WO2010032816A1 - 新規リゾホスファチジルセリン受容体 - Google Patents

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WO2010032816A1
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lysophosphatidylserine
receptor
antagonist
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哲也 杉山
志穂 大上
大介 中山
昭夫 林
顕 藤木
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小野薬品工業株式会社
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • the present invention relates to a method for using H963 as a lysophosphatidylserine (hereinafter abbreviated as LysoPS) receptor.
  • LysoPS lysophosphatidylserine
  • H963 is a so-called orphan receptor whose ligand, function, and related diseases have not been elucidated at all, and is a G protein-coupled receptor (hereinafter abbreviated as GPCR) whose analysis is desired.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • LysoPS is a lysophospholipid produced by hydrolysis of phosphatidylserine by phospholipase A1 or A2, and there are various types depending on the position of the fatty acid, the number of carbon chains, and the degree of saturation. As its physiological action, it has been shown to enhance antigen stimulation via concanavalin A and IgE receptor, and degranulation induction reaction by nerve growth factor. It has been reported to have an important role in allergic reactions (immediate type) (Non-patent Documents 1, 2, and 3).
  • GPR34 which is a GPCR
  • H963 functions as a LysoPS receptor.
  • the antagonist can be applied to the treatment of sepsis and septic shock.
  • Non-patent Document 5 the physiological functions of the regioisomers of LysoPS, particularly the 1-acyl and 2-acyl isomers, differ.
  • Non-patent Document 6 the measurement example with lysophosphatidylcholine has been reported so far (Non-patent Document 6), and there is no report about LysoPS.
  • An object of the present invention is to identify a ligand of H963 that was an orphan receptor, provide a screening method for the antagonist, and provide a use of the antagonist.
  • the present inventors have developed a screening method for the antagonist by identifying LysoPS as a ligand for H963.
  • the present inventors have found the relationship between a specific isomer and sepsis by measuring the position isomer of blood LysoPS, and the receptor antagonist can prevent the onset of sepsis and septic shock and / or the like.
  • the present invention was completed by newly finding that it can be applied to treatment.
  • the present invention is as follows. [1] Use of H963 as a LysoPS receptor. [2] H963 of the above-mentioned [1], wherein the LysoPS is one or more selected from C18: 1-LysoPS, C18: 2-LysoPS, C20: 4-LysoPS, C22: 5-LysoPS, and C22: 6-LysoPS. Use of. [3] Use of H963 of the above-mentioned [2] in screening for a LysoPS receptor antagonist.
  • H963 Use of H963 according to the above [3], wherein the screening of the LysoPS receptor antagonist comprises the following steps; (A) a step of bringing a H963-expressing cell into contact with a test substance; (B) a step of adding LysoPS so that the final concentration is about 10 to 40 ⁇ M; and (C) comparing the H963 activation signal in the presence of the test substance with the same signal in the absence of the test substance, and adding LysoPS. Selecting a test substance that suppresses the activation of H963 by. [5] Use of H963 of the above-mentioned [4], wherein the H963 activation signal is enhancement of ERK phosphorylation.
  • the H963 activation signal is an increase in intracellular Ca 2+ concentration.
  • the LysoPS receptor antagonist is a preventive and / or therapeutic agent for sepsis or septic shock.
  • the present invention makes it possible to provide an H963 antagonist that can be used for preventing and / or treating the onset of sepsis and septic shock.
  • LysoPS LysoPS stimulation
  • LysoPS stimulation It represents enhancement of phosphorylation of ERK by LysoPS stimulation. It represents an increase in intracellular Ca 2+ concentration by LysoPS stimulation. In LPS-stimulated sepsis animal model, it represents the change in blood level of 2-acyl lysoPS by LPS stimulation.
  • H963 is known and is, for example, a protein specified by GenBank accession number AAL47763.1 or a partial protein thereof.
  • the H963 partial protein means that the ligand binding strength, specificity and / or the level and type of intracellular signal induced by the ligand binding are the same or the same as those of H963 specified by the AAL47763.1. Limited to some.
  • G ⁇ 16 is known and is, for example, a protein specified by GenBank accession number AAA35860.1 or a partial protein thereof.
  • the G ⁇ 16 partial protein has a region that interacts with at least H963, binds to guanosine triphosphate (GTP), and further includes a region that interacts with phospholipase ⁇ (PLC ⁇ ), which is an effector. Any of them may be used.
  • H963 or G ⁇ 16 or a partial protein thereof may be expressed as a fusion protein with another protein or peptide.
  • Other protein parts or peptide parts to be fused can be used as a tag for confirming the expression of the fusion protein with H963 or G ⁇ 16 or purifying and isolating the expressed cells.
  • myc, immunoglobulin Fc portion, histidine tandem (6xHis), etc. can be used.
  • the cDNA encoding each of H963 and G ⁇ 16 according to the present invention can be obtained by various known methods or the methods described in the examples. For example, according to Maniatis et al., “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, ColdSpring Harbor Laboratory, NY, 1982, etc., using primers and probes designed and synthesized based on information on known amino acid sequences and nucleotide sequences, It can be isolated from an appropriate library that expresses each by PCR or hybridization.
  • the expression vector can be prepared by inserting each cloned cDNA under a promoter that functions in animal cells by a known method or a method described in Examples.
  • an expression vector for example, a commercial one can be used.
  • examples of the H963-expressing cells include mammalian cells that naturally express H963 or mammalian cells that are transiently or permanently transformed with an H963 expression vector and express H963.
  • examples of mammalian cells that naturally express H963 include mast cells (eg, umbilical cord blood-derived cultured human mast cells (CBMC)).
  • H963 and G ⁇ 16 co-expressing cells include, for example, mammalian cells that are transiently or permanently transformed with H963 expression vector and G ⁇ 16 expression vector and express H963 and G ⁇ 16.
  • a host of a mammalian cell transformed with the H963 expression vector and / or G ⁇ 16 expression vector and expressing H963 and / or G ⁇ 16 for example, COS-7 cell, COS-1 cell, Vero cell, CHO cell CHO-K1 cells, mouse L cells, and human HEK293 cells.
  • the H963-expressing cells can be prepared by introducing the expression vector into a host cell by a known method or the method described in the Examples and, if necessary, selecting stably transformed cells. Further, H963 and G ⁇ 16 co-expressing cells can also be produced by a known method, for example, the method described in JP-A-2003-250551 or the method described in Examples.
  • LysoPS has the general formula (I)
  • R 1 represents a C12-26 alkylcarbonyl group or a C12-26 alkenylcarbonyl group
  • R 1 represents a C12-26 alkylcarbonyl group or a C12-26 alkenylcarbonyl group
  • alkyl in the “C12-26 alkylcarbonyl group” include linear chains such as dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, icosyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl or pentacosyl.
  • alkenyl in the “C12-26 alkenylcarbonyl group” include, for example, undecenyl, dodecenyl, tridecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, nonadecenyl, icocenyl, henicocenyl, dococenyl, tricocenyl, and tetracosenyl groups. And a straight-chain C11-25 alkenyl group.
  • LysoPS of the present invention having 18 and the number of double bonds is sometimes referred to as C18: 1-LysoPS, and its R 1 or R 2 is sometimes referred to as a C18: 1-alkenylcarbonyl group.
  • LysoPS represented by the general formula (I) is sometimes referred to as 1-acyl LysoPS
  • LysoPS represented by the general formula (II) is sometimes referred to as 2-acyl LysoPS.
  • LysoPS is preferably represented by the general formula (Ia)
  • R 1a or R 2a is C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 1, C20: 2, C20: 3, C20: 4, C20: 5, C22: 1, C22: 2, C22: 3, C22: 4, C22: 5 or a C22: 6-alkenylcarbonyl group represented by the above formula (Ia ) Or (IIa), and more preferably, R 1a or R 2a is a C18: 1, C18: 2, C20: 4, C22: 5 or C22: 6-alkenylcarbonyl group, respectively. Examples include (Ia) or (IIa) LysoPS.
  • the position of the double bond between carbon atoms in the C12-26 alkenylcarbonyl group represented by R 1a or R 2a of LysoPS represented by the general formula (Ia) or (IIa) according to the present invention is not particularly limited.
  • the LysoPS in the present invention includes those labeled.
  • the labeling substance include radioisotopes (for example, [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 32 P], [ 35 S], etc.), fluorescent substances (for example, fluorescein, etc.), luminescence Examples include substances (for example, luminol), enzymes (for example, peroxidase), lanthanide elements, and the like.
  • the labeled LysoPS is preferably LysoPS labeled with a radioisotope, and more preferably LysoPS labeled with [ 3 H].
  • LysoPS in the present invention includes known derivatives thereof.
  • the “screening for LysoPS receptor antagonist” of the present invention can be carried out by a known method, for example, GTP ⁇ S binding assay, GTPase activity assay or various functional assays (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-089176).
  • various functional assays include, for example, contacting LysoPS and a test substance with H963-expressing cells, and responding to cells via H963, such as arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, It can be carried out by measuring intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH reduction, cell proliferation activity, reporter gene expression level, and the like.
  • a cell response via H963 is sometimes referred to as an H963 activation signal.
  • the functional assay for detecting intracellular Ca 2+ release directly measures the increase in intracellular Ca 2+ concentration that is released when H963 and G ⁇ 16 co-expressing cells are stimulated with LysoPS. This can be done by detecting manually or indirectly.
  • the increase in intracellular Ca 2+ concentration can be detected directly using, for example, a calcium-binding fluorescent reagent (eg, fura-2 AM or Fluo-3 AM), or intracellular Ca 2+. It can also be detected indirectly by analyzing the transcriptional activity of a gene whose transcription amount is regulated depending on the concentration (for example, a gene having a TRE response element inserted upstream of the luciferase gene).
  • whether or not the test substance is an H963 antagonist is determined by determining the intracellular Ca 2+ concentration by LysoPS stimulation when the cells are contacted with the test substance in the presence of a constant concentration of LysoPS. It can be determined whether or not the increase is inhibited or suppressed by the test substance, and further whether or not it is significantly inhibited or suppressed. An increase in intracellular Ca 2+ concentration due to LysoPS when the cells are contacted with LysoPS in the absence of the test substance is selected as a control.
  • a functional assay for detecting phosphorylation of an intracellular protein (for example, ERK) is, for example, an intracellular protein induced when a H963-expressing cell is stimulated with LysoPS. It can be performed by detecting phosphorylation.
  • phosphorylation of ERK can be detected by a known method or a method described in Examples, for example, ELISA or EIA.
  • whether or not the test substance is an H963 antagonist is determined by the Ca 2+ assay example described above.
  • the final concentration of LysoPS added to H963-expressing cells or H963 and G ⁇ 16 co-expressing cells is preferably the minimum concentration at which the signal detected in the various functional assays is at the maximum level, for example, about 10 to 40 ⁇ M. In particular, about 10-20 ⁇ M is more preferred for the Ca 2+ assay.
  • the binding assay can be performed by a known method, for example, the method disclosed in JP-A-2001-245666, using LysoPS labeled with a radioisotope or the like and the membrane fraction of H963-expressing cells.
  • test substance examples include synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the LysoPS receptor antagonist in the present invention can be a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases that are already known to involve LysoPS, for example, allergic diseases. Furthermore, it can also serve as an agent for preventing and / or treating the onset of diseases, such as sepsis or septic shock, in which LysoPS, particularly 2-acyl LysoPS, is selectively involved in the present invention.
  • the method for measuring the position isomer of LysoPS according to the present invention is a method in which 1-acyl LysoPS and 2-acyl LysoPS in a test sample are separated and measured.
  • the Bligh & Dyer method (Biochem. Physiol., 37, 911-917 (1959)) used for extraction of lipids from test samples has been very difficult to quantitatively analyze.
  • an appropriate amount of an organic acid or inorganic acid or saturated saline is added to a test sample in advance, and then a total lipid containing LysoPS is tested by the Bligh & Dyer method or a method equivalent thereto.
  • Extract from sample use octadecylsilylated silica gel column (ODS column) as separation / analysis column in high performance liquid chromatography (HPLC), etc., use phosphate and ammonium acetate aqueous solution of appropriate concentration as aqueous mobile phase Therefore, it was possible to separate and measure LysoPS positional isomers, which was difficult with the conventional method.
  • ODS column octadecylsilylated silica gel column
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • test sample may be any water-soluble sample, but preferably a plasma or serum sample.
  • the organic acid or inorganic acid or saturated saline solution added to the test sample in advance is more preferably formic acid or acetic acid, more preferably acetic acid, and the addition amount is preferably such that the final concentration is about 1%.
  • the final concentration is a concentration with respect to the total amount of water / methanol / chloroform solution in the extraction / separation operation by the Bligh & Dyer method. By this operation, it becomes possible to improve the extraction efficiency of the total lipid containing LysoPS into the organic layer by about 5 to 10 times or more.
  • the sample extracted by the above method can be separated by on-line or off-line high performance liquid chromatography (HPLC), ultra high performance liquid chromatography (UPLC), or medium to high pressure liquid chromatography (FPLC). it can.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • UPLC ultra high performance liquid chromatography
  • FPLC medium to high pressure liquid chromatography
  • the detection of LysoPS can be performed by a method comprising a combination of various liquid chromatography and a mass spectrometer, a diode array detector, or a fluorescence detector.
  • a method comprising a combination of liquid chromatography and a mass spectrometer include, for example, liquid chromatography and tandem mass spectrometry (eg, LC / MS / MS, LC / MS / MS, etc.) or liquid chromatography Examples thereof include a mass spectrometry (LC / MS) method, and the LC / MS / MS method or a method described in Example 5 corresponding thereto is preferred.
  • the mass spectrometer a double-focusing magnetic field mass spectrometer, an ion trap mass spectrometer, a quadrupole mass spectrometer, or the like is used.
  • a reverse phase column can be used, but preferably an ODS column, more preferably a 3 ⁇ ODS column (for example, UNISON UK-C18, 3.0 ⁇ m).
  • ODS column preferably a 3 ⁇ ODS column
  • a 3 ⁇ ODS column for example, UNISON UK-C18, 3.0 ⁇ m.
  • an acetonitrile-methanol mixed solution for the active mobile phase.
  • the phosphate concentration of the aqueous mobile phase is preferably about 1 mM.
  • concentration gradient and flow rate at the time of separation measurement are not particularly limited because they vary depending on the diameter and length of various separation columns, the size of the gel, etc., but the examples described in Table 1 of Example 5 Is preferred.
  • the measurement method according to the present invention is not limited to the positional isomer of LysoPS, but also the positional isomers of lipids such as lysophosphatidic acid, lysophosphatidylinositol, lysophosphatidylethanolamine, lysophosphatidylglycerol or monoacylglycerol, It can also be used to measure lipids having a glycerol skeleton and analogs in the central skeleton.
  • Example 1 Preparation of H963 Expression Vector Using the subcloning vector containing H963 cDNA cloned based on Patent Document 1 as a template, the following forward primer 1 (SEQ ID NO: 1) and 2 (SEQ ID NO: 2) and reverse primer ( SEQ ID NO: 3); Forward primer 1: 5'-aaaactcatctcagaagaggatctgacaaacagttcgttcttctg-3 ' Forward primer 2: 5'-ccgaattcgccgccaccatggaacaaaactcatctcagaagag- gatctg-3 ' Reverse primer: 5'-ccgcggccgcttatgcattattttcacatc-3 ' PCR reaction [96 ° C., 1 minute ⁇ (98 ° C., 10 seconds ⁇ 45 to 60 ° C., 30 seconds
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells Toyobo
  • E. coli DH5 ⁇ was isolated.
  • the vector was prepared by extraction and purification from E. coli DH5 ⁇ cultured in ampicillin-LB medium.
  • Example 2 Preparation of H963-expressing cells, H963 and G ⁇ 16-expressing cells According to the package insert of Cell Line Nucleofector Kit T (Amaxa), the H963 expression vector (2 ⁇ g) prepared in Example 1 using Nucleofector II (same as right) was transfected into 1 ⁇ 10 6 CHO-K1 cells. Furthermore, in F-12 medium (containing 10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 0.25 ⁇ g / mL amphotericin B and 5 ⁇ g / mL blasticidin) at 37 ° C. under 5% CO 2 . After culturing for 2 weeks, a CHO-K1 cell clone that stably expresses H963 by FACS (hereinafter abbreviated as H963-expressing CHO-K1 cell line) was isolated.
  • F-12 medium containing 10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g /
  • the H963 expression vector was introduced into 1 ⁇ 10 6 G16 / NFAT-bla CHO-K1 cells (Invitrogen). Furthermore, DMEM medium (10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 0.25 ⁇ g / mL amphotericin B, 5 ⁇ g / mL blasticidin, 400 ⁇ g / mL geneticin, 100 ⁇ mol / L non-essential amino acids, 1 mmol / L HEPES And a G16 / NFAT-bla CHO-K1 cell clone (hereinafter referred to as H963 /) that stably expresses H963 by FACS in about 2 weeks at 37 ° C.
  • H963 / G16 / NFAT-bla CHO-K1 cell clone
  • Example 3 ERK phosphorylation assay 3.5 ⁇ 10 4 / 100 ⁇ L of H963 expression CHO-K1 cell lines 37 ° C., and cultured overnight at 5% CO 2 under after removing the culture supernatant, the final concentration Stimulation was performed with 30 ⁇ mol / L C18: 1-LysoPS.
  • LysoPS showed enhanced phosphorylation of ERK in the H963-expressing CHO-K1 cell line (FIG. 1). This result indicates that LysoPS is a ligand for H963.
  • Example 4 Ca 2+ assay 3.5 ⁇ 10 4 / 100 ⁇ L of H963 / G ⁇ 16 expression CHO-K1 cell line 37 ° C., and cultured overnight at 5% CO 2 under after removing the culture supernatant, 100 [mu] L DMEM / F12 medium (5 ⁇ mol / L Fura-2 AM, 10% FBS, 20 mmol / L HEPES, containing 2.5 mmol / L probenecid) was added. Furthermore, after culturing at 37 ° C.
  • the plate is washed 3 times with assay buffer (5 mmol / L HEPES, 2.5 mmol / L probenecid-containing Hanks equilibration salt solution), and 60 ⁇ L assay buffer is added. did.
  • assay buffer 5 mmol / L HEPES, 2.5 mmol / L probenecid-containing Hanks equilibration salt solution
  • 60 ⁇ L assay buffer is added. did.
  • the final concentration of 0-20 ⁇ M LysoPS-containing assay buffer was added, and the increase in intracellular calcium concentration before and after the addition was measured at excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm, and fluorescence wavelength of 500 nm.
  • the increase in intracellular Ca 2+ concentration was evaluated by the measurement ratio at each excitation wavelength (fluorescence ratio at excitation 340 nm / 380 nm).
  • LysoPS showed an increase in intracellular Ca 2+ concentration in the H963 / G ⁇ 16-expressing CHO-K1 cell line (FIG. 2).
  • Example 5 Measurement of LysoPS in LPS-stimulated sepsis animal model C57BL / 6 mice (8- week- old female, Charles River Japan, Ltd.), physiological saline or 10 mg / kg LPS (lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich) was intraperitoneally administered, and 6 hours later, the abdomen was opened under ether anesthesia, and blood was collected from the abdominal vena cava. The collected blood was centrifuged at 4 ° C. and 8000 G for 3 minutes to separate plasma and stored at ⁇ 80 ° C.
  • Dispense 5 ⁇ L of a 2 mg / mL ascorbic acid aqueous solution into a siliconized glass tube add 100 ⁇ L of the collected test plasma, 4.0 ⁇ g / mL of C16: 1-ccPA methanol solution and 6 ⁇ L of acetic acid sequentially, and then at room temperature for 2 minutes Stir. Further, 125 ⁇ L of chloroform was added and stirred for 1 minute, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • the recovered chloroform was combined and the solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved by adding chloroform (100 ⁇ L), methanol (60 ⁇ L), and dimethyl sulfoxide (40 ⁇ L), and centrifugal filtration (4 ° C., 4 ° C., Low Binding PTFE, 0.45 ⁇ m). 2500 times / minute, 15 minutes), and then subjected to LC / MS / MS measurement under the following conditions.
  • the LysoPS concentration was calculated from the ratio to a predetermined amount of internal standard C16: 1-ccPA.
  • the screening method for a LysoPS receptor antagonist that is, an H963 antagonist according to the present invention is useful for the development of a pharmaceutical that can be applied to the onset prevention and / or treatment of sepsis and septic shock.
  • Sequence number 1 primer. Sequence number 2: Primer. Sequence number 3: Primer.

Abstract

　本発明の課題は、オーファン受容体であったＨ９６３のリガンドを同定して、その拮抗剤のスクリーニング方法を提供し、さらにその拮抗剤の用途を提供することにある。 　本発明は、Ｈ９６３がＬｙｓｏＰＳ受容体であることの発見を通じて、その拮抗剤のスクリーニング方法を提供し、ならびに血中ＬｙｓｏＰＳ位置異性体の測定に基づき、特定の異性体と敗血症との関連性を見出すことにより、その受容体拮抗剤が敗血症および敗血症性ショックなどの発症予防および／または治療剤になり得ることを提供する。

Description

新規リゾホスファチジルセリン受容体
　本発明は、Ｈ９６３のリゾホスファチジルセリン（以下、ＬｙｓｏＰＳと略す。）受容体としての使用方法に関する。
　Ｈ９６３は、そのリガンドや機能、さらには関連する疾患が全く解明されていない、いわゆるオーファン受容体であり、その解析が希求されているＧ蛋白質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲと略す。）の一つであった（特許文献１）。
　一方、ＬｙｓｏＰＳは、ホスファチジルセリンがホスホリパーゼＡ１あるいはＡ２によって加水分解されて生成するリゾリン脂質であり、脂肪酸の位置、炭素鎖数および飽和度によって様々な種類が存在する。その生理作用としては、コンカナバリンＡやＩｇＥ受容体を介した抗原刺激、神経成長因子による脱顆粒誘導反応を増強することが示されており、肥満細胞の活性化作用を介した、いわゆるＩ型（即時型）アレルギー反応において重要な働きをもつことが報告されている（非特許文献１、２および３）。
　これまで、ＬｙｓｏＰＳ受容体として、ＧＰＣＲであるＧＰＲ３４が報告されているが（特許文献２、３および非特許文献４）、Ｈ９６３がＬｙｓｏＰＳ受容体として機能することは全く報告されていない。また、その拮抗剤が敗血症や敗血症性ショックなどの治療に適用できることの報告もない。
　一方、ＬｙｓｏＰＳの位置異性体、特に、１－アシル体と２－アシル体による生理機能が異なることが示唆されている（非特許文献５）。そのような生理機能の解析を進める上で、上記位置異性体の血中量の測定は不可欠である。しかしながら、アシル転移反応による異性化により、それら異性体の血中量の正確な測定は困難であった。これまでに唯一、リゾホスファチジルコリンでの測定例が報告されているのみであり（非特許文献６）、ＬｙｓｏＰＳについての報告はない。
国際公開第９８／０７８５９号パンフレット 特開第２００４－８９１７６号公報 国際公開第２００６／０８８２４６号パンフレット
Ｎａｔｕｒｅ，１９７９年，第２７９巻、ｐ．２５０－２５２頁 ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，１９７９年，第１０５巻，５８－６２頁 ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，１９８２年，第１３８巻，ｐ．１９０－１９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６年，第３４１巻，ｐ．１０７８－１０８７ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，２００２年，第１５８２巻，ｐ．２６－３２ ＪＡＯＣＳ，２００１年，第７８巻，第１０号，ｐ．１００７－１０１１
　本発明の目的は、オーファン受容体であったＨ９６３のリガンドを同定して、その拮抗剤のスクリーニング方法を提供し、さらにその拮抗剤の用途を提供することにある。
　本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｈ９６３のリガンドとしてＬｙｓｏＰＳを同定することにより、その拮抗剤のスクリーニング方法を開発した。
　さらに、本発明者らは、血中ＬｙｓｏＰＳの位置異性体の測定により、特定の異性体と敗血症との関連性を見出して、その受容体拮抗剤が敗血症や敗血症性ショックなどの発症予防および／または治療に適用できることを新たに見出して、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　ＬｙｓｏＰＳ受容体としてのＨ９６３の使用。
［２］　ＬｙｓｏＰＳが、Ｃ１８：１－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ１８：２－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２０：４－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２２：５－ＬｙｓｏＰＳおよびＣ２２：６－ＬｙｓｏＰＳから選択される一以上である上記［１］記載のＨ９６３の使用。
［３］　ＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤のスクリーニングにおける上記［２］記載のＨ９６３の使用。
［４］　ＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤のスクリーニングが、以下の工程からなる上記［３］記載のＨ９６３の使用；
　（Ａ）Ｈ９６３発現細胞と被験物質を接触させる工程、
　（Ｂ）さらに、最終濃度が約１０～４０μＭとなるようＬｙｓｏＰＳを添加する工程および
　（Ｃ）前記被験物質存在下におけるＨ９６３活性化シグナルと、被験物質非存在下における同シグナルを比較し、ＬｙｓｏＰＳ添加によるＨ９６３の活性化を抑制する被験物質を選択する工程。
［５］　Ｈ９６３活性化シグナルが、ＥＲＫのリン酸化の亢進である上記［４］記載のＨ９６３の使用。
［６］　Ｈ９６３発現細胞が、さらにＧα１６を発現する細胞である上記［４］記載のＨ９６３の使用。
［７］　Ｈ９６３活性化シグナルが、細胞内Ｃａ２＋濃度の増加である上記［６］記載のＨ９６３の使用。
［８］　ＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤が、敗血症または敗血症性ショックの発症予防および／または治療剤である上記［３］記載のＨ９６３の使用。
　本発明は、敗血症や敗血症性ショックなどの発症予防および／または治療に使用し得るＨ９６３拮抗剤を提供することを可能とする。
ＬｙｓｏＰＳ刺激によるＥＲＫのリン酸化の亢進を表わす。 ＬｙｓｏＰＳ刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を表わす。 ＬＰＳ刺激敗血症動物モデルにおいて、ＬＰＳ刺激による２－アシル体　ＬｙｓｏＰＳの血中量の変動を表わす。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明においてＨ９６３は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ４７７６３．１で特定されるタンパク質またはその部分タンパク質である。ここで、Ｈ９６３の部分タンパク質とは、リガンド結合強度、特異性および／またはそのリガンド結合に伴い誘導される細胞内シグナルの程度と種類が、前記ＡＡＬ４７７６３．１で特定されるＨ９６３と同等あるいは同じであるものに限られる。
　本発明においてＧα１６は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３５８６０．１で特定されるタンパク質またはその部分タンパク質である。ここで、Ｇα１６の部分タンパク質は、少なくともＨ９６３と相互作用し、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）と結合する領域を持ち、さらに、エフェクターであるホスホリパーゼβ（ＰＬＣβ）と相互作用する領域を含むものであればいずれのものでもよい。
　本発明において、Ｈ９６３もしくはＧα１６またはそれらの部分タンパク質は、他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現させてもよい。融合する他のタンパク質部分またはペプチド部分は、Ｈ９６３もしくはＧα１６との融合タンパク質の発現の確認または発現細胞の精製・単離のためのタグとして利用することができる。例えば、ｍｙｃ、免疫グロブリンＦｃ部分、ヒスチジンタンデム（６ｘＨｉｓ）などを利用することができる。
　本発明にかかるＨ９６３やＧα１６の各々をコードするｃＤＮＡは、種々の公知の方法または実施例記載の方法によって得ることができる。例えば、Maniatisら，"Molecular Cloning-A Laboratory Manual"，ColdSpring Harbor Laboratory, NY, 1982年などに従って、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーションによるクローニングにより、各々を発現する適当なライブラリーから単離することができる。
　発現ベクターは、公知の方法または実施例記載の方法で、クローニングされた各々のｃＤＮＡを動物細胞で機能するプロモーター下に挿入して調製することができる。ここで、発現ベクターとして、例えば、商用のものを利用することができる。
　本発明においてＨ９６３発現細胞としては、例えば、天然にＨ９６３を発現する哺乳動物細胞あるいはＨ９６３発現ベクターにより一過的あるいは恒常的に形質転換され、Ｈ９６３を発現する哺乳動物細胞が挙げられる。天然にＨ９６３を発現する哺乳動物細胞としては、例えば、マスト細胞（例えば、臍帯血由来培養ヒト肥満細胞（ＣＢＭＣ））などが挙げられる。
　本発明においてＨ９６３およびＧα１６共発現細胞としては、例えば、Ｈ９６３発現ベクターおよびＧα１６発現ベクターにより一過的あるいは恒常的に形質転換され、Ｈ９６３およびＧα１６を発現する哺乳動物細胞が挙げられる。
　ここで、Ｈ９６３発現ベクターおよび／またはＧα１６発現ベクターにより形質転換され、Ｈ９６３および／またはＧα１６を発現する哺乳動物細胞の宿主としては、例えば、ＣＯＳ－７細胞、ＣＯＳ－１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、マウスＬ細胞およびヒトＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。
　Ｈ９６３発現細胞は、その発現ベクターが公知の方法または実施例記載の方法で宿主細胞に導入され、必要により、安定的に形質転換した細胞を選別することによって作製することができる。また、Ｈ９６３およびＧα１６共発現細胞も、公知の方法、例えば、特開２００３－２５０５５１に記載の方法または実施例記載の方法で作製できる。
　本発明におけるＬｙｓｏＰＳは、一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Ｒ１は、Ｃ１２～２６のアルキルカルボニル基またはＣ１２～２６のアルケニルカルボニル基を表わす。）または一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ２はＲ１と同じ意味を表わす。）で示されるリゾリン脂質である。ここで、
「Ｃ１２～２６のアルキルカルボニル基」中の「アルキル」としては、例えば、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシルまたはペンタコシルなどの直鎖状のＣ１１～２５のアルキル基が挙げられる。また、「Ｃ１２～２６のアルケニルカルボニル基」中の「アルケニル」としては、例えば、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、イコセニル、ヘニコセニル、ドコセニル、トリコセニルまたはテトラコセニル基などの直鎖状のＣ１１～２５のアルケニル基が挙げられる。一方、本明細中、Ｒ１またはＲ２がそれぞれ表わすＣ１２～２６のアルキルカルボニル基またはＣ１２～２６のアルケニルカルボニル基の炭素鎖の炭素数と二重結合数とを用いて、例えば、炭素数が１８であり、二重結合数が１である本発明のＬｙｓｏＰＳをＣ１８：１－ＬｙｓｏＰＳと、そのＲ１またはＲ２をＣ１８：１－アルケニルカルボニル基というように表記することもある。また、本明細書中、一般式（Ｉ）で示されるＬｙｓｏＰＳを、１－アシル　ＬｙｓｏＰＳ、一般式（ＩＩ）で示されるＬｙｓｏＰＳを、２－アシル　ＬｙｓｏＰＳと表記することもある。
　本発明におけるＬｙｓｏＰＳとして好ましくは、一般式（Ｉａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｒ１ａはＲ１と同じ意味を表わす。）または一般式（ＩＩａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ２ａはＲ２と同じ意味を表わす。）で示されるものであり、より好ましくは、Ｒ１ａまたはＲ２ａがそれぞれＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：１、Ｃ２０：２、Ｃ２０：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５、Ｃ２２：１、Ｃ２２：２、Ｃ２２：３、Ｃ２２：４、Ｃ２２：５もしくはＣ２２：６－アルケニルカルボニル基で表わされる上記式（Ｉａ）または（ＩＩａ）のＬｙｓｏＰＳが挙げられ、さらに好ましくは、Ｒ１ａまたはＲ２ａがそれぞれＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２０：４、Ｃ２２：５もしくはＣ２２：６－アルケニルカルボニル基で表わされる上記式（Ｉａ）または（ＩＩａ）のＬｙｓｏＰＳが挙げられる。
　本発明にかかる一般式（Ｉａ）または（ＩＩａ）で表わされるＬｙｓｏＰＳのＲ１ａまたはＲ２ａでそれぞれ表わされるＣ１２～２６のアルケニルカルボニル基における炭素原子間の二重結合の位置は特に限定されない。
　本発明におけるＬｙｓｏＰＳには標識したものも含まれる。標識物質としては、例えば、放射性同位元素（例えば、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］、［１４Ｃ］、［３２Ｐ］、［３５Ｓ］など）、蛍光物質（例えば、フルオレセインなど）、発光物質（例えば、ルミノールなど）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼなど）、ランタニド元素などが挙げられる。ここで、標識されたＬｙｓｏＰＳとして好ましくは、放射性同位元素で標識されたＬｙｓｏＰＳであり、さらに好ましくは［３Ｈ］で標識されたＬｙｓｏＰＳが挙げられる。
　また、本発明におけるＬｙｓｏＰＳには、その公知の誘導体も含まれる。
　なお、本明細書中、記号
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
は当業者にとって明らかなように、β配置を表わし、記号
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
は、α配置を表わし、記号
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
はα配置とβ配置との任意の割合の混合物であることを表わす。
　本発明の「ＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤のスクリーニング」は、公知の方法、例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイ、ＧＴＰａｓｅ活性測定法または各種機能アッセイ（特開２００４－０８９１７６）で実施できる。特に、各種機能アッセイとしては、例えば、ＬｙｓｏＰＳと被験物質をＨ９６３発現細胞に接触させ、Ｈ９６３を介した細胞の応答、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｐＨの低下、細胞増殖活性、またはレポーター遺伝子の発現量などを測定することにより実施できる。なお、本明細書中、Ｈ９６３を介した細胞の応答をＨ９６３活性化シグナルと表記することもある。
　本発明において、細胞内Ｃａ２＋遊離を検出する機能アッセイ（以下、Ｃａ２＋アッセイとする。）は、Ｈ９６３およびＧα１６共発現細胞をＬｙｓｏＰＳ刺激したときに遊離される細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を直接的あるいは間接的に検出することによって行うことができる。ここで、細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ－２　ＡＭまたはＦｌｕｏ－３　ＡＭなど）を用いて直接的に検出することもできるし、細胞内Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子（例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にＴＲＥ応答配列を挿入した遺伝子）の転写活性を分析することにより間接的に検出することもできる。
　Ｃａ２＋アッセイにおいて、被験物質がＨ９６３拮抗物質であるか否かの判定は、前記細胞と被験物質とを一定濃度のＬｙｓｏＰＳの共存下において接触させた場合に、ＬｙｓｏＰＳ刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の増加が、前記被験物質により阻害あるいは抑制されるか否か、さらには有意に阻害あるいは抑制されるか否かで判定できる。なお、前記細胞とＬｙｓｏＰＳとを被験物質の非存在下において接触させた場合のＬｙｓｏＰＳによる細胞内Ｃａ２＋濃度の増加をコントロールとして選択する。
　本発明において、細胞内蛋白質（例えば、ＥＲＫなど）のリン酸化を検出する機能アッセイ（以下、リン酸化アッセイとする。）は、例えば、Ｈ９６３発現細胞をＬｙｓｏＰＳ刺激したときに誘導される細胞内蛋白質のリン酸化を検出することによって行うことができる。例えば、ＥＲＫのリン酸化は、公知の方法または実施例記載の方法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡなどにより検出できる。ＥＲＫのリン酸化アッセイにおいて、被験物質がＨ９６３拮抗物質であるか否かの判定は、上記のＣａ２＋アッセイの例による。
　各種機能アッセイにおいて、Ｈ９６３発現細胞あるいはＨ９６３およびＧα１６共発現細胞に添加されるＬｙｓｏＰＳの最終濃度は、各種機能アッセイで検出されるシグナルが最大レベルとなる最小濃度、例えば、約１０～４０μＭが好ましく、特に、Ｃａ２＋アッセイでは約１０～２０μＭがより好ましい。
　また、Ｈ９６３結合物質を結合アッセイでスクリーニングし、その中から上記方法により、Ｈ９６３拮抗物質を選択することもできる。結合アッセイは、放射性同位元素などで標識したＬｙｓｏＰＳと、Ｈ９６３発現細胞の膜画分を用いて、公知の方法、例えば、特開２００１－２４５６６６に開示された方法で実施できる。
　被験物質としては、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられる。
　本発明におけるＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤、すなわちＨ９６３拮抗剤は、ＬｙｓｏＰＳが関与することが既に知られている疾患、例えば、アレルギー性疾患の予防および／または治療剤となり得る。さらに、本発明におけるＬｙｓｏＰＳ、特に、２－アシル　ＬｙｓｏＰＳが選択的に関与する疾患、例えば、敗血症もしくは敗血症性ショックの発症予防および／または治療剤にもなり得る。
　本発明にかかるＬｙｓｏＰＳの位置異性体測定法は、被検サンプル中の１－アシル　ＬｙｓｏＰＳと２－アシル　ＬｙｓｏＰＳを分離して測定する方法である。
　従来、被検サンプルからの脂質の抽出に用いられるＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法(Biochem. Physiol., 37, 911-917(1959))は抽出効率が非常に低いため、その定量的分析は困難であった。本発明にかかる測定法は、あらかじめ被検サンプルに適当量の有機酸もしくは無機酸あるいは飽和食塩水を添加しておき、続いて、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法あるいはこれに準ずる方法でＬｙｓｏＰＳを含む総脂質を被検サンプルから抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などでの分離・解析カラムとしてオクタデシルシリル化シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を使用し、水性移動相として適当濃度のリン酸塩および酢酸アンモニウム水溶液を使用することにより、従来法では困難であったＬｙｓｏＰＳ位置異性体の分離測定を可能とした。
　ここで、被検サンプルとしては、水溶性の何れのサンプルでもよいが、好ましくは血漿あるいは血清サンプルが挙げられる。
　あらかじめ被検サンプルに添加される有機酸もしくは無機酸あるいは飽和食塩水としてより好ましくは、ギ酸または酢酸であり、さらに好ましくは酢酸であり、その添加量は最終濃度が約１％となる量が好ましい。ここで、最終濃度とは、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法での抽出・分離操作における水／メタノール／クロロホルム溶液の総量に対する濃度である。この操作により、ＬｙｓｏＰＳを含む総脂質の有機層への抽出効率を約５～１０倍以上改善させることが可能となる。
　本発明にかかる測定法において、上記方法による抽出サンプルは、オンラインあるいはオフラインの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）または中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）などにより分離することができる。
　さらに、その被検対象であるＬｙｓｏＰＳの検出は、各種液体クロマトグラフィーと質量分析計、ダイオードアレイ検出計もしくは蛍光検出計との組み合わせからなる方法で実施することができる。液体クロマトグラフィーと質量分析計との組み合わせからなる方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなど）法または液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法などが挙げられるが、好ましくは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法あるいはこれに準ずる実施例５記載の方法である。ここで、質量分析計としては、二重収束磁場型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、四重極型質量分析計などが用いられる。
　ＨＰＬＣなどにおいて使用される分離・解析カラムとしては、例えば、逆相系カラムを用いることができるが、好ましくはＯＤＳカラム、より好ましくは３μＯＤＳカラム（例えば、Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｃ１８，３．０μｍなど）を用いることができる。さらに、その移動相のうち、水性移動相には約０．０１～５ｍＭのリン酸塩および約１～１００ｍＭの有機酸アンモニウム、特に同濃度の酢酸アンモニウムを含む水溶液を用いるのが好ましく、有機溶媒性移動相にはアセトニトリル－メタノール混合溶液を用いるのが好ましい。特に水性移動相のリン酸塩濃度を約１ｍＭとすることが好ましい。以上のような移動相の選択により、被検対象の溶解性と高いイオン化効率の改善が期待でき、ＬｙｓｏＰＳの位置異性体の分離の向上につながる。なお、分離測定時の濃度勾配および流速は、各種分離カラムの口径や長さ、ゲルのサイズなどにより種々変化するため、特に限定されるものではないが、実施例５の表１に記載の例が好ましい。
　なお、本発明にかかる測定法は、ＬｙｓｏＰＳの位置異性体のみならず、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロールまたはモノアシルグリセロールなどの脂質の各位置異性体、さらにはグリセロール骨格およびその類似体を中心骨格に有する脂質の測定にも用いることができる。
　以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：Ｈ９６３発現ベクターの作製
　特許文献１に基づきクローニングされたＨ９６３ｃＤＮＡを含むサブクローニングベクターを鋳型とし、以下のフォーワードプライマー１（配列番号：１）および２（配列番号：２）とリバースプライマー（配列番号：３）;
フォーワードプライマー１：5'-aaaactcatctcagaagaggatctgacaaacagttcgttcttctg-3'
フォーワードプライマー２：5'-ccgaattcgccgccaccatggaacaaaaactcatctcagaagag-
gatctg-3'
リバースプライマー　　　：5'-ccgcggccgcttatgcattattttcacatc-3'
を用いて、ＰＣＲ反応［９６℃，１分間→（９８℃，１０秒→４５～６０℃，３０秒→７２℃，９０秒）を３５サイクル→７２℃，１０分間］を行い、所望の末端構造を有するＤＮＡ断片を増幅させた。これを発現ベクター（pEF6/V5-His TOPO：Invitrogen社）にライゲーションさせ、これを公知の方法により、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（東洋紡）に導入し、その中から適切にＨ９６３を発現し得るベクターを有する大腸菌ＤＨ５αを単離した。同ベクターの調製はアンピシリン－ＬＢ培地で培養した同大腸菌ＤＨ５αから抽出・精製して行った。
実施例２：Ｈ９６３発現細胞、Ｈ９６３およびＧα１６発現細胞の作製
　Cell Line Nucleofector Kit T（Amaxa社）の添付文書に従い、Nucleofector II（右同）にて、実施例１で作製したＨ９６３発現ベクター（２μｇ）を、１×１０６個のＣＨＯ－Ｋ１細胞に遺伝子導入した。さらに、Ｆ－１２培地（１０％　ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン，１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン，０．２５μｇ／ｍＬ　アムホテリシンＢおよび５μｇ／ｍＬ　ブラストサイジン含有）中、３７℃、５％ＣＯ２下にて約２週間培養し、ＦＡＣＳにて安定的にＨ９６３を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞クローン（以下、Ｈ９６３発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株と略す。）を単離した。
　前記方法に従い、１×１０６個のＧ１６／ＮＦＡＴ－ｂｌａ　ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Invitrogen社）に同Ｈ９６３発現ベクターを遺伝子導入した。さらに、ＤＭＥＭ培地（１０％　ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン，１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン，０．２５μｇ／ｍＬ　アムホテリシンＢ，５μｇ／ｍＬ　ブラストサイジン，４００μｇ／ｍＬ　ジェネティシン，１００μｍｏｌ／Ｌ　非必須アミノ酸，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳおよび１００μｇ／ｍＬ　ゼオシン含有）中、３７℃、５％ＣＯ２下にて約２週間培養し、ＦＡＣＳにて安定的にＨ９６３を発現するＧ１６／ＮＦＡＴ－ｂｌａ　ＣＨＯ－Ｋ１細胞クローン（以下、Ｈ９６３／Ｇα１６発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株と略す。）を単離した。
実施例３：ＥＲＫリン酸化アッセイ
　３．５×１０４／１００μＬのＨ９６３発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株を３７℃、５％ＣＯ２下にて一晩培養し、培養上清を除いた後、最終濃度３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｃ１８：１－ＬｙｓｏＰＳで刺激した。１０分後、培養上清を除き、１回洗浄した後、５０μＬ／ウェル　RIPA Cell Lysis Buffer 2 Inhibitors（Assay designs社）および１５０μＬ／ウェル　Assay Buffer 21 plus Inhibitors（右同）をそれぞれ添加して撹拌した。その細胞懸濁液１００μＬ／ウェルをpERK Standards（０～２０００ｐｇ／ｍＬ）（右同）とともにERK Microtiter Plate（Assay designs社）にそれぞれ添加し、Phospho-ERK1/2 Enzyme Immunometric Assay Kit（Assay designs社）添付文書に従い、プレートリーダーSPECTRA MAX250（Molecular Devices社）を用いて、吸光度（450nm）を測定した。ＥＲＫリン酸化率（％）は、４５０ｎｍで測定した吸光度（ｐＥＲＫ値）を用いて、以下の式にて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
［結果］ＬｙｓｏＰＳにより、Ｈ９６３発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株でのＥＲＫのリン酸化の亢進が認められた（図１）。この結果は、ＬｙｓｏＰＳがＨ９６３のリガンドであることを示している。
実施例４：Ｃａ ２＋ アッセイ
　３．５×１０４／１００μＬのＨ９６３／Ｇα１６発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株を３７℃、５％ＣＯ２下にて一晩培養し、培養上清を除いた後、１００μＬ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（５μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｕｒａ－２　ＡＭ，１０％　ＦＢＳ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　プロベネシド含有）を添加した。さらに、３７℃、５％ＣＯ２下にて１時間培養したのち、アッセイバッファー（５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　プロベネシド含有ハンクス平衝塩溶液）で３回洗浄し、６０μＬ　アッセイバッファーを添加した。３０分間、遮光、室温下にて静置したのち、最終濃度０～２０μＭ　ＬｙｓｏＰＳ含有アッセイバッファーを添加し、添加前後の細胞内カルシウム濃度の増加を励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ、蛍光波長５００ｎｍで測定した。細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を各励起波長での測定比（励起３４０ｎｍ／３８０ｎｍでの蛍光比）で評価した。なお、ポジティブコントロールとして、最終濃度３μＭ　ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）溶液を添加した。
［結果］ＬｙｓｏＰＳにより、Ｈ９６３／Ｇα１６発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株での細胞内Ｃａ２＋濃度の増加が認められた（図２）。
実施例５：ＬＰＳ刺激敗血症動物モデルにおけるＬｙｓｏＰＳの測定
　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢雌、日本チャールス・リバー株式会社）に、生理食塩水または１０ｍｇ／ｋｇ　ＬＰＳ（リポポリサッカライド、Sigma-Aldrich社）を腹腔内投与し、６時間後にエーテル麻酔下にて開腹して腹部大静脈より採血した。採取した血液は、４℃、８０００Ｇで３分間遠心して血漿を分離し、－８０℃にて保管した。
　測定当日、血漿を解凍し、内部標準としてＣ１６：１－ｃｃＰＡ（１－アシル－サイクリックホスファチジン酸：国際公開第２００２／９４２８６号）を用いて、以下の方法により、血中ＬｙｓｏＰＳ量を測定した。
　シリコナイズドガラスチューブに２ｍｇ／ｍＬ　アスコルビン酸水溶液５μＬを分注し、採取した被検血漿１００μＬ、４．０μｇ／ｍＬ　Ｃ１６：１－ｃｃＰＡ　メタノール溶液１００μＬおよび酢酸６μＬを順次添加し、室温にて２分間撹拌した。さらにクロロホルム１２５μＬを添加し、１分間撹拌した後、室温にて１０分間静置した。さらにクロロホルム１２５μＬを添加し、０．５分間撹拌し、飽和食塩水１２５μＬを添加し、さらに０．５分間撹拌した後、遠心処理（４℃，３０００回／分，１０分）し、クロロホルム層を採取した。残渣に再びクロロホルム１２５μＬを添加し、１分間撹拌した後、再度遠心分離（４℃，３０００回／分，１０分）し、クロロホルム層を採取した。回収したクロロホルムを合わせて減圧にて溶媒を除去し、残渣にクロロホルム１００μＬ、メタノール６０μＬ、ジメチルスルホキシド４０μＬを加えて溶解し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ　Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｔｅｓ　０．４５μｍ，Ｌｏｗ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ＰＴＦＥにて遠心ろ過（４℃，２５００回／分，１５分）した後、以下に示す条件にてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定に供した。ＬｙｓｏＰＳ濃度は、既定量の内部標準Ｃ１６：１－ｃｃＰＡとの比から算出した。
（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件）
　　ＨＰＬＣ装置　　　：Agilent 1100
　　オートサンプラー　：Agilent 1100 Autosampler
　　解析カラム　　　　：Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｃ１８，３．０μｍ（２ｘ１５０ｍｍ）(Imtakt社)
　　移動相　　　　　　：Ａ；２５ｍＭ　酢酸アンモニウムおよび１ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム水溶液
　　　　　　　　　　　　Ｂ；アセトニトリル：メタノール＝４：１
　　流速　　　　　　　：０．２ｍＬ／分
　　カラム温度　　　　：室温
（移動相濃度勾配）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）条件）
　　ＭＳ／ＭＳ装置　　　：4000 Q TRAP LC/MS/MS（アプライド・バイオシステムズ社）
　　イオン化モード　　　：ＥＳ＋，ＭＲＭ
　　カーテンガス　　　　：窒素
　　コリジョンガス　　　：窒素
　　デソルベーションガス：窒素
（ＭＳ／ＭＳ解析パラメーター）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［結果］ＬＰＳ刺激により、２－アシル体であるＣ１８：１－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ１８：２－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２０：４－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２２：５－ＬｙｓｏＰＳおよびＣ２２：６－ＬｙｓｏＰＳの血中濃度の上昇が確認された（図３）。一方、１－アシル体の有意な上昇は認められなかった。
　本発明にかかるＬｙｓｏＰＳ受容体拮抗剤、すなわちＨ９６３拮抗剤のスクリーニング方法は、敗血症や敗血症性ショックなどの発症予防および／または治療に適用できる医薬品の開発に有用である。
配列番号１：プライマー。
配列番号２：プライマー。
配列番号３：プライマー。

Claims (8)

  1. リゾホスファチジルセリン受容体としてのＨ９６３の使用。
  2. リゾホスファチジルセリンが、Ｃ１８：１－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ１８：２－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２０：４－ＬｙｓｏＰＳ、Ｃ２２：５－ＬｙｓｏＰＳおよびＣ２２：６－ＬｙｓｏＰＳから選択される一以上である請求項１記載のＨ９６３の使用。
  3. リゾホスファチジルセリン受容体拮抗剤のスクリーニングにおける請求項２記載のＨ９６３の使用。
  4. リゾホスファチジルセリン受容体拮抗剤のスクリーニングが、以下の工程からなる請求項３記載のＨ９６３の使用；
    　（Ａ）Ｈ９６３発現細胞と被験物質を接触させる工程、
    　（Ｂ）さらに、最終濃度が約１０～４０μＭとなるようリゾホスファチジルセリンを添加する工程および
    　（Ｃ）前記被験物質存在下におけるＨ９６３活性化シグナルと、被験物質非存在下における同シグナルを比較し、リゾホスファチジルセリン添加によるＨ９６３の活性化を抑制する被験物質を選択する工程。
  5. Ｈ９６３活性化シグナルが、ＥＲＫのリン酸化の亢進である請求項４記載のＨ９６３の使用。
  6. Ｈ９６３発現細胞が、さらにＧα１６を発現する細胞である請求項４記載のＨ９６３の使用。
  7. Ｈ９６３活性化シグナルが、細胞内Ｃａ２＋濃度の増加である請求項６記載のＨ９６３の使用。
  8. リゾホスファチジルセリン受容体拮抗剤が、敗血症または敗血症性ショックの発症予防および／または治療剤である請求項３記載のＨ９６３の使用。
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