TW200412951A - Neurotrophic factor production promoter - Google Patents

Description

200412951 玖、發明說明： 【發明所屬技術領域】 本發明係關於有用於神經變性疾病等之預防或治療之新 穎神經營養因子產生促進齊ij。 【先前技術】 中樞及末梢神經系統中存在許多傳達神經訊息之神經細 胞，然而，由於神經細胞於出生前後即停止分裂，一旦有 損傷要再生係困難的，因爲神經細胞係由同一細胞負責一 生之機能，各種營養因子被認爲在分化、軸突之伸長、突 觸之形成’生存•機能維持上負責相當大的任務。此等神 經營養因子中較先進之比較硏究中，代表性者爲神經營養 素系歹[J ( n e u r 〇 t r 〇 p h i n f a m i 1 y )，此等中有報告者爲神經生 長因子（以下稱爲「N G F」）、來自腦的神經營養因子（以下 稱爲「BDNF」）、神經營養素（neurotr〇phil〇 _3(以下稱爲 「NT-3」）、NT-4/5、NT-6等。神經營養素之外，最近鑑定 出來自膠質細胞之神經營養因子（以下稱爲r Gdnf」），但 認爲負責作爲神經營養因子之重要任務上，並未解答其詳 細內容。 另一方面’基於社會持續筒齡化，阿兹海默氏症或帕金 林氏症寺神經變性疾病之患者增加，此等疾病爲難治且進 行性’並未確立根本性之治療法’因而，硏究神經營養因 子應用於神經變性疾病之治療。惟，由於神經營養因子爲 蛋白質，其於血中易被分解’不能通過腦•血液屏障，於 200412951 直接注入上具 若可見化合物 爲治療藥之活 腦障害抑制， 免疫親和素 樞神經系統中 經保護效果。 應用對於神經 創製出不具有 克羅列馬斯 之相互作用的 L - 2 -六氫吡啶 )之神經保護 £促進效果， 末梢投與上無期待之腦效果，再者，在腦中 倫理、技術上之限制。因此，由末梢投與， 使腦中增加此等因子之表現，則可認爲有作 用可能性（例如參照特許文獻1或2)。 特許文獻1:特表2002-516903 特許文獻2:特表2002-516905 最近報告免疫抑制劑關於腦貧血或外傷之 免疫抑制劑之細胞內結合蛋白質「 (immunophilin )」，不僅於免疫組織，中； 亦豐富地存在，而有報告神經細胞媒介中樞神 惟，免疫抑制作用，其免疫親和素配位體之 保護之目的上有不利益之情形，因此，冀望 免疫抑制作用之神經保護物質。 【發明內容】 本發明者們著眼於爲免疫抑制劑之大 (Tacrolimus)(第1圖（A))其與結合蛋白質 構造’硏究其化學構造上安定化之N -乙醯基-甲酸之部分構造（第1圖（B))(以下稱爲「APA」 作用，發現AP A具有優異之神經營養因子產； 因而完成本發明。 即，本發明具有以下特徴： (1 ) 一種神經營養因子產生促進劑，其含有N-乙醯基 六氫吡啶甲酸或其藥理學上容許鹽爲有效成分。 200412951 (2 )如（1 )所述之神經營養因子產生促進劑，其於神經 變性疾病之預防或治療而投與於人或動物。 (3 )如（2 )所述之神經營養因子產生促進劑，其中神經 變性疾病爲阿茲海默氏症、帕金森氏症、脊髓損傷、 亨丁頓氏舞蹈症、腦梗塞、頭部外傷、多發性硬化症、 肌肉萎縮側向硬化症、糖尿病性或藥物誘發性之末梢 神經障害或網膜神經障害。 (4 )如（1 )至（3 )中任一項所述之神經營養因子產生促 進劑，其中神經營養因子爲神經營養素（n e u r 〇 t r 〇 p h i η)。 其中，「神經營養因子」由前述之說明可知，NGF類爲 具有神經細胞之生存維持、神經分化促進等生理作用之蛋 白質總稱，具體而言包含NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6 之神經營養素系列，更進一步意指GDNF、膠質細胞生長因 子（GGF2)、中樞神經系統生長因子（AF-1)等。 「神經營養因子產生促進劑」意指於活體內或活體外接 觸神經細胞時，顯示出誘導或促進自細胞產生（合成）神 經營養因子作用之藥劑。 「神經營養素（n e u r 〇 t r 〇 p h i η )」意指於活體中，幫助由 神經成長標的等細胞或向標的方向伸長之細胞分泌之神經 營養因子、或自己分泌或傍分泌之神經（神經元）之生長、 分化' 生存’形成神經網路（突觸）之神經營養因子，具體 而言前述之NGF、BDNF、NT-3、ΝΤ-4/5、ΝΤ-6之現在已知 之胺基酸序列相同性亦高之類似構造蛋白質群。 200412951 「神經變性疾病」爲伴隨中樞或末梢神經系統神經細胞 之脫落、壞死之疾病總稱，其代表例爲阿茲海默氏症、帕 金森氏症、脊髓損傷、亨丁頓氏舞蹈症、腦梗塞、頭部外 傷、多發性硬化症、肌肉萎縮側向硬化症。又，依據本發 明之神經變性疾病之槪念，亦包含糖尿病性或藥物誘發性 之末梢神經障害或網膜神經障害。 「醫藥上容許鹽」爲慣用之無毒性鹽，具體地可列舉如鹼 金屬鹽（例如鈉鹽或鉀鹽）及驗土金屬鹽（例如錦鹽或鎂鹽）等 金屬鹽，無機酸添加鹽（例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、 磷酸鹽等），有機羧酸或磺酸加成鹽（例如甲酸鹽、乙酸鹽、 三氟乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、 甲烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等）、鹼性或酸性胺基 酸（例如精胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸等）之鹽。 其次，說明本發明之神經營養因子產生促進劑之製劑化 及投與量。本發明之神經營養因子產生促進劑以膠囊劑、 微膠囊劑、錠劑、顆粒劑、粉末、片劑、九劑、軟膏、栓 劑、注射劑、懸浮劑、糖漿劑、乳劑、液劑、腸溶包衣劑、 噴霧割、吸入劑、點眼劑、點鼻劑等之慣用醫藥製劑之型 式’以口服、非腸胃（包含靜脈內、腹腔內、皮下及肌肉內 注射）或外用（局部）投與（包含直腸、輕度、點眼及經鼻投 與）〇

Jt述醫藥製劑中可使用賦形劑（例如蔗糖、澱粉、甘露糖 醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣、 碳酸鈣等）、結合劑（例如纖維素、甲基纖維素、羥基甲基 200412951 纖維素、聚丙基吡咯烷、明膠、阿拉伯樹膠、聚乙二醇、 蔗糖、澱粉等）、崩壞劑（例如澱粉、羧基甲基纖維素、羥 基丙基澱粉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、檸檬酸鈣等）、潤滑劑（例 如硬脂酸鎂、滑石、十二基硫酸鈉等）、矯味劑（例如檸檬 酸、薄荷醇、甘胺酸、柳橙粉末）、保存劑（例如安息香酸 鈉、重亞硫酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯 等）、安定劑（例如檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸等）、懸浮劑（例 如甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等）、分散劑（例 如羥基丙基甲基纖維素等）、稀釋劑（例如水等）、蠟基材（例 如可可奶油、白色凡士林、聚乙二醇等）等製劑化上習用之 各種有機或無機載劑依據常法製造。 本發明之神經營養因子產生促進劑之投與量，依據所欲 產生之治療（或預防）效果足量爲較佳，例如若經口或非經 口 投與爲 0.01mg/kg 〜100mg/kg，較佳爲 0.1mg/kg 〜10mg/ kg。本發明之神經營養因子產生促進劑通常之單位投與量 爲O.lmg/個體〜lOOOmg/個體，較佳爲每日1至4回投與5mg/ 個體至50 Omg/個體。惟，上述投與量可依患者之年齡、體 重、症狀或投與方法作適宜之增減。 【實施方式】 以下列舉試驗例及實施例進一步詳細說明本發明，但本 發明並未限定於此。 試驗例1(於正常鼠腦中接受APA之神經營養因子表現效果） 試驗方法： 200412951 將5週齡之ddy系雄性鼠（日本LLC)分成3群（每群9隻）分別 進彳了試驗。 第1群（對照組）於7日間每日1次投與磷酸緩衝生理食鹽水 (PBS)於鼠腹腔內。 第2群於7日間每日1次投與溶解於PBS之APA(0.75mg/kg)於 鼠腹腔內。 第3群於7曰間每日1次投與溶解於PBS之APA(7.5mg/kg)於 鼠腹腔內。 此等群中任一群於最終投與2 4小時後斷頭取出大腦皮質 及丘腦紋狀纖維（t h a 1 a m 〇 s t r i a t e )。 酵素免疫試驗（EIA)法用樣品之調製：測定摘出大腦皮質 及丘腦紋狀纖維之重量，將均質緩衝液（含1M鹽酸鈉、2 % B S A、2 M m E D T A、0 · 2 %疊氮化鈉之〇 · 1Μ三-磷酸緩衝液 (ΡΗ7.4))之19倍重量體積加入均質機（80TIU/L)，進行30次 超音波震碎。4°C離心分離（1〇〇, 〇〇 〇gx 30分鐘），取上淸液， 加入相同量之氯仿，仔細攪拌而離心分離（20,000gxl0分 鐘），分散上淸液，作爲El A法用之樣品（冷凍保存於-20 °C直 至使用時）。 基於ElA法之神經營養因子測定：NGF之場合，依據古川 等人之方法（神經化學雜誌（Journal of Neurochemistry)，40， 734-744( 1 983))之EIA法，GDNF之場合，依據新田等人之方 法（Mizuno 氏等人編集之「Mapping the progress of Alzheimer’s and Parkinson's Disease」（2002)之第 46 3 至 467 頁）之EIA法，個別使用，測定各樣品中之神經營養因子濃 -10- 200412951 度’依所得之値作成20倍，爲各腦部位之神經營養因子含 量。 試驗結果：比較7日間連續腹腔投與ap A之鼠及對照組之 鼠觀察行動異常、脫毛或體重減少。丘腦紋狀纖維中NGF 表現量上，相對於APA之投與，對照組中未顯著較差（第2 圖（B)) ’但大腦皮質中，觀察於AP A投與用量依存性增加 之傾向（第2圖（A))。一方面，GDNF表現量於大腦皮質中， 相對於AP A投與，對照組未顯著較差（第3圖（A))，關於丘腦 紋狀纖維，觀察對照組比較APA 0.75mg/kg投與增加 66.0%(第 3 圖（B))。 試驗例2(帕金森氏症模式鼠中接受AP A媒介之神經營養因子 產生促進之神經保護效果） 試驗方法：將5週齡之ddy系雄性鼠（日本LLC)分成4群（每 群9隻）分別進行試驗。鼠先以戊巴比妥麻醉在未開頭時以 微量注射器之針先插入皮膚下右腦之丘腦紋狀纖維中，注 射1/^含0.05%抗壞血酸之生理食鹽水溶解之11.5/^//^6-羥基多巴胺（6-OHDA，siguma公司）。 第1群（對照組）將含抗壞血酸之生理食鹽水注入丘腦紋狀 纖維中進行破壞。之後，每日1回7日間投與PBS於腹腔內。 第2群於6-OHD A破壞丘腦紋狀纖維之日後每日1回7日間於 鼠腹腔內投與PBS。 第3群於6 - Ο HD A破壞丘腦紋狀纖維之日後每日1回7日間於 鼠腹腔內投與溶解於PBS之APA(0.75mg/kg)。 200412951 第4群於6-OHD A破壞丘腦紋狀纖維之日後每日1回7日間於 鼠腹腔內投與溶解於p B S之A P A (7 · 5 m g /k g)。 任一群於最終次投與後24小時斷頭取出大腦皮質。 多巴胺作動性神經之機能評價： 上述各群之帕金森氏症 模式鼠於透明圓柱型容器（玻璃製，直徑9cm-高12cm)內10 分鐘間自由探索後，於腹腔內投與脫氧麻黃鹼 (methamphetamine)(大日本製藥，10mg/kg)，投與後 10 〜 20分中內計數回轉次數。以此試驗觀察右側丘腦紋狀纖維 破壞後右方向之回轉運動（單側回轉運動）。

ElA法用樣品之調製及以ElA法之神經營養因子測定：各自以 試驗例1之相同方式進行。 試驗結果：多巴胺作動性神經機能評價中，破壞丘腦紋狀 纖維而未投與APA之群，顯示86.0 ± 14.1次之單側回轉運 動，丘腦紋狀纖維破壞後7日間投與APA0.75或7.5mg/kg則 分別爲40.9 土 17· 3次、47.1± 13.1次，單側回轉運動受到抑 制（第4圖）。另一方面，大腦皮質中N G F表現量，注入6 - Ο H D A 以50.0%減少，但於投與APA0.75及7.5mg/kg則分別觀察到 1 1.2及3 0· 7之增加（第5圖）。又，依據大腦皮質中GDNF表現 量於投與八？八0.75及7.511^/1^，分別觀察到74.9及232.4%之 增加（第6圖）。 試驗例3(脊髓損傷鼠中接受APA之步行能力向上之效果） 試驗方法：將7週齡雄性Wistar系鼠（日本SMC)分成3群（每 群12〜17隻）分別進行試驗。投與戊巴比妥鈉（大日本製藥， 200412951 3 5 mg/kg)於鼠中，以腹腔內注射，背部正中線切開，傍脊 柱肌肉鈍剝’切除第1 2胸椎之椎弓後，同部位中以銳利之 刃物切斷左脊髓。切斷5小時後，以下列試驗進行左後足麻 痺之障害確認。 第1群 於脊髓未損傷（第1 2胸椎之椎弓切除後，未切斷脊 髓而縫合）鼠中腹腔投與P B S。 第2群 於脊髓損傷鼠，腹腔投與PBS。 第3群 於脊髓損傷鼠，將溶解於P B S之A P A (0.7 5 m g / k g )於 腹腔內投與。 任一群皆自脊椎損傷日後進行1曰1回20日間之投與。 脊髓損傷鼠步行能力之評價方法：將鼠放入灰色塗裝之 箱（長lmx寬lmx高3 0cm)中，使其自由探索，以21-點數 Basso-Besttie-Bresnahan運動評估尺規（BBB尺規）評價。 試驗結果：B B B尺規脊髓損傷後爲〇至以下，至第2日未觀 察到投與AP A之效果，但從第3日AP A投與之步行能力之程 度增加，AP A投與群於第23日，約回復至損傷前之程度， 脊髓損傷群之鼠於時間之經過亦伴隨緩緩上升，1 6日上升 至分數15，但之後未超過以上之回復（弟7圖） 本發明之製劑例如下所示。 實施例1(膠囊劑） AP A 5mg、乳糖 80mg 將上述成分混合，將其塡充於通常之硬明膠膠囊作成膠 -13- 200412951 囊劑。 產業上利用之可能性 依據本發明，誘導、促進NGF、GDNF等之神經營養因子 之生合成，可提供對於阿茲海默氏症、帕金森氏症、脊髓 損傷等神經變性疾病之有效及安全的藥劑。 【圖示簡單說明】 第1圖：（A)大克羅列馬斯之構造式。（B)N-乙醯基-L-2-六氫 吡啶甲酸之構造式。 _ 第2圖：（A)顯示鼠大腦皮質中NGF表現對於接受APA之效 果。（B )顯不鼠丘腦紋狀纖維中N G F表現對於接受A P A之效 果。 第3圖：（A)顯示鼠大腦皮質中GDNF表現對於接受APA之效 果。（B)顯示鼠丘腦紋狀纖維中GDNF表現對於接受APA之效 果。 第4圖：顯示帕金森氏症模式鼠之多巴胺作動性神經之機能馨 對於接受AP A之單側回轉運動之抑制效果。 第5圖：顯示帕金森氏症模式鼠大腦皮質中NGF表現對於接 受APA之效果。 第6圖：顯示帕金森氏症模式鼠大腦皮質中GDNF表現對於 接受APA之效果。 第7圖：顯示脊髓損傷鼠中步行能力向上對於接受AP A之效 果。 -14-

Claims (1)

1. 200412951 拾、申請專利範圍： 1 . 一種神經營養因子產生促進劑’其含有N-乙醯基- L-2-六 氫吡啶甲酸或其藥理學上所容許鹽爲有效成分。 2 ·如申請專利範圍第1項之神經營養因子產生促進劑，其於 神經變性疾病之預防或治療上投與人或動物。 3 ·如申請專利範圍第2項之神經營養因子產生促進劑，其中 神經變性疾病爲阿茲海默氏症、帕金森氏症、脊髓損傷、 亨丁頓氏舞蹈症、腦梗塞、頭部外傷、多發性硬化症、參 肌肉萎縮側向硬化症、糖尿病性或藥物誘發性之末梢神 經障害或網膜神經障害。 4·如申請專利範圍第1至3項中任一項之神經營養因子產生 促進劑，其中神經營養因子爲神經營養素 (neurotrophin) 〇

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