TW200404810A - Ferrocene compounds and uses thereof - Google Patents
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Description
200404810 玖、發明說明·· 【發明所屬之技術領域】 本發明為關於一種新穎之二茂鐵化合物、含有該物之 試藥、利用該試藥之維生素D化合物高靈敏度測定法、及 該二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物。 【先前技術】 目前醫藥品用維生素D化合物（即VD化合物）有 骨化三醇（calcitriol)(商品名Rocaltrol(登記商標））、阿法骨 化醇（alfacalcidol)(商品名Alfarol(登記商標））、麥克瑟骨化 醇（Maxacalcitol)(商品名Oxarol(登記商標））、塔飼醇 (tacalcitol)(商品名Bonalfa(登記商標））、鈣泊三醇 (calcipotri〇l)(商品名Dovonex (登記商標））、氟骨三醇 (falecalcitriolK商品名 Hornel(登記商標）；商品名 Fuistan (登έ己商標）、二点-^-經基丙氧基）· (ED-7 1(開發編號），中外製藥股份有限公司）等各種化合物 上市或在臨床開發階段。VD化合物在極微量下即可發揮 藥效，其表現又有升高Ca之副作用，因此須要高靈敏度 之測定法。近年來，隨著質量分析法之發展使液體層析， 質譜儀（LC/MS)及並聯型液體層析/質譜儀/質譜儀（LC/MS, MS)可以廣泛應用在高靈敏度分析、代謝研究方面。其中 以電麓法（electro spray io]lizatl〇n，ESI)及常壓化學離子化 法（APCI)最為廣用，lC/MS法亦堂 成办㊉應用在VD化合物方 面。然而，在測定麥克瑟骨化醇哎 ^ 卞4 / 1寺分子内含酯基· 鱗基•石鱗基•酿脸其莖；^店 I胺基寺濰原子之VD化合物方面，其可 14825 200404810 有高靈敏度，但相對地對α -羥膽鈣化醇（alfacalcidol)或維 生素03(〇111〇卜〇&1〇^61〇15^/〇3)等分子内不含酯基.醚基· 硫謎基•酸胺基等雜原子之VD化合物，其靈敏度只達含 雜原子VD化合物之1 /5至1 /1 〇〇左右。因此，必須再開發 適用於所有VD化合物之高靈敏度測定法。 質譜儀測定中，衍生化法應該可以提高其對VD化合 物之靈敏度。λ/D化合物之衍生化，常利用其三稀構造可 發生選擇性D i e 1 s - A1 d e r反應之三。坐琳（m e t h y 1 chloroisothiazolinone)衍生物（Cookson 型試劑）〔① Analytical Biochemistry 1992; 1 94: 77-8 卜②藥學雜誌 1998; 118(6): 206-215、③藥學雜諸 1999; 119(12): 898-920、④ Biological Mass Spectrometry 1993; 22: 621-632、⑤ Journal of Chromatography 1993; 645:115-123 ⑥ Analytical Biochemistry，1 9 99; 243: 28-40 等〕、利用在 LC/MS 中可捕 獲共鳴電子之PTAD(4-苯基-1，2,4_三唑啉、3,5-二酮）〔前述 中之④、⑤〕及PFBTAD(4-五氟笨曱基，ι，2,4-三唑啉_3,5-二酮）〔前述中之⑤〕等。PTAD曾被指出可由柱後衍生化 提咼其靈敏度至7至7 0倍，但缺少應用在生物檢體方面之 例〔前述中之④〕。PFBTAD定量之下限可達25pg/mL(人類 血漿1 mL)〔前述中之⑥〕，但此靈敏度仍不足。發明人等 檢討利用PFBTAD類似物PFPTAD(4-五氟笨基-1，2，心三唾 啉-3，5 - 一酮）的方法’結果只可以得到衍生化5倍左右之靈 敏度’且在使用於生物檢體時其衍生化率亦不佳等，因此 無法有充份之靈敏度。故亟須再開發其原子團對LC/M S的 314825 6 200404810 反應有更高靈敏度之試藥（即衍生化劑）。
Beikel等人官報告對於，二茂鐵化合物之作用可 以使其有高$敏度’以二茂鐵迭氮為衍生化劑對含經基化 合物作用’即可作高靈敏度之測定〔⑦Analyt㈣i Chemistry ，7ί)· 1 544*~1 554〕。即利用本衍生物化法在離子化（正 «於氧化，因此可有效地生成安定i離 尚益報^ =離子性化合物可作高靈敏度之測定。但迄今 鐵二：：用此方法測定-化合物。此外，在以二茂 茂鐵迭^化劑之場合’其反應條件有時須要加熱，二 , 亦具爆發性，造成其操作困難之問題。 如上所述，曰二、，七 物，且易於 剛亚”、、一種適合所有種類維生素D化合 其可用之衍患用，高靈敏度維生素D化合物之測定方法' 之化合物：生化劑、及其衍生化劑與維生素D化合物鍵結 【發明内容】 本發明人〜、 以下述式〇、等為解決上述問題，刻意檢討之結果，發現 )所示之二茂鐵化合物 〇 —Q— 〇 Fe Φ> (R_)n (1) (式中之Q表 伸烷基或伸1直接之鍵結、伸烷基或-WrX-W2_(其中％表 -N(R )c 本基；W2 表伸烷基；X 表-〇-、-N(Ra)C(=：0)_、 卜〇)叫、-〇c㈣邮或婦J0S(哪；以低 314825 7 200404810 級烷基。）；R及R’各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰 基、幽素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之低 級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧 基可有取代基之低級醞基、可有取代基之低級羧基或可 有取代基之胺基甲醯基；m表丨至3之整數；η表丨至4 之整數。）與維生素D化合物（VD化合物）鐽結時，對各種 VD化合物均可以且可容易地以液體層析/質譜儀（lc/ MS)，特別是以液體層析/電麗游離化一質譜^質譜儀 (LC/ESI-MS/MS)測定，且可以以已往以來所未有之高靈敏 度測定VD化合物，而完成本發明。 本發明中之前述式Π )所+ π yv t i )斤不化5物，亦為關於其R及R， 為氫原子之二茂鐵化合物。同時’本發明中之前述式⑴ 所示化合物，亦為關於其Q為直接鍵結或伸烧基之二茂鐵 化合物。亦為關於其Q為伸甲其 甘““ 述二茂鐵化合物，及 其Q為直接鍵結之二茂鐵化合物。 二發二之二Λ鐵化合物之具體例可舉如4-(二茂鐵基 曱=，-，:三嗤啉-3，k_(FMTAD)、 三唑啉-3,5-二酮0丁八〇)等。 本發明為關於含有上述二茂鐵化合物、可測定含有： 烯構造化合物之試藥。該試藥中 一 物之溶齊丨。 3 ㈣μ 本發明為關於一種下述式（ ^--茂鐵化合物 314825 8 200404810 Ν·^\
Fe 〇 / (R.)n ( 1 ) (式中之Q表直接之鍵結、伸烷基或-WrX-W2-(其中W】表 伸烧基或伸苯基；W2表伸烷基；X表-〇-、-N(Ra)C( = 〇）-、 -N(Ra)C( = 〇）NH-、-〇C( = 〇) NH-或-N(Ra)〇S( = 0)- ; Ra 表低 級烧基。）；R及R，各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰 基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之低 級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧 基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基或可有取 代基之胺基曱酸基；m表1至3之整數；n表1至4之整 數。）與維生素D化合物鍵結之化合物。 本發明亦為關於一種在前述化合物中，前述化合物與 月il述維生素D化合物之鍵結為共軛鍵結之二茂鐵化合物與 維生素D化合物鍵結之化合物。 本發明之前述二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之 化合物，亦為關於下述式(2)所示化合物之二茂鐵化合物
314825 9 200404810 (式中之A】及As各為獨立，表可有取代基之低級仲烷基、 可有取代基之低級伸烯基、可有取代基之低級伸炔基；八2 表直接之鍵結、-CH = CH-、-CHe CH-、-Ο-、-S-或 -NH-; R]表氫原子或-〇R9(R9表氫原子或保護基。）；r2表氫原子、 ^基 '鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之 低級稀基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷 氧基或可有取代基之低級醯基；表氫原子或保護基； R4、I及R0各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰基、 齒素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之環烷基、 可有取代基之低級烯基、可有取代基之低級快基、可有取 代基之低級烷氧基、可有取代基之低級醯基、可有取代基 之低級羧基、可有取代基之胺基甲醯基或可有取代基之胺 基’ R7表及Rs各為獨立，表氫原子或羥基，或R7與 共同形成雙鍵；Q表直接之鍵結、伸烷基或 中w]表伸烷基或伸苯基；W2表伸烷基；X表屮…·Ν(Ι^) C(〇）--N(Ra)C(-〇)]SiH-、-〇C( = 〇）NH-4-N(Ra)〇S( = 〇）-; Ra表低級烷基。）；R及R，各為獨立，表氫原子、羥基、 硝'基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取 代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之 低級烧氧基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基 或可有取代基之胺基曱醯基；m表1至3之整數；n表1 至4之整數。）與維生素d化合物鍵結之化合物。 本發明亦為關於前述式（2)所示之化合物中，其Α「Αγ α3 表-CH(CH3)-(CH2)3ch(ch3)-ch=ch-或-CH(CH3)- 10 314825 200404810 CH = CH-CH二CH-; R】表氫原子或羥基；&表氫原子或羥基 丙氧基；I表氫原子；R4、I及r6各為獨立，表可由氫 原子、羥基、鹵素原子取代之低級烷基或低級環烷基；& 及R8表氫原子，或I與Rs共同形成雙鍵之化合物。本發 明亦為關於前述式（2)所示之化合物中，其汉及R，表氫原 子之化合物。 本發明亦為關於前述式（2)所示之化合物中，其Q為直 接鍵結或伸烷基之二茂鐵化合物與維生素d化合物鍵結之 化。物亦為關於其Q為伸甲基之前述二茂鐵化合物與維 生；r、D化合物鍵結之化合物，及其Q為直接鍵結之前述二 茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物。 本^明亦為關於別述二茂鐵化合物與維生素D化合物 鍵結j化合物中，其維生素D化合物為維生素h化合物 茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物。 士 >本發明亦為關於一種維生素D化合物之測定方法，其 '為玄測疋檢體中所含維生素D化合物之測定方法，為 以下述式（1)所示之二茂鐵化合物 〇
WA /RX 〇 Fe (R,)n (1) (式中之 〇 、直接之鍵結、伸炫基或飞，，厂2 — ( 中W】表 伸烷基或伸芏装.w主 ^ …、 本基，λλ 2表伸烷基，X表-〇-、一N(Ra)C(二〇）-、 -N ( R . ^ ^ Q X n p Η，、-〇C( = 〇）nh-s乂 4(]^)〇5(二〇卜；Ra 表低 ]1 314825 200404810
級烷基。），R及R’各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰 基、i素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之低 級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧 基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基或可有取 代基之胺基甲酿基；m表1至3之整數；η表1至4之整 數。）與檢體中維生素D化合物反應，其所得之二茂鐵化 合物與維生素D化合物鍵結之化合物再經液體層析/質譜 儀（LC/MS)測定者。 、本發明亦為關於前述維生素D化合物之測定方法，其 月〕i茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物，為其 ^ ^茂鐵化合物與維生素D化合物以共軛鍵結所結合之 化合物。 本^月亦為關於前述維生素D化合物之測定方法，其 前述二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物，為下 述式（2)所示之化合物者。
(式中之A 岛Λ 】及各為獨立 <有取代其 基之低級伸烯基、 表直接之Μ έ士 〈鍵結、‘CH = CH… (R，)n (2) 表可有取代基之低級伸烷基、 可有取代基之低級伸炔基；A _Ce C-、-〇-、-S-或-ΝΉ- ; R】 14825 200404810 表氫原子或-ORdR9表氫原子或保護基。广&表氫原子、 經基、i素原+、可有取代基之低級燒基、可有取代基之 低、及烯基、可有取代基之低級快基、可有取代基之低級烧 氧基或可有取代基之低級酸| ;心表氫原子或保護基； 汉4 及L各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰基、 鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之環烷基、 可有取代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取 代基之低級烷氧基、可有取代基之低級醯基、可有取代基 之低級羧基、可有取代基之胺基甲醯基或可有取代基之胺 基’ R7表及Rs各為獨立，表氫原子或羥基，或與尺8 共同形成雙鍵；Q表直接之鍵結、伸烷基或- (其 中w】表伸烧基或伸苯基；％表伸烷基；X表…N(Ra) c( = 0)-、-N(Ra)C( = 〇）NH-、-OC( = 〇）NH-或-N(Ra)OS( = 〇）-;
Ra表低級烧基。）；R及R，各為獨立，表氫原子、羥基、 硝基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取 代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之 低級烧氧基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基 或可有取代基之胺基曱醯基；m表1至3之整數；η表1 至4之整數。） 本發明亦為關於一種維生素D化合物之測定方法，其 丽述二茂鐵化合物及前述二茂鐵化合物與維生素D化合物 鍵結之化合物中，其ArA2-A3為-CHCCHsHCHJr、-CH (CH/) —CH = CH-或 _CH(CH j CH = CH CH = CH· ·，表氫原子 或基，R2表氫原子或經基丙氧基；R;表氫原子； 13 314825 200404810 及Rr)各為獨立，表可由奇；、¥一 # 、 衣j由風原子經基、鹵素原子取代之低 級烷基或低級環烷基；R及R表 8 4原子，或R7 i R,丘同 形成雙鍵者。本發明亦為關於一 ^八 ..^ , 裡、准生素D化合物之測定 d=L鐵化合物及前述二茂鐵化合物與維生素 :化合物鍵結之化合物m及R，為氫原子者。本發明 於一種维生素D化合物之測定方法，其前述二茂鐵 化a物與維生素D化合物鍵結之、^ ^ ^ ^ ^ ^ 、 σ物為刖述所示化合物 宁’其Q為直接鍵結或仲炫其夕一 ^
飞伸烧基之一戊鐵化合物與維生素D 化合物鍵結之化合物者。本發 不心月又為關於前述維生素D化 5物之測定方法，其前被-货畔 、 一戊鐵化5物與維生素D化合物 :建結之化合物之Q為伸甲基者’及前述維生素D化合物之 ’·）疋方法其則述一戊鐵化合物與維生素D化合物鍵結之 化合物之Q為直接鍵結者。 —本發明亦為關於前述維生素D化合物之敎方法，其 別述二茂鐵化合物與維生辛 ^ /、详玍$ ΰ化合物鍵結之化合物中，其 …生素D化合物為維生素〇3化合物之二茂鐵化合物與維 生素D化合物鍵結之化合物者。 前述檢體（測定對象之檢體）為生物體由來之檢體者 本發明亦為關於前述維生素D化合物之測定方法 本發明亦為關於前述維生素D化合物之測定方法，其 ，其 譜儀’ 〜〇可刃之〉只,J疋" /< 層析/質谱儀（LC/M S)為液n > # / ., 於…， ^/從月且層析/電灑游離化―声 貝％ 儀（LC/ESI-MS/MS)者。 【實施方式】 以下再更詳細說明本發明。 14 314825 200404810 在如下式（1)所示之二茂鐵化合物中，
V—Q
「Q」表直接之鍵、结、伸&基或_Wi_x_W2_(其巾％表伸烧 基或伸苯基；W2表伸烧基；X表-〇-、-N(Ra)C( = 〇)…N(RJ C( = 〇)NH-、_〇C(，·或娜仰（=〇)_ ; Ra 表低級烧 a 基。）’以直接之鍵結、伸烷基或-WrX-U其中w]表伸 曱基或伸苯基；W2表伸曱基；X表-〇-、-n(CH3)c卜〇)_、 伸烷基更佳，伸烷基又更佳，伸f基為最佳。其中，「I」 之「低級烧基」表曱基、乙基、丙基'異丙基了丁基、異 丁基第一丁基、第二-丁基、戊基、異戊基、新戊基、 己基等碳原子數1至6之直鏈或支鏈烷基。 -N(CH3)C( = 0)NH-或_0C( = 0)NH_。）為佳，以直接之鍵結或 上述之Q之「\\^及中之伸烷基」表伸曱基、伸乙 基、伸丙基、伸異丙基、伸丁基等碳原子數1至6之直鏈 或支鏈伸烧基。W i之「伸苯基」表鄰_伸苯基、間-伸苯基、 對-伸笨基。 上述之「R」及「R，」各為獨立，表氫原子、羥基、 硝基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、可有取 代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之 低級:)完氧基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之緩基 或可有取代基之胺基曱醯基，以氫原子、羥基、鹵素原子 3)4825 200404810 或低級烷基為佳，以氫原子更佳。 .., 一中之「鹵素原子」表 虱、虱、溴、碘等；「低級烷基表 工# 、乙基、丙基、異 丙基、丁基、異丁基、第二_ 丁基 一 、、盆此丄 昂二〜丁基、戊基、異 戊基、己基等碳原子數1至6之直鏈或支鏈烧基； 辑基」表乙烯基、丨_丙稀基、婦兩基、卜丁稀基、 基、3-丁烯基、戊稀基、己稀基等碳原子數！至6 =直鏈或支鏈稀基;「低級炔基」“块基、丙快基、丁块 :、戍炔基、己炔基等碳原子數…之直鏈或支鏈块基； 該烧氧基」表甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、 丁乳基卩丁乳基、戊氧基、己氧基、苯氧基等碳原子數 1至6之垸氧基；「低級醯基」表甲醒基' 乙酿基、丙酿基、 丁醯基、異丁醒基、錢基、異戊酿基、^基乙酿基、 己&基等碳原子數1至6之醯基。 上述取代基中之「可有取代基之」纟含有依其所欲之 1或~複數個（例如】至3個）羥基、硝基、氰基，氟、氯、漠、 石，、等鹵素原子，曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁 基^二丁基、第H、戊基、異戊基、新戊基 '己 基等碳原子數i至6之直鏈或支鏈烷基，乙烯基、卜丙烯 基Y烯丙基、^丁烯基、2»丁烯基、3-丁烯基、戊烯基、 己烯基等碳原子數1至6之直鏈或支鏈稀基，乙炔基、丙 炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等碳原子數1至ό之直鏈 或支鏈炔基，曱氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧 基、戍氧基、己氧基、笨氧基等碳原子數1至6之烷氧基， 曱I基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、 16 314825 200404810 異戊醯基、三曱基乙Si基、己酿基等碳原子數1至6之酿 基’叛基、胺基甲^基、及/或胺基寺之取代基。 本發明之二茂鐵化合物（即下述製造流程中之化合物6) 可以依照下述製造流程製造。
HOOC-Q
Fe^Φ> (R*), 1 步驟1
r1o2chnhnochn~q
(式中之Q、R、R’、m及η各表與前述式（1)相同之含意。） 步驟1中，化合物2可以以化合物1經二苯基磷醯迭 氮及鹼作用之方法，或使羧酸轉換為酸之鹼化物、酸酐後 再與迭氮化鈉作用之方法，或使羧酸轉換為酯後再與聯胺 作用、作用為聯胺之醯胺後、再與亞硝酸或亞硝酸酯作用 之方法等合成，其中以與二苯基磷醯迭氮及鹼作用之方法 =成為佳。起始物化合物丨為一般所知之化合物，亦可以 2易地由一般所知之化合物依一般所知之合成法合成。化 一物〃亦有市售，可由例如東厅、化成株式會社講入。與二 笨基磷醯迭氮及鹼作用之方法中使用之鹼，可例舉如三乙 一異丙乙胺等，以三乙胺為佳。與二苯基磷醯迭氮及 驗作用之方法中使用之溶劑，可例舉如二氯甲&、氯仿、 314825 17 200404810 二氯乙烷、苯、甲1、—田$ ^ 〒本一甲本、四氫呋喃、二乙醚、二噁 烷、二曱乳基乙烷等，以二氯甲 严 ^^ 洗為乜。與二苯基磷醯迭 氮及鹼作用之方法中，及雍㈤侉 …、… &應，皿度只要為可進行反應之溫度 即可，亚無特別之限定，作一 至邮更佳。 L 至Μ為宜叫〇 ⑰：驟2中1化合物3可以以化合物2經加熱合成。步 苯、甲苯、_ ψ# 乳甲洮、乳仿、二氯乙烷、 本曱本一甲本、四氯卩夫。南、二μ、二q、 基乙烷等，以甲苯為佳。反声㈤ " ,、，反二酿度只要為可進行反應之溫 度即可，亚無特別之限定，但一 —叙 至200°C為宜，50 至1 5 0 C更佳。 步驟3中，化合物4 .j , u .. 匕3物3與肼基曱酸酯反 應本成。上述步驟3中，你用夕、、六十丨 … 使用之洛劑可例舉如二氯曱烷、 氮仿一氣乙少元、苯、曱笨、-甲贫 芩一〒本、四氳呋喃、二乙醚、 二。惡烷、二甲氧基乙烷等，以 甲本為L。反應溫度只要為 町進打反應之溫度即可，並無特 。 7 π \丨民疋，但一般以〇至 2 〇 0 °C為宜，2 0至1 2 〇 °c更佳。 步驟4中，化合物5可以以化合物4與驗作用製成。 上述步驟4中，使用之驗可例舉如甲醇鈉、乙醇納、叔丁 鞟鈉、甲醇鉀、乙醇鉀、叔丁醇_、 ^ Τ 止丁基鋰、仲丁基鋰、 叔了基S里、 異丙®进胺ί里、-ί夢P於ΠΑ» 才又 一3衣己^胺鋰、雙（三甲基曱矽 嫁基）酿胺鐘、雙（三甲基甲石夕㈣）酿胺卸、氫化納、氫化 鉀、奴酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸钟、碳酸納、碳酸鈣 '碳 跋銘等，纟中以碳酸鉀為佳。上述步驟〇，使用之溶劑 314825 18 200404810 可例舉如曱醇、乙醇、異丙醇、二氯曱烷、氯仿、二氯乙 烷、苯、曱苯、二曱苯、四氫呋喃、二乙醚、二噁烷、二 甲氧基乙烷等，以曱醇為佳。反應溫度只要為可進行反應 之溫度即可，並無特別之限定，但一般以0至200°C為宜， 20至120°C更佳。 步驟5中，化合物6可以以化合物5與苯二乙酸化碘 作用製成。上述步驟4中，使用之溶劑可例舉如乙酸乙酯、 二氯曱烷、氯仿、二氯乙烷、苯、曱苯、二曱苯、四氫呋 喃、二乙醚、二噁烷、二曱氧基乙烷等，以四氫呋喃（THF) 及二噁烷為佳。反應溫度只要為可進行反應之溫度即可， 並無特別之限定，但一般以-78至100°C為宜，-10至50°C 更佳。 本發明之二茂鐵化合物（化合物6中Q = WrX-W2之化 合物）可以依照以下之製造流程製造。
Fe 步驟5
(式中之Q、R、R’、W】、X、W2、m及η各表與前述式（1) 相同之含意。） 步驟6中，化合物9可以以化合物7(Υ表羥基、羧酸 鹼化物殘基、羧酸之酸酐殘基、羧酸酯基、異氰酸酯基、 磺醯氯殘基、i素原子、烷基磺醯氧基或芳基磺醯氧基） ]9 314825 200404810 與化合物8(Z表經基、彳有取代基之胺基、產素原子、烧 基石黃醯氧基或芳基姐氧基）反應合成（步驟6)。此時，反 應以在鹼存在下進行為佳。丫與z之組合，可例舉如Y為 後酸驗化物殘基、缓酸之酸酐殘基、叛酸雖基'異氰酸酷 基、料氯殘基之化合物7_z為經基、可有取代基之胺 基之化合4勿8之組合；γ為羥基之化合物7與z為_素原 子烧基《氧基或芳基績酸氧基之化合物8之組合或？為 *素原子、烷基磺醯氧基或芳基磺醯氧基之化合物7與Z 為羥基之化合物8之組合。起始物化合物7及化合物8為 -般所知之化合物，亦可以容易地由一般所知之化合物依 」又所知之合成法合成。化合物7亦有市售，可由例如東 ::成株式會社購入。上述步驟6中使用之鹼，可例舉如 風乳化納、氫氧化鉀、碳酸氫納、碳酸氫釺、氫化鋼、氯 化鉀、碳酸針、碳酸納、碳酸釣、碳酸铯、三乙胺、二: 丙乙月女吡。疋、2,6-二曱基吡啶、2,4,6_三甲基吡啶、二 甲基胺基)吡啶等。上述步驟6中使用之溶劑，可例舉如 水、甲醇、乙醇、異丙醇、二氣甲烧、氯仿、二氯乙产、 本、曱笨、二曱苯、四氫呋喃、二乙醚、二噁烷、二^氧 基乙：)：兀等。反應溫度只要為可進行反應之溫度即可，並益 特別之限定，但一般以_78至2〇〇t：為宜， 社 更 土。v驟5之反應條件等依照前述者。 以如此得到之本發明二茂鐵化合物，在必要時亦可再 依：一般已知之方法進行精製、乾燥等操作進行單離。該 所得之二茂鐵化合物亦可能有不安定之場合，此時該化二 314825 20 200404810 物亦可保存在可安定存在之溶劑中(例如四氫呋喃、二噁烷 等）。 “ 本發明之二茂鐵化合物，可作為一種以液體層析/質碰 儀（LC/MS),特別是液體層析/電麗游離化_質譜儀/質譜儀曰 (LC/ESI-MS/MS)測定維生素D化合物（VD化合物）等含三 烯構造化合物時之試藥（即衍生化劑）。 本發明之試藥包含上述二茂鐵化合物單體，及含上述 一戊鐵化合物之溶液兩種含意。本發明之試藥中可使用之 溶劑，可例舉如乙酸乙酯、二氯曱烷、氯仿、二氣乙烷、 苯、曱苯、二曱笨、四氫呋喃（THF)、二乙醚、二噁烷、 二曱氧基乙烷等，以四氫呋喃（THF)或二噁烷為佳。該溶 液中二戊鐵化合物之含量並無特別限定，可例舉如選擇 0.001至99重量％，或〇 〇〇5至5〇重量％更佳，〇 〇1至 重量％又更佳。以本發明試藥測定對象化合物之場合，具 體地可以以該試藥中之二茂鐵化合物與VD化合物反鹿 再以其結合之化合物供LC/ESI-MS/MS等測定，測定其 之VD化合物。測定之詳細方法於後再述。 矸興本發明之二茂鐵化合物結合之VD化合物(即測一 對象之VD化合物），以維生素以化合物（Vi化合物）/為疋 佳。其中之VDS化合物為具9，1〇_次膽，基 烯構造之化合物，以具（5Ζ57Ε)_9，1〇—次膽留基-5,7，1〇(1「 三烯構造之化合物為佳，具（1α，5ζ，7Ε>95]〇-次膽崔美 5J，10(19)-三烯-丨_醇構造之化合物、具（3^5z，7e)〜9^〇 次膽留基乃，7，l〇(l 9)—三烯醇構造之化合物、 一凡具（1 α . 3 Μ825 21 200404810 5Z，7E)-9，10-次膽甾基-5,7，l〇(i9)-三焊-i，3 —二醇構造之化 合物更佳。具體地，此等VDS化合物可例舉如維生素d3 (chlolecalciferol，VD3)、骨化三醇^^^以^^^^〜’商品 名Rocaltrol(登記商標），膠囊/製造·代理商中外製藥株 式會社’經銷商杏林製藥株式會社’註/進口商中外製藥 株式會社’經銷商麟麟啤酒株式會社）、阿法骨化醇 (ALF，商品名Alfarol(登記商標），中外製藥株式會社，特 開昭第 48-62750 號公報及 Tetrahedron Lett.，1973，2339
Tetrahedron，30, 270 1(1 974)等）、麥克瑟骨化醇（〇CT，商 品名〇X a r ο 1 (登§己商彳示）’軟賞/經鎖商]a r u h 〇株式會社， 製造商中外製藥株式會社，註/製造經銷商中外製藥株式 會社，特開昭第6卜2675 50號公報等）、塔鈣醇（商品名 Bonalfa(登記商標），帝人株式會社）、妈泊三醇（商品名 Dovonex (登記商標），進口商帝國製藥株式會社，經銷商 藤澤藥品株式會社、帝國Medics株式會社）、氟骨三醇（商 品名Hornel(登記商標），大正製藥株式會社；商品名puistan (登記商標），製造商住友製藥株式會社，經銷商Kissei 藥品株式會社）、2 /9 - (3 -羥基丙氧基）-1 α，2 5 -二經基維生素 D3(ED_7 1(開發編號），中外製藥株式會社，特開昭第61-2 67548 號公報等）、EB 1 089(開發編號，Leo Pharmaceutical Products 公司，J· Chromatogr· Β· 740，117-128(2000)等）， 國際公開公報W095/27697號公報、同W098/28266號公 報、同WO00/49403號公報、同WOOO/6 1 776號公報、同 W0 00/64870號公報、同WO00/665 48號公報、同W〇〇 1/ 22 314825 200404810 16099號公報、同W〇01/62723號公報、同w〇01/79166 號公報、同W001/90061號公報、同λν〇〇1/96293號公報、 同WO02/13832號公報等中所載之化合物。其中之vd3、1 a，25(OH)2D3、ALF 專有販售’可自 s〇ivay pharmaceutical 公司、CALBIO公司、FLUKA公司、f〇rm〇SA公司、WAK〇 公司等購入。此些化合物之代表構造如下所示。 •維生素d3(vd3)
阿法骨化醇（alf)
α，25〜二羥基維生素d3(ED-71) 23 314825 200404810
•國際公開公報则2/13δ32號公報中在實施例6中 之化合物（以下稱之為化合物A)
與上述本發明之二茂錙彳 哉化3物結合之VD化合物（ 定對象之VD化合物）中，特 ' 、不含分子内_鍵結· _ 結•硫_鍵結•酿胺鍵結箅 义、、 令滩原子之VD化合物（具體者即 刖述之VD3化合物、辦泊= > —子、1 α，25(〇H)2D3、ALF、氟 骨三酵、ΕΒ1〇δ9、化合物A等）為佳。 本發明之二茂鐵化合物與VD化合物之鍵結，可由本 發明之二茂鐵化合物之三 #木構經D i e 1 s - A1 d e r反應選 擇性地與VD化合物之三稀構造反應。 具體言之，可在乙酸乙匕、^ G §曰 '二氯曱烷、氯仿、二氯乙 烷、苯、曱苯、二曱苯、四$叶 u虱π夫嗝（THF)、二乙醚、二噁 314825 24 200404810 少兀、一甲氧基乙烷（以四氫呋喃（THF)或二噁烷為佳）等適當 之溶劑中，由本發明之二茂鐵化合物與VD化合物反應: :鐘至：小時(最好是15分鐘至3小時)。其反應溫度；要 疋可進仃反應之溫度即可，並無特別之限定，但一般在8 UOOt下，或更好是在]〇至抓下進行。在必要又時亦 :加入水或甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇等醇溶劑終止反應。 此得到之本發明二茂鐵化合物與VD化合物之… :可再依照須要以-般所知之方法進行精製、乾燥等； 體， 合物 如此付到之本發明二茂鐵化合物與 為岫述一茂鐵化合物與前述VD化 VD化合物之結合 合物共軛鍵結之化 本鉍明一茂鐵化合物與 式U)所示之 VD化合物之結合體 以下述
^ /η ( 0 ) 化合物為佳。1 其中則述式中「Q、R、R， 述式（])相同之八立。「△ η Λ m及η」表與 .. 3思 Al及」各為獨立，表 之低級# Θ苴 衣」有取私 民及伸少兀基、可有取代基之 低級伸炔基D「A……本 布基或可有取代基 2」表直接之鍵結、-CH = CH-、c_ 314825 25 200404810 〇-、-S -或-NH-，以直接之鍵結、-CH = CH -或-C ξ C-為佳。
ArA2-A3 以-CH(CH3HCH2)3-、_CH(CH3)-CH = CH-或-CH (ch3)-ch=ch-ch=ch-為佳，以-ΟΗ((：Η3：μ((：Η2)3_最佳。
R]」表鼠原子或-〇R9(R9表氣原子或保護基。），以氮原 子或羥基較佳。「R2」表氫原子、羥基、鹵素原子、可有取 代基之低級烷基、可有取代基之低級烯基、可有取代基之 低級炔基、可有取代基之低級烷氧基或可有取代基之低級 酸基’以氫原子或羥基丙氧基較佳。r 」表氫原子或保護 基，以氫原子較佳。「R4、I及R6」各為獨立，表氫原子、 羥基、硝基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之低級環烷基、可有取代基之低級稀基、可有 取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧基、可有取代 基之低級醯基、可有取代基之羧基、可有取代基之胺基曱 鼪基或可有取代基之胺基，以各為獨立可由氫原子、羥基、 鹵素原子取代之低級烷基或低級環烷基較佳。「R R
/ 8 J 。為獨立，表氫原子或羥基，或與&共同形成雙鍵， 以氮原子或R?與r8共同形成雙鍵者為佳。 前述及、中之r低級伸烷基」指碳原子數！至6 之直鏈或支鏈之伸烷基鏈，「低級伸烯基」指碳原子數] 至6之直鏈或支鏈之伸烯基鏈，「低級伸炔基」指碳原子數 1至6之直鏈或支鏈之伸炔基鏈。「可有取代基」表含有依 其所欲之1或複數個（例如}至3個）羥基；硝基·，氰基； 氟、氣 '漠、硬等函素原子；甲基、乙基、丙基、異丙基、 丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新 314825 26 200404810 戊基己基等石反原子數丨至6之直鏈或支鏈烷基；乙烯基、 1_丙烯基、烯丙基、Κ丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、^烯 基、己烯基等碳原子數丨至6之直鏈或支鏈烯基；乙炔基、 丙炔基、丁炔基' 戊炔基、己炔基等碳原子數1至6之直 鏈或支鏈炔基；甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁 乳基、戊氧基、己氧基、苯氧基等碳原子數丨至6之烷氧 基；：醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基' * 丁醯基、二 基/、戊S&基、二曱基乙醯基、己醯基等碳原子數丨至6 之醯基；羧基；胺基甲醯基；及/或胺基等之取代基者。 上述之R2、R4、以及I中之「鹵素原子」係指氟、 氣、漠、峨等·’「低級烧基」係指甲基、乙基、丙基、異丙 基丁基、# 丁基、第二丁基、第三丁基、戍基、里戍美 新戊基：己綱原子數…之直鏈或支鏈烧基;「：級 稀基」係指乙縣、1-丙稀基、稀丙基、卜丁稀基、2-丁 稀基、3· 丁料、戊稀基、己稀基等碳原子數1至6之直 鏈或支鏈烯基；「低級炔基」係指乙炔基、丙炔基、丁块基、 戊块基、己炔基等碳原子數i至6之直鏈或支鏈块基广「低 ㈣氧基」係指甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁 乳基、戊氧基、己氧基、苯氧基等碳原子數之燒氧 基；「低級醯基」係指甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁酿基、 異丁酿基'戊醯基'異戊si基、I甲基乙《、己酿i等 石厌原子數]至6之臨基。並且，及〜之「環垸基 指環丙基、環丁基、環戊基、環己基 '環庚&'環辛基 等碳原子數3至8之環烷基。 土 314825 27 200404810 上述取代基中之「可有取代基」表可含有依其所欲之 1或複數個（例如1至3個m基；石肖基；氰基；氟、氯、漠、 =等虐素原子；甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁 基Y第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基 等碳原子數1至6之直鏈或支鏈烷基；乙烯基、丨_丙烯基、 稀丙基' 1-丁稀基、2_丁稀基、3_丁烯基、戊稀基、己烯 基等碳原子數1至6之直鏈或支鏈烯基；乙炔基、丙炔基、 、、基戊炔基、己快基荨碳原子數1至6之直鍵或支鏈 块基，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異 丁氧基、戊氧基、己氧基、苯氧基等碳原子數丨至6之烷 氧基；甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊 醯基、異戊醯基、三甲基乙醯基、己醯基等碳原子數丨至 6之醯基；羧基；胺基曱醯基、及/或胺基等者。 上述R〗及Rs中之「保護基」，只要為羥基適當之保護 基即可’並無特別限定，其例可舉如低級醯基、可有取代 基之低級烷基、可有取代基之低級烷基磺醯基、可有取代 基之低級纟完氧基獄基、取代之秒烧基等。「低級醯基」、「低 級烷基」、「低級烷氧基」、可為「取代基」等均如前段之說 明。 上述本發明二茂鐵化合物與VD化合物反應得到之二 茂鐵化合物與VD化合物之結合體，可用於以乙c/E SI-MS / MS等測定VD化合物時之標定物等。 測定檢體中存在之VD化合物時，依照上述方法使本 發明之二茂鐵化合物與VD化合物結合即可。其中上述之 314825 28 200404810 才双版以來自生物體之檢體 、、存^ V u, U。來自生物體之檢體指由體 液（血液、淋巴液、骨髓液 、 田紅 ^ 二水寻，以血裝、血清、尿茸 為佳。最好是來自生物體之& 尿寺 自人畔，土 γ k體又指來自哺乳類之意，來 自人類、猿猴、犬類、兔、 ^ ^、日丨—+ 、三鼠、大鼠、小鼠者更佳。 在測疋來自生物體之檢體中 ^ ^ ^ 宁存在之VD化合物之場合，必 々在進行醇類除去蛋白等一 絲 $ 1所知去除蛋白必須之處理之 後，再同樣依照前述方法使 便本發明之二茂鐵化合物與檢體 中存在之VD化合，物鍵結，俨$丨丄
>μ . 于彳本發明二茂鐵化合物盘VD 化5物之結合體後再加以測定。 /、 前述之前處理中，在除 # 太肢中之蛋白後，以由本發 月一戊鐵化合物與檢體中存在 ^ π i 在之VD化合物反應前，再以 古相卓取檢體為佳。本發 _ 戍鐵化合物與檢體中存在夕 化合物反應後，以又爯+ 之 再以固相卒取檢體為佳。特 檢體中除去蛋白、以固相萃 J卞取知體後，再由本發明— 化合物與檢體中存在之VD化合物反應、之後再又：：;载 萃取檢體者為佳。除去檢體中之蛋… ： 化合物與檢體中存在之VD化入物π 3 —戊鐵 化口物反應刖之固相萃取， U順相系之固相萃取裝置組為宜，特別以使用石夕膠系固 相卒取裝置組為佳。以本發明二茂鐵化合物與檢體中存在 之VD化合物反應後之固相萃取，以 又扣逆相乐之固相茬 取裝置組為佳。 相卞 如上所得之本發明二茂鐵化合物與VD化合物之結合 體即可供LC/MS測定。其中之LC/MS指 ° 〇 …那疋原理， 以LC/MS(液體層析/質譜儀）之測定方法 凡列疋機态，具體 3]4825 29 200404810 地即液體層析/質譜儀（LC/MS)及並聯型液體層析/質譜儀/ 質請儀（LC/MS/MS) ’以及此等再組合電灑法（Esi)及常琢 化學離子化法（APCI)之測定方法或測定機器。其中本發^月
測定方法在實施時’特別以液體層析/電灌游離化_質譜儀/ 質譜儀（LC/ESI-MS/MS)為佳。 S 以LC/ESI-MS/MS測定時，具體地即將前述所得含本 發明二茂鐵化合物與VD化合物之結合體的餘留物溶解於 流動相中，再注入LC/ESI-MS/MS中測定。其中在各測定 中LC/ESI-MS/MS測定條件之設定等具體之操作，可以依 -般之方法，依照測定對象之檢體的量或種類、檢體中 存在VD化合物之量或種類、必須之測定靈敏度、衍生化 劑使用之本發明二茂鐵化合物之種類、測定時使用之 LC/ESI-MS/MS機器之組成㈣當地調整、言"。具體地， 即先詳細查出本發明二茂鐵化合物與⑽化合物結合體之 MRM(MuUiple Reaction M〇nit〇ring)條件，適當地設定各種 條件’同時設定各種有效離子化之Lc條件。測定生物體 檢體議時，可在空白檢體中由已知濃度之測定標的物 加入成〉辰度梯度，再加入内擇進0 , 知+ °U(LS •，最好是測定標的物 之安定同位素標識物）’再各別測定。再求出測定標的物相 對^•之波峰面積比（或波峰高度比），根據與添加濃度之 關係作成定量曲線’即可由定量曲線與測定標的物之料 面積比（或料高度比），計算生物體檢體中之濃度。詳細 可以參考最新之質譜儀(第1版，發行：化學同人，編集： 丹羽利充，]"5年）、生物質譜儀（發行：東京化學同人， 314825 30 200404810 編集·上野民夫、平山和雄、原田健一，1 997年）、lc/ms 之實際應用（第1版，發行：講談社科學社，編集：原田健 一、岡尚男，1996年）等。 如上述之本發明VD化合物測定方法，為靈敏度比已 彺方法冋之測定方法。本發明測定方法又對目前為止其測 定方法測定之靈敏度不足的不含分子内酯u基·硫醇 基Sm胺基等雜原子之VD化合物（具體地如前述之ν]〇3 化合物、㉟泊三醇、la 525(〇h)2D3、ALF、氟骨三醇、 EB 1 089、化合物A等），可達到比已往方法靈敏度高數百 倍之測定方法。因此，不只對含酯基•酯基·硫醇基•醯 胺基等雜原子之VD化合物（具體地如前述之〇CT、ed_71 等），即不含此等雜原子之VD化合物，亦即對所有VD化 合物均適用之高靈敏度測定方法。 以下即以適當之實施例詳細說明本發明，但本發明並 不限定於此。 實施例 以下實施例中核磁共振光譜之測定使用EX- 27 0(JEOL 公 司製造 ） 。 電灑 游離化 lc/MS/MS(LC/ESI-MS/MS)之測定使用高速液相層析Aiiiance2790(Waters Co. 公司‘ ie )及四極型質i分析計Quattr〇 LC(Micromass UK Ltd.么司‘达）。數據分析使用 Massiynx Ver.3.3(Micromass UK 公司製造）及 Microsoft Excel 2000(Microsoft 公司製 造）。 實施例]衍生化劑之合成 3] 314825 200404810 [實施例1-1] 4-(二茂鐵基曱基）_1;2,4_三唑啉_3,5_二酮 (FMTAD)之合成 (1)3>(二茂鐵基曱基）胺基曱醯基肼基曱酸乙醋之人成 在冰浴下於0.5g(2mm〇1)二茂鐵乙酸(東京化成株式會 社製造）、0.44mL(2mm〇l)二苯基磷醯迭氮及4mL甲苯混: 物中加入0.57mL(4mm〇l)三乙胺，再於室溫下攪拌 鐘。該反應混合物再經二氯甲烧稀釋，並依序以1%鹽= 水溶液、飽合碳酸氫納溶液洗淨’其有機層經無水：酸鎂 乾燥、過渡後再減壓濃縮，即得4mL甲苯溶液。其所得之 甲苯溶液中再次加入2mL甲笨，並於室溫攪拌下加'入二经 (3mmol)之肼基甲酸乙酯，加埶沪 ^ 一 …口級3小日守。該反應混合物 再經二氯甲烷稀釋，並依序以1 0/臨醅 /01s夂水/谷液、飽合碳酸 氫納溶液洗淨，其有機層經無水硫酸錢乾燥、過濾後再減 廢濃縮。其所得之餘留物再經矽膠管柱層析(氯仿·甲醇 =20 : 1)精製，即得 〇.55g(78〇/ ) 名、）之 >(一戊鐵基甲基）胺基曱 醯基肼基曱酸乙酯黃色油狀物。 ，J = 7. 3 Η ζ), m)， 6 · 5 9 ( 1 Η， 1H NMR (CDC 1 3) δ ： 1· 2 7 (3Η， 4.〇一4· 3 (1 3Η, m) , 5. 59 (ιΗ, s)， 6. 6 6 (1 Η, s ) (2)4-( 一茂鐵基甲基）尿哇之合成 將 〇.55g(l ·6πιιώο1)上述φ 純 /曰。 中所付之 >(二茂鐵基曱基） 胺基曱醯基肼基曱酸乙酯、46〇
外Umg(3.3mmo])碳酸鉀及〗6mL 乙醇混合物加熱回流]4小時。 A反應心合物經過濾後再減 壓濃縮。其所得之餘留物再經矽膠管柱層析(氯仿··曱醇 314825 32 200404810 =10 : 1)精製，即得376mg(78%)之4-(二茂鐵基曱基）尿唉 】H NMR (THF-d8) δ : 3· 86 (2H，m) ’ 3· 96 (s H，s)， 4. 1 0 (2H，m)， 4· 1 3 (2H，s)， 8‘ 38 (2 Η, b r s ) (j)4-( 一 /X鐵基曱基）-1，2,4-三°坐啉- 3,5_二g同之合成 於室溫下在1 0mg(0.033mmol)上述（2)中所得之4_( 一 茂鐵基甲基）尿。坐及〇 · 5 m L四氫D夫喃-d 8之混合物中加入 111叫（0.0 3 4]^11〇1)碘化苯基二乙酸酯，並攪拌2小時，即栌 4-(一茂鐵基曱基）-1，2,4-三唑啉-3,5-二酮之四氲[]夫喃溶、 液。 】H NMR (丁 HF — d8) δ : 3. 98 (2H，m)， 4· 〇4 (5 H，s)， 4‘ 1 6 (2H，m)， 4. 3 8 (2H, s) [貫施例卜2]肛二茂鐵基]二4_三唑啉d，5_二酮（Ftad)之 合成 (1)3 -二茂鐵基胺基曱驢基肼基曱酸乙酯之合成 在冰浴下於0.5g(2· 1 7mm〇l)二茂鐵羧酸（東京化成株 式會社製造）、0.47mL(2.17mmol)二苯基磷醯迭氮迭氮及 4mL曱苯混合物中加入0.6mL(4 3mm〇1)三乙胺，再於室溫 下授掉30分鐘。該反應混合物再經二氯曱烷稀釋，並依序 以1 %鹽酸水溶液、飽合碳酸氫鈉溶液洗淨，其有機層經 無水硫酸鎂乾燥、過濾後再減壓濃縮，即得4mL曱笨溶 液。其所得之曱苯溶液中再次加人2mL曱苯，並於室溫授 拌下加入0.34g(3.27mm〇l)之肼基曱酸乙酯，並加熱回流] 小時。該反應混合物再經二氯曱烷稀釋，並依序以ι%鹽
勹Λ JO 314825 200404810 酸水溶液、飽合碳酸氫鈉溶液洗淨，其有機層經無水硫酸 鎂乾燥、過濾後再減壓濃縮。其所得之餘留物再經己烷： 二氯曱烷（1 : 1)混合液洗淨，即得〇 52§(72%)之3_二茂鐵 基胺基甲醯基肼基曱酸乙酯黃色粉末。 Ή NMR (CDC,3) δ ： !. 31 (3Η, tj J = 7. 1Hz), 4. 03 (2H, s) , 4.20 (5H, s) , 4.25 (2H, q, J- 7· 1Hz)， 4· 4 7 (2H，s)， 6. 24 (ih，b r s)， 6·
4 Ο (1H, b r s) , 6. 5 5 (1H, b r s) MS (ES I) ： m/z 3 3 2 (M++l) , 3 3 1 (M + ) (2)4-二茂鐵基尿u坐之合成 將〇.52g(1.57mmol)上述⑴中所得之3·(二茂鐵基甲基） 胺基曱醯基肼基曱酸乙酯、434mg(3l4mm〇i)碳酸鉀及 16mL乙醇混合物加熱回流13小時。再減壓濃縮後，以故 鹽酸調成酸性，再以二氯甲烷·曱醇(1〇: n之混合溶劑萃 取，以水洗淨後有機層經無水硫酸鎂乾燥、過濾後，再減 壓濃縮。其所得之餘留物再經矽膠管柱層析（二氯曱烷· 醇=20 : 1)精製，即得32〇mg(71%)之仁二茂鐵基尿唑。曱 H NMR (ΤΗ F - d 8) δ ： 3· 87 (2H， 3. 9 6 (5 Η, s) , 4 (2 Η，b r s ) MS (ESI) ： m/ z
J 8 6 (2H, t，J -2. 〇Hz)， 2 8 6 (M++ 1 ) , 2 8 5 (M+) 0 H z ) 8* 6 4 OM-二茂鐵基三唑啉- 1,5_二酮之合成 於室溫下在l〇mg(0.035mmo：[)上述（2)中所得之々一 “ 鐵基尿唑及0.5mL四氫呋喃-ds之混合物中加入Umg ^ (0.034麵〇1)蛾苯二乙酸酯，並攪拌]小 “ 1 〜A鐵 34 1 4825 200404810 基三唑啉·3,5-二酮之四氫呋喃溶液。 ]H NMR (THF-d8) δ ： 4.〇〜4. 2 (?Η 瓜) 6 (2Η，t，J = 2. OH ζ) (4)4-二茂鐵基-1，2,4-三°坐啉-3,5-二_之合成（之2) 於室溫下在10mg(0.03 5mm〇l)上述（2)中所得之心二茂 鐵基尿嗤及0.5mL 1，4-二噁烷之混合物中加入丨lmg (0.034mm〇l)碳苯二乙酸酯，並攪拌2小時，即得4_二茂鐵 基-I，2,4-三哇啉-3,5-二酮之1，扣二噁烷溶液。 H NMR ( 1，4 — 一°惡烧一d8) δ ： 4 . 2-4 3 ( 7 Η, m)， 4· 8 7 (2H，m) ’ 衍生化劑與維生素D化合物結合體之合成 [實施例2-ι]阿法骨化醇4_(二茂鐵基甲基）·12,4•三唑啉-3,5-二酮加成體（AlF-FMTAD)之合成 參考貫施例 鐵基甲基）尿唑及 -1 ’於室溫下在5mg(0 017_〇1)心（二茂 〇.25mL四氫呋喃之混合物中加入5rag (0.016mmol)碘笨二乙酸酯，並攪拌2小時，即得二茂 鐵基曱基）·1，2,4-三唑啉-3,5-二酮之四氫呋喃溶液。再於所 得〜/合液中加入lmg(〇〇〇25mm〇丨）依照特開昭第48_6275〇 號公報及 Tetrahedron Lett.，1 973,2339、3〇， 2 7 0 1 ( 1 9 7 3 )中δ己載之方法製成之阿法骨化醇之四氫咲喃 (0·25ιϋ)溶液，再於室溫下攪拌1小時。該所得之混合物 再減壓濃縮，其所得之餘留物再經薄層矽膠層析（己烷：乙 酸乙-2·])精製，即得lmg(57%)標題之阿法骨化醇‘（二 茂’截基曱基）-1，2,4-二唑啉二酮加成體 314825 200404810 黃色油狀物。 2H NMR (CDC 1 3) δ : 〇 , η η f U. 4-〇· 6 (3Η，m)， 3· 6 - 3· 8 UH，m)，4· 〇 —4. 6 (16Η，⑹，4· 6 —4· 8 (ι Η，m)， 4.8-4. 9 (1 η, m) [實施例2-2]阿法骨化醇‘-芘 t ^ 〇 于n 鐵基-1，2,4-三唑啉-3,5-二 酮（ALF-FTAD)之合成 蒼考貫施例1 -2，於宮、、西τ >广 、至，皿下在 5mg(〇.〇i7mmol)4-二茂 鐵尿。坐及0.25mL四氫〇夫喃之混合物中加入4 5邮（〇 〇14 mm〇l)碘苯二乙酸醋，並攪拌1小時’即得4-二茂鐵基- 1，2，4 -三口坐琳-3 5 -二酉同之四tj扯π土、a、— 』之四二呋喃浴液。再於所得之溶液 中加入lmg(0.0025mm〇l)依照特開昭第48·6275〇號公報及 lahedron Lett.? 197j5 23 39 - Tetrahedr〇n? 30? 2701(1974) 中記載之方法製成之阿法骨化醇之四氫咲喃（〇25叫溶 液，再於室溫下擾拌丨小時。該所得之混合物再減壓濃縮， 其所得之餘留物再經薄層矽膠層析（己烷：乙酸乙酯=ι :幻 精製，即得lmg(57%)標題之阿法骨化醇4·二茂鐵基]，2，肛 三唑啉二酮加成體（ALF-FTAD)黃色油狀物。 H ^NMR (CDC 1 3) δ ： 0.54 (3Η, s) , 〇· 8 5 (6Η， d，J 气 3Hz)，〇. 89 (3Η，d，J = 5. 3Ηζ)，3· (1H，b r d’ J二 1 5· 5Hz)， 4· 〇 一 4· 4 (1 ⑹，4. 66 (1H, d, J = 1 7. 6Hz) , 4. 9-5. 1 (3H, m) [實施例2-3]維生素I)3 4-(二茂鐵基曱基三唑啉_ 3,5-二酮加成體（Vd3_fM丁AD)之合成 參考實施例1」，於室溫下在l〇mg(〇.03 3mmQl)4j二 314825 36 200404810 茂鐵基甲基）尿唾及0.5mL四氫咲喃乂之現合物中加入 llmg(0.034mmol)石典苯二乙酸酸，並攪拌2小時，即得(二 茂鐵基曱基）-1，2，4 -三哇啉q ^ mm ^ _ 、、 ％ J，5**一酮之四氫呋喃溶液。再於 所付之〉谷液中加入5ιτΐ2Γ0〇〗η in. Λ. g(u.ul 之維生素 d3 (vd3 , soway pwmaceuticai公司製造）之四氫口夫喃（〇、L)溶 液，再於室溫下授拌i小時。該所得之混合物再減塵濃縮， 其所得之餘留物再經薄層矽膠層析(己烷··乙酸乙酯=1··幻 精製，即得8mg(9〇%)標題之維生素D3心（二茂鐵基甲基）_ 1，2,4-三唑啉_3,5_二酮加成體（VD3_fmtad)黃色油狀物。 Ή nmr (cdci3) a： 〇. 47 (3H) s)j 〇 8? (6Hj d/ J = 6· 4HZ)， 〇· 92 (3H，d，J = 5. 9Hz)， 3. 7] (1H, b r d( J = i 5. 2Hz) , 4. 〇-4. 5 (i 5 H, m) , 4. 6〇 (1H. d, J = 9. 9H2)> 4. 86 (1H； ^ j = 9 6Hz) [實施例2-4]維生素Ο〆·二茂鐵基_】，2,4_三唑啉_3,5_二酮 (vd3-ftad)之合成 參考實施例卜2,於室溫下在l0mg(〇 〇35mm〇l)心二茂 鐵尿唑及0.5mL四氫呋喃之混合物中加入llmg(〇〇34 mmol)碘苯二乙酸酯，並攪拌}小時，即得扣二茂鐵基- 1，2,4-三唑啉-3,5-二酮之四氫呋鳴溶液。再於所得之溶液 中加入 10mg(〇.〇26mm〇l)維生素 D3(Vd3，s〇Way
Pha_ceutical公司製造）之四氫咲喃（〇5mL)溶液，再於室 服下撹拌1小時。戎所得之混合物再減壓濃縮，其所得之 餘留物再經薄層矽膠層析（己烷：乙酸乙酷二2:])精製，即 得]]mg(63%)標題之維生素h舡二茂鐵基」又肛三唑啉一 314825 37 200404810 3,5-二酮加成體（VD3-FTAD)黃色油狀物。 3 H NMR (CD C 1 3) δ :〇· 60 (3H，s) d，J = 6. 6Hz)， 0. 9 2 (3 H, d j ^ q ’ 0· 85 (6H， (1H，brd，J = 15· 5Hz)，4· 〇-4· 3 Z，3· 81 73 (1H，d，J = 9. 9Hz)， 4· 9 — 5·〇（/I9’ m)， 4, 5 (1H, d, J = l. 5Hz) 2H，m)， 5. 〇 生素 D3(VD3- [比較例2-1] 3-(二茂鐵基胺基甲醯基氧基）維 二茂鐵胺基曱酸醋）之合成
在冰浴下於l〇mg(0.043mm〇1)二茂鐵羧酸、〇 〇1爪乙 (0.046mmol)二苯基磷醯迭氮及〇 5m]L * τ本合物中加入 0.015mL(0.108mmol)三乙胺，再於官、严 丹、至/皿下攪拌3 〇分鐘。 該反應混合物再經二氯甲烷稀釋，並依序以鹽酸 水溶液、餘合碳酸氫鈉溶液洗淨，其有機層經無水 乾娣、過濾後再減壓蒸餾去除二氯曱烷，即得未精製之甲 苯溶液。再於室溫下在所得之曱苯溶液中加入丨〇mg (0-026mm〇l)維生素 D3(VD3，s〇Way pharmaceuticai 公司製 造），再於lOOt：下攪拌}小時。該反應混合物減壓濃縮& 其所得之餘留物再經薄層矽膠層析（己烷：乙酸乙酯4 : 1 精製，即得6mg合成之3_(二茂鐵基胺基曱醯基氧基〉維生 素D3(VDS-二茂鐵胺基甲酸酯）黃色油狀物。 ]H NMR (CDC13) δ : 〇· 55 (3H, s)，0· 87 (6h d, J = 6. 4 Hz), 〇. 92 (3H, d, J=6. 1Hz)5 3> (2Hj b Γ s) ^ 4· 1 7 (7H, b r s) , 4.48 (2H? b r s) 4· 8 6 (1 H，s)，4. 9 4 (1 H，b r s)，5. 0 8 d H，s) 5· 7— 5. 9 (1H，，6· 06 UH，d，J = 1 1. 1H〇 , 6.25(lH，d，J = ii.iHz) 3)4825 38 200404810 .貫雜例3衍生化劑與維生素D化合物結合體之測定 [實施例3-1]阿法骨化醇4-(二茂鐵基曱基）-i，2,4-三唑啉一 3,5-二酮加成體（ALF-FMTAD)及阿法骨化醇4-二茂鐵基_ 152,4-三唑啉-3 5 5 -二酮加成體（八1^邛丁八0)之測定 各將參考實施例2 -1合成之阿法骨化醇4 -(二茂鐵基曱 基）-1，2,4-三唑啉- 3,5-二酮加成體（ALF-FMTAD)及參考實 施例2-2合成之阿法骨化醇4-二茂鐵基-1，2,4-三唑啉-3,5-二酮（ALF-FTAD)溶於50//L之移動相（10 mmo]/L乙酸銨/ 乙腈（1: 9，v/v))中，再取 20//L 注入 LC/ESI-MS/MS 中。 HPLC 管柱使用 Capcell PakC18UG-120(5"m, 150χ 2.0mm i.d·:株式會社資生堂製造），以正離子測定alF- FMTAD 及 ALF-FTAD 之 ESI 質譜，各設 m/z 697、m/z 683 分子離子〔Μ〕+為基本峰。第1圖所示為測定結果之一例。 錐型電‘壓各設為70V、66V時，其強度最大。 此等分子離子先作成前驅物離子，再以產物離子光錯 測定時，含二茂鐵架構之強力碎片離子分別設為ηι/ζ丨99、 m/z 227。第2圖所示為測定結果之一例。 詳細調查 ALF-FMTAD 及 ALF-FTAD 之 MRM(Mu]tiple Reaction Monitonng)條件之結果，在監控頻道上，分別使 用 m/z 697〔 Μ〕+>199〔 Μ<29Η44〇4Ν3〕+、m/z 683〔 M〕 + >22 7〔 M-C28H44〇3N2〕+測定頻波、將碰撞能量設定為可 測定超高靈敏度之44eV時，即各可獲得250fg(3 59amol、 3 66am〇l)/inj(S/N比約為6至8)之靈敏度。另一方面，以 同樣直接測定阿法骨化醇（ALF)時，其靈敏度為75pg 9 314825 200404810 (lSSfmolVmKS/N比約為6)，因此本發明之測定法比直接 測定時之靈敏度約高300倍。第3圖所示為各測定結果之 —列 ° [貫施例3 - 2 ]維生素D 3 4 -(一茂鐵基甲基）·丨，2，‘三唑啉一 3,5-二酮加成體（VDg-FMTAD)及維生素d3扣二茂鐵基4 2 4_三唑啉-3J-二酮加成體（VDS-FTAD)之測定 如實施例3-1同樣，各調查參考實施例2_3合成之維 生素034-(一茂鐵基曱基）-1，2,4-三哇啉-3,5-二酮加成體 (V D3 - F Μ T A D)及參考貫施例2-4合成之維生素d，4-二茂 鐵基-I，2,4-三唑啉_3,5-二酮（VE^jPTad)之最適測定條 件，結果靈敏度均可達 250fg(367 amol、375amol)/inj(S/N 比約為8-11)。另一方面，同樣之維生素D3(VD3)、3_(二茂 鐵基胺基曱醯基氧基）維生素D3(Vd3_二茂鐵基胺基曱酸 醋）(參考比較例2-1)直接測定之靈敏度為5〇pg(13〇fm〇1)/ inj(S/N 比約為 8)、] pg(i ·64 fmol)/inj(S/N 比約為 5)，因此 本發明之測定法比直接測定時靈敏度高約2〇〇倍，亦比二 茂鐵基胺基曱酸酯衍生化測定時靈敏度高約4倍。第4圖 所不為各測疋結果之《一例。 [實施例3-3] ED-71之4-(二茂鐵基曱基）-1，2,4-三唑-3,5-二酮加成體（ED-7 1-FMTAD)及國際公開公報WO02/1 3 832 號公報之實施例6中記載化合物（化合物A)之4彳二茂鐵基 曱基三。坐啉-3，^二酮加成體（化合物a_FMTAD)之 測定 各如貫施例3-]同樣調查參考實施例2合成之ED-7 1 40 314825 200404810 之4-(二茂鐵基曱基）-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮加成體（ED-71-FMTAD)及 國際公 開公報 W〇02/13 832 號 公報之 實施例 6中記載化合物（化合物A)之4-(二茂鐵基甲基）-1,2,4-三唑 啉-3,5-二酮加成體（化合物A- FMTAD)之最適測定條件， 結果靈敏度均可達 300fg(381amol)/inj、5 0 0 fg(6 6 8 amol)/ inj。另一方面，同樣之ED-71及化合物（A)直接測定時靈 敏度各為 l〇pg(20fmol)/inj、50pg(lllfmol)/inj。 綜合上述實施例3-1、3-2及3-3之結果示於表1。 表1 化合物 MRM條件 測定靈敏度 (平均注射） S/N比 ALF(直接測定、對照） ALF-FTAD ALF-FMTAD w/2 418 [M+NH4] + > 383 [Μ-Η20+Η]' Wz683 [M]+> 227 [M-C2RH44 03N2]' m/z 697 \MY > 199 [M-C29H 44 04N3]+ 75 pg (188 fmol) 250 fg (366 amol) 250 fg (359 amol) 6 6 8 VD3 (直接測定、對照） VD3-二茂鐵肼基曱酸酯(對照) vd3-ftad VD3-FMTAD mJz 385 [M+H]+> 367 [M-H20+H]4 mhbW [M]4 > 245 [M-C27H42]+ nxJx 667 [M]+> 227 [M-C2SH4402M2]+ W268I [M]+> 199 [M-C29H4403N3]+ 50 pg (130 fmol) 1 pg (1.64 irnol) 250 fg (375 amol) 250 fg (367 amol) 8 5 11 8 ED-71 (直接測定、對照） ED-71-FMTAD m/z 508 [M+NH4]4 > 397 [M-C3H802-H20+H]4 m/x 787 [M]4 > 199 [M-C33H5〇07N3]" 10 pg (20 fmol) 300 fg (381 amol) 10 10 化合物A (直接測定、對照） 化合物A-FMTAD m/z 470 [M+NH4]+ > 435 [M-H20+H]4 749 [M]4 > 199 [M-C32H44〇5N3r 50 pg (1 Π frnol) 500 fg (668 amol) 8 6 實施例4生物體檢體中維生素D化合物之測定 [實施例4-1]大鼠血漿中之阿法骨化醇（ALF)經FMTAD衍 生化之測定 (1)大鼠空白血漿之調製 取SD系未經處理之大鼠（SPF級，自Sic公司購入）， 使用肝素鈉為抗凝血劑採血，再將經離心分離所得之數隻 41
314825 200404810 份血漿混合後作為介 ”、、工血水使用。混合血漿保存於-20〇C以 下。
(2)阿法骨化醇中旦乂 A 1 "疋夏曲線下限之檢討（FMTAD衍生物 化） 方、1⑽// L大鼠空白血漿中加入依照特開昭第
6 2 7 5 0號公報及τ t丨H ^ letiahedron Lett.? 1 973? 2339? Tetrahedron, ’ 以1974)中纪載之方法所製成的阿法骨化醇（ALF)之 己，溶液，調製成〇、請、Q25、Q8、25、8及㈣就 定量曲線用之檢體。再於100//L之各濃度溶液中，加入 2 0 // L 依照 chem· Pharm· Bull·，48, 215(2000)中所記載之 方法製成之4〇ng/mL d^ALF為内標準品，再經乙醇去除蛋 白、固相萃取套組（Bond Elut SI5 3cc，500mg: Vrian Inc•公 司製造）固相萃取後，再以FMTAD衍生化。在衍生化後再 /入’I固相卒取套組（〇as j s HLB，1 cc，3 Omg: Waters公司製 造）固相萃取，再經氮氣乾燥後，其餘留物溶解於4〇 " L 之移動相中，再取1〇 " L注入LC/ESI-MS/MS中。第5圖 所不為檢體前處理之具體處理流程。LC/ESI-MS/MS之測 定條件如表2所示。 42 14825 200404810 表2 ALF-FMTAD測定條件： 管柱： Capcell Pak C18 UG.120 (5 μπι, 150X 2.0 mm i.d.) 移動相： A液 lOmmol/L乙酸錄、 B 液乙腈（A : 15%、B : 85%)
管柱溫度： 30°C 流速： 0.2mL/分鐘
ESI (+) 2.5 kV 70 V 150°C 450°C 46 eV
離子化型： 毛細管設定電壓： 錐型設定電壓： 斷電設定溫度： 德塞爾/3設定溫度 碰撞設定能量： MRM (Multiple Reaction MonitoringM条件： ALF^FMTAD ： m/z 697 [M]+> 199 [Μ-〇29Η44〇^Ν3]+ d4-ALF-FMTAD :仿/之701 [Mh> 199 [M-C29H40D4〇4N3]+ 以S/N比約為3至5求定量曲線下限之結果，本發明 測定法之定量曲線下限值為0.08ng/mL，比比較例4-1中 所示直接測定時之值（10ng/mL)為125倍，比比較例4-2中 所示PTAD衍生物化測定時之值（Ing/mL)為12.5倍，因此 # 靈敏度高。另以1 mL大鼠血漿如上述同樣求其定量曲線下 限之結果，本發明測定法之定量曲線下限值為 0.0 1 n g / m L。第6圖為在定量曲線下限時之層析之一例。 (3)專一性之檢討 比較前述（2)前段中使用之空白定量曲線（0 ng/mL)及 定量曲線下限值（0.08ng/mL)之層析。其結果並無妨礙 ALF-FMTAD及d4-A:LF-FMTAD測定之波峰，定量曲線空 白之空白檢體亦無妨礙ALF-FMTAD溶出時間之波峰。 43 314825 200404810 (4)定量曲線之範圍及直線關係之檢討 各測定前述（2)前段中使用之檢 象對I.S.波峰面積之比，再 a ^日，再求出測定對 二次方作&定量曲線(含1/y2,?、添加濃度之關係以最小 下倒算值之實差值。再由定旦 才目關h數⑴及各濃度 七山- 1 里曲線與各檢體波鋒面積之比 未出早位一、有效數字3位之實測值。以=之： 生物化反應中會生成2種異構物（6r/6s)，因此選擇議比 為大之波峰（滯留時間㈣‘）約為88分鐘）進行定量。 表3為絰3日作成之定量曲線，其標準圖如第7圖所 示0 表3 苐1曰 實測值 (ng/mL) 實差值 (%) 0.0769 -3.9 0.260 4.0 0.858 Ί·2 2.55 2.0 8.01 0.1
添加濃度 (ng/mL) 0.08 0.25 0.8 2.5 8 25 直線回歸式
弟]日 y=0.954488x+0.0550209 γ=〇.991277 (含】/y2 重） 第 2 日 y=1.15772x+0.0282662 r=0.995203 (含]/y2 重） 第 3 日 y=】.05255x+0.040492] γ=〇.99974】（含 1/y2 重） 第3曰 實測值 實差值 (ng/mL) (%) 0.0812 1.5 0.240 -4.0 0.830 3.7 2.58 3.2 7.70 -3.8 _ 第2曰 實測值 實差值 (ng/mL) (%) 0.0790 -1.3 0.251 0.4 0.879 9.9 2.4 -2.4 8.12 1.5 定：g曲線之相關係數⑴在〇.〇8_25 ng/mL範圍下為 0.99 1 2 77至0.999 74](含1/y2重量），各濃度下倒算值之實 差值為-7.6至9.9 %，顯示有良好之直線關係。 44 314825 200404810 (5)同時再現性之檢討 如同前述（2)前段中，各在大鼠空白血漿（1 0〇 // L)中加 入八1^成為〇.〇8、0.25、2.5及251^/11化作成同時再現性 用檢體後測定。各濃度以n = 5測定3日，以1日為單位求 出又動係數（Coefficient of Variation，以下稱之為CV值） 及實差彳杳 、左值。再由CV值及實差值算出次式。 實 ' 值（貝測值之標準偏差/平均實測值）χ丨〇〇(%) 其社值一（（平均實測值一理論值）/理論值）X 100(%) °果之一例示於表4。
4
3)4825 45 200404810
第2日_添加濃度 實測值 平均士 SD CV 實差值 (ng/mL)_(ng/mL) (ng/mL)_(%)_(%) 0.08 0.0878 0.0854 ± 0.0104 122 6.8 0.0949 0.0727 0.0763 _0.0951_ 0.25 0.263 0.267 ± 0.015 5.6 6.8 0.256 0.275 0.290 _0.252_ 2.5 2.75 2.33 ± 0.33 ]4.2 -6.8 1.98 2.06 2.30 ._2,58_ 25 24.8 25.2 ± ]·0 4.0 0.8 24.5 26.8 25.6 24.5
46 314825 200404810 表4(續） 第3日_ 添加濃度 實測值 平均土SD CV 實差值 (ng/mL)_(ng/mL)_(ng/iriL)_(%)_(%) 0.08 0.101 0.0799 ± 0.0149 18.6 -0.1 0.0827 0.0683 0.0844 _0.0632_ 0.25 0.270 0.256 ± 0.025 9.8 2.4 0.267 0.282 0.221 _0.240_ 2.5 2.68 2.58 ± 0.16 6.2 3.2 2.45 2.56 2.41 _2J9_ 25 25.3 24.9 ± 23 9.2 -0.4 22.8 23.0 24.8 28.5
各濃度下之CV值為15%以下（定量下限為20%以 下），實差值為± 15%以内（定量之下限為± 20%以内），因此 有優良之靈敏度、實差值。 (6)日差再現性之檢討 依據前述（5)之測定結果，求出3日間全部之CV值及 實差值。 其結果之一例示於表5。 47 14825 200404810 0.25 oooo P2-M 0.295 0.319 0.219 0.304 0.263 0.256 P275 0.290 P252 P270 567 0.2S2 0.221 0.240 00675 00593 00795 o.i 00679 00878 PS49 00727 00763 00951 P51 00827 0.0S3 0.0844 0.0S2 0.268 ± 0.028 10.4 11 25 24.6 24.6 2r7 24.1 21.9 24.8 24.5 26.8 25.6 24.5 253 22bo 230 24.8 2?°5 24.51+ roo 7.3 丨 20 00770 ± 00138 17.9 丨 3bo 2.5 2.75 2.70 2.57 2.77 2.77 2.75 1.900 206 2.30 2.58 2.68 2,45 2.56 2.41 2.79
2.54 ± SIS 10.2 1.6 铁皆 FNdsw -f<i>l±SD (ng/mL) (ng/mu fng/mL) n< f +i<I£r±SD 19.) (％) (ng/mL) (ng/mJL) (ng/mL) > nv(％) s 48 314825 200404810 各濃度下之CV值為15%以下（定量下限為20G/〇以 下）’貫差值為± 1 5%以内（定量之下限為土 20%以内），因此 有優良之靈敏度、實差值。 (6)回收率之檢討 回收率用檢體是使用如前述（5)中同時再現性中使用 之檢體。測定回收率用之對照用檢體（參考組檢體），為在 各2大鼠空白血漿前處理檢體中加入1〇〇以乙之 FMTAD 成 〇·145、ο·*%、4 △ . 及43.6ng/mL。在各別測定 後，以麥考組檢體波峰之面積 、 手孓命知十均值為i 〇〇%，盥 體波峰之面積比較，求出 ，、、疋才双 印ALF之回收率。 回收率=(回收率用檢 物、版波峰之面積/參考 面積之平均值）χ 1〇〇(%) 等、、且核肢波峰 其結果之一例示於表 度。 D例中之回收率均達實用程 314825 49 200404810 表6
添加濃度 (ng/mL) 測定檢體 波峰面積 爷考樣品 波峰面積 回收率 (%) 平均 (%) SD 0.08 70 137 53.8 37.7 11.6 51 123 39.2 33 25.4 55 42.3 36 27.7 0.25 148 239 44.2 39.1 8.0 149 431 44.5 85 25.4 129 38.5 143 42.7 2.5 】193 3127 40.1 41.2 9.5 1313 2828 44.1 757 25.4 1394 46.8 1474 49.5 25 5207 22412 20.7 24.5 4.8 5406 27884 21.5 5323 2】.2 7820 31.1 7075 28·] (7 )衍生化率之檢討 衍生化率用檢體是使用如前述（5)中同時再現性中使 用之檢體。 計算衍生化率用之對照用檢體（參考組檢體）， 為以乙醇去除大鼠空白血漿中之蛋白，再經固相萃取套組 (Bond Elυt SI5 3cc，500mg: Varian SPP公司製造）固相萃取 後，調製2 :件添力ϋ FMTAD之檢體中力u入ALF-FMTAD之 檢體。在各測定後， 以參考組檢體波峰之面積平均值為 ]0 0 %，與測定檢體波峰之面積比較 ，求出 ALF之衍生化 50 314825 何生化率=(衍生化率 皮峰面積之平均值）x 100(%) 其結果之一例示於表7。各例中 程度。 何生化干均達實用 表 7 衍生化率 平均 —(%) (%) 114.5 89.6 52.9 ·—--- 54.3 一 55.7 添加濃度 測定檢體 焱峰面積
(8)檢體在冷藏庫中安定性之檢討 如同前述⑺前段中’在大鼠空白血漿(1〇〇叫中各加 入 ALF 成為 〇 〇8、〇 25、？ $ ^5及25ng/m]L作為安定性檢討 用檢體後測定。各濃度以n=3測定檢體調製當時之實測值 (in]tiai值）及在5 c冷藏庫中保存24小時後之實測值（p〇st 值）’再以下式計算其變動率。 變動率={post值之平均值/Initial值之平均幻X刚㈤ 由變動率測定之結果可知，各濃度下均無大變動率， 因此並無安定性之問題。 [實施例4-2]大鼠血漿中之ED_71經FMTAD衍生物化之 測定 314825 5] 200404810 除維生素D化合物使用ED-7 1以外，其他如同實施例 4-1(2)前段，以乙(：圯31-]\43/¥8測定大鼠血漿中經？]\4丁八0 衍生化之ED-71。各測定條件如表8所示。 表
Capcell Pak C18 UG-120 (5 μπι，150 X 2.0 mm i.d.) A灰 10 mmoi/L乙酸錢、
管桎 移動相： 管桎溫度： 流速： 離子化型： 毛細管設定電壓： 錐型設定電壓： 斷電設定溫度·· 德塞爾石設定溫度 碰撞設定能量： B 液乙腈（A : 45%、B : 55%)
30°C 0.2 mL/分鐘 ESI (+)
1.0 kV
72 V 150°C *
: 450°C
52 eV MRM (Multiple Reaction Monitoring)條件： EDirFMTAD :瓜々787 [M]+> 199 [M-C33H5()07N3]+ de-EDH-FMTAD :瓜々793 [M]+> 199 [M· C33H44D6〇7N3]+ 在S/N比約為3下求其定量曲線下限值之結果，本發 明測定法為〇.25ng/mL。 [實施例4-3]大鼠血漿中國際公開公報WO02/1 3 832號公 報之實施例6中記載之化合物（化合物A)經FMTAD衍生化 之測定 除以國際公開公報W〇02/1 3 83 2號公報之實施例6中 記載化合物（化合物A)取代ED-71以外，其他同實施例3-2，以LC/ESI-MS/MS測定大鼠血漿中經FMTAD衍生化之 化合物A。各測定條件如表9所示。 52 314825 200404810 表9 化合物A-FMTAD測定條件: 管柱： i.d.) 移動相：
Capcell Pak C18 UG-120 (5 μηι，150 X 2.0 mm A液 10mmoI/L乙酸銨、 官柱溫度： 流速： 離子化型：
B 液乙膳（A : 35%、B : 65%) 30°C 0.2 mL/分鐘
ESI (+) 1.0 kV 65V 150°C 450°C 55 eV 毛細管設定電壓： 錐型設定電壓： 斷電設定溫度： 德塞爾/5設定溫度 碰撞設定能量： MRM (Multiple Reaction Monitoring)條件： 化合物 A-FMTAD : 222々749 [M]+> 199 [Μ·032Η44〇5Ν3]+ 在S/N比約為3下，求其定量曲線下限值之結果，本 發明測定法為〇.25ng/mL。 [比較例4-1]大鼠血漿中阿法骨化醇（ALF)不經衍生化之 直接測定 如同實施例4-1 (2)，在大鼠空白血漿中各加入阿法骨 化醇（八1^)成為0、：1、3、10、30、100、300及 1 0001^/111乙， 作為作成定量曲線用之檢體。再取1 0 0 // L各濃度之檢體， 加入20//L内標準品（I.S.)之400ng/mLt d4-ALF後，再 經乙醇去除蛋白、固相萃取套組（Bond Elut SI，3cc，500mg: Varian SPP公司製造）固相萃取。經氮氣乾燥後，其餘留物 再溶於40 // L之移動相中，並以10 // L注入LC/ESI-MS/MS 中。其測定條件如表1 0所示。 53 314825 200404810 表10 ALF測定條件： 管柱： i.d·) 移動相： 嘗柱溫度： 流速： 離子化型： 毛細管設定電壓： 錐型設定電壓： 斷電設定溫度： 德塞爾/3設定溫度 碰撞設定能量：
Capcell Pak C18 UG-120 (5 μπι，150X2.0 mm
Α液 B液 30〇C 0.2mL/分鐘 ESI (+) 2.8 kV 15 V 110°C 350〇C 10 eV lOmmol/L乙酸銨、 曱醇（A : 15%、B : 85%) MRM (Multiple Reaction Monitoring)^# ： ALF : zq/z418 [M+NHj+> 383 [Μ·Η20+Η]十 drALF-FMTAD : m々422 [M+NH4]+> 387 [ΜΉ2〇+Η]+ 在S/N比約為3下，求其定量曲線下限值之結果，直 接測定之定量曲線下限值為1 0 ng/mL。第6圖所示為定量 曲線下限值中層析之一例、及實施例4-1(2)之結杲及後述 比較例4-2之結果。
[比較例4-2]大鼠血漿中阿法骨化醇（ALF)經PTAD(4-苯 基-1三唑啉_3,5-二酮）衍生物化之測定 如同實施例4-1 (2)，在大鼠空白血漿中各加入阿法骨 化醇（八1^)成為0、0.1、0.3、1、3、10、30、100及 3 00叫/〇1乙， 作為作成定量曲線用之檢體。再取]00 // L各濃度之檢體， 加入20 // L内標準品（I. S .)40ng/mL之d4-ALF後，再經乙 醇去除蛋白、固相萃取套組（Β ο n d E ] u t SI，3 c c，5 0 0 m g: Varian SPP公司製造）固相萃取後，再依照論文記載之方法 (Biological Mass Spectrometry? 1 993, 22: 621-632 ； Journal 54 314825 200404810 of Chromatography，1993,645: 115-123 等）以 4 -苯基 三。坐琳-3，5 -二酮（P T A D: SIG Μ A公司製造）衍生化。經衍生 化後，再經氮氣乾燥，其餘留物再溶於40 // L之移動相中， 並以10 A L注入LC/ESI-MS/MS中。其測定條件如表11 所示。 表11
ALF，PTAD測定條件 管拄 ： Capcell Pak C18 UG~120 (5 μπι, 150 Χ 2.0 移動相： Α液 10 mmoI/L乙酸銨/乙腈 (1:1) B液 10 mmol/L乙酸敍/乙膳 (2 ： 98) (A : 35%、B : 65%) 管柱溫度： 40°C 流速： 0.2 mL/分鐘 離子化型： ESI (+) 毛細管設定電壓： 3.5 kV 錐型設定電壓： 26 V 斷電設定溫度： 110°C 德塞爾/3設定溫度： 350°C 碰撞設定能量： 16 eV MRM (Multiple Reaction Monitoring)^# · ALF-PTAD : ιπ/ζ576 [M+H]+> 314 [M-C19H33h drALF_PTAD : ζα/ζ580 [M+H]+> 314 [M-C19H29D4]+ 在S/N比約為2下，求其定量曲線下限值之結果，經 PTAD衍生物化後測定之定量曲線下限值為1 ng/mL。第6 圖所示為定量曲線下限值中層析之一例、及實施例4-1 (2) 之結果及後述比較例4-1之結果。 [實施例4-4]生物體檢體中維生素D衍生物測定時前處理 方法之簡化 (1)前處理條件之簡化 55 314825
200404810 第5圖中所示前處理之方法可如下簡化。在加入阿法 骨化醇（ALF)之大鼠空白血漿（100 A L)中加入20 # L 40叫/ mL之d4-ALF(I.S.)，再以乙腈去除蛋白處理後，再以96 孔固相萃取套組（Oasis HLB 96 well plate，lcc，10mg， Waters公司製造）固相萃取。再以FMTAD衍生化，經氮氣 乾燥後再溶於1 〇〇 " L之1 0 mm〇l/L乙酸錄/乙腈（23 : 77 ’ v/v)中，並取3 〇 " L由管柱開關注入LC/ESI-MS/MS中。 檢體之具體處理流程如第8圖所示。LC/ESI-MS/MS之測 定條件如表1 2所示。 表12
Cadenza CD-C] 8 (3 μπι, 50 X 2.0 mm l.d.) 室溫
Capcell Pak C18 UG-120 (5 μπΊ, 150X2.0 mm l.d.) 室溫 A液10 mmol/L乙酸銨、B液乙膳 0.5mL/分鐘 0min-5.20min A:23%, B:77% 5.21 min-8.00 min A:0%, B;100°/〇 8.01 min-14.00 min A:23°/〇N B:77%
ALF~FMTAD測定條&曼 捕獲管柱： 分析管柱： 移動相]: 管拄溫度 管柱溫度 流速 移動相2 : 閥開關： 流速 離子化型： 毛細管設定電壓： 錐型設定電壓： 斷電設定溫度： 德塞爾yS設定電壓： 碰撞設定能量： 】0 mmol/L乙酸錢/乙腈 （10:90, v/v 〇.2mL/分鐘 〇 min： Position 1 (25 min: Position 2 5.2 min: Position ] ESI (+)
lOkV 70V ]5〇〇C 45〇〇C 46 eV MRM (Multiple Reaction MonitoringU,ir 技 ALF-FMTAD: m/z 697 [UT >T9g^T^ ^ d4-ALF-FMTAD: m/z 701 [ΜΓ > , ^C29H44〇4N3]
Jy9 [M-C29H,〇D404NJ 56 314825 200404810 '弟9圖所不為管柱開關。在FMTAD衍生化反應中會 生成2種異物構（6R/6S)5由於在肌c中因開始時溶出豈 構物之S/N比例為高，吸附管柱之分析管 株势々 — 開關條 渦β 〜谷許該S/N比例為高之異構物的溶出分畫通 (2)定量曲線之範圍及直線關係之檢討 先以大鼠空白血漿稀釋i 〇〇 ng/mL ALF乙醇溶液，調 製成 〇 、 0.05 、 η 1/ 、 Ο.15、〇·5、1·5、5 及 15ng/mL 之定量曲線 作成用檢體。i ^ inn r 一 再取100# L定量曲線作成用檢體以前述（1) 中所7Γ备'件處理、測定。本檢體測定3日。求出測定對象 對I. S ·波峰 積之比’由與添加濃度之關係，以最小二次 成疋里曲線（含1 /χ重）、相關係數（r)及各濃下倒 算值之實差值。 表13為所作成在3日内之定量曲線，第1〇圖系為 其標準曲線。 200404810
表13 添加濃度-(ng/mL) 第1 曰 第 2曰 第3 曰 實測值 (ng/mL) 實差值 (%) 實測值 (ng/mL) 實差值 (%) 實測值 (ng/mL) 實差值 (°/〇) 0.05 0.0412 -17.6 0.0497 -0.7 0.0470 -5.9 0.15 0.152 1.5 0.139 -7.3 0.161 7.5 0.5 0.541 8.3 0.517 3.3 0.513 2.5 1.5 1.53 1.7 1.5 1.6 1.42 -5.1 5 5.49 9.8 5.24 4.8 5.05 1.0 15 14.4 -3.7 14.7 -1.8 15.0 0.0 直線回歸式 第]曰 γ=1·64608χ+0·0281324 r=0.996552 (含]/X 重） 第 2 日 y=].63]52x+0.0257574 r=0.999206 (含]/X 重） 第 3 日 y=〗.58456x+0.0548324 r=0.999950 (含】/X 重） 定量曲線之相關係數（r)在0.05至15 ng/mL範圍下為 0.996552至0.99995 0，各濃度下倒算值之實差值為-1 7·6 至9.8%，顯示有良好之直線關係。 (3)同時再現性之檢討
如同前述（2)前段中，先以大鼠空白血漿稀釋l〇〇ng/ mL之ALF乙醇溶液，調製成0.05、0.15、1.5及15ng/mL 作為同時再現性用檢體，再各別處理。各濃度以η二5測定 3曰，求出各測定日之CV值及實差值。表1 4為其結果。 58 314825 200404810 表14 第1曰 添加濃度 (ng/mL) 實測值 (ng/mL) 平均士SD (ng/mL) CV (%) ΎΈΈ (%) 0.05 0.0545 0.0546 0.0575 0.0517 0.0547 0.0546 土 0.0021 3.8 9.2 0.15 1.5 15 0J75 0.158 0.166 0.137 0.167 1.40 1.73 1.69 1.74 1l79 16.7 16.0 17.0 18.5 0.160 士 0.0】4 1.67 ± 0.16 16.8 ± 1.1 8.8 6.7 9.6 6.5 1】·3 12.0 添加濃度 (ng/mL) 實測值 平均土 SD CV (ng/mL)_(ng/mL) (%) 0.05 0.0526 0.0407 ± 0.0069 17.0 0.0365 0.0357 實差值 (%) -18.6 0.15 0.0401 0.0384 0A45~ 0.144 0J49 ~± 0.010 6.7 -0.7 1.5 ]5 0.138 0.165 0.152 _ ___ _ 1:6*7 ί~68 0.05~ …3.0 1.68 1.68 1.75 L61 _ _ Υβ.2 ......± …0.2 ......】3· 16.0 15.6 15.9 15.7 12.0 6Ϊ0* 59 314825 200404810 表14(續）
第3曰 添加濃度 (ng/mL) 0.05 0J5 1.5 15 實測值 (ng/mL) 1λ042 0.0392 0.0287 0.0442 0.0492 0.156 0.156 0.122 0.152 0.152Ι.όΤ' 1.68 1.7】 1.57 1.46 _20.0 — 】5·7 15.4 17.8 】6·8 平均土 SD (ng/mL) 0.0406 ±~0:0076 0.147 士 0·0]4 】.61 ± 1·】0 17.1 ± 1.8 cv 實差值 (%) (%) TFi - ]8:8 9.5 -2.0 6.2 7.3 T0.5 14~0
各測定日、各濃度下之CV值為15%以下（定量下限為 2 0%以下），實差值為± 15%以内（定量之下限為± 20%以 内），因此有優良之靈敏度、實差值。 (4)日差再現性之檢討 依據前述（3)之測定結果，求出3日間全部之CV值及 實差值。結果如表1 5所示。 60 314825 200404810 0.15 ps 75 58 66 37 67 45 έ 300 65 52 56 56 22 52 51 00545 PS46 0.0575 00517 00547 00526 00365 P0357 00401 003004 0.0418 00392 P02OO7 00442 I0S9I10 10,. 0.152 ± 0Ό14 00453 ±o.8ss 黎皆鰣衂衅溼商 卡i2:i±SD (ng/mL)_(ng/mu (ng/彐 L) 9.2 1.3 i5 15.6 \rl 160 170 18.5 16,2 160 J5.6 15.9 15.7 20.0 】5.7 15.4 J7.00 16.8 16.6l-f 】3 1.% 1P7 19.4 ,9·4 .5 r4o 1.73 1.69 i；M 1.79 1.67 l.s 1.600 1.75 1.61 1.63 1.68 1.71 1.57 1.46 rs;± £1 6.7 5.0 nv (％) 衅w麻靜會蘇紐衅窆商卡芯商叶目 B (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) >15 61 3]4825 200404810
口展度下之CV值為15%以下 下、，每、， 〇 3/°以h (疋®下限為20%以 下）貝差值為± 15%以内（定量之·p & 有優良之〜^〜 為土 2〇%以内），因此 喇Ί良民之筮敏度、實差值。 (5)回收率之檢討 回收率用檢體传用‘、+、^。、 如別述（3)之同時再現性中使用之 才双脰。測定回收率用之對昭 …、用核肢（茶考組檢體），為在各 ^空白血漿前處理檢體中加入_“之前述（3)中調製 〇·05、Q.15、1,5 及 15ng/mL《ALF 乙醇溶液，分注 3 支後經衍生化後再測定。以參考 ^Λ >哼、、且榀體1波峰之面積平均 值為1 〇 〇 %，與測定檢體波峰面 ’之面和比求出ALF之回收率。 表16所示為結果。各例中之回收率均達實用程度。表16 k)濃mLs |加| α 0. .5 5 U%) +手{5 2 903 199004 410606 4 0 4 '*·*I· · · * ·!· · · · 二 * · · · · · · · · · L j66474! 4120111668775842 女 ~8 66 7 7-8 7 58 7-698 9 9 7 8 9 88 平均土 SD(〇/〇) ?2·3 ± 12.3 87·9 ± 15.9 85·4 ± 7.8 竹生化率(％}平均± SD (%) 65.5 39.3 46.6 58.7 54.8 57.0 68.6 55.4 58.0 74.2 55.5 66.8 50.5 ± 丨3.5 56·8 ± 2.0 60.7 土 7,〇 65.5 ± 9.4 314825 62 200404810 (6) 衍生化率之檢討 衍生化率用檢體是使用如前述（5)中調製之參考組檢 體（1)。計算衍生化率用之對照用檢體（參考組檢體2)，為 以大鼠空白血漿經前處理，在衍生化之檢體中，各加入 0.0436、0.0871、1.39 及 1 3 ·9 ng/mL 之 ALF-FMTAD 乙醇 溶液1 00 // L後，各分注成3支之檢體測定。以參考組檢 體2波蜂之面積平均值為1 0 0 %，與測定檢體波蜂之面積 比求出ALF之萃取率。表1 6所示為結果。各例中之衍生 物化率均達實用程度。 (7) 專一性之檢討 比較大鼠空白血漿、前述（2)中使用之空白定量曲線（0 ng/mL)及定量曲線下限值（0.05ng/mL)之層析結果。第11 圖所示為ALF-FMTAD之層析圖，第12圖所示為d4-ALF-FMTAD之層析圖。大鼠空白血漿中並無妨礙ALF-FMTAD 及d4-ALF-FMTAD測定之波峰。空白定量曲線（Ong/mL)中 亦無妨礙ALF-FMTAD測定之波峰。 (總結） 如以上實施例所示，使用維生素D衍生物之FMTAD 衍生化法比前處理法為簡便，同時使用管柱開關之LC/ ESI-MS/MS法可以提高其回收率，且其靈敏度高，定量下 限達0.05ng/mL。因此，本方法為一種靈敏度、專一性、 線性關係及精密度均高之定量法，可完全適用多樣檢體之 分析。 [產業上利用之可能性] 63 314825 200404810 ' 如上所述，以本發明之二茂鐵化合物與VD化合物反 應，再以其結合之化合物供LC/ESI-MS/MS分析，測定VD 化合物時可以比已往之方法有更高之靈敏度。本發明之測 定方法，對目前其分子内不含酯基·醚基•硫醇基·醯胺 基等雜原子之VD化合物（具體者如前述之VD3、鈣泊三 醇、1 a，2 5(〇H)2D3、ALF、氟骨三醇、EB 1 089、化合物A 等）之測定靈敏度不足之測定方法，為一種靈敏度可比已往 φ 高出數百倍之測定方法。因此，不只對於含酯基·醚基· 硫醇基·醯胺基等雜原子之VD化合物（具體者如前述之 〇CT、ED-71等），對不含該等雜原子之VD化合物，即對 各種VD化合物，均為適宜之高靈敏度測定方法。同時， 在使用二茂鐵迭氮為衍生化劑之場合，反應條件中並不須 加熱，因此亦為操作容易之VD化合物測定方法。 如上所述，本發明之二茂鐵化合物，在以LC/ESI-MS/MS測定VD化合物時為極有用之衍生化劑。 # 本發明二茂鐵化合物與VD化合物反應所得之二茂鐵 化合物與VD化合物之結合體，在以LC/ESI-MS/MS測定 VD化合物時，為極有用之標定物等。 【圖式簡單說明】 第1圖所示為ALF-FMTAD及ALF-FTAD之ESI質譜 儀測定結果之一例。 第2圖所示為以ALF-FMTAD之分子[M] +及ALF-FTAD之分子[M] +為前驅物離子，測定產物離子光譜結果 之一例。 64 314825 200404810 第3圖所示為在LC/ESI-MS/MS測定條件最佳時，直 接測定ALF-FMTAD、ALF-FTAD及ALF(對照）時，測定結 果之一例。 第4圖所示為在LC/ESI-MS/MS測定條件最佳時，直 接測定 VD3-FMTAD、VD3-FTAD、VD3(對照）及 VD3-二茂 鐵胺基曱酸酯（對照）之測定結果之一例。 第5圖所示為使用大鼠血漿檢體之場合，本發明測定 法中前處理之處理流程之一具體例。 第6圖所示為在本發明測定法及已往方法中，定量曲 線下限的色譜圖之一例。A)為使用lmL大鼠血漿之場合， 以本發明測定法定量曲線下限的色譜圖，B)為使用1 00 // L 大鼠血漿之場合，以本發明測定法定量曲線下限的色譜 圖，C)為以PTAD衍生化測定時，定量曲線下限的色譜圖 (為對照組），D)為直接測定時，定量曲線下限的色譜圖。 第7圖所示為在ALF-FMTAD中以本發明測定法測定 時，定量曲線所示的標準色譜圖之一例。 第8圖所示為使用大鼠血漿檢體之場合，本發明測定 法中前處理處理流程之一具體例，為第5圖所示處理法之 簡化圖。 第9圖所示為本發明測定法中層析裝置之開關。 第1 0圖所示為本發明測定法中，在第8圖、第9圖及 表1 2之條件下測定時，標準定量曲線之一例。 第1 1圖所示為本發明測定法中，在第8圖、第9圖及 表12之條件下測定時，ALF-FM.TAD專一性之色譜圖。A) 65 314825 200404810 ‘ 為大鼠血漿為空白時之色譜圖，B)為定量曲線空白（ALF :
Ong/mL)時之色譜圖，C)為定量曲線下限（ALF : 0.05ng/mL) 時之色譜圖。 第12圖所示為本發明測定法中，在第8圖、第9圖及 表12之條件下測定時，d4-ALF-FMTAD專一性之色譜圖。 A)為大鼠血漿為空白時之色譜圖，B)為定量曲線下限（相當 於 ALF : 0.05ng/mL、d4-ALF : 8ng/mL)時之色譜圖。 66 3H825
Claims (1)
- 200404810 拾、申請專利範圍： 1· 一種下述式（丨）所示之二茂鐵化合物，(式中之Q表直接之鍵結、伸烧基及- (其中％ 表伸烧基及伸笨基；W2表伸烷基；X表…-NCRJC ( = 〇）-、-N(Ra)C( = 〇）NH-、-〇C( = 〇）NH-及-N(Ra)〇S (=〇）_ ; Ra表低級烧基）；R及R’各為獨立，表氫原子、 細基、确基、氰基、鹵素原子 '可有取代基之低級烧基、 可有取代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可 有取代基之低級烷氧基、可有取代基之低級醯基、可有 取代基之羧基及可有取代基之胺基甲醯基；m表1至3 之整數，η表1至4之整數）。 2 ·如申請專利範圍第1項之二茂鐵化合物，其中，R及R， 為氮原子者。 3 .如申请專利範圍第1及2項之二茂鐵化合物，其中，Q 為直接之鍵結及伸烷基者。 4·如申請專利範圍第1及2項之二茂鐵化合物，其中，Q 為伸曱基者。 5.如申請專利範圍第1及2項之二茂鐵化合物，其中，Q 為直接鍵結者。 6 ·’申清專利範圍第]項之二茂鐵化合物，其為4 -(一茂 3]4825 67 鐵基曱基 三唑[]林，5…二唑啉~3,5-二酮或心二茂鐵基义25‘ 小”，5〜二_者。 7 · —種試藥，八 4 3有如申請專利範圍第1項之二茂鐵化合 初，測定合女_ 百二烯構造化合物者。 8.專利範圍第7項之試藥，其中亦含可溶解前述二 戊鐵化合物之溶劑者。 、、式（1)所示之二茂鐵化合物與維生素D化合 物鍵結之化合物，(式中之Q表直接之鍵結、伸烷基及其中W】 表伸烷基及伸苯基；W2表伸烷基；X表·〇-…N(RJC (一〇）-、-N(Ra)c( = 〇）NH-、-〇C( = 〇）NH-及-N(Rj〇s (〇) ’ Ra表低級烧基）；r及r，各為獨立，表氫原子、 經基 '頌基、氰基、函素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有 取代基之低級烧氧基、可有取代基之低級醯基、可有取 代基之緩基及可有取代基之胺基曱醯基；m表1至3之 整數；η表1至4之整數）。 ]〇·如申請專利範圍第9項之化合物，其中，前述二茂鐵化 合物與維生素D化合物鍵結之化合物為前述二茂鐵化 合物與維生素D化合物以共軛鍵結之化合物者。 314825 68 200404810 11 ·如申請專利範圍第9項之化合物，其中，前述二茂鐵化 合物與維生素D化合物鍵結之化合物為下述式（2)所示 化合物者，(式中之A1及八3各為獨立，表可有取代基之低級伸烷 基、可有取代基之低級伸烯基、可有取代基之低級伸炔 基；A2表直接之鍵結、-CH=CH-、-C三Ο、-〇-、或 -NH-; R]表氫原子及_〇r9(R9表氫原子及保護基）；l 表氫原子、經基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之低級烯基、可有取代基之低級炔基、可有 取代基之低級烷氧基及可有取代基之低級醯基；&表氫 原子及保護基；&、&及r6各為獨立，表氫原子、羥 基、硝基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之環烷基、可有取代基之低級烯基、可有取 代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧基、可有取代 基之低級醯基、可有取代基之低級羧基、可有取代基之 胺基曱醯基及可有取代基之胺基；及&各為獨立， 表氫原子及羥基，或R?與心共同形成雙鍵；Q表直接 之鍵結、伸烷基及Λν「Χ-\ν^(其中％表伸烷基及伸苯 314825 69 200404810 基，W2 表伸烧基；χ 表-〇-、-N(Ra)C( = 〇>、 ( = 〇）NH…-〇C( = 〇）NH-及-N(Ra)〇S卜&表低級烷 基）；R及R，各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰基、 齒素原子、可有取代基之低級烷基、可有取代基之低級 焊基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧 基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基及可有取代基之胺基甲醯基；m表】至3之整數；n表丨至4 之整數）。 12·如申請專利範圍第9、10及11項之化合物，其中，a A2-A3 表-CH(CH3)-(CH2)3-、-CH(CH3)-CH = CH-及-CH(ch+ch^ch-ch^ch- ; R】表氫原子及經基；r2表氫原 子及羥基丙氧基；Rs表氫原子；R4、R5& r6各為獨立， 表可由氫原子、羥基、齒素原子取代之低級烷基及低級 %烷基’ R7及Rs表氫原子或R7與Rs共同形成雙鍵者。 13·如申請專利範圍第9至12項之任一項中之化合物，其 中’ R及R’表氫原子者。 士申明專利範圍第9至丨3項之任一項中之化合物，其 中，Q為直接鍵結或伸烷基者。 至1 3項之任一項中之化合物，其 1 5 ·如申清專利範圍第 中’ Q為伸甲基者 16·如申請專利範圍第9至 中’ Q為直接鍵結者。 】7.如申请專利範圍第9至 中，前述維生素D化合 b項之任一項中之化合物 1 6項之任一項中之化合物 物為維生素D3化合物者。 其 其 314825 70 200404810 1 8 · —種維生素D化合物之測定方法，其特徵 所含維生素D化合物之方法，為以下述式（1則定檢體中 茂鐵化合物與檢體中維生素D化合物反所不之一 茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化八/、斤得之 ^ / ^ ^ ^ /τ ^ , 、 〇 4匆再經液體 層析/貝曰'儀（L C / M S)測定者， 〇 Ν II Ν A (R)m 〇 ◎ (R% 1 (式中之Q表直接之鍵結、伸烷基及·其中w】 表伸烷基及伸苯基；W2表伸烷基；X表_〇一 -N(RJC ( = 〇）-、-N(Ra)C( = 0)ra_、·〇(；；（ = 〇)nh 及 一n(r〇〇s 卜0)-; Ra表低級烷基）；R及R，各為獨立，表氫原子、 Μ基、确基、氰基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、 」有取代基之低級每基、可有取代基之低級炔基、可有 取代基之低級烷氧基、可有取代基之低級醯基、可有取 代基之緩基及可有取代基之胺基甲醯基；m表1至3之 主數，π表1至4之整數）。 1 9.如申請專利範圍第1 8項之維生素D化合物之測定方 法’其中，前述二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之 化合物’為其前述二茂鐵化合物與維生素D化合物以共 輛鍵結所鍵結之化合物者。 一 〇 ·如申請專利範圍第]8項之維生素D化合物之測定方 法’其W述二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合 71 314825 物，為下述式（2)所示之化合物者R2 ^ (R，)n (2) (式中之A】及As各為獨立，表可有取代基之低級伸烷 基、可有取代基之低級伸烯基、可有取代基之低級伸炔 基，A]表直接之鍵結、-CH = CH-、-CeC-、-〇-、-及 -NH- ; R!表氫原子及-OR/R9表氫原子及保護基）； 表氫原子、每基、鹵素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之低級稀基、可有取代基之低級炔基、可有 取代基之低級烷氧基及可有取代基之低級醯基；&表氫 原子及保護基；R4、&及&各為獨立，表氫原子、經 基、硝基、·氰基、i素原子、可有取代基之低級烷基、 可有取代基之環：)：完基、可有取代基之低級烯基、可有取 代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧基、可有取代 基之低級醯基、可有取代基之低級羧基、可有取代基之 胺基曱醯基及可有取代基之胺基；R7及R8各為獨立， 表氫原子及羥基，或R?與Rs共同形成雙鍵；q表直接 之鍵結、伸烷基及_W「X-W2-(其中％表伸烷基及伸苯 基；w2表伸烷基；X表_〇_、_N(RJC卜〇）一 _N(R (二〇）NH…-〇C(二〇）NH-及-N(RJ〇S( = 〇)_·;心表低級烷 314825 72 200404810 基）·’ R及R，各為獨立，表氫原子、羥基、硝基、氰基、 *素原子、·可有取代基之低級烷基、可有取代基之低級 烯基、可有取代基之低級炔基、可有取代基之低級烷氧 基、可有取代基之低級醯基、可有取代基之羧基及可有 取代基之胺基甲醯基；m表1至3之整數；η表1至4 之整數）。 2 1 ·如申請專利範圍第1 8、丨9及2〇項之維生素〇化合物之 測定方法，其中，在前述二茂鐵化合物及前述二茂鐵化 合物與維生素〇化合物鍵結之化合物中，其A]-Α厂Α3為 -CH(CH3)-(CH2)3- ^ -CH(CH3)-CH = CH-A-CH(CH3)-CH= = ; R]表氫原子及羥基；r2表氫原子及羥基 丙氧基；表氫原子；R4、R5及R6各為獨立，表可由 氯原子、經基、函素原子取代之低級烷基及低級環烷 基；R7及Rs表氫原子，及r7與R8共同形成雙鍵者。 22·如申請專利範圍第18至21項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，在前述二茂鐵化合物及前述 一茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物中，其R 及R ’為氫原子者。 23. 如申請專利範圍第18至22項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，在前述二茂鐵化合物及前述 二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物中，其Q 為直接鍵結或伸烷基者。 24, 如申請專利範圍第18至22項之任一項中之維生素D ^ I"**」、@丨1 广， σ 列疋方法，其中，在前述二茂鐵化合物及前述 73 314825 200404810 二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物中，其Q 為伸甲基者。 25·如申請專利範圍第18至22項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，在前述二茂鐵化合物及前述 二茂鐵化合物與維生素D化合物鍵結之化合物中，其Q 為直接鍵結者。 26. 如申請專利範圍第18至25項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，前述檢體中之維生素D化合 物為維生素D3化合物者。 27. 如申請專利範圍第18至26項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，檢體為來自生物體之檢體 者。 28·如申請專利範圍第18至27項之任一項中之維生素D 化合物之測定方法，其中，液體層析/質譜儀（LC/MS) 為液體層析/電灑游離化-質譜儀/質譜儀（LC/ESI-MS/MS)者。 74 314825
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2003
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