＣＲ等を用
いてC-PLACE1003238をコードするＤＮＡの終始コドンを
除去したものに、Ｇiαを含むポリペプチドをコードす
るＤＮＡを読み枠が合うように、即ちインフレームに、
ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。この際、
C-PLACE1003238のＣ末の一部を欠失させたり、C-PLACE1
003238とＧiαとの間にHisタグ等のリンカー配列を挿入
してもよい。
【００４６】得られた融合蛋白質をコードするＤＮＡ
は、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主哺乳
動物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。
得られた動物細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現する
と、受容体の細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメイン
とＧiαの受容体結合領域とは、C-PLACE1003238に対す
る生理的リガンドの非存在下に相互作用して、Ｇαにお
けるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。従って、Ｇ
αは恒常的に活性化された状態となる。
は、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主哺乳
動物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。
得られた動物細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現する
と、受容体の細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメイン
とＧiαの受容体結合領域とは、C-PLACE1003238に対す
る生理的リガンドの非存在下に相互作用して、Ｇαにお
けるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。従って、Ｇ
αは恒常的に活性化された状態となる。
【００４７】受容体−Ｇiα融合蛋白質発現細胞を、Ｇi
αの効果器への作用を指標にしたスクリーニングに使用
する場合において、Ｇiαが受容体と連結していること
が効果器との相互作用の妨げとなる場合には、受容体と
Ｇiαとのジャンクション部位に、特異的なプロテアー
ゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビ
ン感受性配列等）を導入し、融合蛋白質を膜上に発現さ
せた後に当該プロテアーゼを作用させて受容体とＧiα
とを切り離すことができる。
αの効果器への作用を指標にしたスクリーニングに使用
する場合において、Ｇiαが受容体と連結していること
が効果器との相互作用の妨げとなる場合には、受容体と
Ｇiαとのジャンクション部位に、特異的なプロテアー
ゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビ
ン感受性配列等）を導入し、融合蛋白質を膜上に発現さ
せた後に当該プロテアーゼを作用させて受容体とＧiα
とを切り離すことができる。
【００４８】受容体−Ｇiα融合蛋白質発現細胞につい
ても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、
細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択
して用いることができる。
ても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、
細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択
して用いることができる。
【００４９】本発明のスクリーニング法のために提供さ
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系のさらに別の実施態様は、Ｇi
αを内因的に発現する宿主動物細胞を、C-PLACE1003238
又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクター
でトランスフェクトすることにより調製される細胞、該
細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
この場合、Ｇiαを含むポリペプチドはネイティブなＧi
αであるので、効果器としてホスホリパーゼＣを用いる
スクリーニング法には適用できない。
れる、C-PLACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層
膜、及びＧiαを含むポリペプチドを構成要素として含
有するスクリーニング系のさらに別の実施態様は、Ｇi
αを内因的に発現する宿主動物細胞を、C-PLACE1003238
又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクター
でトランスフェクトすることにより調製される細胞、該
細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
この場合、Ｇiαを含むポリペプチドはネイティブなＧi
αであるので、効果器としてホスホリパーゼＣを用いる
スクリーニング法には適用できない。
【００５０】Ｇiαのうち、Ｇi-2αやＧi-3αは広く全
般的な組織で発現しているので、使用する宿主動物細胞
の由来に特に制限はない。C-PLACE1003238又はその均等
物をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入する発現ベクタ
ー、該発現ベクターの宿主細胞への導入法は、上述の通
りのものを使用することができる。
般的な組織で発現しているので、使用する宿主動物細胞
の由来に特に制限はない。C-PLACE1003238又はその均等
物をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入する発現ベクタ
ー、該発現ベクターの宿主細胞への導入法は、上述の通
りのものを使用することができる。
【００５１】本発明のさらに別の態様においては、C-PL
ACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層膜、及びＧ
iαを含むポリペプチドを構成要素として含有するスク
リーニング系として、精製したC-PLACE1003238又はその
均等物とＧiαを含むポリペプチド、あるいは精製した
該受容体とＧiαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜
中に再構成させたものを使用することができる。C-PLAC
E1003238又はその均等物は、ヒト又は他の哺乳動物の泌
尿器系組織、胎盤、扁桃等の組織から得られる膜画分か
ら、抗C-PLACE1003238抗体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィー等により精製することができる。あるい
は、該受容体は、C-PLACE1003238又はその均等物をコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細
胞から、抗C-PLACE1003238抗体や、His-tag、GST-tag等
を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精
製することもできる。同様に、該受容体とＧiαとの融
合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターを導入された組換え細胞から、抗C-PLACE100
3238抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー等により精製することができる。
ACE1003238又はその均等物を含む脂質二重層膜、及びＧ
iαを含むポリペプチドを構成要素として含有するスク
リーニング系として、精製したC-PLACE1003238又はその
均等物とＧiαを含むポリペプチド、あるいは精製した
該受容体とＧiαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜
中に再構成させたものを使用することができる。C-PLAC
E1003238又はその均等物は、ヒト又は他の哺乳動物の泌
尿器系組織、胎盤、扁桃等の組織から得られる膜画分か
ら、抗C-PLACE1003238抗体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィー等により精製することができる。あるい
は、該受容体は、C-PLACE1003238又はその均等物をコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細
胞から、抗C-PLACE1003238抗体や、His-tag、GST-tag等
を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精
製することもできる。同様に、該受容体とＧiαとの融
合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターを導入された組換え細胞から、抗C-PLACE100
3238抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー等により精製することができる。
【００５２】人工脂質二重層膜を構成する脂質として
は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセ
リン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジ
ルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上
を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセ
リン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジ
ルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上
を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
【００５３】例えば、受容体とＧiα、又は受容体−Ｇi
α融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオ
リポソーム）は、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の
混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分
取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質を
フィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸
濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸
ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて
脂質を完全に懸濁する。ここに、精製した受容体とＧi
α、又は受容体−Ｇiα融合蛋白質を、適量添加し、氷
中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベー
トした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，
０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収するこ
とにより、プロテオリポソームを調製することができ
る。
α融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオ
リポソーム）は、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の
混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分
取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質を
フィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸
濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸
ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて
脂質を完全に懸濁する。ここに、精製した受容体とＧi
α、又は受容体−Ｇiα融合蛋白質を、適量添加し、氷
中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベー
トした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，
０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収するこ
とにより、プロテオリポソームを調製することができ
る。
【００５４】本発明はまた、泌尿器、胎盤又は扁桃等の
組織における疾患の予防及び治療に有効な化合物のスク
リーニング方法を提供する。後記実施例の参考例１に示
される通り、C-PLACE1003238は、膀胱、前立腺、尿管等
の泌尿器系組織、胎盤及び扁桃で比較的高発現している
ことから、C-PLACE1003238に対するリガンドは、これら
の組織における疾患又は症状、例えば、前立腺肥大症
や、上気道炎、肺炎、気管支炎、肺結核等による痰の蓄
積、喘息、前立腺癌、膀胱癌、肺癌等の予防及び治療に
有効であると考えられる。これらの疾患又は症状に対す
る治療活性を有するリガンドは、適当な添加剤と組み合
わせることにより、当該疾患の予防及び治療剤とするこ
とができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリー
ニング法により選抜されたC-PLACE1003238に対するリガ
ンドと、医薬上許容される担体とを配合させることによ
る、泌尿器、胎盤又は扁桃等の組織における疾患の予防
及び治療剤、より詳細には、前立腺肥大症の治療薬、去
痰剤、喘息治療薬、抗癌剤等の製造方法を提供する。
組織における疾患の予防及び治療に有効な化合物のスク
リーニング方法を提供する。後記実施例の参考例１に示
される通り、C-PLACE1003238は、膀胱、前立腺、尿管等
の泌尿器系組織、胎盤及び扁桃で比較的高発現している
ことから、C-PLACE1003238に対するリガンドは、これら
の組織における疾患又は症状、例えば、前立腺肥大症
や、上気道炎、肺炎、気管支炎、肺結核等による痰の蓄
積、喘息、前立腺癌、膀胱癌、肺癌等の予防及び治療に
有効であると考えられる。これらの疾患又は症状に対す
る治療活性を有するリガンドは、適当な添加剤と組み合
わせることにより、当該疾患の予防及び治療剤とするこ
とができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリー
ニング法により選抜されたC-PLACE1003238に対するリガ
ンドと、医薬上許容される担体とを配合させることによ
る、泌尿器、胎盤又は扁桃等の組織における疾患の予防
及び治療剤、より詳細には、前立腺肥大症の治療薬、去
痰剤、喘息治療薬、抗癌剤等の製造方法を提供する。
【００５５】医薬上許容される担体としては、例えば、
ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グ
ルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭
酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロ
リドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコ
ール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボ
キシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、
ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊
剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、
ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントー
ル、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレ
ンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナ
トリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存
剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン
酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、
水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ
脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワック
スなどが挙げられるが、それらに限定されるものではな
い。
ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グ
ルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭
酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロ
リドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコ
ール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボ
キシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、
ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊
剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、
ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントー
ル、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレ
ンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナ
トリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存
剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン
酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、
水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ
脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワック
スなどが挙げられるが、それらに限定されるものではな
い。
【００５６】経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩
水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガン
ドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒と
して含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適
当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液
剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒
中に分散させ乳化させた乳剤等である。
水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガン
ドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒と
して含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適
当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液
剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒
中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５７】非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉
注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤として
は、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、
これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含ま
れていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁
液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、
安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、
コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤
とすることもできる。当該リガンド製剤は、アンプルや
バイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ
容器に封入することができる。また、リガンドおよび医
薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無
菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存す
ることもできる。
注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤として
は、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、
これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含ま
れていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁
液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、
安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、
コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤
とすることもできる。当該リガンド製剤は、アンプルや
バイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ
容器に封入することができる。また、リガンドおよび医
薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無
菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存す
ることもできる。
【００５８】ヒト由来の生体試料、特に泌尿器、胎盤又
は扁桃等のC-PLACE1003238高発現組織由来の生体試料
（例えば、剖検サンプル、尿、血液、唾液、精液等）か
ら単離された被験物質群をスクリーニングして得られた
C-PLACE1003238に対するリガンドは、これらの組織にお
ける疾患の疾患マーカーとなり得る。そこで、C-PLACE1
003238に対するリガンドであると認定された生体物質に
ついて、泌尿器、胎盤又は扁桃等由来の生体試料中での
存在量を、当該組織に疾患を有する患者と正常人とで測
定し、正常人に比べて患者において体内濃度が有意に増
加もしくは減少しているリガンドを抽出することによ
り、当該疾患の疾患マーカーを同定することができる。
は扁桃等のC-PLACE1003238高発現組織由来の生体試料
（例えば、剖検サンプル、尿、血液、唾液、精液等）か
ら単離された被験物質群をスクリーニングして得られた
C-PLACE1003238に対するリガンドは、これらの組織にお
ける疾患の疾患マーカーとなり得る。そこで、C-PLACE1
003238に対するリガンドであると認定された生体物質に
ついて、泌尿器、胎盤又は扁桃等由来の生体試料中での
存在量を、当該組織に疾患を有する患者と正常人とで測
定し、正常人に比べて患者において体内濃度が有意に増
加もしくは減少しているリガンドを抽出することによ
り、当該疾患の疾患マーカーを同定することができる。
【００５９】このようにして複数の疾患マーカーが同定
されれば、泌尿器、胎盤又は扁桃等の組織由来の生体試
料中での各マーカーの存在量を測定することにより、発
症の有無、将来の発症リスク、病気の進行度、症状のタ
イプ、適合する治療薬等を診断することができる。
されれば、泌尿器、胎盤又は扁桃等の組織由来の生体試
料中での各マーカーの存在量を測定することにより、発
症の有無、将来の発症リスク、病気の進行度、症状のタ
イプ、適合する治療薬等を診断することができる。
【００６０】本発明はまた、C-PLACE1003238のAsn-12か
らLeu-36までの２５アミノ酸配列（配列番号２０）又は
C-PLACE1003238均等物の対応するアミノ酸配列と特異的
親和性を有する抗体を提供する。該抗体は、C-PLACE100
3238を特異的に認識する抗体であることから、C-PLACE
が関与する疾患の疾患マーカーとして、また当該疾患の
予防及び治療剤（C-PLACE1003238発現細胞へのターゲッ
ティングの役割を担う場合を含む）として、有効に用い
られる。
らLeu-36までの２５アミノ酸配列（配列番号２０）又は
C-PLACE1003238均等物の対応するアミノ酸配列と特異的
親和性を有する抗体を提供する。該抗体は、C-PLACE100
3238を特異的に認識する抗体であることから、C-PLACE
が関与する疾患の疾患マーカーとして、また当該疾患の
予防及び治療剤（C-PLACE1003238発現細胞へのターゲッ
ティングの役割を担う場合を含む）として、有効に用い
られる。
【００６１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。
説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。
【００６２】参考例１ ヒト組織におけるC-PLACE10032
38の発現分布 発現組織特異性の検討を目的として、市販（Clontechあ
るいはBiochain）の組織由来ｃＤＮＡパネルを用いた半
定量ＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列
は、センス：5'-GTCAAGCCATTTGGGGACTCTCGGA-3'（配列
番号３）、アンチセンス：5'-CGTATGCCATTTGACCCCCAAAG
GA-3'（配列番号４）である。ＰＣＲはPE9600（アプラ
イド・バイオシステムズ）を利用し、KOD-Dash（東洋紡
績）を用いて９４℃、１分／（９８℃、１０秒／７２
℃、３０秒）×３５サイクルの条件で実施した。内部標
準として使用したＧ３ＰＤＨについては、AmpliTaq（ア
プライド・バイオシステムズ）を用いて９４℃、１分／
（９４℃、３０秒／６０℃、４５秒／７２℃、２分）×
２５サイクル／７２℃、７分の条件で行った。結果を図
１に示す。
38の発現分布 発現組織特異性の検討を目的として、市販（Clontechあ
るいはBiochain）の組織由来ｃＤＮＡパネルを用いた半
定量ＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列
は、センス：5'-GTCAAGCCATTTGGGGACTCTCGGA-3'（配列
番号３）、アンチセンス：5'-CGTATGCCATTTGACCCCCAAAG
GA-3'（配列番号４）である。ＰＣＲはPE9600（アプラ
イド・バイオシステムズ）を利用し、KOD-Dash（東洋紡
績）を用いて９４℃、１分／（９８℃、１０秒／７２
℃、３０秒）×３５サイクルの条件で実施した。内部標
準として使用したＧ３ＰＤＨについては、AmpliTaq（ア
プライド・バイオシステムズ）を用いて９４℃、１分／
（９４℃、３０秒／６０℃、４５秒／７２℃、２分）×
２５サイクル／７２℃、７分の条件で行った。結果を図
１に示す。
【００６３】C-PLACE1003238は、尿管、膀胱、前立腺、
胎盤及び扁桃で比較的強い発現が認められ、精巣、胸腺
でも発現が認められた。循環器系では、動脈、静脈、心
嚢で発現が認められ、左心房でもわずかに発現が認めら
れた。
胎盤及び扁桃で比較的強い発現が認められ、精巣、胸腺
でも発現が認められた。循環器系では、動脈、静脈、心
嚢で発現が認められ、左心房でもわずかに発現が認めら
れた。
【００６４】実施例１ ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現
プラスミドの構築 C-PLACE1003238とＧαの融合蛋白質を発現させるプラス
ミドは以下の方法で構築した。まず、ヒトＧα（Ｇ16α
およびＧi-2α）の全コーディング領域を発現ベクターp
cDNA3.1(+)にＰＣＲクローニングした。さらに、ＰＣＲ
反応を利用し、Ｇαコーディング領域の直前に６×His
タグを含む配列を付加したpcHISGα16およびpcHISGαi2
を作製した。即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）を２
０倍に希釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。増幅反
応は、２０μｌの反応液でKOD-plus（TOYOBO）に添付の
反応バッファーを使用した。Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅す
るためにはプライマーGNA15F1（配列番号５）とGNA15R1
（配列番号６）を、またＧi-2αを増幅するためにはプ
ライマーGNAi2F1（配列番号７）とGNAi2R1（配列番号
８）を使用した。増幅は、GeneAmp PCR System 9600（A
pplied Biosystems）を用い、９４℃、２分→（９４
℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクルで行
い、目的のサイズのＰＣＲ産物を得た。各PCR産物の末
端をリン酸化し、アガロースゲルにより分離精製後、発
現プラスミドpcDNA3.1(+)を制限酵素EcoRVで切断し、Ｃ
ＩＡＰ処理したものに挿入した。このようにして得られ
た各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞれ、pcGα16およ
びpcGαi2と命名した。次に、各Ｇ蛋白質のＮ末側にHIS
タグを介してＧＰＣＲを融合することが出来るように、
各Ｇ蛋白質の開始コドンＡＴＧの直前にHISタグ配列を
連結し、さらに制限酵素EcoRVの認識部位を付加した。
即ち、先ず、pcGα16およびpcGαi2それぞれ１０ｎｇを
鋳型として、プライマー（GNA15ATG：配列番号９、GNAi
2ATG：配列番号１０）とベクター部分のプライマー（pc
DNARV：配列番号１１）でＰＣＲを行った。増幅は、９
４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒→６８
℃、６０秒）×２０サイクルで行い、目的の大きさのＰ
ＣＲ産物を得た。次に、HIS2リンカー（配列番号１２）
とHIS2リンカー(R)（配列番号１３）をアニーリング
し、末端をリン酸化後、各ＰＣＲ産物とライゲーション
した。制限酵素EcoRV、XhoIで切断後、目的ＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動で分離、精製した。回収した
ＤＮＡ断片を、EcoRVおよびXhoIで切断した発現プラス
ミドpcDNA3.1(+)に挿入した。このようにして得られた
プラスミドをそれぞれpcHISGα16およびpcHISGαi2と命
名した。pcHISGα16中に含まれる挿入ｃＤＮＡ配列を配
列番号１４に、該配列にコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列を配列番号１５にそれぞれ示す。またpcHISG
αi2中に含まれる挿入ｃＤＮＡ配列を配列番号１６に、
該配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配
列番号１７にそれぞれ示す。またpcHISGα16およびpcHI
SGαi2の構築の工程を図２に示す。
プラスミドの構築 C-PLACE1003238とＧαの融合蛋白質を発現させるプラス
ミドは以下の方法で構築した。まず、ヒトＧα（Ｇ16α
およびＧi-2α）の全コーディング領域を発現ベクターp
cDNA3.1(+)にＰＣＲクローニングした。さらに、ＰＣＲ
反応を利用し、Ｇαコーディング領域の直前に６×His
タグを含む配列を付加したpcHISGα16およびpcHISGαi2
を作製した。即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）を２
０倍に希釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。増幅反
応は、２０μｌの反応液でKOD-plus（TOYOBO）に添付の
反応バッファーを使用した。Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅す
るためにはプライマーGNA15F1（配列番号５）とGNA15R1
（配列番号６）を、またＧi-2αを増幅するためにはプ
ライマーGNAi2F1（配列番号７）とGNAi2R1（配列番号
８）を使用した。増幅は、GeneAmp PCR System 9600（A
pplied Biosystems）を用い、９４℃、２分→（９４
℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクルで行
い、目的のサイズのＰＣＲ産物を得た。各PCR産物の末
端をリン酸化し、アガロースゲルにより分離精製後、発
現プラスミドpcDNA3.1(+)を制限酵素EcoRVで切断し、Ｃ
ＩＡＰ処理したものに挿入した。このようにして得られ
た各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞれ、pcGα16およ
びpcGαi2と命名した。次に、各Ｇ蛋白質のＮ末側にHIS
タグを介してＧＰＣＲを融合することが出来るように、
各Ｇ蛋白質の開始コドンＡＴＧの直前にHISタグ配列を
連結し、さらに制限酵素EcoRVの認識部位を付加した。
即ち、先ず、pcGα16およびpcGαi2それぞれ１０ｎｇを
鋳型として、プライマー（GNA15ATG：配列番号９、GNAi
2ATG：配列番号１０）とベクター部分のプライマー（pc
DNARV：配列番号１１）でＰＣＲを行った。増幅は、９
４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒→６８
℃、６０秒）×２０サイクルで行い、目的の大きさのＰ
ＣＲ産物を得た。次に、HIS2リンカー（配列番号１２）
とHIS2リンカー(R)（配列番号１３）をアニーリング
し、末端をリン酸化後、各ＰＣＲ産物とライゲーション
した。制限酵素EcoRV、XhoIで切断後、目的ＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動で分離、精製した。回収した
ＤＮＡ断片を、EcoRVおよびXhoIで切断した発現プラス
ミドpcDNA3.1(+)に挿入した。このようにして得られた
プラスミドをそれぞれpcHISGα16およびpcHISGαi2と命
名した。pcHISGα16中に含まれる挿入ｃＤＮＡ配列を配
列番号１４に、該配列にコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列を配列番号１５にそれぞれ示す。またpcHISG
αi2中に含まれる挿入ｃＤＮＡ配列を配列番号１６に、
該配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配
列番号１７にそれぞれ示す。またpcHISGα16およびpcHI
SGαi2の構築の工程を図２に示す。
【００６５】次に、C-PLACE1003238発現プラスミド、pM
E-CPLACE（WO 01/09322号公報の実施例１において構築
されるプラスミドと同一物である）を制限酵素HindIII
およびEcoRIで消化し、６．５％ポリアクリルアミド電
気泳動（ＰＡＧＥ）で分離後、約１ｋｂのHindIII-EcoR
I断片（フラグメント１）をゲルより回収した。一方、
１μgのpME-CPLACEを鋳型とし、２種の合成オリゴヌク
レオチド、GPA790M（5'-CAAGCCATTTGGGGACTCTCGGATG-
3'；配列番号１８）およびDelSTOP_Hpa（5'-TTGTTAACAT
CAGTATAATCATAATATATGC-3'；配列番号１９）（キコーテ
ック）をプライマーとして用い、ＤＮＡポリメラーゼEx
Taqを用いた１０サイクルのＰＣＲ反応により、約０．
６５ｋｂの断片を増幅した。この断片をEcoRIおよびHpa
Iで消化した後、６．５％ ＰＡＧＥで分離し、約０．２
６ｋｂのEcoRI-HpaI断片（フラグメント２）をゲルより
回収した。上記pcHISGα16あるいはpcHISGαi2をHindII
IおよびEcoRVで消化し、ＢＡＰ処理による脱リン酸化を
行った後、これをフラグメント１及びフラグメント２と
三者でライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し
た。２種のプライマー、GPA790MおよびFusion#RまたはB
GH#R（キコーテック）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的
のサイズのバンドを生じるクローンを選択した。制限酵
素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものである
ことを確認後、それぞれpcPLACE/Gα16およびpcPLACE/G
αi2と命名した。これらpcPLACE/Gαの構築の工程を図
３に示す。
E-CPLACE（WO 01/09322号公報の実施例１において構築
されるプラスミドと同一物である）を制限酵素HindIII
およびEcoRIで消化し、６．５％ポリアクリルアミド電
気泳動（ＰＡＧＥ）で分離後、約１ｋｂのHindIII-EcoR
I断片（フラグメント１）をゲルより回収した。一方、
１μgのpME-CPLACEを鋳型とし、２種の合成オリゴヌク
レオチド、GPA790M（5'-CAAGCCATTTGGGGACTCTCGGATG-
3'；配列番号１８）およびDelSTOP_Hpa（5'-TTGTTAACAT
CAGTATAATCATAATATATGC-3'；配列番号１９）（キコーテ
ック）をプライマーとして用い、ＤＮＡポリメラーゼEx
Taqを用いた１０サイクルのＰＣＲ反応により、約０．
６５ｋｂの断片を増幅した。この断片をEcoRIおよびHpa
Iで消化した後、６．５％ ＰＡＧＥで分離し、約０．２
６ｋｂのEcoRI-HpaI断片（フラグメント２）をゲルより
回収した。上記pcHISGα16あるいはpcHISGαi2をHindII
IおよびEcoRVで消化し、ＢＡＰ処理による脱リン酸化を
行った後、これをフラグメント１及びフラグメント２と
三者でライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し
た。２種のプライマー、GPA790MおよびFusion#RまたはB
GH#R（キコーテック）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的
のサイズのバンドを生じるクローンを選択した。制限酵
素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものである
ことを確認後、それぞれpcPLACE/Gα16およびpcPLACE/G
αi2と命名した。これらpcPLACE/Gαの構築の工程を図
３に示す。
【００６６】実施例２ 恒常的活性化の評価
導入前日にＣＯＳ−１細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥ
Ｍ／φ１０ｃｍディッシュに１．５×１０6細胞／１０
ｍｌの濃度となるように播種した。遺伝子導入試薬Ｆｕ
ＧＥＮＥ６（ロッシュ）を用い、ディッシュ１枚あたり
５μｇのpME-CPLACE、pcPLACE/Gα16およびpcPLACE/Gα
i2を導入した。コントロールとして、１枚はｃＤＮＡイ
ンサートを含まないベクターpcDNA3.1(+)を導入した。
導入後２４時間後に、各々ディッシュ３枚より膜画分
（１００，０００ｇ遠沈画分）を調製し、以下の
［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験に用いた。［35Ｓ］ＧＴＰ
γＳの結合活性の測定は、以下の方法で行った。即ち、
上記のように調製した膜画分と適当な濃度の［35Ｓ］標
識ＧＴＰγＳを混合し、室温で適当な時間インキュベー
トした後、バキュームマニホールドに装着したグラスフ
ィルター上にアプライした。冷却したバッファーで十分
に洗浄後、グラスフィルターを４ｍｌのＡＣＳIIを入れ
たバイアルに添加し、［35Ｓ］のカウントを液体シンチ
レーションカウンター（パッカード社、TRI-CARB 2700T
R型）で測定した。同時に、反応系に非標識のＧＴＰγ
Ｓを過剰量添加することにより、非特異的な結合を測定
した。非特異的結合を差し引いたカウントを特異的結合
として算出した。結果を図４に示す。
Ｍ／φ１０ｃｍディッシュに１．５×１０6細胞／１０
ｍｌの濃度となるように播種した。遺伝子導入試薬Ｆｕ
ＧＥＮＥ６（ロッシュ）を用い、ディッシュ１枚あたり
５μｇのpME-CPLACE、pcPLACE/Gα16およびpcPLACE/Gα
i2を導入した。コントロールとして、１枚はｃＤＮＡイ
ンサートを含まないベクターpcDNA3.1(+)を導入した。
導入後２４時間後に、各々ディッシュ３枚より膜画分
（１００，０００ｇ遠沈画分）を調製し、以下の
［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験に用いた。［35Ｓ］ＧＴＰ
γＳの結合活性の測定は、以下の方法で行った。即ち、
上記のように調製した膜画分と適当な濃度の［35Ｓ］標
識ＧＴＰγＳを混合し、室温で適当な時間インキュベー
トした後、バキュームマニホールドに装着したグラスフ
ィルター上にアプライした。冷却したバッファーで十分
に洗浄後、グラスフィルターを４ｍｌのＡＣＳIIを入れ
たバイアルに添加し、［35Ｓ］のカウントを液体シンチ
レーションカウンター（パッカード社、TRI-CARB 2700T
R型）で測定した。同時に、反応系に非標識のＧＴＰγ
Ｓを過剰量添加することにより、非特異的な結合を測定
した。非特異的結合を差し引いたカウントを特異的結合
として算出した。結果を図４に示す。
【００６７】その結果、C-PLACE1003238は、Ｇi-2αと
融合させた場合のみ、［35Ｓ］ＧＴＰγＳの結合活性が
上昇した。Ｇ16αとの融合蛋白質では活性の上昇が認め
られなかった。この結果は、C-PLACE1003238がＧiαと
共役する受容体であり、Ｇiαと融合させることによ
り、リガンド非依存的な恒常的活性化が起こったことを
示している。従って、Ｇiαとの融合蛋白質を発現させ
た細胞の膜画分を用いることにより、リガンドが不明な
場合でも阻害剤のスクリーニングが可能である。
融合させた場合のみ、［35Ｓ］ＧＴＰγＳの結合活性が
上昇した。Ｇ16αとの融合蛋白質では活性の上昇が認め
られなかった。この結果は、C-PLACE1003238がＧiαと
共役する受容体であり、Ｇiαと融合させることによ
り、リガンド非依存的な恒常的活性化が起こったことを
示している。従って、Ｇiαとの融合蛋白質を発現させ
た細胞の膜画分を用いることにより、リガンドが不明な
場合でも阻害剤のスクリーニングが可能である。
【００６８】実施例３ 抗体の作製及びそれを用いた免
疫染色 まず、C-PLACE1003238のAsn-12からLeu-36までの２５ア
ミノ酸（NNELHGQESHNSGNRSDGPGKNTTL；配列番号２０）
からなるペプチドをペプチド合成機で合成した。この合
成ペプチドをウシサイログロブリンとコンジュゲートし
た後、２羽のウサギを免疫することにより、抗ペプチド
抗体を作製した。
疫染色 まず、C-PLACE1003238のAsn-12からLeu-36までの２５ア
ミノ酸（NNELHGQESHNSGNRSDGPGKNTTL；配列番号２０）
からなるペプチドをペプチド合成機で合成した。この合
成ペプチドをウシサイログロブリンとコンジュゲートし
た後、２羽のウサギを免疫することにより、抗ペプチド
抗体を作製した。
【００６９】公共のＤＮＡデータベースに対するホモロ
ジー検索の結果、C-PLACE1003238は、部分的ながら、ヒ
ト、ラット、マウス間でアミノ酸配列が類似していた。
そこで、上記ヒト型に対するペプチド抗体を用い、ラッ
トの組織に対する免疫染色を行った。即ち、ＳＤラット
を４％ ＰＦＡで全身灌流固定した後、種々の組織を摘
出し、凍結切片を作製した。凍結切片に対し、上記の方
法で得られた抗血清およびＨＲＰ標識した抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体を用い、抗原抗体反応を行った後、ＨＲＰの発色
基質を添加して、発色を行った。その結果、ラット膀胱
の移行上皮および前立腺の腺上皮で最も強い染色が認め
られた（図５）。
ジー検索の結果、C-PLACE1003238は、部分的ながら、ヒ
ト、ラット、マウス間でアミノ酸配列が類似していた。
そこで、上記ヒト型に対するペプチド抗体を用い、ラッ
トの組織に対する免疫染色を行った。即ち、ＳＤラット
を４％ ＰＦＡで全身灌流固定した後、種々の組織を摘
出し、凍結切片を作製した。凍結切片に対し、上記の方
法で得られた抗血清およびＨＲＰ標識した抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体を用い、抗原抗体反応を行った後、ＨＲＰの発色
基質を添加して、発色を行った。その結果、ラット膀胱
の移行上皮および前立腺の腺上皮で最も強い染色が認め
られた（図５）。
【００７０】実施例４ C-PLACE1003238に対するリガン
ドのスクリーニング 実施例２で作製したC-PLACE1003238−Ｇiα融合蛋白質
発現ＣＯＳ−１細胞から調製した膜画分、およびC-PLAC
E1003238−Ｇiα融合蛋白質非発現ＣＯＳ−１細胞から
調製した膜画分を用いてスクリーニングを行う。即ち、
それぞれの膜画分と適当な濃度の［35Ｓ］ＧＴＰγＳを
混合し、被験物質を添加したものと添加しないものを、
それぞれ室温で適当な時間インキュベートした後、バキ
ュームマニホールドに装着したグラスフィルター上にア
プライし、バッファーで十分に洗浄後、グラスフィルタ
ーを４ｍｌのＡＣＳIIを入れたバイアルに添加し、［35
Ｓ］のカウントを液体シンチレーションカウンター（パ
ッカード社、TRI-CARB 2700TR型）で測定する。同時
に、反応系に非標識のＧＴＰγＳを過剰量添加すること
により、非特異的な結合を測定する。非特異的結合を差
し引いたカウントを特異的結合として算出し、被験物質
を添加したサンプルと添加しないサンプルとで数値を比
較する。C-PLACE1003238−Ｇiα融合蛋白質発現ＣＯＳ
−１細胞から調製した膜画分に対してのみ作用する被験
物質をスクリーニングする。
ドのスクリーニング 実施例２で作製したC-PLACE1003238−Ｇiα融合蛋白質
発現ＣＯＳ−１細胞から調製した膜画分、およびC-PLAC
E1003238−Ｇiα融合蛋白質非発現ＣＯＳ−１細胞から
調製した膜画分を用いてスクリーニングを行う。即ち、
それぞれの膜画分と適当な濃度の［35Ｓ］ＧＴＰγＳを
混合し、被験物質を添加したものと添加しないものを、
それぞれ室温で適当な時間インキュベートした後、バキ
ュームマニホールドに装着したグラスフィルター上にア
プライし、バッファーで十分に洗浄後、グラスフィルタ
ーを４ｍｌのＡＣＳIIを入れたバイアルに添加し、［35
Ｓ］のカウントを液体シンチレーションカウンター（パ
ッカード社、TRI-CARB 2700TR型）で測定する。同時
に、反応系に非標識のＧＴＰγＳを過剰量添加すること
により、非特異的な結合を測定する。非特異的結合を差
し引いたカウントを特異的結合として算出し、被験物質
を添加したサンプルと添加しないサンプルとで数値を比
較する。C-PLACE1003238−Ｇiα融合蛋白質発現ＣＯＳ
−１細胞から調製した膜画分に対してのみ作用する被験
物質をスクリーニングする。
【００７１】
【発明の効果】本発明のスクリーニング系及びスクリー
ニング方法によれば、生理的リガンドの非存在下にC-PL
ACE1003238のアゴニスト又はインバースアゴニストをス
クリーニングすることができ、創薬ターゲットとしての
C-PLACE1003238に実用化の途を開いた点で有用である。
特に、C-PLACE1003238の組織特異的発現を考慮すると、
本発明は、泌尿器系組織、胎盤、扁桃等の組織における
疾患の予防及び治療に有効な化合物、当該疾患の疾患マ
ーカーの探索、当該疾患マーカーを用いた診断方法の開
発に極めて有用である。また、本発明の抗体はC-PLACE1
003238を特異的に認識するので、本受容体が関与する疾
患の疾患マーカーとして、また当該疾患の予防治療剤と
して有用である。
ニング方法によれば、生理的リガンドの非存在下にC-PL
ACE1003238のアゴニスト又はインバースアゴニストをス
クリーニングすることができ、創薬ターゲットとしての
C-PLACE1003238に実用化の途を開いた点で有用である。
特に、C-PLACE1003238の組織特異的発現を考慮すると、
本発明は、泌尿器系組織、胎盤、扁桃等の組織における
疾患の予防及び治療に有効な化合物、当該疾患の疾患マ
ーカーの探索、当該疾患マーカーを用いた診断方法の開
発に極めて有用である。また、本発明の抗体はC-PLACE1
003238を特異的に認識するので、本受容体が関与する疾
患の疾患マーカーとして、また当該疾患の予防治療剤と
して有用である。
【００７２】
【配列表フリーテキスト】配列番号３：C-PLACE1003238
ｍＲＮＡを増幅するためのセンスプライマーとして機
能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：C-PLACE1003238 ｍＲＮＡを増幅するため
のアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号５：Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅するためのセンス
プライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌク
レオチド。 配列番号６：Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号７：Ｇi-2α ｃＤＮＡを増幅するためのセンス
プライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌク
レオチド。 配列番号８：Ｇi-2α ｃＤＮＡを増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号９：pcGα16からＧ16αコード配列を増幅する
ためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされ
たオリゴヌクレオチド。 配列番号１０：pcGαi2からＧi-2αコード配列を増幅す
るためのセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号１１：pcGα16からＧ16αコード配列、およびp
cGαi2からＧi-2αコード配列を増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号１２：EcoRV認識配列および6xHisコード配列か
らなるオリゴヌクレオチド（HIS2 リンカー）。 配列番号１３：6xHisコード配列のアンチセンス鎖から
なるオリゴヌクレオチド（HIS2(R) リンカー）。 配列番号１４：pcHISGα16に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１５：pcHISGα16に含まれるｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列。 配列番号１６：pcHISGαi2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１７：pcHISGαi2に含まれるｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列。 配列番号１８：C-PLACE1003238のＣ末端フラグメント
（０．６５ｋｂ）を増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１９：C-PLACE1003238のＣ末端フラグメント
（０．６５ｋｂ）を増幅するためのアンチセンスプライ
マーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチ
ド。 配列番号２０：抗C-PLACE1003238抗体を製造するための
抗原としてデザインされたオリゴペプチド。
ｍＲＮＡを増幅するためのセンスプライマーとして機
能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：C-PLACE1003238 ｍＲＮＡを増幅するため
のアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号５：Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅するためのセンス
プライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌク
レオチド。 配列番号６：Ｇ16α ｃＤＮＡを増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号７：Ｇi-2α ｃＤＮＡを増幅するためのセンス
プライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌク
レオチド。 配列番号８：Ｇi-2α ｃＤＮＡを増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号９：pcGα16からＧ16αコード配列を増幅する
ためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされ
たオリゴヌクレオチド。 配列番号１０：pcGαi2からＧi-2αコード配列を増幅す
るためのセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号１１：pcGα16からＧ16αコード配列、およびp
cGαi2からＧi-2αコード配列を増幅するためのアンチ
センスプライマーとして機能すべくデザインされたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号１２：EcoRV認識配列および6xHisコード配列か
らなるオリゴヌクレオチド（HIS2 リンカー）。 配列番号１３：6xHisコード配列のアンチセンス鎖から
なるオリゴヌクレオチド（HIS2(R) リンカー）。 配列番号１４：pcHISGα16に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１５：pcHISGα16に含まれるｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列。 配列番号１６：pcHISGαi2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１７：pcHISGαi2に含まれるｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列。 配列番号１８：C-PLACE1003238のＣ末端フラグメント
（０．６５ｋｂ）を増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１９：C-PLACE1003238のＣ末端フラグメント
（０．６５ｋｂ）を増幅するためのアンチセンスプライ
マーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチ
ド。 配列番号２０：抗C-PLACE1003238抗体を製造するための
抗原としてデザインされたオリゴペプチド。
【００７３】
【配列表】
Sequence Listing
<110> Sumitomo Pharmaceuticals
Helix Research Institute
<120> Method for screening of ligand for C-PLACE1003238.
<130> A5351
<160> 18
<210> 1
<211> 358
<212> Prt
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Phe Asn Leu Thr Leu Ala Lys Leu Pro Asn Asn Glu Leu His
1 5 10 15
Gly Gln Glu Ser His Asn Ser Gly Asn Arg Ser Asp Gly Pro Gly Lys
20 25 30
Asn Thr Thr Leu His Asn Glu Phe Asp Thr Ile Val Leu Pro Val Leu
35 40 45
Tyr Leu Ile Ile Phe Val Ala Ser Ile Leu Leu Asn Gly Leu Ala Val
50 55 60
Trp Ile Phe Phe His Ile Arg Asn Lys Thr Ser Phe Ile Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Asn Ile Val Val Ala Asp Leu Ile Met Thr Leu Thr Phe Pro Phe
85 90 95
Arg Ile Val His Asp Ala Gly Phe Gly Pro Trp Tyr Phe Lys Phe Ile
100 105 110
Leu Cys Arg Tyr Thr Ser Val Leu Phe Tyr Ala Asn Met Tyr Thr Ser
115 120 125
Ile Val Phe Leu Gly Leu Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Val Val
130 135 140
Lys Pro Phe Gly Asp Ser Arg Met Tyr Asn Ile Thr Phe Thr Lys Val
145 150 155 160
Leu Ser Val Cys Val Trp Val Ile Met Ala Val Leu Ser Leu Pro Asn
165 170 175
Ile Ile Leu Thr Asn Gly Gln Pro Thr Glu Asp Asn Ile His Asp Cys
180 185 190
Ser Lys Leu Lys Ser Pro Leu Gly Val Lys Trp His Thr Ala Val Thr
195 200 205
Tyr Val Asn Ser Cys Leu Phe Val Ala Val Leu Val Ile Leu Ile Gly
210 215 220
Cys Tyr Ile Ala Ile Ser Arg Tyr Ile His Lys Ser Ser Arg Gln Phe
225 230 235 240
Ile Ser Gln Ser Ser Arg Lys Arg Lys His Asn Gln Ser Ile Arg Val
245 250 255
Val Val Ala Val Phe Phe Thr Cys Phe Leu Pro Tyr His Leu Cys Arg
260 265 270
Ile Pro Phe Thr Phe Ser His Leu Asp Arg Leu Leu Asp Glu Ser Ala
275 280 285
Gln Lys Ile Leu Tyr Tyr Cys Lys Glu Ile Thr Leu Phe Leu Ser Ala
290 295 300
Cys Asn Val Cys Leu Asp Pro Ile Ile Tyr Phe Phe Met Cys Arg Ser
305 310 315 320
Phe Ser Arg Arg Leu Phe Lys Lys Ser Asn Ile Arg Thr Arg Ser Glu
325 330 335
Ser Ile Arg Ser Leu Gln Ser Val Arg Arg Ser Glu Val Arg Ile Tyr
340 345 350
Tyr Asp Tyr Thr Asp Val
355
<210> 2
<211> 1074
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1074)
<400> 1
atg ggg ttc aac ttg acg ctt gca aaa tta cca aat aac gag ctg cac 48
Met Gly Phe Asn Leu Thr Leu Ala Lys Leu Pro Asn Asn Glu Leu His
1 5 10 15
ggc caa gag agt cac aat tca ggc aac agg agc gac ggg cca gga aag 96
Gly Gln Glu Ser His Asn Ser Gly Asn Arg Ser Asp Gly Pro Gly Lys
20 25 30
aac acc acc ctt cac aat gaa ttt gac aca att gtc ttg ccg gtg ctt 144
Asn Thr Thr Leu His Asn Glu Phe Asp Thr Ile Val Leu Pro Val Leu
35 40 45
tat ctc att ata ttt gtg gca agc atc ttg ctg aat ggt tta gca gtg 192
Tyr Leu Ile Ile Phe Val Ala Ser Ile Leu Leu Asn Gly Leu Ala Val
50 55 60
tgg atc ttc ttc cac att agg aat aaa acc agc ttc ata ttc tat ctc 240
Trp Ile Phe Phe His Ile Arg Asn Lys Thr Ser Phe Ile Phe Tyr Leu
65 70 75 80
aaa aac ata gtg gtt gca gac ctc ata atg acg ctg aca ttt cca ttt 288
Lys Asn Ile Val Val Ala Asp Leu Ile Met Thr Leu Thr Phe Pro Phe
85 90 95
cga ata gtc cat gat gca gga ttt gga cct tgg tac ttc aag ttt att 336
Arg Ile Val His Asp Ala Gly Phe Gly Pro Trp Tyr Phe Lys Phe Ile
100 105 110
ctc tgc aga tac act tca gtt ttg ttt tat gca aac atg tat act tcc 384
Leu Cys Arg Tyr Thr Ser Val Leu Phe Tyr Ala Asn Met Tyr Thr Ser
115 120 125
atc gtg ttc ctt ggg ctg ata agc att gat cgc tat ctg aag gtg gtc 432
Ile Val Phe Leu Gly Leu Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Val Val
130 135 140
aag cca ttt ggg gac tct cgg atg tac aac ata acc ttc acg aag gtt 480
Lys Pro Phe Gly Asp Ser Arg Met Tyr Asn Ile Thr Phe Thr Lys Val
145 150 155 160
tta tct gtt tgt gtt tgg gtg atc atg gct gtt ttg tct ttg cca aac 528
Leu Ser Val Cys Val Trp Val Ile Met Ala Val Leu Ser Leu Pro Asn
165 170 175
atc atc ctg aca aat ggt cag cca aca gag gac aat atc cat gac tgc 576
Ile Ile Leu Thr Asn Gly Gln Pro Thr Glu Asp Asn Ile His Asp Cys
180 185 190
tca aaa ctt aaa agt cct ttg ggg gtc aaa tgg cat acg gca gtc acc 624
Ser Lys Leu Lys Ser Pro Leu Gly Val Lys Trp His Thr Ala Val Thr
195 200 205
tat gtg aac agc tgc ttg ttt gtg gcc gtg ctg gtg att ctg atc gga 672
Tyr Val Asn Ser Cys Leu Phe Val Ala Val Leu Val Ile Leu Ile Gly
210 215 220
tgt tac ata gcc ata tcc agg tac atc cac aaa tcc agc agg caa ttc 720
Cys Tyr Ile Ala Ile Ser Arg Tyr Ile His Lys Ser Ser Arg Gln Phe
225 230 235 240
ata agt cag tca agc cga aag cga aaa cat aac cag agc atc agg gtt 768
Ile Ser Gln Ser Ser Arg Lys Arg Lys His Asn Gln Ser Ile Arg Val
245 250 255
gtt gtg gct gtg ttt ttt acc tgc ttt cta cca tat cac ttg tgc aga 816
Val Val Ala Val Phe Phe Thr Cys Phe Leu Pro Tyr His Leu Cys Arg
260 265 270
att cct ttt act ttt agt cac tta gac agg ctt tta gat gaa tct gca 864
Ile Pro Phe Thr Phe Ser His Leu Asp Arg Leu Leu Asp Glu Ser Ala
275 280 285
caa aaa atc cta tat tac tgc aaa gaa att aca ctt ttc ttg tct gcg 912
Gln Lys Ile Leu Tyr Tyr Cys Lys Glu Ile Thr Leu Phe Leu Ser Ala
290 295 300
tgt aat gtt tgc ctg gat cca ata att tac ttt ttc atg tgt agg tca 960
Cys Asn Val Cys Leu Asp Pro Ile Ile Tyr Phe Phe Met Cys Arg Ser
305 310 315 320
ttt tca aga agg ctg ttc aaa aaa tca aat atc aga acc agg agt gaa 1008
Phe Ser Arg Arg Leu Phe Lys Lys Ser Asn Ile Arg Thr Arg Ser Glu
325 330 335
agc atc aga tca ctg caa agt gtg aga aga tcg gaa gtt cgc ata tat 1056
Ser Ile Arg Ser Leu Gln Ser Val Arg Arg Ser Glu Val Arg Ile Tyr
340 345 350
tat gat tat act gat gtg 1074
Tyr Asp Tyr Thr Asp Val
355
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
C-PLACE1003238 mRNA.
<400> 3
gtcaagccat ttggggactc tcgga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for amplifying
C-PLACE1003238 mRNA.
<400> 4
cgtatgccat ttgaccccca aagga 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
G16αcDNA.
<400> 5
ccatggcccg ctcgctgacc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for amplifying
G16αcDNA.
<400> 6
ccgaggctgg agagatagac c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
Gi-2αcDNA.
<400> 7
gcggcggagc ggcggaacg 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for amplifying
Gi-2αcDNA.
<400> 8
ggagaaaagc ggcgggggaa cagg 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
G16αcoding sequence from pcGα16.
<400> 9
atggcccgct cgctgacctg g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
Gi-2αcoding sequence from pcGαi2.
<400> 10
atgggctgca ccgtgagcgc c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for amplifying
G16αcoding sequence from pcGα16 and Gi-2αcoding sequence from
pcGαi2.
<400> 11
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide consisting of EcoRV recognition sequence and 6xHis
coding sequence (HIS2 linker).
<400> 12
gatatccatc atcatcatca ccat 24
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide consisting of antisense strand of 6xHis coding
sequence (HIS2(R) linker).
<400> 12
atggtgatga tgatgatg 18
<210> 14
<211> 1245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert cDNA sequence contained in pcHISGα16.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1245)
<400> 14
atc cat cat cat cat cac cat atg gcc cgc tcg ctg acc tgg cgc tgc 48
Ile His His His His His His Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys
1 5 10 15
tgc ccc tgg tgc ctg acg gag gat gag aag gcc gcc gcc cgg gtg gac 96
Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp
20 25 30
cag gag atc aac agg atc ctc ttg gag cag aag aag cag gac cgc ggg 144
Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly
35 40 45
gag ctg aag ctg ctg ctt ttg ggc cca ggc gag agc ggg aag agc acc 192
Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr
50 55 60
ttc atc aag cag atg cgg atc atc cac ggc gcc ggc tac tcg gag gag 240
Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu
65 70 75 80
gag cgc aag ggc ttc cgg ccc ctg gtc tac cag aac atc ttc gtg tcc 288
Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser
85 90 95
atg cgg gcc atg atc gag gcc atg gag cgg ctg cag att cca ttc agc 336
Met Arg Ala Met Ile Glu Ala Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser
100 105 110
agg ccc gag agc aag cac cac gct agc ctg gtc atg agc cag gac ccc 384
Arg Pro Glu Ser Lys His His Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro
115 120 125
tat aaa gtg acc acg ttt gag aag cgc tac gct gcg gcc atg cag tgg 432
Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp
130 135 140
ctg tgg agg gat gcc ggc atc cgg gcc tgc tat gag cgt cgg cgg gaa 480
Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu
145 150 155 160
ttc cac ctg ctc gat tca gcc gtg tac tac ctg tcc cac ctg gag cgc 528
Phe His Leu Leu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg
165 170 175
atc acc gag gag ggc tac gtc ccc aca gct cag gac gtg ctc cgc agc 576
Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser
180 185 190
cgc atg ccc acc act ggc atc aac gag tac tgc ttc tcc gtg cag aaa 624
Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys
195 200 205
acc aac ctg cgg atc gtg gac gtc ggg ggc cag aag tca gag cgt aag 672
Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys
210 215 220
aaa tgg atc cat tgt ttc gag aac gtg atc gcc ctc atc tac ctg gcc 720
Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala
225 230 235 240
tca ctg agt gaa tac gac cag tgc ctg gag gag aac aac cag gag aac 768
Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn
245 250 255
cgc atg aag gag agc ctc gca ttg ttt ggg act atc ctg gaa cta ccc 816
Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro
260 265 270
tgg ttc aaa agc aca tcc gtc atc ctc ttt ctc aac aaa acc gac atc 864
Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile
275 280 285
ctg gag gag aaa atc ccc acc tcc cac ctg gct acc tat ttc ccc agt 912
Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser
290 295 300
ttc cag ggc cct aag cag gat gct gag gca gcc aag agg ttc atc ctg 960
Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu
305 310 315 320
gac atg tac acg agg atg tac acc ggg tgc gtg gac ggc ccc gag ggc 1008
Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly
325 330 335
agc aag aag ggc gca cga tcc cga cgc ctc ttc agc cac tac aca tgt 1056
Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys
340 345 350
gcc aca gac aca cag aac atc cgc aag gtc ttc aag gac gtg cgg gac 1104
Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp
355 360 365
tcg gtg ctc gcc cgc tac ctg gac gag atc aac ctg ctg tgacccaggc 1153
Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu Asp Glu Ile Asn Leu Leu
370 375 380
cccacctggg gcaggcggca ccggcgggcg ggtgggaggt gggagtggct gcagggaccc 1213
ctagtgtccc tggtctatct ctccagcctc gg 1245
<210> 15
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of polypeptide encoded by cDNA contained in
pcHISGα16.
<400> 15
Ile His His His His His His Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys
1 5 10 15
Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp
20 25 30
Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly
35 40 45
Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr
50 55 60
Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu
65 70 75 80
Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser
85 90 95
Met Arg Ala Met Ile Glu Ala Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser
100 105 110
Arg Pro Glu Ser Lys His His Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro
115 120 125
Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp
130 135 140
Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu
145 150 155 160
Phe His Leu Leu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg
165 170 175
Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser
180 185 190
Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys
195 200 205
Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys
210 215 220
Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn
245 250 255
Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro
260 265 270
Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile
275 280 285
Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser
290 295 300
Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu
305 310 315 320
Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly
325 330 335
Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys
340 345 350
Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp
355 360 365
Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu Asp Glu Ile Asn Leu Leu
370 375 380
<210> 16
<211> 1203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insert cDNA sequence contained in pcHISGαi2.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1203)
<400> 16
atc cat cat cat cat cac cat atg ggc tgc acc gtg agc gcc gag gac 48
Ile His His His His His His Met Gly Cys Thr Val Ser Ala Glu Asp
1 5 10 15
aag gcg gcg gcc gag cgc tct aag atg atc gac aag aac ctg cgg gag 96
Lys Ala Ala Ala Glu Arg Ser Lys Met Ile Asp Lys Asn Leu Arg Glu
20 25 30
gac gga gag aag gcg gcg cgg gag gtg aag ttg ctg ctg ttg ggt gct 144
Asp Gly Glu Lys Ala Ala Arg Glu Val Lys Leu Leu Leu Leu Gly Ala
35 40 45
ggg gag tca ggg aag agc acc atc gtc aag cag atg aag atc atc cac 192
Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile Val Lys Gln Met Lys Ile Ile His
50 55 60
gag gat ggc tac tcc gag gag gaa tgc cgg cag tac cgg gcg gtt gtc 240
Glu Asp Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Cys Arg Gln Tyr Arg Ala Val Val
65 70 75 80
tac agc aac acc atc cag tcc atc atg gcc att gtc aaa gcc atg ggc 288
Tyr Ser Asn Thr Ile Gln Ser Ile Met Ala Ile Val Lys Ala Met Gly
85 90 95
aac ctg cag atc gac ttt gcc gac ccc tcc aga gcg gac gac gcc agg 336
Asn Leu Gln Ile Asp Phe Ala Asp Pro Ser Arg Ala Asp Asp Ala Arg
100 105 110
cag cta ttt gca ctg tcc tgc acc gcc gag gag caa ggc gtg ctc cct 384
Gln Leu Phe Ala Leu Ser Cys Thr Ala Glu Glu Gln Gly Val Leu Pro
115 120 125
gat gac ctg tcc ggc gtc atc cgg agg ctc tgg gct gac cat ggt gtg 432
Asp Asp Leu Ser Gly Val Ile Arg Arg Leu Trp Ala Asp His Gly Val
130 135 140
cag gcc tgc ttt ggc cgc tca agg gaa tac cag ctc aac gac tca gct 480
Gln Ala Cys Phe Gly Arg Ser Arg Glu Tyr Gln Leu Asn Asp Ser Ala
145 150 155 160
gcc tac tac ctg aac gac ctg gag cgt att gca cag agt gac tac atc 528
Ala Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Glu Arg Ile Ala Gln Ser Asp Tyr Ile
165 170 175
ccc aca cag caa gat gtg cta cgg acc cgc gta aag acc acg ggg atc 576
Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg Thr Arg Val Lys Thr Thr Gly Ile
180 185 190
gtg gag aca cac ttc acc ttc aag gac cta cac ttc aag atg ttt gat 624
Val Glu Thr His Phe Thr Phe Lys Asp Leu His Phe Lys Met Phe Asp
195 200 205
gtg ggt ggt cag cgg tct gag cgg aag aag tgg atc cac tgc ttt gag 672
Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu
210 215 220
ggc gtc aca gcc atc atc ttc tgc gta gcc ttg agc gcc tat gac ttg 720
Gly Val Thr Ala Ile Ile Phe Cys Val Ala Leu Ser Ala Tyr Asp Leu
225 230 235 240
gtg cta gct gag gac gag gag atg aac cgc atg cat gag agc atg aag 768
Val Leu Ala Glu Asp Glu Glu Met Asn Arg Met His Glu Ser Met Lys
245 250 255
cta ttc gat agc atc tgc aac aac aag tgg ttc aca gac acg tcc atc 816
Leu Phe Asp Ser Ile Cys Asn Asn Lys Trp Phe Thr Asp Thr Ser Ile
260 265 270
atc ctc ttc ctc aac aag aag gac ctg ttt gag gag aag atc aca cac 864
Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu Phe Glu Glu Lys Ile Thr His
275 280 285
agt ccc ctg acc atc tgc ttc cct gag tac aca ggg gcc aac aaa tat 912
Ser Pro Leu Thr Ile Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Gly Ala Asn Lys Tyr
290 295 300
gat gag gca gcc agc tac atc cag agt aag ttt gag gac ctg aat aag 960
Asp Glu Ala Ala Ser Tyr Ile Gln Ser Lys Phe Glu Asp Leu Asn Lys
305 310 315 320
cgc aaa gac acc aag gag atc tac acg cac ttc acg tgc gcc acc gac 1008
Arg Lys Asp Thr Lys Glu Ile Tyr Thr His Phe Thr Cys Ala Thr Asp
325 330 335
acc aag aac gtg cag ttc gtg ttt gac gcc gtc acc gat gtc atc atc 1056
Thr Lys Asn Val Gln Phe Val Phe Asp Ala Val Thr Asp Val Ile Ile
340 345 350
aag aac aac ctg aag gac tgc ggc ctc ttc tgaggggcag cggggcctgg 1106
Lys Asn Asn Leu Lys Asp Cys Gly Leu Phe
355 360
cgggatgggc caccgccgac tttgtacccc ccaacccctg aggaagatgg gggcaagaag 1166
atcacgctcc ccgcctgttc ccccgccgct tttctcc 1203
<210> 17
<211> 362
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of polypeptide encoded by cDNA contained in
pcHISGαi2.
<400> 17
Ile His His His His His His Met Gly Cys Thr Val Ser Ala Glu Asp
1 5 10 15
Lys Ala Ala Ala Glu Arg Ser Lys Met Ile Asp Lys Asn Leu Arg Glu
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Ala Ala Arg Glu Val Lys Leu Leu Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile Val Lys Gln Met Lys Ile Ile His
50 55 60
Glu Asp Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Cys Arg Gln Tyr Arg Ala Val Val
65 70 75 80
Tyr Ser Asn Thr Ile Gln Ser Ile Met Ala Ile Val Lys Ala Met Gly
85 90 95
Asn Leu Gln Ile Asp Phe Ala Asp Pro Ser Arg Ala Asp Asp Ala Arg
100 105 110
Gln Leu Phe Ala Leu Ser Cys Thr Ala Glu Glu Gln Gly Val Leu Pro
115 120 125
Asp Asp Leu Ser Gly Val Ile Arg Arg Leu Trp Ala Asp His Gly Val
130 135 140
Gln Ala Cys Phe Gly Arg Ser Arg Glu Tyr Gln Leu Asn Asp Ser Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Glu Arg Ile Ala Gln Ser Asp Tyr Ile
165 170 175
Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg Thr Arg Val Lys Thr Thr Gly Ile
180 185 190
Val Glu Thr His Phe Thr Phe Lys Asp Leu His Phe Lys Met Phe Asp
195 200 205
Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu
210 215 220
Gly Val Thr Ala Ile Ile Phe Cys Val Ala Leu Ser Ala Tyr Asp Leu
225 230 235 240
Val Leu Ala Glu Asp Glu Glu Met Asn Arg Met His Glu Ser Met Lys
245 250 255
Leu Phe Asp Ser Ile Cys Asn Asn Lys Trp Phe Thr Asp Thr Ser Ile
260 265 270
Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu Phe Glu Glu Lys Ile Thr His
275 280 285
Ser Pro Leu Thr Ile Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Gly Ala Asn Lys Tyr
290 295 300
Asp Glu Ala Ala Ser Tyr Ile Gln Ser Lys Phe Glu Asp Leu Asn Lys
305 310 315 320
Arg Lys Asp Thr Lys Glu Ile Tyr Thr His Phe Thr Cys Ala Thr Asp
325 330 335
Thr Lys Asn Val Gln Phe Val Phe Asp Ala Val Thr Asp Val Ile Ile
340 345 350
Lys Asn Asn Leu Lys Asp Cys Gly Leu Phe
355 360
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
C-PLACE1003238 C-terminal fragment (0.65 kb).
<400> 18
caagccattt ggggactctc ggatg 25
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for amplifying
C-PLACE1003238 C-terminal fragment (0.65 kb).
<400> 19
ttgttaacat cagtataatc ataatatatg c 31
<210> 20
<211> 25
<212> Prt
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligopeptide designed as antigen for producing anti-C-PLACE1003238
antibody.
<400> 20
Asn Asn Glu Leu His Gly Gln Glu Ser His Asn Ser Gly Asn Arg Ser
1 5 10 15
Asp Gly Pro Gly Lys Asn Thr Thr Leu
20 25
【図１】ヒト組織におけるC-PLACE1003238の発現分布を
示すゲル電気泳動写真である。
示すゲル電気泳動写真である。
【図２】pcHISGα16およびpcHISGαi2の構築の工程を示
す図である。
す図である。
【図３】C-PLACE1003238−Ｇα発現プラスミド構築の工
程を示す図である。
程を示す図である。
【図４】C-PLACE1003238−Ｇα融合のＧα活性化効果を
示す図である。
示す図である。
【図５】ラット膀胱及び前立腺におけるC-PLACE1003238
蛋白質の発現の様子を示す免疫染色写真である。
蛋白質の発現の様子を示す免疫染色写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 11/10 Ａ６１Ｐ 11/10
15/00 15/00
35/00 35/00
Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/44
1/44 1/68 Ａ
1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＮＡＺ
Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＮＡ 33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 金岡 昌治
大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98
号 住友製薬株式会社内
(72)発明者 根来 尚温
大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98
号 住友製薬株式会社内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA02 CA07 DA02 FA02
FA10 FA20 GA11 HA01 HA11
4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ13
QQ32 QQ43 QQ53 QQ63 QQ89
QR32 QR41 QR48 QR56 QR59
QR77 QR80 QS34
4C084 AA16 ZA59 ZA63 ZA81 ZB26
4H045 AA11 BA10 CA40 DA75 EA50
FA71
Claims (23)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
ド： （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプ
チド （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もし
くは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修
飾されたアミノ酸配列からなり、C-PLACE1003238と同等
のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧiファミリ
ーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユ
ニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有す
るポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング系で
あって、該ポリペプチドを含む脂質二重層膜、並びにＧ
iファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットのＧＰＣ
Ｒとの結合に関与する領域及び任意のＧ蛋白質αサブユ
ニットのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域
を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含むこ
とを特徴とするスクリーニング系。 - 【請求項２】 該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを含む発現ベクターと、Ｇiファミリー
に属するＧ蛋白質αサブユニットのＧＰＣＲとの結合に
関与する領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグア
ニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を少なくとも
含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクタ
ーとでトランスフェクトした宿主動物細胞、該細胞のホ
モジネートまたは該細胞由来の膜画分である、請求項１
記載のスクリーニング系。 - 【請求項３】 該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのＣ
末端側に、Ｇiファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニ
ットのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧ蛋
白質αサブユニットのグアニンヌクレオチドとの結合に
関与する領域を少なくとも含むポリペプチドが融合した
ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで
トランスフェクトした宿主動物細胞、該細胞のホモジネ
ートまたは該細胞由来の膜画分である、請求項１記載の
スクリーニング系。 - 【請求項４】 該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクト
した、Ｇiファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニット
を内因的に発現する宿主動物細胞、該細胞のホモジネー
トまたは該細胞由来の膜画分である、請求項１記載のス
クリーニング系。 - 【請求項５】 Ｇiファミリーに属するＧ蛋白質αサブ
ユニットのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意の
Ｇ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチドとの結
合に関与する領域を少なくとも含むポリペプチドが、Ｇ
iファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの効果器
と相互作用するためのドメインをさらに含むものであ
る、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング
系。 - 【請求項６】 Ｇiファミリーに属するＧ蛋白質αサブ
ユニットのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意の
Ｇ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチドとの結
合に関与する領域を少なくとも含むポリペプチドが、Ｇ
qファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの効果器
と相互作用するためのドメインをさらに含むものであ
る、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング
系。 - 【請求項７】 ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモー
ター領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベ
クターをさらに含む宿主動物細胞である、請求項４また
は５記載のスクリーニング系。 - 【請求項８】 ＴＰＡ応答エレメントを含むプロモータ
ー領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベク
ターをさらに含む宿主動物細胞である、請求項６記載の
スクリーニング系。 - 【請求項９】 該リガンドが、泌尿器、胎盤又は扁桃に
おける疾患の予防及び治療に有効である、請求項１〜８
のいずれかに記載のスクリーニング系。 - 【請求項１０】 該リガンドが、泌尿器、胎盤又は扁桃
における疾患のマーカー物質である、請求項１〜８のい
ずれかに記載のスクリーニング系。 - 【請求項１１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
ド： （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプ
チド （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もし
くは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修
飾されたアミノ酸配列からなり、C-PLACE1003238と同等
のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧiファミリ
ーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユ
ニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有す
るポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング法で
あって、該ポリペプチドを含む脂質二重層膜、並びにＧ
iファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットのＧＰＣ
Ｒとの結合に関与する領域及び任意のＧ蛋白質αサブユ
ニットのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域
を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含む系
において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又
は該サブユニットを含むポリペプチドと相互作用する効
果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 請求項２〜４のいずれかに記載のスク
リーニング系に、被験物質の存在下及び非存在下で標識
したＧＴＰγＳを添加し、該サブユニットのグアニンヌ
クレオチドとの結合に関与する領域に結合した標識量を
両条件下で比較することを特徴とする、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１３】 請求項４又は５記載のスクリーニング
系に、被験物質の存在下及び非存在下でＧＴＰを添加
し、アデニル酸シクラーゼ活性を両条件下で比較するこ
とを特徴とする、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項４又は５記載の動物細胞におけ
るｃＡＭＰ量を、被験物質の存在下と非存在下で比較す
ることを特徴とする、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項６記載のスクリーニング系に、
被験物質の存在下及び非存在下でホスファチジルイノシ
トール−４，５−二リン酸を添加し、ホスホリパーゼＣ
活性を両条件下で比較することを特徴とする、請求項１
１記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項６記載の動物細胞における細胞
内カルシウムイオンの量を、被験物質の存在下と非存在
下で比較することを特徴とする、請求項１１記載の方
法。 - 【請求項１７】 請求項７記載のスクリーニング系にお
けるリポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と
非存在下で比較することを特徴とする、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１８】 請求項８記載のスクリーニング系にお
けるリポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と
非存在下で比較することを特徴とする、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１９】 該リガンドが、泌尿器、胎盤又は扁桃
における疾患の予防及び治療に有効である、請求項１１
〜１８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２０】 請求項１９記載の方法により得られる
リガンドと、医薬上許容される担体とを配合することを
特徴とする、泌尿器、胎盤又は扁桃における疾患の予防
及び治療剤の製造方法。 - 【請求項２１】請求項１１〜１８のいずれかに記載の方
法によりリガンドであると認定された生体物質につい
て、泌尿器、胎盤又は扁桃由来の生体試料中での存在量
を、当該組織に疾患を有する患者と正常人との間で比較
することを特徴とする、泌尿器、胎盤又は扁桃における
疾患のマーカー物質の同定方法。 - 【請求項２２】 請求項２１記載の方法により同定され
るマーカー物質の、泌尿器、胎盤又は扁桃由来の生体試
料中での存在量を測定することを特徴とする、泌尿器、
胎盤又は扁桃における疾患の診断方法。 - 【請求項２３】 配列番号１に示されるアミノ酸配列
中、アミノ酸番号１２〜３６で示されるアミノ酸配列か
らなるペプチドを特異的に認識する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002034569A JP2003232790A (ja) | 2002-02-12 | 2002-02-12 | Ｃ−ｐｌａｃｅ１００３２３８に対するリガンドのスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002034569A JP2003232790A (ja) | 2002-02-12 | 2002-02-12 | Ｃ−ｐｌａｃｅ１００３２３８に対するリガンドのスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003232790A true JP2003232790A (ja) | 2003-08-22 |
Family
ID=27777026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002034569A Pending JP2003232790A (ja) | 2002-02-12 | 2002-02-12 | Ｃ−ｐｌａｃｅ１００３２３８に対するリガンドのスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003232790A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1900377A1 (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-19 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Inhibitors of GPR87 for cancer therapy |
| US7605464B2 (en) | 2007-01-19 | 2009-10-20 | Seiko Epson Corporation | Semiconductor device |
-
2002
- 2002-02-12 JP JP2002034569A patent/JP2003232790A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1900377A1 (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-19 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Inhibitors of GPR87 for cancer therapy |
| WO2008031842A1 (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Inhibitors of gpr87 for cancer therapy |
| US7605464B2 (en) | 2007-01-19 | 2009-10-20 | Seiko Epson Corporation | Semiconductor device |
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