CN107406410B

CN107406410B - 有机碲化合物、组合物及其使用方法

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Publication number: CN107406410B
Application number: CN201580056843.6A
Authority: CN
Inventors: M·尼茨; L·J·埃德加; B·G·武泰; D·赫德利; L·M·威利斯; M·A·卢姆巴; H·帕克; R·N·维勒凯
Original assignee: University Health Network; University of Toronto
Current assignee: University Health Network; University of Toronto
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: CA2958092A1; CN107406410A; US10222380B2; US20190250165A1; US10816552B2; EP3183243A4; US20210102949A1; US20170269094A1; WO2016026046A1; EP3183243A1; CA2958092C

Abstract

本文式(I)的化合物及其作为探针在用在组织样品的质谱流式细胞技术分析中的生物传感器或生物活性材料的质量标记中的方法和用途，诸如通过使用例如经碲吩标记的2‑硝基咪唑检测、标记和定量去氧细胞。

Description

有机碲化合物、组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

这是一项专利合作条约申请，其根据美国法典第35部分119条要求2014年8月20日提交的美国临时专利申请US62/039,762和2015年5月21日提交的美国临时专利申请US62,165,002的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及有机碲吩化合物，特别涉及用于质谱流式细胞技术的有机碲吩探针。

背景技术

组织样品中单个细胞的特征描述需要高度参数化试验¹。荧光技术流式细胞术(FC)已成为研究异质细胞群的所选方法，因为其允许常规分析5-10个参数²。然而，由于用于分析物检测的荧光团的光谱重叠，FC不能用于高参数化试验(>20个参数)³。这一问题的解决方案是用电感耦合等离子体光谱仪(ICP-MS)和同位素标记的抗体替代FC中用于质量检测的光学检测和荧光标记的抗体。这种称为质谱仪(MC)的技术能够以单质量单位分辨率检测多个数量级的大量生物正交同位素(理论上>100)¹。MC允许类似于流式细胞术的实验，但具有显著增强的参数化。MC已被用于同时检测和定量34个细胞参数以显示人造血连续体(human hematopoietic continuum)中的药物反应⁴。

可以通过使用商购可获得的

来进行MC实验，用结合一系列高分子量金属同位素(通常为镧系元素)的金属螯合聚合物来标记抗体。美国专利No.9012239中描述了连接到聚合物骨架的元素标记。公开的具体实施例包括包含金属螯合基团二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的元素标签。

还需要其它质量标记的试剂。

有机碲化合物由

在1840年首次合成。尽管该领域的研究仍然不成熟，但对生物系统中的有机碲化合物的研究日益增长^7,8。碲在原核或真核细胞中没有已知的生物学作用。对于生物系统中碲的新陈代谢，我们知之甚少，不过假定其遵循其类似物硒的代谢途径。已经发现微生物将无机碲甲基化使其成为挥发性或离子性物质用于排泄。由于所述代谢物的不稳定性，这一过程的实验证据很少⁷。然而，涉及生物系统中芳基，乙烯基，炔基和烷基碲基醚的细胞研究的报告的数量正在增加^9-14。本研究的绝大部分是基于芳基碲氟醚模拟谷胱甘肽过氧化物酶活性的能力，比如在一些情况下的抗氧化应激以及在其他情况下打乱氧化还原稳态以致细胞凋亡^15,16。最近的鼠科研究已经显示出从基于氨基酸的芳基碲醚预期的毒性到用烷基碲醚处理的小鼠的记忆增强的不同效果^17,18。

发明概述

本文描述了在一个实施方案中质谱流式细胞技术(MC)探针能够用于测定细胞生物化学。图1描绘了MC探针的一个实施方案。理想地，质量标签应该在可以用在可接受同位素并入的高产率合成中，在生物相关条件下是稳定的并且具有低毒性。构建用于测量细胞缺氧的MC探针(Telox)(描述于美国申请序列号62/039762)⁵。该探针使用2-硝基咪唑作为活性基团用于缺氧特异性标记，并用甲基碲醚官能团作为标签单位用于MC检测⁵。选择碲作为用于检测的元素，是因为已知其与碳形成稳定的键，并且其具有8种天然存在的同位素，这可以产生一系列可唯一识别的、用相同的化学方法在生物学上不能区分的MC探针。

在Telox中，碲醚官能团(telluroether functionality)具有中等稳定性和接近所需测定浓度的代谢LD₅₀值。

本文描述了一系列烷基碲醚和碲吩官能团的合成、含水/有氧的稳定性和体外毒性。

根据以下详细描述，本申请的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，表明本申请的实施方案的详细描述和具体实施例仅以解释说明的方式给出，所述权利要求的范围不应当被这些实施方案限制，而应当给出与整个说明书一致的最宽泛的解释。

附图说明

现在描述本公开涉及附图的实施方案，其中：

图1显示了本申请的某些实施方案中的质谱流式细胞技术探针的一般要求和设计。

图2显示了示例性化合物1-11的¹H NMR稳定性实验的结果。(A)化合物1、2和7。(B)化合物3、4、5和6。(C)化合物8、9、10和11。将有机碲化合物

溶解于d-DMSO中，以1,3,5-三氧杂环己烷为内标物。将所述化合物保存在20mL的透明玻璃瓶中。连续供应经包含磷酸、氢氧化钾和硫酸钙的一系列鼓泡器干燥的环境空气以保持所述小瓶处于无水环境中24小时。通过¹H NMR分析等分试样，积分有机碲信号和d5-H-DMSO峰。取时间为0时的DMSO和有机碲质子之间的比例，并进行标准化以生成降解图。通过从每个单独的初步NMR数据生成三重积分数据(triplicate integration data)来计算实验误差。该误差考虑了积分偏差和仪器波动。

图3显示了示例性化合物10和11在50％d-DMSO、d-PBS缓冲溶液中降解的NMR实验的结果。在所示时间点取化合物10的¹⁹F NMR和化合物11的¹H NMR。化合物10用三氟乙酸作为内标物，化合物11用d5-DMSO作为内标物。

图4：在第二代CyTOF仪器上通过质谱流式细胞技术进行分析的Telox/Telox2细胞标记的示意图。b)信号事件长度相对于¹³⁰Te信号(任意单位)的密度图。c)¹⁹³Ir信号(任意单位)相对于¹⁰³Rh信号(任意单位)的b)中右上门输出的密度图。超过93％的检测到的事件落在该方形门中。d)¹⁹³Ir信号(任意单位)相对于¹⁰³Rh信号(任意单位)的b)中左下门输出的密度图。超过89％的检测到的事件落在该方形门中。e)细胞¹³⁰Te含量(任意单位)的总体直方图。氧浓度以数值百分比的形式列出，P＝哌莫硝唑(100μM)。蓝色和红色直方图是哌莫硝唑的阴性对照。橙色和绿色直方图是哌莫硝唑-阳性竞争实验。注：密度图中的较暖色表示较高的细胞种群密度。

图5显示通过¹H NMR监测的示例性化合物Telox-2随时间函数的稳定性。Telox-2的浓度为200μM(D₂O中含0.01％的D₆-DMSO)。

图6显示了通过紫外可见光谱监测的示例性化合物Telox-2随时间函数的稳定性。Telox-2的浓度为200μM(磷酸盐缓冲盐水中含0.01％的DMSO)。小光谱表明碲吩和硝基咪唑官能团的独特吸收。

图7显示a)在各种浓度的示例性化合物Telox-2存在下，HCT116细胞随时间函数的细胞增殖率(饱和度分析)；和b)通过减少WST-1而测量的示例性化合物Telox-2在白血病细胞中的代谢毒性。用Telox-2培养细胞24小时，然后暴露于WST-1中30分钟。

图8显示了a)通过用示例性化合物Telox-2在近缺氧

低氧

或常氧(21％O₂)的氛围中培养3小时的HCT116细胞的质谱流式细胞技术分析而确定的随浓度函数的绝对¹³⁰Te信号；和b)在a)部分所呈现的数据的信噪比(倍数变化)。

图9显示了a)通过用10μM示例性化合物Telox-2(恒定暴露)在近缺氧

低氧

或常氧(21％O₂)氛围中培养的HCT116细胞的质谱流式细胞技术分析而确定的随浓度函数的绝对¹³⁰Te信号；b)在a)部分所呈现的数据的信噪比(倍数变化)；和c)通过用10μM的Telox-2培养3小时的HCT116细胞，随后在近缺氧

低氧

或常氧(21％O₂)氛围中用新鲜培养基替换含Telox-2培养基的质谱流式细胞技术分析而确定的随时间函数的绝对¹³⁰Te信号；和d)在c)部分所呈现的数据的信噪比(倍数变化)。

图10显示了a)在含有21％O₂、1％O₂、0.2％O₂或小于0.02％O₂的氛围中用10μM示例性化合物Telox-2培养3小时的野生型HCT116细胞的质谱流式细胞技术直方图；b)在含有21％O₂、1％O₂、0.2％O₂或小于0.02％O₂的氛围中用10μMTelox-2培养3小时的过表达POR的突变HCT116细胞的质谱流式细胞技术直方图；和c)在含有21％O₂、1％O₂、0.2％O₂或小于0.02％O₂的氛围中用10μMTelox-2培养3小时的不能表达POR的突变HCT116细胞的质谱流式细胞技术直方图。

图11显示了在常氧(21％O₂)或近缺氧

氛围中培养的HCT116细胞中的示例性化合物、Telox-2和哌莫硝唑的竞争性标记。Telox-2的浓度为10μM。使用质谱流式细胞技术测量绝对¹³⁰Te信号。

发明详述

I.定义

本文所用术语“细胞”包括单细胞以及多个细胞或细胞群。

本文所用术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体及其结合片段。所述抗体可以来自重组源和/或在转基因动物中产生。可以使用常规技术将抗体片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理所述抗体来产生F(ab')2片段。可以处理得到的F(ab')2片段以还原二硫键从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可导致Fab片段的形成。也可以通过重组技术合成Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其它片段。本文所用的抗体片段意指结合片段。

本文所用术语“生物传感器”意指1)被酶转化为反应产物(例如但不限于亚甲基醌中间体)、不溶性产物和/或膜定位产物(例如包含产物的脂肪酸)，其中所述产物标记细胞(例如细胞成分)、局部组织环境或者是标记活性酶的不可逆酶抑制剂，和2)可以缀合有机碲化合物的任何酶底物，任选地为式(I)的化合物。在一些实施方案中，所述生物传感器耦合到和/或进一步包含一个或多个质量标签或质量标签的支撑结构。

本文所用术语“生物活性材料”意指选自细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸、肽核酸、寡糖、多醣脂多醣、细胞代谢物、半抗原、激素、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖的实体，并且包括例如其合成模拟物。在一些实施方案中，所述生物活性材料偶联至和/或进一步包含一个或多个质量标签或质量标签的支撑结构。

本文所用术语“差异碲同位素”(distinct tellurium isotope)是指具有单个碲同位素的一个或多个原子的化合物中的Te原子。例如，可以在试验中使用一系列质量标记的实体，每个具有不同的差异碲同位素，使得包含差异碲同位素的每种化合物与其他化合物是可区别的。

本文所用术语“差异质量”表示所述化合物具有单一碲同位素的一个或多个原子或者单独的碲同位素的独特组合(例如区别碲质量)或与其它质量标签组合。一个实施例包括一系列化合物，任选地为聚合物，每种化合物单独具有不同水平的不同碲同位素或与其它杂质标签组合，任选地用于条形码实施方案中。或者，所述化合物例如酶底物可以包含单独的碲的多种同位素或与其它质量标签组合。在分裂所述底物后，可以使用比率测量方法来评估酶是否是有活性的。

本文所用术语“质量标签”是指包含至少一种特定元素的同位素组分用于通过质谱分析来区分所述标签所连接的分子或任选地标签本身与包含不同元素同位素组分的其他分子。在一些实施方案中，所述质量标签包括至少一种元素的同位素和用于所述至少一种元素的同位素的支撑结构。

本文所用术语“代谢标记”是指将生物分子合并到大分子中，例如将氨基酸合并到蛋白质中，或将单糖合并到多糖或糖蛋白中。

本文所用“有机碲吩标记”是指包含碲吩部分和连接体(L)(其例如是紧凑的并且可以缀合至生物传感器、聚合物骨架和/或生物活性材料)的任何含碲吩的化合物，且包括例如本文描述的和/或在美国申请62/039762中描述的有机碲吩化合物，通过引用并入本文。例如，有机碲吩标签可以包含碲吩部分、直接或间接地任选间接地通过聚合物骨架缀合至诸如抗体的生物传感器的连接体。

本文所用术语“蛋白酶”意在包括肽酶和蛋白酶，并且是可以催化肽键分裂的酶的子集，包括例如半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。

本文所用“亚细胞颗粒”包括细胞器，例如细胞核、溶酶体、核内体、线粒体、微粒体等。

本申请所用词语“包括(comprising)”(以及任何形式的“包括”，诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的“具有”，例如“具有(have)”和“具有(has)”)或“包含(containing)”(以及任何形式的“包含”，例如“包含(contain)”和“包含(contains)”是包括在内的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或工艺步骤。

本申请和权利要求中所使用的词语“组成(consisting)”及其派生词，是指定所述特征、组件、部件、组、整体和/或步骤的存在的封闭式术语，并且还排除其它未陈述的特征、组件、部件、组、整体和/或步骤的存在。

本文所用术语“基本上由......组成”意在说明所述特征、组件、部件、组、整体和/或步骤的存在，以及不会实质上影响其基本特征和新颖特性的这些特征、组件、部件、组、整体和/或步骤的存在。

本文所用术语“约”、“基本上”和“大约”意指所修饰的术语的合理数量的偏差以使最终结果不发生显著改变。如果这种偏差不会否定其修饰的词语的含义，则这些程度术语应当被解释为包括所修饰词语的至少±5％的偏差。

本说明书引用了本领域技术人员使用的许多化学和生物术语以及缩写词。然而，为了清楚和一致性，提供了所选术语的定义。

本文所用术语“合适的”意指特别的化合物或条件的选择将取决于要进行的具体合成操作以及待转化分子的同一性，但所述选择会完全在本领域技术人员的技能范围内。本文所述的所有工艺/方法步骤将在足以提供所示产品的条件下进行。本领域技术人员将理解，为了优化所需产物的产率，所有反应条件，包括例如反应溶剂、反应时间、反应温度、反应压力、反应物比例以及反应是否应在无水或惰性环境中进行，可以是变化的，并且在这样做在其技术范围内。

本申请所使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数指代，除非文中另有明确规定。例如，包括“一种化合物”的实施方案应理解为在某些方面表现为一种化合物或两种或多种另外的化合物。

在包含“另外的”或“第二”组分例如另外的或第二化合物的实施方案中，本文所使用的第二组分在化学上不同于其它组分或第一组分。“第三”组分不同于其他第一组分和第二组分，类似地，进一步列举的或“另外的”组分也不同。

在本申请的实施方案中，本文所述的化合物可以具有至少一个非对称中心。当化合物具有多于一个非对称中心时，其可以作为非对映异构体存在。应当理解，所有这些异构体及其任何比例的混合物都包含在本申请的范围内。应进一步理解的是，虽然所述化合物的立体化学可以如本文所列的任何给定化合物所示，但这样的化合物也可以含有一定量(例如，小于20％，合适地小于10％，更合适地小于5％)具有互生立体化学的本申请所述的化合物。希望将任何光学异构体(分离的、纯的或部分纯化的光学异构体或其外消旋混合物)包括在本申请的范围内。

本文所用的术语“烷基”，无论其是单独使用还是作为另一基团的一部分使用，意指直链或支链的饱和烷基。所提及的烷基中可能的碳原子数由数字前缀“C_n1-n2”表示。例如，术语C_1-6烷基意指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。

本文所用术语“亚烷基”，无论其是单独使用还是作为另一基团的一部分使用，意指直链或支链的饱和亚烷基；即在其两个末端上含有取代基的饱和碳链。所提及的亚烷基中可能的碳原子数由数字前缀“C_n1-n2”表示。例如，术语C_4-20亚烷基是指具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的亚烷基。

本文所用术语“芳基”，无论其单独使用还是作为另一基团的一部分使用，是指含有至少一个芳族碳环的单环、二环或三环基团。在本申请的一个实施方案中，所述芳基含有6、9、10或14个碳原子，诸如苯基、萘基、茚满基或蒽基。

本文所用术语“碲吩”是指下式所示化合物：

其中，所述数字用于命名所述碲吩环上的各种取代基。

所述术语“有机碲吩”是指被至少一个含碳基团取代的碲吩。

本文所用术语“吸电子基团”是指从共轭π体系移除电子密度、使得所述π体系更亲电子的原子或官能基团。

本文所用术语“不饱和的”是指包含至少一个双键的化合物或基团，包括具有最高数量的双键的化合物和基团，以及芳香族化合物和基团。

本文所用术语“保护基团(protective group)”或“保护基团(protectinggroup)”或“PG”或者诸如此类，其是指保护或掩蔽分子的反应性部分以防止在操纵或反应所述分子的不同部分时所述分子的反应性部分中的副反应的化学部分。操作或反应完成后，在不降解或分解剩余部分分子的条件下除去所述保护基团。本领域技术人员可以选择合适的保护基团。许多常规保护基团是本领域已知的，例如“有机化学中的保护基团”(“Protective Groups in Organic Chemistry”)McOmie，J.F.W.Ed，Plenum Press，1973，Greene，T.W和Wuts，P.G.M.，“有机合成中的保护基团”(“Protective Groups in OrganicSynthesis”)，John Wiley&Sons，3rd Edition，1999以及Kocienski，P.保护基团(Protecting Groups)，3rd Edition，2003，Georg Thieme Verlag(The Americas)中所述。合适的保护基团的实例包括但不限于t-Boc、Ac、Ts、Ms、甲硅烷基醚，诸如TMS、TBDMS、TBDPS、Tf、Ns、Bn、Fmoc、苯甲酰基、二甲氧基三苯甲基、甲氧基乙氧基甲基醚、甲氧基甲基醚、新戊酰基、对甲氧基芐基醚、四氢吡喃基、三苯甲基、乙氧基乙基醚、苄氧羰基(carbobenzyloxy)、苯甲酰基等。

本文所用术语“官能团”是指将与另一组原子或单个原子(所谓的“互补官能团”)反应以在两基团或原子间形成化学相互作用的一组原子或单个原子。

本文所用术语“互补官能团”意指与另一指定官能团相互作用或与其反应以形成化学相互作用的官能团。在一个实施方案中，所述化学相互作用是共价键或离子键。在另一个实施方案中，所述化学相互作用是共价键。

本文所用术语“与……反应”通常意指存在引起化学相互作用形成的电子流或静电电荷的转移。

本文所用术语“化学相互作用”是指在所述反应性官能团之间形成共价离子键。

本文所用术语“可用氢原子”是指在不会降解或分解母体化合物的条件下，可以被另一基团取代的分子上的氢原子。这样的条件包括在替换氢原子时用保护基保护分子中的敏感官能团。

本文所用术语“本申请的化合物(compound(s)of the application)”或“本申请的化合物(compound(s)of the present application)”等包括含碲吩部分、连接体和反应性官能团的有机碲吩化合物，其中所述反应性官能团能够被生物传感器、生物活性材料和/或聚合物骨架官能化；含碲吩部分、连接体和生物传感器、生物活性材料和/或聚合物骨架的有机碲吩化合物，特别是式(I)、(II)和(IIa)所示的化合物及本文所限定的其药学上可接受的盐和/或溶剂合物。

酸加成盐意指任何碱性化合物的任何有机或无机盐。形成酸加成盐的碱性化合物包括例如包含氨基的化合物。形成合适盐的例证性无机酸包括盐酸、氢氟酸、三氟乙酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾的金属盐。形成合适盐的例证性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸，诸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸以及诸如对甲苯磺酸和甲磺酸的磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐，并且这些盐可以以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。通常，酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂，与其游离碱形式相比通常表现出较高的熔点。合适的盐的选择是本领域技术人员已知的。

碱加成盐是指任何酸性化合物的任何有机或无机碱加成盐。形成碱加成盐的酸性化合物包括例如包含羧酸基团的化合物。形成合适盐的例证性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适盐的例证性有机碱包括脂肪族、脂环族或芳族有机胺，诸如如甲胺、三甲胺和甲基吡啶、烷基铵或氨。合适的盐的选择是本领域技术人员已知的。

使用标准技术实现所需化合物盐的形成。例如，在合适的溶剂中用酸或碱处理中性化合物，并且通过过滤、萃取或任何其它合适的方法分离所形成的盐。

本文所用术语“溶剂合物”是指式(I)或式II所示的化合物或式(I)或式(II)化合物的药学上可接受的盐，其中合适溶剂的分子并入晶格。合适的溶剂在给药剂量上是生理上可耐受的。合适溶剂的实例是乙醇、水等。当水是所述溶剂时，所述分子被称为“水合物”。本申请所述化合物的溶剂合物的形成根据化合物和溶剂合物而变化。通常，通过将所述化合物溶解在所述合适的溶剂中并通过冷却或使用抗溶剂分离所述溶剂合物而形成溶剂合物。通常在环境条件下干燥或共沸所述溶剂合物。

本文所用术语“有效量”是指为了获得期望的结果在必要时间范围内的有效的量。

本文所用术语“聚合物骨架”是指包含一系列共同产生聚合物分子的连续链(直链或支链)的共价键合的原子的合适聚合物的主链。所述聚合物是包含至少一种与其共价连接的式(IIa)的化合物的任何合适的聚合物或共聚物。在一些实施方案中，所述聚合物骨架包括增加水溶性的官能原子，例如聚乙二醇单元，和/或增加水溶性的连接官能团，例如两性离子基团。在一些实施方案中，所述聚合物骨架耦合到和/或进一步包括一个或多个生物传感器、生物活性材料、质量标签和/或质量标签的支撑结构。

在特别部分中描述的所述定义和实施方案意在适用于本文所描述的本领域技术人员能够理解的合适的其它实施方案。例如，在以下段落中，更详细地定义了不同的方面。除非明确指明相反的内容，否则如此定义的每个方面可以与任何其他方面组合。特别地，指明为优选或有利的任何特征可以与指明为优选或有利的任何其它特征组合。

II化合物、组合物和试剂盒

已经如本申请中所述制备了作为用于质谱流式细胞技术(MC)的探针的官能化有机碲吩化合物。通过核磁共振光谱表征所述有机碲吩化合物，并通过紫外-可见光谱监测它们的稳定性。本申请的研究中也已经评估了作为MC探针的代谢毒性及其后续潜能。

因此，本申请包括含碲吩部分、连接体和反应性官能团的有机碲吩化合物，其中所述反应性官能团能够被生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架官能化。在进一步的实施方案中，本申请包括含碲吩部分、连接体和生物传感器、生物活性材料和/或聚合物骨架的有机碲吩化合物。

在一个实施方案中，本申请所述的有机碲吩化合物包含碲吩，其任选在5-位上以庞大基团和/或吸电子基团官能化并且在2-位上以连接至反应性官能团X的连接体官能化。在另一个实施方案中，所述的有机碲吩化合物包含碲吩，其任选在5-位上以庞大基团和/或吸电子基团官能化并且在2-位上连接至生物传感器、生物活性材料和/或聚合物骨架连接的连接体官能化。5-位上的取代的实施方案有助于例如通过抑制Te原子的氧化来稳定所述有机碲吩化合物。

在另一个实施方案中，本申请包括式(I)的有机碲吩化合物或盐和/或溶剂合物：

其中，A是Te的天然存在的同位素；

R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₂₀烷基、未取代或取代的C₃-C₂₀环烷基、未取代或取代的芳基和吸电子基团；

L是C_1-30亚烷基，未取代或被一个或多个取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O、S、NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被一个或多个C(O)和C(S)所间隔；

R⁷独立地选自H，PG和C1-6烷基；

X是选自卤素、OH、OTs、OMs、C(O)H、C(O)OR⁸、C(O)NR⁹R¹⁰、O-C(O)-OR¹¹、O-C(O)-NR¹²、C(O)ONR¹³R¹⁴、C(O)R¹⁵、C(O)SR¹⁶和NR¹⁷R¹⁸的反应性官能团；

R⁸选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者，

R⁹和R¹⁰与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环或双环饱和或不饱和环；

R¹¹选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹²选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹³和R¹⁴独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者

R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环或双环饱和或不饱和环；

R¹⁵是卤素；

R¹⁶选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-6烷基、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者

R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环或双环饱和或不饱和环；并且

一个或多个可用的氢任选地被D替代；

条件是，当X是C(O)OR¹⁹且R¹⁹是H或C_1-6烷基时，L不是C_1-8亚烷基；以及当X是OH时，L不是C_1-2亚烷基。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的R¹是选自C(O)R²、C(R³)₃、C≡N和NO₂的吸电子基团，其中R²选自H和C_1-6烷基，R³是卤素。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物中R¹上的取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基和C_1-6烷氧基中的一个或多个。

在进一步的实施方案中，式(I)所示的化合物中的R¹是H、未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₃-C₁₀环烷基、未取代或取代的苯基和选自C(O)R²和C(R³)₃的吸电子基团。在另一个实施方案中，R¹上的取代基独立地选自卤素和C_1-6烷基中的一个或多个，R²选自H和C_1-6烷基，R³是F、Cl、Br和I。在进一步的实施方案中，R¹选自H和C(R³)₃，其中R³是F。在一个实施方案中，R¹是H。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的L上的取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶，其中R⁴选自H和C_1-6烷基；R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-20烷基和C(O)OC_1-20烷基。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的L的C_1-25亚烷基，未取代或被一个或多个独立地选自C_1-3烷基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔，R⁴选自H和C_1-2烷基，R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-6烷基和C(O)OC_1-6烷基，R⁷独立地选自H和PG。

在另一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的L是C_1-25亚烷基，未取代或被一个或多个独立地选自NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔，R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-6烷基；R⁷是H。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的X是选自Cl、Br、I、OH、C(O)OR⁸、C(O)NR⁹R¹⁰、O-C(O)-OR¹¹、C(O)ONR¹³R¹⁴、C(O)R¹⁵和NR¹⁷R¹⁸的反应性官能团；R⁸选自H和C_1-2烷基；R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；R¹¹是未取代或被F、Cl、Br、I和NO₂中的一个或多个取代的苯基；R¹³和R¹⁴独立地选自H和C_1-2烷基，或者，R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O和＝S取代的4至10元单环或双环；R¹⁵是Cl或Br；R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-3烷基，或者，R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O和＝S取代的4至12元单环或双环。

在另一个实施方案中，式(I)所示的化合物中的X是选自Cl、OH、C(O)OR⁸、C(O)NR⁹R¹⁰、O-C(O)-OR¹¹、C(O)ONR¹³R¹⁴和NR¹⁷R¹⁸的反应性官能团；其中R⁸是H；R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；R¹¹是被NO₂取代的苯基；R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成被＝O取代的4至6元单环；R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-2烷基，或者，R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成被＝O取代的4至10元双环。

在一个实施方案中，式(I)所示的化合物选自：

在一个实施方案中，本申请还包括式(II)所示的有机碲吩化合物和/或其盐和/或其溶剂合物：

其中，A是Te的天然存在的同位素；

L是C_1-20亚烷基，未取代或被一个或多个取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O、S、NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被一个或多个C(O)和C(S)所间隔；

R⁷独立地选自H，PG和C_1-6烷基；以及

Z是生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架。

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的R¹是选自C(O)R²、C(R³)₃、C≡N和NO₂的吸电子基团，其中R²选自H和C_1-6烷基，R³是卤素。

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的R¹上的取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基和C_1-6烷氧基中的一个或多个。

在另一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₃-C₁₀环烷基、未取代或取代的苯基和选自C(O)R²和C(R³)₃的吸电子基团；所述R¹上的取代基独立地选自卤素和C_1-3烷基中的一个或多个；R²选自H和C_1-6烷基；R³是F、Cl、Br和I。

在进一步的实施方案中，式(II)所示的化合物中的R¹选自H和C(R³)₃，其中R³是F。

在进一步的实施方案中，式(II)所示的化合物中的R¹是H。

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的L上的取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶，其中R⁴选自H和C_1-6烷基，R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-20烷基和C(O)OC_1-20烷基。

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的L是C_1-25亚烷基，未取代或被一个或多个独立地选自C_1-3烷基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔的；R⁴选自H和C_1-2烷基；R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-6烷基和C(O)OC_1-6烷基；R⁷独立地选自H和PG。

在另一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的L是C_1-25亚烷基，未取代或被一种或多种独立地选自NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔；R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)OC_1-4烷基；R⁷是H。

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的Z是生物传感器。

在一个实施方案中，生物传感器是氧化还原酶底物，诸如黄嘌呤氧化酶底物或P450底物。如本文所述，黄嘌呤氧化酶催化Telox和Telox2的2-硝基咪唑组分的还原。

在另一个实施方案中，所述生物传感器进一步包含质量标签或质量标签的支撑结构，其中所述质量标签或支撑结构任选地直接连接到生物传感器或通过连接体，诸如本文所述的连接体L进行连接。

在另一个实施方案中，所述生物传感器是2-硝基咪唑。

在进一步的实施方案中，式(II)所示的化合物选自：

如本文所示，这些化合物可用于在缺氧条件下标记细胞。在缺氧条件下培养细胞时，这样的化合物会经历2-硝基咪唑官能团的酶催化还原，以产生形成加合物的亲电蛋白-标记正氮离子，允许标记缺氧细胞。

在一个实施方案中，可以使用一系列这些化合物，每种包含一种或多种Te的不同同位素，例如，以在单一的质谱流式细胞技术中描述不同的测试变量。

各种酶底物可用作生物传感器，包括例如氧化还原酶、糖基水解酶、脂肪酶、磷酸酶、激酶和蛋白酶的底物，对于蛋白酶具有特异性的活性位点特异性活性化合物，例如包含位于酶活性位点的共价结合至催化亲核试剂(例如在丝氨酸，半胱氨酸和苏氨酸蛋白酶中分别为Ser，Cys或Thr)的亲电子基团。

其他生物传感器包括例如产生反应性产物的蛋白酶底物为选择性标记活性酶的不可逆抑制剂。在一个实施方案中，所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶底物。

其它生物传感器包括例如糖基水解酶底物。在一个实施方案中，所述糖基水解酶底物是包括例如本文所述的化合物24的B-半乳糖苷酶底物。一旦底物分裂后，该β-半乳糖苷酶底物会产生与细胞组分反应的碲吩标记的醌甲基化物化合物，从而标记细胞。

在一个实施方案中，所述反应性产物是醌甲基化物。

在一个实施方案中，所述生物传感器包含诸如脂肪酸的膜靶向部分。所述脂肪酸可以例如包含具有至少4个碳、至少6个碳或4至22个碳之间的任何数量的碳的脂肪族末端。

在一个实施方案中，所述生物传感器是组织蛋白酶蛋白酶底物，诸如组织蛋白酶S蛋白酶底物。在一个实施方案中，所述碲吩标记的生物传感器包括：

所述化合物是组织蛋白酶S肽底物并且是膜缔合的。在一个实施方案中，用两个质量标签，任选地两个各自含有Te的不同同位素的有机碲吩部分标记底物。在这样的实施方案中，细胞组织蛋白酶S活性导致所述底物的分裂以及所述质量标签中的一个释放。可以计算两个质量标签的比例，其指示组织蛋白酶的活性。

其他的生物传感器包括例如诸如碱性磷酸酶底物的磷酸酶底物，以及ATP酶活性位点特异性反应化合物、GTP酶活性位点特异性反应化合物和激酶活性位点特异性反应化合物。

在另一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的Z是生物活性材料。

在进一步的实施方案中，所述生物活性材料选自细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸、缩氨酸核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。

在进一步的实施方案中，所述生物活性材料选自多肽、寡糖、多糖、脂多糖、糖、细胞代谢物、药理活性物质和氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述生物活性材料选自糖、药理活性物质和氨基酸。

在一个实施方案中，所述氨基酸是赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。

在另一个实施方案中，所述生物活性材料是选自抗体或其结合片段、适体、抗生物素蛋白试剂、核酸或凝集素的亲和试剂。

在另一个实施方案中，所述生物活性材料进一步包含质量标签或质量标签的支撑结构，其中所述质量标签或支撑结构任选地直接连接到生物传感器或通过连接体，诸如本文所述的连接体进行连接L。

在进一步的实施方案中，式(II)所示的化合物选自：

在一个实施方案中，式(II)所示的化合物中的Z是聚合物骨架的单体单元，所述化合物包含至少一个式(IIa)：

其中，n是表示式(IIa)的重复单体单元数量的整数。

在另一个实施方案中，所述聚合物骨架进一步包含改善水溶性的含有负电荷和/或侧链的单体。

在进一步的实施方案中，所述改善水溶性的单体包含聚乙二醇单元和/或两性离子。

在另一个实施方案中，所述聚合物骨架进一步包含一种或多种生物传感器和/或生物活性材料，任选地直接连接或通过连接体，诸如本文所述的连接体L连接。在另一个实施方案中，所述聚合物骨架进一步包含质量标签或质量标签的支撑结构，其中所述质量标签或支撑结构任选地直接连接到生物传感器或通过连接体，诸如本文所述的连接体L进行连接。

在一个实施方案中，所述聚合物骨架如Lou等人Angew.Chem Int Ed 2007[42]，或Majonis等人Anal Chem 2010[43]所述，各自通过引用并入本文。

在进一步的实施方案中，式(IIa)的化合物选自：

其中，Q是O或NH。

在一个实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(IIa)的化合物包含选自¹²⁰Te、¹²²Te、¹²³Te、¹²⁴Te、¹²⁵Te、¹²⁶Te、¹²⁸Te和¹³⁰Te的碲同位素。

本文所述化合物可连接至固体支撑体，诸如珠、载玻片(slide)、合成膜、板、管或柱。例如，所述珠可以是琼脂糖珠或硅珠。所述固体支撑体可以包含一种或多种不同的化合物和/或差异碲质量和/或差异碲同位素以便通过碲质量分析使其与其他类型的固体支撑体区别开来。

用本领域已知的方法用商购可获得的材料或者用本领域已知的技术制备获得的材料来制备式(I)的化合物。例如，式(I)的化合物通过以下来制备：将式(III)的化合物或其保护的形式：

其中，R¹、L和X如上文所限定，与一种或多种天然存在的同位素Te⁰和碱性保险粉溶液的水悬浮液在一定条件下合并以提供式(I)的化合物。通过将合适的前体与生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架反应，由式(I)的化合物来制备式(II)的化合物，所述合适的前体包含X的互补官能团。

使用本领域已知的方法，例如使用亲核加成条件和活化的酸替代条件，使式(I)的化合物转化为式(II)的化合物。使用本领域已知的方法制备聚合物骨架和生物传感器生物活性材料、质量标签和/或质量标签支撑结构的连接物，例如美国专利号9012239中所述，其通过引用并入本文。

反应条件将取决于例如反应性官能团与生物传感器、生物活性材料、质量标签、质量标签中的支撑结构和/或聚合物骨架的特性，并且可以包含一个或多个预步骤。例如，可以对生物活性材料进行预处理以活化可与有机碲吩标签官能团反应的基团和/或可以对有机碲吩标记物进行预处理以活化可与生物活性材料反应的基团。此外，可能需要修改所述反应以包括保护基团的用途。

净化所述质量标签的生物传感器、生物活性材料和/或聚合物可以包括去除未反应的起始材料，并且可以包括过滤、柱纯化，离心和/或洗涤和回收质量标签的生物传感器、生物活性材料或聚合物中的一个或多个步骤。

在一个实施方案中，本申请还包括包括一种或多种选自式(I)的化合物和式(II)的化合物的化合物及其盐和/或溶剂合物的组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含载体。载体的实例包括但不限于溶剂、佐剂和赋形剂。在进一步的实施方案中，所述组合物还包含其它组分，例如用于所述组合物的稳定性，例如抗氧化剂和/或抗微生物制剂。在一个实施方案中，所述包含一种或多种式(II)的化合物和/或其盐和/或其溶剂合物的组合物与包括细胞在内的生物系统兼容。在一个实施方案中，“与......兼容”意指无毒或至少具有可接受水平以下的毒性。

在一个实施方案中，本申请的组合物包含多种具有不同碲同位素的式(I)和/或(II)的化合物。

在一个实施方案中，本申请的组合物包含多种式(II)的化合物，其各自具有不同的生物传感器、不同的生物活性材料(任选不同的抗体)和/或不同的聚合物。

在一个实施方案中，本申请所述的组合物包含有效量的一种或多种选自式(I)的化合物和式(II)的化合物的化合物及其盐和/或其溶剂合物。

在一个实施方案中，本申请所述的化合物或组合物包含在小瓶中。例如，所述小瓶是用于光敏化合物或组合物的遮光小瓶。在一个实施方案中，所述化合物或组合物在惰性气体条件下储存在小瓶中，特别是例如对于氧反应性化合物。

在一个实施方案中，本申请包括试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的化合物、组合物或小瓶以及用于在例如质量检测试验中重构和/或使用所述化合物或组合物的说明书或试剂。例如，所述试剂盒可以包含用式(I)的碲吩化合物标记的碱性磷酸酶底物。在一个实施方案中，所述说明书用于用式(I)的化合物对生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架进行质量标记或用质量标记的生物传感器或生物活性材料进行质量检测试验。在一个实施方案中，所述质量检测试验是质谱流式细胞技术试验。

在一个实施方案中，所述试剂盒是多重试剂盒，并且包含至少2、3、4、5、6、7或8种化合物，每种化合物包含不同的碲同位素、碲同位素的不同组合，以使所述化合物具有差异碲质量和/或不同的生物传感器、不同的生物活性化合物和/或聚合物骨架。所述试剂盒可以包含除碲同位素以外的相同的一系列化合物，或者其可以是包含不同碲表位的不同化合物。实例包括多种式(I)的化合物，每种化合物具有相同的结构并包含不同的碲同位素。或者，所述化合物可以是式(II)的化合物，任选地其中所述生物活性材料例如是亲和试剂，诸如特定抗原的特异性的抗体，其中每种化合物包含不同的碲同位素。

本文所述的化合物、组合物和试剂盒包括组分和/或可包装用于特定试验。

在一个实施方案中，所述试剂盒包含标准，诸如内标，例如，用在质谱流式细胞技术应用中的校准珠。

III方法和用途

本文所述的一个方面包括对生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架进行质量标记的方法或有机碲吩标签(例如式(I)的化合物)用于制备质量标记的生物传感器、质量标记的生物活性材料或质量标记的聚合物的用途。

在一个实施方案中，所述方法包含在合适的反应条件下使包含连接体和反应性官能团的有机碲吩标签与生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架接触；以及纯化所述质量标记的生物传感器或质量标记的生物活性材料。

在一个实施方案中，所述有机碲吩标签是式(I)的化合物。

本文描述了不同的生物传感器、生物活性材料和聚合物骨架，并且其可用于本文所述的方法和用途中。下文提供了若干式(III)的化合物的合成方案。相应地，在一个实施方案中，所述质量标记的方法生产式(II)的化合物。在一个实施方案中，所述方法采用本文所述的合成方案。

在一个实施方案中，所述方法的接触步骤包括使选自细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸、缩氨酸核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖的生物活性材料与所述碲吩标签在合适的条件下接触。

在另一个实施方案中，所述生物活性材料选自亲和试剂，所述亲和试剂选自抗体或其结合片段、适体、抗生物素蛋白试剂、核酸或凝集素。可以通过例如半胱氨酸残基的硫醇或设计成生物活性材料的硫醇来将所述生物活性材料标记至碲吩标签上。硫醇与硫醇选择性试剂(例如马来酰亚胺)的反应会产生所需的构造。或者，所述生物活性材料上的游离胺可以通过所述碲吩标签进行酰化。

本文所述的化合物可用在若干试验中，包括可使用荧光标记物的血细胞计数试验。例如，本文所述的碲吩质量标记化合物可以耦合到诸如抗体、寡核苷酸、凝集素、适体等的亲和试剂，并用于检测目标分析物，任选地在细胞内或细胞上。

特别地，所述化合物可用于细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸等的多重标记。例如，可以如所述的制备质量标记的生物活性材料，诸如质量标记的亲和试剂(诸如抗体)用于多种目标分析物。在一个实施例中，每个质量标记的亲和试剂针对不同的分析物并且包含差异碲质量或与其他非-碲质量标记的分子结合使用以增加可被分析的参数的数量。可以在正常条件下培养细胞，在一种反应混合物中用质量标记的亲和试剂的理想组合标记细胞以测定单一细胞群的多重参数。或者，可以在不同的反应混合物中用针对一种或多种目标分析物的亲和试剂标记细胞以测定一个或多个试验参数，其中每一种反应混合物是在不同试验参数下处理的细胞群。可以清洗、收集、固定、任选地用一种或多种嵌入剂(诸如基于铑的核酸嵌入剂(例如：

嵌入剂-Rh，Fluidigm))给细胞染色以区分死亡细胞与活细胞和/或区分单一核细胞与其他细胞，并通过质谱流式细胞技术进行分析，例如如本文对Telox/Telox2缺氧实例的描述。

因此，本文另一方面包括一种检测或定量目标活性或目标分析物的方法，包含以下步骤：

提供细胞或细胞群；

提供碲吩标记的生物传感器或生物活性材料，任选式(II)的化合物，其中所述生物传感器是用于目标活性的底物和/或所述生物活性材料特异性结合所述目标分析物；

将所述细胞或细胞群与所述碲吩标记的生物传感器或生物活性材料混合；

检测碲标记和/或定量所述细胞或细胞群的碲标记量。

所述目标分析物例如可以是所述细胞群的细胞中的细胞表面或细胞内实体。类似地，所述活性可以是细胞表面或细胞内的酶活性。由于所述标签可以是紧凑的(compact)，可以用所述标签标记细胞内成分以及细胞外抗原。分析所述细胞群的碲标记指示是否存在目标分析物或活性和/或分析物或活性的量。

检测和/或定量目标分析物和/或细胞群的碲标记的试验包括可监测差异碲质量或差异碲同位素的基于质量的方法，诸如质谱流式细胞技术试验。

如本文所述，用质谱流式细胞技术检测和/或定量碲标记包括蒸发细胞并通过飞行时间质谱技术分析所述细胞。

质谱流式细胞技术除了能够进行单细胞分析以外，还可以包括质谱流式细胞技术成像方法，例如如(Giesen等 2014，通过引用并入本文)中所述。在这样的方法中，在体外用质量标记的生物传感器和/或生物活性材料标记组织或细胞群，所述组织或细胞群经激光烧蚀耦合质谱流式细胞技术处理，处理碲信号以提供显示单细胞分裂的影像。可以使用不同的组织制品，包括例如福尔马林固定的和新鲜的组织。

在其他的实施方案中，所述底物可以产生包含局部沉淀的化合物的不溶性碲。所述沉淀的存在被影像化，并且可以提供细胞或组织中酶定位的指示。

所述检测和/或定量碲标记还可以使用酶联试验。在酶联试验中，用碲吩标签标记所述酶底物，任选地碱性磷酸酶底物。所述底物一旦分裂会产生诸如醌甲基化物的反应性产物。在酶存在下，所述包含产物的反应性碲可以形成并且可共价标记所述酶或其他局部生物分子。碲的存在可以测量并且可以指示酶或酶活性的存在和/或数量。

可以用每个包含差异质量的不同的碲吩标签来分析许多平行参数。

在一个实施方案中，提供了碲吩标记的生物活性材料。在一个实施方案中，所述目标分析物是多肽，所述生物传感器生物活性材料是多肽亲和试剂，任选地为抗体、适体和诸如链霉亲和素或去糖基化亲和素的抗生物素蛋白试剂。

核酸探针也可以制备为包含碲吩标签。因此在一个实施方案中，所述目标分析物是核酸，所述生物活性材料是寡核苷酸探针。

在一个实施方案中，提供了碲吩标记的生物传感器。

如本文所示，除了观察静态生物标记物之外，可以方便地使用诸如本文所述的碲吩标记的生物传感器来探测细胞酶促和/或代谢活性。在一个实施方案中，所述碲标记指示目标活性的存在或量。

例如，描述了包含所述缺氧敏感性生物传感器2-硝基咪唑的化合物。本文所示的这些化合物可用于检测或标记缺氧细胞。将Telox和Telox2以及其它含有2-硝基咪唑的化合物进行酶处理，并在低氧条件下形成反应性中间体。所述反应性中间体形成加合物，进而标记所述细胞。测定碲同位素的细胞识别暴露于低氧条件下的细胞。

因此，在一个实施方案中，所述活性是氧化还原酶活性。在一个实施方案中，所述方法用于检测和/或标记缺氧细胞，所述方法包括：将细胞群与式(II)化合物(其中Z是包含2-硝基咪唑的生物传感器)一起培养，检测和/或定量所述细胞群中的碲标记量，其中碲标记指示氧缺乏。

所述细胞群可以例如在组织样品中，或者可以经受不同的测试条件以评估其是否诱导缺氧。在一个实施方案中，通过质谱流式细胞技术测量所述碲标记。

在一个实施方案中，所述方法还包括定量所述群中缺氧细胞的数量。

在一个实施方案中，所述方法包含图4或本文中所述的一个或多个步骤。在一个实施方案中，所述定量包含与对照组进行比较。

其他酶活性也可以使用有机碲吩质量标记的化合物来测量。当蛋白酶具有活性时，所述蛋白酶包含可用于底物的活性位点。例如，描述了组织蛋白酶S底物，其可用于测量组织蛋白酶S的活性，所述组织蛋白酶S底物为：

在活性组织蛋白存在下，所述底物的分裂导致产生定位于膜的含肽的碲(碲同位素1)。可以将第二同位素(或其他金属标签，任选地镧系元素)结合到所述分子的DTPA部分，并且在蛋白酶分裂后作为可溶性实体释放。碲同位素1与其他同位素(或其他金属标签)之比可用于量化所述组织蛋白酶活性的水平。

因此，在一个实施方案中，所述活性是蛋白酶活性。在另一个实施方案中，所述活性是组织蛋白酶S的活性。

在另一个实施方案中，所述活性是糖基水解酶活性。本文描述了一种β-半乳糖苷酶碲吩标记的底物(化合物24)。当通过β-半乳糖苷酶分裂时，产生醌甲基化物。标记包含活性β-半乳糖苷酶的细胞，并可以通过例如质谱流式细胞技术对其进行检测。

β-半乳糖苷酶或LacZ用在许多应用中。单独的或与其他金属标签组合的不同的碲吩同位素可以例如用于评估一系列克隆的β-半乳糖苷酶活性。

在另一个实施方案中，所述活性是磷酸酶活性、激酶活性或脂肪酶活性。在一个实施方案中，所述磷酸酶活性是碱性磷酸酶。

在一个实施方案中，所述生物传感器选自2-硝基咪唑、氧化还原底物、蛋白酶底物、磷酸酶底物、激酶底物、糖基水解酶底物或脂肪酶底物。

氨基酸如赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸也可以进行质量标记。此外，核苷酸、糖也可以进行质量标记。这样的有机碲吩标记的试剂可用于代谢标记。在一个实施方案中，所述方法包括在其中天然分子砌块以质量标记的类似物替代的培养基中培养细胞群，所述培养在一定条件下进行，且对于目标分析物生物分子的合成时间充足，例如允许质量标记的类似物并入生物分子目标分析物，通过例如质谱流式细胞技术检测和/或测量所述细胞群和/或目标分析物的碲标记。

在一些实施方案中，检测和/或定量多个目标分析物和/或目标活性，并且所述方法包括提供多个碲吩标记的生物传感器和/或生物活性材料，任选地多个式(II)的化合物，其中每种化合物包含不同的生物传感器或不同的生物活性材料，任选地为亲和试剂，以及不同的碲同位素，从而允许复用。

上述公开内容大体上描述了本申请。通过参考以下具体的实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅为了说明的目的，并不意在限制本申请的范围。形式上的变化和等价物的替代考虑作为可能暗示或呈现便利的情形。虽然在本文中已经采用了特定术语，但是这些术语意在描述性意义而不是为了限制的目的。

以下非限制性实施例是对本公开的说明：

实施例

缩写词和定义

CDCl₃＝氘代氯仿；DART MS＝实时直接分析质谱；DCC＝N,N’-二环己基碳二亚胺；DCU＝二环脲；DCM＝二氯甲烷；DME＝二甲基乙烷；DMSO＝二甲基亚砜；ESI＝电喷射离子化；EtOAc＝乙酸乙酯；FBS＝胎牛血清；HPLC＝高效液相色谱；LC-MS＝液相色谱质谱分析；MC＝质谱流式细胞技术；NHS＝N-羟基丁二酰亚胺；NMR＝核磁共振；O.N＝过夜；PBS：磷酸盐缓冲液；p-NP＝对硝基苯酚；ppm＝百万分之一；RPMI＝洛斯维公园纪念研究所(Rosewell ParkMemorial Institute)；THF＝四氢呋喃；TLC＝薄层色谱；WST-1＝水溶性四唑盐1

方法

仪器：

使用Heidolph旋转蒸发器进行旋转蒸发。所有NMR光谱在25℃下在以下一种光谱仪上记录：Agilent DD2 600MHz(含OneNMR H/F{X}探针)、Agilent DD2 500MHz(含Xsens低温探针)或Varian 400MHz(含AutoX探针)。以百万分率报告一维质子和碳化学位移，并参考NMR溶剂的残留质子信号(CD3OD；δ3.31ppm，CDCl3；7.26ppm)。所有耦合常数以赫兹(Hz)报告，质子多样性被描述为s＝单峰、d＝双峰、dd＝双二重峰、t＝三重峰、q＝四重峰、p＝五重峰或m＝多峰。NMR数据按以下顺序/格式报告；化学位移(多重性、积分、耦合常数、赋值)。使用带有实时直接分析(DART)电离源的JEOL AccuTOF质谱仪记录高分辨率质谱。使用PerkinElmer ELAN-9000光谱仪获得ICP-MS数据。使用第二代CyTOF(DVS Sciences/Fluidigm)获得质谱流式细胞技术数据。使用Agilent紫外-可见光光谱仪(型号#8453)记录UV-Vis光谱数据。

通过以下之一获得高分辨率质谱：配备有DART离子源的JEOL AccuTOF型号JMS-T1000LC质谱仪或配备有Agilent 1200HPLC和ESI离子源的Agilent 6538 Q-TOF质谱仪。

试剂和一般条件

在大约40℃下在真空条件下除去溶剂。所有反应在使用N₂作为惰性气体下进行。使用所提供的干燥THF(Acros Organics)、甲醇(Acros Organics)、吡啶(AcrosOrganics)、乙二胺(Alfa Aesar)和所有其他试剂(Sigma-Aldrich)。

实施例1：N-(2-氨基乙基)-2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰胺的合成

经烘干的50mL圆底烧瓶装有2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸甲酯^[40](500mg，2.7mmol)的甲醇(4.72mL)溶液和磁力搅拌棒。在1分钟内将乙二胺(0.722mL，10.8mmol)逐滴加到该溶液中，将所述混合物在室温下搅拌18小时。然后通过旋转蒸发除去溶剂，将所得固体在真空下干燥2天，得到3(575mg，

)，一种无定形淡黄色固体。¹H NMR(500MHz，MeOD)：δ7.45(d，1H，J＝1.2Hz，Ar)，7.17(d，1H，J＝1.2Hz，Ar)，5.17(s，2H，Ar-CH₂ -CO-)，3.31(t，2H，J＝6.2Hz，-CH₂-CH₂ -NHCO-残余MeOD重叠)，2.75(t，2H，J＝6.2Hz，H₂N-CH₂ -CH₂-)；¹³C NMR(125MHz，MeOD)：δ167.00、128.00、126.97、51.48、41.74、40.47。C₇H₁₂N₅O₃(MH⁺)的HRMS m/z计算值为214.0940，实测值为214.0937。

实施例2：化合物1-5的合成

方案1.化合物1-5的合成。以下所述反应的产率如下：1＝66％,2＝74％,3＝85％,4＝91％和5＝50％。

3-甲基碲基-1-乙醇(1)：用研钵和研杵将金属碲(颗粒状，-5-+50目，500mg，3.9mmol)研磨成细粉末并混悬在THF(50mL)中。在室温向所述混悬液中逐滴加入甲基锂(2.5mL，4.0mmol)，直到所述溶液变为均匀的黄色溶液。将所得混合物在液氮浴中冷却至-196℃。在冻结时，一次性加入2-氯乙醇(0.261mL，3.9mmol)，将反应物回温至室温。将所述反应混合物在室温下搅拌2.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，向所述混合物中加入饱和NH₄Cl(100mL)。将所述溶液萃取到乙醚(2×100mL)中。用盐水(1×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(戊烷中10％的EtOAc)纯化所述粗产物，真空下干燥，得到粘稠的黄色油。产率：66％，488mg。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):3.78(s,-CH₂OH,2H),2.80(t,J＝6.8Hz,-CH₂CH₂OH,2H),1.88(s,-TeCH₃,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):62.59(-CH₂OH),8.40(-CH₂-Te),-22.41(-Te-CH₃).[M+NH₄]⁺＝207.99829。

3-甲基碲基-1-丙醇(2)：用研钵和研杵将金属碲(颗粒状，-5-+50目，500mg，3.9mmol)研磨成细粉末并混悬在THF(50mL)中。在室温向所述混悬液中逐滴加入甲基锂(2.5mL，4.0mmol)，直到所述溶液变成黄色。将所得混合物在液氮浴中冷却至-196℃。在冻结时，一次性加入1-氯-3-丙醇(0.326mL，3.9mmol)，将反应物回温至室温。将所述反应混合物在室温下搅拌2.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，向所述混合物中加入饱和NH₄Cl(100mL)。将所述溶液萃取到乙醚(2×100mL)中。用盐水(1×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到粘稠的深橙色油状产物。产率：74％，581mg。产品特征与文献Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2014,53,11473-11477中的描述相同。

3-甲基碲基丙酸甲酯(3)：用研钵和研杵将金属碲(颗粒状，-5-+50目，500mg，3.9mmol)研磨成细粉末并混悬在THF(50mL)中。在室温向所述混悬液中逐滴加入甲基锂(2.5mL，4.0mmol)，直到所述溶液变成黄色。向所述溶液中加水(0.18mL)，诱使变色成深棕色混合物。将所得混合物在液氮浴中冷却至-196℃。在冻结时，一次性加入丙烯酸甲酯(0.355mL，3.9mmol)，将反应物回温至室温。将所述反应混合物在室温下搅拌0.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，向所述混合物中加入饱和NH₄Cl(100mL)。将所述溶液萃取到乙醚(2×100mL)中。用盐水(1×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到粘稠的深黄色油。产率：85％，775mg。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):3.68(s,-COOCH₃,3H),2.86(m,-CH₂COOCH₃,2H),2.76(m,-CH₂CH₂Te-,2H),1.92(s,-Te-CH₃,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):173.87(C＝O),52.11(-COOCH₃),37.17(-CH₂COOCH₃),-4.72(-TeCH₂CH₂-),-21.35(-Te-CH₃).[M+H]⁺＝232.98149。

4-甲基碲基-丁酸甲酯(4)：用研钵和研杵将金属碲(颗粒状，-5-+50目，500mg，3.9mmol)研磨成细粉末并混悬在THF(50mL)中。在室温向所述混悬液中逐滴加入甲基锂(2.5mL，4.0mmol)，直到所述溶液变成黄色。将所得混合物在液氮浴中冷却至-196℃。在冻结时，一次性加入4-氯丁酸甲酯(0.478mL，3.9mmol)，将反应物回温至室温。将所述反应混合物在室温下搅拌2.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，向所述混合物中加入饱和NH₄Cl(100mL)。将所述溶液萃取到乙醚(2×100mL)中。用盐水(1×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到粘稠的深黄色油。产率：91％，877mg。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):3.64(s,-COOCH₃,3H),2.60(t,J＝7.6Hz,-TeCH₂-2H),2.39(t,J＝7.4Hz,-CH₂COOCH₃,2H),2.01(m,-CH₂CH₂CH₂-,2H),1.86(s,-TeCH₃,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):173.09(C＝O),51.36(-COOCH₃),35.71(-CH₂C＝O-),26.76(-CH₂CH₂C＝O-),1.92(-TeCH₂CH₂-),-22.52(-TeCH₃).[M+H]⁺＝246.99690。

4-((三氟甲基)碲基)丁酸甲酯(5)：用研钵和研杵将金属碲(颗粒状，-5-+50目，500mg，3.9mmol)研磨成细粉末并混悬在7mL的DME中。用40％乙二醇60％乙醇和干冰冷却浴将所述溶液冷却至-60℃。在冷却时，向所述反应混合物中加入三甲基(三氟甲基)硅烷(0.356mL，2.61mmol)和四甲基氟化铵(243mg，2.61mmol)。-60℃下剧烈搅拌所述反应物1小时，并在室温下搅拌3小时。一旦反应完成，就将黄色上清液倒出，用DME洗涤残留的固体残余物。将所述上清液与所述洗涤液合并并浓缩。向浓缩的粗混合物中加入3mL DME和4-溴丁酸甲酯(0.230mL，1.82mmol)。室温下搅拌所述反应混合物过夜。一旦反应完成，就通过旋转蒸发除去DME，并用EtOAc提取剩余的粗混合物。用水(3x)，盐水(1x)洗涤有机层，用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(硅胶上的甲苯)纯化所述粗产物混合物。产率：50％，270mg。¹HNMR(500MHz,CDCl₃,δ):3.68(s,-COOCH₃,3H),3.13(t,J＝7.7Hz,-TeCH₂-,2H),2.47(t,J＝7.7Hz,-CH₂COOCH₃,-2H),2.26(p,J＝7.1Hz,-CH₂CH₂CH₂-,2H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):172.82(C＝O),103.79-95.40(q,J＝351.5Hz,-Te-CF₃),51.763(-COOCH₃),35.41(-CH₂CH₂CH₂Te-),27.08(-CH₂CH₂CH₂-),8.20(-TeCH₂-).[M+NH₄]⁺＝317.99529。

实施例3：化合物6和7的合成

方案2.化合物6&7的合成。所述反应物的产率：6＝70％&7＝66％。

1-(溴乙炔基)三异丙基硅烷：将N-溴代丁二酰亚胺(5.15g，29mmol)，硝酸银(4.28g，25.2mmol)和TIPS-乙炔(5.6mL，25.2mmol)加入到200mL丙酮中。在室温下剧烈搅拌所述溶液混合物3小时。一旦反应完成，向所述混合物中加入150mL水。将所述溶液萃取到己烷(3×125mL)中。用盐水(2x)洗涤所述合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到澄清的油产物。产量：6.51g，98％。参考：Org.Lett.2011,13,537-539。

庚-4,6-二炔酸中间体：根据文献(J.P.Marino，H.N.Nguyen，J.Org.Chem.,2002,67,6841-6844)完成Cadiot-Chodkiewics耦合。在室温下将CuCl(15mg，0.15mmol)加入到30％BuNH₂的水溶液(25mL)中，形成透明的蓝色溶液。向所述溶液混合物中加入一些盐酸羟胺晶体以去除颜色。立即向所述混合物中加入4-戊炔酸(901mg，9.2mmol)，得到黄色混悬液。用冰水浴冷却所述溶液。在冷却时，逐滴加入2-溴-1-三异丙基甲硅烷基乙炔(2g，7.6mmol)。当发生蓝-绿颜色变化时，另外再加入盐酸羟胺晶体以维持黄色溶液。剧烈搅拌所述反应物0.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，用EtOAc(2×100mL)萃取所述溶液。用1MHCl(1×100mL)，盐水(1×100mL)洗涤所述合并的有机层，用MgSO ₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到深棕色结晶粗产物(1.6g，76％)。将粗产物6-(三异丙基甲硅烷基)庚-4,6-二炔酸(388mg，1.39mmol)溶于THF(15mL)中。用冰水浴冷却所述溶液混合物。冷却时，逐滴加入四丁基氟化铵(1.39mL，在THF中1M)，直到所述溶液达到室温。剧烈搅拌所述反应物3小时。一旦反应完成，用EtOAc(3×100mL)萃取所述溶液。用1M柠檬酸(3×100mL)，盐水(3×100mL)洗涤所述合并的有机层，用MgSO ₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到棕色油状粗产物。将所述化合物直接用于下一步2-(碲吩-2-基)丙酸的合成。

2-(碲吩-2-基)丙酸(6)：用研钵和研杵将所述碲金属(颗粒状，-5-+50目，3.0g，12.68mmol)研磨成细粉末。将所述碲粉末加入到1M NaOH(30mL)的水溶液中。向所述反应混合物中加入甲醛合次硫酸氢钠(6.0g，21.18mmol)并剧烈搅拌。用油浴加热所述反应溶液0.5小时至95℃，所述溶液变成深紫色。将所述反应溶液冷却至60℃并再搅拌5分钟。向所述反应混合物中加入在5mL乙醇中的庚-4,6-二炔酸(388mg，3.17mmol)。60℃下搅拌所述溶液混合物1.5小时。然后通过去除隔膜与大气接触使所述反应物暴露于氧气。使所述反应物冷却至室温并搅拌15分钟。在冷却时，用饱和NH₄Cl溶液(100mL)稀释所述反应物。用EtOAc(2×100mL)萃取所述溶液。用1M HCl(2×100mL)，盐水(2×100mL)洗涤所述结合的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到深黄色固体粗产物。通过快速色谱法(硅胶上5％-50％EtOAc/己烷)纯化所述粗产物，得到浅黄色固体(563mg，70％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):8.71(dd,J＝6.9,1.2Hz,-HCTe-,1H),7.59(m,-HCHCTe-,1H),7.38(m,-TeCCH-,1H),3.22(t,J＝7.3,碲吩-CH₂-,2H),2.73(t,J＝7.3,-CH₂CH₂COOH,2H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):178.94(C＝O),148.69(-TeCCH-),137.42(-HCHCTe-),136.15(-TeCCH-),125.29(-HCTe-),37.95(碲吩-CH₂-),32.01(-CH₂CH₂COOH).[M+H]⁺＝254.96665。

己-3,5-二炔醇中间体：Cadiot-Chodkiewics耦合。在室温下将CuCl(7.5mg，0.08mmol)加入到30％BuNH₂的水溶液(25mL)中，形成透明的蓝色溶液。向所述溶液混合物中加入一些盐酸羟胺晶体以去除颜色。向所述混合物中加入3-丁炔-1-醇(1g，3.83mmol)，得到黄色混悬液。用冰水浴冷却所述溶液。在冷却时，逐滴加入2-溴-1-三异丙基甲硅烷基乙炔(832mg，3.19mmol)。另外再加入盐酸羟胺晶体以阻止所述溶液发生蓝-绿颜色变化。剧烈搅拌所述反应物0.5小时。一旦通过TLC确定反应完成，用EtOAc(2×100mL)萃取所述溶液。用1M HCl(1×100mL)，盐水(1×100mL)洗涤所述合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到无水深棕色油。

将所述产物直接脱保护形成2-(碲吩-2基)乙醇。将所述产物6-(三异丙基甲硅烷基)己-3,5-二炔-1-醇(873mg，1.44mmol)溶于THF(15mL)中。用冰水浴(1:1)冷却所述溶液混合物。在冷却时，逐滴加入四丁基氟化铵(1.44mL，在THF中1M)，直到所述溶液达到室温。剧烈搅拌所述反应物3小时。一旦通过TLC确定反应完成，用EtOAc(3×100mL)萃取所述溶液。用1M柠檬酸(3×100mL)，盐水(3×100mL)洗涤所述合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到棕色油。将所述粗产物立即用于下一步2-(碲吩-2-基)乙醇的合，因为具有游离二炔，所述化合物具有有限的稳定性。

2-(碲吩-2-基)乙醇(7)：用研钵和研杵将所述碲金属(颗粒状，-5-+50目，3.2g，41.96mmol)研磨成细粉末。将所述碲粉末加入到1M NaOH的水溶液(30mL)中。向所述反应混合物中加入甲醛合次硫酸氢钠(6.4g，42.47mmol)并剧烈搅拌。用油浴加热所述反应溶液0.5小时至95℃，所述溶液变成深紫色。将所述反应溶液冷却至60℃并再搅拌5分钟。向所述反应混合物中加入在5mL乙醇中的己-3,5-二炔-1-醇(600mg，6.37mmol)。60℃下搅拌所述溶液混合物1.5小时。此时通过去除隔膜让反应物与大气接触来使所述反应物暴露于氧气。使所述反应物冷却至室温并搅拌15分钟。在冷却时，用饱和NH₄Cl溶液(100mL)稀释所述反应物。用EtOAc(2×100mL)萃取所述溶液。用1M HCl(2×100mL)，盐水(2×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到深黄色油状粗产物。通过快速色谱法(硅胶固定相上10％-30％EtOAc/己烷)纯化所述粗产物，得到浅黄色油(949mg，66％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.71(dd,J＝6.9,1.2Hz,-HCTe-,1H),7.65(m,-HCHCTe-,1H),7.44(m,-TeCCH-,1H),3.82(t,J＝6.0Hz,碲吩-CH₂-,2H),3.13(t,J＝6.4Hz,-CH₂CH₂OH,2H),2.68(s,-OH,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):145.37(-TeCCH-),136.34(-HCHCTe-),135.48(-TeCCH-),124.89(-HCTe-),63.64(-CH₂CH₂OH),38.85(-碲吩-CH₂-).[M+H]⁺＝254.96665。

实施例4：化合物2与苄胺的氨甲酰化

方案3.化合物2与苄胺的氨甲酰化。两步骤后的产率为77％。

实施例5：化合物4-6与苄胺的酰胺化

方案4.化合物4-6与苄胺的酰胺化。所述反应的产率：9＝81％，10＝30％，&11＝81％。

N-芐基-4-(甲基碲基)丁酰胺(9)：将化合物4(400mg，1.64mmol)溶于THF(25mL)中并剧烈搅拌。向混合物中加入1M NaOH(25mL)，形成两相混合物。搅拌所述溶液1小时。然后用H₂O(50mL)稀释所述反应物，并加入1M柠檬酸直至所述反应混合物经pH试纸检测为酸性。将所得混合物萃取到乙醚(3×100mL)中，用盐水(2×100mL)洗涤。通过旋转蒸发从合并的有机层中除去溶剂。将该化合物再溶解于DCM(5mL)中，并加入到加有DCC(355mg，1.72mmol)的新圆底烧瓶中，并搅拌5分钟。一旦所述混合物变成乳状溶液，将NHS(198.2mg，1.72mmol)加入到所述混合物中并再搅拌5分钟。室温下向所得溶液中加入芐胺(215μL，1.97mmol)和TEA(275μL，1.97mmol)在DCM(5mL)中的混合物。所述反应物搅拌过夜。一旦通过TLC确定反应完成，移除搅拌棒并通过旋转蒸发除去所述溶剂。将所得产物再溶解于冷的EtOAc(100mL)中，在溶液中形成白色沉淀。通过过滤除去所述沉淀物(推测为DCU)。重复所述过程3次以除去DCU。用0.5M柠檬酸(2×100mL)，NaHCO₃(2×100mL)和盐水(1×100mL)洗涤所述滤液。合并有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到淡黄色固体产物(440mg，81％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):7.33(m,芳基-,5H),5.92(s,-NH-1H),4.40(d,J＝5.8Hz,芳基-CH₂NH-2H),2.62(t,J＝7.4Hz,-TeCH₂-,2H),2.29(t,J＝7.3Hz,-COCH₂CH₂CH₂Te-,2H),2.06(m,-COCH₂CH₂CH₂Te-,2H),1.86(s,-TeCH₃,3H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):172.25(C＝O),(138.63,129.08,128.17&127.89,芳基),43.99(aryl-CH₂-NH-),38.66(-CH₂CH₂CH₂Te-),27.78(-CH₂CH₂CH₂Te-),2.90(-CH₂TeCH₃),-21.95(-TeCH₃).[M+H]⁺＝322.04378。

N-芐基-4-(三氟甲基碲基)丁酰胺(10)：将化合物5(400mg，1.4mmol)溶于25mL的THF中并剧烈搅拌。向混合物中加入25mL 1M NaOH，形成两相混合物。搅拌所述溶液1小时。完成时，稀释所述反应物，并加入1M柠檬酸直至所述反应混合物为酸性。将所得混合物萃取到乙酸乙酯(3×100mL)中，用盐水(2×100mL)洗涤。合并所述合并的有机层并通过旋转蒸发除去溶剂。将该化合物再溶解于DCM(5mL)中，并加入加有DCC(303mg，1.47mmol)的新圆底烧瓶中，并搅拌5分钟。一旦所述混合物变成乳状溶液，将NHS(169mg，1.47mmol)加入到所述混合物中并再搅拌5分钟。室温下向所得溶液中加入芐胺(180μL，1.68mmol)和TEA(235μL，1.68mmol)在5mL DCM中的混合物。将反应物搅拌过夜。完成时，移除搅拌棒并通过旋转蒸发除去溶剂。将所得产物再溶解于冷的EtOAc(100mL)中，形成白色沉淀。通过过滤除去所述沉淀物(推测为DCU)。用0.5M柠檬酸(2×100mL)，NaHCO 3(2×100mL)和盐水(1×100mL)洗涤所述滤液。合并有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到黄色固体产物(157mg，30％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):7.33(m,芳基,5H),5.79(s,-NH-,1H),4.41(d,J＝5.7Hz,芳基-CH₂NH-,2H),3.14(t,J＝6.9Hz,-CH₂Te-,2H),2.34(m,-CH₂CH₂CH₂Te-,2H),2.28(p,J＝6.8,-CH₂CH₂CH₂Te-,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):171.87(C＝O),(138.40,129.19,128.26&128.07,芳基),(104.84-96.44,-CF₃),44.15(芳基-CH₂-NH-),37.94(-CH₂CH₂CH₂Te-),27.75(-CH₂CH₂CH₂Te-),9.05(-CH₂CH₂CH₂Te-).[M+H]⁺＝376.0175。

N-芐基-3-(碲吩-2-基)丙酰胺(11)：将化合物6(400mg，0.4mmol)溶于DCM(5mL)中，加入DCC(86mg，0.42mmol)并搅拌5分钟。一旦所述混合物变成乳状溶液，加入NHS(48mg，0.42mmol)并再搅拌5分钟。室温下向所得溶液中加入芐胺(52μL，0.48mmol)和TEA(67μL，0.48mmol)在5mL DCM中的混合物。将所述反应物搅拌过夜。完成时，移除搅拌棒并通过旋转蒸发除去所述溶剂。将所得产物再溶解于冷的EtOAc(150mL)中，溶液中析出白色沉淀。通过过滤除去所述沉淀物(推测为DCU)。用0.5M柠檬酸(2×150mL)，NaHCO ₃(2×150mL)和盐水(1×150mL)洗涤所述滤液。合并有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到黄色固体。通过快速色谱法(5％-25％EtOAc/己烷)纯化所述产物得到黄色固体(440mg，81％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃,δ):8.71(dd,J＝6.9,1.3Hz,-HCTe-,1H),7.57(m,-HCHCTe-,1H),7.31(m,-TeCCH-&芳基,7H),5.76(s,-NH-,1H),4.41(d,J＝5.7Hz,芳基-CH₂NH-,2H),3.25(t,J＝7.6Hz,碲吩-CH₂CH₂-,2H),2.53(t,J＝7.6Hz,碲吩-CH₂CH₂-,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃,δ):171.31(C＝O),148.96(-TeCCH-),137.85(-HCHCTe-),136.73(-TeCCH-),(135.54,128.84,128.56,127.7,127.39&124.87,芳基),43.58(芳基-CH₂NH-),39.88(碲吩-CH₂CH₂-),32.33(碲吩-CH₂CH₂-).[M+H]⁺＝344.02941。

实施例6：2-(碲吩-2基)甲醇(12)

方案5.

2-(碲吩-2基)甲醇(12)：用研钵和研杵将所述碲金属(颗粒状，-5-+50目，640g，5mmol)研磨成细粉末。将所述碲粉末加入到1M NaOH(30mL)的水溶液中。向所述反应混合物中加入甲醛合次硫酸氢钠(1.18g，10mmol)并剧烈搅拌。用油浴加热所述反应溶液0.5小时至95℃，所述溶液变成深紫色。将所述反应溶液冷却至60℃并再搅拌5分钟。向所述反应混合物中加入在5mL乙醇中的戊-2,4-二炔-1-醇(c)(100mg，1.25mmol)。化合物c的制备与化合物6类似。60℃下搅拌所述溶液混合物1.5小时。然后通过去除隔膜与大气接触使所述反应物暴露于氧气。使所述反应物冷却至室温并搅拌15分钟。冷却时，用饱和NH₄Cl溶液(100mL)稀释所述反应物。用EtOAc(2×100mL)萃取所述溶液。用1M HCl(2×100mL)，盐水(2×100mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩并真空干燥，得到深橙棕色油状粗产物。通过快速色谱法(硅胶上5％-50％EtOAc/己烷)纯化所述粗产物，得到浅黄色固体(200mg，76％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):8.83(dd,J＝6.9,1.2Hz,-HCTe-,1H),7.68(m,-HCHCTe-,1H),7.49(m,-TeCCH-,1H),4.83(d,J＝1.2Hz,碲吩-CH₂-,2H)。

实施例7：2-(氯甲基)碲吩(13)

方案6.

2-(氯甲基)碲吩(13)：向乙腈(15mL)溶液中加入2-(碲吩-2-基)甲醇(100mg，0.47mmol)和三苯基膦(156mg，0.59mmol)。向所述溶液中逐滴加入四氯化碳(300μL，0.47mmol)。在80℃下回流反应物30分钟。使所述反应物冷却至室温并搅拌5分钟。冷却时，将反应物浓缩并真空干燥，得到橙色油状粗产物(55mg，41％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):7.61(m,-HCTe-,1H),7.48(m,-HCHCTe-,1H),7.41(m,-TeCCH-,1H),4.74(d,J＝1.1Hz,碲吩-CH₂-,2H)。

实施例8:2,5-二氧吡咯烷-1-基3-(碲吩-2-基)丙酸酯(14)

方案7.

2,5-二氧吡咯烷-1-基3-(碲吩-2-基)丙酸酯(14)：将3-(碲吩-2-基)丙酸(150mg，0.59mmol)溶解于EtOAc(5mL)和吡啶(2.5mL)的溶液混合物中。向所述混合物中加入T3P(379mg，1.18mmol)，用冰浴使所述反应冷物却至0℃并搅拌5分钟。冷却时，向所述反应物中加入NHS(75mg，0.65mmol)使所述反应物达到室温。室温下搅拌所述反应物过夜。通过TLC确定反应完成时，用水(50mL)稀释反应物。将所得反应混合物萃取到EtOAc(50mL×3)中。浓缩合并的有机层并在真空下干燥得到所述产物(155mg，76％)。％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δ):8.73(dd,J＝6.9,1.2Hz,-HCTe-,1H),7.59(m,-HCHCTe-,1H),7.41(m,-TeCCH-,1H),3.33(t,J＝7.3,碲吩-CH₂-,2H),2.97(t,J＝7.3,-CH₂CH₂COOH,2H),2.84(s,琥珀酰亚胺,4H)。

实施例9：(S)-2-((叔丁基氧基羰基)氨基)-7-(三异丙基甲硅烷基)庚-4,6-二炔酸(15)：

方案8.

(S)-2-((叔丁基氧基羰基)氨基)-7-(三异丙基甲硅烷基)庚-4,6-二炔酸(15)：向闪烁计数瓶中加入CuCl(19mg，0.1914mmol)，正丁胺水溶液(5.5mL，30％正丁胺：水(v/v))和磁力搅拌棒。将几粒盐酸羟胺加入到剧烈搅拌的蓝色溶液中直至溶液变澄清。接下来，快速加入boc-L-炔丙基甘氨酸(游离酸，428.5mg，2.01mmol)，用氩气交换所述瓶中的空气，并在冰浴中冷却所述瓶。经5分钟，向所得黄色溶液中逐滴加入(溴乙炔基)三异丙基硅烷1(500mg，1.914mmol)。加完后，除去冰浴，在室温下搅拌所述反应至少4小时。如果反应物变蓝，则再加入盐酸羟胺颗粒；这使所述溶液恢复为黄色/红棕色。一旦反应完成，将所述产物萃取到乙醚中(用1.0M HCl洗涤3次)，用无水MgSO₄干燥，浓缩，得到标题所述化合物，为粘性清澈油(750mg，

)。

实施例10：(S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(碲吩-2-基)丙酸(16)：

方案9

(S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(碲吩-2-基)丙酸(16)：

部分A：向25mL烘干圆底烧瓶中加入(S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-7-(三异丙基甲硅烷基)庚-4,6-二炔酸(750mg，1.9mmol)、干燥的四氢呋喃15(7.7mL)以及干燥的磁力搅拌棒。然后在冰浴中冷却烧瓶，用氩气交换所述空气。然后立即加入四丁基氟化铵(7.7mL无水四氢呋喃中1.0M溶液，7.6mmol)。在冰上搅拌所述反应物15分钟，然后立即将全部混合物注入部分B制备的溶液中。

部分B：向250mL二颈圆底烧瓶中加入羟基甲烷亚磺酸一钠二水合物(3.26g，21.12mmol)、新鲜粉碎的碲金属(-5-+50目的小球，270mg，2.11mmol)、脱气氢氧化钠水溶液(2.0M，20mL)、无水乙醇(20mL)和磁力搅拌棒。一边搅拌一边将氩气通入所述溶液起泡20分钟。然后为反应容器的一个颈部装配回流冷凝器，另一个装配橡胶隔膜。然后将所述容器放置在75℃的硅油浴中，并保持恒定的氩气流流过烧瓶。当形成深紫色溶液时，将油浴的温度降至40℃。当烧瓶的内容物与油浴的新温度平衡时，立即通过橡胶隔膜注入部分A中制备的溶液。搅拌所述反应物至少4小时，然后从油浴中取出烧瓶，将内容物暴露于空气中直至未反应的碲金属沉淀，将所述有机组分萃取到乙酸乙酯(用1.0M HCl洗涤5-10次)中，用无水MgSO₄干燥，并浓缩，得到标题化合物，为不纯的黄色油状物。通过快速色谱法(硅胶固定相，1％三乙胺，3％甲醇，96％氯仿流动相，用2％三乙胺、8％甲醇、90％氯仿流动相并用KMnO ₄染色的二氧化硅涂层薄层色谱板上，产物的R_f～0.55-0.6)进一步纯化产物，得到标题化合物的三乙基铵盐，为粘稠清澈油(474mg，从(溴乙炔基)三异丙基硅烷起始物料计算为53％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.60(dd,1H,J＝7.0,1.2Hz),7.54(dd,1H,J＝7.0,3.9Hz),7.35(m,1H),5.65(br s,1H),4.26(br s,1H),3.48(br s,2H),1.41(s,9H)ppm。

实施例11：(S)-2-氨基-3-(碲吩-2-基)丙酸三乙基铵盐(17)：

方案10.

(S)-2-氨基-3-(碲吩-2-基)丙酸三乙基铵盐(17)：向处于冰浴中的烘干闪烁计数瓶中加入(S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(碲吩-2-基)丙酸(16)的三乙基铵盐(234mg，0.5mmol)、二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)和干燥的磁力搅拌棒。在冰浴中搅拌所述反应物40分钟，然后用三乙胺中和所述反应物(用石蕊试纸监测)。然后浓缩所述反应物，并在少量的2％甲醇/水中重构。将所述产物在C18反相塞(2％甲醇/水至1：1甲醇/水流动相)上纯化，得到标题化合物(100mg，54％)为清澈油，冷冻干燥固化(白色固体)。¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄):δ8.92(dd,1H,J＝7.0,1.3Hz),7.63(dd,1H,J＝7.0,3.9Hz),7.52(dd,1H,J＝3.9,1.3Hz),4.21(app t,1H,J＝5.0Hz),3.49(m,2H)ppm。

实施例12：(3S，4R，5S，6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基三乙酸酯(18)：

方案11

(3S，4R，5S，6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基三乙酸酯(18)：向闪烁计数瓶中加入盐酸甘露糖胺(42.5mg，0.197mmol)、碳酸氢钠水溶液(3mL，100mM)、四氢呋喃(2mL)、2,5-二氧吡咯烷-1-基3-(碲吩-2-基)丙酸酯(12)(86mg，0.247mmol)和磁力搅拌棒。在室温下搅拌所述混合物18小时，然后通过旋转蒸发浓缩所述反应物，并在高真空下进一步干燥。接下来，将该干燥的反应粗产物在无水吡啶(4mL)中重构，并在冰浴中冷却。然后加入乙酸酐(3mL)，将混合物温热至室温(搅拌)18小时。通过旋转蒸发除去挥发性化合物(加入甲苯以利于吡啶的蒸发)。通过快速色谱法(硅胶固定相，3：1至1：1的戊烷：乙酸乙酯，用1：1的戊烷：乙酸乙酯流动相并用茚三酮染色的二氧化硅涂层的薄层色谱板，产物R_f～0.55，)纯化所述产物，得到澄清油(61mg，53％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.71(dd,1H,J＝6.9,1.3Hz),7.58(dd,1H,J＝6.9,3.8Hz),7.39(m,1H),5.96(d,1H,J＝1.9Hz),5.84(br m,1H),5.31(dd,1H,J＝10.2,4.6Hz),5.10(t,1H,J＝10.2Hz),4.64(ddd,1H,J＝9.1,4.6,1.9Hz),4.24(m,1H),4.03(m,2H),3.24(dt,2H,J＝6.9,1.2Hz),2.60(m,2H),2.17(s,3H),2.08(s,3H),2.05(s,3H),1.96(s,3H)ppm。

实施例13：(4S，5R，6R)-5-乙酰氨基-6-((1R，2R)-1,2-二羟基-3-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺基)丙基)2,4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸钠盐(19)：

方案12.

(4S，5R，6R)-5-乙酰氨基-6-((1R，2R)-1,2-二羟基-3-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺基)丙基)2,4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸钠盐(19)：向25mL圆底烧瓶中加入(4S，5R，6R)-5-乙酰氨基-6-((1R，2R)-3-氨基-1，2-二羟基丙基)-2，4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(108mg，0.35mmol)、饱和碳酸氢钠水溶液(5.9mL)、1，4-二恶烷(5.8mL)、2，5-二氧吡咯烷-1-基3-(碲吩-2-基)丙酸酯(12)(162.37mg，0.465mmol)和磁力搅拌棒。在室温下搅拌所述混合物18小时，然后通过旋转蒸发浓缩所述反应物。然后将粗混合物在2％甲醇/H₂O中重构，并将产物在C18反相塞(2％甲醇/H₂O至1：1甲醇/H₂O流动相)上纯化，得到标题所述化合物，为清澈油。¹H NMR(500MHz,MeOD-d₄):δ8.70(dd,1H,J＝6.9,1.3Hz),7.52(dd,1H,J＝6.9,3.9Hz),7.34(m,1H),3.97(m,3H),3.68(m,1H),3.63(dd,1H,J＝13.8,3.2Hz),3.17(m,3H),2.53(t,2H,J＝7.3Hz),2.08(dd,1H,J＝12.6,4.4Hz),1.98(s,3H),1.88(t,1H,J＝11.8Hz)ppm.注:对应于单个质子的缺失共振可能位于3.31ppm处的残留溶剂峰。

实施例14:1-(2-二氟甲基-4-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺)苯基)-β-D-吡喃半乳糖(24)：

方案13.β-半乳糖苷酶碲吩探针(24)的合成。反应物和条件：a)Bu₄NBr,1M NaOH:DCM(52％)；b)二甲氨基三氟化硫,DCM(89％)；c)H₂,Pd/C,EtOAc(97％)；d)3-(碲吩-2-基)丙酸,T3P，

吡啶：EtOAc(59％)；e)NaOMe,MeOH(75％)。

1-(2-甲酰-4-硝基苯基)-2,3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(20)：在室温搅拌下，将四丁基溴化铵(0.783g，2.43mmol)在1M NaOH(3.7mL)中的溶液加入到DCM(7.4mL)中的2-羟基-5-硝基苯甲醛(0.609g，3.65mmol)中。加入在最少的DCM中的2，3，4，6-四乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(1.00g，2.43mmol)溶液，在室温下搅拌所述混合物3天。随后用DCM(200mL)稀释，并用2M NaOH(4×200mL)和盐水(200mL)洗涤。将所述有机萃取物用MgSO₄干燥，过滤并浓缩，得到橙色固体。通过快速色谱法(固相，硅胶；流动相，DCM，0％-5％MeOH，0.1％三乙胺)纯化所述粗产物，得到化合物20(1.23g，51％)，为粘稠橙色液体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.33(s,1H,CHO),8.71(d,J＝3.0Hz,1H,Ar-H),8.42(dd,J＝9.0Hz,3.0Hz,1H,Ar-H),7.25(d,J＝9.0Hz,1H,Ar-H),5.61(dd,J＝10.5Hz,8.0Hz,1H,H-2),5.51(dd,J＝3.5Hz,1.0Hz,1H,H-4),5.28(d,J＝7.5Hz,H-1),5.18(dd,J＝10.5Hz,3.5Hz,1H,H-3),4.15-4.25(m,3H,H-5H-6a,H-6b),2.20,2.08,2.07,2.03(s,3H,4x COCH ₃)。

1-(2-二氟甲基-4-硝基苯基)2-3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(21)：将二甲基氨基三氟化硫(0.146mL，1.50mmol)加入到20(0.622g，1.25mmol)在无水DCM(16mL)中的溶液中。在室温下在N₂条件下搅拌所述反应物6.5小时，然后通过加入冰(100mL)淬灭反应并萃取到DCM(2×100mL)中。用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤所述合并的有机萃取液，用MgSO₄干燥，过滤并浓缩，得到黄色油。通过快速色谱法(固相，硅胶；流动相，DCM，5％MeOH，0.1％三乙胺)纯化所述粗产物，得到化合物21(0.577g，89％)，为粘稠黄色液体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.49(dd,J＝3.0Hz,1.5Hz,1H,Ar-H),8.33(dd,J＝9.0Hz,2.0Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J＝9.5Hz,1H,Ar-H),6.85(t,J＝54.5Hz,1H,CHF₂),5.57(dd,J＝10.5Hz,8.0Hz,1H,H-2),5.50(app d,J＝3.5Hz,1H,H-4),5.16(d,J＝8.0Hz,H-1),5.15(dd,J＝11.0Hz,3.5Hz,1H,H-3),4.15-4.25(m,3H,H-5H-6a,H-6b),2.20,2.09,2.06,2.03(s,3H,4xCOCH ₃).C₂₁H₂₃F₂NO₁₂的DART-MS m/z计算值519.40,实测值537.15170[M+NH₄]⁺。

1-(2-二氟甲基-4-氨基苯基)2-3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(22)：向含21(1.08g，2.08mmol)在乙酸乙酯(5mL)的搅拌溶液的25mL三颈圆底烧瓶中加入Pd/C(5％Pd，0.220g)。先后用N₂和H₂净化所述烧瓶，然后置于2.04atm的新鲜H₂中室温下搅拌过夜。通过硅藻土过滤Pd/C，浓缩所述滤液，得到纯22(0.990g，97％)，为橙色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.94(s,1H,Ar-H),6.87(dd,J＝2.8Hz,1.6Hz,1H,Ar-H),6.80(t,J＝55.6Hz,1H,CHF₂),5.47(dd,J＝10.8Hz,8.0Hz,1H,H-2),5.44(dd,J＝3.2Hz,0.8Hz,1H,H-4),5.08(dd,J＝10.8Hz,3.6Hz,1H,H-3),4.86(d,J＝8.0Hz,1H,H-1),4.00-4.26(m,3H,H-5,H-6a,H-6b),2.19,2.08,2.06,2.01(s,3H,4x COCH₃ ).¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ–108.43(dd,J＝300.8Hz,56.4Hz,1F),–122.67(dd,J＝300.8Hz,56.4Hz,1F).C₂₁H₂₅F₂NO₁₀的DART-MS m/z计算值489.14,实测值found 490.2[M+H]⁺。

1-(2-二氟甲基-4-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺)苯基)2-3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(23)：在-20℃下N₂条件下，向25mL圆底烧瓶中加入22(0.176g，0.360mmol)、3-(碲吩-2-基)丙酸(6)(0.082g，0.327mmol)、吡啶(0.10mL)和乙酸乙酯(0.20mL)。逐滴加入丙基膦酸(T3P，在乙酸乙酯中50重量％，0.43mL)，在0℃下搅拌所述溶液20小时。用DCM(40mL)稀释所述溶液，并用饱和碳酸氢钠(3×40mL)、水(40mL)和盐水(40mL)洗涤所述溶液。将所述有机萃取物用MgSO₄干燥，过滤并浓缩，得到黄色固体。通过柱色谱法(固定相，硅胶；流动相，DCM，5％MeOH，0.1％三乙胺)纯化所述粗产物，得到23(0.153g，59％)，为黄色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.64(dd,J＝6.8Hz,1.2Hz,1H,TeAr-H),7.96(app.s,1H,TeAr-H),7.76(dd,J＝9.2Hz,0.4Hz,1H,Ar-H),7.53(dd,J＝10.8Hz,4.0Hz,1H,TeAr-H),7.45(br s,1H,NH),7.33(d,J＝2.8Hz,1H,Ar-H),7.04(d,J＝9.2Hz,1H,Ar-H),6.77(t,J＝55.2Hz,1H,-CHF₂),5.47(dd,J＝10.8Hz,8.0Hz,1H,H-2),5.44(app.d,J＝2.8Hz,1H,H-4),5.09(dd,J＝10.4Hz,3.2Hz,1H,H-3),4.95(d,J＝8.0Hz,1H,H-1),4.04-4.22(m,3H,H-5,H-6a,H-6b),3.25(t,J＝6.8Hz,2H,-OC-CH₂ -CH₂),2.64(t,J＝6.8Hz,2H,-CH₂-CH₂ -CTe),2.15,2.03,2.02,1.98(s,3H,3x-COCH₃ ).C₂₈H₃₁F₂NO₁₁ ¹³⁰Te的DART-MS m/z计算值725.09,实测值726.1[M+H]⁺。

1-(2-二氟甲基-4-(3-(碲吩-2-基)丙酰胺)苯基)-β-D-吡喃半乳糖(24)：将23(0.076g，0.106mmol)溶解于无水甲醇(2mL)中，并向所述搅拌溶液中逐滴加入在甲醇中的NaOMe的0.5M溶液(0.20mL)。3小时后，通过加入

50WX2氢形式的树脂(50-100目)直至pH为中性来淬灭所述反应物，并将所述溶液浓缩，得到淡黄色固体。用反相净化滤芯(固定相C18；流动相，水，50％-100％MeOH)使粗产物脱盐，得到24(0.044g，75％)，为淡黄色固体。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ8.71(dd,J＝6.8Hz,1.2Hz,1H,TeAr-H),7.77(d,J＝2.5Hz,1H,TeAr-H),7.63(dd,J＝9.0Hz,2.0Hz,1H,Ar-H),7.54(dd,J＝7.0Hz,4.0Hz,1H,TeAr-H),7.39(dd,J＝4.0Hz,1.5Hz,1H,Ar-H),7.27(s,1H,Ar-H),7.16(t,J＝55.5Hz,1H,-CHF₂)4.83(d,J＝8.0Hz,1H,H-1),3.56-3.90(m,6H,H-2,H-3,H-4,H-5,H-6a,H-6b),3.27(t,J＝8.0Hz,2H,-OC-CH₂ -CH₂),2.69(t,J＝7.0Hz,2H,-CH₂-CH₂ -CTe).¹³C NMR(126MHz,CD₃OD)δ171.58,148.43,136.07,135.13,133.49,124.14,123.54,117.29,116.75,112.97,111.11,109.24,102.64,75.70,73.43,70.77,68.76,60.94,39.81,31.91.C₂₀H₂₃F₂NO₇ ¹³⁰Te的DART-MS m/z计算值557.05,实测值575.08786[M+NH₄]⁺。

实施例15：Telox和Telox-2的合成

Telox如美国申请系列案号62/039,762的方案1所述进行制备。所述Telox的结构如下：

通过方案14所述的合成路线获得含碲吩的低氧探针。本文将该分子称为Telox-2。

方案14

方案14：a)AgNO₃(1.0eq.),NBS(1.15eq.),丙酮,18℃,3h,85％；b)高炔丙基醇(1.2eq.),CuCl(0.02mol％),30％BuNH2(aq.),0℃-18℃,30min,80％；c)四丁基氟化铵(3.3eq.),THF,0℃,10min,70％；d)Te0(4.0eq.),保险粉(6.67eq.),NaOH(aq.)/EtOH,70℃,2h,80％；e)氮霉素(1.05eq.),PPh₃(1.05eq.),偶氮二异丁腈(1.05eq.),THF,0℃-18℃,3h,25％。

以下描述用2-(碲吩-2-基)丙酸作为起始物料合成的Telox-2。

2-硝基-1-(2-(碲吩-2-基)乙基)-1H-咪唑(Telox 2)(25)：向50mL烘干圆底烧瓶中加入2-(碲吩-2-基)乙-1-醇(7)(500mg，2.23mmol)、无水四氢呋喃(15mL)、三苯基膦(1.17g，4.47mmol)，氮霉素(505.4mg，4.47mmol)和干燥的磁力搅拌棒。用氮气冲所述反应容器并在冰浴上冷却，然后经5分钟逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(0.822mL，4.47mmol)，搅拌所述反应物并逐渐升至室温18小时。然后通过旋转蒸发浓缩所述反应物，通过快速色谱法(硅胶固定相，10-50％EtOAc/戊烷，在用KMnO₄染色的用1：1戊烷/EtOAc流动相的二氧化硅涂覆的薄层色谱板上，产物R_f～0.5，)直接纯化所述反应物，得到标题化合物(674.2mg，95％)，为黄色固体。¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ8.79(dd,1H,J＝6.6,1.2Hz),7.55(dd,1H,J＝7.2,4.2Hz),7.24(m,1H),7.07(d,1H,J＝1.0Hz),6.93(d,1H,J＝1.0Hz),4.65(t,2H,J＝7.0Hz),3.41(dt,2H,J＝7.0,1.1Hz)ppm。

2-硝基-1-(2-(碲吩-2-基-5-d)乙基)-1H-咪唑(Telox 2-d，26)：向20mL烘干闪烁计数瓶中加入2-硝基-1-(2-(碲吩-2-基)乙基)-1H-咪唑(Telox2，25，25mg，0.0784mmol)、甲醇-d₄(1mL)、氧化氘(1mL)、三氟乙酸-d(0.308mL，4mmol)和磁力搅拌棒。室温下在氩气条件下搅拌所述反应物18小时。将所述产物从溶液中萃取到氯仿中(用中性去离子水洗涤3次)，用无水MgSO₄干燥，浓缩，得到黄色固体(25mg，

)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.54(d,1H,J＝3.84Hz),7.24(dt,1H,J＝3.84,1.1Hz),7.06(d,1H,J＝1.1Hz),6.92(d,1H,J＝1.1Hz),4.63(t,2H,J＝6.9Hz),3.40(dt,2H,J＝6.9,1.1Hz)ppm。

实施例16

i.细胞培养和维持

HCT116，结直肠癌细胞系(CCL-247^TM)获自美国典型培养物保藏中心，并培养/维持在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。

ii.缺氧暴露

将HCT116(500000)细胞接种在60mm塑料陪替氏培养皿(康宁公司，纽约)中，并在37℃，21％O₂/5％CO₂下培养24小时。将细胞转移到缺氧室(H35/H85缺氧工作站，DonWhitley Scientific)并在1％/0.2％或<0.02％O₂下维持3小时。通过将细胞接种在60mm玻璃板(Corning Inc.，NY)中来进行低氧实验(<0.02％O₂)。

iii.融合(增殖毒性)试验

将HCT116细胞(25000)接种在24孔板中并培养过夜以允许细胞粘附。除去培养基，加入含有50-400μM TELOX或Telox2的新鲜培养基并培养1小时。然后将细胞转运到37℃下保持21％或0.2％O₂的INCUCYTE ^TM动力学成像系统中。通过IncuCyte^TM ZOOM控制软件，使用集成融合算法，每4小时用10×物镜监测生长曲线，直到对照未处理的细胞达到稳定期。在相位对比模式中收集每孔16个高清质量图像，并对其进行平均，以提供代表性统计测量的孔汇合。

iv.代谢毒性试验

向96孔干净的荧光板上装载200μL的Jurkat细胞，培养密度为1×10⁶个细胞/mL。向每个孔中加入适量的无菌DMSO中Telox/Telox2的储备液以达到理想浓度的Telox/Telox2(1-1000微摩尔)。所有孔中DMSO的浓度为1％。使细胞在37℃，正常大气下培养24小时，然后向每个孔中加入20μL商购可获得的PBS中的WST-1溶液(罗氏诊断公司，商品号05015944001)(轻轻移液，使所述试剂均匀分布于整个孔)。37℃下在标准大气下再培养所述细胞0.5小时，然后使用TECAN Safire 2平板读数器在450nm处测量每个孔的吸光度。相对于含有细胞生长培养基(无细胞)、适当浓度的Telox2、终浓度为1％的DMSO和WST-1的孔对数据进行背景校正。以与细胞阳性孔所述相同的方式培养背景校正孔。

v.黄嘌呤氧化酶试验

向可隔离密封的石英比色皿中加入K₂PO₄缓冲液(800μL，100mM，pH7.4)、在K₂PO₄缓冲液(100μL，

黄嘌呤(饱和溶液)，100mM缓冲液，pH7.4)中的黄嘌呤，以及在K₂PO₄缓冲液(100μL，1.0mM的2-NI，100mM缓冲液，pH7.4)中的哌莫硝唑、Telox或Telox2。然后用橡胶隔片密封所述比色皿，整体溶液用高纯度氦气脱气。然后经由汉米尔顿注射器加入黄嘌呤氧化酶((NH4)₂SO₄混悬液中0.2单位III级酶，Sigma-Aldrich，批号SLBB1572V)，通过安捷伦紫外可见光光谱仪(模型#8453)记录325nm处的吸光度随时间的变化。

vi.传统ICP-MS实验

在包含适宜浓度O₂的气氛下，在含有Telox或Telox2(100μM，以在无菌DMSO中的纯溶液形式加入；最终DMSO＝0.1％)的培养基中培养HCT 116细胞(见第i和第ii部分)3小时。培养后，除去培养基，用无菌PBS洗涤细胞，然后经由胰蛋白酶消化(37℃，10分钟)和轻轻刮擦而从培养板上分离。使所述细胞悬浮液成团粒状，并重新悬浮于含有β-ME的PBS(1.0mL，100mM)中。使所述细胞成团粒状，再重新悬浮于PBS(900μL，无β-ME)中，并用甲醛(100μL，37％溶液)固定25分钟。

固定后，使细胞成团粒状，重新悬浮于含有β-ME(1.0mL，100mM)的PBS中，并再次使其成团粒状。然后将所得团粒溶解于超纯HNO₃(1.0mL，

溶液)中，提交一半样品经由ICP-MS分析。然后在已知浓度(5ppb，测量自ICPMS组合方案，PerkinElmer)下，将¹³⁰Te的信号标准化为¹¹⁵In的信号，以考虑检测器灵敏度漂移。对得到的信号进一步标准化以得到具有最大碲信号(值为1.0)的样品。重复进行所有试验。

vii.质谱流式细胞技术实验

在包含适宜浓度O₂的气氛下，在含有Telox或Telox2(100μM，以在无菌DMSO中的纯溶液形式加入；最终DMSO＝0.1％)的培养基中培养HCT116细胞(见第i和第ii部分)3小时。培养后，除去培养基，用无菌PBS洗涤细胞，然后经由胰蛋白酶消化(37℃，10分钟)和轻轻刮擦而从培养板上分离。使所述细胞悬浮液成团粒状并重新混悬于含有β-ME的PBS(1.0mL，100mM)中。使所述细胞成团粒状，重新混悬于PBS(900μL，无β-ME)中，并用甲醛(100μL，37％溶液)固定25分钟。固定后，使细胞成团粒状，重新混悬于含有β-ME的PBS(1.0mL，100mM)中，并再次成团粒状。然后将细胞重新混悬于PBS(990μM，无β-ME)中，并与含Ir的核酸嵌入剂(缺氧细胞)或含有Rh的核酸嵌入剂(常氧细胞)(10μL，100μM在无菌PBS中的溶液)一起培养20分钟。然后将细胞成团粒状并重新混悬于PBS(1.0mL，无β-ME)中两次。然后将细胞团粒重新混悬于含有^151/153Eu珠的PBS(1/10稀释的CyTOF校准珠，DVS Sciences，取决于颗粒大小加1.0-2.5mL)中。然后将两个细胞样品(每个250μL)合并，将250μL所得样品注入第二代

仪器上进行MC分析。对于涉及Ir和Rh的实验，细胞样品不混合在一起，而是分别在

上运行。对于哌莫硝唑竞争实验，将细胞与哌莫硝唑和Telox或Telox2(每个100μM)同时培养，所有其它步骤以与上述实验相同的方式进行(注：本实验仅使用Ir-嵌入剂，因为所有样品是分别进行的。

结果与讨论

甲基碲乙醚：合成与稳定性

最初研究的有机碲官能团是甲基碲乙醚，因为其尺寸小且易于合成(表1，化合物1-4，8-9)。没有研究芳基碲乙醚是因为其在生物体系中的氧化还原活性的有大量报导，报告其在环境光照下不稳定性¹⁹。甲基碲乙醚是从亲核性锂甲基碲合成的，使用了由N.Kunun首先创立的方法的改进方法，然后与理想的亲核试剂反应(方案1)。²⁰化合物3的合成需要在对丙烯酸甲酯进行迈克尔式加成反应之前用水淬灭甲基碲酸酯以产生碲醇。这些加成反应的产率在66％至91％之间。

用¹H NMR通过结合CH₃-Te信号和残留的DMSO-d₅内标来定量所述甲基碲乙醚(1-4)的相对化学稳定性。样品在DMSO-d6溶液中制备，并置于有缓慢连续的干燥空气流的洁净玻璃干燥器中。这种设置允许监测化合物的稳定性而不受大气水份的干扰(图2)。

化合物1-4在24小时培养期间全部降解。化合物4是经研究的最稳定的烷基碲，在24小时内降解约15％(图2B)。化合物2(图2A)和3(图2B)显示出最大的降解，分别为约75％和85％。(图2A)。

假设烷基碲化物在实验条件下经历了氧化。在培养期间，随着以不同速率形成白色沉淀，初始的黄色溶液变成了无色。之前已经观察到这种现象，并且假设是碲氧化物类形成了聚合结构或形成了TeO₂ ^21&22。此外，先前已经观察到，TelOx的溶液的¹H NMR的表观吸收度与硫族元素氧化相一致^5，23。也已知烷基碲化合物经历溶血性键裂，这可能导致观察到少量的二甲基二碲化物和二甲基碲化物^24-26。这些物质是挥发性的，仅在化合物1和2的早期时间点被观察到。在化合物3的第8小时样品中观察到相同的物质。此外，在化合物3的降解期间产生了甲基丙烯酰胺。无法鉴定这些降解导致的其余有机组分，可能是由于它们的低分子量和挥发性。为了降低所述碲乙醚的氧化降解的倾向，研究了三氟甲基碲醚、5和10，以及所述碲吩6、7和11。

三氟甲基碲乙醚：合成与稳定性

带有三氟甲基的化合物5在碲中心将有降低的电子密度，因此氧化应该更加缓慢。通过用三甲基(三氟甲基)硅烷和四甲基氟化铵处理碲金属，在原位生成四甲基铵三氟甲基碲酸酯来合成化合物5²⁷。向所述溶液中加入4-溴丁酸甲酯，得到产物5，产率50％(方案1)。

在与化合物1-4相同的条件下评估所述三氟甲基碲化物5的稳定性(图2B)。结构相关化合物4和5的比较支持了降低Te中心电子密度会使化合物稳定的假设，因为经24小时的培养没有观察到降解，表明三氟甲基官能团正如所假设的稳定了碲乙醚。

碲吩：合成与稳定性

碲吩还没有在生物系统中被评估过，只有最近才报导了第一种水溶性碲吩²⁸。碲吩具有有趣的光物理性质，并且已经被研究作为太阳能电池应用中的光收集剂并且在材料化学中被研究^29，30，31。硫族元素类似物硒吩已经在生物系统中被研究，并有望作为抗氧化剂分子。通过计算分析，碲吩的基态芳香性被认为比硒吩更稳定³²。假设在理想的生物条件下，碲吩的芳香性质会提供比碲乙醚衍生物更好的化学稳定性。

碲吩经由将Te^2-加入到单官能化联乙炔来合成，这是从Stephens和Sweat的最初报告改进的合成方法³³。在合成这些碲吩时，Te^2-的生成一般是通过用NaBH₄处理Te⁰的水性混悬液进行的，利用碱性保险粉(NaHOCH₂SO₂)溶液进行，其能重复产生Te^2-，并产生更高产率的所需碲吩³⁵。

三烷基甲硅烷基二乙炔可以例如使用Cadiot-Chodkiewicz交叉偶联反应(方案2)以优异的产率而产生³⁶。用Wulff³⁷等所述的条件，使用N-溴代丁二酰亚胺和硝酸银使三异丙基甲硅烷基乙炔溴化得到已知的偶合中间体，然后使用在30％BuNH₂中的CuCl使这一化合物与按需选择的乙炔组分偶合。使用原料4-戊炔酸合成化合物6，使用原料3-丁炔-1-醇合成化合物7。使用四丁基氟化铵使三烷基甲硅烷基保护的二乙炔化合物脱保护，并以良好的产率用保险粉和碲金属的碱性溶液环化成碲吩6和7(方案2)。

使用与烷基碲化物类相同的方案研究所述两种碲吩的稳定性(图2A和B)。与甲基烷基碲乙醚相比，化合物6和7具有改善的稳定性。两种碲吩化合物经24小时培养后都显著降解，具有与三氯甲基碲乙醚5相似的稳定性。

苄胺缀合的有机碲衍生物：合成与稳定性

为了将来生成MC探针，将有机碲与生物相关官能团缀合。这里考虑两个提供标记伯胺、氨基甲酰化和酰胺化反应的方法的缀合反应。此外，有机碲化合物2、4、5和7的芐胺衍生物的形成，导致化合物(8-11)具有用于细胞毒性研究的更相似的分配系数(方案3&4)。

通过用对硝基苯基氯甲酸酯处理化合物2产生的对硝基苯基碳酸酯来合成化合物8。所述反应性碳酸酯可以纯化和储存。通过水解甲酯来合成化合物9和10，在分离羧酸后，在NHS和芐胺的存在下，与DCC进行偶联0。化合物11的合成与9和10的合成类似，但使用柱色谱法进行纯化。

使用开发的¹H NMR试验评估这些芐胺衍生物的稳定性(图2C)。这些化合物的降解速率反映了甲基碲化物化合类的未衍生化合物的降解速率，化合物8和9经培养降解20-25％，化合物10和11在培养中保持稳定。有趣的是，氨基甲酸酯8比母体醇2稳定得多，这表明所述乙醇可能对降解机制有直接贡献。

PBS缓冲液中的稳定性

在所评估的化合物中，三氟甲基碲乙醚-酰胺(10)和碲吩-酰胺(11)在有氧条件下表现出最好的稳定性。为了进一步验证这些化合物作为MC质量标记的潜力，还在通过将所述化合物溶解在d-DMSO/PBS缓冲液的50/50溶液中研究了其在缓冲水溶液中的降解。保持所述化合物在在室温下暴露于空气和环境照明的环境中。用¹⁹F NMR研究，化合物10，使用三氟乙酸内标，而¹H NMR研究化合物11的降解，使用d5-DMSO内标。如图3所示，三氯甲基碲乙醚10在24小时后显示出60％的降解。然而，在相同条件下，碲吩11保持稳定。

细胞毒性

为了研究所研究的有机碲化合物作为MC的探针部分的潜力，评估了化合物的代谢毒性。有机碲化合物通常被描述为有毒的，在不同试验条件下，芳基碲乙醚一系列细胞系中显示低于100μM的细胞毒性^{9-11，38，39}。化合物8-11的毒性用通常使用Jurkat细胞，培养24小时后，按每个厂家的说明使用代谢探针WST-1(罗氏诊断公司，Laval，Quebec)研究。基于NMR稳定性研究，由于化合物8、9和10预期在毒性试验的时间范围内显示降解，这些实验显示了这些化合物及它们的降解产物的相对毒性(表2)。化合物8具有610μM的表观LD₅₀值，但是由于化合物8在较高浓度下的溶解度不足，其实验误差较大。化合物9和10在LD₅₀<200μM时毒性更大，但碲吩11的毒性较小，LD₅₀为280μM。这些数据表明，一般而言，烷基碲乙醚和碲吩的毒性低于以前研究的芳基碲乙醚。本申请的示例性有机碲化合物的LD₅₀值为它们基于MC探针的活性的应用提供了希望，因为通常的MC实验可以以

的浓度实现。

实施例17：

MC是强大的分析工具。碲具有作为MC质量标记具有有价值的特征，包括八个稳定的同位素、最小的官能团大小和最小的极性。已经合成并表征了用于MC探针开发各种功能化的有机碲化合物。烷基碲化物类是易合成的，但具有相对较小的化合物稳定性。碲吩部分能以良好的产率获得，是化学稳定的且足够无毒。

Telox-2利用与Telox相同的2-硝基咪唑官能团，然而，含碲的质量标记显著不同。不同于Telox中的甲基碲乙醚官能团，Telox-2采用了一种碲吩杂环(参见方案14中标注为“质量标记”的官能团)。

为了研究Telox-2相对于Telox的的稳定性，在生物相关条件下(在D 2O中的0.01％dDMSO)收集Telox-2的¹H NMR谱一周。Telox-2对于含硫族元素的大分子显示出显著的稳定性，因为NMR数据表明在测试条件下未发生可观察到的降解(图5)。此外，Telox-2在高浓度(2mM)下的¹H NMR光谱中缺乏可观察到的峰加宽表明Telox-2不在水溶液中形成聚集体或胶束。

使用紫外可见光谱法进行正交稳定性试验以证实NMR稳定性结果(图6)。在该试验中，经3天时间，在水性缓冲液的固定浓度记录Telox-2的紫外可见光谱。作为降解的结果，杂环、碲吩或硝基咪唑的损失预期会分别在282和/或325nm处引发吸光度的下降。在该实验中没有检测到吸光度的变化，因此证实了我们的NMR结果：Telox-2是极为稳定的有机硫族元素。使用类似的紫外可见试验条件测量Telox-2的经验logP值为1.3。该logP值低于相应噻吩的预测值，部分解释了Telox-2异常高的水溶性。

接下来，使用与用于Telox的相同的试验研究了Telox-2的毒性曲线。融合分析(图7部分a)表明，Telox-2在常氧条件下在50至100μM的浓度范围内和低氧条件下在100至200μM的浓度范围内开始减缓细胞增殖。这种增殖毒性曲线与Telox相当，或许表明是2-硝基咪唑官能团而不是所述含碲官能团是限制性毒性的因子。通过WST-1试验测定的代谢毒性(图8部分b)表明Telox-2的代谢LD₅₀为

再一次的，该值与Telox的类似。

使用图4a中的方案研究氧标记。Telox的结果在图4b-e中显示。Telox-2在HCT116细胞中的氧标记和剂量标记关系的评估(图8)显示，在10μM的最佳探针浓度(在这些条件下)可使在常氧条件下培养的细胞与接近无氧条件下培养的细胞之间的信噪比(即特异性标记÷非特异性结合)最大化。在中等低氧条件(1％O₂)下培养的细胞的信噪比显著低于接近无氧条件下的对应物。

然后使用优化剂量评估在恒定药物暴露条件下标记的时间依赖性(图10部分a)。该实验表明，当将接近无氧和中度缺氧细胞与常氧对照比较时，随着培养时间增加，信噪比增强。尽管对于体外试验是有用的实验，但是恒定的药物暴露条件对于体内实验是不现实的，因为可预期药物清除会快速降低动物模型中的探针浓度。为了更好地模拟体内情况，研究了脉冲暴露于探针的Telox-2标记的时间依赖性。在该实验中，将细胞暴露于Telox-2 3小时，之后除去含有探针的培养基，换用新鲜培养基。然后在进行MC分析之前，再培养所述细胞(直至)另外21小时(图9部分c和d)。该实验的结果表明，Telox-2蛋白缀合物(参见Telox-2方案部分b)按照指数型衰变而丧失(图9部分c)。这与预期一致，因为预计在不存在额外的未代谢的Telox-2的情况下，每个细胞的Telox-2-蛋白质缀合物的量随着时间的推移而减少，因为预期细胞在所研究的时间段内分裂，进而在每次分裂后，一半的Telox-2蛋白缀合物被传递给子代细胞。

为了证实Telox-2的还原代谢，利用了突变型HCT116细胞系来研究，其过表达NADPH：细胞色素P450氧化还原酶(POR)或能敲除该酶(图10部分b)。在过表达POR的细胞系中，观察到用Telox-2大大增强的标记(与野生型细胞相比)，表明该酶在Telox-2的代谢和随后激活中是重要的。有趣的是，POR敲除细胞系中的Telox-2标记与野生型几乎相同(图10部分c)。这表明细胞能够通过可选的氧化还原酶来代谢Telox-2，其可以被上调以补偿POR的缺乏。

在具有哌莫硝唑的竞争条件下，Telox-2标记以(哌莫硝唑)剂量依赖性方式减少(图11)。在过高剂量的哌莫硝唑时甚至未观察到完全竞争，表明存在能够减少Telox-2但不能加工哌莫硝唑的代谢途径。仅在接近无氧条件下观察到竞争，表明在常氧条件下培养的细胞中观察到的小碲信号不是还原代谢的结果。

实施例18：

组织蛋白酶S

在正常条件和/或一种或多种试验条件下生长细胞并用由诸如下式碲吩化合物标记的组织蛋白酶S底物培养，

其中，所述分子的DTPA部分用第二金属标记(标记2)进行标记，任选具有不同质量的碲吩部分。由于化合物的脂肪酸末端，底物与膜结合。如果组织蛋白酶S是有活性的，则底物被分裂释放分子的可溶性DTPA部分。碲吩/标记2信号的比例指示组织蛋白酶S的活性。例如，1：1的比例表明组织蛋白酶无活性，而小于1的比例表明有活性。这些探针可以由本领域技术人员使用类似于文献实施例的方案(例如Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53(29)：7669-7673。doi：10.1002/anie.201310979，通过引用并入本文)来合成。

实施例19：

酶联试验

包含有机碲吩标记的碱性磷酸酶(AP)底物，例如，

可以通过如下方案制备：

AP可以作为抗体缀合物直接或间接地固定到平板或珠粒上(例如，抗体缀合物与已经与固定在平板或珠粒上的抗原一起培养)。在磷酸盐裂解时产生醌甲基化物的碲标记的底物与珠或孔一起培养。如果AP存在，则磷酸酯被切割，所述醌甲基化物与AP和/或附近的其它生物分子反应。碲水平用作AP存在和/或其存在的量的示值读数。

AP可以是用于细胞或组织样品上的抗原检测的抗体缀合物的一部分。将在磷酸酯裂解时产生醌甲基化物的所述碲标记的底物与细胞或组织样品一起培养。如果存在AP，则磷酸酯被切割并且所述醌甲基化物与AP和/或附近的其它生物分子反应。碲水平用作AP存在和/或其存在的量的示值读数。

实施例20：

可以使用碲吩标记的化合物进行酶定位。组织样品碲吩标记的酶底物一起培养，其在裂解时形成包含碲吩部分的沉淀。例如，所述碲吩并3，3'二氨基联苯胺是辣根过氧化物酶的底物，在反应时产生不溶性聚合物。所述辣根过氧化物酶的存在和量将由与不溶性聚合物相关的碲指示。在另一个实例中，结合至2-(2'-磷酰氧基苯基)-6-[125l]碘-4-(3H)-喹唑啉酮的碲吩将提供水溶性碱性磷酸酶底物，其释放不溶性的碲连接的喹唑啉，该不溶性的碲连接的喹唑啉一旦磷酸酯裂解时就会局部沉淀。碱性磷酸酶活性的量与所形成的不溶性碲化合物相关。成像方法用于检测碲沉淀。

表格

表1.研究的有机碲化合物

表2.有机碲化合物8-11的LD50值.*化合物8由于溶解度缺陷而具有较大的实验误差。在实验可接受的最高浓度所有细胞都不能被杀死(2mM)

虽然已经根据目前被认为是优选的实施例描述了本申请，但是应当理解，本申请不限于所公开的实施例。相反，本申请旨在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的各种修改和等同布置。

所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用整体并入。具体而言，与本文提供的每个检索号相关的序列包括例如表中或其他地方提供的登记号和/或生物标志物序列(例如蛋白质和/或核酸)，其全部内容通过引用并入本文。

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Claims

1.式(I)的化合物或其盐和/或其溶剂合物：

其中：

A是Te的天然存在的同位素；

R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₂₀烷基、未取代或取代的C₃-C₂₀环烷基、未取代或取代的芳基和吸电子基团，其中R¹上的所述取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基和C_1-6烷氧基中的一个或多个，所述吸电子基团选自C(O)R²、C(R³)₃、C≡N和NO₂；

R²选自H和C_1-6烷基；

R³是卤素；

L是C_1-30亚烷基，未取代或被一个或多个取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O、S、NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)和C(S)中的一个或多个所间隔，其中L上的所述取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶，其中R⁴选自H和C_1-6烷基，R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-20烷基和C(O)OC_1-20烷基；

R⁷独立地选自H，PG和C_1-6烷基；

R⁸选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被一个或多个卤素和NO₂取代；

R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者，

R⁹和R¹⁰与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环的或双环饱和或不饱和环；

R¹¹选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹²选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹³和R¹⁴独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者，R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环或双环饱和或不饱和环；

R¹⁵是卤素；

R¹⁶选自C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-6烷基、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代，或者，R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O、＝S、卤素和C_1-6烷基取代的4至12元单环或双环饱和或不饱和环；以及

一个或多个可用的氢任选地被D替代；

PG选自t-Boc、Ac、Tf、Ns、Bn、Fmoc、苯甲酰基和苄氧羰基；

条件是：当X是C(O)OR⁸且R⁸是H或C_1-6烷基时，L不是C_1-8亚烷基；且当X是OH时，L不是C_1-2亚烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹是选自C(O)R²,C(R³)₃,C≡N和NO₂的吸电子基团，其中

R²选自H和C_1-6烷基；

R³是卤素。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₃-C₁₀环烷基、未取代或取代的苯基和选自C(O)R²和C(R³)₃的吸电子基团；

R¹上的所述取代基独立地选自卤素和C_1-6烷基中的一个或多个；

R²选自H和C_1-6烷基；以及

R³是F、Cl、Br和I。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中R¹选自H和C(R³)₃，其中R³是F。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中R¹是H。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中L是C_1-25亚烷基，未取代或被一个或多个独立地选自C_1-3烷基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔；

R⁴选自H和C_1-2烷基；

R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-6烷基和C(O)OC_1-6烷基；以及

R⁷独立地选自H和PG。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中L是C_1-25亚烷基，其未被取代或被一个或多个独立地选自NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔；

R⁵和R⁶独立地选自H、PG和C(O)OC_1-4烷基；以及

R⁷是H。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中X是选自Cl、Br、I、OH、C(O)OR⁸、C(O)NR⁹R¹⁰、O-C(O)-OR¹¹、C(O)ONR¹³R¹⁴、C(O)R¹⁵、和NR¹⁷R¹⁸的反应性官能团；

R⁸选自H和C_1-2烷基；

R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基、芳基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹¹是未取代或被F、Cl、Br、I和NO₂中的一个或多个取代的苯基，；

R¹³和R¹⁴独立地选自H和C_1-2烷基，或者，R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O和＝S取代的4至10元单环或双环；

R¹⁵是Cl或Br；以及

R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-3烷基，或者，R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成未取代或被一个或多个＝O和＝S取代的4至12元单环或双环。

9.根据权利要求8所述的化合物，其中X是选自Cl、OH、C(O)OR⁸、C(O)NR⁹R¹⁰、O-C(O)OR¹¹、C(O)ONR¹³R¹⁴和NR¹⁷R¹⁸的反应性官能团；

R⁸是H；

R⁹和R¹⁰独立地选自H、C_1-6烷基和C_1-6亚烷基芳基，其中所述后三种基团未取代或被卤素和NO₂中的一个或多个取代；

R¹¹是被NO₂取代的苯基；

R¹³和R¹⁴与它们所键合的N原子一起形成被＝O取代的4至6元单环；以及

R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、C(O)C_1-2烷基，或者，R¹⁷和R¹⁸与它们所键合的N原子一起形成被＝O取代的4至10元双环。

10.根据权利要求1所述的化合物，选自

11.式(II)的化合物和/或其盐和/或其溶剂合物：

其中，A是Te的天然存在的同位素；

R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₂₀烷基、未取代或取代的C₃-C₂₀环烷基、未取代或取代的芳基和吸电子基团，其中R¹上的所述取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基和C_1-6烷氧基中的一个或多个，其中所述吸电子基团选自C(O)R²、C(R³)₃、C≡N和NO₂；

R²选自H和C_1-6烷基；

R³是卤素；

L是C_1-20亚烷基，未取代或被一个或多个取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O、S、NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)和C(S)中的一个或多个所间隔，L上的所述取代基独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶，其中R⁴选自H和C_1-6烷基，R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-20烷基和C(O)OC_1-20烷基；

PG选自t-Boc、Ac、Tf、Ns、Bn、Fmoc、苯甲酰基和苄氧羰基；

R⁷独立地选自H，PG和C_1-6烷基；以及

Z是生物传感器、生物活性材料或聚合物骨架；

所述生物传感器为酶底物，所述酶底物选自氧化还原酶底物、黄嘌呤底物、P450底物、糖基水解酶底物、脂肪酶底物、磷酸酶底物、激酶底物和蛋白酶底物；

所述生物活性材料选自细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸、肽核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢产物、半抗原、激素、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸、糖、亲和试剂和硫醇反应性官能团；以及

所述聚合物骨架是包含一系列共同产生聚合物分子的连续链的共价键合的原子的聚合物的主链。

12.根据权利要求11所述的化合物，其中R¹是选自C(O)R²,C(R³)₃,C≡N和NO₂的吸电子基团，其中

R²选自H和C_1-6烷基；

R³是卤素。

13.根据权利要求11所述的化合物，其中R¹选自H、未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₃-C₁₀环烷基、未取代或取代的苯基和选自C(O)R²和C(R³)₃的吸电子基团；

R¹上的所述取代基独立地选自卤素和C_1-3烷基中的一个或多个；

R²选自H和C_1-6烷基；以及

R³是F、Cl、Br和I。

14.根据权利要求13所述的化合物，其中R¹选自H和C(R³)₃，其中R³是F。

15.根据权利要求14所述的化合物，其中R¹是H。

16.根据权利要求11所述的化合物，其中L是C_1-25亚烷基，未取代或被一个或多个独立地选自C_1-3烷基、C(O)R⁴和NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔；

R⁴选自H和C_1-2烷基；

R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)C_1-6烷基和C(O)OC_1-6烷基；以及

R⁷独立地选自H和PG。

17.根据权利要求16所述的化合物，其中L是C_1-25亚烷基，未取代或被一种或多种独立地选自NR⁵R⁶的取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O和NR⁷的杂基团所间隔，和/或任选地被C(O)所间隔；

R⁵和R⁶独立地选自H、PG、C(O)OC_1-4烷基；以及

R⁷是H。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的化合物，其中Z是生物传感器。

19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述生物传感器是2-硝基咪唑。

20.根据权利要求11所述的化合物，选自：

21.根据权利要求11所述的化合物，其中Z是生物活性材料。

22.根据权利要求21所述的化合物，其中所述生物活性材料是氨基酸。

23.根据权利要求22所述的化合物，其中所述氨基酸选自酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

24.根据权利要求21所述的化合物，其中生物活性材料为选自马来酰亚胺的硫醇反应性官能团。

25.根据权利要求11所述的化合物，选自：

26.根据权利要求11所述的化合物，其中Z是聚合物骨架的单体单元，所述化合物包含至少一个式(IIa)：

其中，n是表示式(IIa)的重复单体单元数量的整数。

27.根据权利要求26所述的化合物，其中所述聚合物骨架进一步包含改善水溶性的含有负电荷和/或侧链的单体。

28.根据权利要求27所述的化合物，其中所述改善水溶性的单体包含聚乙二醇单元和/或两性离子。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的化合物，其中所述聚合物骨架进一步包含质量标签中的一种或多种生物传感器、生物活性材料、质量标签和/或支撑结构，任选地直接连接到所述聚合物骨架或经由连接体L¹进行连接，其中L¹是C_1-20亚烷基，未取代或被一个或多个取代基取代，和/或任选地被一个或多个独立地选自O，S，NR⁷的杂环基所间隔，和/或任选地被一个或多个C(O)和C(S)所间隔。

30.根据权利要求26所述的化合物，选自：

其中，Q是O或NH。

31.根据权利要求21所述的化合物，其中所述生物活性材料选自亲和试剂，所述亲和试剂选自抗体或其结合片段、适体、抗生物素蛋白试剂、核酸或凝集素。

32.根据权利要求1或11所述的化合物，其中所述碲同位素选自¹²⁰Te、¹²²Te、¹²³Te、¹²⁴Te、¹²⁵Te、¹²⁶Te、¹²⁸Te或¹³⁰Te。

33.一种组合物，包含一种或多种根据权利要求1或11所述的化合物。

34.根据权利要求33所述的组合物，包含多种根据权利要求11所述的化合物，其中每种化合物具有不同的生物传感器或生物活性材料，任选地包含不同的抗体。

35.根据权利要求33所述的组合物，包含多种根据权利要求1所述的化合物，其中每种化合物具有不同的碲同位素。

36.根据权利要求33所述的组合物，其中所述化合物耦合至包含外壁的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒耦合至所述外壁。

37.一种小瓶，包含根据权利要求33所述的组合物。

38.一种试剂盒，包含权利要求1或11所述的化合物以及用于在质量检测试验中重构、质量标记和/或使用所述化合物或组合物的说明书或试剂。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少2、3、4、5、6、7或8种化合物，每种化合物包含不同的碲同位素，任选用作条形码试剂。

40.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求10化合物，其中所述生物传感器是蛋白酶底物。

41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述蛋白酶底物为

42.一种对生物传感器、生物活性材料或聚合物进行质量标记的方法，所述方法包括在合适的反应条件下使权利要求1至10中任一项所述的式(I)的化合物与所述生物传感器、生物活性材料或聚合物接触；任选通过除去未反应的化合物和/或未反应的生物传感器或生物活性材料纯化分离经质量标记的生物传感器。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述生物传感器包含2-硝基咪唑；蛋白酶底物、任选组织蛋白酶2底物；糖基水解酶底物、任选β-半乳糖苷酶底物；磷酸酶底物，诸如碱性磷酸酶底物；或激酶底物。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述生物活性材料选自细胞、病毒、亚细胞颗粒、多肽、核酸、肽核酸、寡糖、多醣、脂多醣、细胞代谢物、半抗原、激素、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述生物活性材料选自亲和试剂，所述亲和试剂选自抗体或其结合片段、适体、抗生物素蛋白试剂、核酸或凝集素。

46.权利要求1至10中任一项所述的式(I)的化合物用于制备经质量标记的生物传感器、生物活性材料或聚合物的用途。

47.根据权利要求46所述的用途，其中所述有机碲吩化合物是权利要求10所述的化合物。

48.根据权利要求46所述的用途，其中所述经质量标记的生物传感器或生物活性材料是式(II)的化合物。

49.根据权利要求48所述的用途，其中所述经质量标记的生物传感器用于任选地使用质谱仪的多重测定。

50.根据权利要求48所述的用途，其中所述经质量标记的生物传感器用于通过酶联检测进行检测。

51.根据权利要求46至50中任一项所述的用途，其中所述生物传感器或生物活性材料按照权利要求42所述的方法进行质量标记。

52.一种检测或定量细胞目标活性或目标分析物的方法，包含以下步骤：

a.提供细胞或细胞群；

b.提供碲吩标记的生物传感器或生物活性材料，其中所述碲吩标记的生物传感器或生物活性材料为权利要求11至32中任一项所述的式(II)的化合物，其中所述生物传感器是用于所述细胞目标活性的底物和/或所述生物活性材料与目标分析物特异性结合或反应；

c.将所述细胞或细胞群与所述碲吩标记的生物传感器或生物活性材料混合；以及

d.检测碲标记和/或定量所述细胞或细胞群的碲标记的量。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述碲标记使用质谱流式细胞技术检测或定量。

54.根据权利要求52所述的方法，其中所述碲标记表示目标活性的存在或量。

55.根据权利要求52所述的方法，其中所述目标活性是酶活性或代谢活性。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述酶是氧化还原酶、蛋白酶、磷酸酶、激酶、糖基水解酶或脂肪酶。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述生物传感器选自2-硝基咪唑、氧化还原底物、蛋白酶底物、磷酸酶底物、激酶底物、糖基水解酶底物或脂肪酶底物。

58.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述目标分析物是多肽，所述生物活性材料是亲和试剂，任选地是抗体、适体和诸如链霉亲和素或去糖基化亲和素的抗生物素蛋白试剂。

59.根据权利要求52或53的方法，其中所述目标分析物是核酸，所述生物活性材料是寡核苷酸探针。

60.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中检测或定量了多种目标分析物和/或活性，所述方法包括提供多个碲吩标记的生物传感器和/或生物活性材料，其中每种化合物包含不同的生物传感器或不同的生物活性材料，任选亲和试剂和/或不同的碲物质。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述活性是氧化还原酶活性，所述方法用于检测和/或标记缺氧细胞。

62.根据权利要求61所述的方法，所述方法包括：

用经碲吩标记的生物传感器孵育细胞群，其中所述生物传感器是2-硝基咪唑；

在所述细胞群的一个或多个细胞中检测碲标记，

其中碲标记表示去氧。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述方法进一步包括定量所述群中去氧细胞的数量。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述方法包括将碲标记的量与对照进行比较。