Tarifname de ve istemlerde kullanildigi sekliyle, baglain açikça baska türlü dikte etmedigi sürece, "bir"in tekili, çogul referanslari kapsar. Örnegin, "bir hücre" terimi, hücrelerin karisimlari dahil, birçok hücreyi kapsar. Benzer sekilde, ilaçlarin burada tarif edildigi gibi hazirlanmasinda tedaviye yönelik "bir bilesigin" kullanimi, baglam açikça baska türlü dikte etmedigi sürece, bu tedavi veya hazirlama için bir veya birden çok bilesigin kullanimini gerektirir. Burada kullanildigi sekliyle, "içeren" teriminin, bilesimlerin ve usullerin, atifta bulunulan elemanlari içerdigi, ancak baskalarini dislamadigi anlamini belirtmesi amaçlamistir Dolayisiyla, esasen burada tanimlanan elemanlardan olusan bir bilesim, ayirma ve saflastirma usulünden iz kontaminantlari ve fosfat tainponlu tuzlu su çözeltisi, koruyucu maddeler gibi farmasötik olarak uygun tasiyici maddeleri dislamayacaktir. "Olusan" terimi, bulusun bilesimini uygulamak için, diger bilesenlerin iz elementlerinden ve önemli usul asamalarindan fazlasinin hariç tutulmasi anlamina gelir. Geçis terimlerinden her biri tarafindan tanimlanan düzenlemeler, bu bulusun kapsami içindedir. düz veya dallanmis hidrokarbon zincir radikaline atifta bulunur. Farkli sekilde belirtilmedigi sürece "alkil" terimi, bir ila sekiz karbon atomuna (örnegin, bir ila alti karbon atomuna veya bir ila dört karbon atomuna) sahip olan ve molekülün geri kalanina tek bir bag ile bagli olan bir gruba atifta bulunur. Alkil gruplarinin örnekleri, metil, etil, n- propil, i-propil, n-bütil, t-bütil, s-bütil, n-pentil ve s-pentili içerir. olabilen bir alifatik hidrokarbon grubuna atifta bulunur. Farkli sekilde belirtilmedigi sürece propenil, 2-propenil (alil), iso-propenil, 2-metil-l-propenil, l- bütenil ve 2-bütenile atifta hidrokarbil radikaline atifta bulunur. Farkli sekilde belirtilmedigi sürece "alkinil" terimi, 2 ila yaklasik 12 arasinda karbon atomuna (örnegin, 2 ila 10 karbon atomuna) sahip bir gruba, örnegin etinil, propinil ve bütinile atifta bulunur. karbon atomuna sahip aromatik olmayan, mono veya multisiklik bir halka sistemini belirtir. aralikta karbon atomu içeren radikali içeren bir siklik halkaya atifta bulunur; alkil grubu ana yapiya, alkil grubundaki herhangi bir karbonda baglanir; bunun sonucunda, siklopropilinetil, siklobütiletil ve siklopentiletil gibi stabil bir yapi olusur. atomuna sahip bir mono- veya multi-siklik aromatik radikale atifta bulunur. tanimlanan gibi bir aril grubuna atifta bulunur; örnegin -CH2C6H5, ve -C2H5C6H5. az bir heteroatomdan olusan aromatik olmayan 3 ila 15 elemanli bir halka radikale atifta bulunur. Heterosiklik halka radikali, kaynasmis, köprülü veya spiro halka sistemlerini içerebilen bir m0no-, bi-, tri- veya tatrasiklik halka sistemi olabilir ve heterosiklik halka radikalindeki azot, fosfor, karbon, oksijen veya kükürt atomlari, istege bagli olarak farkli oksidasyon durumlarina oksitlenebilir. Buna ek olarak, azot atomu istege bagli olarak kuaternize edilebilir. yukarida tanimlanan gibi bir heterosiklil grubuna atifta bulunur. heteroatoma sahip, istege bagli olarak sübstitüe edilmis 5-14 elemanli bir aromatik halkaya atifta bulunur. Heteroaril, bir mono-, bi- veya trisiklik halka sistemi olabilir. Bu gibi heteroaril halka radikallerinin örnekleri, oksazolil, tiazolil imidazolil, pirolil, furanil, piridinil, piriinidinil, pirazinil, benzoûiranil, indolil, benzotiazolil, benzoksazolil, karbazolil, kinolil ve izokinolili içerir. yukarida tanimlanan gibi bir aril grubuna atifta bulunur; örnegin -CH2C6H4N ve - C2H5C6H4N. zincirine (R) atifta bulunur. Örnegin, inetilin yan zinciri alanindir, glisinin yan zinciri hidrojendir, valinin yan zinciri izo-propildir ve triptofanin yan zinciri (lH-indol-3- il)metildir. Bu bulusun bilesiklerindeki uygun amino asit yan zincirleri, proteinojenik amino asitler dahil, dogal amino asitlerin yan Zincirlerini kapsar. Dogal ainino asitlerin sinirlayici olamayan örnekleri, standart amino asitleri veya proteinojenik amino asitleri10 içerir; bunlar alanin, arginin, asparagin, aspartik asit, sistein, glutamik asit, glutamin, glisin, histidin, izolösin, lösin, lisin, metiyonin, fenilalanin, prolin, pirolisin, selenosistein, serin, treonin, triptofan, tirosin ve valini içerir. herhangi biri veya herhangi bir kombinasyonu ile sübstitüsyona atifta bulunur: hidrojen, hidroksi, halojen, karboksil, siyano, nitro, okso (:0), tio (=S), alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, sikloalkil, sikloalkenil, aril, heterosiklil, heteroaril, -COORX, - RXC(O)RX, -RXOC(O)Ry, -SRX, -SORX, -SOzRx, ve -ON02; burada yukaridaki gruplardan herhangi birindeki RX, Ry ve R2, hidrojen atomu, alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, sikloalkil, sikloalkenil, amino, aril, heteroaril, heterosiklil olabilir veya RX, Ry ve Rz'den herhangi ikisi, istege bagli olarak ayni veya farkli olabilen ve O, NH veya S'den seçilen heteroatomlar içerebilen, doymus veya doymamis 3-10 elemanli bir halkayi olusturmak üzere birlestirilebilir. Bir düzenlemede, sübstitüe edilmis terimi, bir veya birden çok halojen (örnegin, tlor) ile sübstitüsyona atifta bulunur. memeliye atifta bulunur. Tercihen, hasta bir insandir. uygulandiginda, hastaligin bu tedavisini etkilemeye yetecek miktara atifta bulunur. kalan bir süjede veya hastada, hastaligin engellenmesini (örnegin, patolojinin ve/veya semptomatolojinin daha da gelismesinin durdurulmasini), (2) bir hastaligin patolojisine veya semptomatolojisine maruz kalan bir süjede veya hastada, hastaligin iyiye gitmesini (örnegin, patolojinin ve/veya semptomatolojinin gerilemesini) (3) bir hastaligin patolojisine veya semptomatolojisine maruz kalan bir süjede veya hastada, hastalikta ölçülebilir herhangi bir azalmanin gerçeklesmesini içerir. Farmasötik F ormülasvonlar ve Uygulama Yollari Bu bulusun bilesikleri, agizdan ve enjeksiyon vasitasiyla (örnegin deri altindan, intravenöz ve intraperitoneal olarak) dahil, çesitli yollarla verilebilir. Bilesikler agizdan, bir kati veya sivi dozaj formunda verilebilir. Her ikisinde bilesik, onu etkisiz hale getirebilecek asitlerin etkisinden ve baska dogal kosullardan korumak için bir malzeme ile kaplanabilir. Bilesikler, sulu çözeltiler, sivi dagilimlar, (hazmedilebilir) tabletler, agiz içi tabletler, troslar, kapsüller, eliksirler, süspansiyonlar, suruplar ve yassi haplar olarak formüle edilebilir. Oral dozaj formlari, baglayici maddeler, parçalayici maddeler, tat verici maddeler, antioksidanlar ve koruyucu maddeler gibi teknikte bilinen eksipiyanlari içerebilir. Sivi dozaj formlari, tuzlu su çözeltisi veya bir sulu tampon gibi seyreltici maddeler içerebilir. Bilesikler ayrica, enjeksiyon vasitasiyla uygulanabilir. Enjeksiyon için uygun formülasyonlar, (suda çözünür oldugu durumda) steril sulu çözeltileri veya dagilimlari ve steril enjektabl çözeltilerin veya dagilimlarin aninda hazirlanmasi için steril tozlari içerebilir. Bilesim, steril olabilir ve siringa ile kolayca uygulanabilirligin mevcut oldugu ölçüde akiskan olmalidir. Imalat ve depolama kosullari altinda stabil olabilir ve bakteriler ve mantarlar gibi mikroorganizmalarin kontamine edici etkisine karsi korunmus olmalidir. Tasiyici madde, örnegin su, etanol, poliol (örnegin gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol) ve bunlarin uygun karisimlarini içeren bir çözücü madde veya dagilim ortami olabilir. Dogru akiskanlik, örnegin lesitin gibi bir kaplamanin kullaniini vasitasiyla, dagilim durumunda gerekli partikül boyutunun korunmasi vasitasiyla ve yüzey aktif maddelerin kullanimi vasitasiyla korunabilir. Mikroorganizmalarin etkisinin önlenmesi, çesitli antibakteriyel ve antiûingal maddeler, örnegin parabenler, klorobütanol, fenol ve askorbik asit vasitasiyla elde edilebilir. Birçok durumda, bilesime izotonik maddelerin, örnegin sekerlerin, sodyum klorürün veya manitol ve sorbitol gibi polialkollerin dahil edilmesi tercih edilecektir. Enjektabl bilesimlerin uzatilmis emilisi, bilesime emisi geciktiren bir maddenin, örnegin alüminyum monostearatin veya jelatinin dahil edilmesiyle gerçeklestirilebilir. Steril enjektabl çözeltiler, terapötik bilesigin gerektiginde, yukarida belirtilen bilesenlerden biri veya bunlarin bir kombinasyonu ile birlikte uygun bir çözücü madde içine gereken miktarda katilmasi, ardindan filtrasyonlu sterilizasyon ile hazirlanabilir. Genellikle dagilimlar, terapötik bilesigin, temel bir dagilim ortamini ve yukarida belirtilen gerekli olan baska bilesenleri içeren bir steril tasiyici maddenin içine katilmasi vasitasiyla hazirlanir. Steril enjektabl çözeltilerin hazirlanmasina yönelik steril tozlar durumunda hazirlama usulleri, aktif bilesenin (yani terapötik bilesigin) arti daha önceden steril olarak filtrelenmis çözeltiden istenen ek herhangi bir bilesenin bir tozunu veren vakumlu kurutmayi ve dondurarak kurutmayi içerir. Bir hastaya uygulanan bilesigin gerçek dozaj miktari, yas, cinsiyet, vücut agirligi, hastaligin siddeti, tedavi edilecek hastaligin tipi, önceki veya es zamanli terapötik müdahaleler, hastanin idyopatisi ve uygulama yolu gibi fiziksel ve fizyolojik faktörler vasitasiyla belirlenebilir. Bu faktörler, teknikte uzman bir kisi tarafindan belirlenebilir. Uygulamadan sorumlu pratisyen doktor, bilesimdeki aktif bilesenin (bilesenlerin) konsantrasyonunu ve tekil hasta için uygun dozu (dozlari) tipik olarak belirleyecektir. Bir düzenlemede, bir insan hastaya yaklasik 0,0] mg/kg ila yaklasik 100 mg/kg'lik günlük dozlar verilmektedir. Bilesiklerin tek veya birden fazla dozlari düsünülmüstür. Birden çok dozun verilmesi için istenen zaman araliklari, teknikte siradan uzmanlik sahibi kisi tarafindan sadece rutin testler kullanilarak belirlenebilir. Örnek olarak, hastalara yaklasik 12 saat ara ile günlük iki doz verilebilir. Bazi düzenlemelerde, bilesik günde bir kez verilir. Bilesikler, bir rutin programa göre verilebilir. Burada kullanildigi sekliyle, rutin program, önceden belirlenmis bir zaman periyoduna atifta bulunur. Rutin program, önceden belirlenmis oldugu sürece, ayni olan veya uzunlugu farkli olan zaman periyodlarini kapsayabilir. Örnegin, rutin program, günden iki kez, her gün, iki günde bir, üç günde bir, dört günde bir, bes günde bir, alti günde bir, haftalik bazda, aylik bazda veya arada kalan belirlenmis herhangi bir gün veya hafta sayisi bazinda verilmesini içerebilir. Alternatifli olarak, önceden belirlenmis rutin program, birinci hafta boyunca günde iki kez bazinda, ardindan birkaç ay boyunca günlük bazda verilmesini içerebilir. Baska düzenlemelerde bulus, maddenin (maddelerin) agizdan alinabilmesini ve zamanlamasinin gida alimina bagimli olmamasini öngörür. Dolayisiyla, örnegin madde, hastanin ne zaman yedigini veya yiyecegini dikkate almadan, her sabah ve/Veya her aksam alinabilir. Kombine tedavi Bilesikler, monoterapi olarak kullanimlarina ek olarak, kombine terapilerde de kullanim alani bulurlar. Etkili kombine tedavi, her iki maddeyi içeren tek bir bilesim veya farmakolojik formülasyonla veya ayni anda uygulanan iki farkli bilesim veya formülasyonla gerçeklestirilebilir; burada bir bilesim bu bulusun bir bilesigini ve digeri ikinci maddeyi (maddeleri) içerir. Alternatifli olarak terapi, dakikalar ila aylar arasinda degisen araliklarla, diger madde tedavisinden önce veya sonra uygulanabilir. Ek madde veya maddeler, bir nörolojik hastaligi tedavi etmek için yararli herhangi bir madde veya maddelerden, örnegin pantotenat kinaz, 4'-fosf0pant0tenat veya Koenzim A eksikligini tedavi etmek için yararli herhangi bir madde veya maddelerden seçilebilir. Bir düzenlemede, ek madde veya maddeler, bilissel fonksiyonun gelistirilmesinde yararlidir: örnek olarak, fizostigmin, neostigmin, piridostigmin, ambenonyum, demarkaryum, rivastigmin, galantamin, donezepil ve bunlarin kombinasyonlari gibi bir asetilkolinesteraz inhibitörü sayilabilir. Baska bir düzenlemede, ek madde veya maddeler, deferipron, deferoksamin, deferasiroks gibi bir demir selatlastirici madde ve bunlarin kombinasyonlaridir. Fosfopantotenat Türevlerinin Sentezi Bu bulusun bilesikleri, kolaylikla elde edilebilen pantotenik asitten (vitamin B5) Patentlerinde açiklanmistir. G formüllü bilesik asagidaki sekilde hazirlanabilir: (a) pantotenik asidin her iki hidroksil grubunun korunmasi; (b) korunmus pantotenik asidin asit molekül parçasinin, asagidaki formüle sahip bir bilesigi olusturmak üzere esterlestirilmesi: burada Pg, bagimsiz olarak bir koruyucu grubu belirtir ve R", G formülüne iliskin olarak yukaridaki gibi tanimlanmistir; (c) hidroksil gruplarinin korumasinin kaldirilmasi; (d) korumasi kaldirilan bilesigin, asagidaki formüle sahip bir bilesikle fosforlanmasi: burada L, bir ayrilan gruptur (örnegin, halojen) ve R ve R', G formülüne iliskin olarak yukaridaki gibi tanimlanmistir ve (e) istege bagli olarak, ((1) asamasinda olusan bilesigin bir tuzunun olusturulmasi. Bu reaksiyon semasi asagida gösterilmistir (burada L, CI'dir): *Yi/`f 'knm ' "www, Koruma asamasi (a), pantotenik asit, uygun asetali vermek üzere benzaldehit ve çinko (Not: son asamadaki Rl hidrojen olabilir) klorürle islenerek gerçeklestirilebilir (T. W. Green ve P. G. M. Wuts, Protective Groups in asit ayrica, uygun asidi vermek üzere aseton ve tolüen sülfonik asitle islem görmesi vasitasiyla korunabilir (M. Carmack ve C. J. Kelley, "Synthesis ofoptically active bir örnekte, pantotenik asit, di-O-benzillenmis pantotenik asidi vermek üzere sodyum hidrürle, ardindan benzil bromürle islem görür (T. W. Green ve digerleri, supra). Hidroksil gruplarinin korumasinin kaldirilmasindan sonra, bir esterin (R") olusmasi, örnegin, korumasi kaldirilan pantotenik asidin, uygun bir alkol ve disikloheksildikarbodimid (DCC) veya dietilazodikarboksilat (DEAD) ve trifenilfosfinle reaksiyona girmesi vasitasiyla gerçeklestirilebilir (bir Mitsunobu reaksiyonu). Alternatifli olarak, korunmus pantotenik asit, (örnegin, tiyonil klorür veya oksalil klorürle) uygun asit klorüre dönüstürülebilir, ardindan uygun alkolle islem görebilir. Korumanin kaldirilmasi, T. W. Green ve digerleri, supra'da açiklanan gibi, teknikte bilinen herhangi bir usulle gerçeklestirilebilir. Asama (a) ila (c)'ye alternatif olarak pantotenik asit, R"OH formüllü bir alkolle, örnegin pantotenik asit Fischer esterifikasyon kosullarina (yani, alkol fazlasi ve geriye akis altinda katalitik asit) tabi tutularak esterlestirilebilir. Asama (c)'de olusan bilesigin birincil hidroksil grubu, seçici sekilde fosforlanabilir. (Bakiniz J. D. Patrone, J. Yao, N. E. Scott, ve G. D. Dotson, "Selective Inhibitors of Bacterial Phosphopantothenoylcysteine Synthetase", J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, Procedure for the Synthesis ofNucleoside Phosphoramidates", Organic Process Research Bu usul, fosforilasyon reaktif maddesini hazirlamak için bir usulle birlikte, asagida gösterilmistir. Istege bagli olarak, nihai ürünün veya asamalar arasinda, ara ürünlerden birine kiral separasyonu uygulanarak, optik olarak saf bir ürün elde edilebilir. Alternatif olarak, bu bulusun bilesikleri, B. S. Ross, F. G. Reddy, H.-R. Zhang, S. Rachakonda, ve M, J. Sofia, "Synthesis of Diastereomerically Pure Nucleotide Bu yolla, bir nihai kiral separasyon asamasi uygulanmadan, optik olarak saf bir ürün elde edilebilir. Örnekler Referans Örnek 1 Etil-3-((2R)-4-(((((S)-1-etoksi-1-oksopropan-2-il)amino)(fenoksi) fosforil)0ksi)-2- hidroksi-3,3-dimetilbütanamid0)propan0atin sentezi L-Alanin etil ester hidroklorür (0,50 g, 3,25 mmol), 10 mL CHQCIg'dC süspansiyon haline getirilmis ve -10°C'ta ve azot atmosferi altinda, fenil fosforodikloridat (0,50 mL, 3,35 mmol) ile islem görmüstür. Iyi karistirilan karisim daha sonra, N-metilimidazol ( ile damla damla islem görmüstür. 1 saat sonra ve yine -10 °C'ta, 3 mL CH2C12'ye etil pantotenat (0,70 g, 2,8 mmol) yavas yavas ilave edilmistir. Bu karisimin oda sicakligina isinmasina izin verilmis ve 3 saat sonra, 2 mL metanol ilave edilmistir. Ekstraksiyon ardisik olarak, 1 M HCl, su, % 5 NaHCO3 ve tuzlu su ile gerçeklestirilmistir. Organik faz kurutulmus (Na2SO4) ve çözücü madde, 1,11 g berrak, renksiz bir surup vererek buharlasmistir. Bu malzeme, 30 g silis jeli kullanilarak ve % 5 EtOH içeren 111 EtOAc/heksan ile ayristirilarak, ani kolon kromatograIisi vasitasiyla saflastirilmistir. Islem, 1,1 g fosforamidat elde edilinceye kadar tekrarlanmistir. HPLC ürünü, % 97 safliga sahip, fosforil)oksi)-3,3-dimetilbütanamido)propanoatin sentezi L-Alanin metil ester hidroklorür (1,35 g, 9,65 mmol), diklorometanda (20 mL) süspansiyon haline getirilmis ve -78 °C'ta argon atmosferi altinda, fenil fosforodikloridat damla damla ilave edilmistir. Karisim, -78°C'ta 30 dakika boyunca karistirilmis, ardindan 1 saat boyunca oda sicakligina isinmasina izin verilmistir. Karisim, -5°C'a sogutulmus ve metil pantotenat ( , diklorometana damla damla ilave edilmistir. N- metilimidazol ( ilave edilmis ve 30 dakika boyunca -5°C'ta ve 1 saat boyunca oda sicakliginda karistirildiktan sonra, 2 mL metanol ilave edilmistir. Karisim, ardisik olarak su (30 mL), % 5 sitrik asit (30 mL) ve tuzlu su (10 mL) ile yikanmistir. Organik faz kurutulmus (Na2SO4) ve çözücü madde, düsük basinç altinda giderilmistir. Saflastirma, berrak renksiz bir yag halinde ürün verecek sekilde, 1 :1 EtOAczheksan karisimi ile elde edilmistir. (1_,1 g, % 24 verim). HPLC ürünü, % 97 safliga sahip, bir 1:l dizastereomer karisimi olarak göstermistir. IH NMR (: 5 1,11 (s, 3H, CH3), , 3,55 475,03 [M + H+]. Referans Örnek 3-14 Asagidaki tabloda gösterilen bilesikler, uygun baslangiç malzemeleri kullanilarak, Referans Örnek 1 ve 2'de belirtilen sentetik prosedürlere göre hazirlanmistir. Referans R R' R" Izole Satlik Beklenen Gözlemlenen Örnek (Amino Edilen (%) M01. M01 Agirligi asit) Kütle (g) Agirligi [M+H+] Örnek 15:1n Vitro Bakteri Testi SJ 16 Escheri'chi'a 0011` 'inin, çogalmak için pantotenik asit ilavesine ihtiyaç gösteren bir susudur (yani, pantotenik asit gayri faal olacak sekilde bir mutasyona sahiptir). Dolayisiyla bu test, bir bilesigin, PKAN'in nedeni olan yetersiz PANK'i olan bir organizmayi kurtarip kurtaramayacaginin belirlenmesinde yararli bir deney islevini görür. Bu bulusun bilesikleri, toksisite ve izin veren ve vermeyen kosullar altinda, Escheri'chi'a coli' K-12 büyütme kabiliyeti açisindan test edilmistir. Bir çözücü maddedeki (dimetilsülfoksit, DMSO) test bilesigi, büyüme ortamina, 8 "M nihai konsantrasyonda ilave edilmistir. Büyüme ortamina, kontrol olarak, 5 % 0,] "M nihai konsantrasyonda sadece çözücü SJ 16 susu, agar (% 1,5), M9 minimum ölçüde gerekli tuzlar (bakiniz, Miller, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972), glikoz (% 0,4) metiyonin (50 ug/ml) içeren ve kalsiyum pantotenat (1 uM) içeren (izin veren) ve içermeyen (izin vermeyen) bir kati ortamda 37°C'ta 18 saat boyunca büyütülmüstür. Kalsiyum pantotenat ilavesiyle büyüme olmamasi, toksisiteyi göstermistir. Kalsiyum pantotenat ilavesi olmadan büyüme, bakterilerin, pantotenat veya ß-alanin verecek sekilde, bilesigi metabolize etme kabiliyetini göstermistir. DV70 susu, agar (% 1,5), M9 minimum ölçüde gerekli tuzlar, glikoz (% 0,4) metiyonin (50 ;Lg/ml) ve kalsiyum pantotenat (1 uM) içeren bir kati ortamda 30°C'ta (izin veren) veya 42°C'ta (izin vermeyen) 18 saat boyunca büyütülmüstür. 30°C'ta büyüme olmamasi, toksisiteyi göstermistir. 42°C'ta büyüme olmasi, bakterilerin bilesigi metabolize ettigini ve ardindan ko enzim A'ya dönüstürdügünü göstermistir. Örnek 2 ve Referans Örnek 5, 7 ve 12'nin bilesikleri için SJ 1 6 toparlanma sonuçlari asagidaki tabloda gösterilmistir. "Evet" sonucu, bakterilerin 18 saat sonra canli olduklarini belirtir. Örnek 2 ve Referans Örnek 5, 7 ve l2'nin bilesikleri, DV70 susunun toparlanmasi ile sonuçlanmamistir. Örnek Kullanilan DMSO SJ16 Toparlanmasi 2 < 10% Evet (Referans) 50% Evet 7 (Referans) 60% Evet 12 (Referans) 70% Evet* * test bilesigi çökelmistir Örnek 2 ve Referans Örnek 5, 7 ve 12'nin bilesikleri, ölümsüzlestirilmis insan hücrelerinde (HEK 293T) test edilmistir. Örnek 2 ve Referans Örnek 5, 7 ve 12'nin bilesiklerinin uygulanmasindan sonra, asetil-CoA miktari (PANK'in islem sonrasi sonucu), kütle spektrometrisi vasitasiyla ölçülmüstür. Sonuçlar Sekil 1'de gösterilmistir. Sekil 1'den görülebilecegi gibi, HEK 293T hücrelerinin, Örnek 2'nin bilesiginden 200 uM ile islem görmesi, asetil CoA'nin referans degeri üzerinde % 42'lik bir artis vermistir (p < görmesi, asetil CoA'nin referans degeri üzerinde % 38'lik bir artis vermistir (p < 0,005). Örnek 17: In Viva Test Bulusun bilesikleri etkinlik açisindan, yaslari eslesen Pan/(1+1+ (sus 129SvJ x C57BL/6J) arkaplan) test edilmistir. Her fare, kodlu bir kulak künyesi ile tanimlanmis ve testin birinci gününde kodlanmistir. Her bilesik, bes gün boyunca günde bir kez, 5 uL dimetilsülfoksit içinde 1,2 umol/ g Vücut agirligi dozunda, intraperitoneal enjeksiyon vasitasiyla 4-5 fareye gün boyunca verilinis ve fareler daha sonra gece boyunca aç birakilmis, tartilmis ve ötenazi uygulanmistir. Tedavi görmeyen fareler, 5 gün boyunca günde bir kez 5 uL dimetilsülfoksit almis ve ardindan gece boyunca aç birakilarak tartilmis ve ötenazi uygulanmistir. Karacigerler her fareden kesilip çikarilmis, alikuotlar sivi azotta soklanarak dondurulmus ve -80° C'ta depolanmistir. 7 gün içinde karaciger numuneleri buz üzerinde çözdürülmüs, tartilmis ve asagida açiklandigi gibi, koenzim A için analiz edilmistir. Etkinlik, islem görmeyen Pan/`:14` farelerinin karacigerleri ile kiyaslandiginda, Pank1`/` farelerin karacigerlerinde Koenzim A seviyelerinde istatistiksel olarak anlamli bir artisla ve islem görmeyen Panlir/Jr farelerinde Koenzim A seviyelerine kiyasla esdegerlilik vasitasiyla belirtilmistir. COA Öleümleri: Fibroblastlarin ve Karacigerin Ekstraksiyonu ve Yüksek Basinçli Sivi Kromatografisinden (HPLC) önce Koenzim A'nin Türevlendirilmesi Fibroblastlarin veya karacigerin ekstraksiyonu, daha önce açiklanan bir usulün modifikasyonu ile gerçeklestirilmistir (bakiniz, Minkler ve digerleri, Anal. Biochem., 376, modifikasyonu ile gerceklestirilmistir (bakiniz, Shimada ve digerleri, J. Chromatogr. B Karaciger (20-50 mg), 2 mL 1 mM KOH içinde homojenlestirilmis ve pH, 0,25 M KOH ile 12'ye ayarlanmistir. Fibroblastlar kültür kabindan kazinmis ve 1 mL suda toplanmis, bu ise 200 uL 0,25 M NaOH'a aktarilmistir. Karaciger homojenati daha sonra, 55°C'ta 2 saat boyunca inkübe edilinis ve fibroblast hücreleri, 55°C'ta 1 saat boyunca inkübe edilmistir. pH, 1 M Trizma-HCl ile pH 8'e ayarlanmis ve 100 mM monobromobimandan (mBBr, Life Technologies, NY) 10 uL, 2 saat boyunca karanlikta ilave edilmistir. Reaksiyon asetik asit ile asitlestirilmis ve 15 dakika boyunca 500 g'da santriûijlenmistir. Süpernatant daha sonra, 1 mL % 50 metanol/% 2 asetik asitle dengelenen, bir 2-(2-piridi1)eti1 kolonuna (Supelco) ilave edilmistir. Kolon, 2 x '1 mL % 50 metanol/% 2 asetik asit ve 1 mL su ile yikanmistir.10 Numuneler, % 95 etanolde 2 x 1 mL 50 mM amonyum formatla ayristirilinistir. Numuneler, nitrojen altinda buharlastirilmis ve 300 pL suda yeniden süspansiyon haline getirilmistir. Örnekler, HPLC'den önce herhangi bir çökeltici maddeyi gidermek için, bir Spin-X Santrifüj Boru Filtrede (0,22 iim Selüloz Asetat, Costar) döndürülmüstür. Koenzim A Miktarinin HPLC ile Belirlenmesi Koenzim A'nin mBBr türevi, Phenomenex (Torrance, CA) ürünü bir Gemini Cig 3 nm kolon (150 X 4,60 mm) kullanilarak, ters faz HPLC vasitasiyla ayrilmistir. Kullanilan kromatografi sistemi, bir UV/Vis dedektörlü bir Waters e2695 separasyon modülüdür ve Empower 3 yazilimi vasitasiyla kumanda edilmektedir. Çözücü madde A, 50 mM potasyum fosfat pH 4,6'dir ve çözücü madde B, % 100 asetonitrildir. 20 iiL numune kolona enjekte edilmistir ve debi 0,5 mL/dakikadir. HPLC programi asagidaki gibidir: izokratik, Z'den ve 9 dakikaya kadar % 10 B'den % 25 B'ye lineer gradyent, 9'dan 23 dakikaya kadar % 25 B'den % 40 B'ye içbükey gradyent, 23'ten 25 dakikaya kadar Dedektör, %393 nm'ye ayarlanmistir. mBBr'den türevine dönüsen Koenzim A pikinin altindaki alanin integrali alinmis ve ticari Koenzim A'dan hazirlanan mBBr-Koenzim A standart konsantrasyon egrisi ile kiyaslanmistir. Sekil 2, PANK inaktive edilmis farelerde, Örnek 2'deki bilesik uygulandiktan sonra mBBr CoA seviyelerini göstermektedir. Sekil 2'den görülebilecegi gibi, Örnek 2'nin bilesigi, CoA seviyelerini normal farelerde görülen seviyelere geri döndürmüstür. Bu, asagidaki tabloda da görülmektedir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR