TR201910890T4 - Anemi tedavisinde kullanılmaya yönelik GDF tuzakları. - Google Patents

Anemi tedavisinde kullanılmaya yönelik GDF tuzakları. Download PDF

Info

Publication number
TR201910890T4
TR201910890T4 TR2019/10890T TR201910890T TR201910890T4 TR 201910890 T4 TR201910890 T4 TR 201910890T4 TR 2019/10890 T TR2019/10890 T TR 2019/10890T TR 201910890 T TR201910890 T TR 201910890T TR 201910890 T4 TR201910890 T4 TR 201910890T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
polypeptide
sequence
seq
amino acids
actriib
Prior art date
Application number
TR2019/10890T
Other languages
English (en)
Inventor
Seehra Jasbir
Scott Pearsall Robert
Kumar Ravindra
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Publication of TR201910890T4 publication Critical patent/TR201910890T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/1103—Receptor protein serine/threonine kinase (2.7.11.30)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Belirli açılarda mevcut buluş, kemirgenler ve primatlar da dahil olmak üzere omurgalılarda ve özellikle insanlarda kırmızı kan hücresi ve/veya hemoglobin düzeylerini yükseltmeye yönelik bileşimler ve yöntemler sağlar.

Description

TARIFNAME ANEMI TEDAVISINDE KULLANILMAYA YÖNELIK GDF TUZAKLARI BULUSUN ALTYAPISI Olgun kirmizi kan hücresi veya eritrosit, omurgalilarin dolasim sistemlerinde oksijen tasinimindan sorumludur. Kirmizi kan hücreleri, nispeten yüksek kismi oksijen basincina (pOz) sahip akcigerlerde oksijene baglanan ve oksijeni vücudun nispeten düsük bir pOz seviyesine sahip alanlarina ulastiran bir protein olan hemoglobini yüksek konsantrasyonlarda tasir.
Olgun kirmizi kan hücreleri, eritropoiez olarak adlandirilan bir süreçte pluripotent hematopoietik kök hücrelerinden üretilir. Postnatal eritropoiez öncelikli olarak kemik Iliginde ve dalagin kirmizi pulpasinda gerçeklesir. Çesitli sinyal iletim yolaklarinin koordine etkisi, hücre proliferasyonunun, farklilasmasinin, sagkaliminin ve ölümünün dengesini kontrol eder.
Normal kosullar altinda, kirmizi kan hücreleri vücutta sabit bir kirmizi hücre kütlesi saglayacak bir hizda üretilir ve üretim, artmis veya azalmis oksijen tansiyonu veya doku talebi de dahil olmak üzere çesitli uyaranlara yanit olarak artabilir veya azalabilir. Eritropoiez süreci soya adanmis öncül hücrelerin olusumuyla baslar ve bir dizi farkli öncül hücre türü üzerinden ilerler. Eritropoiezin son asamalarinda retikülositler kari dolasimina salinir ve mitokondrilerini ve ribozomlarini kaybederken olgun kirmizi kan hücresi morfolojisini alir.
Kanda yüksek bir retikülosit düzeyi veya yüksek bir retikülositeritrosit orani, artmis kirmizi kan hücresi üretim hizlarinin bir göstergesidir.
Eritropoietin (Epo) yaygin sekilde post-natal omurgalilarda eritropoiezin en önemli pozitif regülatörü olarak bilinir. Epo, düsük doku oksijen tansiyonuna (hipoksi) ve düsük kirmizi kan hücresi düzeylerine veya düsük hemoglobin düzeylerine yönelik dengeleyici eritropoietik yaniti regüle eder. Insanlarda yüksek Epo düzeyleri, kemik iliginde ve dalakta eritroid progenitörlerin üretimini uyararak kirmizi kan hücresi olusumunu destekler. Farelerde Epo öncelikli olarak dalaktaki eritropoiezi artirir.
Hekimler tarafindan çesitli klinik ortamlarda ve özellikle anemi tedavisinde kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmek için muhtelif rekombinant Epo formlari kullanilmaktadir.
Anemi, kanda normalden düsük hemoglobin veya kirmizi kan hücresi düzeyleri ile karakterize edilen, yaygin olarak bilinen bir durumdur. Bazi durumlarda anemi, kirmizi kan hücrelerinin üretiminde veya sagkaliminda bir primer bozukluktan kaynaklanir. Daha yaygin olarak anemi, diger sistemlerdeki hastaliklara eslik eder (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1169-1175). Anemi, kirmizi kan hücrelerinin azalmis üretim hizindan veya artmis yikim hizindan veya kanamaya bagli kirmizi kan hücresi kaybindan kaynaklanabilir. Anemi örnegin kronik böbrek yetmezligi, kemoterapi tedavisi, miyelodisplastik sendrom, romatoid artrit ve kemik iligi nakli de dahil olmak üzere çesitli bozukluklardan kaynaklanabilir.
Saglikli insanlarda Epo ile tedavi tipik olarak birkaç haftalik bir süre boyunca hemoglobinlerde yaklasik 1-3 g/dL'Iik bir artisa neden olur. Bu tedavi rejimi anemik bireylere uygulandiginda çogu kez hemoglobin ve kirmizi kan hücresi düzeylerinde önemli artislar saglar ve yasam kalitesinde ve sagkalimda iyilesmelere yol açar. Epo tekdüze biçimde etkili degildir ve çogu birey yüksek dozlara bile dirençlidir (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50). Kanser hastalarinin %50'sinden fazlasi Epo'ya karsi yetersiz bir yanit sergiler, son evre böbrek hastaligi olan hastalarin yaklasik olarak %10'u yetersiz yanit gösterir (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425) ve miyelodisplastik sendromu olan hastalarin %10'undan azi olumlu yanit verir (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67). Inflamasyon, demir ve vitamin eksikligi, yetersiz diyaliz, alüminyum toksisitesi ve hiperparatiroidizm gibi birtakim faktörler yetersiz bir terapötik yanita neden olabilir, Epo'ya karsi direncin moleküler mekanizmalari henüz belirsizdir.
Dolayisiyla, mevcut tarifnamenin bir amaci, hastalarda kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmeye yönelik alternatif bilesimler ve yöntemler saglamaktir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus istemlerde tanimlanmaktadir.
Bir birinci açida bulus, ihtiyaci olan bir hastada kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmeyi amaçlayan bir yöntemde veya bir aneminin tedavisini amaçlayan bir yöntemde kullanilmaya yönelik olarak, SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %90 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip olan, SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içeren ve bir hücre esasli analizde miyostatin ve/veya GDF-11 aracili sinyal iletimini inhibe eden bir varyant ActRIIB polipeptidi saglar.
Bulus ayrica bulusun birinci açisina göre kullanilmaya yönelik olarak bulusun birinci açisina göre bir polipeptidi içeren bir farmasötik preparat saglar.
Burada, bulusun birinci açisina göre bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asit içeren bir kültürlenmis hücre açiklanir.
Tarifname, kismen, GDF Tuzaklarinin kirmizi kan hücresi ve hemoglobin düzeylerini yükseltmek için kullanilabilecegini gösterir. GDF11 ve/veya miyostatin gibi diger ActRIIB Iigandlarina kiyasla aktivin (örnegin aktivin A ve/veya aktivin B) için anlamli ölçüde düsük bir afinite sergileyen varyant ActRIIB polipeptitleri, GDF Tuzaklari olarak adlandirilir. Burada tarif edilen ActRIIB varyantlari aksi belirtilmedikçe GDF Tuzaklaridir. Daha özel bir ifadeyle tarifname, SEO ID NO:1'in 79. pozisyonunda bir asidik kalintiya sahip ActRIIB polipeptidinin bir çözünür formu olan bir GDF Tuzaginin, in vi'vo olarak uygulandiginda, kanda kirmizi kan hücresi düzeylerini yükselttigini gösterir. Dolayisiyla tarifname, GDF Tuzaklarinin hastalarda kirmizi kan hücresi ve hemoglobin düzeylerini yükseltmek ve ihtiyaci olan hastalarda düsük kirmizi kan hücresi veya hemoglobin düzeyleri ile iliskili bozukluklari tedavi etmek için kullanimina yönelik yöntemler saglar. U.S. Patent Basvuru No. 12/012,652'de tarif edildigi üzere, GDF Tuzaklari, kas kütlesini artirmak ve yag kütlesini azaltmak Için kullanilabilir.
Mevcut tarifname, amino ve karboksi terminal budamalarina ve dizi degisikliklerine sahip ActRIIB polipeptitleri de dahil olmak üzere varyant ActRIIB polipeptitleri olan GDF Tuzaklari saglar. GDF Tuzaklari, istege bagli olarak, ActRIIB reseptörlerinin GDF8 (miyostatin olarak da anilir), GDF11, Nodal ve BMP7 (OP-1 olarak da anilir) gibi bir veya daha fazla Iigandini tercihli sekilde antagonize edecek sekilde tasarlanabilir. GDF Tuzaklarinin örnekleri, aktivin için büyük ölçüde azalmis afiniteye sahip ActRIIB'den türetilen varyantlarin bir kümesini kapsar. Bu varyantlar, kirmizi kan hücreleri üzerinde arzu edilebilir etkiler sergiler ve diger dokular üzerinde zayif etkilere sahiptir. Bu tip varyantlarin örnekleri, SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir asidik amino asit (örnegin aspartik asit (D) veya glutamik asit (E)) içerenleri kapsar. Bulusta kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptidi, SEQ ID No:7, 28, 29, 32, 37 veya 38'in ve bunlardan herhangi biriyle en az %95, %97, %98 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen polipeptitlerin amino asit dizisini içeren, bundan olusan veya esasen bundan olusan bir amino asit dizisine sahiptir. Burada açiklanan diger GDF Tuzagi polipeptitleri, SEQ ID NO:26'nin ve SEO ID NO:26 ile en az %95, %97, %98 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen polipeptitlerin amino asit dizisini içeren, bundan olusan veya esasen bundan olusan bir amino asit dizisine sahiptir.
Tarifname, GDF8, GDF11, aktivin (örnegin aktivin B). BMP7 veya nodal gibi bir ActRIIB Iigandina baglanan bir GDF Tuzagi ile birlikte farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren farmasötik preparatlar saglar. Istege bagli olarak, GDF Tuzagi bir ActRIIB Iigandina mikromolardan düsük, 1 mikromolardan düsük, 100 nanomolardan düsük, 10 nanomolardan düsük veya 1 nanomolardan düsük bir Kd ile baglanir. GDF Tuzagi, istege bagli olarak, ActRIIB sinyal iletimini, örnegin bir ActRIIB Iigandi ile tetiklenen intraselüler sinyal iletim olaylarini inhibe eder. Bu tip bir preparatta kullanilmaya yönelik bir GDF Tuzagi, örnegin SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 veya 40 arasindan seçilen bir amino asit dizisine sahip GDF Tuzaklari veya SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 veya 40 arasindan seçilen bir amino asit dizisi ile en az %80, %85, %90, %95, %97 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip GDF Tuzaklari veya SEO ID NO:1'de L79'a karsilik gelen pozisyonun bir asidik amino asit oldugu, SEQ ID N02, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 veya 40 arasindan seçilen bir amino asit dizisi ile en az %80, %85, %90, %95, %97 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip GDF Tuzaklari da dahil olmak üzere burada açiklananlardan herhangi biri olabilir. Bu tip bir preparatta kullanilmaya yönelik tercih edilen bir GDF Tuzagi, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisinden olusur veya esasen bundan olusur. Bir GDF Tuzagi, bir dogal ActRIIB polipeptidinin fonksiyonel bir fragmanini, örnegin SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 veya 40 arasindan seçilen bir dizinin veya SEQ ID NO:2'nin dizisinin en az 10, 20 veya 30 amino asidini içeren ve 1, 2, 3, 4, 5 veya 10 ila 15 C terminal amino asidinin ve N terminusta 1, 2, 3, 4 veya 5 amino asidi içermeyen bir fragmani ihtiva edebilir. Tercih edilen bir polipeptit, SEQ ID No:2 veya 40'a kiyasla, N terminusta 2 ve 5 amino asitlik ve C terminusta en fazla 3 amino asitlik bir budama içerecektir. Bir GDF Tuzagi, dogal yoldan meydana gelen bir ActRIIB polipeptidine kiyasla, bir ActRIIB polipeptidinin amino asit dizisinde (örnegin Iigand baglayici domeninde) bir veya daha fazla degisiklik içerebilir. Amino asit dizisindeki degisiklik, örnegin, dogal yoldan meydana gelen ActRIIB polipeptidine kiyasla, bir memelide, böcekte veya baska bir ökaryotik hücrede üretildiginde polipeptidin glikozilasyonunu degisiklige ugratabilir veya polipeptidin proteolitik kesimini degisiklige ugratabilir.
Bir GDF Tuzagi, bir domen olarak bir ActRIIB polipeptidine (örnegin bir veya daha fazla dizi varyasyonu ile birlikte bir ActRIIB'nin bir ligand baglayici domenine) ve iyilestirilmis farmakokinetikler, daha kolay saflastirma, belirli dokulara hedefleme vs. gibi arzu edilebilir bir özellik saglayan bir veya daha fazla ilave domene sahip bir füzyon proteini olabilir. Örnegin bir füzyon proteininin bir domeni, in vivo stabilite, in vivo yari ömür, alim/uygulama, doku Iokalizasyonu veya dagilimi, protein komplekslerinin olusumu, füzyon proteininin multimerlesmesi ve/veya saflastirmadan bir veya daha fazlasini iyilestirebilir. GDF Tuzagi füzyon proteinleri, bir immünglobülin Fc domeni (dogal sus veya mutant) veya bir serum albümini içerebilir. Bir GDF Tuzagi füzyonu, Fc domeni ile ekstraselüler ActRllB domeni arasinda yer alan nispeten yapilanmamis bir baglanti içerir. Bu yapilanmamis baglanti, ActRIIB'nin ekstraselüler domeninin C terminal ucunda yaklasik 15 amino asitlik yapilanmamis bölgeye ("kuyruk") karsilik gelebilir veya sekonder yapiyi nispeten içermeyen 3 ila 5, 15, 20, 30, 50 veya daha fazla amino asitlik bir yapay dizi olabilir. Bir baglanti, glisin ve prolin kalintilari bakimindan zengin olabilir ve örnegin treonin/serin ve glisinlerden olusan tekrar dizileri (örnegin TG4 veya SG4 teklileri veya tekrarlari) veya üç glisinlik bir seri içerebilir.
Bir füzyon proteini bir saflastirma alt dizisine, örnegin bir epitop isareti, bir FLAG isareti, bir polihistidin dizisi ve bir GST füzyonuna sahip olabilir. Bir GDF Tuzagi füzyonu, bir lider dizi içerir. Lider dizi, bir dogal ActRllB lider dizisi veya bir heterolog lider dizi olabilir. Belirli düzenlemelerde lider dizi, bir Doku Plazminojen Aktivatörü (TPA) lider dizisi olabilir. Bir GDF Tuzagi füzyon proteini, A-B-C formülüyle gösterilen bir amino asit dizisine sahip olabilir. B kismi, SEQ ID No:2 veya 40'in 25-131. amino asitlerine karsilik gelen amino asit dizisinden olusan, N ve C terminali budanmis bir ActRIIB polipeptididir. A ve C kisimlari bagimsiz olarak sifir, bir veya daha fazla amino asit olabilir ve hem A hem de C kismi B için heterologtur. A ve/veya C kisimlari B kismina bir baglanti dizisi üzerinden baglanabilir.
Bir GDF Tuzagi, istege bagli olarak, sunlar arasindan seçilen bir veya daha fazla degistirilmis amino asit kalintisina sahip bir varyant ActRIIB polipeptidini içerir: bir glikozilli amino asit, bir PEG'II amino asit, bir farnezilli amino asit, bir asetilli amino asit, bir biyotinli amino asit, bir lipit kismi ile konjüge bir amino asit ve bir organik türevlendirici ajan ile konjüge bir amino asit. Bir farmasötik preparat ayrica bir veya daha fazla ilave bilesik, örnegin ActRIIB ile iliskili bir bozuklugu tedavi etmek için kullanilan bir bilesik içerebilir. Tercih edildigi haliyle, bir farmasötik preparat büyük ölçüde pirojensizdir. Genel olarak, bir GDF Tuzaginin, bir hastada istenmeyen immün yanit ihtimalini azaltmak amaciyla, GDF Tuzaginin dogal glikozilasyonuna uygun sekilde aracilik eden bir memeli hücre hattinda ifade edilmesi tercih edilebilir. Insan ve CHO hücre hatlari basarili bir sekilde kullanilmaktadir ve diger yaygin memeli ifade vektörlerinin faydali olacagi tahmin edilmektedir.
Tarifname, burada tarif edilen bir farmasötik preparati içeren ve bir insanda kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmek için kullanilmak üzere etiketlenmis olan ambalajli farmasötikler saglar.
Tarifname, bir degistirilmis ligand baglayici (örnegin GDF8 baglayici) domene sahip çözünür ActRllB polipeptitleri olan GDF Tuzaklari saglar. Degistirilmis ligand baglayici domenlere sahip GDF Tuzaklari, örnegin, insan ActRlIB'sinin E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 ve F101 (numaralandirma SEQ ID NO:1'e göredir) gibi amino asit kalintilarinda bir veya daha fazla mutasyon içerebilir. Istege bagli olarak, degistirilmis ligand baglayici domen, bir ActRlIB reseptörünün dogal sus ligand baglayici domenine kiyasla, GDF8/GDF11 gibi bir ligand için artmis seçicilige sahip olabilir. Açiklama amaciyla, burada su mutasyonlarin, degistirilmis ligand baglayici domenin aktivine kiyasla GDF11 için (ve dolayisiyla varsayimsal olarak GDF8 için) seçiciligini artirdigi gösterilir: K74Y, K74F, K74I, L79D, L79E ve D80I. Su mutasyonlar, GDF11'e kiyasla aktivine baglanma oranini artirmak suretiyle ters etkiye sahiptir: D54A, K55A, L79A ve F82A. Genel (GDF11 ve aktivin) baglanma aktivitesi, "kuyruk" bölgesinin veya varsayimsal olarak bir yapilanmamis baglanti bölgesinin dahil edilmesi ve ayrica bir K74A mutasyonunun kullanilmasi yoluyla artirilabilir.
Ligand baglanma afinitesinde genel bir düsüse neden olan diger mutasyonlar sunlari içerir: R4OA, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D806, D80F, D80M ve D8ON. Mutasyonlar, arzu edilen etkileri saglamak amaciyla birlestirilebilir. Örnegin, GDF11zAktivin baglanma oranini etkileyen mutasyonlarin birçogu Iigand baglanimi üzerinde genel bir olumsuz etkiye sahiptir ve dolayisiyla bu mutasyonlar, Iigand seçiciligine sahip bir iyilestirilmis baglayici protein üretmek amaciyla, Iigand baglanimini genel olarak artiran mutasyonlar ile birlestirilebilir. Bir GDF Tuzagi, istege bagli olarak ilave amino asit sübstitüsyonlari, eklemeleri veya eksilmeleri ile kombinasyon halinde bir L79D veya L79E mutasyonuna sahip bir ActRIIB polipeptidi olabilir_ Istege bagli olarak, bir degistirilmis Iigand baglayici domene sahip bir GDF Tuzaginin, aktivin baglanimi için Kd degeri ile GDF8 baglanimi için Kd degeri arasindaki orani, dogal sus Iigand baglayici domenin oranina kiyasla en az 2, 5, 10 ve hatta 100 kat daha yüksektir. Istege bagli olarak, bir degistirilmis Iigand baglayici domene sahip GDF Tuzaginin, aktivin inhibisyonu için IC50 degeri ile GDF8/GDF11 inhibisyonu için ICso degeri arasindaki orani, dogal sus ActRIIB Iigand baglayici domenine kiyasla en az 2, 5, 10 ve hatta 100 kat daha yüksektir. Istege bagli olarak, bir degistirilmis Iigand baglayici domene sahip GDF Tuzagi, GDF8/GDF11'i, aktivin inhibisyonu için leo degerinden en az 2, 5, 10 ve hatta 100 kat daha düsük bir IC50 degeri ile inhibe eder. Bu GDF Tuzaklari, bir immünglobülin Fc domenine (dogal sus veya mutant) sahip füzyon proteinleri olabilir. Belirli durumlarda, ilgili çözünür GDF Tuzaklari, GDF8 ve/veya GDF11'in antagonistleridir (inhibitörleridir).
Sunlar gibi baska GDF Tuzaklari da öngörülmektedir: SEQ ID No:1 veya 39 ile gösterilen ActRIIB dizisinden türetilen bir kisma ve bir ikinci polipeptit kismina sahip bir GDF Tuzagi füzyon proteini, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEO ID NO:1 veya 39'un 21-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan (istege bagli olarak SEO ID No:1 veya 39'un 22-25. amino asitlerinden baslayan) ve SEO ID NO:1 veya 39'un 109-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir ve burada GDF Tuzagi füzyon proteini bir hücre esasli analizde aktivin, miyostatin ve/veya GDF11 aracili sinyal iletimini inhibe eder.
Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1 veya 39'un 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan (istege bagli olarak SEQ ID No:1 veya 39'un 22-25. amino asitlerinden baslayan) ve SEO ID No:1 veya 39'un 109-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1 veya 39'un 20- 24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan (istege bagli olarak SEQ ID No:1 veya 39'un 22-25. amino asitlerinden baslayan) ve SEO ID NO:1 veya 39'un 109-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1 veya 39'un 21-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 109-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1 veya 39'un 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1 veya 39`un 118-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ lD No:1 veya 39'un 21-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1 veya 39'un 118-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEO ID NO:1 veya 39'un 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1 veya 39'un 128-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID No:1 veya 39'un 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 128-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID No:1 veya 39'un 21-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 118-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1 veya 39'un 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1 veya 39'un 118-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID No:1 veya 39'un 21-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1 veya 39'un 128-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteini olup, burada ActRIIB'den türetilen kisim, SEQ ID NO:1'in 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 128-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir diziye karsilik gelir. Sasirtici bir sekilde, SEQ ID NO:1 veya 39'un 22-25. amino asitlerinden baslayan konstraktlar, insan ActRIIB'sinin tüm ekstraselüler domenine sahip proteinlere kiyasla daha yüksek aktivite düzeylerine sahiptir. Burada açiklanan GDF Tuzagi füzyon proteinleri, SEQ ID NO:1 veya 39'un 25. pozisyonunda yer alan amino asitten baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 131. pozisyonunda yer alan amino asitte sonlanan bir amino asit dizisini içerebilir, esasen bundan olusabilir veya bundan olusabilir. Tercih edilen düzenlemelerde, bulusta kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptidi, SEO ID No:7, 28, 29, 32, 37 veya 38'in amino asit dizisinden olusur veya esasen bundan olusur. Burada açiklanan diger örneklerde, GDF Tuzagi polipeptidi, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisinden olusur veya esasen bundan olusur. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteinlerinden herhangi biri bir homodimer olarak üretilebilir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteinlerinden herhangi biri, bir IgG agir zincirine ait bir sabit bölge, örnegin bir FC domeni içeren bir heterolog kisma sahip olabilir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteinlerinden herhangi biri, istege bagli olarak SEO ID NO:1'e kiyasla bir veya daha fazla ilave amino asit sübstitüsyonu, eksilmesi veya katilimi ile kombinasyon halinde, SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir asidik amino asit içerebilir. Örnegin sunlar gibi baska GDF Tuzagi proteinleri de öngörülmektedir: SEQ lD No:1 veya 39'un 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %80 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir GDF Tuzagi proteini, burada SEQ ID NO:1'in 64. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir R veya K bulunur ve burada GDF Tuzagi proteini bir hücre esasli analizde aktivin, miyostatin ve/veya GDF11 aracili sinyal iletimini inhibe eder. Yukaridaki GDF Tuzagi proteini olup, burada, SEQ lD No:1 veya 39'un dizisine kiyasla, Iigand baglanma cebinin disinda en az bir degisiklik mevcuttur. Yukaridaki GDF Tuzagi proteini olup, burada, SEO ID No:1 veya 39'un dizisine kiyasla en az bir degisiklik, Iigand baglanma cebinin içinde yer alan bir konzervatif degisikliktir. Yukaridaki GDF Tuzagi proteini olup, burada SEQ ID No:1 veya 39'un dizisine kiyasla en az bir degisiklik, K74, R40, Q53, K55, F82 ve L79'tan olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla pozisyonda bir degisikliktir.
Yukaridaki GDF Tuzagi proteini olup, burada protein, ActRIIB'ye ait bir endojen N-X-S/T dizisinin disinda bir pozisyonda ve Iigand baglanma cebinin disinda bir pozisyonda en az bir N-X-S/T dizisine sahiptir.
Sunlar gibi baska GDF Tuzaklari da öngörülmektedir: SEQ ID No:1 veya 39'un 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %80 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir GDF Tuzagi proteini, burada protein, ActRIIB'ye ait bir endojen N-X-S/T dizisinin disinda bir pozisyonda ve ligand baglanma cebinin disinda bir pozisyonda en az bir N-X-S/T dizisine sahiptir. Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada GDF Tuzagi proteini, SEQ ID No:1 veya 39'un 24. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir N ve SEO ID NO:1 veya 39'un 26. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir 8 veya T içerir ve burada GDF Tuzagi bir hücre esasli analizde aktivin, miyostatin ve/veya GDF11 aracili sinyal iletimini inhibe eder.
Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada GDF Tuzagi proteini, SEQ ID NO:1 veya 39'un 64. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir R veya K içerir. Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada ActRIIB proteini, SEQ ID No:1 veya 39'un 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir D veya E içerir ve burada GDF Tuzagi bir hücre esasli analizde aktivin, miyostatin ve/veya GDF11 aracili sinyal iletimini inhibe eder. Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada, SEQ ID No:1 veya 39'un dizisine kiyasla en az bir degisiklik, ligand baglanma cebinin içinde yer alan bir konzen/atif degisikliktir. Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada SEQ ID No:1 veya 39'un dizisine kiyasla en az bir degisiklik, K74, R40, Q53, K55, F82 ve L79'tan olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla pozisyonda bir degisikliktir. Yukaridaki GDF Tuzagi olup, burada protein, ilaveten bir heterolog kisim içeren bir füzyon proteinidir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteinlerinden herhangi biri bir homodimer olarak üretilebilir. Yukaridaki GDF Tuzagi füzyon proteinlerinden herhangi biri, bir lgG agir zincirine ait bir sabit bölge, örnegin bir FC domeni içeren bir heterolog kisma sahip olabilir.
Tarifname, bir GDF Tuzagi polipeptidini kodlayan nükleik asitler saglayabilir. Bir izole polinükleotit, yukarida tarif edilen gibi bir çözünür GDF Tuzagi polipeptidi için bir kodlayici dizi içerebilir. Örnegin bir izole nükleik asit, bir veya daha fazla dizi varyasyonuna sahip bir ActRIIB polipeptidinin bir ekstraselüler domenini (örnegin ligand baglayici domenini) içeren bir GDF Tuzagi için kodlama yapan bir dizi ve bir ActRIIB polipeptidinin transmembran domeninin ve/veya sitoplazmik domeninin bir kismi veya tamami için ve ancak transmembran domen veya sitoplazmik domen içinde yer alan veya ekstraselüler domen ile transmembran domen veya sitoplazmik domen arasinda yer alan bir durdurma kodonu için kodlama yapacak bir dizi içerebilir. Örnegin bir GDF Tuzagi için kodlama yapan bir izole polinükleotit, bir veya daha fazla varyasyona sahip SEQ ID NO:4 gibi bir tam uzunluklu ActRIIB polinükleotit dizisine veya kismen budanmis bir versiyona sahip olabilir, bahsedilen izole polinükleotit, ilaveten, 3' terminusundan en az alti yüz nükleotit öncesinde veya aksi takdirde polinükleotidin translasyonunun, istege bagli olarak bir tam uzunluklu ActRIIB'nin budanmis bir kismi ile kaynasik bir ekstraselüler domen vermesini saglayacak sekilde konumlanmis bir transkripsiyon terminasyon kodonuna sahiptir. Burada açiklanan nükleik asitler, ifade için bir promotöre operatif sekilde bagli olabilir ve tarifname, böylesi rekombinant polinükleotitler ile transformasyona ugratilmis hücreler saglar. Hücre tercihen bir memeli hücresi, örnegin bir CHO hücresidir.
Tarifname, bir GDF Tuzagi polipeptidinin yapimina yönelik yöntemler saglayabilir. Böylesi bir yöntem, burada açiklanan nükleik asitlerden (örnegin SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31) herhangi birinin uygun bir hücrede, örnegin bir Çin hamster overi (CHO) hücresinde ifade edilmesini içerebilir. Böylesi bir yöntem sunlari içerebilir: a) bir GDF Tuzagi ifade konstrakti ile transformasyona ugratilmis bir hücrenin, GDF Tuzagi polipeptidinin ifadesi için uygun kosullar altinda kültürlenmesi ve b) bu sekilde ifade edilen GDF Tuzagi polipeptidinin geri kazanilmasi. GDF Tuzagi polipeptitleri, hücre kültürlerinden protein elde edilmesi için iyi bilinen tekniklerden herhangi biriyle, ham, kismen saflastirilmis veya yüksek düzeyde saflastirilmis fraksiyonlar halinde geri kazanilabilir.
Burada açiklanan bir GDF Tuzagi polipeptidi, bir öznede kirmizi kan hücresi üretimini desteklemeye veya kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmeye yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Tarifname, ihtiyaci olan hastalarda düsük kirmizi kan hücresi sayilari veya düsük hemoglobin düzeyleri ile iliskili bir bozuklugu (örnegin bir anemi) tedavi etmeye veya kirmizi kan hücresi üretimini desteklemeye yönelik yöntemler saglar. Bir yöntem, bir GDF Tuzagi polipeptidinin etkili bir miktarinin ihtiyaci olan bir özneye verilmesini içerir. Tarifname, GDF Tuzagi polipeptitlerinin, burada tarif edilen bir bozuklugun veya durumun tedavisine yönelik bir ilacin üretiminde kullanimini saglar.
Tarifname, bir GDF Tuzagi polipeptidinin bir hastaya uygulanmasina yönelik yöntemler saglayabilir. Tarifname, kismen, GDF Tuzagi polipeptitlerinin kirmizi kan hücresi ve hemoglobin düzeylerini yükseltmek için kullanilabilecegini gösterir. GDF Tuzagi polipeptitleri ayrica diger terapötik durumlari tedavi etmek veya önlemek, örnegin kas büyümesini desteklemek için kullanilabilir. Belirli durumlarda, bir GDF Tuzagi polipeptidi kas büyümesini desteklemek için verildiginde, kirmizi kan hücrelerine yönelik istenmeyen etkileri azaltmak amaciyla, GDF Tuzagi polipeptidi uygulamasi süresince kirmizi kan hücreleri üzerindeki etkilerin izlenmesi veya GDF Tuzagi polipeptidinin dozajinin belirlenmesi veya ayarlanmasi arzu edilebilir. Örnegin, kirmizi kan hücresi düzeylerinde, hemoglobin düzeylerinde veya hematokrit düzeylerinde artislar, kari basincinda artislara neden olabilir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, çoklu ActRIIB ve ActRllA kristal yapisinin kompozit analizine göre, burada çikarsanan kalintilar ile birlikte insan ActRIIA (SEQ ID NO:15) ve insan ActRIIB (SEQ ID No:2) ekstraselüler domenlerinin bir hizalamasini gösterir, Iiganda dogrudan temas (Iigand baglanma cebi) kutularla gösterilir.
Sekil 2, çesitli omurgali ActRIIB proteinleri ve insan ActRllA'sinin (SEQ ID NO:16-23) çoklu dizi hizalamasini gösterir.
Sekil 3, GDF Tuzagi ActRIIB(L7QD 20-134)-hFc (SEQ ID NO:11) için TPA lider dizisi (alti iki çizgili), ActRIIB ekstraselüler domeni (SEQ ID NO:1'de 20-134. kalintilar; alti çizgili) ve hFc domeni de dahil olmak üzere tam amino asit dizisini gösterir. Dogal dizide 79. pozisyonda sübstitüe edilen aspartat ve sekanslama yoluyla olgun füzyon proteininde N terminal kalintisi oldugu görülen glisin, alti iki çizgili ve vurgulu olarak gösterilir.
Sekil 4, ActRIlB(L79D 20-134)-hFc'yi kodlayan bir nükleotit dizini gösterir. SEO ID NO:25 sens iplige karsilik gelir ve SEO ID NO:33 antisens iplige karsilik gelir. TPA lider dizisi (1-66. nükleotitler) alti iki çizgili olarak gösterilir ve ActRIlB ekstraselüler domeni (76-420. nükleotitler) alti çizgili olarak gösterilir.
Sekil 5, budanmis GDF Tuzagi ActRIlB(L79D 25-131)-hFc (SEQ ID NO:26) için TPA lider dizisi (alti iki çizgili), ActRIlB ekstraselüler domeni (SEO ID NO:1'de 25-131. kalintilar; alti çizgili) ve hFC domeni de dahil olmak üzere tam amino asit dizisini gösterir. Dogal dizide 79. pozisyonda sübstitüe edilen aspartat ve sekanslama yoluyla olgun füzyon proteininde N terminal kalintisi oldugu görülen glutamat, alti iki çizgili ve vurgulu olarak gösterilir.
Sekil 6, ActRIlB(L79D 25-131)-hFc'yi kodlayan bir nükleotit dizini gösterir. SEQ ID NO:27 sens iplige karsilik gelir ve SEO ID NO:34 antisens iplige karsilik gelir. TPA lider dizisi (1-66. nükleotitler) alti iki çizgili olarak gösterilir ve budanmis ActRIlB ekstraselüler domeni (76-396. nükleotitler) alti çizgili olarak gösterilir. ActRIlB ekstraselüler domeni (SEQ ID NO:1'de 25- 131. kalintilar) için amino asit dizisi de gösterilir.
Sekil 7, bir lider dizi (SEQ ID NO:28) içermeyen budanmis GDF Tuzagi ActRIlB(L79D 25- 131)-hFc için amino asit dizisini gösterir. Budanmis ActRIlB ekstraselüler domeni (SEQ ID NO:1'de 25-131. kalintilar) alti çizgili olarak gösterilir. Dogal dizide 79. pozisyonda sübstitüe edilen aspartat ve sekanslama yoluyla olgun füzyon proteininde N terminal kalintisi oldugu görülen glutamat, alti iki çizgili ve vurgulu olarak gösterilir.
Sekil 8, lider, hFc domeni ve baglanti içermeyen budanmis GDF Tuzagi ActRIlB(L7QD 25- 131) için amino asit dizisini gösterir (SEO ID NO:29). Dogal dizide 79. pozisyonda sübstitüe edilen aspartat ve sekanslama yoluyla olgun füzyon proteininde N terminal kalintisi oldugu görülen glutamat, alti çizgili ve vurgulu olarak gösterilir.
Sekil 9, ActRIlB(L79D 25-131 )-h Fc'yi kodlayan bir alternatif nükleotit dizisini gösterir. SEQ ID NO:30 sens iplige karsilik gelir ve SEO ID NO:35 antisens iplige karsilik gelir. TPA lider dizisi (1-66. nükleotitler) alti iki çizgili olarak gösterilir, budanmis ActRIlB ekstraselüler domeni (76- 396. nükleotitler) alti çizgili olarak gösterilir ve ekstraselüler domenin dogal sus nükleotit dizisindeki sübstitüsyonlar alti iki çizgili ve vurgulu olarak gösterilir (SEQ ID NO:27, Sekil 6 ile 12 karsilastiriniz). ActRIIB ekstraselüler domeni (SEQ ID NO:1'de 25-131. kalintilar) için amino asit dizisi de gösterilir.
Sekil 10, Sekil 9'da (SEO ID NO:30) gösterilen alternatif nükleotit dizisinin 76-396. nükleotitlerini (SEQ ID NO:31) gösterir. Sekil 9'da gösterilen nükleotit sübstitüsyonlari burada da alti çizgili ve vurgulu olarak gösterilir. SEQ ID NO:31 sadece bir L79D sübstitüsyonuna sahip budanmis ActRIIB ekstraselüler domenini (SEO ID NO:1'de 25-131. kalintilara karsilik gelir), örnegin ActRIIB(L79D 25-131) domenini kodlar.
Sekil 11, kemoterapi ile uyarilan anemiye yönelik bir fare modelinde ActRIIB(L79D 25431)- hFc'nin hemoglobin konsantrasyonuna etkisini gösterir. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. **, P < 0.01 (ayni zaman noktasinda paklitaksele kiyasla). Bu GDF Tuzagi, paklitaksel uygulamasi ile uyarilan anemiyi dengelemistir.
Sekil 12, kronik böbrek hastaligina yönelik bir tek tarafli nefrektomize (NEPHX) fare modelinde ActRllB(L79D 25-131)-hFc'nin kirmizi kan hücresi (RBC) düzeylerine etkisini gösterir. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. ***, P < 0.001 (baslangica kiyasla). Bu GDF Tuzagi, kontrol farelerinde gözlemlenen nefrektomi ile uyarilan anemiyi tersine çevirmistir.
Sekil 13, kronik böbrek hastaligina yönelik bir tek tarafli nefrektomize (NEPHX) fare modelinde ActRIIB(L79D 25-131)-hFc'nin kirmizi kan hücresi (RBC), hemoglobin (HGB) ve hematokrit (HCT) düzeylerine etkisini gösterir. Veriler, 4 hafta boyunca baslangica göre ortalama degisimler (± OSH) olarak ifade edilir. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001 (NEPHX kontrollere kiyasla). Bu GDF Tuzagi, bu eritrositik parametrelerde nefrektomi ile iliskili düsüsü önlemistir ve bunlarin her birinde, saglam böbrekli (sham operasyonlu) farelerdekine benzer büyüklükte bir artis saglamistir.
Sekil 14, akut kan kaybi ile uyarilan anemiye yönelik bir siçan modelinde ActRIIB(L79D 25- 131)-hFc'nin kirmizi kan hücresi (RBC) düzeylerine etkisini gösterir. Kan alimi -1. Günde gerçeklestirilmistir, doz uygulamasi 0 ve 3. Günlerde yapilmistir. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. **, P < 0.01; ***, P < 0.001 (ayni zaman noktasinda araca kiyasla). Bu GDF Tuzagi, kan kaybi ile uyarilan anemiden kurtulma hizini ve süresini iyilestirmistir.
Sekil 15, sinomolgus maymununda ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (gri) veya ActRIIB(L79D 25- 131)-hFc (siyah) uygulamalarinin kirmizi kan hücresi konsantrasyonunda baslangica göre mutlak degisim üzerindeki etkisini gösterir. VEH = araç. Veriler, ortalama ± OSH olarak Ifade edilir. n = 4-8/grup.
Sekil 16, sinomolgus maymununda ActRllB(L79D 20-134)-hFc (gri) veya ActRllB(L7QD 25- 131)-hFc (siyah) uygulamalarinin hematokrit düzeyinde baslangica göre mutlak degisim üzerindeki etkisini gösterir. VEH = araç. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. n = 4- 8/grup.
Sekil 17, sinomolgus maymununda ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (gri) veya ActRIIB(L79D 25- 131)-hFc (siyah) uygulamalarinin hemoglobin konsantrasyonunda baslangica göre mutlak degisim üzerindeki etkisini gösterir. VEH = araç. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. n = 4-8/grup.
Sekil 18, sinomolgus maymununda ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (gri) veya ActRIIB(L7QD 25- 131)-hFc (siyah) uygulamalarinin dolasimdaki retikülosit konsantrasyonunda baslangica göre mutlak degisim üzerindeki etkisini gösterir. VEH = araç. Veriler, ortalama ± OSH olarak ifade edilir. n = 4-8/grup.
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI 1. Giris Dönüstürücü büyüme faktörü beta (TGF-beta) üst ailesi, ortak dizi ögelerine ve yapisal motiflere sahip çesitli büyüme faktörlerini içerir. Bu proteinlerin hem omurgalilarda hem de omurgasizlarda çok çesitli hücre türleri üzerinde biyolojik etkiler sergiledigi bilinir. Üst ailenin üyeleri, embriyonik gelisim süresince patern olusumunda ve doku özellesmesinde önemli fonksiyonlari yerine getirir ve adipojenez, miyojenez, kondrojenez, kardiyojenez, hematopoez, nörojenez ve epitel hücre farklilasmasi da dahil olmak üzere çesitli farklilasma süreçlerini etkileyebilir. Aile, üyeleri çesitli ve çogu kez tamamlayici etkilere sahip olan BMP/GDF ve TGF-beta/Aktivin/BMPtO olmak üzere iki genel kola ayrilir. TGF-beta ailesine ait bir üyenin aktivitesinin manipüle edilmesi sonucunda çogu kez bir organizmada anlamli fizyolojik degisimlerin saglanmasi mümkündür. Örnegin Piedmontese ve Belgian Blue sigir irklari, GDF8 (miyostatin olarak da anilir) geninde, kas kütlesinde belirgin bir artisa neden olan bir fonksiyon kaybi mutasyonu tasir. Grobet et al.. Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Ayrica, insanlarda GDF8'in pasif alelleri, artmis kas kütlesi ve raporlara göre istisnai güç ile iliskilendirilir. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 35022682-8. 14 TGF-ß sinyalleri, Iigand uyarimindan sonra akis asagi Smad proteinlerini fosforile ve aktive eden tip I ve tip II serin/treonin kinaz reseptörlerinin heteromerik kompleksleri araciliginda iletilir (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178). Bu tip I ve tip II reseptörler, sistein bakimindan zengin bölgeye sahip bir Iigand baglayici ekstraselüler domenden, bir transmembran domenden ve kestirilmis serin/treonin spesifikligine sahip bir sitoplazmik domenden olusan transmembran proteinlerdir. Tip I reseptörler sinyal iletimi için esansiyeldir.
Tip II reseptörler, Iigandlara baglanma ve Tip I reseptörlerin ifadesi için gereklidir. Tip I ve II aktivin reseptörleri Iigand baglanimindan sonra stabil bir kompleks olusturur, bu, Tip I reseptörlerin Tip II reseptörler araciliginda fosforilasyonu ile sonuçlanir.
Aktivinlere yönelik Tip II reseptörler olarak iki alakali Tip II reseptörü (ActRll) (ActRllA ve ActRllB) belirlenmistir (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Aktivinlerin yani sira, ActRllA and ActRllB biyokimyasal olarak BMP7, Nodal, GDF8 ve GDF11 de dahil olmak üzere birtakim diger TGF-ß ailesi proteinleri ile etkilesime geçebilir (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 1302217-226; Lee ve McPherron, 2001, Proc.
Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4, aktivinlere, özellikle aktivin A'ya yönelik primer tip I reseptördür ve ALK-7 de aktivinler için, özellikle aktivin B için bir reseptör olarak islev görebilir. Mevcut tarifname, kismen, ActRllB reseptörlerinin bir ligandinin (bir ActRllB ligandi olarak da anilir) ilgili bir GDF Tuzagi polipeptidi ile antagonize edilmesi ile ilgilidir. ActRllB reseptörlerinin örnek Iigandlari, aktivin, Nodal, GDF8, GDF11 ve BMP7 gibi bazi TGF-ß ailesi üyelerini kapsar.
Aktivinler, TGF-beta üst ailesine ait dimerik polipeptit büyüme faktörleridir. Yakindan alakali iki [3 alt biriminin homo/heterodimerleri (sirasiyla BABA, ßBßB ve ßAßB) olan üç temel aktivin formu (A, B ve AB) mevcuttur. Insan genomu ayrica öncelikli olarak karacigerde ifade edilen bir aktivin C ve bir aktivin E için kodlama yapar ve ßc veya BE içeren heterodimerik formlar da bilinmektedir. TGF-beta üst ailesinde aktivinler, over ve plasenta hücrelerinde hormon üretimini uyarabilen, nöronal hücre sagkalimini destekleyebilen, hücre döngüsünün ilerleyisini hücre türüne bagli olarak olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilen ve en azindan amfibi embriyolarinda mezodermal farklilasmayi uyarabilen essiz ve çok fonksiyonlu faktörlerdir (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Ayrica, uyarilmis insan monositik lösemi hücrelerinden izole edilen eritroid farklilasma faktörünün (EDF) aktivin A ile özdes oldugu bulunmustur (Murata et al., 1988, PNAS, 8512434). Aktivin A'nin kemik iliginde eritropoiezi destekledigi önerilmistir. Birtakim dokularda aktivin sinyal iletimi, ilgili inhibin heterodimeri ile antagonize edilir. Örnegin folikül uyarici hormon (FSH) hipofiz bezinden salinirken, aktivin FSH sekresyonunu ve sentezini destekler, inhibin ise FSH sekresyonunu ve sentezini önler. Aktivin biyoaktivitesini regüle edebilen ve/veya aktivine baglanabilen diger proteinler, follistatin (FS), follistatin ile ilgili protein (FSRP) ve 02- makroglobulini kapsar.
Nodal proteinler erken embriyojenezde mezoderm ve endoderm uyariminda ve olusumunda ve ayrica kalp ve mide gibi sonraki aksiyel yapilarin organizasyonunda fonksiyonlara sahiptir.
Gelismekte olan bir omurgali embriyosunda dorsal dokunun agirlikli olarak notokord ve prekordal plagin aksiyel yapilarina katki sagladigi ve ayni zamanda aksiyel olmayan embriyonik yapilar olusturmak üzere çevredeki hücreleri topladigi gösterilmistir. Nodal sinyal iletiminin hem tip I hem de tip II reseptörler üzerinden ve Smad proteinleri olarak bilinen intraselüler efektörler üzerinden gerçeklestigi görülmektedir. Güncel çalismalar, ActRIIA ve ActRllB'nin Nodal için tip II reseptörler olarak islev gördügü fikrini desteklemektedir (Sakuma et al., Genes Celller. 2002, 7:401-12). Nodal ligandlarin, Smad2'yi fosforile eden aktivin tip I ve tip II reseptörlerini aktiflestirmek için kofaktörleri (örnegin kripto) ile etkilesime girdigi önerilir. Nodal proteinler, erken omurgali embriyosu için önemli olan mezoderm olusumu, anterior patern olusumu ve sol-sag eksen özellesmesi de dahil olmak üzere birçok olaya karisir. Deneysel kanitlar, Nodal sinyal iletiminin, aktivine ve TGF-betaya spesifik olarak yanit verdigi önceden gösterilmis bir lüsiferaz raportörü olan pAR3-Lux'i aktiflestirdigini göstermistir. Ancak Nodal, kemik morfojenetik proteinlerine spesifik olarak duyarli bir raportör olan pTIx2-Lux'i uyarma kapasitesine sahip degildir. Güncel sonuçlar, Nodal sinyal iletiminin, aktivin-TGF-beta yolagi Smad proteinleri Smad2 ve Smad3 araciliginda gelistigine dair dogrudan biyokimyasal kanitlar saglar. Diger kanitlar, ekstraselüler kripto proteininin Nodal sinyal iletimi için gerekli oldugunu ve Nodal sinyal iletimini aktivin veya TGF-beta sinyal iletiminden farkli kildigini göstermistir.
Büyüme ve Farklilasma Faktörü 8 (GDF8), miyostatin olarak da bilinir. GDF8, iskelet kasi kütlesinin negatif regülatörüdür. GDF8, gelismekte olan ve eriskin iskelet kasinda yüksek düzeyde ifade edilir. Transgenik farelerde GDF8 yokluk mutasyonu, iskelet kasinda belirgin bir hipertrofi ve hiperplazi ile karakterizedir (McPherron et al., Nature, 1997, 387183-90).
Iskelet kasi kütlesinde benzer artislar, sigirlarda (Ashmore et al., 1974, Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron ve Lee, Proc. Natl. Acad.
Sci. ABD, 1997, 94:12457-12461 ve Kambadur et al., Genom Res., 1997, 7:910-915) ve çarpici sekilde insanlarda (Schuelke et al., N Engl J Med 2004;350:2682-8) dogal yoldan meydana gelen GDF8 mutasyonlarinda belirgindir. Çalismalar ayrica insanlarda HIV enfeksiyonu ile iliskili kas atrofisine GDF8 protein ifadesinde artislarin eslik ettigini göstermistir (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS, 1998, 95:14938-43). Ilaveten, GDF8 kasa 16 spesifik enzimlerin (örnegin kreatin kinaz) üretimini modüle edebilir ve miyoblast hücre proliferasyonunu modüle edebilir (WO 00/43781). GDF8 propeptidi, olgun GDF8 domeni dimerine kovalent olmayan sekilde baglanarak bu dimerin biyolojik aktivitesini pasiflestirebilir (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol.
Chem., 263; 7646-7654 and Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). GDF8'e veya yapisal olarak alakali proteinlere baglanan ve bunlarin biyolojik aktivitesini inhibe eden diger proteinler, follistatini ve potansiyel olarak follistatin ile ilgili proteinleri kapsar (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232).
BMP11 olarak da bilinen Büyüme ve Farklilasma Faktörü 11 (GDF11), bir salgilanan proteindir (McPherron et al., 1999, Nat. Genet. 22: 260-264). GDF11, fare gelisiminde kuyruk tomurcugu, ekstremite tomurcugu, maksiller ve mandibular kemerler ve dorsal kök ganglionlarinda ifade edilir (Nakashima et al., 1999, Mech. Dev. 80: 185-189). GDF11, mezodermal ve nöral dokularin patern olusumunda essiz bir role sahiptir (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). GDF11'in, gelismekte olan piliç ekstremitesinde kondrojenezin ve miyojenezin negatif regülatörü oldugu gösterilmistir (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407- ). Ayrica, kastaki GDF11 ifadesi, GDF8'e benzer bir sekilde kas büyümesinin regülasyonunda GDF11'in rolünü gösterir. ilaveten, beyinde GDF11 ifadesi, GDF11'in sinir sistemi fonksiyonu ile ilgili aktivitelere de sahip olabilecegini gösterir. Ilginç bir sekilde, GDF11'in olfaktör epitelinde nörojenezi inhibe ettigi bulunmustur (Wu et al., 2003, Neuron. 37:197-207). Dolayisiyla GDF11, kas hastaliklari ve nörodejeneratif hastaliklar (örnegin amyotrofik lateral skleroz) gibi hastaliklarin tedavisinde in vitro ve in vi'vo uygulamalara sahip olabilir.
Osteojenik protein 1 (OP-1) olarak da anilan kemik morfojenetik proteininin (BMP7) kikirdak ve kemik olusumunu uyardigi iyi bilinir. BMP7 ayrica çok çesitli fizyolojik süreçleri regüle eder. Örnegin BMP7, epitelyal osteojenez fenomeninden sorumlu osteoindüktif faktör olabilir.
Ayrica, BMP7'nin kalsiyum regülasyonunda ve kemik homeostazinda rol aldigi bulunmustur.
Aktivine benzer sekilde, BMP7 de Tip II reseptörlere (ActRIIA ve ActRllB) baglanir. Ancak BMP7 ve aktivin, heteromerik reseptör komplekslerine farkli Tip I reseptörlerini toplar.
Gözlemlenen majör BMP7 Tip I reseptörü ALK2'dir, aktivin ise sadece ALK4'e (ActRIIB) baglanir. BMP7 ve aktivin, ayri biyolojik yanitlari uyarmistir ve farkli Smad yolaklarini aktiflestirmistir (Macias-Silva et al., 1998, J Biol Chem. 273:25628-36).
Burada gösterildigi üzere, bir varyant ActRIIB polipeptidi (ActRIIB) olan bir GDF Tuzagi polipeptidi, in vi'vo olarak kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltme bakimindan, bir dogal sus çözünür ActRIIB polipeptidine kiyasla daha etkilidir ve anemilere yönelik çesitli modellerde 17 faydali etkilere sahiptir. Hematopoezin eritropoietin, G-CSF ve demir homeostazi da dahil olmak üzere çesitli faktörler tarafindan regüle edilen karmasik bir süreç oldugu dikkate alinmalidir. "Kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmek" ve "kirmizi kan hücresi olusumunu desteklemek" terimleri, hematokrit, kirmizi kan hücresi sayilari ve hemoglobin ölçümleri gibi klinik olarak gözlemlenebilir metrikleri ifade eder ve bu terimlerin, böylesi degisimlerin meydana gelmesini saglayan mekanizmadan bagimsiz olmasi amaçlanir.
Kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmenin yani sira, GDF Tuzagi polipeptitleri, örnegin kas büyümesini desteklemek de dahil olmak üzere çesitli terapötik uygulamalar için faydalidir (bakiniz PCT Yayin No. WO 2006/012627 ve WO 2008/097541). Belirli durumlarda, bir GDF Tuzagi polipeptidi kas artirimi için verildiginde, kirmizi kan hücrelerine yönelik etkilerin azaltilmasi veya minimize edilmesi arzu edilebilir. Bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilen veya bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için aday olan hastalarda çesitli hematolojik parametrelerin izlenmesi yoluyla, uygun dozaj (uygulama miktarlari ve sikligi dahil), her bir hastanin ihtiyaçlarina, baslangiçtaki hematolojik parametrelere ve tedavinin amacina göre belirlenebilir. Ayrica, zaman içerisinde terapötik ilerleme ve bir veya daha fazla hematolojik parametreye yönelik etkiler, hasta bakiminin kolaylastirilmasi, uygun idame dozajinin (miktarlar ve siklik) belirlenmesi vs. sayesinde, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile dozlanan hastalarin yönetilmesi için faydali olabilir.
Bu tarifnamede kullanilan terimler genel olarak bu bulus baglaminda ve her bir terimin kullanildigi spesifik baglamda ilgili alandaki mutat anlamlarina sahiptir. Belirli terimler, pratisyene bulusun konusunu açiklamada ve yapimi ve kullanimi hakkinda ilave yönlendirme saglamak amaciyla, tarifnamenin ilerleyen kisimlarinda veya baska bölümlerde tartisilir. Bir terimin herhangi bir kullaniminin kapsami veya anlami, terimin kullanildigi spesifik baglamdan anlasilacaktir.
"Yaklasik" ve "yaklasik olarak" terimleri genel olarak ölçümlerin dogasi veya kesinligi dikkate alindiginda ölçülen miktar için kabul edilebilir bir hata derecesini ifade eder. Tipik olarak, örnek hata dereceleri, belirli bir degerin veya degerler araliginin yüzde (%) 20'si, tercihen %1 O'u ve daha çok tercih edildigi haliyle %5'i içerisindedir.
Alternatif olarak ve özellikle de biyolojik sistemlerde "yaklasik" ve "yaklasik olarak" terimleri, bir mertebe içerisinde, tercihen belirli bir degerin 5 kati içerisinde ve daha çok tercih edildigi haliyle 2 kati içerisinde kalan degerleri ifade edebilir. Burada verilen sayisal miktarlar aksi belirtilmedikçe yaklasiktir, yani "yaklasik" veya "yaklasik olarak" terimi açikça belirtilmeyen durumlarda çikarsanabilir. 18 Burada açiklanan yöntemler, dogal sus dizinin bir veya daha fazla mutant (dizi varyantlari) ile karsilastirilmasi da dahil olmak üzere, dizilerin birbirleriyle karsilastirildigi adimlar içerebilir.
Bu tip karsilastirmalar tipik olarak polimer dizilerin örnegin ilgili alanda iyi bilinen dizi hizalama programlari ve/veya algoritmalari (örnegin birkaçini belirtmek gerekirse BLAST, FASTA ve MEGALIGN) ile hizalanmasini içerir. Ilgili alanin uzmanlari, bu tip hizalamalarda, bir mutasyonun bir kalinti katilimi veya eksilmesi içerdigi durumlarda, dizi hizalamasinin, katilan veya eksilen kalintiyi içermeyen polimer dizisine bir "bosluk" (tipik olarak bir tire isareti veya "A" ile gösterilir) yerlestirecegini takdir edecektir.
"Homolog" terimi, tüm dilbilgisel formlarinda ve yazim varyasyonlarinda, ayni organizma türünde üst ailelere ait proteinler ve ayrica farkli organizma türlerine ait homolog proteinler de dahil olmak üzere, bir "ortak evrimsel kökene" sahip iki protein arasindaki iliskiyi ifade eder.
Bu tip proteinler (ve bunlarin kodlayici nükleik asitleri), aralarindaki dizi benzerliginin yansittigi üzere, özdeslik yüzdesi açisindan veya spesifik kalintilarin veya motiflerin varligi ve korunmus pozisyonlar bakimindan dizi homolojisine sahiptir.
"Dizi benzerligi" terimi, tüm dilbilgisel formlarinda, ortak bir evrimsel kökene sahip olan veya olmayan nükleik asit veya amino asit dizileri arasindaki özdeslik veya baginti derecesini ifade eder Ancak, yaygin kullanimda ve mevcut basvuruda "homolog" terimi, “yüksek düzeyde" gibi bir zarf ile nitelendiginde, dizi benzerligini ifade edebilir ve ortak bir evrimsel köken ile ilgili olabilir veya olmayabilir. 2. GDF Tuzagi Polipeptitleri Mevcut tarifname, kismen, GDF Tuzagi polipeptitleri, örnegin ActRllB polipeptitlerinin fragmanlari, fonksiyonel varyantlari ve degistirilmis formlari da dahil olmak üzere çözünür varyant ActRllB polipeptitleri ile ilgilidir. GDF Tuzagi polipeptitleri, karsilik gelen bir dogal sus ActRllB polipeptidi ile en az bir benzer veya özdes biyolojik aktiviteye sahiptir. Örnegin bulusta kullanilmaya yönelik bir GDF Tuzagi polipeptidi, bir ActRllB ligandina (örnegin aktivin A, aktivin AB, aktivin B, Nodal, GDF8, GDF11 veya BMP7) baglanabilir ve bunun fonksiyonunu inhibe edebilir. Istege bagli olarak, bir GDF Tuzagi polipeptidi, kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltir. GDF Tuzagi polipeptitlerinin örnekleri, bir veya daha fazla dizi varyasyonuna sahip insan ActRllB öncül polipeptitlerini (SEO ID NO:1 veya 39) ve bir veya daha fazla dizi varyasyonuna sahip çözünür insan ActRllB polipeptitlerini (örnegin SEO ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ve 41) kapsar. Bir GDF Tuzagi, örnegin GDF11 19 ve/veya miyostatin de dahil olmak üzere diger ActRIIB Iigandlarina kiyasla aktivin için düsük afinite sergileyen bir ActRIIB polipeptidini ifade eder.
Burada kullanildigi haliyle "ActRIIB" terimi, herhangi bir türe ait bir aktivin reseptörü tip llb (ActRIIB) proteinleri ailesini ve bu gibi ActRllB proteinlerinden mutagenez veya baska bir modifikasyon yoluyla türetilen varyantlari ifade eder. Burada ActRIIB'den bahsedildiginde, halihazirda belirlenmis formlardan herhangi birinin kastedildigi anlasilmalidir. ActRIIB ailesinin üyeleri genel olarak sistein bakimindan zengin bir bölgeye sahip bir Iigand baglayici ekstraselüler domenden, bir transmembran domenden ve kestirilmis serin/treonin kinaz aktivitesine sahip bir sitoplazmik domenden olusan transmembran proteinlerdir. Insan ActRIIA çözünür ekstraselüler domeninin (karsilastirma amaciyla verilmistir) ve ActRIIB çözünür ekstraselüler domeninin amino asit dizileri Sekil 1'de gösterilir.
"ActRIIB polipeptidi" terimi, bir ActRIIB aile üyesinin dogal yoldan meydana gelen herhangi bir polipeptidini ve ayrica bunlarin faydali bir aktiviteyi koruyan herhangi bir varyantini (mutantlar, fragmanlar, füzyonlar ve peptidomimetik formlar dahil) içeren polipeptitleri kapsar.
Bakiniz örnegin WO 20061012627. Örnegin ActRIIB polipeptitleri, bir ActRIIB polipeptidinin dizisi ile en az yaklasik %80 oraninda özdeslik ve istege bagli olarak en az %85, %90, %95, %97, %99 veya daha yüksek oranda özdeslik sergileyen bir diziye sahip bilinen herhangi bir ActRIIB dizisinden türetilen polipeptitleri kapsar. Örnegin bir ActRIIB polipeptidi, bir ActRllB proteinine ve/veya aktivine baglanabilir ve bunun fonksiyonunu inhibe edebilir. Bir GDF Tuzagi olan bir ActRIIB polipeptidi, in vi'vo olarak kirmizi kan hücresi olusumunu desteklemede aktivite için seçilebilir. ActRllB polipeptitlerinin örnekleri, insan ActRIIB öncül polipeptidini (SEQ ID NO:1 ve 39) ve çözünür insan ActRIIB polipeptitlerini (örnegin SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ve 41) kapsar. Burada tarif edilen ActRIIB ile ilgili tüm polipeptitler için amino asitlerin numaralandirmasi, aksi özellikle belirtilmedikçe, SEQ ID NO:1 için numaralandirmaya dayanir.
Insan ActRIIB öncül protein dizisi su sekildedir: MTÄPWVALÄLLNGSLWPGSGRGEAETRECIYYNANWELERqgQSGLERC EGEQDKRLHCYASWRESSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTIITVIA*517PTG GLSLIVLLÂFWÂYRHRKPPIGHTDIEEDPGP?PPSPLYGLKP:QLLEIK ARGRFSCYHKAQLMNDIVÃTKIIPLQDKQSWQSERE:?STPGHKHZNLL QFZAÄEKRGSNLETELWLIIAFEDKGSLIDYLKGNI:TWNELCHVÄETH SRGLEYLEEDVPWCRGEGHXPS:AERDFKSKNVLLKSDLTÃVLADIGLA VPFEPGKP?GDIHGQVGTRPYMÃPE"LEGAINFÇRDAFLRIDIYAEGL? LWELYSRCKÄÃDGPVDEYMLPFEEE:GQEPSLEELQEYVVHKKMRPTIK DHHLKHPGLAÇLCÜTIEECWDHIAEERLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTS DCLVSLVTSVINVZLPPKESSI (SEQIDIQO21) Sinyal peptidi, alti tek çizgili olarak gösterilir; ekstraselüler domen kalin harflerle gösterilir ve potansiyel N-bagli glikozilasyon bölgeleri kutu içinde gösterilir.
Asagida gösterildigi üzere 64. pozisyonda bir alanin içeren bir form da literatürde bildirilmistir: MTAPWÜALÄLLNGSLW?GSGRGEAETRECIYYNANWELERHEQSGLERC EGEQDKRLHCYASWAESSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT'ITVIATSR`PTG GLSLiVLLÄFWÂIRHRKPEEGUVDiLMUQGPQUESPLVÜLKU;QLLE1E ARGRFGÖVNKÃQLFVDTVAÜKT?PTQDFÖSWSSFQR`TSTDGVZHTWLI QE:AAEKRGSNLETELHLIîAEEDKGSLîDYLKGNI:TWKELCHVAETH SRGLS?LERDV?WCRGFGHXPSTAERDPZSKMVT:KSÜLTAVTAnîîna VRFEPSKPEGDJHGQVGERNIMAPhELESAiNEQRDAELRLDIYAHSLT LWZLYSRFKAADGPVDEYMLPFEEEIFOEPSLEELOEUVUHKZMRPTIK DHMLKÃPGLAQTCTTTFECIDHDAFARTSÄGCVFIRVSLTQRSVNSTTS DCIVSLVTSVTNVDLPPKnSST (SFQIDTQO:39) Insan ActRIIB çözünür (ekstraselüler), islenmis polipeptit dizisi su sekildedir: GRGEAETREC:YYNANHELERTKQSGLERCEGEÇDKRLHCYASWRNSSG TIELVKKGCW:DDINCIDRQECTATZENPQVIFCCCEGNFINERFIHLP EAGGPEVIYE??PIAPI (SEQIDIQO:2) Bir A64 içeren alternatif form su sekildedir: 21 GRGERETREC:YYNANEELERTKQSGLERCEGEÇDKRLHCYASWANSSE TIELVKKGCW:DDFNCIDRÇECTATEENPQVIFC:CEGNFîNERFIHLP EÃGGPEVIYEPFPIAPI (SEQID`VOZ40) Bazi durumlarda protein, N terminusta bir "SGR..." dizisi ile birlikte üretilebilir. Ekstraselüler domenin C terminal “kuyrugu", alti çizgili olarak gösterilir. "Kuyrugu" silinmis dizi (bir A15 dizi) su sekildedir: GRGEAETREC:YYNANEELERTEQSGLERCEGEÇJKRLHCYASNRNSSS TIELVKKGÇW:DDFNCYDRQECTATEENPQVYFCCCEGNFÇNERFTHLP F./1(SFQIDNOI3) Bir A64 içeren alternatif form su sekildedir: ÜRCEAETREC:YYNANHELZRTKQSCLERCEGEÇDKRLHCYASWÃNSSî “1' 1 i-: i .`..-`I/\K(,I-î.îi^lÇ .::iiis- xICYi)R;iiLi'.:~/A'i E-IlülYlIQXTY l"f.,`î;(.jl.:iNl`î.îNl t: EZ;(SL~`Q 11) NO; 41; Bazi durumlarda protein, N terminusta bir "SGR..." dizisi ile birlikte üretilebilir. Bir insan ActRIIB öncül proteinini kodlayan nükleik asit dizisi su sekildedir: (Genbank giris no. NM_001 106'nin 5-1543. nükleotitleri) (gösterilen dizi, 64. pozisyonda bir alanin saglar ve bunun yerine bir arginin saglayacak sekilde degisiklige ugratilabilir) ACGACUGCUCCÇTÇJULUUÇCCICGÇÇCZÇCÜÇTSGCUAZCUCIUIUUC CCEGCTCPSGGCGîsGGGÄGGCÜGAGÄCÃCGGGÄGTGCÄÜCTÃCTÃCAÃ ÇGÇÇAÂÇLSGGAGCEGGAGÇUÇACÇgAßçAGAGCSGÇÇTGSAGÇGCEGÇ GÂÃGGIGRSJÃGGÃTÄÃGFGGC?GÖLÜTGCTÂGGICICCIGGGTÜÃÃCÃ GCIÇUGGCACÇATÇGAGCTCGTGAASAAGGGÇTGCTGGCZAGAIGhCTL CÃÃCTGCIÄCCÄTASGCACCAGIGTGTCCCCÄCTGACSACÄÂCCCCCAG 22 - - - 1 ^ _-. - _ i - - ...... - i __._._.._. _____ |i _ _ _ ` _____ _ _ i II'I`"I'I'.`..`.I.`.I'I- I . I I ' [i i |i !i ..... I 'II' 1 ` I' ::“1”"” '” .'- T' ° ' * f** ' °' i 'i ']i . ii Bir insan ActRIIA çözünür (ekstraselüler) polipeptidini kodlayan nükleik asit dizisi su sekildedir (gösterilen dizi 64. pozisyonda bir alanin saglar ve bunun yerine bir arginin saglayacak sekilde degisiklige ugratilabilir): GÇJCCÜUCJUAUCÇEGLJACACCGLÄGISÇAJÇTiCEACAÂCCJÇ&ACE GLJAÇ:TCJACCGCACCAACCAÇACCGCCÇTGGAJCCCTCCGAACCCGA GCAGGACAÃGCGGCTGCACTGCIACGCCTCCTGGSCCAACAGCTCTGGC ACCAQCGASCZCGZSAAGAAGGGCTSC1GGCÜAGATGACZÜÇAAÇIGÇE AusAüAGecAssAerGIGTGeggAç:GASGAGAgicçjcAGGIGTACT: CTGCTGCISTGAAG&CRACITCTGCEACSAGCGCITCACIÇATTTGCCÄ GAGGCEGGGGGCCÇSGnAGiCACGTscciGCCACÇCCCGACAGCCCCCA cc (8150 ID NO: 5) 23 Burada, çözünür ActRIIB polipeptitlerinin varyant formlari olan GDF Tuzagi polipeptitleri açiklanir. Burada tarif edildigi üzere, “çözünür ActRIIB polipeptidi" terimi genel olarak bir ActRIIB proteininin bir ekstraselüler domenini içeren polipeptitleri ifade eder. Burada kullanildigi haliyle "çözünür ActRIIB polipeptidi" terimi, bir ActRIIB proteininin dogal yoldan meydana gelen herhangi bir ekstraselüler domenini ve ayrica bunun faydali bir aktiviteyi koruyan herhangi bir varyantini (mutantlar, fragmanlar ve peptidomimetik formlar dahil) kapsar. Örnegin bir ActRIIB proteininin ekstraselüler domeni bir liganda baglanir ve genel olarak çözünür niteliktedir. Çözünür ActRIIB polipeptitlerinin örnekleri, ActRIIB çözünür polipeptitlerini (örnegin SEQ ID NO:22, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ve 41) kapsar. Çözünür ActRIIB polipeptitlerinin diger örnekleri, bir ActRIIB proteininin ekstraselüler domenine ek olarak bir sinyal dizisi içerir (bakiniz Örnek 1). Sinyal dizisi, bir ActRIIB'ye ait bir dogal sinyal dizisi veya baska bir proteine ait bir sinyal dizisi, örnegin bir doku plazminojen aktivatörü (TPA) sinyal dizisi veya bir bal arisi melittin (HBM) sinyal dizisi olabilir.
Tarifname, ActRIIB'nin fonksiyonel olarak aktif kisimlarini ve varyantlarini tanimlar. Basvuru sahipleri, SEQ ID NO:1'in 64. amino asidine karsilik gelen pozisyonda bir Alanin (A64) içeren, Hilden et al. (Blood. 1994 Apr 15;83(8):2163-70) tarafindan açiklanan diziye sahip bir Fc füzyon proteininin, aktivin ve GDF-11 için nispeten düsük bir afiniteye sahip oldugunu dogrulamistir. Öte yandan, 64. pozisyonda bir Arginin (R64) içeren ayni Fc füzyon proteini, aktivin ve GDF-11 için düsük nanomolar ile yüksek pikomolar araliginda bir afiniteye sahiptir.
Dolayisiyla bu tarifnamede insan ActRIIB'si için dogal sus referans dizi olarak R64 içeren bir dizi kullanilir.
Attisano et al. (Cell. 1992 Jan 10;68(1):97-108), ActRIIB ekstraselüler domeninin C terminusunda bir prolin dügümü eksilmesinin, reseptörün aktivine yönelik afinitesini azalttigini göstermistir. SEQ ID NO:1'in 20-119. amino asitlerini içeren bir ActRIIB-F0 füzyon proteini, "ActRIIB(20-119)-Fc", prolin dügümü bölgesine ve tam jukstamembran domenine sahip bir ActRIIB(20-134)-Fc'ye kiyasla, GDF-11 ve aktivin için düsük baglanma sergiler.
Ancak, bir ActRIIB(20-129)-Fc proteini, prolin dügümü bölgesi bozulmus olmasina ragmen, yabanil tipe kiyasla benzer, ancak bir sekilde azalmis bir aktiviteye sahiptir. Dolayisiyla, 134, 133, 132, 131, 130 ve 129. amino asitte sonlanan ActRIIB ekstraselüler domenlerinin hepsinin aktif olmasi beklenir, ancak 134 veya 133. amino asitte sonlanan konstraktlar, en aktif konstraktlar olabilir. Benzer bir sekilde, 129-134. kalintilarin herhangi birinde yer alan mutasyonlarin Iigand baglanma afinitesini yüksek oranlarda degistirmesi beklenmez. Bu baglamda, P129 ve P130 mutasyonlari Iigand baglanimini büyük ölçüde düsürmez.
Dolayisiyla, bir ActRIIB-FC füzyon proteini olan bir GDF Tuzagi polipeptidi, 109. amino asit (son sistein) kadar erken bir pozisyonda sonlanabilir, ancak 109 ve 119. pozisyonlarda veya 24 bunlarin arasinda sonlanan formlarin düsük Iigand baglanimina sahip olmasi beklenir. 119. amino asit yetersiz düzeyde korunur ve dolayisiyla kolayca degistirilebilir veya budanabilir. 128. pozisyonda veya daha ileride sonlanan formlar Iigand baglanma aktivitesini korur. 119 ve 127. pozisyonlarda veya bunlarin arasinda sonlanan formlar orta düzeyde baglanma becerisine sahip olacaktir. Klinik veya deneysel ortama bagli olarak bu formlardan herhangi birinin kullanilmasi arzu edilebilir.
ActRIIB'nin N terminusunda, 29. amino asitten ve öncesinden baslayan bir proteinin Iigand baglanma aktivitesini korumasi beklenir. 29. amino asit ilk sistein kalintisini temsil eder. 24. pozisyonda bir alanin -› asparagin mutasyonu, Iigand baglanimini büyük ölçüde etkilemeden bir N-bagli glikozilasyon dizisi saglar. Bu, 20-29. amino asitlere karsilik gelen sinyal kesim peptidi ile sisteine çapraz bagli bölge arasinda kalan bölgedeki mutasyonlarin iyi tolere edildigini dogrular. Daha özel bir ifadeyle, 20, 21, 22, 23 ve 24. pozisyondan baslayan konstraktlar aktiviteyi koruyacaktir ve 25, 26, 27, 28 ve 29. pozisyonlardan baslayan konstraktlarin da aktiviteyi korumasi beklenir. Örneklerde gösterilen veriler, sasirtici bir sekilde, 22, 23, 24 veya 25. pozisyondan baslayan bir konstraktin en yüksek aktiviteye sahip olacagini gösterir.
Birlikte ele alindiginda, aktif bir ActRIIB kismi SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerini içerir ve GDF Tuzagi konstraktlari örnegin SEQ ID No:1 veya 39'un 20-29. amino asitlerine karsilik gelen bir kalintidan baslayan ve SEO ID No:1 veya 39'un 109-134. amino asitlerine karsilik gelen bir pozisyonda sonlanan bir ActRIIB kismini içerir. Diger örnekler, SEQ ID NO:1 veya 39'un 20-29 veya 21-29. pozisyonundan baslayan ve 119-134, 119-133, 129-134 veya 129-133. pozisyonunda sonlanan konstraktlari kapsar. Diger örnekler, SEO ID NO:1 veya 39'un 20-24. (veya 21-24 veya 22-25) pozisyonundan baslayan ve 109-134 (veya 109- 133), 119-134 (veya 119-133) veya 129-134. (veya 129-133) pozisyonunda sonlanan konstraktlari kapsar. Bu araliklarda, özellikle SEQ ID NO:1 veya 39'un karsilik gelen kismi ile en az %80, %85, %90, %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen varyantlar da öngörülmektedir. Burada açiklanan GDF Tuzagi polipeptitleri, SEQ ID NO:1 veya 39'un 25- 131. amino asit kalintilari ile en az %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir polipeptit içerebilir, esasen bundan olusabilir veya bundan olusabilir. Belirli düzenlemelerde, bulusta kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptidi, SEQ ID No:7, 28, 29, 32, 37 veya 38 ile en az %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir polipeptit içerir, esasen bundan olusur veya bundan olusur. Diger GDF Tuzagi polipeptitleri, SEQ ID NO:26 ile en az %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir polipeptit içerebilir, esasen bundan olusabilir veya bundan olusabilir. Tercih edilen düzenlemelerde, GDF Tuzagi polipeptidi, SEQ ID No:7, 28, 29, 32, 37 veya 38'in amino asit dizisinden olusur veya esasen bundan olusur.
Tarifname, Sekil 1'de gösterildigi üzere, kompozit ActRIIB yapilarina yönelik bir analizin sonuçlarini kapsar, bu sonuçlar, ligand baglanma cebinin Y31, N33, N35, L38 ila T41, E47, E50, Q53 ila K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 ila N83, Y85, R8?, A92 ve E94 ila F101 kalintilari ile tanimlandigini gösterir. Bu pozisyonlardaki konzervatif mutasyonlarin tolere edilmesi beklenir, ancak R40A, K55A, F82A ve L79 pozisyonundaki mutasyonlarda oldugu gibi bir K74A mutasyonu iyi tolere edilmektedir. R40'in Xenopus'ta bir K olmasi, bu pozisyonda bazik amino asitlerin tolere edilecegini gösterir. 053, sigir ActRllB'sinde R'dir ve Xenopus ActRllB'sinde K'dir ve dolayisiyla bu pozisyonda R, K, Q, N ve H gibi amino asitler tolere edilecektir. Dolayisiyla, bir GDF Tuzagi proteini için genel bir formül, SEQ ID No:1 veya 39'un 29-109. amino asitlerini içeren, ancak istege bagli olarak 20-24 veya 22-25 araliginda bir pozisyondan baslayan ve 129-134 araliginda bir pozisyonda sonlanan ve ligand baglanma cebinde en fazla 1, 2, 5, 10 veya 15 konzervatif amino asit degisikligi içeren ve ligand baglanma cebinde 40, 53, 55, 74, 79 ve/veya 82. pozisyonlarda sifir, bir veya daha fazla konzervatif olmayan degisiklik içeren bir genel formüldür. Böylesi bir protein, SEQ lD NO:1 veya 39'un 29-109. amino asitlerinin dizisi ile %80, %90, %95 veya %99'dan yüksek oranda dizi özdesligi sergileyebilir. Degiskenligin özellikle iyi tolere edilebildigi baglanma cebinin disindaki bölgeler, ekstraselüler domenin amino ve karboksi terminuslarini (yukarida belirtildigi gibi) ve 42-46 ve 65-73. pozisyonlari kapsar. 65. pozisyonda bir asparagin -› alanin degisikligi (N65A) gerçekten de A64 arka planinda ligand baglanimini iyilestirir ve dolayisiyla bu degisikligin R64 arkaplaninda ligand baglanimi üzerinde herhangi bir zararli etkiye sahip olmamasi beklenir. Bu degisiklik muhtemelen A64 arkaplaninda N65 pozisyonunda glikozilasyonu elimine eder ve dolayisiyla bu bölgede anlamli bir degisimin tolere edilme ihtimalinin mevcut oldugunu gösterir. Bir R64A degisikligi yetersiz düzeyde tolere edilir, ancak R64K iyi tolere edilir ve dolayisiyla 64. pozisyonda H gibi baska bir bazik kalinti tolere edilebilir.
ActRIIB neredeyse tüm omurgalilarda iyi korunmustur ve ekstraselüler domenin büyük parçalari tamamen korunmustur. ActRllB'ye baglanan Iigandlarin birçogu da yüksek düzeyde korunmustur. Dolayisiyla, çesitli omurgali organizmalara ait ActRllB dizilerinin karsilastirmalari, degisiklige ugramis olabilecek kalintilar hakkinda bilgi saglar. Bu nedenle, bir GDF Tuzagi olarak faydali bir aktif insan ActRIIB varyant polipeptidi, baska bir omurgali ActRIIB dizisine ait karsilik gelen pozisyonlarda bir veya daha fazla amino asit içerebilir veya insan veya diger omurgali dizisindekine benzer bir kalinti içerebilir. Asagidaki örnekler, bir aktif ActRIIB varyantinin belirlenmesine yönelik bu yaklasimi gösterir. L46, Xenopus 26 ActRllB'sinde bir valindir ve dolayisiyla bu pozisyon degisiklige ugratilabilir ve istege bagli olarak V, l veya F gibi baska bir hidrofobik kalinti veya A gibi bir apolar kalinti ile degisiklige ugratilabilir. E52'nin Xenopus'ta bir K olmasi, bu bölgenin, polar kalintilar, örnegin E, D, K, R, H, 8, T, P, G, Y ve muhtemelen A da dahil olmak üzere çok çesitli degisikliklere karsi toleransli oldugunu gösterir. T93'ün Xenopus'ta bir K olmasi, bu pozisyonda genis bir yapisal varyasyonun tolere edildigini gösterir, burada 8, K, R, E, D, H, G, P, G ve Y gibi polar kalintilar tercih edilir. F108 Xenopus'ta bir Y'dir ve dolayisiyla Y veya baska bir hidrofobik grup, örnegin l, V veya L tolere edilmelidir. E111'in Xenopus'ta K olmasi, bu pozisyonda D, R, K ve H ve ayrica Q ve N de dahil olmak üzere yüklü kalintilarin tolere edilecegini gösterir.
R112'nin Xenopus'ta K olmasi, bu pozisyonda R ve H de dahil olmak üzere bazik kalintilarin tolere edildigini gösterir. 119. pozisyondaki A nISpeten yetersiz düzeyde korunur ve kemirgenlerde P olarak ve Xenopus'ta V olarak gözlemlenir, dolayisiyla bu pozisyonda esasen herhangi bir amino asidin tolere edilmesi gerekir.
Tarifname, baska bir N-bagli glikozilasyon bölgesi (N-X-S/T) ilavesinin, ActRIIB(R64)-Fc formuna kiyasla, bir ActRIlB-Fc füzyon proteininin serum yari ömrünü uzattigini gösterir. 24. pozisyona bir asparagin yerlestirildiginde (A24N konstrakti), daha uzun bir yari ömür kazandiran bir NXT dizisi olusur. 42-44 (NQS) ve 65-67. (NSS) pozisyonlarda baska NX(T/S) dizileri bulunur, ancak bunlardan ikincisi, 64. pozisyondaki R ile birlikte verimli bir sekilde glikozilasyona ugramayabilir. N-X-S/T dizileri genel olarak Sekil 1'de tanimlanan Iigand baglanma cebinin disinda kalan pozisyonlara dahil edilebilir. Endojen olmayan N-X-S/T dizilerinin katilimi için özellikle uygun bölgeler, 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 veya 129-134. amino asitleri kapsar. N-X-S/T dizileri ayrica ActRIIB dizisi ile Fc veya baska bir füzyon bileseni arasinda yer alan baglantiya dahil edilebilir. Böylesi bir bölge, önceden var olan bir 8 veya T'ye göre dogru pozisyona bir N'nin yerlestirilmesi veya önceden var olan bir N'ye karsilik gelen bir pozisyona bir 8 veya T'nin yerlestirilmesi yoluyla minimal çabayla dahil edilebilir. Dolayisiyla, bir N-bagli glikozilasyon bölgesi olusturacak arzu edilebilir degisiklikler sunlardir: A24N, R64N, 867N (muhtemelen bir N65A degisikligi ile birlikte), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S ve R112T. Glikozilli oldugu kestirilen herhangi bir 8, glikozilasyonun sagladigi koruma sayesinde bir immünojenik bölge olusturmadan bir T halinde degisiklige ugratilabilir. Benzer bir sekilde, glikozilli oldugu kestirilen herhangi bir T, bir 8 halinde degisiklige ugratilabilir. Dolayisiyla 867T ve S44T degisiklikleri öngörülür.
Benzer bir sekilde, bir A24N varyantinda, bir S26T degisikligi kullanilabilir. Dolayisiyla bir GDF Tuzagi, bir veya daha fazla endojen olmayan ilave N-bagli glikozilasyon konsensus dizisine sahip bir ActRlIB varyanti olabilir. 27 ActRIIB'nin L79 pozisyonu, degistirilmis aktivin - miyostatin (GDF-11) baglanma özellikleri kazandirmak için degisiklige ugratilabilir. L79A veya L79P, GDF-11 baglanimini aktivin baglanimindan daha yüksek düzeyde azaltir. L79E veya L79D, GDF-11 baglanimini korur.
Belirgin bir sekilde, L79E ve L79D varyantlari büyük ölçüde azalmis aktivin baglanimina sahiptir. In vivo deneyler, bu aktivin harici reseptörlerin, kirmizi kan hücrelerini anlamli düzeyde artirma becerisini korudugunu, ancak diger dokular üzerinde azalmis etkiler sergiledigini gösterir. Bu veriler, aktivin üzerinde düsük etkilere sahip polipeptitlerin elde edilmesine yönelik arzu edilebilirligi ve kullanilabilirligi gösterir. Burada tarif edilen yöntemlerde, istege bagli olarak bir veya daha fazla ilave amino asit sübstitüsyonu, eklemesi veya eksilmesi ile kombinasyon halinde, SEQ ID NO:1 veya 39'un 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda bir asidik amino asit (örnegin D veya E) içeren bir varyant ActRIIB polipeptidi olan bir GDF Tuzagi polipeptidi kullanilabilir.
Tarif edilen varyasyonlar çesitli yollarla birlestirilebilir. ilaveten, burada tarif edilen mutagenez programinin sonuçlari, ActRIIB'de korunmasi çogu kez faydali olan amino asit pozisyonlarinin mevcut oldugunu gösterir. Bunlar 64. pozisyon (bazik amino asit), 80. pozisyon (asidik veya hidrofobik amino asit), 78. pozisyon (hidrofobik ve özellikle triptofan), 37. pozisyon (asidik ve özellikle aspartik veya glutamik asit), 56. pozisyon (bazik amino asit), 60. pozisyonu (hidrofobik amino asit, özellikle fenilalanin veya tirozin) kapsar. Dolayisiyla tarifname, burada açiklanan varyantlarin her birinde, korunabilecek bir amino asit çerçevesi saglar. Korunmasi arzu edilebilecek diger pozisyonlar sunlardir: 52. pozisyon (asidik amino asit), 55. pozisyon (bazik amino asit), 81. pozisyon (asidik), 98. pozisyon (polar veya yüklü, özellikle E, D, R veya K).
ActRIIB polipeptitlerinin izole edilmis fragmanlari, bir ActRIIB polipeptidini kodlayan nükleik asidin (örnegin SEQ lD No:4 ve 5) karsilik gelen fragmanindan rekombinant olarak üretilen polipeptitlerin taranmasi yoluyla elde edilebilir. Fragmanlar ayrica konvansiyonel Merrifield kati faz f-Moc veya t-Boc kimyasi gibi ilgili alanda bilinen tekniklerle kimyasal olarak sentezlenebilir. Fragmanlar üretilebilir (rekombinant olarak veya kimyasal sentez yoluyla) ve örnegin bir ActRIIB proteininin veya bir ActRIIB Iigandinin antagonistleri (inhibitörleri) veya agonistleri (aktivatörleri) olarak islev görebilen peptidil fragmanlarini belirlemek için test edilebilir.
Burada, SEQ ID N02, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 veya 41 arasindan seçilen bir amino asit dizisi ile en az %75 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahip bir varyant ActRllB polipeptidi olan bir GDF Tuzagi polipeptidi açiklanir. Belirli durumlarda, GDF Tuzagi, SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 veya 41 arasindan seçilen bir 28 amino asit dizisi ile en az %80, %85, %90, %95, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir. GDF Tuzagi, SEQ ID No:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 veya 41 arasindan seçilen bir amino asit dizisi ile en az %80, %85, %90, %95, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisi içerebilir, esasen bundan olusabilir veya bundan olusabilir, burada SEQ ID NO:1'in L79 pozisyonuna karsilik gelen pozisyon, bir asidik amino asittir (örnegin bir D veya E amino asit kalintisidir).
Mevcut bulus, terapötik etkinligi veya stabiliteyi (örnegin ex vivo raf ömrünü ve in vivo olarak proteolitik yikima karsi direnci) artirmak gibi amaçlar dogrultusunda, bir GDF Tuzagi polipeptidinin yapisini degistirmek suretiyle fonksiyonel varyantlarin yapimini öngörür. GDF Tuzagi polipeptitleri ayrica amino asit sübstitüsyonu, eksiltmesi veya eklemesi yoluyla üretilebilir. Örnegin, bir lösinin bir izolösin veya valin ile, bir aspartatin bir glutamat ile, bir treoninin bir serin ile izole ikamesi veya bir amino asidin yapisal olarak alakali bir amino asit ile benzer bir ikamesinin (örnegin konzervatif mutasyonlar), elde edilen molekülün biyolojik aktivitesi üzerinde önemli bir etki olusturmayacaginin beklenmesi makuldür. Konzervatif ikameler, yan zincirlerinde baglantili olan bir amino asit ailesinin içinde gerçeklestirilen ikamelerdir. Bir GDF Tuzagi polipeptidinin amino asit dizisinde bir degisimin fonksiyonel bir varyant ile sonuçlanip sonuçlanmayacagi, GDF Tuzagi polipeptidinin, degistirilmemis GDF Tuzagi polipeptidine veya bir dogal sus ActRIIB polipeptidine kiyasla hücrelerde bir yanit olusturma veya degistirilmemis GDF Tuzagi polipeptidine veya bir dogal sus ActRIIB polipeptidine kiyasla aktivin, GDF-11 veya miyostatin gibi bir veya daha fazla Iiganda baglanma becerisinin degerlendirilmesi yoluyla kolayca belirlenebilir.
Mevcut bulus, bir ActRIIB polipeptidinin degistirilmis Iigand baglayici aktivitelere (örnegin baglanma afinitesi veya baglanma spesifikligi) sahip olmasini saglamak üzere, ActRIIB polipeptidinin ekstraselüler domeninde (Iigand baglayici domen olarak da adlandirilir) mutasyonlarin yapimini öngörür. Belirli durumlarda, bu gibi GDF Tuzagi polipeptitleri, spesifik bir Iigand için degistirilmis (artirilmis veya azaltilmis) baglanma afinitesi sergiler. Diger durumlarda, GDF Tuzagi polipeptitleri, ActRIIB ligandlari için degistirilmis baglanma spesifikligine sahiptir. Örnegin tarifname, aktivinlere kiyasla GDF8/GDF11'e tercihli sekilde baglanan GDF Tuzagi polipeptitleri saglar. Tarifname, ilaveten, bu tip polipeptitlerin hedef disi etkileri azaltmak için arzu edilebilirligini kanitlar, ancak böylesi seçici varyantlar, terapötik etki için kirmizi kan hücresi düzeylerinde çok yüksek kazanimlara ihtiyaç duyuldugu ve bir kisim hedef disi etkinin kabul edilebilir oldugu agir hastaliklarin tedavisinde daha az arzu edilebilir. Örnegin 29 ActRIIB proteininin E39, K55, Y60, K74, W78, D80 ve F101 gibi amino asit kalintilari Iigand baglanma cebindedir ve aktivin ve GDF8 gibi Iigandlara baglanima aracilik eder. Dolayisiyla mevcut tarifname, bu amino asit kalintilarinda bir veya daha fazla mutasyon içeren, bir ActRIIB reseptörüne ait bir degistirilmis Iigand baglayici domene (örnegin GDF8 baglayici domen) sahip bir GDF Tuzagi saglar. Istege bagli olarak. degistirilmis Iigand baglayici domen, bir ActRIIB reseptörüne ait bir dogal sus Iigand baglayici domene kiyaslai GDF8 gibi bir Iigand için artmis seçicilige sahip olabilir. Açiklama amaciyla, bu mutasyonlar, degistirilmis Iigand baglayici domenin aktivine kiyasla GDF8 için seçiciligini artirir. Istege bagli olarak, degistirilmis Iigand baglayici domenin, aktivin baglanimi için Kd degeri ile GDF8 baglanimi için Kd degeri arasindaki orani, dogal sus Iigand baglayici domenin oranina kiyasla en az 2, , 10 ve hatta 100 kat daha yüksektir. Istege bagli olarak, degistirilmis Iigand baglayici domenin, aktivin inhibisyonu için leo degeri ile GDF8 inhibisyonu için ICso degeri arasindaki orani, dogal sus Iigand baglayici domene kiyasla en az 2, 5, 10 ve hatta 100 kat daha yüksektir. Istege bagli olarak, degistirilmis Iigand baglayici domen, GDF8'i, aktivin inhibisyonu için |C50 degerinden en az 2, 5, 10 ve hatta 100 kat daha düsük bir ICso degeri ile inhibe eder.
Spesifik bir örnek olarak, ActRIIB'nin Iigand baglayici domeninin arti yüklü Asp (D80) amino asit kalintisi, GDF8'e tercihli sekilde baglanan, ancak aktivine baglanmayan bir GDF Tuzagi polipeptidi üretmek için, farkli bir amino asit kalintisi halinde mutasyona ugratilabilir. Tercih edildigi haliyle, D80 kalintisi, sunlardan olusan gruptan seçilen bir amino asit kalintisi ile degistirilir: bir yüksüz amino asit kalintisi, bir eksi yüklü amino asit kalintisi ve bir hidrofobik amino asit kalintisi. Baska bir spesifik örnek olarak, hidrofobik kalinti L79, aktivin baglanimini büyük ölçüde azaltmak ve ayni zamanda GDF11 baglanimini korumak amaciyla asidik amino asitler aspartik asit veya glutamik asit ile degistirilebilir. Ilgili alanin uzmanlarinca fark edilecegi üzere, tarif edilen mutasyonlarin, varyantlarin veya degisikliklerin birçogu nükleik asit seviyesinde veya bazi durumlarda post-translasyonel modifikasyon veya kimyasal sentez yoluyla gerçeklestirilebilir. Bu tip teknikler ilgili alanda iyi bilinir.
Mevcut bulus, ActRIIB polipeptidinin glikozilasyonunu degistirmek üzere ActRIIB'de spesifik mutasyonlar içeren GDF Tuzagi polipeptitlerini öngörür. GDF Tuzagi polipeptitlerinde örnek glikozilasyon bölgeleri Sekil 1'de gösterilir (örnegin alti çizgili NX(S/T) bölgeleri). Bu tip mutasyonlar, O-bagli veya N-bagli glikozilasyon bölgeleri gibi bir veya daha fazla glikozilasyon bölgesini ekleyecek ve elimine edecek sekilde seçilebilir. Asparagine bagli glikozilasyon tanima bölgeleri genel olarak uygun hücresel glikozilasyon enzimleri tarafindan spesifik olarak taninan bir tripeptit dizisi, asparagin-X-treonin (burada "X“, herhangi bir amino asittir) içerir. Degisiklik ayrica bir veya daha fazla serin veya treonin kalintisinin dogal sus ActRIIB polipeptit dizisine eklenmesi veya orijinal antikor dizisinin bir veya daha fazla serin veya treonin kalintisi ile sübstitüe edilmesi yoluyla yapilabilir (0 bagli glikozilasyon bölgeleri için). Bir veya bir glikozilasyon tanima bölgesinin birinci ve/veya üçüncü amino asit pozisyonlarinda çesitli amino asit sübstitüsyonlari veya eksilmeleri (ve/veya ikinci pozisyonda amino asit eksilmesi), degistirilmis tripeptit dizisinde aglikozilasyon ile sonuçlanir. Bir GDF Tuzagi polipeptidinde karbonhidrat kisimlarinin sayisini artirmanin baska bir yolu, glikozitlerin GDF Tuzagi polipeptidine kimyasal veya enzimatik olarak kenetlenmesidir.
Sekerler, kullanilan kenetleme moduna bagli olarak, (a) arginin ve histidin kalintilarina, (b) serbest karboksil gruplarina, (G) serbest sülfhidril gruplarina, örnegin sistein kalintisindaki serbest sülfhidril gruplarina, (d) serbest hidroksil gruplarina, örnegin serin, treonin veya hidroksiprolin kalintisindaki serbest hidroksil gruplarina, (e) fenilalanin, tirozin veya triptofandakiler gibi aromatik kalintilara veya (f) glutamin kalintisindaki amid grubuna baglanabilir. Bu yöntemler WO 87/05330'da ve Aplin ve Wriston (1981) CRC Crit. Rev.
Biochem., pp. 259-306'da açiklanir. Bir GDF Tuzagi polipeptidinde bir veya daha fazla karbonhidrat kisminin çikarilmasi kimyasal olarak ve/veya enzimatik olarak gerçeklestirilebilir. Kimyasal deglikozilasyon örnegin GDF Tuzagi polipeptidinin triflorometansülfonik asit bilesigine veya esdeger bir bilesige maruz birakilmasini içerir. Bu muamele, baglayici seker (N-asetilglikozamin veya N-asetilgalaktozamin) haricinde sekerlerin çogunun veya tamaminin kesime ugramasini ve ayni zamanda amino asit dizisinin saglam kalmasini saglar. Kimyasal deglikozilasyon, Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem.
Biophys. 259:52 ve Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131 tarafindan daha ayrintili olarak açiklanir. GDF Tuzagi polipeptitlerinde karbonhidrat kisimlarinin enzimatik kesimi, Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350 tarafindan açiklandigi üzere çesitli endo- ve ekzo-glikozidazlarin kullanimi yoluyla basarilabilir. Bir GDF Tuzagi polipeptidinin dizisi, uygun oldugu takdirde, kullanilan ifade sisteminin türüne bagli olarak ayarlanabilir, çünkü memeli, maya, böcek ve bitki hücrelerinden her biri peptidin amino asit dizisinden etkilenen farkli glikozilasyon patemleri saglayabilir. Genel olarak, insanlarda kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptitleri, dogru glikozilasyon saglayan bir memeli hücre hattinda, örnegin HEK293 veya CHO hücre hatlarinda ifade edilecektir, ancak diger memeli ifade hücre hatlarinin da faydali olmasi beklenir.
Bu tarifname, ilaveten, istege bagli olarak budama varyantlari da dahil olmak üzere, bir GDF Tuzagi polipeptidinin varyantlarini, özellikle kombinatoryal varyantlarinin kümelerini üretmeye yönelik bir yöntemi öngörür; kombinatoryal mutant havuzlari özellikle GDF Tuzagi dizilerini belirlemek için faydalidir. Böylesi kombinatoryal kütüphanelerin taranmasinin amaci, örnegin degistirilmis özelliklere, mesela degistirilmis farmakokinetiklere veya degistirilmis Iigand baglanimina sahip GDF Tuzagi polipeptidi varyantlarini üretmek olabilir. Ilerleyen kisimlarda 31 çesitli tarama analizleri verilir ve bu analizler varyantlari degerlendirmek için kullanilabilir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptit varyanti, bir ActRllB polipeptidine baglanma, bir ActRIIB ligandinin bir ActRIIB polipeptidine baglanimini engelleme veya bir ActRllB ligandindan kaynaklanan sinyal iletimine müdahale etme becerisi için taranabilir.
Bir GDF Tuzagi polipeptidinin veya bunun varyantlarinin aktivitesi ayrica bir hücre esasli veya in vivo analizde test edilebilir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptit varyantinin, hematopoeze karisan genlerin ifadesine etkisi degerlendirilebilir. Bu, gerektigi takdirde, bir veya daha fazla rekombinant ActRllB Iigand proteininin (örnegin aktivin) varliginda gerçeklestirilebilir ve hücreler, bir GDF Tuzagi polipeptidi ve/veya bunun varyantlari ve istege bagli olarak bir ACtRIIB ligandini üretmek için transfekte edilebilir. Benzer bir sekilde, bir GDF Tuzagi polipeptidi bir fareye veya baska bir hayvana verilebilir ve ilgili alanda bilinen yöntemlerle bir veya daha fazla kan ölçümü, örnegin bir RBC sayisi, hemoglobin düzeyleri, hematokrit düzeyleri, demir depolari veya retikülosit sayisi degerlendirilebilir.
Bir referans GDF Tuzagi polipeptidine kiyasla bir seçici etki gücüne sahip kombinatoryal olarak türetilen varyantlar üretilebilir. Bu tip varyant proteinler, rekombinant DNA konstraktlarindan ifade edildiginde, gen tedavisi protokollerinde kullanilabilir. Benzer bir sekilde, mutagenez, karsilik gelen degistirilmemis GDF Tuzagi polipeptidine kiyasla dramatik düzeyde farkli intraselüler yari ömürlere sahip varyantlar saglayabilir. Örnegin degistirilmis protein, bir degistirilmemis GDF Tuzagi polipeptidinin yikimi veya aksi takdirde pasiflesmesi ile sonuçlanan proteolitik yikima veya diger süreçlere karsi daha çok stabil veya daha az stabil hale getirilebilir. Bu varyantlar ve bunlari kodlayan genler, GDF Tuzagi polipeptitlerinin yari ömrünü modüle etmek suretiyle GDF Tuzagi polipeptidinin düzeylerini degistirmek için kullanilabilir. Örnegin kisa bir yari ömür, daha geçici biyolojik etkilere neden olabilir ve bir uyarilabilir ifade sisteminin bir parçasi oldugunda, hücre içinde rekombinant GDF Tuzagi polipeptidi düzeylerinin daha siki kontrolünü saglayabilir. Bir Fc füzyon proteininde, proteinin yari ömrünü degistirmek için baglanti (eger mevcutsa) ve/veya Fc kisminda mutasyonlar gerçeklestirilebilir.
Bulusta kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptitleri, ilaveten, ActRIIB polipeptitlerinde dogal olarak bulunan herhangi bir degisiklige ek olarak post-translasyonel degisiklikler içerebilir. Bu tip degisiklikler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla asetilasyon, karboksilasyon, glikosilasyon, fosforilasyon, lipidasyon ve asilasyonu kapsar. Sonuç olarak, GDF Tuzagi polipeptitleri polietilen glikoller, Iipitler, polisakkarit veya monosakkarit ve fosfatlar gibi amino asit harici ögeler içerebilir. Bu amino asit harici ögelerin, bir GDF Tuzagi polipeptidinin fonksiyonelligine etkileri, burada diger GDF Tuzagi polipeptit varyantlari için tarif edildigi gibi 32 test edilebilir. Bir GDF Tuzagi polipeptidi hücrelerde GDF Tuzagi polipeptidinin yeni olusan bir formun kesime ugramasi yoluyla üretildiginde, proteinin dogru katlanmasi ve/veya fonksiyonu için post-translasyonel islemler de önemli olabilir. Farkli hücreler (örnegin CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 veya HEK293) bu tip post-translasyonel aktiviteler için spesifik hücresel unsurlara ve karakteristik mekanizmalara sahiptir ve GDF Tuzagi polipeptitlerinin dogru modifikasyonu ve dogru sekilde islenmesini saglayacak sekilde seçilebilir.
GDF Tuzagi polipeptitleri, bir ActRIIB polipeptidinin en azindan bir kismina ve bir veya daha fazla füzyon domenine sahip füzyon proteinlerini kapsayabilir. Bu gibi füzyon domenlerinin iyi bilinen örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, polihistidin, GIu-Glu, glutation S transferaz (GST), tioredoksin, protein A, protein G, bir immünglobülin agir zincir sabit bölgesi (örnegin bir Fc), maltoz baglayici protein (MBP) veya insan serum albüminini kapsar. Bir füzyon domeni, arzu edilen bir özelligi kazandiracak sekilde seçilebilir. Örnegin bazi füzyon domenleri özellikle füzyon proteinlerinin afinite kromatografisi ile izolasyonu için faydalidir.
Afinite saflastirmasi için, afinite kromatografisine yönelik ilgili matriksler, örnegin glutation, amilaz ve nikel veya kobalt ile konjüge reçineler kullanilir. Bu tip matrikslerin birçogu, örnegin (HISs) füzyon partnerleri ile birlikte kullanilabilen QIAexpressTM sistemi (Qiagen) ve Pharmacia GST saflastirma sisteminde oldugu gibi "kit" formunda bulunur. Baska bir örnek olarak, bir füzyon domeni, GDF Tuzagi polipeptitlerinin tayinini kolaylastiracak sekilde seçilebilir. Bu gibi tayin domenlerinin örnekleri, çesitli floresan proteinleri (örnegin GFP) ve ayrica genellikle kendilerine yönelik spesifik bir antikorun mevcut oldugu kisa peptit dizileri olan "epitop isaretleri" kapsar. Kendilerine yönelik spesifik monoklonal antikorlarin halihazirda mevcut oldugu iyi bilinen epitop isaretler, FLAG, influenza virüsü hemagglutinini (HA) ve c-myc isaretlerini kapsar. Bazi durumlarda füzyon domenleri, ilgili proteazin füzyon proteinlerini kismen kesime ugratmasini ve böylece rekombinant proteinlerin serbest kalmasini saglayan, örnegin Faktör Xa veya Trombin için bir proteaz kesim bölgesine sahiptir. Serbest kalan proteinler akabinde sonraki kromatografik ayirma islemleriyle füzyon domeninden izole edilebilir. Bir GDF Tuzagi polipeptidi, GDF Tuzagi polipeptidini in vivo olarak stabilize eden bir domen (bir "stabilizör" domen) ile kaynastirilabilir. "Stabilize etmek" teriminden kasit, azalmis yikim, böbrekte azalmis kIirens veya baska bir farmakokinetik etkiden kaynaklanip kaynaklanmadigindan bagimsiz olarak serum yari ömrünü artiran herhangi bir islemdir. Bir immünglobülinin Fc kismina sahip füzyonlarin çok çesitli proteinlere arzu edilebilir farmakokinetik özellikler kazandirdigi bilinir. Benzer bir sekilde, insan serum albümini ile füzyonlar da arzu edilebilir özellikler kazandirabilir. Seçilebilecek diger füzyon domeni türleri, multimerlestirici (örnegin dimerlestirici, tetramerlestirici) domenleri ve 33 fonksiyonel domenleri (bir ilave biyolojik fonksiyon kazandirir, örnegin kirmizi kan hücresi düzeylerini daha da artirir) kapsar.
Spesifik bir örnek olarak, mevcut tarifname, ActRllB polipeptidinin bir ekstraselüler (örnegin Iigand baglayici) domenini bir FC domeni ile kaynasik halde içeren bir ActRllB-Fc füzyon proteini olan bir GDF Tuzagi saglar. Bir örnek FC domeni dizisi asagida gösterilir (SEO ID No:6).
I.' 1. ~..'I..l.|3- i.t..' ;'l'.}.' Iv'I,.'Il'l f', ...tl..:.."-7' ;'r-."Ii.'.':..- "'î'."'r-'1r'*:':'irrig"î«'."'îi"','.î'" "" "f'ii'.°›”'“"r' 4' ""I'l-" i r":"”'”'f:" " Istege bagli olarak, Fc domeni, Asp-265, lizin 322 ve Asn-434 gibi kalintilarda bir veya daha fazla mutasyon içerir. Belirli durumlarda, bu mutasyonlarin (örnegin Asp-265 mutasyonu) bir veya daha fazlasina sahip mutant Fc domeni, Fcy reseptörüne baglanma becerisi, bir dogal sus FC domenine kiyasla daha azdir. Diger durumlarda, bu mutasyonlarin (örnegin Asn-434 mutasyonu) bir veya daha fazlasina sahip mutant Fc domeninin MHC sinif I ile ilgili Fc reseptörüne (FCRN) 'e baglanma becerisi, bir dogal sus Fc domenine kiyasla daha fazladir.
Füzyon proteinlerinin farkli ögelerinin, arzu edilen fonksiyonellik ile tutarli olarak herhangi bir sekilde düzenlenebilecegi anlasilmalidir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidi, bir heterolog domenin C terminal tarafina yerlestirilebilir veya alternatif olarak bir heterolog domen, bir GDF Tuzagi polipeptidinin C terminal tarafina yerlestirilebilir. Bir füzyon proteininde GDF Tuzagi polipeptit domeni ile heterolog domenin bitisik olmasi gerekmez ve herhangi bir domenin C veya N terminal tarafina veya domenlerin arasina ilave domenler veya amino asit dizileri dahil edilebilir.
Bir GDF Tuzagi füzyon proteini, A-B-C formülüyle gösterilen bir amino asit dizisine sahip olabilir. B kismi, SEQ ID NO:26'nin 26-132. amino asitlerine karsilik gelen amino asit dizisinden olusan, N ve C terminali budanmis bir ActRllB polipeptididir. A ve C kisimlari bagimsiz olarak sifir, bir veya daha fazla amino asit olabilir ve mevcut oldugunda hem A hem de C kismi B için heterologtur. A ve/veya C kisimlari B kismina bir baglanti dizisi üzerinden baglanabilir. Örnek baglantilar, kisa polipeptit baglantilari, mesela 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 Glisin kalintisini, örnegin bir GIy-Gly-Gly baglantisini kapsar. Diger uygun baglantilar yukarida tarif edilmektedir. Bir GDF Tuzagi füzyon proteini, A-B-C formülüyle gösterilen bir amino asit dizisine sahip olabilir, burada A, bir lider dizidir, B, SEQ ID NO:26'nin 26-132. amino asitlerinden olusur ve C, in vivo stabilite, in vivo yari ömür, alim/uygulama, doku 34 Iokalizasyonu veya dagilim, protein komplekslerinin olusumu ve/veya saflastirmadan bir veya daha fazlasini iyilestiren bir polipeptit kismidir. Bir GDF Tuzagi füzyon proteini, A-B-C formülüyle gösterilen bir amino asit dizisine sahip olabilir, burada A, bir TPA lider dizisidir, B, SEQ ID NO:26'nin 26-132. amino asitlerinden olusur ve C, bir immünglobülin Fc domenidir.
Tercih edilen bir GDF Tuzagi füzyon proteini, SEQ lD NO:26 ile gösterilen amino asit dizisine sahiptir.
Mevcut bulusta kullanilmaya yönelik GDF Tuzagi polipeptitleri, GDF Tuzagi polipeptitlerini stabilize etme kapasitesine sahip bir veya daha fazla degisiklik içerebilir. Bu tip degisiklikler örnegin GDF Tuzagi polipeptitlerinin in vitro yari ömrünü uzatabilir, GDF Tuzagi polipeptitlerinin dolasimdaki yari ömrünü uzatabilir veya GDF Tuzagi polipeptitlerinin proteolitik yikimini azaltabilir. Stabilize edici bu degisiklikler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, füzyon proteinleri (örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidi ve bir stabilizör domen içeren füzyon proteinleri), bir glikozilasyon bölgesi degisiklikleri (örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidine bir glikozilasyon bölgesinin eklenmesi) ve karbonhidrat kismi degisikliklerini (örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidinden karbonhidrat kisimlarinin çikarilmasi) kapsar.
Füzyon proteinleri söz konusu oldugunda, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile bir lgG molekülü (örnegin bir Fc domeni) gibi bir stabilizör domen kaynastirilir. Burada kullanildigi haliyle, "stabilizör domen" terimi, füzyon proteinleri söz konusu oldugunda bir füzyon domeninin (örnegin Fc) yani sira, bir karbonhidrat kismi veya proteinsiz polimer, örnegin polietilen glikol gibi proteinsiz degisiklikleri de kapsar.
Mevcut tarifname, GDF Tuzagi polipeptitlerinin, diger proteinlerden izole edilen veya aksi takdirde diger proteinleri büyük ölçüde içermeyen izole edilmis ve/veya saflastirilmis formlarini saglar.
GDF Tuzagi polipeptitleri (degistirilmemis veya degistirilmis), ilgili alanda bilinen çesitli tekniklerle üretilebilir. Örnegin bu gibi GDF Tuzagi polipeptitleri, Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) ve Grant G. A. (ed), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)'de açiklananlar gibi standart protein kimyasi teknikleriyle sentezlenebilir. Ilaveten, otomatik peptit sentezleyicileri piyasadan temin edilebilir (örnegin Advanced ChemTeCh Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternatif olarak, GDF Tuzagi polipeptitleri, bunlarin fragmanlari veya varyantlari, ilgili alanda iyi bilindigi üzere çesitli ifade sistemleriyle (örnegin E. coli, Çin Hamster Overi (CHO) hücreleri, COS hücreleri, bakulovirüs) rekombinant olarak üretilebilir. Degistirilmis veya degistirilmemis GDF Tuzagi polipeptitleri, rekombinant olarak üretilen tam uzunluklu GDF Tuzagi polipeptitlerinin örnegin tripsin, termolisin, kimotripsin, pepsin veya eslenik bazik amino asit dönüstürücü enzim (PACE) gibi bir proteaz ile kesime ugratilmasi yoluyla üretilebilir. Proteolitik kesim bölgelerini belirlemek için bilgisayar analizi (piyasadan temin edilebilen bir yazilim, örnegin MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kullanilabilir. Alternatif olarak, bu tip GDF Tuzagi polipeptitleri, ilgili alanda bilinen standart tekniklerle, örnegin kimyasal kesim (örnegin siyanojen bromür, hidroksilamin) yoluyla, rekombinant olarak üretilen tam uzunluklu GDF Tuzagi polipeptitlerinden elde edilebilir. 3. GDF Tuzagi Polipeptitlerini Kodlayan Nükleik Asitler Burada, burada açiklanan GDF Tuzagi polipeptitlerinden herhangi birini kodlayan izole edilmis ve/veya rekombinant nükleik asitler açiklanir. SEQ ID No:4, dogal yoldan meydana gelen bir ActRllB öncül polipeptidini kodlar, SEQ ID No:5, bir çözünür ActRllB polipeptidini kodlar ve SEO ID NO:25, 27, 30 ve 31, çözünür GDF Tuzaklarini kodlar. Ilgili nükleik asitler tek iplikli veya çift iplikli olabilir. Bu nükleik asitler, DNA veya RNA molekülleri olabilir. Bu nükleik asitler örnegin GDF Tuzagi polipeptitlerinin yapimina yönelik yöntemlerde veya dogrudan terapötik ajanlar olarak (örnegin bir gen tedavisi yaklasiminda) kullanilabilir.
GDF Tuzagi polipeptitlerini kodlayan ilgili nükleik asitlerin, SEQ ID No:5, 25, 27, 30 ve 31'in varyantlari olan nükleik asitleri kapsadigi anlasilmalidir. Varyant nükleotit dizileri, bir veya daha fazla nükleotit sübstitüsyonu, eklemesi veya eksilmesi bakimindan farklilik gösteren dizileri, örnegin alelik varyantlari içerir ve dolayisiyla SEQ ID No:5, 25, 27, 30 ve 31'de gösterilen kodlayici dizinin nükleotit dizisinden farkli kodlayici dizileri kapsar.
Burada, SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31 ile en az %80, %85, %90, %95, %97, %98, %99 veya %100 oraninda özdeslik sergileyen izole edilmis veya rekombinant nükleik asit dizileri açiklanir. Ilgili alanin uzmanlari, SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31'in komplementeri olan nükleik asit dizilerinin ve SEO ID No:5, 25, 27, 30 veya 31'in varyantlarinin da burada açiklandigini takdir edecektir. Nükleik asit dizileri izole edilmis, rekombinant ve/veya bir heterolog nükleotit dizisi ile kaynasik olabilir veya bir DNA kütüphanesi içinde bulunabilir.
Burada açiklanan nükleik asitler ayrica SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31 ile gösterilen nükleotit dizisi, SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31'in komplementer dizisi veya bunlarin fragmanlari ile yüksek kesinlik kosullari altinda hibritlesen nükleotit dizilerini içerir. Yukarida ele alindigi üzere, ilgili alanin uzmanlari, DNA hibridizasyonunu destekleyen uygun kesinlik kosullarinin degiskenlik gösterebilecegini kolaylikla anlayacaktir. Örnegin hibridizasyon, yaklasik 45°C'de 6.0 x sodyum kIorür/sodyum sitrat (SSC) ve akabinde yikama adimi olarak 50°C'de 2.0 x SSC ile gerçeklestirilebilir. Örnegin yikama adimindaki tuz konsantrasyonu, 36 50°C'de yaklasik 2.0 x SSC seklinde bir düsük kesinlik ila 50°C'de yaklasik 0.2 x SSC seklinde bir yüksek kesinlik arasindan seçilebilir. Ilaveten, yikama adimindaki sicaklik, oda sicakliginda (yaklasik 22°C) düsük kesinlik kosullarindan, yaklasik 65°C'de yüksek kesinlik kosullarina yükseltilebilir. Hem sicaklik hem de tuz konsantrasyonu degisebilir veya baska bir degisken degisirken sicaklik veya tuz konsantrasyonu sabit kalabilir. Burada, oda sicakliginda 6 x SSC ve akabinde yikama adimi olarak oda sicakliginda 2 x SSC seklindeki düsük kesinlik kosullari altinda hibritlesen nükleik asitler açiklanir.
Burada, genetik kodda dejenerasyondan dolayi SEQ ID No:5, 25, 27, 30 veya 31 ile gösterilen nükleik asitler farkli olan izole nükleik asitler de açiklanir. Örnegin birtakim amino asitler, birden fazla üçlü ile gösterilir. Ayni amino asidi belirten kodonlar veya esanlamlilar (örnegin histidin için CAU ve CAC esanlamlidir), proteinin amino asit dizisini etkilemeyen "sessiz" mutasyonlar ile sonuçlanabilir. GDF Tuzagi polipeptidi, alternatif bir nükleotit dizi tarafindan kodlanabilir. Alternatif nükleotit dizileri, dogal GDF Tuzagi nükleik asit dizisine göre dejeneredir, ancak hala ayni füzyon proteinini kodlamaktadir. SEQ ID NO:26'ya sahip GDF Tuzagi, SEQ ID NO:30'u içeren bir alternatif nükleik asit dizisi tarafindan kodlanabilir.
Ancak, memeli hücreleri arasinda ilgili proteinlerin amino asit dizilerinde degisimlere yol açan DNA dizi polimorfizmlerinin mevcut olmasi beklenir. Ilgili alanin uzmanlari, belirli bir proteini kodlayan nükleik asitlerin bir veya daha fazla nükleotidindeki (nükleotitlerin yaklasik %3-5 kadari) bu varyasyonlarin, dogal alelik varyasyondan dolayi, belirli bir türe ait bireyler arasinda mevcut olabilecegini takdir edecektir. Böylesi nükleotit varyasyonlarinin ve meydana gelen amino asit polimorfizmlerinin herhangi biri ve tamami burada açiklanmaktadir.
Burada açiklanan rekombinant nükleik asitler bir ifade konstraktinda bir veya daha fazla regülatör nükleotit dizisine operatif sekilde baglanabilir. Regülatör nükleotit dizileri genel olarak ifade için kullanilan konakçi hücre için elverislidir. Çesitli konakçi hücreler için muhtelif uygun ifade vektörleri ve uygun regülatör diziler ilgili alanda bilinir. Tipik olarak, bahsedilen bir veya daha fazla regülatör nükleotit dizisi, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, promotör diziler, lider diziler veya sinyal dizileri, ribozomal baglanma bölgeleri, transkripsiyonel baslatma ve durdurma dizileri, translasyonel baslatma ve durdurma dizileri ve hizlandirici veya aktivatör dizileri kapsar. Ilgili alanda bilinen konstitütif veya uyarilabilir promotörler öngörülür. Promotörler, dogal yoldan meydana gelen promotörler veya birden fazla promotör ögesini birlestiren hibrit promotörler olabilir. Bir ifade konstrakti bir hücrede bir epizom. örnegin bir plazmit üzerinde bulunabilir veya ifade konstrakti bir kromozoma dahil edilebilir.
Tercih edildigi haliyle ifade vektörü, transformasyona ugrayan konakçi hücrelerin seçilmesini 37 saglayan bir seçilebilir belirteç geni içerir. Seçilebilir belirteç genleri ilgili alanda iyi bilinir ve kullanilan konakçi hücreye göre degiskenlik gösterir.
Ilgili nükleik asit, bir GDF Tuzagi polipeptidini kodlayan bir nükleotit dizini, en az bir regülatör diziye operatif sekilde bagli halde içeren bir ifade vektörünün içinde saglanabilir. Regülatör diziler ilgili alanda bilinir ve GDF Tuzagi polipeptidinin ifadesini kontrol edecek sekilde seçilir.
Dolayisiyla, regülatör dizi terimi promotörleri, hizlandiricilari ve diger ifade kontrol ögelerini kapsar. Örnek regülatör diziler Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)'da tarif edilir. Örnegin bu vektörlerde, bir GDF Tuzagi polipeptidini kodlayan DNA dizilerini ifade etmek için, operatif sekilde bagli oldugu bir DNA dizisinin ifadesini kontrol eden Çok çesitli ifade kontrol dizilerinden herhangi biri kullanilabilir. Böylesi faydali ifade kontrol dizileri örnegin SV40 erken ve geç promotörleri, tet promotörü, adenovirüs veya sitomegalovirüs en erken promotörü, RSV promotörleri, Iac sistemi, trp sistemi, TAC veya TRC sistemi, ifadesi T7 RNA polimeraz tarafindan kontrol edilen T7 promotörü, faj lambdanin majör operatör ve promotör bölgeleri, fd kilif proteinine yönelik kontrol bölgeleri, 3-fosfogliserat kinaz veya diger glikolitik enzimlere yönelik promotör, asit fosfataz, örnegin Ph05 promotörleri, maya oi eslestirme faktörlerinin promotörleri, bakulovirüs sisteminin polihedron promotörü ve prokaryotik veya ökaryotik hücrelerde veya bunlarin virüslerinde genlerin ifadesini kontrol ettigi bilinen diger diziler ve bunlarin çesitli kombinasyonlarini kapsar. Ifade vektörünün tasariminin, transformasyona ugratilacak konakçi hücrenin seçimi ve/veya ifade edilmesi arzu edilen proteinin tipi gibi faktörlere bagli olacagi anlasilmalidir. Ayrica, vektörün kopya sayisi, bu kopya sayisini kontrol etme becerisi ve vektör tarafindan kodlanan antibiyotik belirteçleri gibi heihangi bir diger proteinin ifadesi de göz önünde bulundurulmalidir.
Bir rekombinant nükleik asit, klonlanan genin veya bir kisminin, prokaryotik hücrelerde ve/veya ökaryotik hücrelerde (maya, kus, böcek veya memeli) ifade için uygun bir vektöre Iigasyon yoluyla baglanmasi suretiyle üretilebilir. Bir rekombinant GDF Tuzagi polipeptidinin üretimine yönelik ifade araçlari, plazmitleri ve diger vektörleri kapsar. Örnegin uygun vektörler, su tipte plazmitleri içerir: E. coli gibi prokaryotik hücrelerde ifade için pBR322 kökenli plazmitler, pEMBL kökenli plazmitler, pEX kökenli plazmitler, pBTac kökenli plazmitler ve pUC kökenli plazmitler.
Bazi memeli ifade vektörleri, hem vektörün bakterilerde çogalmasini kolaylastirmak için prokaryotik dizilere, hem de ökaryotik hücrelerde ifade edilen bir veya daha fazla ökaryotik transkripsiyon birimine sahiptir. poDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV29pt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo ve pHyg kökenli vektörler, ökaryotik 38 hücrelerin transfeksiyonu için uygun memeli ifade vektörlerinin örnekleridir. Bu vektörlerin bazilari, hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde replikasyon ve ilaç direnci seçimini kolaylastirmak amaciyla, pBR322 gibi bakteriyel plazmitlere ait diziler ile degisiklige ugratilir.
Alternatif olarak, proteinlerin ökaryotik hücrelerde geçici ifadesi için sigir papilloma virüsü (BPV-1) veya Epstein-Barr virüsü (pHEBo, pREP kökenli ve p205) gibi virüslerin türevleri kullanilabilir. Diger viral (retroviral dahil) ifade sistemlerinin örnekleri ilerleyen kisimlarda gen tedavisi uygulama sistemlerinin açiklamasinda bulunabilir. Plazmitlerin hazirlanmasinda ve konakçi organizmalarin transformasyonunda kullanilan çesitli yöntemler ilgili alanda iyi bilinir.
Hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler için diger uygun ifade sistemleri ve ayrica genel rekombinasyon prosedürleri için bakiniz Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed.: Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17. Bazi durumlarda, rekombinant polipeptitlerin bir bakulovirüs ifade sistemi ile ifade edilmesi arzu edilebilir. Bu gibi bakulovirüs ifade sistemlerinin örnekleri, pVL kökenli vektörler (örnegin pVL1392, pVL1393 ve pVL941), pAcUW kökenli vektörler (örnegin pAcUW1) ve pBIueBac kökenli vektörleri (örnegin ß-gal içeren pBIueBac lll) kapsar.
Tercih edildigi haliyle, ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerinin CHO hücrelerinde üretimine yönelik bir vektör, örnegin bir Pcmv-Script vektörü (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 vektörleri (lnvitrogen, Carlsbad, Calif.) ve pCI-neo vektörleri (Promega, Madison, Wise.) tasarlanacaktir. Anlasilacagi üzere, ilgili gen konstraktlari, ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerinin kültürde çogaltilan hücrelerde ifadesini saglamak, örnegin saflastirma için füzyon proteinleri veya varyant proteinler de dahil olmak üzere proteinleri üretmek amaciyla kullanilabilir.
Bu tarifname ayrica ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerinden bir veya daha fazlasi için bir kodlayici dizi (örnegin SEQ ID No:4, 5, 25, 27, 30 veya 31) içeren bir rekombinant gen ile transfekte edilen bir konakçi hücre ile ilgilidir. Konakçi hücre, herhangi bir prokaryotik veya ökaryotik hücre olabilir. Örnegin bulusta kullanilmaya yönelik bir GDF Tuzagi polipeptidi, bakteri hücrelerinde, örnegin E. coli hücrelerinde, böcek hücrelerinde (örnegin bir bakulovirüs ifade sistemi kullanilarak), maya hücrelerinde veya memeli hücrelerinde ifade edilebilir. Diger elverisli konakçi hücreler ilgili teknigin uzmanlarinca bilinmektedir.
Dolayisiyla mevcut tarifname, ilaveten, ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerinin üretimine yönelik yöntemler ile ilgilidir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidini kodlayan bir ifade vektörü ile transfekte edilen bir konakçi hücre, GDF Tuzagi polipeptidinin ifadesini saglayacak uygun kosullar altinda kültürlenebilir. GDF Tuzagi polipeptidi, GDF Tuzagi polipeptidini içeren bir hücreler ve ortam karisimindan salgilanabilir ve izole edilebilir. Alternatif olarak, GDF Tuzagi polipeptidi sitoplazmik olarak veya bir membran fraksiyonunda tutulabilir ve hücreler toplanir, 39 Iize edilir ve protein izole edilir. Bir hücre kültürü, konakçi hücreleri, ortamlari ve diger yan ürünleri içerir. Hücre kültürü için uygun ortamlar ilgili alanda iyi bilinir. Ilgili GDF Tuzagi polipeptitleri, iyon degistirme kromatografisi, jel filtreleme kromatografisi, ultrafiltreleme, elektroforez ve GDF Tuzagi polipeptitlerinin belirli epitoplarina spesifik antikorlar ile immün afinite saflastirmasi da dahil olmak üzere proteinlerin saflastirilmasina yönelik ilgili alanda bilinen tekniklerle hücre kültürü ortamindan ve/veya konakçi hücrelerden izole edilebilir. GDF Tuzagi polipeptidi, saflastirmayi kolaylastiran bir domene sahip birfüzyon proteini olabilir.
Rekombinant GDF Tuzagi polipeptidinin arzu edilen kisminin N terminusunda bir saflastirma bölgesi dizisi, ifade edilen füzyon proteininin bir Ni2+ metal reçine üzerinden afinite kromatografisiyle saflastirilmasini saglayabilir. Saflastirma lider dizisi akabinde saflastirilmis GDF Tuzagi polipeptidini saglamak için enterokinaz ile muamele edilerek uzaklastirilabilir (bakiniz örnegin Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177 ve Janknecht et al., PNAS ABD 8828972).
Füzyon genlerinin yapimina yönelik teknikler iyi bilinir. Esasen, farkli polipeptit dizileri için kodlama yapan çesitli DNA fragmanlarinin birlestirilmesi, Iigasyon için kör uçlu veya kaçik uçlu terminuslarin kullanilmasi, uygun terminuslar saglamak için restriksiyon enzimi kesimi, uygun oldugu takdirde yapiskan uçlarin yerlestirilmesi, istenmeyen birlesmeleri engellemek için alkalin fosfataz uygulamasi ve enzimatik Iigasyon gibi konvansiyonel tekniklerle gerçeklestirilebilir. Füzyon geni, otomatik DNA sentezleyiciler de dahil olmak üzere konvansiyonel tekniklerle sentezlenebilir. Alternatif olarak, gen fragmanlarinin PCR amplifikasyonu, iki ardisik gen fragmani arasinda, sonradan bir kimerik gen dizisi üretmek üzere birlestirilebilen komplementer çikintilarin olusmasini saglayan çapa primerler ile gerçeklestirilebilir (bakiniz örnegin Current Protocols in Molecular Biology, ed.: Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). 4. Tarama Analizleri Burada, ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerinin (örnegin çözünür varyant ActRIIB polipeptitleri), ActRIIB polipeptitlerinin agonisti veya antagonisti olan bilesikleri (ajanlari) belirlemeye yönelik kullanimi açiklanir. Bu tarama ile belirlenen bilesikler, kirmizi kan hücresi, hemoglobin ve/veya retikülosit düzeylerini in vivo veya in vitro olarak modüle etme becerilerini degerlendirmek için test edilebilir. Bu bilesikler örnegin hayvan modellerinde test edilebilir. 40 ActRIIB sinyal iletimini hedefleme yoluyla kirmizi kan hücresi veya hemoglobin düzeylerini yükseltmeye yönelik terapötik ajanlar için taramayi amaçlayan çok sayida yaklasim mevcuttur. Bilesiklerin yüksek verimli taramasi, seçilen bir hücre hattinda ActRIIB aracili etkilerini bozan ajanlari belirlemek amaciyla gerçeklestirilebilir. Analiz, bir ActRIIB polipeptidinin baglanma partnerine, örnegin bir ActRIIB ligandina (örnegin aktivin, Nodal, GDF8, GDF11 veya BMP?) baglanimini spesifik olarak inhibe eden veya azaltan bilesikleri taramak ve belirlemek amaciyla gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak analiz, bir ActRIIB polipeptidinin baglanma partnerine, örnegin bir ActRIIB ligandina baglanimini artiran bilesikleri belirlemek amaciyla kullanilabilir. Bilesikler, bir ActRIIB polipeptidi ile etkilesime girme becerileri üzerinden belirlenebilir. Çesitli analiz formatlari yeterli olacaktir ve mevcut tarifname dogrultusunda burada açikça tarif edilmeyenler ilgili alanin uzmanlarinca her halükarda anlasilacaktir. Burada tarif edildigi üzere, burada açiklanan test bilesikleri (ajanlar), herhangi bir kombinatoryal kimyasal yöntem ile üretilebilir. Alternatif olarak, ilgili bilesikler, in vivo veya in vitro olarak sentezlenmis dogal yoldan meydana gelen biyomoleküller olabilir. Doku büyümesinin modülatörleri olarak islev görme becerileri için test edilecek bilesikler (ajanlar) örnegin bakteriler, mayalar, bitkiler veya diger organizmalar (örnegin dogal ürünler) ile, kimyasal olarak (örnegin peptidomimetikler de dahil olmak üzere küçük moleküller) veya rekombinant olarak üretilebilir. Öngörülen test bilesikleri, peptidil olmayan organik moleküller, peptitler, polipeptitler, peptidomimetikler, sekerler, hormonlar ve nükleik asit moleküllerini kapsar. Test ajani, yaklasik 2,000 Daltondan küçük bir molekül agirligina sahip bir küçük organik molekül olabilir.
Burada açiklanan test bilesikleri tekli ayri unsurlar olarak veya örnegin kombinatoryal kimya yöntemleriyle üretilen daha karmasik kütüphanelerde saglanabilir. Bu kütüphaneler örnegin alkoller, alkil halojenürler, aminler, amidler, esterler, aldehitler, eterler ve baska organik bilesik siniflari içerebilir. Test bilesikleri test sistemine izole edilmis bir formda veya özellikle baslangiçtaki tarama adimlarinda bilesik karisimlari seklinde sunulabilir. Bilesikler istege bagli olarak diger bilesiklerle türevlendirilebilir ve bilesiklerin izolasyonunu kolaylastiran türevlendirici gruplara sahip olabilir. Türevlendirici gruplarin sinirlandirici olmayan örnekleri, biyotin, floresin, digoksigenin, yesil floresan protein, izotoplar, polihistidin, manyetik kürecikler, glutation S transferaz (GST), isikla aktiflesebilen çapraz baglayicilar veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu kapsar.
Bilesiklerin ve dogal özütlerin kütüphanelerini test eden birçok ilaç tarama programinda, belirli bir süre zarfinda arastirilan bilesiklerin sayisini maksimize etmek için yüksek verimli analizler arzu edilebilir. Örnegin saflastirilmis veya yari saflastirilmis proteinler ile 41 türevlendirilebilen hücresiz sistemlerde gerçeklestirilen analizler çogu kez "primer" tarama olarak tercih edilir, çünkü bu analizler, bir moleküler hedefte bir test bilesigi araciliginda gerçeklesen bir degisikligin hizli gelisimini ve nispeten kolay tayinini saglayabilir. Ayrica, test bilesiginin hücresel toksisite veya biyoyararlanim etkileri in vitro sistemde genel olarak göz ardi edilebilir, çünkü analiz temel olarak ilacin moleküler hedef üzerindeki etkisine odaklanir, bu etki, bir ActRllB polipeptidi ile baglanma partneri (örnegin bir ActRllB Iigandi) arasindaki baglanma afinitesinde bir degisiklik üzerinden gözlemlenebilir.
Sadece açiklama amaciyla, bir örnek tarama analizinde ilgili bilesik, uygun oldugu takdirde analizin hedefleri dogrultusunda, mutat olarak bir ActRllB ligandina baglanma kapasitesine sahip bir izole edilmis ve saflastirilmis ActRllB polipeptidine temas ettirilir. Akabinde, bilesik ve ActRllB polipeptidi karisimina, bir ActRllB ligandi içeren bir bilesim ilave edilir.
ActRllB/ActRllB ligandi komplekslerinin saptanmasi ve tayini, bilesigin, ActRllB polipeptidi ile baglayici protein arasinda kompleks olusumunu inhibe etme (veya uyarma) etkinligini belirlemeye yönelik bir yol saglar. Bilesigin etkinligi, test bilesiginin çesitli konsantrasyonlari ile elde edilen verilerle doz yanit egrilerinin olusturulmasi yoluyla degerlendirilebilir. Ayrica, karsilastirma için bir referans saglamak amaciyla bir kontrol analizi de gerçeklestirilebilir. Örnegin bir kontrol analizinde, izole edilmis ve saflastirilmis ActRllB ligandi, ActRllB polipeptidini içeren bir bilesime ilave edilir ve test bilesiginin yoklugunda ActRllB/ActRllB ligandi kompleksinin olusumu tayin edilir. Genel olarak, reaktanlari karistirma sirasinin degiskenlik gösterebilecegi ve reaktanlarin eszamanli olarak karistirilabilecegi anlasilmalidir.
Ayrica, saflastirilmis proteinler yerine, uygun bir hücresiz analiz sistemi saglamak için hücresel özütleri ve lizatlari kullanilabilir.
ActRllB polipeptidi ile baglayici protein arasindaki kompleks olusumu çesitli tekniklerle saptanabilir. Örnegin kompleks olusumunun modülasyonu, immün analiz veya kromatografik tayin yoluyla, mesela radyoaktif isaretli (örnegin 32P, 358, 14C veya 3H), floresan isaretli (örnegin FITC) veya enzimatik isaretli ActRllB polipeptidi veya bunun baglayici proteini gibi saptanabilir sekilde isaretlenmis proteinler kullanilarak tayin edilebilir.
Burada, floresans polarizasyon analizleri ve floresans rezonans enerji transferi (FRET) analizlerinin, bir ActRllB polipeptidi ile bunun baglayici proteini arasindaki etkilesim derecesinin dogrudan veya dolayli olarak ölçümünde kullanimi açiklanir. Ayrica baska tayin modlari, örnegin optik dalga kilavuzlari (PCT Yayini WO 96/26432 ve U.S. Patent No. ,677,196), yüzey plazmon rezonansi (SPR), yüzey yükü sensörleri ve yüzey kuvveti sensörlerini esas alanlar kullanilabilir. 42 Burada ayrica "iki hibrit analiz" olarak da bilinen bir etkilesim tuzak analizinin, bir ActRIIB polipeptidi ve bunun baglanma partneri arasindaki etkilesimi bozan veya güçlendiren ajanlari belirlemeye yönelik kullanimi açiklanir. Bakiniz örnegin U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268z12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924 ve lwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Burada, ters iki hibrit sistemlerin, bir ActRIIB polipeptidi ve bunun baglayici proteini arasindaki etkilesimleri ortadan kaldiran bilesikleri (örnegin küçük molekülleri veya peptitleri) belirlemeye yönelik kullanimi açiklanir. Bakiniz örnegin Vidal ve Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal ve Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81 ve U.8. Patent No. ,525,490; 5,955,280 ve 5,965,368.
Ilgili bilesikler, bir ActRIIB polipeptidi ile etkilesime girme becerileri üzerinden belirlenebilir.
Bilesik ile ActRIIB polipeptidi arasindaki etkilesim kovalent olabilir veya kovalent olmayabilir. Örnegin böylesi bir etkilesim protein seviyesinde foto-çapraz baglama, radyoaktif isaretli Iigand baglanimi ve afinite kromatografisi de dahil olmak üzere in vitro biyokimyasal yöntemlerle belirlenebilir (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Belirli durumlarda bilesikler, bir mekanizma esasli analizde, örnegin bir ActRIIB polipeptidine baglanan bilesikleri saptamaya yönelik bir analizde taranabilir. Bu, bir kati faz veya akiskan faz baglanma olayini içerebilir. Alternatif olarak bir hücre, bir raportör sistem (örnegin 8- galaktosidaz, Iüsiferaz veya yesil floresan protein) ile birlikte bir ActRIIB polipeptidini kodlayan gen ile transfekte edilebilir ve kütüphaneye karsi tercihen yüksek verimli bir taramayla veya kütüphanenin ayri üyelerine karsi taranabilir. Baska bir mekanizma esasli baglanma analizi, örnegin serbest enerji degisimlerini saptayan baglanma analizleri kullanilabilir. Baglanma analizleri, bir göze, kürecige veya çipe sabitlenmis veya bir sabit antikor ile yakalanmis veya kapiler elektroforez ile ayristirilmis bir hedef ile gerçeklestirilebilir.
Bagli bilesikler genellikle kolorimetri veya floresans veya yüzey plazmon rezonansi ile saptanir. . Örnek Terapötik Kullanimlar Burada açiklanan GDF Tuzagi polipeptitleri memelilerde, örnegin kemirgenler ve primatlar ve özellikle insan hastalarda kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmek için kullanilabilir.
Burada, ihtiyaci olan bir bireyde aneminin tedavisine veya önlenmesine yönelik yöntemler açiklanir, yöntemler, bir GDF Tuzagi polipeptidinin terapötik olarak etkili bir miktarinin bireye verilmesini içerir. Bu yöntemler, memelilerin ve özellikle insanlarin terapötik ve profilaktik tedavileri için kullanilabilir. 43 Burada kullanildigi haliyle, bir bozuklugu veya durumu "önleyen“ bir terapötik, bir istatistiksel örneklemde, bir muamele edilmeyen kontrol numunesine kiyasla muamele edilen numunede bozuklugun veya durumun görülme sikligini azaltan veya muamele edilmeyen kontrol numunesine kiyasla bozuklugun veya durumun bir veya daha fazla semptomunun baslangicini geciktiren veya siddetini azaltan bir bilesigi ifade eder. Burada kullanildigi haliyle "tedavi etmek" veya "tedavi" terimi, bahsedilen durumun profilaksisini veya gelistikten sonra durumun iyilesmesini veya eliminasyonunu kapsar. Her halükarda, önleme veya tedavi, bir hekim veya baska bir saglik uzmani tarafindan koyulan tanida ve terapötik ajan uygulamasinin hedeflenen sonucunda ayirt edilebilir.
Burada gösterildigi üzere, GDF Tuzagi polipeptitleri saglikli bireylerde kirmizi kan hücresi, hemoglobin veya retikülosit düzeylerini yükseltmek için kullanilabilir ve bu gibi GDF Tuzagi polipeptitleri seçilen hasta popülasyonlarinda kullanilabilir. Uygun hasta popülasyonlarinin örnekleri, istenmeyen derecede düsük kirmizi kan hücresi veya hemoglobin düzeylerine sahip olanlari, örnegin bir anemisi olan hastalari ve istenmeyen düzeyde düsük kirmizi kan hücresi veya hemoglobin düzeyleri gelisme riski bulunanlari, örnegin yakin zamanda majör cerrahi müdahaleye veya önemli kan kaybi ile sonuçlanabilecek diger prosedürlere maruz kalacak hastalari kapsar. Yeterli kirmizi kan hücresi düzeylerine sahip bir hasta, kirmizi kan hücresi düzeylerinin yükseltilmesi ve akabinde kanin alinmasi ve sonradan transfüzyonlarda kullanilmak üzere saklanmasi amaciyla bir GDF Tuzagi polipeptidi ile muamele edilebilir.
Burada açiklanan GDF Tuzagi polipeptitleri, bir anemisi olan hastalarda kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmek için kullanilabilir. Insanlarda hemoglobin düzeyleri gözlemlenirken, uygun yas ve cinsiyet kategorisi için normalden düsük bir düzey aneminin göstergesi olabilir, ancak burada bireysel varyasyonlar dikkate alinmalidir. Örnegin 12 g/dl'lik bir hemoglobin düzeyinin genel olarak genel eriskin popülasyonunda normalin alt siniri oldugu kabul edilir.
Potansiyel nedenler kan kaybi, beslenme eksiklikleri, ilaç reaksiyonu, kemik iligi ile ilgili çesitli problemler ve birçok hastaligi kapsar. Daha özel bir ifadeyle anemi, örnegin kronik böbrek yetmezligi, miyelodisplastik sendrom, romatoid artrit, kemik iligi nakli gibi çesitli bozukluklar ile iliskilendirilmektedir. Anemi ayrica su durumlarla iliskili olabilir: kati tümörler (örnegin meme kanseri, akciger kanseri, kolon kanseri); lenf sistemi tümörleri (örnegin kronik Ienfosit lösemi, Hodgkin disi ve Hodgkin lenfomalari); hematopoietik sistem tümörleri (örnegin lösemi, miyelodisplastik sendrom, multipl miyelom); radyasyon tedavisi; kemoterapi (örnegin platin içeren rejimler); inflamatuar ve otoimmün hastaliklar, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla romatoid artrit, diger inflamatuar artritler, sistemik Iupus eritematozus (SLE), akut veya kronik cilt hastaliklari (örnegin psoriyazis), inflamatuar bagirsak hastaligi (örnegin Crohn hastaligi ve ülseratif kolit); idiopatik veya konjenital durumlar da dahil olmak üzere 44 akut veya kronik böbrek hastaligi veya yetmezligi; akut veya kronik karaciger hastaligi; akut veya kronik kanama; hastanin alloantikorlarindan veya otoantikorlarindan ve/veya dini nedenlerden dolayi kirmizi kan hücresi transfüzyonunun mümkün olmadigi durumlar (örnegin bazi Yehova Sahitleri); enfeksiyonlar (örnegin sitma, osteomiyelit); hemoglobinopatiler, örnegin orak hücre hastaligi, talasemiler; ilaç kullanimi veya suiistimali, örnegin alkol suiistimali; transfüzyon için engel teskil eden herhangi bir nedene bagli anemili pediatrik hastalar ve asiri dolasim yüklemesi kaygilarindan dolayi transfüzyon alamayan anemili yasli hastalar veya altta yatan kardiyopulmoner hastaliga sahip hastalar.
GDF Tuzagi polipeptitleri, tipik olarak kirmizi kan hücresi (RBC) morfolojisinde küçük bir degisim ile iliskilendirilen hipoproliferatif kemik iligi anemilerinin tedavisi için uygundur.
Hipoproliferatif anemiler sunlari kapsar: 1) kronik hastalik anemisi, 2) böbrek hastaligi anemisi ve 3) hipometabolik durumlar ile iliskili anemi. Bu tiplerin her birinde, gözlemlenen anemi derecesi için endojen eritropoietin düzeyleri uygunsuz biçimde düsüktür. Diger hipoproliferatif anemiler sunlari kapsar: 4) erken evre demir eksikligi anemisi ve 5) kemik iligi hasarindan kaynaklanan anemi. Bu tiplerde, gözlemlenen anemi derecesi için endojen eritropoietin düzeyleri uygun biçimde yüksektir.
En yaygin tip, inflamasyon, enfeksiyon, doku hasari ve kanser gibi durumlari kapsayan ve hem düsük eritropoietin düzeyleri hem de kemik iliginde eritropoietine karsi yetersiz yanit ile ayirt edilebilen kronik hastalik anemisidir (Adamson, 2008, Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.: MCGraw Hill, New York, pp 628-634). Kanser ile ilgili anemiye birçok faktör katki saglayabilir. Bazilari bizzat hastalik süreci ve interlökin 1, interferon gama ve tümör nekroz faktörü gibi inflamatuar sitokinlerin üretimi ile iliskilidir (Bron et al., 2001, Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6). Etkileri arasinda, inflamasyon, anahtar demir düzenleyici hepsidin peptidini uyararak demirin makrofajlardan disa aktarimini inhibe eder ve genel olarak demirin eritropoiez için kullanilabilirligini sinirlandirir (Ganz, 2007, J Am Soc Nephrol 18:394-400). Çesitli yollardan kan kaybi da kanser ile ilgili anemiye katki saglar. Kanser ilerlemesinden kaynaklanan anemi prevalansi kanserin türüne göre prostat kanseri için %5 ila multipl miyelom için %90 araliginda degisir. Kanser ile ilgili anemi hastalar için yorgunluk ve azalmis yasam kalitesi, azalmis tedavi etkinligi ve azalmis mortalite de dahil olmak üzere önemli sonuçlar dogurur.
Kronik böbrek hastaligi, siddeti böbrek yetmezliginin derecesine göre degiskenlik gösteren hipoproliferatif anemi ile iliskilendirilir. Bu tip anemi öncelikli olarak yetersiz eritropoietin Üretim/nden ve kirmizi kan hücrelerinin düsük sagkalimindan kaynaklanir. Kronik böbrek hastaligi genellikle yillar boyunca veya onlarca yil boyunca kademeli olarak son evre (5. 45 Evre) hastaliga kadar ilerler, bu noktada hasta sagkalimi için diyaliz veya böbrek nakli gerekir. Anemi bu süreçte çogu kez erken gelisir ve hastalik ilerledikçe kötülesir. Böbrek hastaligi anemisinin klinik sonuçlari iyi belgelenmistir ve sol ventriküler hipertrofi gelisimi, bozuk bilissel fonksiyon, düsük yasam kalitesi ve degismis immün fonksiyonu kapsar (Levin et al., 1999, Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson, 1992, Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki et al., 1995, Am J Kidney Dis 25:548-554; Gafter et al., 1994, Kidney Int 45:224-231). Basvuru sahipleri tarafindan kronik böbrek hastaligina yönelik bir fare modelinde gösterildigi üzere (bakiniz asagidaki Örnek), bir GDF Tuzagi polipeptidi, böbrek hastaligi anemisini tedavi etmek için kullanilabilir.
Bir hipometabolik hiz ile sonuçlanan birçok durum, hafif ila orta siddetli bir hipoproliferatif anemiye neden olabilir. Bu tip durumlar, endokrin yetmezligi durumlarini kapsar. Anemi örnegin Addison hastaliginda, hipotiroidizmde, hiperparatiroidizmde veya kisirlastirilmis veya östrojen tedavisi görmüs erkeklerde meydana gelebilir. Hafif ila orta siddetli anemi ayrica özellikle yaslilarda yaygin bir durum olan azalmis besinsel protein aliminda meydana gelebilir. Son olarak anemi, neredeyse herhangi bir nedenden kaynaklanan kronik karaciger hastaligina sahip hastalarda da meydana gelebilir (Adamson, 2008, Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634).
Yeterli hacimde akut kan kaybindan, örnegin travmadan veya postpartum hemorajiden kaynaklanan anemi, akut post-hemorajik anemi olarak bilinir. Akut kan kaybi baslangiçta anemisiz hipovolemiye neden olur, çünkü diger kan bilesenleri ile birlikte RBC'lerin orantili deplesyonu mevcuttur. Ancak hipovolemi, hemodilüsyon ve anemi ile sonuçlanan, siviyi ekstravasküler kompartimandan vasküler kompartimana kaydiran fizyolojik mekanizmalari hizla tetikleyecektir. Kan kaybi kronik oldugunda kademeli olarak vücuttaki demir depolarini bosaltir ve nihai olarak demir eksikligine yol açar. Basvuru sahipleri tarafindan bir fare modelinde gösterildigi üzere (bakiniz asagidaki Örnek), bir GDF Tuzagi polipeptidi, akut kan kaybi anemisinden iyilesmeyi hizlandirmak için kullanilabilir.
Demir eksikligi anemisi, ara evre olarak negatif demir dengesi ve demir eksikligi eritropoiezini içeren, dereceli olarak artan demir eksikliginin son evresidir. Demir eksikligi, gebelik, yetersiz beslenme, intestinal emilim bozuklugu, akut veya kronik inflamasyon ve akut veya kronik kan kaybi gibi durumlarda görüldügü üzere artmis demir talebinden, azalmis demir alimindan veya artmis demir kaybindan kaynaklanabilir. Bu gibi hafif ila orta siddetli anemide, kemik iligi hipoproliferatif kalir ve RBC morfolojisi büyük ölçüde normaldir; ancak hafif siddetli anemi bile bazi mikrositik hipokromik RBC'ler ile sonuçlanabilir ve agir siddetli demir eksikligi anemisine geçise, kemik iligi hiperproliferasyonu ve artan düzeyde yaygin mikrositik ve hipokromik 46 RBC'Ier eslik eder (Adamson, 2008, Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634). Demir eksikligi anemisi için uygun tedavi, nedenine ve agirligina göre, majör konvansiyonel seçenekler olarak oral demir preparatlari, parenteral demir formülasyonlari ve RBC transfüzyonu ile gerçeklestirilir. Bir GDF Tuzagi polipeptidi, kronik demir eksikligi anemilerini tedavi etmek, özellikle multifaktöriyel kökenli anemileri tedavi etmek için tek basina veya konvansiyonel terapötik yaklasimlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir.
Hipoproliferatif anemiler, inflamasyon, enfeksiyon veya kanser ilerlemesine bagli fonksiyon bozuklugu yerine, primer fonksiyon bozuklugundan veya kemik iligi yetmezliginden kaynaklanabilir. Önemli örnekler, kanser kemoterapötik ilaçlarindan veya kanser radyasyon tedavisinden kaynaklanan miyelosüpresyondur. Klinik deneyler kapsamli olarak incelendiginde, hafif siddetli aneminin kemoterapiden sonra hastalarin %100'ünde, daha agir siddetli aneminin ise bu tip hastalarin %80 kadarinda meydana gelebilecegi bulunmustur (Groopman et al., 1999, J Natl Kanser Inst 91:1616-1634). Miyelosüpresif ilaçlar sunlari kapsar: 1) azot hardallari (örnegin melfalan) ve nitrozoüreler (Örnegin streptozosin) gibi alkilleyici ajanlar; 2) folik asit antagonistleri (örnegin metotreksat), pürin analoglari (örnegin tioguanin) ve pirimidin analoglari (örnegin gemsitabin) gibi antimetabolitler; 3) antrasiklinler (örnegin doksorubisin) gibi sitotoksik antibiyotikler; 4) kinaz inhibitörleri (örnegin gefitinib); 5) taksanlar (örnegin paklitaksel) ve vinka alkaloidleri (örnegin vinorelbin) gibi mitotik inhibitörler; 6) monoklonal antikorlar (örnegin rituksimab) ve 7) topoizomeraz inhibitörleri (örnegin topotekan ve etoposid). Kemoterapi ile uyarilan anemiye yönelik bir fare modelinde gösterildigi üzere (bakiniz asagidaki Örnek), bir GDF Tuzagi polipeptidi, kemoterapötik ajanlardan ve/veya radyasyon tedavisinden kaynaklanan anemiyi tedavi etmek için kullanilabilir.
GDF Tuzagi polipeptitleri ayrica kismen normalden küçük (mikrositik), normalden büyük (makrositik), yanlis sekilli veya anormal renkli (hipokromik) RBC'Ier ile karakterize düzensiz RBC matürasyonuna bagli anemilerin tedavisi için uygundur.
Hastalar, hastanin hemoglobin düzeyini genellikle yaklasik 10 g/dl ila yaklasik 12.5 g/dl ve tipik olarak yaklasik 11.0 g/dl olmak üzere hedeflenen bir düzeye getirmeyi amaçlayan bir doz uygulama rejimi ile tedavi edilebilir (bakiniz ayrica Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transbitki 15, 15-19), ancak daha düsük hedef düzeyler daha az kardiyovasküler yan etkilere neden olabilir. Alternatif olarak, kirmizi kan hücrelerinin durumu için bir ölçü olarak hematokrit düzeyleri (bir kan numunesinde hücrelerin isgal ettigi hacim yüzdesi) kullanilabilir.
Saglikli bireyler için hematokrit düzeyleri, eriskin erkekler için %41 ila %51 ve eriskin kadinlar 47 için %35 ila %45 araliginda degisir. Hedef hematokrit düzeyleri genellikle %30-33 civarindadir. Ayrica, hemoglobin/hematokrit düzeyleri kisiden kisiye degisir. Dolayisiyla hedef hemoglobin/hematokrit düzeyi optimal olarak her hasta için özellestirilebilir.
Burada açiklanan GDF Tuzagi polipeptitlerinin kirmizi kan hücresi düzeylerine hizli etkisi, bu ajanlarin Epo'dan farkli bir mekanizma üzerinden etki ettigini gösterir. Dolayisiyla bu antagonistler, Epo'ya iyi yanit vermeyen hastalarda kirmizi kan hücresi ve hemoglobin düzeylerini yükseltmek için faydali olabilir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidi, normal ila yüksek (>300 IU/kg/hafta) dozda bir Epo uygulamasinin hemoglobin düzeyinde hedef düzeye kadar bir artis saglamadigi bir hasta için faydali olabilir. Yetersiz bir Epo yanitina sahip hastalar tüm anemi tipleri için mevcuttur, ancak özellikle kanserli hastalarda ve son evre böbrek hastaligi olan hastalarda siklikla daha yüksek sayida yanit vermeyen hasta gözlemlenmistir. Epo'ya yönelik yetersiz bir yanit konstitütif (yani Epo ile ilk tedavide gözlemlenen) veya edinilmis (örnegin Epo ile tekrarli tedavide gözlemlenen) olabilir.
GDF Tuzagi polipeptitleri ayrica Epo'nun olumsuz etkilerine duyarli hastalari tedavi etmek için kullanilabilir. Epo'nun primer olumsuz etkileri, hematokrit veya hemoglobin düzeylerinde asiri artis ve polisitemidir. Yüksek hematokrit düzeyleri hipertansiyona (daha spesifik olarak hipertansiyonun agirlasmasina) ve vasküler tromboza neden olabilir. Bazilari hipertansiyon ile ilgili olan bildirilmis diger olumsuz Epo etkileri, bas agrilari, influenza benzeri sendrom, santlarin tikanmasi, miyokardiyal enfarktüsler ve trombozdan, hipertansif ensefalopatiden ve kirmizi hücre kari hücresi aplazisinden kaynaklanan serebral konvülziyonlardir (Singibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), 836-843; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transbitki (suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).
GDF tuzaklari ayrica eritropoietin yolagini aktiflestiren Epo ve diger ajanlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Bazi durumlarda bu, kombinasyondaki her ilaç için daha düsük doz uygulamasi saglayabilir.
Burada, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilmis olan veya bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için aday olan bir hastanin, hastada bir veya daha fazla hematolojik parametrenin ölçülmesi yoluyla yönetimine yönelik yöntemler açiklanir. Hematolojik parametreler, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için bir aday olan bir hastaya yönelik uygun doz uygulamasini degerlendirmek, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi süresince hematolojik parametreleri izlemek, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi süresince dozajin ayarlanip ayarlanmayacagini degerlendirmek ve/veya bir GDF Tuzagi polipeptidinin uygun bir idame dozunu 48 degerlendirmek amaciyla kullanilabilir. Hematolojik parametrelerden bir veya daha fazlasi normal düzeyin disindaysa, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasi azaltilabilir, ertelenebilir veya sonlandirilabilir.
Burada saglanan yöntemlere göre ölçülebilecek hematolojik parametreler örnegin ilgili alanda bilinen yöntemlere göre kirmizi kan hücresi düzeyleri, kan basinci, demir depolari ve vücut sivilarinda yüksek kirmizi kan hücresi düzeyleri ile korelasyon halindeki diger ajanlari kapsar.
Bu tip parametreler bir hastadan alinan bir kan numunesi ile belirlenebilir. Kirmizi kan hücresi düzeyleri, hemoglobin düzeyleri ve/veya hematokrit düzeylerinde artislar, kan basincinda artislara neden olabilir.
Bir veya daha fazla hematolojik parametre normal araligin disindaysa veya normal araligin yüksek tarafindaysa, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için bir aday olan bir hastada GDF Tuzagi polipeptidi uygulamasini baslangici, hematolojik parametreler dogal olarak veya terapötik müdahale sonucunda normal veya kabul edilebilir bir düzeye dönene kadar ertelenebilir. Örnegin bir aday hasta hipertansif veya prehipertansif ise, hasta, hastanin kan basincini düsürmek için bir kan basinci düsürücü ajan ile tedavi edilebilir. Örnegin diüretikler, adrenerjik inhibitörler (alfa blokerler ve beta blokerler), vazodilatörler, kalsiyum kanali blokerleri, anjiyotensin dönüstürücü enzim (ACE) inhibitörleri veya anjiyotensin II reseptörü blokerleri de dahil olmak üzere, her hastanin durumu için uygun herhangi bir kan basinci düsürücü ajan kullanilabilir. Kan basinci alternatif olarak bir diyet ve egzersiz rejimi ile tedavi edilebilir. Benzer bir sekilde, bir aday hasta normalden düsük veya normalin düsük tarafinda demir depolarina sahipse, hasta, hastanin demir depolari normal veya kabul edilebilir bir düzeye dönene kadar uygun bir diyet ve/veya demir takviyesi rejimi ile tedavi edilebilir.
Normalden yüksek kirmizi kan hücresi düzeylerine ve/veya hemoglobin düzeylerine sahip hastalar için, GDF Tuzagi polipeptidi uygulamasi, düzeyler normal veya kabul edilebilir bir düzeye dönene kadar ertelenebilir.
Bir veya daha fazla hematolojik parametre normal araligin disindaysa veya normal araligin yüksek tarafindaysa, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için bir aday olan bir hastada uygulama baslangici ertelenmeyebilir. Ancak, GDF Tuzagi polipeptidinin doz uygulamasinin dozaj miktari veya sikligi, hematolojik parametrelerde GDF Tuzagi polipeptidi uygulamasindan kaynaklanan kabul edilmez bir artis riskini azaltacak bir miktara ayarlanabilir. Alternatif olarak, hasta için bir GDF Tuzagi polipeptidi ile istenmeyen hematolojik parametre düzeyine yönelik bir terapötik ajani birlestiren bir terapötik rejim gelistirilebilir. Örnegin hasta yüksek kan basincina sahipse, bir GDF Tuzagi polipeptidi ve bir kan basinci düsürücü ajanin uygulanmasini içeren bir terapötik rejim tasarlanabilir. Arzu 49 edilenden düsük demir depolarina sahip bir hasta için, bir GDF Tuzagi polipeptidi ve demir takviyesinden olusan bir terapötik rejim gelistirilebilir.
Bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi için bir aday olan bir hastaya yönelik olarak, bir veya daha fazla hematolojik parametre için baslangiç parametresi (parametreleri) belirlenebilir ve bu hasta için baslangiç degerine (degerlerine) göre uygun bir doz uygulama rejimi tasarlanabilir. Alternatif olarak, bir hasta için uygun bir GDF Tuzagi polipeptidi doz uygulama rejimini bildirmek amaciyla, bir hastanin tibbi geçmisine göre belirlenen baslangiç parametreleri kullanilabilir. Örnegin bir saglikli hasta, tanimli normal araligin üzerinde bir belirlenmis baslangiç kan basinci okumasina sahipse, GDF Tuzagi polipeptidi ile tedaviden önce hastanin kan basincinin genel popülasyon için normal olarak kabul edilen araliga getirilmesi gerekli olmayabilir. Bir hastanin bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedaviden önce bir veya daha fazla hematolojik parametre için baslangiç degerleri ayrica GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi süresince hematolojik parametrelerde herhangi bir degisimi izlemeye yönelik ilgili karsilastirma degerleri olarak kullanilabilir.
Bir veya daha fazla hematolojik parametre, bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilmekte olan hastalarda ölçülebilir. Hematolojik parametreler, tedavi süresince hastayi izlemek ve GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasinin veya baska bir terapötik ajan ile ilave doz uygulamasinin ayarlanmasini veya sonlandirilmasini saglamak için kullanilabilir. Örnegin, bir GDF Tuzagi polipeptidi uygulamasinin kan basincinda, kirmizi kan hücresi düzeyinde veya hemoglobin düzeyinde bir artis veya demir depolarinda bir düsüs ile sonuçlanmasi halinde, GDF Tuzagi polipeptidinin doz miktari veya sikligi, GDF Tuzagi polipeptidinin bir veya daha fazla hematolojik parametre üzerindeki etkilerini azaltmak amaciyla düsürülebilir. Uygulama veya bir GDF Tuzagi polipeptidi, bir veya daha fazla hematolojik parametrede hasta için olumsuz bir degisime neden olursa, GDF Tuzagi polipeptidinin doz uygulamasi geçici olarak, hematolojik parametre (parametreler) kabul edilebilir bir düzeye dönene kadar veya kalici olarak sonlandirilabilir. Benzer bir sekilde, GDF Tuzagi polipeptidinin dozu veya sikligi azaltildiktan sonra bir veya daha fazla hematolojik parametre kabul edilebilir bir araliga getirilemezse, doz uygulamasi sonlandirilabilir. GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasinin azaltilmasina veya sonlandirilmasina alternatif veya ek olarak, hasta, hematolojik parametrede (parametrelerde) istenmeyen düzeyi ele alacak ilave bir terapötik ajan, örnegin bir kan basinci düsürücü ajan veya bir demir takviyesi ile dozlanabilir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilen bir hasta yüksek kan basincina sahipse, GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasi ayni düzeyde sürdürülebilir ve tedavi rejimine bir kan basinci düsürücü ajan eklenebilir, GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasi azaltilabilir (örnegin miktar ve/veya siklik olarak) ve tedavi rejimine bir kan basinci düsürücü ajan eklenebilir veya 50 GDF Tuzagi polipeptidi ile doz uygulamasi sonlandirilabilir ve hasta bir kan basinci düsürücü ajan ile tedavi edilebilir.
Bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilen hastalar veya bir GDF Tuzagi polipeptidi ile tedavi edilecek aday hastalar, kas büyümesine ihtiyaç duyan hastalar, örnegin bir nöromusküler bozukluk veya muskülojeneratif bozukluktan mustarip olan veya buna yakalanma riski tasiyan hastalar olabilir. Örnegin hastalar veya aday hastalar, Lou Gehrig hastaligi (ALS), kanser anoreksi-kaseksi sendromu, musküler distrofi, kas atrofisi, konjestif obstruktif akciger hastaligi (ve COPD ile iliskili kas atrofisi), kas atrofisi sendromu, sarkopeni veya kaseksiden mustarip olabilir veya buna yakalanma riski tasiyabilir. Musküler distrofi, iskelet kaslarinin ve bazen kalp ve solunum kaslarinin kademeli zayiflamasi ve kötülesmesi ile karakterize bir grup dejeneratif kas hastaligini ifade eder. Ilgili GDF Tuzagi polipeptitlerini içeren bir rejim ile tedavi edilebilecek örnek musküler distrofiler sunlari kapsar: Duchenne Musküler Distrofisi (DMD), Becker Musküler Distrofisi (BMD), Emery-Dreifuss Musküler Distrofisi (EDMD), Limb-Girdle Musküler Distrofisi (LGMD), Fasioskapulohumeral Musküler Distrofi (FSH veya FSHD) (Landouzy-Dejerine olarak da bilinir), Miyotonik Distrofi (MMD) (Steinert Hastaligi olarak da bilinir), Okulofaringeal Musküler Distrofi (OPMD), Distal Musküler Distrofi (DD), Konjenital Musküler Distrofi (CMD). 6. Farmasötik Bilesimler Mevcut bulusun bilesikleri (örnegin GDF Tuzagi polipeptitleri), farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte formüle edilebilir. Örnegin bir GDF Tuzagi polipeptidi tek basina veya bir farmasötik formülasyonun (terapötik bilesimin) bir bileseni olarak uygulanabilir. Ilgili bilesikler, insan veya veterinerlik ilaçlarinda kullanilmaya yönelik uygun herhangi bir yoldan uygulama için formüle edilebilir.
Burada açiklanan terapötik yöntem, bilesimin sistemik olarak veya bir implant veya cihaz vasitasiyla lokal olarak uygulanmasini içerebilir. Bu bulusta kullanilmaya yönelik terapötik bilesim uygulandiginda elbette fizyolojik olarak kabul edilebilir pirojensiz bir formda olacaktir.
Yukarida tarif edilen bilesime istege bagli olarak dahil edilebilecek GDF Tuzagi polipeptitleri disinda terapötik olarak faydali ajanlar, burada açiklanan yöntemlerde ilgili bilesiklerle (örnegin GDF Tuzagi polipeptitleriyle) eszamanli olarak veya sirali olarak uygulanabilir.
Tipik olarak bilesikler parenteral yoldan verilecektir. Parenteral uygulama için uygun farmasötik bilesimler, bir veya daha fazla GDF Tuzagi polipeptidi ile birlikte, antioksidanlar, tamponlar, bakteriyostatik maddeler, formülasyonu hedeflenen alicinin kani ile izotonik hale 51 getiren çözünür maddeler veya süspansiyon yapici veya kivam artirici maddeler ihtiva eden farmasötik olarak kabul edilebilir bir veya daha fazla steril izotonik sulu veya susuz solüsyon, dispersiyon, süspansiyon veya emülsiyon veya kullanimdan hemen önce enjekte edilebilir steril solüsyonlar veya dispersiyonlar halinde sulandirilabilen steril tozlar içerebilir. Bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilabilecek uygun 5qu ve susuz tasiyicilara dair örnekler, su, etanol, polioller (örnegin gliserol, propilen glikol, polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlarin uygun karisimlari, bitkisel yaglar, örnegin zeytinyagi ve enjekte edilebilir organik esterler, örnegin etil oleati kapsar. Uygun akiskanlik, örnegin lesitin gibi kaplama materyallerinin kullanilmasi, dispersiyonlar açisindan gerekli partikül boyutunun korunmasi ve yüzey aktiflerin kullanilmasi sayesinde korunabilir.
Bilesim ayrica bir hedef doku bölgesine (örnegin kemik iligi) uygulamaya yönelik bir formda enjekte edilebilir veya kapsüllenebilir. Mevcut bulusun bilesimleri, bir veya daha fazla terapötik bilesigi (örnegin GDF Tuzagi polipeptidini) bir hedef doku bölgesine (örnegin kemik iligine) ulastirma, gelismekte olan doku için bir yapi saglama ve optimal olarak vücutta yeniden emilme kapasitesine sahip bir matriks içerebilir. Örnegin matriks, GDF Tuzagi polipeptitlerinin yavas salimini saglayabilir. Bu tip matriksler, implante edilen diger tibbi uygulamalarda halihazirda kullanilan materyallerden olusabilir.
Matriks materyalinin seçimi, biyouyumluluk, biyobozunurluk, mekanik özellikler, kozmetik görünüm ve arayüz özelliklerine göre yapilir. Uygun formülasyon, ilgili bilesimlerin spesifik uygulamasina göre tanimlanacaktir. Bilesimlere yönelik potansiyel matriksler, biyobozunur ve kimyasal olarak tanimlanmis kalsiyum sülfat, trikalsiyumfosfat, hidroksiapatit, polilaktik asit ve polianhidrürler olabilir. Diger potansiyel materyaller, kemik veya dermal kollajen gibi biyobozunur ve biyolojik olarak iyi tanimlanmis niteliktedir. Diger matriksler, saf proteinlerden veya ekstraselüler matriks bilesenlerinden olusur. Diger potansiyel matriksler, sinterlenmis hidroksiapatit, biyocam, alüminatlar veya diger seramikler gibi biyobozunur olmayan ve kimyasal olarak tanimlanmis niteliktedir. Matriksler, yukaridaki belirtilen materyal türlerinin kombinasyonlarindan, örnegin polilaktik asit ile hidroksiapatit veya kollajen ile trikalsiyumfosfattan olusabilir. Biyoseramiklerin bilesimi degisiklige ugratilabilir (örnegin kalsiyum-alüminat-fosfat) ve gözenek boyutu, partikül boyutu, partikül sekli ve biyobozunurlugu degistirmek için islenebilir.
Bulusun bilesimleri oral yoldan, örnegin her biri etken madde olarak bir ajanin önceden belirlenmis bir miktarini ihtiva eden kapsüller, kaseler, haplar, tabletler, pastiller (genellikle sakaroz ve akasya veya kitre gibi bir tatlandirilmis taban ile birlikte), tozlar, granüller, sulu veya susuz bir sivi içinde bir solüsyon veya süspansiyon, bir sivi yag/su veya su/yag 52 emülsiyonu, bir eliksir veya surup, pastiller (jelatin ve gliserin gibi bir atil baz veya sakaroz ve akasya ile birlikte) ve/veya gargaralar ve benzeri bir formda uygulanabilir. Bir ajan ayrica bir bolus, elektuar veya macun formunda uygulanabilir.
Oral uygulamaya yönelik kati dozaj formlarinda (kapsüller, tabletler, haplar, drajeler, tozlar, granüller vs.) mevcut bulusun bir veya daha fazla terapötik bilesigi, sodyum sitrat veya dikalsiyum fosfat ve/veya su maddeler gibi farmasötik olarak kabul edilebilir bir veya daha fazla tasiyici ile karistirilabilir: (1) dolgu maddeleri veya uzaticilar, örnegin nisastalar, Iaktoz, sakaroz, glikoz, mannitol ve/veya silisik asit; (2) baglayicilar, örnegin karboksimetilselüloz, aljinatlar, jelatin, polivinil pirrolidon, sakaroz ve/veya akasya; (3) nemlendiriciler, örnegin gliserol; (4) dagiticilar, örnegin agar-agar, kalsiyum karbonat, patates veya tapyoka nisastasi, aljinik asit, belirli silikatlar ve sodyum karbonat; (5) solüsyon olusumunu geciktirici maddeler, örnegin parafin; (6) emilimi hizlandirici maddeler, örnegin kuaterner amonyum bilesikleri; (7) islaticilar, örnegin setil alkol ve gliserol monostearat; (8) absorbanlar, örnegin kaolin ve bentonit kiIi; (9) kaydiricilar, örnegin talk, kalsiyum stearat, magnezyum stearat, kati polietilen glikoller, sodyum Iauril sülfat ve bunlarin karisimlari ve (10) renklendiriciler. Kapsül, tablet ve hap formundaki farmasötik bilesimlere tamponlayici maddeler de dahil edilebilir.
Benzer türdeki kati bilesimler ayrica Iaktoz veya süt sekerinin yani sira yüksek molekül agirlikli polietilen glikoller ve benzeri eksipiyanlarin kullanildigi yumusak ve sert dolgulu jelatin kapsüllerde dolgu maddesi olarak kullanilabilir.
Oral uygulamaya yönelik sivi dozaj formlari, farmasötik olarak kabul edilebilir emülsiyonlar, mikroemülsiyonlar, solüsyonlar, süspansiyonlar, suruplar ve eliksirleri kapsar. Sivi dozaj formlari, etken maddeye ek olarak, ilgili alanda yaygin olarak kullanilan atil seyrelticiler, örnegin su veya diger solventler, çözündürücüler ve etil alkol, izopropil alkol, etil karbonat, etil asetat, benzil alkol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-bütilen glikol gibi emülgatörler, bitkisel yaglar (özellikle pamuk tohumu yagi, yerfistigi yagi, misir yagi, zeytinyagi, hintyagi ve susam yagi), gliserol, tetrahidrofuril alkol, polietilen glikoller, sorbitanin yag asidi esterleri ve bunlarin karisimlarini içerebilir. Oral bilesimlerde atil seyrelticilerin yani sira islaticilar, emülsiyon veya süspansiyon yapicilar, tatlandiricilar, aroma katicilar, renklendiriciler, koku vericiler ve koruyucular da bulunabilir.
Süspansiyonlar, aktif bilesiklere ek olarak, etoksilli izostearil alkoller, polioksietilen sorbitol ve sorbitan esterleri, mikrokristalli selüloz, alüminyum metahidrosit, bentonit, agar-agar, kitre ve bunlarin karisimlari gibi süspansiyon yapicilar içerebilir. 53 Bulusun bilesimleri ayrica koruyucular, islaticilar, emülgatörler ve dispersiyon yapicilar gibi adjuvanlar içerebilir. Mikroorganizma etkisinin önlenmesi, örnegin paraben, klorobütanol, fenol, sorbik asit ve benzeri muhtelif antibakteriyel ve antifungal maddelerin formülasyona dahil edilmesi yoluyla saglanabilir. Ayrica izotonik maddelerin, örnegin sekerler, sodyum klorür ve benzerlerinin de bilesimlere dahil edilmesi arzu edilebilir. Bu anlatilanlara ek olarak, alüminyum monostearat ve jelatin gibi emilimi geciktiren maddelerin formülasyona dahil edilmesi suretiyle enjekte edilebilirfarmasötik formülasyonun uzun süreli emilimi saglanabilir.
Dozaj rejiminin sorumlu hekim tarafindan ilgili bilesiklerin (örnegin GDF Tuzagi polipeptitlerinin) etkisini degistiren çesitli faktörler dikkate alinarak belirlenecegi anlasilmalidir. Çesitli faktörler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hastanin kirmizi kan hücresi sayisi, hemoglobin düzeyi veya diger tanisal degerlendirmeler, arzu edilen hedef kirmizi kan hücresi sayisi, hastanin yasi, cinsiyeti ve diyeti, bir baskilanmis kirmizi kan hücresi düzeyine katki saglayabilen herhangi bir hastaligin siddeti, uygulama zamani ve diger klinik faktörleri kapsar. Bilinen diger büyüme faktörlerinin nihai bilesime dahil edilmesi de dozaji etkileyebilir. Ilerleme, kirmizi kan hücresi ve hemoglobin düzeylerinin periyodik olarak degerlendirilmesi ve ayrica retikülosit düzeylerinin ve hematopoietik sürecin diger göstergelerinin degerlendirilmesi yoluyla izlenebilir.
Burada, GDF Tuzagi polipeptitlerinin in vi'vo üretimine yönelik gen tedavisi açiklanir. Bu tedavi terapötik etkisini, GDF Tuzagi polinükleotit dizilerinin, yukarida listelenen bozukluklara sahip hücrelere veya dokulara dahil olmasi sonucunda gösterir. GDF Tuzagi polinükleotit dizilerinin ulastirilmasi, bir rekombinant ifade vektörü, örnegin bir kimerik virüs veya bir kolloidal dispersiyon sistemi ile saglanabilir. GDF Tuzagi polinükleotit dizilerinin terapötik uygulamasi için hedefli Iipozomlarin kullanimi tercih edilir.
Burada ögretildigi üzere gen tedavisi için kullanilabilecek çesitli viral vektörler, adenovirüs, herpes virüsü, vaksinia veya bir RNA virüsü, örnegin bir retrovirüsü kapsar. Retroviral vektör, bir murin veya avian retrovirüsünün bir türevi olabilir. Içine tek bir yabanci genin yerlestirilebilecegi retroviral vektörlerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla sunlari kapsar: Moloney murin lösemi virüsü (MoMuLV), Harvey murin sarkom virüsü (HaMuSV), murin meme tümörü virüsü (MuMTV) ve Rous Sarkom virüsü (RSV). Birtakim ilave retroviral vektörler çok sayida gen içerebilir. Bu vektörlerin tümü, transdüse hücrelerin belirlenebilmesini ve üretilebilmesini saglayan bir seçilebilir belirteç genini aktarabilir veya dahil edebilir. Retroviral vektörler, örnegin bir sekerin, bir glikolipitin veya bir proteinin baglanmasi yoluyla hedefe spesifik hale getirilebilir. Tercih edilen hedefleme, bir antikor kullanilarak saglanir. Ilgili alanin uzmanlari, GDF Tuzagi polinükleotidine sahip retroviral 54 vektörün hedefe spesifik tasinimini saglamak için spesifik polinükleotit dizilerinin retroviral genom içerisine yerlestirilebilecegini veya bir viral zarfa baglanabilecegini takdir edecektir.
Alternatif olarak doku kültürü hücreleri konvansiyonel kalsiyum fosfat transfeksiyonu yoluyla dogrudan retroviral yapisal gag, pol ve env genlerini kodlayan plazmitler ile transfekte edilebilir. Bu hücreler akabinde ilgili genleri içeren vektör plazmiti ile transfekte edilir.
Meydana gelen hücreler, retroviral vektörü kültür ortamina salar.
GDF Tuzagi polinükleotitleri için baska bir hedefli uygulama sistemi, bir kolloidal dispersiyon sistemidir. Kolloidal dispersiyon sistemleri, makromoleküllü kompleksler, nanokapsüller, mikroküreler, kürecikler ve Iipit esasli sistemler, örnegin yag/su emülsiyonlari, miseller, karisik miseller ve Iipozomlari kapsar. Tercih edilen kolloidal sistem bir Iipozomdur.
Lipozomlar, in vitro ve in vivo uygulama araçlari olarak faydali yapay membran vezikülleridir.
RNA, DNA ve saglam virionlar sulu iç kisimda kapsüllenebilir ve hücrelere biyolojik olarak aktif bir formda tasinabilir (bakiniz örnegin Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981).
Bir lipozom araciyla etkili gen transferine yönelik yöntemler ilgili alanda bilinir, bakiniz örnegin Mannino, et al., Biotechniques, 62682, 1988. Lipozomun bilesimi genellikle steroidler, özellikle kolesterol ile kombinasyon halinde fosfolipitlerin bir kombinasyonudur. Baska fosfolipitler veya baska lipitler de kullanilabilir. Lipozomlarun fiziksel karakteristikleri pH, iyon siddeti ve iki degerlikli katyonlarin varligina dayanir.
Lipozom üretiminde faydali Iipitlerin örnekleri, fosfatidil bilesikleri, örnegin fosfatidilgliserol, fosfatidilkolin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipitler, serebrositler ve gangliositleri kapsar. Temsili fosfolipitler, yumurta fosfatidilkolini, dipaImitoilfosfatidilkolin ve distearoilfosfatidilkolini içerir. Lipozomlarin örnegin organa spesifiklik, hücreye spesifiklik ve organele spesifiklik esasinda hedeflenmesi de mümkündür ve ilgili alanda bilinmektedir. ÖRNEKLER Bulus bu noktaya kadar genel olarak tarif edilmistir ve sadece belirli düzenlemeleri ve mevcut bulusun düzenlemelerini açiklama amaciyla verilen ve bulusu sinirlandirmamasi amaçlanan asagidaki örneklere basvurularak daha kolay bir sekilde anlasilacaktir. Örnek 1. Bir GDF Tuzaginin üretimi.
Basvuru sahipleri bir GDF Tuzagini su sekilde üretmistir: GDF11 ve/veya miyostatine kiyasla büyük ölçüde azalmis aktivin A baglanimina sahip olan (SEQ ID NO:1'de 79. pozisyonda bir 55 Iösin -› aspartat sübstitüsyonundan dolayi) ActRIIB'nin bir degistirilmis ekstraselüler domenini içeren bir polipeptit, arada bir minimal baglanti (üç glisin amino asidi) ile birlikte, bir insan veya fare Fc domeni ile kaynastirilmistir. Konstraktlar sirasiyla ActRIIB(L79D 20-134)- hFc ve ActRIIB(L79D 20-134)-mFc olarak adlandirilir. 79. pozisyonda bir aspartat yerine bir glutamat içeren alternatif formlar benzer bir performans sergilemistir (L79E). Asagidaki SEQ ID NO:7'ye göre 226. pozisyonda bir valin yerine bir alanin içeren alternatif formlar da üretilmistir ve test edilen tüm yönler itibariyla esdeger performans sergilemistir. SEQ ID NO:1'e göre 79. pozisyondaki veya SEQ ID NO:7'ye göre 60. pozisyondaki aspartat asagida gri renkle vurgulanir. SEQ ID NO:7'ye göre 226. pozisyondaki valin de asagida gri renkle vurgulanir.
GDF Tuzagi ActRIIB(L79D 20-134)-hFc asagida CHO hücre hatlarindan saflastirilmis halde gösterilir (SEO ID No:7). (iRtriF '\|"TF (i(`\\`l)l)[)l`\(`\ I)Rt)lî(`\ .-\`[ EIIC\P()\'\›[`(`(`(`Ii(if\i('\içRl^ I`lll I'i:.~\(i(il'i-.\- l'YliPPPI .i\I'4I`('i('i(i'liH`I't' l'l't l'~\l'H I(i(`i|`*<\ H H'PKPKIIH “ISK I l'I-\`I( \`\ \`I)\ SHl-IWI-*i k l'\J\\ \ \ I)(_j\ l \ II\ `k I Kl'RH UN \5I \ R\ \ 5`v'l I\`l llQlHNl \l_ikl \ k(_ l\\ 5\k.\l P\"l'Il-.I\”1'1.\`K.-\K(&OPRI-.I'IIJVYII.l'PSRIrIl-NI'TKVJVSIII'( l.\ K(}FYI`I\[)1.'\\'I~\\`}I.\\(i<`_) Pr\\\'KTTPP\`l IHD( iSFFI \'\KI.T\'[)KNI4.\\1,!I_H i\\T.\( .\\"\liIFÄLHVHATQRSIN ISPÜK GDF Tuzaginin ActRIIB kökenli kismi asagida gösterilen amino asit dizisine (SEQ ID NO:32) sahiptir ve bu kisim bir monomer olarak veya bir monomer, dimer veya daha yüksek dereceden bir kompleks seklinde bir FC harici füzyon proteini olarak kullanilabilir.
(JR(_i[-.\FTR[_{_ I`i'\'\.~'\i\`\'i F.] FRTMJSLiITRL UJI'UDKRI HL Y-ISÜ› RNSN'JTIF I \ kkl'jCV. Dl)l)l'\(`_›\ URQI C& "\ | l l<\l"(`)\\ l›('_'('_ (jl ('_`i\lr(_i\ll RI` I !II PI› ``\t'_i(il"l \ l `i l PPPTKPT (Srl) ID \(`_) .12`i GDF Tuzagi proteini CHO hücre hatlarinda ifade edilmistir. Üç farkli lider dizi düsünülmüstür: (i) Bal arisi melittini (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID No:8) (ii) Doku Plazminojen Aktivatörü (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID No:9) (iii) Dogal: MTAPWVALALLWGSLCAGS (SEQ ID NO:10).
Seçilen form TPA liderini kullanir ve asagidaki islenmemis amino asit dizisine sahiptir: 56 HF)\\1KR(.I( ('\I I l(`(iv\\'l`\'.\P(i-\.\'L(_.R(`iF.XFTRF(`I\'\'\lv'~.\\\'FI F.RT\t`)\(_i1 FR( i'- (iFQDKRl ll( `Y -'\S\'. R\.\'\'(.iTIF I,'\-'KK(i( '0. DUDI'N( YÜRÜK( '\ .i\TI'.l'-\Jf't`)\"i'1`('( '(T. (if\|<'(`\l*Rl"l'lll.Pi' '\(i(iPl \"l YlrPPPVI .-\P'I(i(i[i`l'll`l'[`PP[`P \Pl`l LÜUPSVH E'PPKPKI) TI \411$RTPF\`T(`\'\"\`D\`Sl[FDPFYKF\\V\"\'l')('i\'f7\'|i\ %KTKPRTFLWNSTYRVVSY 1_ [ \'LHQLJ\\'L.\(il\'L`}`I\-( I\\'$.\I\'_'\LI"\ I'ILKITSKAKULJPIU_I"<.!\"i 'I'Ll'l,.\l\`LL.`~1l KM.! `\ `L ICL\ l\(.il \'I'$L)l.-\\ L“ LRVi'iQI'LhVi k 11”“ LURDGSH'L3 `KL I \'L)k9R\\ QQ kiT\\'l›R(`S\'MIlI-IAUî\lIY TÜKM Sl SPOR iSH) [Ü V( II '.l'i Bu polipeptit, asagidaki nükleik asit dizisi (SEO ID NO:12) tarafindan kodlanir: _ - __ . z_ . z - _ z ._ _. T _ T "T ` ` T .~ ~ ~ ~ - i i - .~.. - 1 ~- ~ .. . l . .1. l . - _ __ _ _ _ _ `IT' 'T 'T _ ^I . . . i_ ' 'i 'i "l . . l I'I '. .' 'l ` ` 1 l i'I l " l 1 'I 'I I i _:1 ... . _, i i ..' ' - - 111' ' '7- .'.r- 11'", l . 1 I . I | ,. .« 5 .1. '-1 Mr'- T" TZ"^'_Z"." "ij-i' Saflastirma, örnegin herhangi bir sirayla sunlardan üç veya daha fazlasi da dahil olmak üzere bir dizi kolon kromatografisi adimi ile gerçeklestirilmistir: protein A kromatografisi, Q sefaroz kromatografisi, fenilsefaroz kromatografisi, boyut dislama kromatografisi ve katyon degistirme kromatografisi. Saflastirma, viral filtreleme ve tampon degisimi ile tamamlanabilir.
Bir örnek saflastirma semasinda, hücre kültürü ortami bir protein A kolonundan geçirilir, 150 mM Tris/NaCI (pH 8.0) içinde yikanir, akabinde 50 mM Tris/NaCI (pH 8.0) Içinde yikanir ve 0.1 M glisin (pH 3.0) ile ayristirilir. Düsük pH seviyeli elüat bir viral klirens adimi olarak 30 dakika boyunca oda sicakliginda tutulur. Elüat akabinde nötrlestirilir ve bir Q sefaroz iyon degistirme kolonundan geçirilir ve 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl içinde yikanir ve 50 mM Tris (pH 8.0) içinde ayristirilir (NaCI konsantrasyonu: 150 mM ila 300 mM). Elüat akabinde 50 mM Tris (pH 8.0), 1.1 M amonyum sülfat içerisine yüklenir ve bir fenil sefaroz kolonundan geçirilir, yikanir ve 150 ila 300 mM amonyum sülfat ile birlikte 50 mM Tris (pH 8.0) içinde ayristirilir. Elüat diyaliz edilir ve kullanim için filtrelenir.
Ilave GDF Tuzaklari (miyostatin veya GDF11'e kiyasla aktivin A baglanim oranini azaltmak için degistirilmis ActRIIB-Fc füzyon proteinleri), PCT/US2008/001506 ve WO 2006/012627'de tarif edilir. 57 Örnek 2. GDF-11 ve Aktivin aracili sinyal iletimine yönelik biyoanaliz.
ActRIlB-Fc proteinlerinin ve GDF Tuzaklarinin GDF-11 ve Aktivin A aracili sinyal iletimine etkilerini degerlendirmek için bir A-204 Raportör Gen Analizi kullanilmistir. Hücre hatti: Insan Rabdomiyosarkom (kastan türetilmistir). Raportör vektör: pGL3(CAGA)12 (Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-3100'de açiklanir). CAGA12 motifi TGF-Betaya duyarli genlerde (PAI- 1 geni) mevcuttur, dolayisiyla bu vektör, Smad2 ve 3 üzerinden sinyal iletiminde bulunan faktörler için genel kullanima sahiptir. 1. Gün: A-204 hücreleri 48 gözlü plaga dagitilir. 2. Gün: A-204 hücreleri 10 ug pGL3(CAGA)12 veya pGL3(CAGA)12 (10 ug) + pRLCMV (1 ug) ve Fugene ile transfekte edilir. 3. Gün: Faktörler (ortam + %0.1 BSA ile seyreltilmistir) ilave edilir. Hücrelere ilave edilmeden önce inhibitörlerin 1 saatligine Faktörler ile ön inkübasyona tabi tutulmasi gerekir. 6 saat sonra hücreler PBS ile yikanir ve hücreler Iize edilir.
Akabinde bir Lüsiferaz analizi gerçeklestirilir. Herhangi bir inhibitörün yoklugunda, Aktivin A, katlik raportör gen ifadesi uyarimi ve ~ 2 ng/ml'lik bir ED50 sergilemistir. GDF-11: 16 katlik uyarim, ED50: ~ 1.5 ng/ml.
ActRIIB(20-134) bu analizde aktivin, GDF-8 ve GDF-11 aktivitesinin etkili bir inhibitörüdür. Bu analizde varyantlar da test edilmistir. Örnek 3. N terminal ve C terminal Budamalari ile GDF-11 Inhibisyonu N terminusta ve/veya C terminusta budamalar içeren ActRIIB(20-134)-hFc varyantlari üretilmistir ve GDF-11 ve aktivin inhibitörleri olarak aktivite için test edilmistir. Aktiviteler asagida gösterilir (sartlandirilmis ortamda ölçülmüstür): C Terminal ActRllB-hFc Budamalari: ICSO (ng/mL) GDF-11 Aktivin ActRIIB(20-134)-hFC 45 22 58 ActRIIB(20-132)-hFc 87 32 ActRIIB(20-131)-hFc 120 44 ActRIIB(20-128)-hFc 130 158 Görüldügü üzere, C terminusta üç (...PPT ile sonlanan). alti (...YEP ile sonlanan) veya daha fazla amino asitlik budamalar molekülün aktivitesinde üç katlik veya daha büyük bir düsüs ile sonuçlanir. ActRIIB kisminda son 15 amino asidin budanmasi daha büyük bir aktivite kaybina neden olur (bakiniz W02006/012627).
Bir ActRIlB(20-131)-hFc proteini arkaplaninda amino terminal budamalari gerçeklestirilmistir.
Aktiviteler asagida gösterilir (sartlandirilmis ortamda ölçülmüstür): N Terminal ActRIIB-hFc Budamalari: ICSO (ng/mL) GDF-11 Aktivin ActRIIB(20-131)-hFc (GRG...) 183 201 ActRIIB(21-131)-hFc (RGE...) 121 325 ActRIIB(22-131)-hFC (GEA...) 71 100 ActRIIB(23-131)-hFC (EAE...) 60 43 ActRIIB(24-131)-hFc (AET...) 69 105 Buna göre, N terminusta iki, üç veya dört amino asitlik budamalar, bir tam uzunluklu ekstraselüler domene sahip versiyonlardan daha aktif bir proteinin üretimi ile sonuçlanir.
Ilave deneyler, bes amino asitlik bir budamanin {ActRllB(25-131)-hFc}, budanmamis form ile esdeger aktivite sagladigini ve N terminusta ilave eksilmelerin protein aktivitesini azaltmaya devam ettigini gösterir. Dolayisiyla optimal konstraktlar, SEQ ID NO:1'in 133-134. amino asitlerinde sonlanan bir C terminusa ve SEO ID NO:1'in 22-24. amino asitlerinden baslayan bir N terminusa sahip olacaktir. 21 veya 25. amino asitlere karsilik gelen bir N terminus, ActRIIB(20-134)-hFc konstraktina benzer bir aktivite saglayacaktir. Bu budamalar ayrica GDF Tuzaklari, örnegin bir L79D veya L79E varyanti baglaminda kullanilabilir. Örnek 4. ActRIIB-Fc Varyantlari, Hücre Esasli Aktivite.
ActRIIB-FC proteinlerinin ve GDF Tuzaklarinin aktivitesi yukarida tarif edildigi üzere bir hücre esasli analizde test edilmistir. Sonuçlar asagidaki tabloda Özetlenir. Bazi varyantlar, farkli C terminal budama konstraktlarinda test edilmistir. Yukarida ele alindigi üzere, bes veya on 59 bes amino asitlik budamalar aktivitede azalmaya neden olmustur. GDF Tuzaklari (L79D ve L79E varyantlari) aktivin baglaniminda önemli bir kayip sergilemistir ve ayni zamanda GDF- 11'in dogal sus inhibisyonunu büyük ölçüde korumustur.
GDF11 ve Aktivin A'ya baglanan çözünür ActRllB-Fc: ActRlIB-Fc ActRllB Kismi (SEQ ID NO:1'de GDF11 Inhibisyon Aktivin Inhibisyon Varyasyonlari karsilik geldigi amino asitler) Aktivitesi Aktivitesi R64 20-134 +++ +++ (yaklasik 10'8 M (yaklasik 10'8 M K.) Ki) A64 20-134 + (yaklasik 10'6 M + (yaklasik 10'8 M Ki) Ki) R64 20-129 +++ +++ R64 K74A 20-134 ++++ ++++ R64 A24N 20-134 +++ +++ R64A24N 20-119 ++ ++ R64 A24N K74A 20-119 + + R64 L79P 20-134 + + R64 L79P K74A 20-134 + + R64 L79D 20-134 +++ + R64 L79E 20-134 +++ + R64K 20-134 +++ +++ R64K 20-129 +++ +++ R64 P1298 P130A 20-134 +++ +++ R64N 20-134 + + + Yetersiz aktivite (yaklasik 1x10'6 Ki) ++ Orta düzeyde aktivite (yaklasik 1x10`7 Ki) +++ Iyi (yabanil tip) aktivite (yaklasik 1x10'8 K.) ++++ Yabanil tipten yüksek aktivite Birkaç varyant siçanlarda serum yari ömrü için degerlendirilmistir. ActRIIB(20-134)-Fc, yaklasik olarak 70 saatlik bir serum yari ömrüne sahiptir. ActRIIB(A24N 20-134)-Fc, yaklasik olarak 100-150 saatlik bir serum yari ömrüne sahiptir. A24N varyanti hücre esasli analizde (yukarisi) ve in vivo analizlerde (asagisi) dogal sus molekül ile esdeger aktivite sergiler. 60 Bunun anlami, daha uzun bir yari ömür ile birlikte, zaman içerisinde bir A24N varyantinin birim protein için dogal sus molekülden daha yüksek bir etki saglayacagidir. A24N varyanti ve yukarida test edilen diger varyantlardan herhangi biri, GDF Tuzagi molekülleriyle, örnegin L79D veya L79E varyantlariyla birlestirilebilir. Örnek 5. GDF-11 ve Aktivin A Baglanimi.
Belirli ActRlIB-Fc proteinlerinin ve GDF Tuzaklarinin Iigandlara baglanimi bir BiaCoreT'V' analizinde test edilmistir.
AotRIIB-Fc varyantlari veya dogal sus protein, bir anti-hFc antikor ile yakalanarak sisteme baglanmistir. Ligandlar enjekte edilmistir ve yakalanmis reseptör proteinleri üzerinden akitilmistir. Sonuçlar asagidaki tablolarda özetlenir.
IIB varyantlarinin ligand baglanma spesifikligi.
GDF11 Protein Kon (1/Ms) Koff (1Is) KD (M) ActRllB(20-134)-hFc 1.34e-6 1.13e-4 8.42e-11 ActRlIB(A24N 20-134)-hFc 1.21e-6 6.35e-5 5.19e-11 ActRlIB(L79D 20-134)-hFc 6.7e-5 4.39e-4 6.55e-10 ActRlIB(L79E 20-134)-hFc 3.8e-5 2.74e-4 7.16e-10 ActRlIB(R64K 20-134)-hFc 6.77e-5 2.41 e-5 3.569-11 GDF8 Protein Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M) ActRlIB(20-134)-hFc 3.69e-5 3.45e-5 9.35e-11 ActRlIB(A24N 20-134)-hFc ActRlIB(L79D 20-134)-hFc 3.85e-5 8.3e-4 2.15e-9 ActRlIB(L79E 20-134)-hFc 3.74e-5 9e-4 2.41e-9 ActRlIB(R64K 20-134)-hFc 2.25e-5 4.71e-5 2.1e-1O ActRlIB(R64K 20-129)-hFc 9.74e-4 2.09e-4 2.15e-9 ActRlIB(P1298, P130R 20-134)-hFc1.08e-5 1.8e-4 1.67e-9 ActRlIB(K74A 20-134)-hFc 2.8e-5 2.03e-5 7.18e-11 61 Aktivin A Protein Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M) ActRIIB(20-134)-hFc 5.94e6 1.59e-4 2.68e-11 ActRIIB(A24N 20-134)-hFc 3.34e6 3.46e-4 1 .04e-1O ActRIIB(L79D 20-134)-hFc Düsük baglanma ActRIIB(L79E 20-134)-hFc Düsük baglanma ActRIIB(R64K 20-134)-hFc 6.82e6 3.25e-4 4.76e-11 ActRIIB(R64K 20-129)-hFc 7.46e6 6.28e-4 8.41e-11 ActRIIB(P129S, P13OR 20-134)-hFc 5.02e6 4.17e-4 8.31e-11 Bu verilerin, hücre esasli analiz verilerini dogrulamasi, A24N varyantinin ActRIIB(20-134)- hFc molekülü ile benzer bir Iigand baglanma aktivitesini korudugunu ve L79D veya L79E molekülünün miyostatin ve GDF11 baglanma aktivitesini korudugunu, ancak Aktivin A için belirgin düzeyde düsük (tayin edilemez) baglanma sergiledigini gösterir.
W02006/012627'de (bakiniz örnegin 3. 59-60) bildirildigi üzere, ligandlarin cihaza kenetlenmesi ve reseptörün akis yoluyla kenetli Iigandlar üzerinden geçirilmesi suretiyle baska varyantlar üretilmistir ve test edilmistir. Bilhassa, K74Y, K74F, K74I (ve varsayimsal olarak K74 pozisyonundaki diger hidrofobik sübstitüsyonlar, örnegin K74L) ve DSOI, dogal sus K74 molekülüne kiyasla, Aktivin A baglanimi ile GDF11 baglanimi arasindaki oranda bir düsüs saglar. Bu varyantlar ile ilgili verilerin tablosu asagida yeniden olusturulmustur: GDF11 ve Aktivin A'ya baglanan çözünür ActRllB-Fc varyantlari (BiaCore analizi) ActRIIB ActA GDF11 WT (64A) KD=1.8e-7M(+) KD: 2.6e-7M(+) WT (64R) na KD= see-sivi (+++) +15tail KD ~2.6 e-8M (+++) KD=1.9e-8M(++++) E37A * * R40A - - D54A - * K55A ++ * R56A * * K74A KD=4.356-9 M +++++ KD=5.Se-9M +++++ 62 K74Y * - K74F * - K74I * - W78A * * L79A + * D8OK * * D80R * * D80A * * D80F * * D8OG * * D80M * * D80N * * D80I * -- F82A ++ - * Gözlemlenen herhangi bir baglanma yok -- WT baglaniminin 1/5'inden küçük - WT baglaniminin ~1/2'si + WT ++ 2 kattan düsük oranda artmis baglanim +++ ~5 kat artmis baglanim +++ ~10 kat artmis baglanim +++ ~40 kat artmis baglanim Örnek 6. ActRllB-hFc, Insan Harici Primatlarda Eritropoiezi Uyarir ActRIIB(20-134)-hFc (lgG1), erkek ve disi sinomolgus maymunlarina 1 ay boyunca haftada bir kere subkütanöz enjeksiyon yoluyla uygulanmistir. Kirk sekiz sinomolgus maymunu (24/cinsiyet) dört uygulama grubundan birine atanmistir (6 hayvan/cinsiyet/grup) ve hayvanlara 4 hafta boyunca haftada bir kere (toplam 5 doz) subkütanöz enjeksiyon yoluyla 3, veya 30 mg/kg'lik ActRIIB-hFc veya araç verilmistir. Degerlendirilen parametreler genel klinik patolojiyi kapsar (hematoloji, klinik kimya, pihtilasma ve idrar analizi). ActRllB-hFc, muamele edilen hayvanlarda 15. Günde istatistiksel olarak anlamli düzeyde artmis ortalama mutlak retikülosit degerleri saglamistir. ActRIIB-hFc 36. günde artmis ortalama mutlak retikülosit ve kirmizi kan hücresi dagilim genisligi degerleri ve daha düsük ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu da dahil olmak üzere birtakim hematolojik degisimlere neden 63 olmustur. Tüm uygulama gruplari ve her iki cinsiyet de etkilenmistir. Bu etkiler, ActRllB- hFc'nin, kemik iliginden olgunlasmamis retikülosit salimi üzerindeki pozitif etkisi ile tutarlidir.
Bu etki, muamele edilen hayvanlar ilaçtan arindiktan sonra (56. çalisma gününde) tersine dönmüstür. Dolayisiyla ActRllB-hFc'nin eritropoiezi uyardigi sonucuna varilmistir. Örnek 7. ActRllB-mFc Farelerde Splenik Eritropoietik Aktivitelerin Uyarimi Üzerinden Eritropoiez Özelliklerini Destekler Bu çalismada, in vivo ActRIIB(20-134)-mFc uygulamasinin kemik iliginde ve dalakta hematopoietik progenitörlerin sikligi üzerindeki etkileri analiz edilmistir. Bir grup C57BL/6 faresine kontrol olarak PBS enjekte edilmistir ve ikinci bir grup fareye 10 mg/kg'lik iki doz ActRllB-mFc uygulanmistir ve her iki grup da 8 gün sonra feda edilmistir. Tam kan sayimi için periferik kan kullanilmistir ve her organdaki Ienfatik, eritroid ve miyeloid progenitör hücre içerigini degerlendirmeye yönelik in vitro klonojenik analizleri gerçeklestirmek için femurlar ve dalaklar kullanilmistir. Bu çalismanin kisa zaman araliginda, muamele edilen farelerin kirmizi kan hücresi, hemoglobin veya beyaz kan hücresi düzeylerinde anlamli herhangi bir degisim gözlenmemistir. Femurlarda, kontrol ve uygulama gruplari arasinda çekirdekli hücre sayilarinda veya progenitör içerigi bakimindan herhangi birfark mevcut degildir. Dalaklarda, bilesik uygulama grubunun her bir kaptaki olgun eritroid progenitör (CFU-E) koloni sayisi, sikligi ve her bir dalaktaki toplam progenitör sayisinda istatistiksel olarak anlamli bir artis gözlenmistir. Ayrica, her bir dalakta miyeloid (CFU-GM), olgunlasmamis eritroid (BFU-E) ve total progenitör sayisinda bir artis gözlenmistir.
Hayvanlar: Çalismada 6-8 haftalik on alti disi CS7BL/6 faresi kullanilmistir. Sekiz fareye 1 ve 3. günlerde subkütanöz olarak 10 mg/kg'lik bir dozda test bilesigi ActRlIB-mFc enjekte edilmistir ve sekiz fareye subkütanöz olarak 100 uL/fare oraninda araç kontrolü, fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edilmistir. Tüm fareler birinci enjeksiyondan 8 gün sonra ilgili Hayvan Bakimi Yönergelerine göre feda edilmistir. Her bir hayvandan kardiyak punktür yoluyla periferik kan (PB) numuneleri alinmistir ve tam kan sayimi ve diferansiyel (CBC/Diff) için kullanilmistir.
Her fareden femurlar ve dalaklar alinmistir.
Yapilan testler: CBCIDiff Sayimi 64 Her fareden kardiyak punktür yoluyla PB alinmistir ve uygun Microtainer tüplerine yerlestirilmistir. Numuneler bir CeIlDyn 3500 sayim cihazinda analiz için CLV'ye gönderilmistir.
Klonojenik Analizler Miyeloid, eritroid ve Ienfatik soylarin klonojenik progenitörleri, asagida tarif edilen in vitro metilselüloz esasli ortam sistemleri ile degerlendirilmistir.
Olgun Eritroid Progenitörler: Olgun eritroid (CFU-E) soylarinin klonojenik progenitörleri, rekombinant insan (rh) Eritropoietini (3 U/mL) içeren bir metilselüloz esasli ortam olan MethoCultTM 3334 içinde kültü rlenmistir.
Lenfatik Progenitörler: Lenfatik (CFU-pre-B) soyun klonojenik progenitörleri, rh Interlökin 7 (10 ng/mL) içeren bir metilselüloz esasli ortam olan MethoCult® 3630 içinde kültürlenmistir.
Miyeloid ve Olgunlasmamis Eritroid Progenitörler: Granülosit-monosit (CFU-GM), eritroid (BFU-E) ve multipotansiyel (CFU-GEMM) soylarinin klonojenik progenitörleri, rekombinant murin (rm) Kök Hücre Faktörü (50 ng/mL), rh Interlökin 6 (10 ng/mL), rm Interlökin 3 (10 ng/mL) ve rh Eritropoietin (3 U/mL) içeren bir metilselüloz esasli ortam olan MethoCultTM 3434 içinde kültürlenmistir.
Yöntemler: Fare femurlari ve dalaklari standart protokollere göre islenmistir. Özet olarak kemik iligi, femoral boslugun bir 21 G'Iik igne ve 1 cc'lik siringa yardimiyla %2 fetal sigir serumu (IMDM %2 FBS) içeren Iscove'un Degistirilmis Dulbecco Ortami ile yikanmasi yoluyla elde edilmistir.
Dalak hücreleri, dalaklarin bir 70 uM'Iik filtreden geçirilmesi ve filtrenin IMDM %2 FBS ile yikanmasi yoluyla elde edilmistir. Akabinde bir Neubauer sayim odasi kullanilarak %3 saf asetik asit içinde tekli hücre süspansiyonlarinda çekirdekli hücre sayimi gerçeklestirilmistir ve böylece her organ için toplam hücre sayisi hesaplanabilmistir. Akabinde kontamine edici kirmizi kan hücrelerini uzaklastirmak için total dalak hücreleri 3 kat hacimde amonyum klorür 65 Iiziz tamponu ile seyreltilmistir ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilmistir. Hücreler akabinde yikanmistir ve IMDM %2 FBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmistir ve Iizizden sonra hücre konsantrasyonunu belirlemek için ikinci bir hücre sayimi gerçeklestirilmistir.
Hücre stoklari hazirlanmistir ve her bir doku için her bir ortam formülasyonunda optimal ekim konsantrasyonunu elde etmek amaciyla metilselüloz esasli ortam formülasyonlarina ilave edilmistir. Kemik iligi hücreleri, olgun eritroid progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3334 içinde 1x“l05 hücre/kap oraninda, lenfatik progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3630 içinde 2x105 hücre/kap oraninda ve olgunlasmamis eritroid ve miyeloid progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3434 içinde 3x104 hücre/kap oraninda ekilmistir. Dalak hücreleri, olgun eritroid progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3334 içinde 4x105 hücre/kap oraninda, lenfatik progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3630 içinde 4x105 hücre/kap oraninda ve olgunlasmamis eritroid ve miyeloid progenitörleri degerlendirmek için MethoCuItTM 3434 içinde 2x105 hücre/kap oraninda ekilmistir. Kaplara üç kopya halinde ekilen kültürler, koloni sayimina kadar 37°C'de %5 002 altinda inkübe edilmistir ve degerlendirme egitimli personel tarafindan yapilmistir. Olgun eritroid progenitörler 2 gün kültürlenmistir, lenfatik progenitörler 7 gün kültürlenmistir ve olgun eritroid ve miyeloid progenitörler 12 gün kültürlenmistir.
Analiz: Klonojenik analizlerin üç kopya kültürleri için ve tüm veri kümelerine yönelik olarak kontrol ve uygulama gruplari için ortalama +/- 1 standart sapma hesaplanmistir.
Her bir dokuda koloni olusturan hücrelerin (CFC) sikligi su sekilde hesaplanmistir: Her bir kapta ekilen hücreler Her bir kapta skorlanan ortalama CFC Her bir femur veya dalak için total CFC su sekilde hesaplanmistir: Skorlanan total CFC x her bir femur veya dalak için çekirdekli hücre sayisi (RBC Iizizinden sonra) Kültürlenen çekirdekli hücrelerin sayisi PBS kontrol fareleri ve bilesik ile muamele edilen fareler arasinda hücrelerin veya hematopoietik progenitörlerin ortalama sayisi bakimindan bir farkin bulunup bulunmadigini degerlendirmek için standart t testleri gerçeklestirilmistir. Koloni sayiminin potansiyel 66 öznelliginden dolayi, 0.01'den küçük bir p degeri anlamli olarak kabul edilmistir. Her bir grup için ortalama degerler (+/- SS) asagidaki tablolarda gösterilir.
Tablo: Hematolojik Parametreler Uygulama Beyaz Kan Hücreleri Kirmizi Kari Hücreleri Hemoglobin Hematokrit Grubu (x109/L) (X109/L) (g/L) (L/L) PBS (n=8) 9.53 +/- 1.44 10.5 +/-1.1 160.9 +/- 13.3 0.552 +/- 0.057 ActRIIB-mFc 9.77 +/- 1.19 10.8 +/- 0.3 162.1 +/- 4.1 0.567 +/- (n=8) 0.019 Tablo: Femur ve Dalak için CFC Uygulama Grubu Total Total Total CFU- Total CFU- CFC/Femur CFC/Dalak E/Femur E/Dalak PBS (n=8) 88 +/- 10 54 +/- 14 156 +/- 27 131 +/- 71 ActRIIB-mFc 85 +/- 9 79 +/- 6* 164 +/- 23 436 +/- 86* (n=8) * ön analiz, p<0.05 oldugunu gösterir Farelerin ActRIIB(20-134)-mFc ile muamele edilmesi, bu çalismanin kisa zaman araliginda, kirmizi kan hücresi veya hemoglobin içeriginde anlamli artislar ile sonuçlanmamistir. Ancak progenitör hücre Içerigi üzerindeki etki belirgindir. Femurlarda, kontrol ve uygulama gruplari arasinda çekirdekli hücre sayilarinda veya progenitör içerigi bakimindan herhangi bir fark mevcut degildir. Dalaklarda, kirmizi kan hücresi Iizizinden önce bilesik uygulama grubunun çekirdekli hücre sayisinda ve olgun eritroid progenitör (CFU-E) koloni sayisi/kap, siklik ve total progenitör sayisi/dalak degerlerinde istatistiksel olarak anlamli bir artis gözlenmistir.
Ayrica, her bir dalakta miyeloid (CFU-GM), olgunlasmamis eritroid (BFU-E) ve total progenitör sayisinda bir artis gözlenmistir. Dolayisiyla, daha uzun bir süre zarfinda ActRIIB(20-134)-mFc uygulamasinin artmis kirmizi kan hücresi ve hemoglobin içerigi ile sonuçlanabilmesi beklenmektedir. Örnek 8: Bir GDF Tuzagi in vivo olarak Kirmizi Kan Hücresi Düzeylerini Yükseltir On iki haftalik erkek CS7BL/6NTac fareleri birine iki uygulama grubundan birine atanmistir (N=10). Farelere 4 hafta boyunca haftada iki kere subkütanöz enjeksiyon (SC) yoluyla 10 mg/kg'lik bir dozda bir varyant ActRIIB polipeptidi ("GDF Tuzagi") [ActRIIB(L79D 20-134)- 67 hFc] veya araç uygulanmistir. Çalismanin sonunda EDTA içeren tüplere kardiyak punktür yoluyla tam kan alinmistir ve bir HM2 hematoloji analiz cihazi (Abaxis, Inc) ile hücre dagilimi için analiz edilmistir.
Grup Tahsisi Grup N Fareler Enjeksiyon Doz Yol Siklik (mg/kg) 1 10 C57BL/6 PBS 0 SC Haftada iki kere 2 10 C57BL/6 GDF Tuzagi [ActRIIB(L79D 20-134)- 10 SC Haftada iki hFc] kere GDF Tuzagi uygulamasi, beyaz kan hücrelerinin (WBC) sayisi üzerinde araç kontrollerine kiyasla istatistiksel olarak anlamli bir etki sergilememistir. Kirmizi kan hücresi (RBC) sayilari kontrollere kiyasla uygulama grubunda artmistir (bakiniz asagidaki tablo). Ayrica ilave kirmizi kan hücrelerinden dolayi hem hemoglobin içerigi (HGB) hem de hematokrit (HCT) artmistir. Kirmizi kan hücrelerinin ortalama genisliginin (RDWc) muamele edilen hayvanlarda daha yüksek olmasi, olgunlasmamis kirmizi kan hücreleri havuzunda bir artisa isaret eder.
Dolayisiyla GDF Tuzagi uygulamasi, beyaz kan hücresi popülasyonlari üzerinde ayirt edilebilir herhangi bir etki olmaksizin kirmizi kan hücrelerinde artislar saglar.
Hematoloji Sonuçlari RBC 1012/L HGB (gldL) HCT (%) RDWc (%) PBS .7±0.1 14.8 ± 0.6 44.8 ± 0.4 17.0±O.1 GDF Tuzagi 12.4 ± 0.4** 17.0 ± 0.7* 48.8 ± 1.8* 18.4 ± 0.2** *=p<0.05, **=p<0.01 Örnek 9: Bir GDF Tuzagi In Vivo Olarak Kirmizi Kan Hücresi Düzeylerini Artirma Bakimindan ActRlIB-Fc'den Üstündür.
On dokuz haftalik erkek CS7BL/6NTac fareleri üç gruptan birine rastgele sekilde atanmistir.
Farelere üç hafta boyunca haftada iki kere subkütanöz enjeksiyon yoluyla araç (10 mM Tris Tamponlu Salin, TBS), dogal sus ActRllB(20-134)-mFc veya GDF tuzagi ActRIIB(L79D 20- 134)-hFc uygulanmistir. Baslangiçta ve doz uygulamasindan üç hafta sonra yanaktan kari alinmistir ve bir hematoloji analiz cihazi (HM2, Abaxis, Inc.) ile hücre dagilimi için analiz edilmistir. 68 ActRIIB-F0 veya GDF tuzagi uygulamasi beyaz kan hücresi (WBC) sayilari üzerinde araç kontrollerine kiyasla anlamli bir etki sergilememistir. Kirmizi kari hücresi sayisi (RBC), hematokrit (HCT) ve hemoglobin düzeylerinin tümü, kontrollere veya dogal sus konstrakta kiyasla GDF Tuzagi ile muamele edilen farelerde degerlendirilmistir (bakiniz asagidaki tablo). Dolayisiyla, bir dogrudan karsilastirmada, GDF tuzagi kirmizi kan hücrelerindeki artislari bir dogal sus ActRIIB-FC proteinine kiyasla anlamli bir ölçüde daha yüksek derecede destekler. Gerçekten de bu deneyde dogal sus ActRIIB-FC proteininin kirmizi kan hücrelerinde istatistiksel olarak anlamli bir artisa yol açmamis olmasi, bu etkiyi açiga çikarmak için daha uzun süreli veya daha yüksek doz uygulamasinin gerekli olacagini gösterir.
Doz uygulamasindan üç hafta sonraki Hematoloji Sonuçlari RBC (101zlml) HCT °/o HGB gIdL TBS 11.06 ± 0.46 46.78 ± 1.9 15.7 ± 0.7 ActRIIB-mFc 11.64 ± 0.09 49.03 ± 0.3 16.5 ± 1.5 GDF Trap 13.19 ± 0.2** 53.04 ± 0.8** 18.4 ± 0.3** **=p<0.01 Örnek 10. Budanmis ActRIIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzaginin üretimi Örnek 1'de tarif edildigi üzere, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc olarak adlandirilan bir GDF Tuzagi, TPA liderinin, bir Iösin ~› aspartat sübstitüsyonu (SEO ID NO:1'de 79. kalintida) içeren ActRIIB ekstraselüler domenine (SEQ ID NO:1'de 20-134. kalintilar) N terminal füzyonu ve insan Fc domeninin minimal baglanti (üç glisin kalintisi) ile C terminal füzyonu üzerinden üretilmistir (Sekil 3). Bu füzyon proteinine karsilik gelen bir nükleotit dizisi Sekil 4'te gösterilir.
Budanmis ActRIIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzagi (ActRllB(L79D 25-131)-hFc olarak adlandirilir), TPA liderinin, bir Iösin a aspartat sübstitüsyonu (SEQ ID NO:1'de 79. kalinti) içeren budanmis ekstraselüler domene (SEO ID NO:1*de 25-131. kalintilar) N terminal füzyonu ve insan Fc domeninin minimal baglanti (üç glisin kalintisi) ile C terminal füzyonu üzerinden üretilmistir (Sekil 5). Bu füzyon proteinine karsilik gelen bir nükleotit dizisi Sekil 6'de gösterilir. Örnek 11. Ikili Budanmis ActRIIB Ekstraselüler Domenine sahip GDF Tuzaginin Seçici Ligand Baglanimi 69 GDF Tuzaklarinin ve diger ActRlIB-hFC proteinlerinin birtakim Iigandlara yönelik afinitesi bir BiacoreTM cihaziyla in vitro olarak degerlendirilmistir. Sonuçlar asagidaki tabloda özetlenir.
Kd degerleri kompleksin çok hizli birlesmesinden ve ayrismasindan dolayi kararli afinite uyumu ile elde edilmistir, bu da kesin kon ve kon tayinini engellemistir.
ActRllB-hFc Varyantlarinin Ligand Seçiciligi: Füzyon Konstrakti Aktivin A (Kd e-11) Aktivin B (Kd e-11) GDF11 (Kd e-11) ActRIIB(L79 20-134)-hFc 1.6 1.2 3.6 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 1350.0 78.8 12.3 AotRlIB(L79 25-131)-hFc 1.8 1.2 3.1 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 22900 62.1 7.4 Bir budanmis ekstraselüler domene sahip GDF Tuzagi (ActRIIB(L79D 25-131)-hFc), L79D sübstitüsyonu içermeyen ActRIIB-hFc karsitlarina kiyasla aktivin A ve aktivin B baglaniminda belirgin kayip ve GDF11 baglaniminda neredeyse tam retansiyon ile birlikte, daha uzun varyant olan ActRIIB(L79D 20-134)-hFc'nin Iigand seçiciligine denk veya daha üstün Iigand seçiciligi sergilemistir. Tek basina budamanin (L79D sübstitüsyonu olmadan) burada gösterilen Iigandlar arasinda seçiciligi degistirmedigi dikkate alinmalidir [ActRIIB(L79 25- 131)-hFc ile ActRIIB(L79 20-134)-hFc'yi karsilastiriniz]. Örnek 12. Alternatif Nükleotit Dizileri ile ActRIIB(L79D 25-131)-hFc üretimi ActRIIB(L79D 25-131)-hFc üretimi için, dogal 79. pozisyonda (SEO lD No:1) bir aspartat sübstitüsyonu içeren ve N terminal ve C terminal budamalarina (SEQ ID NO:1'de 25-131. kalintilar) sahip olan insan ActRIIB ekstraselüler domeni, N terminal olarak dogal ActRIIB lider dizisi yerine bir TPA lider dizisiyle ve C terminal olarak bir minimal baglanti (üç glisin kalintisi) üzerinden bir insan Fc domeniyle kaynastirilmistir (Sekil 5). Bu füzyon proteinini kodlayan bir nükleotit dizisi Sekil 6'da gösterilir (SEQ ID NO:27) ve tam olarak ayni füzyon proteinini kodlayan bir alternatif nükleotit dizisi Sekil 9'da gösterilir (SEQ ID NO:30). Bu protein Örnek 1'de tarif edilen metodolojiyle ifade edilmistir ve saflastirilmistir. Örnek 13. Bir Budanmis ActRIIB Ekstraselüler Domenine Sahip GDF Tuzagi Fareler Eritroid Progenitörlerin Proliferasyonunu Artirir ActRIIB(L7QD 25-131)-hFc, eritroid progenitörlerin proliferasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için degerlendirilmistir. Erkek CS7BL/6 fareleri (8 haftalik) 1 ve 4. Günlerde 70 ActRllB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, s.c.; n = 6) veya araç (TBS; n = 6) ile muamele edilmistir, akabinde 8. Günde dalak, tibia, femur ve kan alimi için ötenaziye tabi tutulmustur.
Dalak ve kemik iligi hücreleri izole edilmistir, %5 fetal sigir serumu içeren lscove'un degistirilmis Dulbecco ortaminda seyreltilmistir, özellestirilmis metilselüloz esasli ortamda süspansiyon haline getirilmistir ve koloni olusturan birim-eritroid (CFU-E) ve patlama olusturan birim-eritroid (BFU-E) asamalarinda klonojenik progenitörler düzeylerini degerlendirmek amaciyla sirasiyla 2 veya 12 gün kültürlenmistir. BFU-E tayini için metilselüloz esasli ortam (MethoCult M3434, Stem Cell Technologies), CFU-E tayinine yönelik metilselüloz ortaminda (MethoCult M3334, Stem Cell Technologies) mevcut olmayan rekombinant murin kök hücre faktörü, interlökin 3 ve interlökin 6 içerir, öte yandan her iki ortam da diger bilesenlerin yani sira eritropoietin içermektedir. Hem BFU-E hem de CFU-E için kolonilerin sayisi, her bir doku numunesinden türetilen iki kopya halindeki kültür plaklarinda belirlenmistir ve sonuçlarin istatistiksel analizi, her uygulama grubundaki fare sayisina dayandirilmistir.
ActRllB(L79D 25-131)-hFc ile muamele edilen farelere ait dalak kökenli kültürlerde CFU-E kolonilerinin sayisi, kontrol farelerine ait karsilik gelen kültürlerin iki katidir (P < 0.05), BFU-E kolonilerinin sayisi ise in vivo uygulama ile anlamli ölçüde degismemistir. Kemik iligi kültürlerine ait CFU-E veya BFU-E kolonilerini sayisi da uygulama ile anlamli ölçüde degismemistir. Beklendigi üzere, kontrollere kiyasla ActRllB(L79D 25-131)-hFc ile muamele edilen farelerde ötenazide dalak kökenli kültürlerde CFU-E kolonilerinin artmis sayisina kirmizi kan hücresi düzeyinde (%116 artis), hemoglobin konsantrasyonunda (%12 artis) ve hematokrit düzeyinde (%116 artis) yüksek düzeyde anlamli (P < 0.001) degisimler eslik etmistir. Bu sonuçlar, budanmis ActRIIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzaginin in vivo uygulamasinin, kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmeye yönelik genel etkisinin bir parçasi olarak eritroid progenitörlerin proliferasyonunu uyarabildigini gösterir. Örnek 14. Bir Budanmis ActRllB Ekstraselüler Domenine Sahip GDF Tuzagi Farelerde Kemoterapi ile Uyarilan Anemiyi Dengeler Basvuru sahipleri, mikrotübül polimerizasyonunu bloke ederek hücre bölünmesini inhibe eden paklitaksel esasli kemoterapi ile uyarilan anemiye yönelik bir fare modelinde ActRllB(L79D 25-131)-hFc'nin eritropoietik parametreler üzerindeki etkisini incelemistir.
Erkek C57BL/6 fareleri (8 haftalik) dört uygulama grubundan birine atanmistir: 1) paklitaksel (25 mg/kg, i.p.) 2) ActRllB(L79D 25-13 1)-hFc (10 mg/kg, i.p.) 3) paklitaksel + ActRllB(L79D 25-131)-hFc 71 4) araç (TBS).
Paklitaksel 0. Günde verilmistir, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc veya araç ise 0 ve 3. Günlerde verilmistir. CBC analizi için 1, 3 ve 5. Günlerde ayri kohortlardan kan numuneleri alinmistir ve 1-3. uygulama gruplari (yukarisi) için sonuçlar, belirli bir zaman noktasinda araca göre fark yüzdesi olarak ifade edilmistir. Paklitaksel toksisitesine bagli yipranma, sadece paklitaksel kohortunda 3. Günde bir sorundur (n = 1; aksi takdirde n = 3-5/uygulama/zaman noktasi).
Araca kiyasla, sadece paklitaksel hemoglobin konsantrasyonunu 5. Günde neredeyse %13 oraninda düsürmüstür, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc ilavesi ise paklitaksel ile uyarilan bu düsüsü engellemistir (Sekil 11). Hematokrit ve RBC düzeyleri için benzer etkiler gözlemlenmistir. Paklitakselin yoklugunda, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 3 ve 5. Günlerde hemoglobin konsantrasyonunu araca kiyasla %10 oraninda yükseltmistir (Sekil 11).
Dolayisiyla, budanmis ActRIIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzagi, kirmizi kan hücrelerinin düzeylerini, kemoterapi ile uyarilan anemiyi dengelemek için yeterli derecede yükseltebilir. Örnek 15. Bir Budanmis ActRllB Ekstraselüler Domenine Sahip GDF Tuzagi Farelerde Nefrektomi ile Uyarilan Anemiyi Tersine Çevirir Basvuru sahipleri, kronik böbrek hastaligina yönelik bir nefrektomize fare modelinde ActRIIB(L79D 25-131)-hFc'nin anemi üzerindeki etkisini incelemistir. Erkek CS7BLIB fareleri (11 haftalik), eritropoietin üretim kapasitesini azaltmak için bir tek tarafli nefrektomiye veya bir sham operasyonuna tabi tutulmustur. Fareler ameliyat sonrasi derlenme için bir hafta dinlendirilmistir ve akabinde toplam 4 hafta boyunca haftada iki kere ActRIIB(L79D 25431)- hFc (10 mg/kg, i.p.; n = 15/durum) veya araç (TBS; n = 15/durum) ile muamele edilmistir.
Doz uygulamasi baslamadan önce ve uygulamadan 4 hafta sonra kan numuneleri alinmistir.
Araç ile muamele edilen nefrektomize fareler ise 4 haftalik uygulama süresi boyunca kirmizi kan hücresi sayisinda anlamli bir düsüs sergilemistir, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc uygulamasi düsüsü engellemistir ve ayrica eritropoietin üretimi için azalmis böbrek kapasitesine ragmen kirmizi kan hücresi düzeylerini baslangica göre %17 (P < 0.001) oraninda artirmistir (Sekil 12). Nefrektomize farelerde, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc ayrica hemoglobin konsantrasyonu ve hematokrit düzeyinde baslangica göre anlamli artislar saglamistir ve sham operasyonlu kosullarda oldugu gibi bu eritropoietik parametrelerin her birini nefrektomize kosullar altinda yaklasik olarak ayni derecede belirgin sekilde uyarmistir (Sekil 13). Dolayisiyla, budanmis ActRlIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzagi, kirmizi kan hücresi düzeylerini, bir kronik böbrek hastaligi modelinde anemiyi tersine çevirmek için yeterli düzeyde yükseltebilir. 72 Örnek 16. Bir Budanmis ActRIIB Ekstraselüler Domenine Sahip GDF Tuzagi Siçanlarda Kan Kaybi ile Uyarilan Anemiden Iyilesmeyi Hizlandirir Basvuru sahipleri, akut kan kaybi ile uyarilan anemiye (akut post-hemorajik anemi) yönelik bir siçan modelinde ActRlIB(L79D 25-131)-hFc'nin eritropoietik parametreler üzerindeki etkisini incelemistir. Erkek Sprague-Dawley siçanlarina (yaklasik olarak 300 g) tedarikçi (Harlan) tarafindan bir kronik juguler kateter takilmistir. -1. Günde her bir siçanda izofluran anestezisi altinda 5 dakikalik bir süre boyunca toplam kan hacminin %20'si kateter üzerinden çekilmistir. Çekilen kan hacmi, vücut agirligi 120 g'den yüksek olan siçanlar için Lee ve emslektaslari (J Nucl Med 25:72-76, 1985) tarafindan türetilen asagidaki iliskiye göre hesaplanan toplam kan hacmi için bir degere dayandirilmistir: Toplam kan hacmi (ml) = 0.062 x vücut agirligi (9) + 0.0012 Kan alimi zamaninda kateter üzerinden ikame olarak esit hacimde fosfat tamponlu salin verilmistir. Siçanlar 0 ve 3. Günlerde ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, s.c.; n = 5) veya araç (TBS; n = 5) ile muamele edilmistir. CBC analizi için -1 (baslangiç), 0, 2, 4 ve 6.
Günlerde kateter üzerinden kan numuneleri alinmistir.
Kontrol siçanlari %20 kan kaybina 0. Günde kirmizi kan hücresi düzeylerinde neredeyse %15'Iik bir düsüs ile yanit vermistir. Bu düzeyler 2 ve 4. Günlerde baslangica göre anlamli ölçüde düsük kalmistir ve 6. Günde tamamen iyilesmemistir (Sekil 14). ActRIIB(L79D 25- 131)-hFc ile muamele edilen siçanlar, %20 kan kaybindan sonra kirmizi kan hücresi düzeylerinde neredeyse özdes bir düsüs sergilemistir, bu siçanlar akabinde bu düzeylerde 2.
Günde tam iyilesme sergilemistir, bunu 4 ve 6. Günlerde artislar takip etmistir, karsilik gelen zaman noktalarinda kontrol düzeylerine göre yüksek düzeyde anlamli bir iyilesme gözlemlenmistir (Sekil 14). Hemoglobin konsantrasyonu için benzer sonuçlar elde edilmistir.
Bu bulgular, budanmis ActRIIB ekstraselüler domenine sahip bir GDF Tuzaginin, kirmizi kan hücresi düzeylerinin akut hemorajiden kaynaklanan anemiden daha hizli bir iyilesme saglayabilecegini gösterir. Örnek 17. Budanmis ActRIIB Ekstraselüler Domenine Sahip GDF Tuzagi Insan Harici Primatlarda Kirmizi Kan Hücresi Düzeylerini Yükseltir Iki GDF Tuzagi, ActRIIB(L79D 20-134)-hFC ve ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, sinomolgus maymununda kirmizi kan hücresi üretimini uyarma becerileri için degerlendirilmistir.
Maymunlara 1 ve 8. Günlerde subkütanöz olarak GDF Tuzagi (10 mg/kg; n = 4 erkek/4 disi) 73 veya araç (n = 2 erkek/2 disi) uygulamasi yapilmistir. 1 (tedavi öncesi baslangiç), 3, 8, 15, 29 ve 44. Günlerde kan numuneleri alinmistir ve kirmizi kan hücresi düzeyleri (Sekil 15), hematokrit (Sekil 16), hemoglobin düzeyleri (Sekil 17) ve retikülosit düzeyleri (Sekil 18) için analiz edilmistir. Araç ile muamele edilen maymunlar, tekrarli kan aliminin beklenen etkisi olarak uygulama sonrasindaki tüm zaman noktalarinda düsük kirmizi kan hücreleri, hematokrit ve hemoglobin düzeyleri sergilemistir. Öte yandan, ActRllB(L7QD 20-134)-hFc veya ActRllB(L79D 25-131)-hFc uygulamasi bu parametreleri uygulama sonrasindaki birinci zaman noktasinda (3. Gün) artirmistir ve çalisma süresince büyük ölçüde yüksek düzeylerde tutmustur (Sekiller 15-17). Önemli oldugu üzere, ActRllB(L79D 20-134)-hFc veya ActRlIB(L79D 25-131)-hFc ile muamele edilen maymunlarin retikülosit düzeyleri 8, 15 ve 29.
Günlerde araca kiyasla büyük ölçüde yükselmistir (Sekil 18). Bu sonuç, GDF Tuzagi uygulamasinin kirmizi kan hücresi öncüllerinin üretimini artirarak yüksek kirmizi kan hücresi düzeyleri sagladigini gösterir.
Birlikte ele alindiginda bu veriler, budanmis GDF Tuzaklarinin ve ayrica tam uzunluklu varyantlarin, kirmizi kan hücresi olusumu in w'vo olarak artirmak için, GDF11'in ve potansiyel olarak alakali Iigandlarin seçici antagonistleri olarak kullanilabilecegini gösterir. Örnek 18. ActRlIB5'ten Türetilen GDF Tuzagi ActRllB transmembran domeni de dahil olmak üzere 4. eksonu farkli bir C terminal dizisi ile ikame edilmis olan bir alternatif çözünür ActRllB formu (ActRlIBö olarak anilir) baskalari tarafindan bildirilmistir (WO2007/053775).
Lider dizi olmadan dogal Insan ActRllBS'inin dizisi su sekildedir: .H'riâ `.;.I.›'~,.›'~.;,5î"_ ?"19 " ."l' ~ ~ (Sl-;Q ID NO: 36) Asagidaki diziye sahip ActRlIBS(L79D) varyantinin yapimi için tarif edildigi üzere dogal 79. pozisyonda (alti çizgili ve vurgulu) bir Iösin -› aspartat sübstitüsyonu veya baska asidik sübstitüsyonlar gerçeklestirilebilir: 74 mm 11) \i.›: 37'.! Bu varyant, asagidaki diziye sahip bir insan ActRIIB5(L79D)-hFc füzyon proteini vermek üzere bir TGGG baglantisi üzerinden insan Fc'sine baglanabilir: iii ii ini i i ii i .."riri'i"°'î:' "" ' »“i “ “ '“1" '" 'r"r'.;" ' ii . i . 'i ._-ii i i i “Pili/'[3' . l ll i I I I iii i ':l.' i i i i i 1 11:?” I_ i i i .'i i .`.'I › ;nm ` . ::-.. ii:- 1:'...:. .- isi-.(311) .\() &bi Bu konstrakt CHO hücrelerinde ifade edilebilir.
Konunun spesifik düzenlemeleri tartisilmistir, ancak yukaridaki tarifname açiklama amacini tasir ve kisitlayici degildir. Bu tarifnameyi ve asagidaki istemleri inceledikten sonra birçok varyasyon ilgili alanin uzmanlarina asikar gelecektir. Bulusun tam kapsami, esdegerlerinin tam kapsami ile birlikte Istemlere ve bu tip varyasyonlar ile birlikte tarifnameye basvurularak belirlenmelidir.
Bu varyant, asagidaki diziye sahip bir insan ActRIIBS(L79D)-hFc füzyon proteini vermek üzere bir TGGG baglantisi üzerinden insan Fc'sine baglanabilir: i i N . ini i i ii i ..'iiri'i'î"=:' “" ' ?i " " “H" '" 'r"r;i' ' ii . i . '1 ._11 i i i *l'H'ir'li' I l 11 i I t 1 iii i ~:i.' . i i i i i i 1.3.?" i_ i i i .il.1.:«.'Ii; _ ;ii.; .; ..-.. liî'. 1.::.. ;. .- isi-_um .\() .hi Bu konstrakt CHO hücrelerinde ifade edilebilir.
REFERANS OLARAK DAHIL ETME Konunun spesifik düzenlemeleri tartisilmistir, ancak yukaridaki tarifname açiklama amacini tasir ve kisitlayici degildir. Bu tarifname ve asagidaki istemler incelendiginde, istemlerin kapsamina giren birçok varyasyon ilgili alanin uzmanlarina asikar gelecektir. Bulusun tam kapsami istemlere basvurularak belirlenmelidir.

Claims (1)

  1. ISTEMLER Ihtiyaci olan bir hastada kirmizi kan hücresi düzeylerini yükseltmeyi amaçlayan bir yöntemde veya bir aneminin tedavisini amaçlayan bir yöntemde kullanilmaya yönelik olarak, SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %90 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisini içeren. SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içeren ve bir hücre esasli analizde miyostatin ve/veya GDF-11 aracili sinyal iletimini inhibe eden bir varyant ActRIIB polipeptididir. istem 1'in kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi bahsedilen varyant ActRIIB polipeptidinin, bunlardan olusan gruptan seçilen bir dizi ile en az %90 oraninda amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO lD NO:1'in 133-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (b) SEQ ID NO:1`in 21-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 118-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (0) SEQ ID NO:1'in 21-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 128-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (d) SEQ lD NO:1'in 21-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 109-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (e) SEQ ID NO:1'in 21-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 118-134. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (f) SEQ ID NO:1'in 21-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO NO:1'in 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 109- 133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (h) SEQ ID NO:1'in 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 118-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (i) SEQ ID NO:1'in 20-29. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 128-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (j) SEQ ID NO:1'in 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 109-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (k) SEQ ID NO:1'in 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 118-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi; (l) SEQ lD NO:1'in 20-24. amino asitlerinin herhangi birinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 128-133. amino asitlerinin herhangi birinde sonlanan bir dizi ve (m) SEQ ID NO:1'in 20. amino asidinden baslayan ve SEO ID NO:1'in 134. amino asidinde sonlanan bir dizi. Istem 2'nin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, (a) SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %95 oraninda özdeslik sergileyen, (b) SEQ ID NO:1'in 25-118. amino asitlerinin dizisi ile en az %95 oraninda özdeslik sergileyen, (o) SEQ ID NO:1'in 25-128. amino asitlerinin dizisi ile en az %95 oraninda özdeslik sergileyen veya (d) SEQ ID NO:1'in 25-131. amino asitlerinin dizisi ile en az Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, bir insan hasta olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, bir böbrek bozuklugu ile iliskili olan, bir kemoterapi tedavisi ile iliskili olan veya kan kaybi sonucunda meydana gelen anemiye sahip olmasidir. Istem 5'in kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi böbrek bozuklugunun, kronik böbrek hastaligi olmasidir. istem 5'in kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi kemoterapi tedavisinin bir taksan olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, kronik böbrek hastaligi veya yetmezligi ile iliskili anemiye sahip olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, akut böbrek hastaligi veya yetmezligi ile iliskili anemiye sahip olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, multipl miyelom ile iliskili anemiye sahip olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, bir miyelodisplastik sendrom ile iliskili anemiye sahip olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi hastanin, bir talasemi ile iliskili anemiye sahip olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi kirmizi kan hücresi düzeylerindeki artisin, kandaki hemoglobin düzeylerinde bir artis olarak ölçülmesidir. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, hastanin iskelet kasi kütlesinde %15'ten küçük bir artisa neden olur. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, bir varyant ActRIIB polipeptit domenine ek olarak, sunlardan olusan gruptan seçilen bir polipeptit kismina sahip bir füzyon proteini olmasidir: bir immünglobülin Fc domeni ve bir serum albümini. Istem 15'in kullanimina yönelik füzyon polipeptit olup, özelligi polipeptidin, ilaveten, bir immünglobülin agir zincirinin bir sabit bölgesini içermesidir. Istem 16'nin kullanimina yönelik füzyon polipeptit olup, özelligi bir immünglobülinin sabit bölgesinin bir Fc domeni olmasidir. Istemler 15 ila 17'den herhangi birinin kullanimina yönelik füzyon polipeptidi olup, özelligi füzyon proteininin bir homodimer olusturmasidir. Istem 18'in kullanimina yönelik füzyon polipeptit olup, özelligi sabit bölgenin, bir lgG agir zincirinden türetilmesidir. Istemler 15 ila 19'dan herhangi birinin kullanimina yönelik füzyon polipeptidi olup, özelligi polipeptidin, ilaveten, bir Gly-Gly-Gly baglanti domenini içermesidir. Istem 15'in veya istem 15'e bagimli olmasi halinde istemler 16-20'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi füzyon proteinin, bunlar arasindan seçilen bir veya daha fazla degistirilmis amino asit kalintisi içermesidir: bir glikozilli amino asit, bir PEG'li amino asit, bir farnezilli amino asit, bir asetilli amino asit, bir biyotinli amino asit, bir Iipit kismi ile konjüge bir amino asit ve bir organik türevlendirici ajan ile konjüge bir amino asit. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerinin dizisine veya SEQ ID NO:1'in 29-109. amino asitlerinin dizisi ile en az %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir ve SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içermesidir. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:7'nin dizisine veya SEQ ID NO:7'nin dizisi ile en az %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir ve SEQ ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içermesidir. Istemler 1-22'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:32'nin dizisine veya SEQ ID NO:32'nin dizisi ile en az %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir ve SEO ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içermesidir. Istemler 1-22'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:37'nin dizisine veya SEQ ID NO:37'nin dizisi ile en az %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir ve SEO ID NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içermesidir. Istemler 1-22'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:38'in dizisine veya SEQ ID NO:38'in dizisi ile en az %95 veya %99 oraninda özdeslik sergileyen bir amino asit dizisine sahiptir ve SEO lD NO:1'in 79. pozisyonuna karsilik gelen pozisyonda glutamik asit veya aspartik asit içermesidir. Istemler 1-22'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:28'in dizisini içermesidir. Istemler 1-22'den herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olup, özelligi polipeptidin, SEQ ID NO:29'un dizisini içermesidir. Önceki istemlerden herhangi birinin kullanimina yönelik polipeptit olupi özelligi polipeptidin, GDF11zAktivin A baglanmasi için, karsilik gelen dogal sus ActRIIB polipeptidinin oranindan daha yüksek bir orana sahip olmasidir. 30. Istemler 1 ila 29'dan herhangi birine göre kullanilmaya yönelik istemler 1 ila 29'dan herhangi birinin bir polipeptidini içeren bir farmasötik preparattir.
TR2019/10890T 2008-08-14 2009-08-13 Anemi tedavisinde kullanılmaya yönelik GDF tuzakları. TR201910890T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18909408P 2008-08-14 2008-08-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201910890T4 true TR201910890T4 (tr) 2019-08-21

Family

ID=41669153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/10890T TR201910890T4 (tr) 2008-08-14 2009-08-13 Anemi tedavisinde kullanılmaya yönelik GDF tuzakları.

Country Status (21)

Country Link
US (10) US8058229B2 (tr)
EP (3) EP3750552B1 (tr)
JP (6) JP5922928B2 (tr)
AU (1) AU2009282441B2 (tr)
CA (1) CA2733911C (tr)
CY (3) CY1121971T1 (tr)
DK (3) DK2340031T3 (tr)
ES (3) ES2808139T3 (tr)
FI (1) FI3750552T3 (tr)
FR (1) FR20C1066I2 (tr)
HR (3) HRP20230761T1 (tr)
HU (4) HUE051137T2 (tr)
LT (4) LT3750552T (tr)
NL (1) NL301082I2 (tr)
NO (1) NO2020045I1 (tr)
PL (3) PL3750552T3 (tr)
PT (3) PT3750552T (tr)
SI (3) SI3494986T1 (tr)
TR (1) TR201910890T4 (tr)
TW (7) TW201919685A (tr)
WO (1) WO2010019261A1 (tr)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2891010C (en) 2004-07-23 2022-09-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
EP1855694B1 (en) 2005-02-09 2020-12-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense composition for treating muscle atrophy
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
KR20140137463A (ko) 2007-02-01 2014-12-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 유방암을 치료 또는 예방하기 위한 이들의 용도
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TWI606062B (zh) 2007-02-09 2017-11-21 艾瑟勒朗法瑪公司 包含ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白的醫藥組合物；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
TWI454479B (zh) 2007-03-06 2014-10-01 Amgen Inc 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
WO2009038745A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
CA2729096C (en) * 2008-06-26 2020-04-28 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HUE051137T2 (hu) 2008-08-14 2021-03-01 Acceleron Pharma Inc GDF-csapdák
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
PE20150680A1 (es) 2008-11-26 2015-05-16 Amgen Inc Variantes de polipeptidos receptores de activina iib y aplicaciones de estos
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
KR20120049214A (ko) 2009-06-08 2012-05-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 발열성 지방세포를 증가시키는 방법
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CN113577291A (zh) * 2009-08-13 2021-11-02 阿塞勒隆制药公司 Gdf捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加红细胞水平
AU2015203400A1 (en) * 2009-08-13 2015-07-16 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
EP3202459B1 (en) * 2009-09-09 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof for treating obesity or type 2 diabetes by regulating body fat content
CA2779472C (en) * 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
RU2012127383A (ru) * 2009-12-02 2014-01-10 Акселерон Фарма Инк. Композиции и способы для увеличения времени полужизни fc-слитых белков в сыворотке
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
EP3266793A1 (en) * 2010-06-21 2018-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for purifying protein using amino acid
WO2012064771A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma, Inc. Actriia binding agents and uses thereof
US8883982B2 (en) * 2011-06-08 2014-11-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
BR122019023174B1 (pt) * 2011-10-17 2021-02-23 Acceleron Pharma, Inc Uso de um polipeptídeo para a fabricação de um medicamento paratratar anemia associada à esplenomegalia
HUE038570T2 (hu) 2011-11-14 2018-10-29 Regeneron Pharma Készítmények és eljárások izomtömeg és izomerõ növelésére GDF8 és/vagy aktivin A specifikus antagonizálásával
CA2859504A1 (en) * 2011-12-19 2013-07-18 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
WO2014030683A1 (ja) * 2012-08-21 2014-02-27 国立大学法人九州大学 貧血患者の貧血の要因を検出するためのバイオマーカー
CN113604550A (zh) * 2012-10-24 2021-11-05 细胞基因公司 用于治疗贫血症的生物标志物
CA2889286A1 (en) * 2012-10-24 2014-05-01 Celgene Corporation Methods for treating anemia
CN104936605A (zh) 2012-11-02 2015-09-23 细胞基因公司 激活素-actrii拮抗剂和用于治疗骨和其它病症的用途
KR20150136061A (ko) 2013-02-01 2015-12-04 산타 마리아 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드 대상에 항-액티빈-a 화합물의 투여
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
US20160046690A1 (en) * 2014-03-21 2016-02-18 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
CA2962197C (en) 2014-04-18 2023-10-03 Ravindra Kumar Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
BR112016029226A2 (pt) 2014-06-13 2017-10-17 Acceleron Pharma Inc métodos e composições para o tratamento de úlceras
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
EP3922259A1 (en) 2014-10-30 2021-12-15 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions using gdf15 polypeptides for increasing red blood cells
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
WO2016090077A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating anemia
WO2016128523A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the responsiveness of a patient affected with malignant hematological disease to chemotherapy treatment and methods of treatment of such disease
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
CN113683709A (zh) 2015-04-06 2021-11-23 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
CN114736307A (zh) 2015-04-06 2022-07-12 阿塞勒隆制药公司 TGF-β超家族I型和II型受体异多聚体及其用途
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
CA2982810A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
EP3286206B1 (en) 2015-04-22 2021-02-17 Biogen MA Inc. Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
KR102640198B1 (ko) * 2015-05-13 2024-02-23 셀진 코포레이션 Actrii 리간드 트랩을 사용한 베타-탈라세미아의 치료
CA2986432A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Celgene Corporation In vitro cell culture methods for beta-thalassemia using activin type ii receptor ligand traps
WO2017062835A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
WO2017079591A2 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
US10550170B2 (en) 2015-11-23 2020-02-04 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating vascular eye disorders with actrii antagonists
WO2018013936A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
KR102359192B1 (ko) 2016-07-25 2022-02-04 세파론, 인코포레이티드 친화성 크로마토그래피 세정 완충액
AU2017302282A1 (en) * 2016-07-27 2019-02-07 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions for treating myelofibrosis
US10934532B2 (en) 2016-10-05 2021-03-02 Acceleron Pharma Inc. ALK4.ActRIIB heteromultimers
US11267865B2 (en) * 2016-10-05 2022-03-08 Acceleron Pharma Inc. Variant ActRIIB proteins and uses thereof
AU2017357944A1 (en) 2016-11-10 2019-06-20 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
JOP20180036A1 (ar) 2017-04-18 2019-01-30 Vifor Int Ag أملاح لمثبطات فروبورتين جديدة
CA3082146A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
CN112292144A (zh) 2018-01-12 2021-01-29 科乐斯疗法公司 激活素受体iib型变体及其使用方法
CN111787981A (zh) 2018-03-01 2020-10-16 瑞泽恩制药公司 改变身体组成的方法
KR20210006952A (ko) * 2018-05-09 2021-01-19 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iia 변이체 및 그의 사용 방법
MX2022009553A (es) * 2020-02-03 2022-11-07 Acceleron Pharma Inc Proteínas actriib variantes y sus usos.
US11945856B2 (en) 2022-01-28 2024-04-02 35Pharma Inc. Activin receptor type IIB variants and uses thereof

Family Cites Families (210)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1265208A (en) 1915-09-07 1918-05-07 Edward C Kahn Liquid-fuel burner.
JPH0637520B2 (ja) 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4973577A (en) 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
AU8761391A (en) * 1990-09-13 1992-04-15 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
JPH06500574A (ja) 1991-05-10 1994-01-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ アクチビン／ＴＧＦ―βスーパーファミリーのレセプターのクローニングおよび組換えによる産生
US5885794A (en) 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US6162896A (en) 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
DK0592562T3 (da) 1991-06-25 1999-08-30 Genetics Inst BMP-9-præparater
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
US6692925B1 (en) 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
WO1994015965A1 (en) 1993-01-12 1994-07-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-3
US5354934A (en) 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
EP0698095B1 (en) 1993-05-12 2004-04-28 Genetics Institute, LLC Bmp-10 compositions
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5831050A (en) 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
AU701623B2 (en) 1993-10-14 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
AU716893B2 (en) 1995-04-11 2000-03-09 General Hospital Corporation, The Reverse two-hybrid systems
US6132988A (en) 1995-10-27 2000-10-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA encoding a neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US6372480B1 (en) * 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
CA2268001A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 G.D. Searle & Co. Circularly permuted erythropoietin receptor agonists
US6017534A (en) * 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6605699B1 (en) 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6696260B1 (en) 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
EP1015468A4 (en) 1997-08-29 2000-09-06 Human Genome Sciences Inc FOLLISTATINE-3
US6953662B2 (en) 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
RU2221809C2 (ru) 1997-10-03 2004-01-20 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ получения природного гуманизированного антитела
US6696411B1 (en) 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
CN1317967A (zh) 1998-09-17 2001-10-17 伊莱利利公司 蛋白质制剂
AU5502799A (en) 1998-09-22 2000-04-10 Long Yu New human growth differentiation factor encoding sequence and polypeptide encoded by such dna sequence and producing method thereof
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
CN1342085A (zh) 1998-10-30 2002-03-27 遗传研究所有限公司 通过p－选择素配体(psgl)拮抗剂抑制细胞素t细胞的分化
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2000043781A2 (en) 1999-01-21 2000-07-27 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
WO2000062809A1 (fr) 1999-04-19 2000-10-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes
US6468543B1 (en) 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
KR20020065517A (ko) 1999-11-12 2002-08-13 맥시겐 홀딩스 리미티드 인터페론 감마 접합체
NZ519546A (en) 1999-12-15 2005-07-29 Res Dev Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
HU230874B1 (hu) 2000-05-15 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
EP1303605A2 (en) 2000-07-19 2003-04-23 Eli Lilly And Company Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
US7048949B2 (en) 2000-11-20 2006-05-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Membrane scaffold proteins
AU2002236558A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Regents Of The University Of California Method and composition for modulating bone growth
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
WO2002074340A1 (fr) 2001-03-16 2002-09-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de fabrication d'une preparation a liberation continue
IL158920A0 (en) 2001-05-24 2004-05-12 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin fusion proteins
AU2001286171B2 (en) 2001-05-25 2008-01-10 Serono Genetics Institute S.A. Human CDNAs and proteins and uses thereof
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
US6855344B2 (en) 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
CN102912016A (zh) 2001-07-17 2013-02-06 帝人株式会社 通过测定PPARδ激活作用筛选物质的方法和药剂
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
CA2467689C (en) 2001-12-06 2013-10-01 Fibrogen, Inc. Stabilization of hypoxia inducible factor (hif) alpha using inhibitors of hif prolyl hydroxylase
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US6998118B2 (en) 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
AU2003216250A1 (en) 2002-02-11 2003-09-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
KR20040094709A (ko) 2002-02-21 2004-11-10 와이어쓰 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
AU2003232485A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
CA2497304A1 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Bmp-2 estrogen responsive element and methods of using the same
ZA200503024B (en) 2002-10-15 2006-11-29 Celgene Corp Selective cytokine inhibitory drugs for treating myelodysplastic syndrome
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
KR101120775B1 (ko) 2003-02-07 2012-04-18 프로메틱 바이오사이언시즈 인코포레이티드 적혈구생성의 자극제로서의 중쇄 지방산, 글리세리드 및유사체
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
GB0304424D0 (en) 2003-02-26 2003-04-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compounds
US20040197828A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Gaddy Dana P. Method for diagnosis and treatment of bone turnover
US20070184052A1 (en) 2003-05-09 2007-08-09 Lin Herbert Y Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins
CA2526669A1 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
EP1636270B1 (en) 2003-06-16 2016-07-20 UCB Pharma S.A. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
EP1706428B1 (en) 2004-01-22 2009-09-23 MERCK PATENT GmbH Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US20050197292A1 (en) 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
JP2007530055A (ja) 2004-03-26 2007-11-01 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド Ｂｍｐ−３プロペプチドおよび関連する方法
CA2561809A1 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
US7465706B2 (en) 2004-06-24 2008-12-16 Acceleron Pharma Inc. GDF3 propeptides and related methods
CA2891010C (en) 2004-07-23 2022-09-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
EP1789391B1 (en) 2004-07-23 2017-06-28 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
EP1794191B1 (en) 2004-08-05 2016-05-18 The Regents of The University of California Molecules with effects on cellular development and function
US7095608B2 (en) 2004-08-12 2006-08-22 Audiovox Corporation Video display mounting system and method
EP1778275A2 (en) 2004-08-12 2007-05-02 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors
CA2581896C (en) 2004-09-29 2015-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
JP2008522621A (ja) 2004-12-09 2008-07-03 ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション 世界的に流行するトリインフルエンザに対して迅速に応答するためのワクチン
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
EP1858541B1 (en) 2005-02-16 2012-07-25 The General Hospital Corporation Use of bmp antagonists to regulate hepcidin-mediated iron metabolism and treat iron deficiency
KR20080003929A (ko) 2005-04-26 2008-01-08 아지노모토 가부시키가이샤 골수 적혈구 전구 세포 분화 촉진제
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
WO2007038703A2 (en) 2005-09-28 2007-04-05 Zymogenetics, Inc Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US8106176B2 (en) 2005-10-07 2012-01-31 Instituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti SpA Matrix metalloproteinase 11 vaccine
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA2856436A1 (en) 2005-12-06 2007-06-14 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
US7799787B2 (en) 2005-12-20 2010-09-21 Merck Frosst Canada Ltd. Heteroaromatic compounds as inhibitors of stearoyl-coenzyme a delta-9 desaturase
US20070161578A1 (en) 2005-12-21 2007-07-12 Hwa Joyce J Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and/or H3 receptor antagonist/inverse agonist
WO2007076127A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Biogen Idec Ma Inc Condensed imidazoles or pyrazoles and their use as transforming growth factor modulators
JP4925364B2 (ja) 2006-01-20 2012-04-25 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 鉄欠乏を検出する方法
JP2009531280A (ja) 2006-01-25 2009-09-03 ウェルスタット セラピューティクス コーポレイション 代謝障害を処置するための化合物
NZ570100A (en) 2006-02-28 2011-01-28 Wellstat Therapeutics Corp Compounds for the treatment of metabolic disorders
WO2007120767A2 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Amgen Inc. Agonist erythropoietin receptor antibodies
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
US20080075692A1 (en) 2006-05-09 2008-03-27 Perrine Susan P Methods for treating blood disorders
KR101553719B1 (ko) 2006-07-21 2015-09-16 린 래보러토리즈 칼슘 아세테이트의 액체 조성물
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
US20100003190A1 (en) 2006-12-08 2010-01-07 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephropathy (RCN)
JP5632582B2 (ja) 2006-12-14 2014-11-26 中外製薬株式会社 抗Ｃｌａｕｄｉｎ３モノクローナル抗体およびそれを用いる癌の治療および診断
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US7988973B2 (en) 2006-12-18 2011-08-02 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
KR20140137463A (ko) 2007-02-01 2014-12-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 유방암을 치료 또는 예방하기 위한 이들의 용도
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TWI606062B (zh) 2007-02-09 2017-11-21 艾瑟勒朗法瑪公司 包含ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白的醫藥組合物；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
TWI454479B (zh) 2007-03-06 2014-10-01 Amgen Inc 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
US20090017019A1 (en) 2007-06-01 2009-01-15 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
PE20090510A1 (es) 2007-08-03 2009-05-22 Summit Corp Plc Combinaciones de drogas para el tratamiento de la distrofia muscular de duchenne
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
US20100279409A1 (en) 2007-09-13 2010-11-04 Neil Robson Method for modifying celluar immune resonse by modulating activin activity
WO2009038745A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
JP5583591B2 (ja) 2007-11-21 2014-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｗｉｓｅ結合抗体及びエピトープ
WO2009114180A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 The General Hospital Corporation Inhibitors of the bmp signaling pathway
WO2009137075A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
CN102083969A (zh) 2008-05-06 2011-06-01 乔斯林糖尿病中心股份有限公司 诱导褐色脂肪形成的方法和组合物
CA2729096C (en) 2008-06-26 2020-04-28 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
ES2791699T3 (es) * 2008-06-26 2020-11-05 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de activina-ActRIIA soluble y usos para incrementar los niveles de glóbulos rojos
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
HUE051137T2 (hu) 2008-08-14 2021-03-01 Acceleron Pharma Inc GDF-csapdák
WO2010059861A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
PE20150680A1 (es) 2008-11-26 2015-05-16 Amgen Inc Variantes de polipeptidos receptores de activina iib y aplicaciones de estos
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
HUE035240T2 (hu) 2009-04-27 2018-05-02 Novartis Ag Készítmények és eljárások az izomerõ növelésére
KR20120049214A (ko) 2009-06-08 2012-05-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 발열성 지방세포를 증가시키는 방법
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CN113577291A (zh) 2009-08-13 2021-11-02 阿塞勒隆制药公司 Gdf捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加红细胞水平
EP3202459B1 (en) 2009-09-09 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof for treating obesity or type 2 diabetes by regulating body fat content
CA2779472C (en) 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
US9595813B2 (en) 2011-01-24 2017-03-14 Soraa Laser Diode, Inc. Laser package having multiple emitters configured on a substrate member
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
SI2726099T1 (sl) 2011-07-01 2018-11-30 Novartis Ag Postopek za zdravljenje metaboličnih motenj
BR122019023174B1 (pt) 2011-10-17 2021-02-23 Acceleron Pharma, Inc Uso de um polipeptídeo para a fabricação de um medicamento paratratar anemia associada à esplenomegalia
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
US20140303068A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Paranta Biosciences Limited Method of treating mucus hypersecretion
CA2859504A1 (en) 2011-12-19 2013-07-18 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
EP3521310A1 (en) 2012-06-14 2019-08-07 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (bmp) signaling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
EP2868667B1 (en) 2012-07-02 2019-01-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Therapeutic agent for anemia including renal anemia and cancer-induced anemia which contains anti-bmp9 antibody as active ingredient
CN113604550A (zh) 2012-10-24 2021-11-05 细胞基因公司 用于治疗贫血症的生物标志物
CA2889286A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Celgene Corporation Methods for treating anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
CN104936605A (zh) 2012-11-02 2015-09-23 细胞基因公司 激活素-actrii拮抗剂和用于治疗骨和其它病症的用途
JP6487848B2 (ja) 2012-11-08 2019-03-20 クリアサイド バイオメディカル，インコーポレイテッド ヒト被験体における眼部障害の処置のための方法およびデバイス
US20150328249A1 (en) 2012-12-11 2015-11-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin strategies and/or ppar gamma ligands, alone or in combination with stem cells, for the therapy of critical limb ischemia and other ischemic processes affecting the skeletal muscle
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
ES2692363T3 (es) 2013-03-14 2018-12-03 Translate Bio, Inc. Composiciones terapéuticas de ARNm y su uso para tratar enfermedades y trastornos
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
TW201536318A (zh) 2013-08-14 2015-10-01 Novartis Ag 治療偶發性包涵體肌炎之方法
EP3084000A4 (en) 2013-12-16 2017-09-20 Paranta Biosciences Limited Method of diagnosis and treatment
EP3094751A4 (en) 2014-01-14 2017-06-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
US20170248609A1 (en) 2014-01-27 2017-08-31 Novartis Ag Biomarkers predictive of muscle atrophy, method and use
JP6601687B2 (ja) 2014-03-31 2019-11-06 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
CA2962197C (en) 2014-04-18 2023-10-03 Ravindra Kumar Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
JP2017519009A (ja) 2014-06-13 2017-07-13 サンタ マリア バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 製剤化された受容体ポリペプチドおよび関連する方法
BR112016029226A2 (pt) 2014-06-13 2017-10-17 Acceleron Pharma Inc métodos e composições para o tratamento de úlceras
KR102640198B1 (ko) 2015-05-13 2024-02-23 셀진 코포레이션 Actrii 리간드 트랩을 사용한 베타-탈라세미아의 치료

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009282441B2 (en) 2015-01-22
US10377996B2 (en) 2019-08-13
US9505813B2 (en) 2016-11-29
JP6968917B2 (ja) 2021-11-17
CY2020043I1 (el) 2021-03-12
TW201919685A (zh) 2019-06-01
JP2020055883A (ja) 2020-04-09
NL301082I2 (nl) 2021-02-03
TW202135851A (zh) 2021-10-01
EP3494986B1 (en) 2020-06-03
HUS2000054I1 (hu) 2021-01-28
JP6649432B2 (ja) 2020-02-19
US20220098559A1 (en) 2022-03-31
JP2022009561A (ja) 2022-01-14
TWI617316B (zh) 2018-03-11
US20200199547A1 (en) 2020-06-25
HRP20201185T1 (hr) 2020-12-11
JP2014224154A (ja) 2014-12-04
US8361957B2 (en) 2013-01-29
TWI748373B (zh) 2021-12-01
EP2340031A4 (en) 2013-01-09
CA2733911C (en) 2019-09-03
ES2949049T3 (es) 2023-09-25
HUE063136T2 (hu) 2023-12-28
EP2340031A1 (en) 2011-07-06
JP7329573B2 (ja) 2023-08-18
US11162085B2 (en) 2021-11-02
DK3494986T3 (da) 2020-08-03
CA2733911A1 (en) 2010-02-18
EP3494986A1 (en) 2019-06-12
EP3750552B1 (en) 2023-05-10
ES2808139T3 (es) 2021-02-25
SI2340031T1 (sl) 2019-09-30
US20170204382A1 (en) 2017-07-20
HRP20230761T1 (hr) 2023-10-13
NL301082I1 (tr) 2020-12-23
TW201513879A (zh) 2015-04-16
EP3750552A1 (en) 2020-12-16
PT3494986T (pt) 2020-07-14
US20200199546A1 (en) 2020-06-25
CY1121971T1 (el) 2020-10-14
PL3494986T3 (pl) 2020-11-16
TW202023602A (zh) 2020-07-01
TWI784538B (zh) 2022-11-21
NO2020045I1 (no) 2020-12-17
SI3494986T1 (sl) 2020-10-30
WO2010019261A1 (en) 2010-02-18
JP2018130126A (ja) 2018-08-23
EP2340031B1 (en) 2019-04-24
JP2017019860A (ja) 2017-01-26
TWI472336B (zh) 2015-02-11
CY1123217T1 (el) 2020-11-25
PL2340031T3 (pl) 2019-10-31
PT3750552T (pt) 2023-06-28
LT3494986T (lt) 2020-07-10
TW201803586A (zh) 2018-02-01
US11155791B2 (en) 2021-10-26
PL2340031T4 (pl) 2020-12-28
PL3750552T3 (pl) 2023-11-06
TW201006487A (en) 2010-02-16
TW201618807A (zh) 2016-06-01
LT2340031T (lt) 2019-08-12
HRP20191109T1 (hr) 2019-09-20
JP2011530599A (ja) 2011-12-22
SI3750552T1 (sl) 2023-10-30
FR20C1066I2 (fr) 2023-03-24
US20200199548A1 (en) 2020-06-25
HUE051137T2 (hu) 2021-03-01
DK2340031T3 (da) 2019-07-15
LTC2340031I2 (lt) 2022-06-27
FR20C1066I1 (fr) 2021-03-05
FI3750552T3 (fi) 2023-07-25
US20100068215A1 (en) 2010-03-18
CY2020043I2 (el) 2021-03-12
JP5922928B2 (ja) 2016-05-24
US20120015877A1 (en) 2012-01-19
US20130244324A1 (en) 2013-09-19
DK3750552T3 (da) 2023-07-24
LT3750552T (lt) 2023-06-26
US11168311B2 (en) 2021-11-09
AU2009282441A1 (en) 2010-02-18
ES2738543T3 (es) 2020-01-23
US8058229B2 (en) 2011-11-15
US20200208124A1 (en) 2020-07-02
PT2340031T (pt) 2019-07-25
US20200165583A1 (en) 2020-05-28
TWI626945B (zh) 2018-06-21
HUE045456T2 (hu) 2019-12-30
LTPA2020006I1 (lt) 2021-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7329573B2 (ja) 赤血球レベルを高めるためのｇｄｆトラップの使用
JP6860533B2 (ja) 赤血球レベルを増大させるための、ｇｄｆトラップとエリスロポエチン受容体活性化因子とを組み合わせた使用
EP2797620B1 (en) Compositions for treating iron overload in thalassemia
EP2303917B1 (en) Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
AU2015202035B2 (en) Use of GDF traps to increase red blood cell levels