200528713 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種可高精度地測定試料中之基質之方法 以及其測定用試劑，上述方法係利用酶反應測定試料中之 基質的方法’可減輕由於試料中共存之血紅素對測定系所 造成之干擾，可高精度地測定試料中之基質。 【先前技術】 金液、尿等之生物體試料中存在的特定成分之測定，其 隨著已了解其存在量之變動與疾病之關聯，已經成為診斷 疾患、解明病態、判斷治療效果等方面不可或缺者。現在， 作為生物體試料（例如血清）中之特定成分的測定方法，一般 採用酶法，其係使用於作為目的之特定成分或源自該特^ 成分之成分(以下，有時總稱為「基質」)中特異性反應之酶 從而實施酶反應，測定該結果生成之生成物，藉此加以定 量者。該等酶法中’廣為普及有下述方法：使如氧化酶之 過氧化氫生成酶（以下，有時稱為「氧化酶」㈣ =所生成之過氧化氫使㈣氧化酶以及被氧化性呈色試劑 導入發色系，將該呈色實施比色定量。 至於利用上述氧化酶之其暂认丨 儿乳啤之基質的測定方法中之基質 可列舉葡萄糖、膽固醇、中性脂 汾昨傲 P_ B缺 口生月^肪、磷脂質、游離脂肪酸' 尿ι、肌酸酐、唾液酸、聚胺以及糖化血紅素等 ^ 床檢查領域中得以實際測定。 已於臨 但是’由於該測定方法主張將藉由氧化酶所實 反應作為基礎原理，因此存有下述_ n 97689.doc 200528713 共存之抗壞血酸、膽紅素、血紅素等之生物體内還原物質 所造成之干擾，測定值中會產生負誤差。又，膽紅素或血 、’工素係因其自身於可見光區域中具有吸收作用，故而眾所 周知有下述情形：與比色定量時之測定波長重疊造成誤 差，或膽紅素或血紅素自身吸光藉由來自外部之光線或測 定試劑中之成分經時性變化從而影響測定結果。除如上所 述以外，亦眾所周知有容易受到脂質等造成之渾濁干擾之 情形。 上述物質中，通常血紅素係極微量地混入至生物體試料 (血清、血漿、尿、唾液、髓液等）中，但除溶血造成之疾患 等情形以外，由於抽血等測定用試料之採樣條件、血液試 料之凋製、保存條件，有時會二次性地漏出至試料中。又， 將全血、血球或處理該等獲得之溶血液設為試料之情形 =，自然而然地會混入有血紅素。故而，利用氧化酶之基 質測定方法中，減輕血紅素之干擾已經成為重要課題。 至於使用氧化酶定量試料中之基質時減輕血紅素干擾之 方法，眾所周知有下述方法：以避免血紅素自身吸收波長 之特疋波長實施測定之方法(例如，參照日本專利特開平 9-119932號公報），使用陽離子系或兩性界面活性劑之方法 (例如，參照曰本專利特開平弘1〇696號公報）。 但是，避免血紅素自身吸收波長而以特定檢測波長實施 測定之方法中，不僅限定有比色定量時之檢測波長，並且 亦對測定裝置加以㈣。又，使用陽離子系或兩性界面活 性劑之方法中，存有與試料混合時會產生渾濁，或影響酶 97689.doc 200528713 活性之情形。 上所述以外’亦眾所周知有組合使用兩種陰離子系界 面’舌性劑之方法（參照日本專利特開平8-89288號公報），該 方法中為避免由於陰離子系界面活性劑所造成之酶蛋白質 改性’必須同時使用特定量之烷基磺酸鹽以及烷基萘磺酸 鹽。 、 【發明内容】 本發明係提供一種方法以及其測定用試劑，該方法係利 用酶反應測定試料中之基質的方法，可減輕試料中共存之 血紅素對測定系所造成之干擾，可適用於各種自動分析裝 置且操作簡便、效率較高。 本發明者等鑒於相關實情，於利用酶反應測定試料中之 基質的方法中，積極討論有關於減輕試料中共存之金紅素 對測疋糸所造成之干擾的方法後，發現藉由特定陰離子系 界面活性劑處理試料，可減輕血紅素對測定系所造成之干 擾，從而完成本發明。 即’本發明係提供一種於含有血紅素之試料中之基質的 測定方法，其係使對應於基質之氧化酶發揮作用，將生成 之過氧化氫使用過氧化酶以及被氧化性呈色試劑實施光學 性測定，藉此測定試料中之基質者，其特徵在於：藉由陰 離子系界面活性劑處理含有血紅素之試料，該陰離子系界 面活性劑係選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙稀烧基 苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙稀烧基 磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙稀烧基 97689.doc 200528713 醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥站酸類以 及基本基叾黃酸鹽類者。 又，本發明係提供一種於含有丘紅素之試料中之基質測 定用試劑，其特徵在於··包含有（A)陰離子系界面活性劑， 其選自聚氧乙_基㈣酸鹽類' 聚氧乙烯㈣苯基鱗硫 I鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀 酸類、聚氧乙㈣基醚㈣鹽類、聚氧乙烯烧基醚續酸鹽 類月桂基硫酸二乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類以及烷基苯 基醚％酸鹽類，（B)氧化酶，其係作用於基質而生成過氧化 氫者，以及（C)過氧化酶及被氧化性呈色試劑。 又，本發明係提供一種糖化蛋白質、糖化肽或糖化胺基 酸之浪度或該等之濃度比之測定方法，其特徵在於··至少 包含有（1)界面活性劑，（2)作用於糖化蛋白質，從而生成果 糖肽之蛋白質分解酶，以及（3)作用於果糖狀，從而生成過 氧化氫之酶。 又，本發明係提供一種血紅素濃度、血紅素Alc濃度以及 血紅素Ale濃度比之測定方法，其特徵在於··測定至少包含 以界面活性劑實施前處理之血紅素的試料中之血紅素，進 而於血紅素測定用反應液中使生成果糖纈胺醯基組胺酸之 蛋白質分解酶發揮作用，測定血紅素Ale濃度。 又，本發明係提供一種血紅素濃度、血紅素Ale濃度以及 血紅素Ale濃度比之測定方法，其特徵在於包含··將含有血 球之試料與包含界面活性劑之反應液混合，從而自血球溶 出血紅素之步驟；稀釋本反應液，光學性求得血紅素濃度 97689.doc 200528713 之步驟；於血紅素中使蛋白質分解酶發揮作用，從而至少 生成果糖绳胺醯基組胺酸之步驟；至少於果糖顯胺酿基也 胺酸中·，將其作為基質從而使生成過氧化氮之酶發揮作用 的步驟，使過氧化氫與過氧化酶以及被氧化性呈色試劑發 揮作用之步驟；測定由於呈色化合物生成所造成之吸光^ 變化，從而求得血紅素Alc濃度之步驟；以及根據血紅素濃 度與血紅素Ale濃度而求得血紅素Alc濃度比之步驟。 又，本發明係提供一種血紅素濃度、血紅素A。濃度以及 血紅素Ale濃度比之測定中試料之前處理方法，其特徵在 於.使用選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙稀燒基峻之硫酸鹽 類、磷酸醋類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥轴酸： 以及烷基苯基醚磺酸類者之非離子系界面活性劑及/或陰 離子系界面活性劑者。 又，本發明係提供一種血紅素濃度之測定方法，其特徵 在於··於包含自血球溶出血紅素之步驟以及求得血紅素濃 度之步驟的血紅素濃度測定中，至少選自聚氧乙烯衍生 物、聚氧乙烯烷基醚之硫酸鹽類、磷酸酯類、月桂基硫酸 三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類以及烷基苯基醚磺酸類之使 用非離子系界面活性劑以及/或者陰離子系界面活性劑者。 進而，本發明係提供一種使用生化學自動分析裝置測定 血紅素Ale濃度比之方法，其特徵在於··將使用生化學自動 分析裝置測定血紅素A1 c濃度比作為目的，設定生化學自動 分析裝置之操作條件時，（1)分別設定血紅素濃度測定與血 紅素Ale濃度測定之操作條件，（2)可共用血紅素濃度測定 97689.doc -10 - 200528713 试劑作為血紅素Ale濃度測定用之構成試劑，（3)可共用血 紅素濃度測定用與血紅素Ale濃度測定用之試料，以及（4) 可將血紅素濃度測定與血紅素Ale濃度測定之測定波長設 為相同。 根據本發明之基質之測定方法，可減輕試料中共存之也 紅素干擾，從而高精度地測定基質。又，本發明之基質之 測定方法係可以簡便操作實施測定，故而可適用於各種分 析方法，於臨床檢查領域中亦極為有用。 【實施方式】 本發明之基質之測定方法，其目的在於減輕試料令共存 之血紅素干擾，除以特定陰離子系界面活性劑處理試料以 外，亦可根據眾所周知之酶法實施。 作為可適用於本發明之試料，只要係含有血紅素之試料 則未加以特別限制。作為生物體試料，可列舉全血、血球、 血π、血漿、髄液、汗液、尿液、淚液、唾液、皮膚、黏 膜以及毛髮等。其中，較好是全血、血球、血清或血漿。 該等試料當然可直接供給至測定，亦可過濾或透析處理後 供給至測定，又，若有必要亦可將試料（基質）實施濃縮、萃 取、稀釋等。 上述稀釋係可藉由水或緩衝液實施。對於該情形使用之 緩衝液種類、濃度未加以特別限制，可使用〇.〇〇〇〇1〜2 m〇1/L 濃度，較好是0.001〜1 m〇l/L濃度之磷酸、苯二甲酸、檸檬 酸、三胺基甲烷鹽酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、 醋酸以及固得（Good)(MES，PIPES，ADA等）緩衝液等。 97689.doc -11 - 200528713 可使用於本發明之基質之測定方法的特定陰離子系界面 活性劑，其係選自聚氧乙烯烧基驗硫酸鹽類、聚氧乙浠烧 基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷 基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷 基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類 以及烷基苯基醚磺酸鹽類之陰離子系界面活性劑，較好是 聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽、聚 氧乙烯烷基醚磷酸類或烷基磺基琥珀酸類，特別好的是聚 氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽或烷基磺基琥 珀酸類，最好是聚氧乙烯烷基醚磷酸。該等特定陰離子系 界面活性劑可作為零售品獲取。 至於聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類，例如可列舉Nikkor SBL-4N、Nikkor SBL-2T-36(以上為曰本油脂公司製造）， Emar 20T、Emar 327、Emar 20C(以上為花王公司製造）， Hitenol 225L、Hitenol 325D、Hitenol NF13、Hitenol NF15(以 上為第一工業製藥公司製造），Sunnol LMT-1430、Sunnol DM1470(以上為Lion公司製造）等。至於聚氧乙烯烷基苯基 醚硫酸鹽類，例如可列舉Nikkor SNP-4N(日本油脂公司製 造）、Emar NC3 5(花王公司製造）等。聚氧乙烯烷基醚磷酸 類亦可係磷酸單酯、磷酸二酯或其混合物，至於聚氧乙烯 烧基醚磷酸類，例如可列舉Plysurf A208B、Plysurf A219B、 Plysurf A208S、Plysurf A212C、Plysurf A212E、Plysurf A215C(以上為第一工業製藥公司製造）等。該等聚氧乙烯烷 基醚雄酸中，較好的是Plysurf A208B。至於聚氧乙烯烧基 97689.doc -12- 200528713 續基號始酸類，例如可列舉响奥氦特諾爾s_7〇、 諾爾L-30、响奥氨特諾爾LM_2〇(以上為第_工業製藥公^ 製造)專。至於聚氧乙烯烷基鍵缓酸鹽類，例如 啊基波應-酬V(花王公司製造），响奥氣特諾爾 ECL-30(第-工業製藥公司製造），阿努則扣富奶％、阿努 則扣富2PS45(以上為新日本理化公司製造）等。至於聚氧乙 烯烧基轉續酸類，例如可列舉裏奥諾爾0AI_N、裏奥諾 〇BI(以上為Lion公司製造）等。 、 至於月桂基硫酸三乙醇胺，例如可列舉E_ td(花王公 司製造)。至於烷基磺基琥珀酸類’例如可列舉普來克斯 CS(花王公司製造）。至於烷基苯基醚磺酸鹽類，例如可列 舉普來克斯SS-H(花王公司製造）。 含有血紅素之試料之處理可藉由混合該特定陰離子系界 面活㈣!與試料之處理實施。特定陰離子系界面活性劑之 使用里，其作為與上述全血、血球、血清等試料混合後之 濃度為0.0001〜10%，較好是〇 〇〇1〜3%。對於含有血紅素之 試料之處理時間、處理溫度未加以特別限制，但例如適用 於自動分析裝置之情形時，較好是處理時間為五分鐘，處 理溫度為37°c等。又，適用於自動分析裝置之前，亦可實 施另行處理。該等處理之條件均可根據實驗適宜選擇。同 樣地藉由特疋陰離子系界面活性劑處理試料時，只要pH值 或添加物等在利用酶反應測定基質時不會造成阻礙的範圍 内，則未加以特別限制。 藉由本發明之基質之測定方法可測定之基質，其若係可 97689.doc -13- 200528713 藉由使用氧化酶之酶法測定者，則未加以限制。故而，本 發明之「基質」中包含有下述情形：其自身係可成為氧化 酶基質之物質的情形，以及藉由酶反應或幾種處理所生成 之生成物可成為氧化酶基質之情形（相當於源自上述特定 成分之成分）。至於該等基質，可例示有葡萄糖、甘露糖、 半乳糖等之糖類，膽固醇、中性脂肪、磷脂質、游離脂肪 酸等之脂質類，糖化白蛋白、糖化血紅素等之糖化蛋白質 類，尿酸、尿素、肌酸酐、唾液酸以及聚胺等。 該等中，葡萄糖、尿酸等相當於其自身可成為氧化酶基 質之物質之情形，將血清中之酯型膽固醇藉由加水分解酶 處理所獲得之膽固醇或將血清中之糖化蛋白質藉由蛋白質 分解酶處理所獲得之糖化肽以及糠化胺基酸等，該等相當 於藉由酶反應或幾種處理所生成之生成物可成為氧化酶基 質之情形。 藉由酶反應或幾種處理所生成之生成物於可成為氧化酶 基質之情形中，進而以藉由蛋白質分解酶處理糖化蛋白 質’從而可獲得成為氧化酶基質之糠化肽以及糖化胺基酸 為例加以說明。 該情形之蛋白質分解酶只要具有蛋白質分解活性、肽分 解活性，則亦可係源自微生物、源自動物、源自植物等之 任一種’未加以特別限制。可使用自以短時間且高效率為 目的之糖化蛋白質（例如血紅素Ale)游離有糖化肽或糖化 胺基酸’較好是游離有果糖肽或果糖胺基酸，特別好的是 游離有果糖顯胺醯基組胺酸或果糠纈胺酸者。具體的是， 97689.doc -14- 200528713 可列舉蛋白酶κ、胰蛋白酶、菠羅蛋白酶、羧基肽酶、木瓜 蛋白酶、胃蛋白酶以及胺基肽酶等作為研究用試劑而廣為 零售者，或中性蛋白酶、Toyoteam ΝΕΡ(以上為東洋紡公司 製造）、酸性蛋白酶、驗性蛋白酶、摩爾新、AO蛋白酶、肽 酶（以上為 Kikkoman公司製造）、Smiteam CP、Smiteam TP、 Smiteam LP50D(以上為新日本化學工業公司製造）、 Samoase PC10F、Protin PC、Protin PC10F、Protin PS10、 Protin NY10、Protin NL10、Protin NC25(以上為大和化成 公司製造）、Actinase AS(科研製藥公司製造）、Pronase E(Roche 公司製造）、Umamizaim、蛋白酶 S「Amano」G、 蛋白酶A「Amano」G、蛋白酶P「Amano」3G(以上為Amano Enzyme公司製造）等作為工業用途所零售者。該等蛋白質分 解酶係與作為目的之糖化蛋白質、果糖肽發生作用，使用 毛細管電泳而分析、比較作用前後之試料，藉此可確認效 果。上述蛋白質分解酶亦可單獨使用，又亦可組合兩種以 上使用。該等中較好的是源自桿菌屬、曲黴菌屬或放線菌 屬之微生物，或藉由該基因操作所生成者，或屬於金屬蛋 白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶或驗性蛋白酶者。 蛋白質分解酶之濃度若係可使作為目的之基質高效率游 離之濃度，則未加以特別限制。考慮到所使用之酶之比活 性等，可實驗性地適宜設定使用濃度。藉由蛋白質分解酶 處理時之pH值可不必特別調整，但為成為適於所使用之酶 作用的pH值，亦可藉由適當pH值調整劑，例如藉由緩衝液 調整為pH值3〜11。處理溫度較好是10〜40°C。 97689.doc -15- 200528713 至於可使用於本發明夕其哲+ w+ 具有使應敎之_氧^ / 法的氧化酶，其係 基λ虱化從而生成過氧化氫之能力的酶， 可使用二所周知之氧化酶。例如’可列舉葡萄糖氧化酶、 半礼糖λ化酶、尿酸酶、膽固醇氧化酶、果糖胺基酸氧化 酶（日本專利特開2〇〇3_79386號公報以及國際公開第 97/20039號小冊子），_胺氧化酶（日本專利特開平5_19219 號公報果糖肽氧化酶（日本專利特開·^测號公報以 及日本專利特開_·235585號公報）等。該等酶亦可係源自 微生物、源、自動物、源自植物等之任一種，亦可 因操作所製成者。進而，亦與化學㈣之有無無關:該等 酶亦可係溶液狀態，亦可係乾燥狀態，亦可保持或結合於 不溶性載體，亦可單獨使用或組合兩種以上使用。 該等酶之使用量係根據酶種類有所不同，但考慮到所使 用之酶比活性等，可實驗性地適宜設定使用濃度，未加以 特別限制。較好是0.001〜1000單位/mL，特別好的是 0.01〜10 0 0單位/ m L。發揮作用時之p Η值係考慮到所使用之 酶之最適當pH值，可使用緩衝液調整。作用溫度例如係 10〜40 C ’通常可適宜選擇使用於酶反應之溫度。 上述氧化S#係可根據需要’與其他酶、辅酶、被氧化性 呈色試劑等組合使用。至於其他酶，可列舉未將過氧化酶、 心肌黃酶或果糖纈胺酸作為基質之胺基酸代謝酶等。又， 將處理血紅素以外之生物體内干擾物質作為目的，亦可使 用抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等之酶。至於輔酶，可 列舉煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、煙醯胺腺嘌吟二核苦 97689.doc -16- 200528713 I還原型（NADH)、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADp)、煙 醯胺腺嗓呤二核芽酸還原型磷酸（NADpH)、硫代nad、硫 代NADP等。 至於被氧化性呈色試劑，若係可與過氧化氫反應進行呈 色者，則亦可係任一者。例如，可列舉4_胺基安替比林與 苯酚系、奈酚系或苯胺系化合物之組合，3_甲基_2_苯幷噻 唑酮腙與苯胺系化合物之組合等。至於可與4_胺基安替比 林組合之酚系化合物，可列舉苯酚、严氣苯酚、2,4_二氯苯 酚、2,4-二溴苯酚、2,4,6-三氣苯酚等，至於苯胺系化合物， 可列舉N，N-二甲基苯胺、n，N_二乙基苯胺、n，N-二甲基-m-曱苯胺、N，N-二乙基-m_甲苯胺、冰乙基屮磺基丙基·心甲 苯胺、N-乙基-N-(2_羥基磺基丙基）_m_甲苯胺（T〇〇s)、 N-乙基-N-(3-甲基苯基乙醯乙二胺、3-甲基-N-乙基 -N-(羥基乙基）苯胺、N-乙基羥基-3-磺基丙基）苯胺 (ALOS)、N_乙基-N_(3-石黃基丙基）苯胺（ALPS)、N，N二甲基 -m-甲氧基苯胺以及N-乙基-N-(2-羥基-3-績基丙基）-m-甲氧 基苯胺（ADOS)等。此外，可列舉N-(羧基甲基胺基羰 基）-4,4’-雙（二甲胺基）-二苯基胺·納鹽（Da-64)、10·(羧基甲 基胺基羰基）-3,7-雙（二甲胺基）-吩嗟唤·納鹽（DA-67)、10-Ν-甲基胺基甲醯基-3,7-二甲基胺基_1〇士吩噻嗓（]\/1€0?)、 ]^，：^，>1’，>^，>^’，：^”-六-3-石黃基丙基-4,4，，4"-三胺基三苯基曱烷 (TPM-PS)、二胺基聯苯胺、羥基苯基丙酸、四甲基聯苯胺 以及鄰-苯二胺等。 本發明之基質之測定方法中，亦可分別實施藉由上述陰 97689.doc -17- 200528713 離子系界面活性劑處理 的牛m 处4枓從而減輕試料中之血紅素干擾 的v驟以及測定使氧化 驟，從而測定基質，亦可^揮乍用而生成之過氧化氯的步 、 ；個階段中連續性實施該等步 ^ ^基質。反應溫度於該等兩個步驟中亦可相同亦 :上5 a本^明之基f測定用試劑成為溶液狀態之溫度， 其較好是例如1〇〜4〇。〇。 本發明之基質之^目，丨$ t 、幻疋方法不僅可減輕藉由氧化酶反應測 定基質時之血紅素干擾，並且若㈣由本發明之陰離子系 界面活性劑處理試料之階段中測定具有血紅素之吸收波^ 域中之吸光度，則可測定試料中之血紅素。藉此，由於可 測疋糖化血紅素（較好是血紅素Au)，因此就藉由本發明之 基質之測定方法測定血紅素Alc之情形加以說明。 血、’X素A1 c係包含於紅血球之血紅素經過非酶性糖化所 形成者’因可反映過去固定期間之平均血糖值，故而作為 臨床檢查中之指標受到重視。由於血紅素Alc係以對於總血 紅素存在篁之比率（％)表示，故而其測定中必須經過下述步 驟：⑴使紅血球溶血從而使血紅素放出至紅血球外，設為 可測定狀態之步驟，（ii)測定血紅素存在量之步驟，（iH)測 定血紅素Alc存在量之步驟（酶法之情形時，包含藉由蛋白 質分解酶而自血紅素Alc使特異性糖化肽或糖化胺基酸游 離的步驟以及使用特異性氧化酶測定該游離之糖化肽或糖 化胺基酸之步驟），以及（iv)將血紅素Aic存在量除以總血紅 素存在量從而求得比率之步驟（運算步驟）。再者，如此處所 述，本說明書中「基質之測定」除包含測定試料中之基質 97689.doc •18- 200528713 存在量（例如濃度）以外，亦包含測定於特定基準物質中所佔 有之存在比例（例如濃度比）。 由於本發明之陰離子系界面活性劑亦具有血紅素之甲基 化處理能力，因此可測定血紅素之吸收波長域之吸光度， 從而毫無問題地實施（ii)步驟。 ⑴步驟中可使用先前眾所周知之各種界面活性劑（例 如，作為非離子系界面活性劑之Trit〇n又_1〇〇等），但本發 明之陰離子系界面活性劑，特別是選自聚氧乙烯烷基醚之 硫酸鹽類、磷酸酯類或月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥 珀酸類以及烷基苯基醚磺酸類的陰離子系界面活性劑，其 亦可使用於（1)步驟，亦可單獨使用或亦可與先前眾所周知 之各種界面活性劑併用。又，作為⑴步驟中可單獨使用或 與本發明之陰離子系界面活性劑併用的非離子系界面活性 劑，其除先前眾所周知者以外，亦可使用作為聚氧乙烯衍 生物之Emulgen類（花王公司製造、Emuigen 709、Emulgen 108、Emulgen A90、Emulgen B66 等）、Nikkor類（Nikko化學 公司製造、Nikkor BC20TX、Nikkor OP-10、Nikkor BT9 等）、 力普瑙克斯類（Lion公司製造、力普瑙克斯NC80、力普瑙克 斯 OC100 等）、Leocol類（Lion公司製造、Leocol TD90、Leocol SC120等）、Noigen類（第一工業製藥公司製造、N〇igen EA120、Noigen ET147等）、Ebon類（第一工業製藥公司製 造、Ebon 485、EbonU103等）、Pluronic類（旭電化公司製造、 Pluronic F、Pluronic TR704 等）以及 Adekatol類（旭電化公司 製造、Adekatol SO120等）。 97689.doc •19- 200528713 ⑽步驟係藉由蛋白質分解酶，使源自血紅素Au之糖化 肽或糖化胺基酸自血紅素Ale游離，進而使用果糖肽氧化酶 或果糖胺基酸氧化酶加以實施。關於㈣步驟如前所示，進 而加以詳細說明。血紅素Alc測定中，血紅素卜亞單元之胺 基末端之胺酸經過糖化的果糖㈣酸或果⑽胺酿基組 胺酸與對於ε-果糖賴胺酸之氧化酶的反應性不同而決定特 異性，但於血紅素分子中存在有44個賴胺酸殘基，即使對 於ε-果糖賴胺酸之反應性較低，亦不可忽視其影響。又， 雖然血紅素α鏈N末端之纈胺酸亦藉由糖化成為果糖纈胺 酸，但由於與纈胺酸鄰接結合之胺基酸並非組胺酸，因此 不會生成果糖類胺酿基組胺酸。故而，為確保藉由酶法所 達成之血紅素Ale測定之特異性，當然應儘量排除測定果糖 賴胺酸，與僅測定果糖纈胺酸相比，測定果糖纈胺醯基組 胺醢肽更為有利。藉此，因蛋白質分解酶係使果糖織胺酿 基組胺醯肽游離，較好是使果糖纈胺醯基組胺酸游離者， 故而考慮到提高特異性之方面，最好是果糖肽氧化酶作用 於果糖綠胺醢基組胺酸者。 至於如上所述之蛋白質分解酶，較好是源自上述桿菌 屬、曲黴菌屬或放線菌屬之微生物，或藉由其基因重組所 生成者。至於源自桿菌屬之酶，可列舉Pr〇tin PC ][ 〇F、pr〇tin NC25(大和化成公司製造）、τ〇γ〇ΤΕΑΜ NEp(東洋紡公司 製造）等，至於源自曲黴菌屬之酶，可列舉M〇rsin(Kikk〇man 公司製造）；至於源自放線菌屬之酶，可列舉Actinase as、
Actmase AF、Actinase E(科研製藥）、蛋白酶 XIV型（Sigma 97689.doc -20- 200528713 公司製造)等。該等除可單獨使用以外，T〇y〇teamNEp等亦 可與蛋白酶κ混合併用。該等酶中較好的是屬於金屬蛋白 酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶或鹼性蛋白酶者❶使用濃度 或使用條件係如上所述。 至於如上所述之果糖肽氧化酶，可列舉改變棒狀桿菌屬 菌所生成之果糖胺基酸氧化酶的酶（日本專利特開 2001-95598號公報），源自線狀菌之果糖肽氧化酶（日本專利 特開2003-235585號公報）等。特別好的是Fp〇X-CE或 FPOX-EE(兩者均由Kikkoman公司製造）。 亦可自（i)步驟依次實施至（iv)步驟為止，亦可同時實施複 數個；/驟例如，右藉由試劑處理全血或血球，則可同時 實施（i) (ii)步驟，進而若共存有蛋白酶尺或八…仙化八^等 之蛋白質分解酶，則亦可同時實施（iH)步驟之一部分，上述 忒劑含有Tnton X-1〇〇等之以溶血作為目的之界面活性劑 以及Plysurf A208B等之本發明之陰離子系界面活性劑。 又，進而根據本發明之血紅素A1 c之測定方法，可於使用 曰立71 50型自動分析裝置等臨床檢查（特別是生化學檢查） 領域中所通用之自動分析裝置（以下，有時稱為「生化學自 動分析裝置」）測定血紅素Ale濃度比（％)(以下，有時稱為 「血紅素Alc(%)」）之情形，設定生化學自動分析裝置之操 作條件時，（1)可分別設定血紅素濃度測定與血紅素Aic濃 度測定之操作條件，（2)可共用血紅素濃度測定用試劑作為 血紅素Ale濃度測定用之構成試劑，（3)可共用血紅素濃度 測定用與血紅素Ale濃度測定用之試料，以及（4)可將血紅 97689.doc -21- 200528713 素濃度载與錄素A㈣度敎之㈣波長設為相同。亦 可，供將该專⑴〜(4)作為特徵且使用生化學自動分析裝置 測定血紅素Ale值（％)之方法。 、 本發明之試劑於測定血紅素Alc濃度比時，亦可使用一個 反應容器測定血紅素濃度與血紅素Ale濃度，又使用生化學 自動分析裝置測㈣，亦可使料續添加構成試劑的所^ 通道法’但設定生化學自動分析裝置之操作條件時，較好 是分別設定血紅素濃度敎Μ紅素A㈣度測定之試劑 使用量等操作條件。本發明之試劑係可共用血紅素濃度測 定用試劑作為錄素Ale濃度敎用之構成試劑，亦可:用 試料。载條件中，可將血紅素濃度敎與金紅素W濃度 測定之測定波長設為相同。 本發明之基質測定用試劑包含（A)陰離子系界面活性 劑，其係選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯 基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺 基琥轴酸類、聚氧乙稀烧基峻羧酸鹽類、聚氧乙稀烷基鍵 磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類以及 烷基苯基醚磺酸鹽類者，（B)氧化酶，其係作用於基質或作 用於藉由酶反應所生成之基質，從而生成過氧化氫者，以 及（C)過氧化酶及被氧化性呈色試劑。 進而，自使上述（B)中揭示之氧化酶發揮作用後所生成之 生成物’進而生成過氧化氳從而實現靈敏度增加。例如， 亦可於葡糖酮醛中含有糖氧化分解酶，上述葡糖酮醛係自 血紅素A1 c游離之糖化肽或糖化胺基酸與果糖肽氧化酶或 97689.doc -22- 200528713 果糖胺基酸氧化酶作用時所生成者（日本專利特開 /00 3336%號公報）。至於該情形時之糖氧化分解酶，較好 疋k自由葡萄糖氧化酶、3_半乳糖苷酶以及哌喃醣氧化酶 所組成之群的至少_種氧化酶。此外，如前所述，可使用 、自血球取出血紅素供給反應的前處理劑。進而，又 亦可添加處理血液中之夾雜成分的酶、氯㈣、氣化鉀、 亞鐵氰化卸等之鹽、反應調整劑、用以避免還原性物質影 曰的四坐餘鹽以及作為防腐劑之抗生物質、疊氮化納等。 本七明之基負》則定用試劑不僅可提供溶液狀態，亦可提 態或凝膠狀態。又，除可以填充至玻璃瓶、塑膠 =器等之形態以外，亦可以塗敷、浸沒至不溶性載體的形 匕、等加以提供。至於不溶性載體，例如可列舉乳膠、玻璃、 膠質等之粒子/球狀載體、半導體或玻璃等之平板狀載體、 紙或硝基纖維素等之膜狀載體以及纖維狀載體。 實施例 其次，列舉實施例更加詳細地說明本發明，但本發明並 非限定於該實施例。 [實施例1〜6 ]尿酸之測定 (1) 調製試料 對於血清9容積添加生理食鹽水或人類血紅素液體1容 積’從而調製出血紅素濃度為〇、1〇〇、300以及5〇〇 mg/dL 之含有血紅素之試料。 (2) 測定試料 使用曰立71 50型自動分析裝置，藉由下述操作測定各試 97689.doc -23- 200528713 料0 陰離子系界面活性劑實施例1 : 0.5% Emar 20C(花王公 司製造） 實施例 2 : 0.5%Hitenol NF13(第一 工業製藥公司製造） 實施例 3: 0.05%HitenolNF15(第一 工業製藥公司製造） 實施例 4: 0.5%Plysurf A208B(第一 工業製藥公司製造） 實施例5 : 0.05%普來克斯CS(花王 公司製造） 實施例6: 0.1%普來克斯SS-H(花王 公司製造） 比較例1 :未包含陰離子系界面活 性劑
比較例 2 : 0.05%Latemul PS + 0.05%普來克斯NBL 比較例 3 : 0.1%Latemul PS+0.1% 普來克斯NBL 5 00 μπιοΙ/L TOOS(同仁化學公司製造） 50 mmol/L 磷酸緩衝液（pH值7.0) (將組合陰離子系界面活性劑用以避免血紅素干擾之先 前眾所周知（曰本專利特開平8-89288)之方法中所揭示的烷 97689.doc -24- 200528713 基~酸#3鹽（商品名：Latemulps、花王公司製造）以及烧基 萘磺酸鈉鹽（商品名··普來克斯NB-L、花王公司製造）之組 合設為比較例2、3。） <第二試劑> 2單位/mL 尿酸酶（東洋紡公司製造） 10單位/mL過氧化酶（111)(東洋紡公司製造） 1 mmol/L 4_胺基安替比林 50 mmol/L 磷酸緩衝液（pH值7.0) 於各5式料7 pL中添加第一試劑260 pL，測定於37°C下加溫 五分鐘後之吸光度（吸光度1}。其次，添加第二試劑13〇|1^， 測定於37°C下加溫五分鐘後之吸光度（吸光度〗〗）。吸光度之 測定係以主波長546 nm(副波長800 nm)實施，將代替試料 使用生理食鹽水實施相同操作者（試劑空白組）設為對照。根 據各試料之吸光度I以及吸光度π，使用式A算出各試料之 吸光度變化量，與將已知濃度之尿酸溶液（2〇 mg/dL)作為試 料以與上述相同之方式操作時之吸光度變化量相比，算出 尿酸濃度。 式A :試料之吸光度=吸光度π_(吸光度1><(7+ 260)/(7 + 260+ 130)) 關於所獲得之尿酸之測定值，將血紅素濃度為Omg/乩情 形之測定值設為100%進行比較。將結果示於表1中。 97689.doc -25- 200528713 表1 陰離子系界面活性劑 血紅素濃度(mg/dL) 0 100 300 500 比較例1 無添加 100.0 92.1 74.8 77.2 比較例2 0.05%Latemul PS + 0.05% 普來克斯 NBL 100.0 83.6 62.1 54.3 比較例3 0.1 °/〇Latemul PS + 0.1 % 普來克斯 NBL 100.0 82.4 72.6 74.0 實施例1 0.5% Emar 20C 100.0 95.0 89.0 85.3 實施例2 0.5%HitenolNF13 100.0 93.9 87.9 84.6 實施例3 0.05%HitenolNF15 100.0 89.8 86.6 83.6 實施例4 0.5%PlysurfA208B 100.0 95.5 94.4 86.4 實施例5 0.05%普來克斯CS 100.0 92.9 88.9 88.7 實施例6 0.1%普來克斯SS-H 100.0 97.2 80.5 78.7 (%)(%)(%)(%) 如表1所明示，先前眾所周知之陰離子系界面活性劑之組 合（比較例2以及3)中，與無添加界面活性劑之比較例1相 比，反而會放大血紅素干擾。對此，使用本發明之陰離子 系界面活性劑之情形時（實施例1〜6)，與無添加界面活性劑 之比較例1相比，均可減輕血紅素之干擾。藉此，可瞭解本 發明之基質之測定方法即使於先前眾所周知之方法並非有 效之情形時亦有效。 [實施例7]果糖胺基酸之測定 (1) 調製試料 使用以542 nm中之吸光度成為5 OD之方式所調製的血紅 素-生理食鹽水稀釋液，調製出果糖纈胺酸（fV)濃度為5 μηιοΙ/L、10 μιηοΙ/L之含有血紅素的試料。作為對照組，代 替血紅素-生理食鹽水稀釋液而使用生理食鹽水。fV係使用 Bioquest公司製造品。 (2) 測定試料 使用日立71 50型自動分析裝置，藉由下述操作測定各試 97689.doc -26- 200528713 料。 〈第一試劑> 陰離子系界面活性劑 實施例7 : 0.2%Plysin*f A208B(第 一工業製藥公司製造） 比較例4 ··未包含陰離子系界面活 性劑 20 mmol/L 磷酸緩衝液（pH值8.0) <第二試劑> 15單位/mL 果糖胺基酸氧化酶（Kikkoman公司製造） 20單位/mL 過氧化酶（111)(東洋紡公司製造） 80 μηιοΙ/L TPM-PS(同仁化學公司製造） 200 mmol/L 磷酸緩衝液（pH值7.0) 於各試料20 pL中添加第一試劑240 ，測定於37°C下加 溫五分鐘後之吸光度（吸光度I)。其次，添加第二試劑80 μί，測定於37°C下加溫五分鐘後之吸光度（吸光度II)。吸光 度之測定以及試料之吸光度變化量係根據實施例1〜6算 出。將結果不於表2中。 表2 fv濃度 a b b/a 5 實施例7 71 67 94 比較例4 60 51 85 10 實施例7 118 110 93 比較例4 103 85 83 (μιηοΙ/L) (mOD/mL) (mOD/mL) (%) a :對照組之吸光度變化量 b :含有血紅素之試料之吸光度變化量 97689.doc -27- 200528713 如表2所明示，使用本發明之陰離子系界面活性劑之情形 時，可減輕血紅素之干擾。 [貫施例8 ]果糖胺基酸之測定 (1) 調製試料 以與實施例7相同之方式調製出含有血紅素之試料以及 對照组。 (2) 測定試料 使用日立7150型自動分析裝置，除將第二試劑設為如下 以外，藉由與實施例7相同操作測定各試料。 <第二試劑> 4單位/mL 果糖肽氧化酶（Kikkoman公司製造） 20單位/mL過氧化酶（ΙΠ)(東洋紡公司製造） 80 μηιοΙ/L TPM-PS(同仁化學公司製造） 200 mmol/L 磷酸緩衝液（pH值5.5) 表3 fV濃度 a b ^b/a~^〜 5 實施例8 44 43 比較例5 43 2一厂 10 實施例8 84 78 9Γ^' 比較例5 83 50 (μηιοΙ/L) (mOD/mL) (mOD/mL) (〇/〇) a :對照組之吸光度變化量 b :含有血紅素之試料之吸光度變化量 如表3所明示，使用本發明之陰離子系界面活性劑之情形 時’可減輕血紅素之干擾。 [實施例9〜13]血紅素Ale之測定 97689.doc -28- 200528713 (1) 調製試料 使用包含EDTA作為抗凝血劑之採血管，藉由常法自被檢 者10人身上抽取全血，將該全血於冷藏室中放置一晚而: 紅血球沉澱。自所沉澱之各紅血球層分取1〇(^乙，於其中添 加混合0.1% Triton χ-100水溶液300此，從而調製出血球溶 血試料。 (2) 測定試料 使用曰立7150型自動分析裝置，藉由下述操作測定各試 料。 <第一試劑> 陰離子系界面活性劑實施例9 : 〇.5%PlySurf AU2E(第 一工業製藥公司製造） 實施例 10 : 〇.5%PlySUrf A215C (第一工業製藥公司製造） 實施例 11 : 0.2% Plysurf A208B (第一工業製藥公司製造） 實施例 12 : 0.5% Nikkor SBL-4N (日本油脂公司製造） 實施例 13 : 3.0% Emar NC35(花王 公司製造） 比較例6 :未包含陰離子系界面活 性劑 1單位/mL蛋白酶κ 0,02 mol/L 磷酸緩衝液（pH值8.0) 97689.doc -29- 200528713 <第二試劑> 4單位/mL果糖肽氧化酶（FPOX_CE、Kikkoman公司製造） 2〇單位/mL過氧化酶（111)(東洋紡公司製造） 80 μηιοΙ/L TPM-PS(同仁化學公司製造） 7500單位/mL Toyoteam NEP(東洋紡公司製造）* 37.5 mmol/L NaCl 0.2mol/L磷酸緩衝液（pH值5.5) *Toyoteam NEP 係對於包含 500 mmol/L 之 NaCl 的 20 mmol/L磷酸緩衝液（pH值5.5)，於4°C中透析4小時後使用10 萬單位/mL濃液。 於各試料20 μί中添加第一試劑240 μί，測定於37°C下加 溫五分鐘後之吸光度（吸光度III)。其次，添加第二試劑80 pL，測定於37°C下加溫五分鐘後之吸光度（吸光度IV)。吸 光度之測定係以波長600 nm實施，將代替試料而使用生理 食鹽水以相同方式操作者（試劑空白組）設為對照。 根據各試料之吸光度III以及吸光度IV，使用式B算出相 應於各試料中之果糖肽量的吸光度變化量（吸光度V)。 式B :吸光度V =吸光度IV-(吸光度IIIx(20+ 240)/(20 + 240+ 80)) 由於上述吸光度III與試料中之總血紅素濃度成正比，因 此將血紅素Ale值（％)為已知之血球溶血液（作為血紅素Ale 值為8.6%)與以上述相同方式操作之情形時的吸光度III以 及V進行比較，算出各試料中之血紅素Ale值（％)。 分別比較藉由實施例9〜13以及比較例6求得之血紅素Ale 97689.doc -30- 200528713 值與藉由零售套組「Rapdia Ale」（富士 Rebio公司製造） 所測定之各試料之血紅素Ale值（％)(參照例）。將結果示於 表4中。 表4 試料 編號 1 ^-----η 實施例 9 實施例 10 實施例 11 實施例 12 實施例 13 比較例6 參照例 1 ο 5.0 4^~~ 4.7 5.6 5.2 -165.6 5.6 — 2 η 3.9 4.4 5.0 3.8 4.3 -77.8 4.9 3 3.5 3.6 3.0 3.8 3.3 -94.8 4.6 4 c 5.2 5.5 5.7 4.6 5.1 -8.0 6 5 7.3 7.0 7.8 6.3 6.7 19.3 6.8 6 一 7.9 7.4 8.5 9.9 -10.7 7.9 7 〇 T9 8.3 8.2 9.1 9.6 -15.4 8.4 0 〇 8.5 8.9 8.9 9.4 10.1 25.2 8.8 y 1 η 9.1 9.7 9.9 10.5 10.5 -1.0 9.6 10.8 11.1 12.3 12.0 11.7 30.0 11.5 相關 係數 0.99 0.99 0.97 0.98 0.96 0.71 相關係數以外之值係（0/〇) 如表4所明示，未包含本發明之陰離子系界面活性劑的比 較例6中，存有會成為原本不可能引起之負值之情形，完全 無法實施金紅素Ale值（％)之測定。對此，藉由本發明之基 質之測定方法所獲得之血紅素Am(%)，其表示出與參照 例結果良好的相關性。可獲悉藉由本發明之基質之測定方 :二可避免含有血紅素之試料中之血紅素干擾，從而可測 定試料中之血紅素Alc與總血紅素。 97689.doc -31 -