MXPA06008612A - Derivados de furosemida como modulares de hm74 y su uso para el tratamiento de la inflamacion. - Google Patents

Abstract

Se usaron celulas hospedantes que expresan HM74 para obtener moleculas de tipo furosemida con actividad agonista, que tienen la siguiente formula estructural: (ver formula).

Description

células epiteliales bronquiales humanas normales con las citoquinas TH2 , IL-4 o IL-13, que se sabe que son importantes en la etiología del asma. La expresión del HM74 y HM74A es positivamente regulada en eosinófilos primarios humanos por la IL-5. Finalmente, la expjesiój .del_HM74A pulmonar es positivamente. regulada en el modelo de asma experimental en murinos. La distribución tisular restringida del HM74 y HM74A, y su regulación, sugieren que el HM74 y HM74A tienen un papel en los procesos inflamatorios, tales como el asma, la AR, EPOC, en la inflamación. Dado el papel que tienen los GPCR en la enfermedad y la capacidad para tratar enfermedades modulando la actividad de los GPCR, la identificación y caracterización de los ligandos de los GPCR puede proporcionar el desarrollo de nuevas composiciones y métodos para tratar estados patológicos que implican la actividad de un GPCR. La presente invención identifica y caracteriza moléculas que se acoplan con el HM74, y proporciona composiciones y métodos para aplicar el descubrimiento a la identificación y tratamiento de las enfermedades relacionadas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas que activan el HM74 pero no el HM74A. Las moléculas tienen la siguiente estructura: en la que R es hidrógeno, o alquilo d-C-ts, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo CrC18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo Ci-C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo Ci-Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-C 8i que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C-|8i que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-Ci8 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-Ci8 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-Ci8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y cada Z es R. En otro aspecto de la invención, se describen métodos para' identificar moduladores de HM74. Por ejemplo, un método de interés comprende las etapas de proporcionar un resto químico, proporcionar una célula que exprese HM74 y determinar si el resto químico modula la actividad señalizadora de HM74, incluyendo si dicha modulación se produce en presencia o ausencia de un agonista de la presente invención. En un aspecto relacionado, entre los restos químicos se pueden incluir, pero no se limitan, péptidos, anticuerpos, agonistas, agonistas inversos y antagonistas. Alternativamente, se puede usar un modulador conocido en un ensayo competitivo para identificar otros moduladores. Los ácidos antranílicos sustituidos en la base o furosemidas de interés activan el HM74. Estos compuestos producen la movilización selectiva de calcio sensible a la dosis, en células que expresan H 74, tales como células humanas, tales como células CHO, células 293 y células L1.2. Las células testigo no transformadas con la secuencia que codifica HM74, no demostraron esta respuesta del calcio. Los compuestos de interés también activaban el HM74 en un ensayo indicador en levaduras, e inducían quimiotaxis en células L1.2 transfectadas. En general, los compuestos de interés son agonistas. Por lo tanto, un compuesto de interés se podría desarrollar como un candidato a fármaco. Un compuesto de interés también se podría usar para identificar otras moléculas que activen, se unan y/o modulen HM74, por ejemplo, por ensayos competitivos. Otro aspecto de la invención incluye composiciones terapéuticas, donde dichas composiciones incluyen ácidos nucleicos, anticuerpos, polipéptidos, agonistas, agonistas inversos y antagonistas. Además, los métodos de la invención también incluyen métodos para tratar estados patológicos y modular la actividad señalizadora de HM74, administrando dichas composiciones terapéuticas a un paciente que lo necesite. Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Además, a continuación se presentan varias referencias, que describen con más detalle algunos procedimientos o composiciones. Cada una de las referencias se incorpora, por la presente, en la presente, memoria como referencia, como si se indicara la incorporación individual de cada una de ellas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de moléculas que activan el HM74. Se conoce la secuencia que codifica HM74, Nomura et al., véase antes. En esta memoria se proporcionan métodos para obtener, preparar y usar el HM74. Los cambios en la secuencia que codifica el HM74 y en los aminoácidos, son tolerados siempre que no afecten negativamente a las actividades funcionales conocidas del HM74. Los presentes compuestos modulan la actividad del H 74 y son agonistas del HM74 y por lo tanto son candidatos a fármacos para trastornos caracterizados por la inflamación, tales como el asma. Los presentes compuestos también se pueden usar para cribar antagonistas del HM74. Por ejemplo, las células que expresan HM74 son expuestas a un compuesto de ensayo, y después a un agonista de la presente invención. Después se puede determinar el efecto del compuesto de ensayo, por ejemplo, en la movilización de calcio, para determinar si el compuesto de ensayo reduce los niveles de movilización de calcio inducidos por el agonista de la presente invención. Se contempla que otros ensayos para identificar, por ejemplo, agonistas y agonistas inversos, están dentro del alcance de la presente invención. Entre los compuestos de este tipo adecuados se incluyen ácidos . sulfamoilantranílicos, tales como los que tienen la estructura: en la que R es hidrógeno, o alquilo Ci-Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo CrC18l que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo Ci-C-|8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo Ci-C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilp C3-C 8 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-C18 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C-|8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y cada Z es R. En otro aspecto de la invención, se describen métodos para identificar moduladores de HM74. Por ejemplo, un método de interés comprende las etapas de proporcionar un resto químico, proporcionar una célula que exprese HM74 y determinar s¡ el resto químico modula la actividad señalizadora de HM74, incluyendo si dicha modulación se produce en presencia o ausencia de un agonista de la presente invención. En un aspecto relacionado, entre los restos químicos se pueden incluir, pero no se limitan, péptidos, anticuerpos, agonistas, agonistas inversos y antagonistas. Alternativamente, se puede usar un modulador conocido en un ensayo competitivo para identificar otros moduladores. El término "alquilo" significa un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada. Son ejemplos representativos metilo, etilo, propilo, ísopropilo, butilo, isobutiio, tere-butilo, sec-butilo, pentilo y hexilo. El hidrocarburo puede contener uno o más dobles o triples enlaces insaturados, tales como alquenos y alquinos. El término "alcoxi" significa un grupo alquilo unido a un átomo de oxígeno. Son ejemplos metoxi, etoxi, propoxi, butoxi y pentoxi. "Arilo" es un anillo que es un hidrocarburo aromático. Los ejemplos incluyen feniio y naftilo. "Heteroátomo" generalmente es un átomo que difiere de los que caracterizan a una molécula. Así, en un hidrocarburo, cualquier átomo que no sea un carbono o un hidrógeno es un heteroátomo. Entre los heteroátomos comunes biológicamente aceptables se incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. El término "heteroarilo" se refiere a un grupo ariio en el que uno o más átomos de carbono son sustituidos por un heteroátomo. Son ejemplos piridilo, i idazolilo, pirrolilo, tieniio, furilo, piranilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, quinolilo, naftiridinilo e isoxazoliio. El término "cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico. Algunos ejemplos son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. "Heterociclo" es un cicloalquilo en el que uno o más carbonos son sustituidos por un heteroátomo. Ejemplos son pirrolindinilo, piperidinilo y piperazinilo. El término "heteroalquilo" es un alquilo en el que uno o más átomos de carbono son sustituidos por un heteroátomo. Un éter es un heteroalquilo. Por "sustituido" se entiende que el radical orgánico base tiene uno o más grupos sustituyentes. Por lo tanto, un átomo o grupo, sustituye a otro átomo o grupo en una molécula. Entre los sustituyentes representativos se incluyen halógeno, alquilo C C8, -CN, -N02, alcoxilo, hidroxilo, sulfuro, sulfato, sulfonamida, amina y amida. "Ramificado" significa que la estructura contiene una o más ramificaciones en uno o más sitios. Una ramificación puede ser un grupo R como se ha definido antes u otro grupo lateral.

EI término "anillo" significa una, una de una pluralidad de estructuras anulares, o una pluralidad de estructuras anulares, donde dos o más de la pluralidad de anillos pueden estar condensados, en el que uno o más de la pluralidad de anillos pueden ser aromáticos, contener un heteroátomo, pueden estar sustituidos, o una de sus combinaciones. El anillo puede ser bicíclico o policíclico. El anillo puede contener un puente de longitud variable. Un "halógeno" es, por ejemplo, cloro, flúor o bromo. La expresión "grupo lateral" significa un átomo o molécula unido a otra estructura. Por lo tanto, un grupo lateral puede ser un grupo R como se ha definido antes, un alquilo, un alquenilo, un arilo, un cicloalquilo y similares. El término "puente" se refiere a un conector entre dos estructuras. Por ejemplo, un hidrocarburo no cíclico, tal como un alquilo, alquenilo, y similares, que puede contener un heteroátomo, puede estar sustituido, puede estar ramificado o sus combinaciones, puede conectar dos hidrocarburos cíclicos, tales como grupos arilo o cicloalquilo. El puente también puede estar contenido en una estructura cíclica que une al menos dos átomos de la estructura cíclica. El puente intramolecular puede contener 0, 1 , 2, 3, 4 o más átomos. El puente intramolecular puede ser lineal, ramificado o estar sustituido. Son compuestos de interés particulares los compuestos donde 1 ) cuando R es hidrógeno y Q es oxígeno o azufre, entonces W no es hidrógeno, o uno o ambos grupos Z no son hidrógeno; y 2) cuando ambos grupos Z, W y R son hidrógeno, y Q es oxígeno, entonces X e Y están combinados en una estructura de anillo. Los compuestos de interés contienen grupos funcionales que pueden formar derivados, para formar profármacos como se conoce en la técnica, por ejemplo, para potenciar la biodisponibilidad. Por lo tanto, la presente invención contempla variantes de los compuestos activos de interés, que después de administración, son metabolizados a una forma bioactiva. Dichos precursores de fármacos bioactivos también se conocen como vehículos biorreversibles, fármacos latentes, sistemas de suministro de fármacos o profármacos. ("Bioreversible Carriers in Drug Design" E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987; "Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems", Higuchi & Stella, eds., American Chemical Society, DC, 1975) La modificación química de fármacos se dirige a abordar aspectos particulares de la farmacodinámica, tales como, cómo potenciar la disponibilidad de un compuesto polar que debe cruzar una barrera lipídica, cómo estabilizar un compuesto que normalmente es susceptible a la degradación in vivo etc.

Otras razones para preparar profármacos incluyen la toxicidad del fármaco bioactivo, falta de especificidad, inestabilidad, ser metabolizado en el sitio de absorción, ser absorbido demasiado rápido, observancia del paciente, tal como sabor malo, o dolor en el sitio de inyección, poca aceptación por el médico o problemas de formulación. Una modificación común es la esterificación, que no está limitada a la modificación de un ácido carboxílico. Existen procedimientos químicos para preparar dichos derivados, por ejemplo, para aminas, ¡minas, sustituyentes que contienen azufre, y también amidas. En el caso de ésteres, se pueden añadir diferentes sustituyentes, incluyendo hidrocarburos no ramificados, cíclicos o ramificados, que pueden estar sustituidos, pueden contener uno o más dobles o triples enlaces, pueden contener estructuras de anillo, y la cadena principal del hidrocarburo puede contener uno o más heteroátomos, tales como nitrógeno, azufre u oxígeno, etc. Cuando se considera el grupo R para construir el éster, otro factor que hay que considerar es la susceptibilidad a la escisión enzimática. Así, la carga esférica y los factores conformacionales pueden ser determinantes para la biodisponibilidad. Por ejemplo, un grupo alquilo ramificado puede proporcionar impedimento esférico para la accesibilidad de la esterasa al sitio activo, ralentizando así la velocidad' de hidrólisis. Esto puede ser menos conveniente, se retrasa la biodisponibilidad, o conveniente, se prolonga la biodisponibilidad. En otras circunstancias, es conveniente potenciar la solubilidad acuosa de un fármaco. Los ejemplos de sustituyentes que logran este objetivo, incluyen succinatos, sulfatas, hemisuccinatos, fosfatos, aminoácidos, acetatos, aminas y similares. Se pueden derivatizar nitrógenos de amidas, imidas, carbonatas, hidantoínas y similares. Entre los grupos adecuados para la reacción con el nitrógeno, se incluyen grupos hidroximetilo, o grupos hidroxialquilo en general, grupos aciloxialquilo y grupos acilo. Los grupos carbonilo también son sitios para formar derivados. Ejemplos de derivados son las bases de Schiff, oxinas, cetales, acétales, oxazolidinas, tiazolidinas y enol-ésteres. Aunque los derivados antes discutidos comprenden enlaces covalentes del sustituyente al fármaco, se puede unir un sustituyente al fármaco de otras formas, por ejemplo, por enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, fuerzas electrostáticas, interacciones hidrófobas y similares.

Todavía otro medio para obtener derivados es usar sustituyentes que se eliminan de un profármaco por un mecanismo no enzimátíco. Entre los ejemplos se incluyen profármacos que contienen ásteres de (2-oxo-1 ,3-d¡oxol-4-il)met¡lo, bases de Mannich, oxazolidinas, ásteres con una cadena lateral básica que cataliza la hidrólisis intramolecular y ásteres o amidas que sufren una reacción de delación-eliminación nucleófila intramolecular. El mecanismo de delación se puede conseguir para fármacos que contienen fenoles, alcoholes y aminas. "Prodrug Design" Testa & Mayer in "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology," 2nd ed. V. 3, Swarbrick & Boilan, eds., Marcel Dekker, 2002. Por lo tanto, la presente invención contempla cualquier medicación adicional de los compuestos de interés mediante la práctica de métodos de síntesis nuevos para obtener compuestos que una vez administrados reaccionan o se hacen reaccionar in vivo para dar un compuesto que modula la actividad del HM74. La expresión "restos de aminoácidos equivalentes" en la presente memoria significa que los aminoácidos ocupan sustancialmente la misma posición dentro de una secuencia de una proteína, cuando se alinean dos o más secuencias para analizarlas. Los polipéptidos de HM74 preferidos de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente idéntica a la del HM74 salvaje. Por "salvaje" se entiende la forma o alelo más extendido presente en una población definida, sea local o con alcance mayor. La expresión "suficientemente idénticas" se usa en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número mínimo o suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (p. ej, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común, que son al menos 98% idénticas a una actividad de HM74, en esta memoria se definen como suficientemente idénticas. Usado de forma intercambiable en la presente memoria, una "actividad de H 74", "actividad biológica de HM74" o "actividad funcional de H 74" se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de H 74, en una célula que expresa HM74, determinado in vivo o in vitro, de acuerdo con técnicas patrón. Una actividad de HM74 puede ser una actividad directa, tal como una asociación con, o una actividad enzimática en, una segunda proteína, o una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción del H 74 con una segunda proteína. En una realización preferida, una actividad de HM74 incluye al menos una o más de las siguientes actividades: (i) la capacidad de interaccionar con proteínas en ia ruta de señalización de HM74; (ii) la capacidad de interaccionar con un ligando de HM74; (iii) la capacidad de alterar la célula hospedante cuando se activa; (iv) la activación por la unión de una molécula de la invención; y (v) la capacidad de interaccionar con una proteína intracelular objetivo. Un aspecto de la invención se refiere a la expresión de HM74 en células que demuestran una respuesta cuando HM74 es activado. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de ácido nucleico" se pretende que incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" no tiene secuencias que flanquean de forma natural al ácido nucleico que codifica el HM74 (es decir, secuencias situadas en ios extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se obtiene el ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico del H 74 aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural el marco de lectura abierto de la molécula- de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se obtiene el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede no tener sustancialmente otro material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes, o no tener sustancialmente precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el HM74, se puede aislar usando técnicas patrón de biología molecular y después secuenciar (Nomura et al., véase antes). Usando toda o una parte de la secuencia de HM74, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico de HM74 usando técnicas patrón de hibridación y clonación (p. ej. como describen Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando ADNc, ARNm o ADN genómico como molde, y los cebadores · oligonucleótidos adecuados de acuerdo con técnicas patrón de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de esta forma se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar por análisis de la secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de nucleótidos del HM74, se pueden preparar por técnicas sintéticas patrón, por ejemplo, usando un sintetizador automático de ADN. Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender sólo partes de una secuencia del ácido nucleico que codifica el HM74, por ejemplo, un fragmento que codifica los dominios extracelulares y/o dominios intracelulares que producen un suceso intracelular detectable, cuando se une a él un ligando. Preferiblemente, el suceso intracelular detectable es uno que se observa cuando el HM74 es activado en una célula hospedante normal. Se puede preparar un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa del HM74" aislando un parte del HM74 que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de HM74, expresando la parte codificada de la proteína HM74 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la parte codificada de HM74 . La invención abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos del HM74 descrita, debido a la degeneración del código genético, y por lo tanto que codifican sustancialmente la misma proteína HM74, como se ha descrito previamente. Los expertos en la técnica entenderán que dentro de una población (por ejemplo, la población humana) pueden existir polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos del HM74. Dicho polimorfismo genético en la secuencia que codifica el HM74 puede existir entre individuos dentro de una población, debido a la variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que se encuentran de forma alternativa en un locus genético dado. Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína HM74, preferiblemente una proteína H 74 de mamífero. Tal como se usa en la presente memoria, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra en un locus de HM74, o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Se pueden identificar alelos alternativos por secuenciación del gen de interés en una serie de individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una variedad de individuos. Se pretende que cualquiera y todas dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones de HM74 que son el resultado de la variación aiélica natural, y que no alteran la actividad funcional del HM74, estén dentro del alcance de la invención. Además, se pretende que estén dentro del alcance de la invención las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas HM74 de otras especies (homólogos de HM74) con una secuencia de nucleótidos que difiere de la del HM74 humano, pero tiene sustancialmente la misma actividad. Se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las variantes alélicas naturales y homólogos del ADNc del HM74 de la invención, basándose en la identidad con los ácidos nucleicos del HM74 humano descritos en la presente memoria, usando los ADNc humanos, o una de sus partes, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación patrón en condiciones de hibridación restrictivas. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "híbrida en condiciones restrictivas" se pretende que describa condiciones para la hibridación y lavado, en las cuales las secuencias de nucleótidos típicamente permanecen hibridadas. Dichas condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden encontrar en "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido y no limitante de condiciones de hibridación restrictivas, es la hibridación en 6 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1%, a 50-65° C. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que híbrida en condiciones restrictivas con la secuencia de HM74 o su complementaria, corresponde a una molécula de ácido nucleico natural. Tal como se usa en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). Además, de las variantes alélicas naturales de la secuencia de HM74 que pueden existir en la población, un experto en la técnica entenderá además que se pueden introducir cambios por mutación en la secuencia de nucleótidos, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína HM74 codificada, sin alterar sustancialmente la actividad biológica de la proteína HM74. Así, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos "no esenciales". Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar en la secuencia natural del HM74 sin alterar sustancialmente la actividad biológica. Un aminoácido "esencial" es un resto de aminoácido necesario para la actividad biológica sustancial. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que no son conservados o son sólo semiconservados entre los HM74 de diferentes especies, pueden no ser esenciales para la actividad, y por lo tanto serían objetivos probables para alterar. Alternativamente, los restos de aminoácidos que son conservados entre las proteínas de HM74 de diferentes especies pueden ser esenciales para la actividad, y por lo tanto no serían objetivos probables para alterar.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas HM74 que contienen cambios en los restos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Dichas proteínas HM74 difieren de la secuencia de aminoácidos conocida, pero retienen la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos conocida de HM74. Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína HM74 que tiene una secuencia que difiere de la conocida del HM74, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos conocida del HM74, de modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir por técnicas patrón, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más restos de aminoácidos que se prevé que no son esenciales. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se definen las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Las familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido que se prevé no esencial en el HM74 se sustituye preferiblemente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de una secuencia que codifica al HM74, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden cribar según su actividad biológica de HM74 para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar de forma recombinante, y se puede determinar la actividad de la proteína. Entre los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar ácidos nucleicos de interés, se incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiour¡dina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, ß-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-met¡laminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, ß-D-manosilqueosina, 5-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitos¡na, 5-metil-2-tiouraci!o, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5.-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Una forma de afectar a la función de HM74 es afectar a la expresión de H 74. Por lo tanto, se pueden manipular los niveles de transcripción para un menor o mayor nivel de ARNm de HM74, que a su vez conduciría a un menor o mayor nivel de expresión de HM74 en la superficie celular. Una forma de lograr dicha manipulación es usar promotores regulables que se puedan introducir en el sitio adecuado en el genoma, cerca de la secuencia de codificación de HM74, por ejemplo, por recombinación. homologa. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-HM74. El término "anticuerpo" como se emplea en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión del antígeno, que se unen específicamente a un antígeno, tal como HM74. Una molécula que se une específicamente al HM74, es una molécula que se une al HM74 pero no se une sustancialmente a otras moléculas en la muestra, por ejemplo, una muestra biológica que contiene HM74 natural. Entre los ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina se incluyen fragmentos F(a ) y F(ab')2 que se pueden generar por tratamiento del anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a HM74. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se emplea en esta memoria, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienén sólo una especie de un idiotipo o un clon de un sitio de unión al antígeno capaz de reacción inmunológica con un epítopo particular del HM74. Por lo tanto, una composición de anticuerpo monoclonal típicamente presenta una sola afinidad de unión para un epítopo particular de proteína HM74. Como se sabe en la técnica, se pueden preparar otras formas de unión del antígeno a los anticuerpos, incluyendo fragmentos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados y similares. Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica el HM74 (o una de sus partes). Tal como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en un genoma vírico. Algunos vectores son capaces de replicacion autónoma en una célula hospedante (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedante cuando se introducen en- la célula hospedante, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedante. Además, algunos vectores, vectores de expresión, pueden dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de modo operativo. En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante, corj frecuencia están en forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus con replicacion defectuosa, adenovirus y virus adenoasqciados) que tienen funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante. Esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a usar para la expresión, que están unidas de forma operativa al ácido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresión recombinante, "unido de forma operativa" se pretende que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión "secuencia reguladora" se pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo por Goeddel, Gene Expression Technology: ethods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de la secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica entenderán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la células hospedantes que se van a transformar, el nivel de expresión deseado de la proteína, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedantes para producir proteínas o péptidos codificados ' por ácidos nucleicos como se describe en esta memoria (p. ej., HM74, formas mutantes de HM74, proteínas de fusión etc.). Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de HM74 en células procariotas o eucariotas, por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células hospedantes adecuadas son discutidas con más detalle por Goeddel, véase antes. Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, usando, por ejemplo, secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. En otra realización, el vector de expresión de HM74 es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores de expresión en levaduras tales como S. cerevisiae incluyen pYepSecI (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Alternativamente, el HM74 se puede expresar en células de insecto usando vectores de expresión baculovirus. Entre los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células Sf 9) se incluyen las series pAc (Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39). Todavía en otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Entre ios ejemplos de vectores de expresión de mamíferos se incluyen pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187195). Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión con frecuencia son proporcionadas por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores usados normalmente se obtienen del virus del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simio. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, véase los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., véase antes. Para la transformación estable de células de mamíferos, se sabe que dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en el genoma. Para identificar y seleccionar los integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a antibióticos) en las células hospedantes junto con el gen de interés. Entre los marcadores seleccionabas preferidos se incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedante en el mismo vector que el que codifica el HM74, o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar, por selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán). Los moduladores que se unen a HM74 y que activan el HM74, son ácidos sulfamoilantranílicos, también conocidos como compuestos de tipo furosemida. Las moléculas tienen la siguiente estructura: en la que R es hidrógeno, o alquilo C C18 alquilo, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C-I-C-IS, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener . un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo C C 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C C 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo .C5-d8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en ei que dicho anillo es un heterociclo C3-C13, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-C18 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-C18 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-Ci8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y cada Z es R. El término "alcoxi" significa un grupo alquilo unido a un átomo de oxígeno. Son ejemplos metoxi, etoxi, propoxi, butoxi y pentoxi. "Arilo" es un hidrocarburo aromático. Los ejemplos incluyen fenilo y naftilo. "Heteroátomo" generalmente es un átomo que difiere de los que caracterizan a una molécula. Así, en un hidrocarburo, cualquier átomo que no sea un carbono o un hidrógeno es un heteroátomo. Entre los heteroátomos comunes biológicamente aceptables se incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. El término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo en el que uno o más átomos de carbono son sustituidos por un heteroátomo. Son ejemplos piridilo,. imidazolilo, pirrolilo, tienilo, furilo, piranilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, quinolilo, naftiridinilo e isoxazolilo. El término "cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico. Algunos ejemplos son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. * "Heterociclo" es un cicloalquilo en el que uno o más átomos de carbono son sutituidos por un heteroátomo. Son ejemplos pirrolindinilo, piperidinilo y piperazinilo. El término "heteroalquilo" es un alquilo en el que uno o más átomos de carbono son sustituidos por un heteroátomo. Un éter es un heteroalquilo. Por "sustituido" se entiende que el radical orgánico base tiene uno o más grupos sustituyentes. Por lo tanto, un átomo o grupo, sustituye a otro átomo o grupo en una molécula. Entre los sustituyentes representativos se incluyen halógeno, alquilo C C8, -CN, -N02, alcoxilo, hidroxilo, sulfuro, sulfato, sulfonamida, amina y amida. Son compuestos particulares de interés los compuestos donde 1) cuando R es hidrógeno y Q es oxígeno o azufre, entonces W no es hidrógeno, o uno o ambos grupos Z no son hidrógeno; y 2) cuando ambos grupos Z, W y R son hidrógeno, y Q es oxígeno, entonces X e Y están combinados en una estructura de anillo. Los cationes de los ácidos antranílicos que dan sales biológicamente compatibles, son tales como sodio, potasio o grupos amonio. Los ácidos sulfamoilantranílico de interés se pueden preparar como se proporciona en las patentes de EE.UU. n° 4.406.895 y 5.739.361. Por lo tanto, se prepara un producto intermedio nitrilo como se enseña en estas patentes, que se hidroliza para dar el correspondiente ácido carboxílico de interés. Después, los ácidos carboxílicos se convierten en las correspondientes sales. Dichos compuestos de tipo furosemida eran conocidos como diuréticos. Por lo tanto, el uso de dichos compuestos para modular el HM74 es nuevo e inesperado. Los compuestos de tipo furosemida de interés activan el HM74, pero no activan el H 74A. Los moduladores del HM74, los compuestos de tipo furosemida de la invención, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Dichas composiciones, típicamente comprenden el ingrediente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en esta memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se pretende que incluya cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con la vía de administración pretendida. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil-parabenes; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como EDTA; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajusfar con ácidos o bases, tales como HCI o NaOH. La preparación parenteral se pueden encerrar en ampollas, jeringas desechables, o viales de dosis múltiple de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, entres los vehículos adecuados se incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril, y debe ser fluida en la medida que se pueda inyectar con jeringa fácilmente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe proteger frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y sus mezclas adecuadas. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, usando un revestimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas necesario en el caso de la dispersión, y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables, se puede llevar a cabo incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejempio, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado, con uno o una combinación de los ingredientes antes enumerados, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en. un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados antes. En el caso de polvos estériles para preparar soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado con vacío y liofilización, que dan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de su solución previamente esterilizada por filtración. Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Las composiciones se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para proporcionar un jarabe o formulación líquida, o para usar como elixir bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral, y se agita y expectora o traga. Se pueden incluir como parte de la composición agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, pildoras, cápsulas, pastillas y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato magnésico o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente de sabor tal como menta, salicilato de metilo o sabor de naranja. Para administrar por inhalación, los compuestos se suministran en forma de un pulverizador de aerosol de un envase presurizado o dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, se usan en ia formulación penetrantes adecuados para la barrera que se va a penetrar. En general dichos penetrantes son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración por vía transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración por vía transmucosa se puede llevar a cabo mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración por vía transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica. Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con basés convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal. En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener en el comercio en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales). Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.522.811. » Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y para la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas en forma de dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, asociado con el vehículo farmacéutico requerido. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial para administrar al paciente, es de aproximadamente 1 //g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 a 20 mg/kg) de ingrediente activo, sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 jt/g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de la terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. Se describe un régimen de dosificación de ejemplo, en el documento WO 94/04188. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención, viene dada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes a la técnica para componer dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un envase, paquete o dispensador, junto con instrucciones para la administración Los moduladores de HM74 de interés se pueden usar para ensayos de cribado y métodos de tratamiento. (p. ej., terapéutico y profiláctico). Los moduladores de HM74 de interés se pueden usar para cribar otros fármacos o compuestos que modulan la actividad o expresión de HM74, así como para tratar trastornos caracterizados por inflamación. Los moduladores de interés también pueden ser útiles en estados que resultan de la producción insuficiente o excesiva de proteína HM74, o producción de formas de proteína HM74 que tienen menor actividad o una actividad aberrante comparada con la proteína H 74 salvaje. La invención se refiere además a nuevos moduladores de HM74 identificados por ensayos de cribado, y a sus usos para tratamientos como se describe en esta memoria. La invención proporciona un método (también denominado en lo sucesivo un "método de cribado") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidato o de ensayo (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, anticuerpos u otros fármacos) que se unen al HM74 o tienen un efecto estimulante o inhibidor, por ejemplo en la expresión del HM74 o la actividad del HM74. En una realización, la invención proporciona ensayos para cribar compuestos candidato o de ensayo que se unen o modulan la actividad del HM74. Por lo tanto, los ensayos de cribado se pueden usar para identificar otros compuestos de tipo furosemida que modulan el HM74. Dichos moduladores también se pueden usar en ensayos competitivos para identificar otros moduladores tales como los antagonistas de HM74. En una realización, un ensayo es un ensayo basado en células, en el que una célula que expresa una forma de HM74 unida a membrana en fa superficie celular, se ponen en contacto con un compuesto de ensayo, y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para activar el HM74. La célula puede ser, por ejemplo, una célula de levadura o una célula de origen mamífero. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para activar HM74 se puede llevar a cabo, por ejemplo, por acoplamiento del compuesto de ensayo con un marcador radioisótopo o enzimático, de modo que la unión del compuesto de ensayo al HM74 se puede determinar detectando el compuesto marcado en un complejo con H 74, o donde se localiza HM74. Por ejemplo, los compuestos de ensayo se pueden marcar con 1251, 35S, '14C o 3H, directamente o indirectamente, y el radioisótopo se puede detectar por recuento directo de la radioemisión o por recuento de centelleo. Alternativamente, los compuestos de ensayo se pueden marcar enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimático se puede detectar determinando la conversión de un sustrato adecuado en producto. En una realización preferida, el ensayo comprende poner en contacto una célula que expresa una forma de HM74 unida a membrana en la superficie celular, con un compuesto conocido que se une a HM74 junto con un compuesto de ensayo, para determinar la capacidad del compuesto de ensayo para competir con el compuesto conocido para interaccionar con un HM74. En otra realización, un ensayo es un ensayo basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una forma de H 74 unida a membrana en la superficie celular con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad de HM74. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de HM74 se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad del compuesto de ensayo para activar o inhibir el HM74. Esto se puede poner de manifiesto cuando el HM74 activado interacciona con una molécula objetivo intracelular o de membrana asociada con la ruta de señalización. Tal como se usa en esta memoria, una "molécula objetivo" es una molécula con la que el HM74 se une o interacciona en la naturaleza, por ejemplo, una molécula en la superficie de una célula que expresa un HM74, una molécula en la superficie de una segunda célula, una molécula en el medio extracelular, una molécula asociada con la superficie interna de una membrana celular, o una molécula citoplasmática. Una molécula objetivo de HM74 puede ser una no molécula de HM74. En una realización, una molécula objetivo de HM74 es un componente de una ruta de transducción de señales que facilita la transducción de una señal extracelular (p. ej., una señal generada por unión de un compuesto a HM74) a través de la membrana celular y dentro de la célula. El objetivo puede ser, por ejemplo, una segunda proteína intercelular que tiene actividad catalítica o una proteína que facilita la asociación de moléculas señalizadoras corriente abajo con el HM74. La determinación de la capacidad del HM74 para unirse o para interaccionar con una molécula objetivo de HM74, se puede llevar a cabo por uno de los métodos descritos antes para determinar la unión directa. En una realización preferida, la determinación de la capacidad del HM74 para unirse o para interaccionar con una molécula objetivo de HM74, se puede llevar a cabo determinando la actividad de la molécula objetivo. Por ejemplo, la actividad de la molécula objetivo se puede determinar detectando la inducción de un segundo mensajero celular del objetivo (p.ej., Ca2+ intracelular, diacilglicerol, IP3 etc.), detectando la actividad catalítica/enzimática del objetivo en un sustrato adecuado, detectando la inducción de un gen indicador (p.ej., un elemento regulador sensible al HM74 operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, p. ej., luciferasa) o detectando una respuesta celular, por ejemplo, la diferenciación celular o proliferación celular. Todavía en otra realización, un ensayo de la presente invención es un ensayo sin células, que comprende poner en contacto el HM74 con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse al HM74. La unión del compuesto de ensayo al HM74 se puede determinar directamente o indirectamente como se ha descrito antes. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto el HM74 con un compuesto conocido de la invención junto con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para afectar a la actividad de HM74 del compuesto conocido descrito en la presente memoria. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con HM74, comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferiblemente al H 74 comparado con la unión del compuesto conocido descrito en esta memoria. En otra realización, un ensayo es un ensayo sin células, que comprende poner en contacto el HM74 con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad de HM74. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad del HM74 se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad del H 74 activado para unirse a una molécula objetivo de HM74 por uno de los métodos descritos antes para determinar la unión directa. En una realización alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad del HM74 se puede llevar a cabo determinando la capacidad de! H 74 para modular además una molécula objetivo de HM74. Por ejemplo, se puede determinar la actividad catalítica/enzimática de la molécula objetivo en un sustrato adecuado, como se ha descrito previamente. Todavía en otra realización, el ensayo sin células comprende poner en contacto el HM74 con un compuesto conocido que se une a H 74 y con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con un HM74, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con un HM74 comprende determinar la capacidad del HM74 para unirse preferiblemente o modular la actividad de una molécula objetivo de HM74. Los receptores pueden ser activados por moléculas que no son ligandos que no inhiben necesariamente la unión del ligando, pero producen cambios estructurales en el receptor para permitir la unión de la proteína G o quizás la agregación, dimerización o agrupación del receptor, que pueden producir activación. Los ensayos sin células de la presente invención son susceptibles de ser usados tanto con la forma soluble como con la forma unida a membrana del H 74. En el caso de ensayos sin células que comprenden la forma de HM74 unida a membrana, puede ser conveniente usar un agente de soiubilización, de modo que la forma de · HM74 unida a membrana se mantenga en solución. Entre los ejemplos de dichos agentes solubilizantes se incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N- metilglucamida, Tritón X- 00, Tritón X-114, Thesit®, isotridecilpol¡(et¡lenglicol-éter)n, 3- [(3-colamidopropil)dimetilamino]-1-propano-sulfonato (CHAPS), 3-[(3- colamidopropil)dimetilamino]-2-hidroxi-1-propano-sulfonato (CHAPSO) o N- dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano-sulfonato. En otra realización, el HM74 se altera para que esté en un estado activo constante cuando es expresado en una célula hospedante. La alteración de HM74 puede hacer al receptor activo sin tener que unir ligando. Una forma de obtener un receptor activado, es alterar HM74 para que interaccione con proteínas G sin unión de ligando. La alteración mimetiza los cambios conformacionales del receptor cuando se une el ligando, permitiendo que el receptor una proteínas G intracelulares. Uno de dichos métodos se proporciona en el documento WO 00/22129. El documento WO 00/22129 muestra aminoácidos particulares en la región de TM6 y IC3 que producen actividad constitutiva. Los métodos para incorporar los aminoácidos particulares en el HM74 son conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida, subclonación etc. Después, la molécula de HM74 alterada es expresada en una célula hospedante para producir un HM74 constitutivamente activo.

Después, la célula activada es expuesta a moléculas que se sospecha que son agonistas, antagonistas, agonistas inversos etc., de HM74, moléculas que alteran la actividad de HM74. Las moléculas que alteran la actividad de la proteína G se dirigen al tratamiento de trastornos asociados con el metabolismo alterado de H 74 usando métodos conocidos en el desarrollo farmacéutico. En más de una realización de los métodos del ensayo anteriores de- la presente invención, puede ser conveniente inmovilizar o el HM74 o una de sus moléculas objetivo, para facilitar la separación de las formas complejas de las que no forman complejo de una o ambas proteínas, así como para adaptar la automatización del ensayo.- La unión de un compuesto de ensayo al HM74, o la interacción del HM74 con una molécula objetivo en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para poner en contacto los reactivos. Entre los ejemplos de dichos recipientes se incluyen placas de microvaloráción, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, se pueden adsorber proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/HM74 o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/objetivo sobre perlas de glutatión-Sepharose® (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microvaloráción derivatizadas con glutatión. Después, este complejo se combina con el compuesto de ensayo y la proteína objetivo o la proteína HM74 no adsorbida y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejo (p. ej., en condiciones salinas y de pH fisiológicas). Después de la incubación, las perlas o pocilios de la placa de microvaloráción se lavan para eliminar cualesquiera componentes no unidos y se mide la formación de complejo directa o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito antes. Alternativamente, se pueden disociar los complejos de la matriz, y determinar el nivel de actividad o unión del HM74 usando técnicas patrón. También se pueden usar otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices en los ensayos de cribado de la invención. Por ejemplo, se puede inmovilizar el H 74 o una de sus moléculas objetivo, usando la conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas objetivo o de HM74 biotiniladas se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotiniliación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizando en pocilios de placas de 96 pocilios revestidas con estreptavidina (Pierce Chemicals). Alternativamente, se pueden unir a los pocilios de la placa anticuerpos reactivos con HM74 o. moléculas objetivo, pero que no interfieren en la unión de la proteína HM74 a una molécula objetivo, y desligar la molécula objetivo o HM74 atrapada en los pocilios por conjugación con el anticuerpo. Entre los métodos para detectar dichos complejos, además de los descritos antes para los complejos inmovilizados en GST, se incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con ??74· o molécula objetivo, así como ensayos con enzimas ligadas que se basan en detectar la actividad enzimática asociada con HM74 o molécula objetivo. En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de HM74 en un método en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato, y se determina la expresión del ARNm o proteína de HM74 en la célula. Se compara el nivel de expresión del ARNm o proteína de HM74 en presencia del compuesto candidato, con el nivel de expresión del ARN o proteína de HM74 en ausencia del compuesto candidato. Después, el compuesto candidato se puede identificar como un modulador de la expresión del HM74 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o proteína de HM74 es mayor (estadísticamente significativamente mayor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador o agonista del ARNm o proteína de HM74. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o proteína de HM74 es menor (estadísticamente significativamente menor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor o antagonista del ARNm o proteína del HM74. Si la actividad de HM74 disminuye en presencia de ligando o agonista, o en un HM74 constitutivo, por debajo de los valores iniciales, el compuesto candidato se identifica como un agonista inverso. El nivel de expresión del ARNm o proteína de HM74 en las células se puede determinar por métodos descritos en la presente memoria para detectar el ARNm o proteína de HM74 Puesto que se pueden preparar cantidades grandes de HM74 puro, se puede determinar la caracterización física de la conformación de zonas de función probable para el diseño racional de fármacos. Por ejemplo, la región IC3 de la molécula y los dominios EC son regiones de interés particular. Una vez que se ha diferenciado la forma y configuración iónica de una región, se pueden configurar fármacos candidatos que interaccionan con esas regiones, y después se pueden ensayar en células intactas, en animales y en pacientes. Entre los métodos que permitirían obtener dicha información de la estructura se incluyen la cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN, modelización molecular, etc. La estructura 3-D también puede conducir a la identificación de sitios conformacionales análogos en otras proteínas conocidas, donde existen fármacos conocidos que actúan en un sitio particular. Esos fármacos o sus derivados, pueden ser útiles con HM74. La invención además se refiere a nuevos agentes identificados por los ensayos de cribado antes descritos, y a sus usos para tratamientos, como se describe en la presente memoria. La presente invención proporciona tanto métodos profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto con riesgo (o susceptible) de padecer un trastorno, o que tiene un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del HM74. Dichos trastornos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan, trastornos inflamatorios tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y artritis reumatoide. En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un sujeto una enfermedad o estado asociado con la expresión o actividad aberrante del HM74, administrando al sujeto un agente que modula la expresión del HM74 o al menos una actividad del HM74. Los sujetos que tienen riesgo de padecer una enfermedad causada o a la que contribuye la expresión o actividad aberrante del HM74, se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en la presente memoria. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de que se manifiesten los síntomas característicos de la aberración del HM74, de modo que se prevenga, o alternativamente, se retrase el avance de una enfermedad o trastorno. Dependiendo del tipo de aberración de H 74, se puede usar, por ejemplo, un agente agonista de HM74 o antagonista de HM74 para tratar al sujeto. El agente adecuado se puede determinar basándose en . ensayos de cribado descritos en la presente memoria. Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para modular la expresión o actividad del HM74 con propósitos terapéuticos. El método de modulación de la invención, implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades del HM74 asociadas con la célula. Un agente que modula la actividad de HM74 puede ser un agente como se describe en la presente memoria, tal como una furosemida, ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado natural de una proteína HM74, un péptido, un peptidomimético de HM74 u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más actividades biológicas del HM74. En otra realización, el agente inhibe una o más actividades biológicas del HM74. Entre los ejemplos de dichos agentes inhibidores se incluyen anticuerpos anti- HM74. Los métodos de modulación se pueden llevar a cabo in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente), o alternativamente in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o actividad aberrante de un HM74. En una realización, el método implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de cribado descrito en la presente memoria) o una combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regulan positiva o negativamente) la expresión o actividad del HM74. La estimulación de la actividad del HM74 es conveniente en situaciones en las que el HM74 está regulado negativamente de forma anómala y/o en las que es probable que la mayor actividad del HM74 tenga un efecto beneficioso. Inversamente, la inhibición de la actividad del H 74 es conveniente en situaciones en las que el HM74 está regulado positivamente de forma anómala y/o en las que es probable que la menor actividad del HM74 tenga un efecto beneficioso. La invención se ilustra con más detalle con los siguientes ejemplos que no se deben considerar limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de la solicitud se incorporan por la presente como referencia. Ejemplo 1 - Generación de células de mamíferos que expresan HM74 El ADNc que codifica el H 74 se clona en un vector de expresión y se transfecta a células de mamíferos, tales como células CHO o células 293. Para generar células de mamífero que sobreexpresan el HM74, se cultivan células de mamífero en una placa de cultivo tisular de seis pocilios de 35 mm (3 x 105 células de mamífero por pocilio (ATCC Catálogo no. CRL-1573)) en 2 mi de medio DMEM (Gibco/BRL, Catálogo n° 11765-054) en presencia de suero bovino fetal al 10% (Gibco/BRL Catálogo n°. 1600-044). Después, las células se incuban a 37°C en un incubador con C02 hasta que las células son 50-80% confluentes. La secuencia del ácido nucleico ADNc clonado del HM74 se inserta en un vector de clonación pcDNA 3.1 (Invitrogen, Catálogo n° V790-20). Se diluyen 2 //g del ADN en 100 µ\ de medio Ham F12 sin suero. Por separado, se diluyen 25 µ\ de reactivo Lipofectamine (Life Technologies, Catálogo n° 18324-020) en 100 µ\ de medio Ham F12 sin suero. La solución de ADN y la solución de Lipofectamine después se mezclan suavemente y se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos para permitir la formación de complejos de ADN-lípido. Las células se aclaran una vez con 2 mi de medio Ham F12 sin suero. Para cada transfección (seis transfecciones en una placa de seis pocilios), se añaden 0,8 mi de medio Ham F12 sin suero a la solución que contiene los complejos de ADN-lípido (volumen total 0,2 mi) y se mezcla suavemente. Después, con la mezcla resultante (en lo sucesivo la "mezcla de trasnfección") se cubren (0,8 mi + 0,2 mi) las células aclaradas. No se añaden reactivos antibacterianos. Después, las células se incuban con los complejos de ADN-lípido durante 16 horas a 37°C en un incubador con C02 para permitir la transfección. Después de completar el periodo de incubación, se añade 1 mi de medio Ham F12 que contiene suero bovino fetal al 10% a las células sin separar primero la mezcla de transfección. 18 horas después de la transfección, se aspira el medio qye cubre las células. Después, las células se lavan con PBS pH 2-4 (Gibco/BRL Catálogo n° 10010- 023) y se sustituye el PBS por medio HAM F12 que contiene suero al 5% ("medio selectivo"). 72 horas después de la transfección, las células se diluyen diez veces en medio selectivo que contiene el agente antibacteriano geneticina con 400 µg/ \ (Life Technologies, Catálogo n° 1 1811 ). Ejemplo 2 - ensayo agonista Para cribar agonistas del HM74 humano, se puede acoplar artificialmente el HM74 a un mecanismo Gq. La activación del mecanismo Gq estimula la liberación de Ca2+ de las vesículas del retículo sarcoplasmático dentro de la célula. El Ca2+ es liberado en el citoplasma donde se puede detectar usando colorantes quelantes de Ca2+. Se usa un lector de placa de imágenes fluorométricas o aparato FLIPR® (Molecular Devices) para controlar cualquier cambio resultante en la fluorescencia. La actividad de un agonista se refleja por cualquier aumento de la fluorescencia. Se diseñan previamente células CHO-KI que expresan HM74 para expresar una forma indiscriminada de proteína Gq (G„i6). Para preparar dichas células, se obtienen en el comercio células CHO acopladas con Gai6 (células Molecular Devices LIVEWARE™, Catálogo n°. RD-HGAI6) y se sigue el protocolo del Ejemplo 1 , para facilitar la expresión de HM74 en esas células. Las células se mantienen en fase logarítmica de crecimiento a 37°C y C02 al 5% en medio Ham F12 (Gibco/BRL, Catálogo n° 1 1765-054) que contiene suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 Ul/ml (Gibco/BRL, Catálogo n° 15140-148), estreptomicina 100 //g/ml (Catálogo n° 15140-148, Gibco/BRL), geneticina 400 µg/m\ (G418) (Gibco/BRL, Catálogo n° 10131-035) y zeocina 200 ^g/ml (Invitrogen, Catálogo n° R250-05). Un día antes de un ensayo, se cultivan en placa 12.500 células/pocilio de las células CHO-K1 en placas de ensayo de fondo transparente de 384 pocilios, con un volumen por pocilio de 50 µ\ (Greiner/ arsh, Catálogo n° N58102) usando un dispositivo Multidrop 96/384 (Labsystems, Type 832). Las células se incuban a 37°C en un incubador humidificado con C02 al 5% (incubador con camisa de agua y C02 Forma Scientific Modelo 3110). Se preparan las siguientes soluciones madre: una solución madre 1 M de Hepes (pH 7,5) (Gibco/BRL, Catálogo n° 15630-080); una solución madre 250 mM de probenicida (Sigma, Catálogo n° P8761) preparada en NaOH 1 N; y una solución madre 1 mM de colorante Fluo 4-AM (Molecular Probes, Catálogo n° Fl 4202) preparada en DMSO (Sigma D2650). El tampón de reacción se prepara con 1000 mi de solución salina equilibrada de Hank (Fisher/Mediatech, Catálogo n° MT21023), 20 mi de la solución madre de Hepes 1 M y 10 mi de la solución madre de probenicida 250 mM. Para preparar el tampón de carga, se mezclan 1,6 mi de la solución madre de colorante Fluo 4-AM 1 mM con 0,32 mi de ácido plurónico (Molecular Probes, Catálogo n° P6866) y después se mezcla con 400 mi del tampón de reacción anterior y 4 mi de suero bovino fetal. Una hora antes del ensayo, se añaden 50 µ\ de tampón de carga recién preparado a cada pocilio de la placa de 384 pocilios usando un dispositivo Multidrop 96/384. Las células se incuban a 37°C en un incubador humidificado para maximizar la captación de colorante. Inmediatamente antes del ensayo, las células se lavan 2 veces con 90 µ\ de tampón de reacción usando un lavador de células EMBLA 384 (Skatron; Modelo N° 12386) con la cabeza de aspiración fijada al menos 10 mm por encima del fondo de la placa, dejando 45 µ\ de tampón por pocilio. La cámara CCD (Princeton Instruments) del instrumento FLIPR® II (Molecular Devices) se fija con una apertura de diafragma de 2,0 y un tiempo de exposición de 0,4 segundos. La cámara se usa para controlar en las placas de células la precisión de la carga de colorante. Se ensaya una biblioteca de compuestos que contiene posibles compuestos de tipo furosemida, con una concentración de aproximadamente 10 µ?, cada uno en tampón salino fisiológico, por pocilio. Se miden los cambios en la fluorescencia durante 10 segundos antes de añadir el compuesto. Después de añadir el compuesto, se mide la fluorescencia cada segundo durante el primero minuto, seguido de exposiciones tomadas cada seis segundos para un tiempo total de análisis experimental de tres minutos. Se añaden alícuotas de 5 µ\ de la solución madre de compuesto 100 //M después del décimo barrido, dando una concentración final de compuesto en las células de 10 //M. Se registran los cambios de. fluorescencia máxima durante los primeros 80 barridos como una medida de la actividad agonista, y se comparan con el cambio de fluorescencia máxima inducida por ATP 10 //M ATP (Sigma A9062). Se encontró que una serie de compuestos de tipo furosemida activaban el HM74. Ejemplo 3 - Ensayo antagonista Para cribar antagonistas del HM74 humano, se puede acoplar artificialmente el HM74 a un mecanismo Gq. Como en el ejemplo 2, se usa un aparato FLIPR® para controlar cualquier cambio que se produzca en la fluorescencia. La actividad de un antagonista se refleja por cualquier disminución de la fluorescencia. Se diseñan previamente células CHO-K1 que expresan HM74, para expresar una forma indiscriminada de la proteína Gq (Go16), como se describe en el Ejemplo 2. Las células se mantienen en fase logarítmica de crecimiento a 37°C y C02 al 5% en medio Ham F12 (Gibco/BRL, Catálogo n° 11765-054) que contiene suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 Ul/ml (Gibco/BRL, Catálogo n° 15140-148), estreptomicina 100 //g/ml (Catálogo n° 15140-148, Gibco/BRL), geneticina 400 yg/ml (G418) (Gibco/BRL, Catálogo n° 10131-035) y zeocina 200 / g/ml (Invitrogen, Catálogo n° R250-05). Un día antes de un ensayo, se cultivan en placa 12.500 células/pocilio de las células CHO-K1 en placas de ensayo de fondo negro/transparente de 384 pocilios, con un volumen por pocilio de 50 µ\ (Greiner/Marsh, Catálogo n° N58102) usando un dispositivo Multidrop 96/384 (Greiner/Marsh, Catálogo n° N58102). Las células se dejan incubar a 37°C en C02 al 5% humidificado. Se preparan las siguientes soluciones madre: una solución madre 1 M de Hepes (pH 7,5) (Gibco/BRL, Catálogo n° 15630-080); una solución madre 250 mM de probenicida (Sigma, Catálogo n° P8761) preparada en NaOH 1 N; una solución madre de colorante Fluo 4-AM 1 mM (Molecular Probes, Catálogo n° F14202) preparada en DMSO (Sigma D2650); y una solución madre de ligando o antagonista. El tampón de reacción se prepara con 1000 mi de solución salina equilibrada., de Hank (Fisher/Mediatech, Catálogo n° MT21023), 20 mi de la solución madre de Hepes 1 M y 10 mi de la solución madre de probenicida 250 mM y CaCI2 1 mM. Para preparar el tampón de carga, se mezclan 80 /I de la solución madre de colorante Fluo 4-AM 1 mM con 16 //I de ácido plurónico (Molecular Probes, Catálogo n° P6866) y después se mezcla con 20 mi del tampón de reacción anterior y 0,2 mi de suero bovino fetal.

Treinta minutos antes del ensayo, se añaden 30 µ\ de tampón de carga recién preparado a cada pocilio de la placa de 384 pocilios usando un dispositivo Muitidrop 96/384. Las células se incuban a 37°C en un incubador con C02 humidifícado para maximizar la captación de colorante. Inmediatamente antes del ensayo, las células se lavan 3 veces con 100 µ\ de tampón de reacción usando un lavador de células EMBLA 384 con la cabeza de aspiración fijada al menos 40 mm por encima del fondo de la placa, dejando 45 µ\ de tampón por pocilio. Se añaden 5 µ\ de la solución madre de compuesto antagonista 1 Q0 µ? a las células usando un dispositivo Piatemate-384 pipettor (Matrix). La concentración de compuesto durante la etapa de incubación es aproximadamente 10 µ?. Las células se ponen en el aparato FLIPR® II y se mide la fluorescencia de la placa cada segundo durante el primer minuto seguido de exposiciones tomadas cada seis segundos para un tiempo total de análisis experimental de tres minutos. Después del décimo barrido se añade antagonista o ligando (10 µ?). Después de cada adición, las 384 puntas de las micropipetas se lavan con 20 µ\ de DIVISO 0,01% en agua. Las células con HM74 se pueden exponer a un agonista identificado o no, antes de ensayar antagonistas candidatos. Ejemplo 4 - Ensayo de unión al receptor Para preparar fracciones de membrana que contengan HM74, se recogen líneas de células CHO que expresan HM74 por incubación en solución salina tamponada con fosfato (10 mi) que contiene EDTA 1 mM. Las células se lavan 3 veces más con solución salina tamponada con fosfato que contiene EDTA 1 mM (10 mi) antes de volver a suspenderlas en 5 mi de tampón A (Tris-HCI 50 mM (pH 7,8) (Sigma T6791), MgCI25 mM (Sigma M8266) y EGTA 1 mM (Sigma 0396). Después, las células se rompen en un homogeneizador de tejidos (Poiytron, Kinemetica, Modelo PT 10/35) durante 1 minuto. El homogeneizado resultante se centrifuga en una centrífuga refrigerada Sorvall Instruments RC3B a 49.000 X g a 4°C durante 20 minutos. El sedimento resultante se vuelve a suspender en25 mi de tampón A y se repite la etapa de centrifugación 3 veces. Después de la centrifugación final, el sedimento se vuelve a suspender en 5 mi de tampón A, se divide en partes alícuotas, y se almacena a -70°C. Se lleva a cabo un ensayo de unión al receptor usando la fracción de membrana y un agonista radiomarcado de interés como trazador. El ensayo se lleva a cabo en una placa de 96 pocilios (Beckman Instruments). La reacción de unión consiste en 18 µ de la preparación de células CHO en presencia de agonista radiactivo (0,01 nM - 25 nM) en un volumen final de 0,2 mi de tampón A que contiene albúmina de suero bovino al 1% (Sigma, Catálogo n° 34287) (véase, Im et al., J. Biol. Chem. (2000) 275(19):14281-14286). La reacción se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se termina por filtración a través de filtros Whatman GF/C en un recolector de multicanales (Brandell) que se trata previamente con polietilenimina al 0,3% (Sigma, Catálogo n° P3143) y albúmina de suero bovino al 0,1 % (BSA) durante 1 hora. La mezcla se aplica al filtro y se incuba durante una hora. Los filtros se lavan 6 veces con 1 mi de Tris-HCl 50 m helado, pH 7,6. La unión específica se calcula basándose en la diferencia entre la unión total y la unión no específica (fondo) para cada concentración de trazador, midiendo la radiactividad. Se'obtienen de 8 a 16 datos de concentración para determinar la unión del agonista al receptor conseguida en un estado de equilibrio entre el agonista y el receptor (parámetros de unión en equilibrio). En un ensayo competitivo, se añade un compuesto de ensayo a la mezcla para que compita por la unión del agonista radiactivo en el receptor (valores de unión competitiva). Se preparan curvas de inhibición para determinar la concentración necesaria para lograr 50% de inhibición de la unión (IC50). Ejemplo 5 - Moléculas pequeñas agonistas Se expuso una serie de moléculas de tipo furosemida a células que expresaban HM74 como se ha descrito antes. Las moléculas objetivo se marcaron para determinar si se producía la unión a HM74. La unión se detectó determinando el grado de mareaje de las células después de lavado. La unión también se determinó aislando el HM74 por electroforesis en gel 2-D, y determinando el grado de mareaje asociado con esta proteína. Después de determinar esta unión, o independientemente de la determinación de la unión, se determinó la capacidad de un agonista candidato para activar HM74. Se usó el ensayo FLIPR para evaluar la movilización de calcio intracelular en la unión de la molécula objetivo al HM74. Así, se identificaron las moléculas que producen movilización de calcio. Habiéndose descrito ahora la invención, los expertos en la técnica sabrán que se pueden hacer diferentes cambios y modificaciones de las enseñanzas de la presente memoria, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención enseñada en la presente memoria. Todas las referencias citadas en esta memoria se incorporan en su totalidad en esta memoria.

Claims (6)

REIVINDICAC10NES

1. Un método terapéutico para modular la actividad señalizadora de HM74 o la transducción de señales, en un paciente que necesite tratamiento, que comprende administrar a dicho paciente una molécula que tiene la estructura: en la que R es hidrógeno, o alquilo Ci-Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo Ci-Ci3, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; · Y es alquilo CrCi8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo Ci-C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-Ci8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-Ci8que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-C18 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-Ci8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.

2. Un método para identificar un agonista de HM74, que comprende poner en contacto un potencial agonista con una célula que expresa HM74, y determinar si en presencia de dicho potencial agonista la actividad señalizadora de HM74 es mayor respecto a la actividad de H 74 en ausencia de dicho potencial agonista, en ei que dicho potencial agonista tiene la estructura en la que R es hidrógeno, o alquilo C C 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C-I8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo Ci-C18> que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo Ci-C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C-i8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo 0·,-018, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en ias que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-Ci8 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-C 8 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.

3. Un método para identificar un agonista inverso de HM74, que comprende poner en contacto un potencial agonista inverso con una célula que expresa H 74, y determinar si en presencia de dicho potencial agonista inverso la actividad de HM74 es menor respecto a la actividad de HM74 en ausencia de dicho potencial agonista inverso, y es menor en presencia de un agonista, en el que dicho potencial agonista inverso tiene la estructura : en la que R es hidrógeno, o alquilo C-|-C 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo Cr Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo Ci-Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Cis, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo CrC 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquiniio C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un ariio C3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C13, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-Ci8 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-C18 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C 8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.

4. Un método para identificar un antagonista de HM74 que comprende: poner en contacto un potencial antagonista con una célula que expresa HM74 y determinar si en presencia de dicho potencial agonista la actividad señalizadora de HM74 es menor con respecto a la actividad de HM74 en presencia de un agonista, en el que dicho potencial antagonista tiene la estructura: en la que R es hidrógeno, o alquilo CrC18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquiniio CrC18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C-i8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloaiquilo C5-C 8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-C18 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloaiquilo C3-C18 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C 8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.

5. Un compuesto de fórmula: en la que R es hidrógeno, o alquilo CrC 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo CrC18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Cis, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloaiquilo C5-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo. C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo Ci-Ci8. que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C Cis, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-C 8 que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-Ci8 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C-|8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.

6. Un método para modular la inflamación que comprende, exponer a un paciente que necesita tratamiento, a una cantidad moduladora de la inflamación de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula: en la que R es hidrógeno, o alquilo CrC 8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C C18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo C Ci8, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo 3-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-C18, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones; Q y X son cada uno O, S o NR; Y es alquilo CrCi8l que puedé estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; alquenilo C-I-C-IS, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; un alquinilo CrC18, que puede estar ramificado, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones un arilo C3-Ci3, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o un cicloalquilo C5-Ci8, que puede contener un grupo lateral, puede contener un puente, puede contener un heteroátomo o puede estar sustituido, o sus combinaciones; o sus combinaciones, en las que X e Y pueden estar fusionados dentro de uno o más anillos cuando X es N, en el que dicho anillo es un heterociclo C3-C18, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un heteroarilo C3-C18 que puede , estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, un cicloalquilo C3-Ci8 sustituido, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral, o arilo C3-C 8, que puede estar ramificado y que puede contener un grupo lateral; y y cada Z es R.