TEKNIK ALAN Bulus, protein preparasyonlarIan kontaminantlarl giderilmesi alan. dahildir. Bir yönde, bulus, bir protein preparasyonundan, slûn afinite kromatografi kontaminantlarIlEl giderilmesi ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Afinite kromatografisi, antikorlar ve Fc-füzyon proteinleri gibi proteinlerin arIEEIhasElçin güçlü bir araçtEl Ancak, proteinlerin terapötik kullanl için üretilmesi durumunda, afinite adsorbanlarII bir parçaslîlolarak kullanEân bir protein de dahil olmak üzere, afinite kromatografisi sßsIa bir numunenin içine slîlabilen diger proteinlerin mevcudiyeti endise kaynagIIE Ilaveten, örnegin arlBhlElân proteini üreten konak hücrelerden elde edilen proteinler gibi diger protein kontaminantlarEl da bir numunenin içerisinde mevcut olabilmektedir. Proteinler A ve G, afinite kromatografisi ile antikorlar. arIIEEE1asa slIZJEZIa kullanEIhaktadlB Ford ve meslektaslarEQZOOl), J. Chromatogr. B 754: 427-435. Bu proteinler kullanlSJIEl zira birçok farklElantikorun sabit (FC) bir klim- baglanmaktadEllar. Bir IgG antikorunun bir FC klîrnlîlda dahil olmak üzere rekombinant füzyon proteinleri, benzer yöntemler kullanEârak arIEEâbilmektedir. Çogu protein A ve protein G afinite kromatografi islemlerinde, protein A veya protein G IigandII küçük miktarlari: afinite kolonundan sünaktadElve serbest Iigand olarak veya hedef protein ile kompleks halindeki Iigand olarak eluata düsmektedir. Antikorun veya füzyon proteini bir terapötik olarak kullanEBiasEI durumunda, slim Iigand ve ligand/protein kompleksleri giderilmelidir. Kromatografi reçinelerinin imalatçllârüprotein A gibi kallEtlIkontaminantlarI giderilmesi için iyon degistirme kromatografisinin kullanHIhasIElönermektedir. Bkz. örn. "Process Scale Antibody Purification" Basvuru Notu 11- referanslZI Kelley ve meslektaslarükatyon degisim kromatografisinin, daha tipik olarak bir baglama ve ayrlstlîilna modunda kullanIiglIÇlburada üründen daha az temel olan katlgkllârlül, yükleme ve ylKlamada giderildigini ve daha temel olan katlSkllârI ise ayrlgtlElna süsia üründen ayrIIlgllIaktarmlgtlü Kelley ve meslektaslarlZlZOOS, Biotechnol. and Bioeng., cilt 100: 950- 963. AynEyazarlara göre, anyon degisim kromatografisi, genellikle bir sürekli aklg modunda çallStlEllE1aktadlEl çünkü endotoksin gibi polianyonlar ve nükleik asitler, istenen ürünün sürekli akmasIlînümkün k[lân kosullar aItIa kolona baglanabilmektedir. Id. 950'de. Bir sürekli aklgl modundaki anyon degisim kromatografisi, ayrlîla, tipik olarak konak hücre proteinlerinin ve protein A'nIgiderilmesi için kullanilâbilmektedir. Id. 961'de. Hidroksiapatit koramtografisi, sasIlEDbir sekilde, islem ölçekli protein üretimi slßsia slîlan protein A'nI gideirlmesinde etkilidir. 7,476,722 numaraIElUS Patent DokümanÇl bir hidroksiapatit kolonu sürekli aklgl modunda çallgtlîllâbilirken, %90 üzerinde hedef proteinin kurtarIiIElve 5.3 ila 5.4 kat Protein A komtaminasyonu azaltIiII korundugunu açilZlamaktadB Ancak bazEl durumlarda, mekanik istikrarslîlithan ve/veya yeniden kullanilâbilirligin düsük olmasIan dolayÇl hidroksiapatitin kullanilE1asEl uygun olmayabilmektedir veya slîbn protein A'nI tamamIügideremeyebilmektedir. Dolaylglsîla, slîlan protein A giderilirken, aynlZlzamanda protein kurtar-III maksimize edilmesi ve böylelikle rekombinant protein üretimi maliyetlerinin kontrol edilmesine yönelik alternatif yollara teknikte ihtiyaç duyulmaktadlEl Çogu monoklonal antikor platformu arIIElna islemleri, bir afinite yakalama adIiEIve ardIan gelen bir veya iki parlatma ad"an olusmaktadlü Iskra ve meslektaslarlZl bir zayiElbölmeli anyon degisim kromatografisi parlatma adIiII katakterizasyonu için ygksek bir girdi-çiEtEtaramasIElHTS) açilZlamlIslardEl Iskra ve meslektaslarü2013, Biotechnol. and anyonu degistirme reçinesi psan Fractogel EMD TMAE HiCap'in (M) kirlenme özellikleri, islemle ilgili kirlenme etkisinin belirlenmesi için Corbett ve meslektaslarEtarafIan analiz BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Afinite kromatografisi proteinlerin izole edilmesi için fazlaca etkili bir teknik olmas. ragmen, bununla ilgili bir problem sudur ki afinite IigandÇlafinite kromatografi ortamIan slîlarak elde edilen rekombinant proteini numunesini kirletebilmektedir. Afinite Iigandlarü rekombinant protein ile iliskilenme yetilerinden dolayBSeçildikleri için rekombinant proteini kaybetmeden bunsarI nihai preparasyondan giderilmesi zor olabilmektedir. Bulus, tentakül anyon degisim matris kromatografisi ortamleullanllârak bu amaca ulasmak için etkili, nazik ve kolaylikla ölçeklendirilebilir bir yol saglamaktadlE Belirli hiçbir mekanizmaya baglElkallElTiamasEl istenirken, bulusun anyon degisim matrisi kromatografisi ortamII tentakül yönünün, bulusun yöntemlerine, rekombinant proteinin kurtarIiIa ciddi kaylplar olmaks- afinite ligandII giderilmesi bak"an, diger herhangi bir anyon degisim reçinesinden, dogrusu çogu reçineden, beklenmeyecek sekilde daha iyi sonuçlar. kazand Ellüiaslölßaglamaktadlü Bu baglamda, bir yönde yöntem, rekombinant proteini ve proteine baglanan bir ikinci proteini içeren bir numuneden bir rekombinant tümör nekroz faktörü reseptörü Fc (TNFR-Fc) füzyon proteinin arlEdlEllEnas- yönelik bir yöntem saglamakta olup, rekombinant proteinin tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortamIEb baglandlgllîkosullar altEtla, numumenin, bir tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortam- tabi klIIEmalelÇlardIan bir eluentin içinde kromatografi ortam. baglanan rekombinant proteinin ayrIStEIÜiasIElçermektedir, böylelikle en az %85 rekombinant protein eluentin içerisinde kurtarllîhaktadlEve en az %75 ikinci protein, eluentten giderilmektedir, burada ikinci protein Protein A veya Protein G'dir ve tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlZ] trimetilamonyumetil (TMAE) içermektedir. Tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortamIIEl reçine substratlÇlbir metakrilat polimerik reçine veya bir polivinilstiren polimerik reçine olabilmektedir. Yukar-ki yapllândülnalarl bir yönünd,e kromatografi 0rtamEIFractogel® EMD TMAE HiCap'tIE Yukarlölaki yapllândlîilnalarl tümünde, bulusun yöntemleri, bir antikorun bir CHZ/CH3 bölgesini içeren rekombinant proteinin arlEd lElIBiaslîçin kullanllâbilmektedir. Bu tür proteinler, örnegi bir Protein A veya Protein G kromatografi reçinesi gibi afinite kolonlarII üzerinde arIlEllâbilmektedir. Bu baglamda, bulusun yöntemleri, ikinci proteinin Protein A veya Protein G olmasEUurumunda kullanllâbilmektedir. Yukar-ki yapllândlElnalardan herhangi birinde, numune, proteinin afinite arlEdlElnaletlan elde edilebilmektedir. Bu tür bir afinite arlEbIlîiinasü bir Protein A kromatografi ortamEüzerinden gerçeklestirilebiImektedir. Bulusun yukarElhki yönlerinden herhangi birinde, rekombinant protein, örnegin etanersept gibi bir tümör nekroz faktörü reseptörü Fc füzyon proteinidir. Istege baglEblarak, bulusun yukarIki yönlerinden herhangi birinde, rekombinant protein tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam- baglandithan sonra ve rekombinant protein ayrlStlBlBIadan önce, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamübir y[lZbma ad" tabi k-bilmektedir. Bir diger opsiyon olarka, bulusun yukar-ki yönlerinden herhangi birinde, rekombinant protein, tentakül anyon degisim matrisi kromatografisinden önce ve/veya sonra ilave ariünaya tabi k-bilmektedir. Bu tür ilave arIlElna adllarlîl afinite kromatografisi, iyon degisim kromatografisi, hidroksiapatit kromatografisi, hidrofobik interaksiyon kromatografisi, bir jel filtrelemesi (boyut dlglama) kromatografisi, karlgKl modlu kromatografi ve/veya filtrasyonu içermektedir, ancak bunlarla sIlîllEldegildir. Ilaveten, bulusun yukarlillaki yönlerinin tümünde, rekombinant protein ayrlîla, sonradan bir farmasötik bilesim halinde formüle edilebilmektedir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, çallgl'na örnekleri 1 ila 8'den aIEUEglEüzere belirtilen reçinelerin her birine yönelik tarama ve optimizasyon deneylerinin derleme sonuçlarlügöstermektedir. Test rekombinant proteinin, etanerseptin kurtariÇlX ekseni üzerinde çizilen sßn protein A azaltllîyüzdesinin bir fonksiyonu olarak Y ekseni üzerinde grafige dökülmüstür. Kullanüân reçineler gösterilmektedir ve su sekildedir: DEAE Sfaroz HlZElAklg (GE Healthcare Life Sciences); Eshmuno® Q (EMD Millipore); Fractogel® SO3 (Merck Millipore); HIC (Toyopearl 650-M; ToyoScreen Ether-650M; ToyoScreen Fenil-650M; ToyoScreen PPG-600M, tümü Tosoh Bioscience GmbH'den); CHT Seramik Hidroksiapatit Tip II 80 mm parçaclKl reçine (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA); Q Sefaroz Hüüâklgl (GE Healthcare Life Sciences); ve Fractogel® EMD TMAE HiCap (EMD Millipore). Sekil 2, Sekil 1'de grafige dökülen KurtarIi/Slîlan Protein A Indirgemesi egrisinin bir yardIiclIgrafiktir. Her bir reçine için gafikte kullanilan semboller, sekil göstergesinde belirtilmektedir. AYRINTILI AÇIKLAMA Tan milar Adsorban: Bir adsorban, bir katüzlestege eklenmil en az bir molekül veya kromatografinin gerçeklestirilmesi için kullanllân, kendisi bir katlîcblan en az bir moleküldür. Afinite Kromatografisi: Afinite kromatografisi, kromatografik ayrllîhaya etkide bulunulmasEl için izoelektrik nokta, hidrofobisite veya büyüklük gibi bir molekülün genel özelliklerinden ziyade, biyomoleküller arasiaki tersinebilir etkilesimlerden, örnegin Protein A'nI bir IgG antikorunun bir FC klîinl baglanma yetisinden faydalanan bir kromatografidir. Uygulamada, afinite kromatografisi, adsorbana neredeyse lelEa baglanan moleküllerin kromatografik sekilde ayrllhîaslîlamaclýla katEIbir destege eklenmis olan Protein A gibi bir adsorban. kullanUIhasIEliçermektedir. Bkz. Ostrove (1990), Guide to Protein Purification içinde, Methods in Enzymology 182:357-379. Kromatografi: Kromatografi, bir karIglEiI içerisinde bulunan kimyasal olarak farklEl moleküllerin, neredeyse güçlü bir sekilde farklünolekülleri adsorbe eden veya tutan bir adsorban vasitîlislýla karlglînilül slîdlîllîhasliile birbirinden ayrllüiasllü Asdorbana en güçsüz sekilde adsorbe edilen veya adsorban tarafian tutulan moleküller, daha güçlü bir sekilde adsorbe edilen veya tutulan moleküllerin salEtnadig'Ekosullar altlEUa salEtnaktadB Bulaskan: Bir bulaskan, herhangi bir yabancElieya uygunsuz molekül, özellikle bir DNA, bir RNA veya ariülân bir protein numunesinde mevcut olan proteinlerden farkIElolan bir protein gibi bir biyolojik makromoleküldür. Bulaskanlar; arlEdIEllân proteini salgüâyan hücrelerden elde edilen proteinler veya afinite kromatografisi süsia bir numunenin içerisine slîabilen, afinite kromatografisi için kullanllân bir adsorbanlEl bir parçasüolan, örnegin Protein A gibi diger proteinleri kapsamaktadB ArIdlIhiak: Bir proteinin arimasüyabancEl/eya uygunsuz elementlerin, özellikle bir protein numunesinde mevcut olabilen örnegin proteinler veya DNA gibi biyolojik makromoleküllerin miktari& azaltllB1asü anlamlEla gelmektedir. YabancEI proteinlerin mevcudiyeti, jel elektroforezi ve lekeleme ve/veya ELISA denemesi dahil olmak üzere uygun herhangi bir yöntem tarafIan denenebilmektedir. DNA mevcudiyeti, jel elektroforezi ve lekeleme ve/veya polimeraz zincir reaksiyonundan faydalanan denemeler dahil olmak üzere uygun herhangi bir yöntem taraflEtIan denenebilmektedir. Aylîh'iak: Bir protein, karlglînl bir isleme tabi tutuldugunda her iki proteini de içeren bir karlglülil içerisindeki bir ikinci proteinden ayrilBwaktadB böylelikle protein moleküllerinin en azian çogunlugu, ikinci proteinin moleküllerinin en azIan çogunu içeren karlglEliI bu klîrnIan giderilmektedir. Büyük oranda benzer: Bulusun amaçlar. yönelik olarak proteinler; amino asit sekanslda birbirine en az %80, tercihen en az %90 özdes olmalarüjurumunda ve degistirilmemis olan proteinin biyolojil aktivitesini arzu edilen sekilde sürdürmeleri veya degistirmeleri durumunda büyük oranda benzer olmaktadlBIar. Proteinlerin büyük oradan benzer olup olmadEEIarII belirlenmesi amacElçin özdes olarak varsayllân amino asitlere, biyolojik aktiviteyi etkileme olasUJglEblmayan konzervatif ikameler dahil olup, sunlarElçermektedir: Ser için Ala, Ile için Val, Glu için Asp, Ser için Thr, Gly için Ala, Thr için Ala, Asn için Ser, Val için Ala, Gly için Ser, Phe için Tyr, Pro için Ala, Arg için Lys, Asn için Asp, Ile için Leu, Val için Leu, Glu için Ala, Gly için Asp ve reversteki bu degisimler. Bkz. örn. Neurath ve meslektaslarüThe Proteins, Academic Press, New York (1979). Iki amino sekansII yüzde kimligi, gözle inceleme ve matematiksel hesaplama vasßsüla belirlenebilmektedir veya daha tercihen, klýlaslama, Genetics Computer Group (GCG; Madison; WI) Wisconsin paketi versiyonu 10.0 programlZl programlari] gibi bir bilgisayar programli kullanllîhaslîl vasltâslýla sekans bilgisinin karsllâstlîllüiaslîlile gerçeklestirilmektedir. `GAP' programlîliçin tercih edilen, varsayilân parametreler sunlarlîiçermektedir: (1) Editörler Schwartz ve Dayhoff tarafIdan Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, syf. 353-358 (1979) referansIa açiklandlgllîüzere Gribskov ve Burgess'in ölçülen amino asit klýlaslama (2) amino asit sekanslarülçin her bir bosluk için 30'luk bir penaltüle her bir bosluktaki her bir sembol için 1'Iik bir ilave penaltü(3) bitim bosluklarEiÇin penaltlîinevcut degildir; ve (4) uzun bosluklar için maksimum penaltElnevcut degildir. Sekans karsüâstlîmaslüla yönelik teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen diger programlar da kullanuâbilmektedir. Bulusun Yöntemlerinin AçtlillamasEI Bu baglamda, bir yönde yöntem, rekombinant proteini ve proteine baglanan bir ikinci proteini içeren bir numuneden bir rekombinant tümör nekroz faktörü reseptörü Fc (TNFR-Fc) füzyon proteinin arlEtllEllBialela yönelik bir yöntem saglamaktadlEl Yöntem, rekombinant proteinin tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortam- baglandlgllîl kosullar altlEUa, numumenin, bir tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortam- tabi kHJEmalelü ardIan bir eluentin içinde kromatografi ortam- baglanan rekombinant proteinin ayrlgtlEIlBiasIEiçermektedir, burada tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamü trimetilamonyumetil (TMAE) içermektedir. Bulusun yöntemlerini kullanarak mevcut bulus sahipleri, bir eluentin içinde rekombinant proteinin en az %85'ini kurtarabilmekteyken, ikinci bulasan proteinin en az %75'ini gidermistir. Tabii ki, bulusun yöntemleri; çogu durumda rekombinant proteinin en az o/o90'lIlkurtarllâbilirken aynüamanda ikinci bulasan proteinin en az %80'inin giderilebilecegi sekildeydi. Daha iyi olan bu sonuçlara, endüstriyel üretimde tipik olarak kullanilân diger hiçbir anyon, katyon veya hidrofobik etkilesim kromatografisi ile ulasllîhaslîilnümkün degildir. Belirli hiçbir mekanizmaya bagIElkallEmamasübtenirken, bulusun anyon degisim matrisi kromatografisi ortamII tentakül yönünün, bulusun yöntemlerine, diger herhangi bir anyon degisim reçinesinden, dogrusu çogu reçineden, beklenmeyecek sekilde daha iyi sonuçlar. kazandBlîhaslßaglad[giüiüsünülmektedin teknolojisini kullanan bir anyon degisim matrisine isaret etmektedir. Tentakül teknolojisini kullanan anyon degisim matrisleri, genellikle lineer polimer zincirleri (tentaküller) tarafian meydana getirilen aralayülârlîlyüzeylerinde taslýhn reçine parçaclElarlîllB burada anyon degisim aktivitesine sahip fonksiyonel gruplar, tentaküllere ilistirilmektedir. Bir diger yapllândünada, söz konusu tentakülleri meydana getiren polimer zincirleri akrilamit polimerlerdir. Belirli bir yapandlElnada, güçlün anyon degistirici fonksiyonel grup TMAE'dir. Bir yönde, tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi ortamII reçine substratlZl bir metakrilat polimerik reçine veya bir polivinilstiren polimerik reçinedir. Bir yapllândlîrlnada, metakrilat veya polivinilstiren polimer çapraz bagl- Burada aç[lZIanan örneklerde, reçine parçadElarElçapraz baglElmetakrilat polimerinden olusmaktadlEl Tentakül anyon degisim matrislerinin örnekleri sunlardlü Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE HiCap, Fractogel® EMD TMAE MedCap(m), ve Fractoprep® DEAE iyon degistiricileri (EMD Millipore). Bir yönde, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlîslunlarübermektedir; (i) çapraz baglEImetaktilar polimer olabilen metakrilat polimer gibi metakrilat polimer veya vinil polimerin reçine parçacllaarüüi) akrilamit tantaküller olup, burada akrilamit tentaküller söz konusu reçine parçacllîlarII yüzeylerine ilistirilmektedir, ve burada TMAE (Trimetilaminoetil- ) gruplarüakrilamit tantakülfonksiyonele ilistirilmektedir. Bulusun yöntemleri, ikinci protein, rekombinant proteinin önceden baslangEl olarak ari-@Elbir afinite kromatografi ortamIan slûn bir protein oldugunda özellikle kullanlSJIlEl DolayElEa, bir yapllândlîilnada, rekombinant proteini ve ikinci proteini içeren numune, önceki bir afinite kromatografi adli bir sonucu olarak elde edilmektedir. Güncel olarak kullanida olan en yaygI afinite kromatografi proteinleri, Fc füzyon proteinleri gibi bir antikorun bir Ch2/CH3 bölgesini içeren antikorlarI ve diger proteinlerin baglanmasEliçin kullanllân Protein A, Protein G ve Protein LG'dir. Protein A, aslen, bir IgG antikorunun bir FC klim- spesifik olarak baglanan StafilokoklarI hücre duvarIa kesfedilen bir proteindir. Bulusun amaçlarüdogrultusunda, "Protein A," Protein A'nI piyasada mevcut olan ve/veya rekombinant formlarElda dahil olmak Üzere Stafilokokal Protein A' ile özdes olan veya buna büyük oranda benzer olan herhangi bir proteindir. Bulusun amaçlarüjogrultusunda, büyük oranda benzerligin belirlenmesi amaclEb yönelik Protein A'nI biyolojik aktivitesi, IgG antikotunun FC klglnIEb baglanma kapasitesidir. Protein G, aslen, bir IgG antikorunun bir FC klîm. spesifik olarak baglanan StafilokoklarI hücre duvaria kesfedilen bir proteindir. Bulusun amaçlarüdogrultusunda, "Protein G," Protein G'nin piyasada mevcut olan ve/veya rekombinant formlarlIlda dahil olmak üzere Stafilokokal Protein G' ile özdes olan veya buna büyük oranda benzer olan herhangi bir proteindir. Bulusun amaçlarEdogrultusunda, büyük oranda benzerligin belirlenmesi amac. yönelik Protein G'nin biyolojik aktivitesi, IgG antikotunun Fc klim- baglanma kapasitesidir. Protein LG, hem Protein G'nin (yukarlki açllZlamaya bkz.) hem de Protein L'nin kJIarIEl içeren IgG antikorlarlEla baglanan bir rekombinant füzyon proteinidir. Protein L, aslen, Peptostreptokoklarl hücre duvarIan izole edilmistir. Protein LG, hem Protein L'nin hem de Bulusun amaçlarljdogrultusunda, "Protein LG," Protein LG'nin piyasada mevcut olan ve/veya rekombinant formlarüja dahil olmak üzere Stafilokokal Protein LG' ile özdes olan veya buna büyük oranda benzer olan herhangi bir proteindir. Bulusun amaçlarlîtlogrultusunda, büyük oranda benzerligin belirlenmesi amac_ yönelik Protein G'nin biyolojik aktivitesi, bir IgG antikorunaa baglanma kapasitesidir. Millipore taraflEtlan üretilen ProSep® kontrollü gözenelkli cam reçineler, önceden Amersham Biosciences olan GE Healthcare tarafIan üretilen MabSelectTM çapraz bagllîlagaroz reçine ürünleri de dahil olmak üzere, afinite arIHnasEiçin kullanüâbilen, piyasada mevcut birçok protein A kromatografi ortamEbqunmaktadE Hem MabSeIect hem de ProSep reçineleri, 20 g/L'den daha aleas. yaklasan dinamik baglama kapasitelerine, 200 ila 600 cm/sa arallglia olan antikorlarlEl ticari miktarlarlElI Üretilmesi için lineer aklgl hlZar- ve yaklasllZl 2 ila yaklasüîl 10 arasElpH stabilitelerine sahiptir. Üre veya diger azalti maddelerine maruz bßkllgiia iki reçine türü de kimyasal olarak stabil olmaktadß Buradaki bulusu açllZlauan örneklerde kullanllân Protein A kromatografi ortamII bir türü, MabSeIect SuReTM Protein A reçinesidir. MabSeIect SuReTM Protein A reçinesi, yerli protein A'dan daha stabil olmasElçin genetigi degistirilen protein A'nI degistirilmis bir rekombinant formudur. MabSeIect SuReT'VI Protein A kolonundan elde edilen protein A'nI slgn miktarlarÇlayrlEh, bulusun yöntemlerinin kullanllizhaslîlle giderilebilmektedir. Piyasada mevcut olan diger bir Protein A kromatografi ortamüProtein A Sefaroz FF reçinesidir (GE Healthcare Life Sciences). Piyasada mevcut olan bir Protein G kromatografi ortamII bir örnegi, Protein G Sefaroz 4 Fast Flow'dur (GE Healthcare Life Sciences). Bulusun yöntemleri, bilinen ve gelistirilecek olan afinite reçinelerinin kullanUBialellIglierektirmektedir. Bazüyapllândünalarda, bulusun prosesi ayrlîb, en az iki adi içermektedir. Birinci olarak, bir adsorban olarak bir katlîcllestege eklenen ikinci proteinin kullanllüiaslýla, rekombinant protein, aûnite kromatografisinin bir ön arlEUlElna adIiIEb tabi klIlEmaktadIB Ikinci olarak, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlürekombinant proteinin, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam. baglanacaglîkosullar aItIa gerçeklestirilmektedir. Opsiyonel bir yllZlama adIiIan sonra, rekombinant protein, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam-an ayrigtlElB1aktadlEl Proteinin arHElBias yönelik tüm proses, asagi hatlEllatIlglEüzere, bu adIiIarI her birinden önce ve/veya sonraki diger adIiIarlZI içerebilmektedir. Denge ve kromatografiden önce, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamÇIseçilen bir çözeltide, örnegin bir tuz ve/veya tampon çözeltisinde bir ön dengelemeye tabi kElErnaktadB Ön-dengeleme, kromatografi ortamlElI yeniden düzenlenmesi ve/veya depolanmasEiçin kullanliân bir çözeltinin yerinin degistirilmesi islevini görmektedir. Teknikte uzman bir kisi, ön-dengeleme çözeltisi bilesiminin, depolama çözeltisi bilesimine ve bir sonraki kromatografi için kullanllâcak olan çözeltiye bagllîchugunu fark edecektir. Dolaylglîla, uygun ön-dengeleme çözeltileri, kromatografi gerçeklestirilirken kullanllân tampon ve tuzun tercihen kromatografi gerçeklestirilirken kullanllândan daha yüksek bir konsantrasyonda bulunan halini içerebilmektedir. Kromatografi için kullanlßbilen tamponlar ve tuzlar, asaglElh tartgliöiaktadß Numune kolona uygulanamdan önce, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamü proteinin kromatografisinde kullanüâcak olan tampon veya tuzun içerisinde dengelenebilmektedir. Asagi tartEllBlgEiizere, kromatografi (ve arilîllâcak olan proteinin yüklenmesi); sodyum, potasyum, amonyum, magnezyum, kalsiyum, klorür, florür, asetat, fosfat ve/veya sitrat tuzlarlÃl'e/veya Tris, fosfat, sitrat, HEPES, MOPS ve MES tamponlarülahil çesitli tamponlarda gerçeklesebilmektedir. Bu tür tamponlar veya tuzlar, en az yaklasilZl 5.5 olan bir pH'a sahip olabilmektedir. BazÜ/apllândüinalarda, denge, bir Tris veya bir sodyum fosfat tamponu içeren bir çözeltide meydana gelebilmektedir. Opsiyonel olarak, Tris veya sodyum fosfat tamponu, yaklasllZl 0.5 milimolar ve yaklasüZ] 50 milimolar arasElbir konsantrasyondadlü daha tercihen yaklasllZl 15 milimolar ve 35 milimolar arasEi bir konsantrasyondadE Tercihen, dengeleme, en az yaklasilîl 5.5 olan bir pH'ta meydana gelmektedir. Dengeleme, yaklasik! 6.0 ve yaklaslKl 8.6 arasIZbir pH degerlerinde, tercihen yaklas[lZl 7.0 ve 8.5 arasElpH degerlerinde meydana gelebilmektedir. Bir yönde, çözelti, yaklasllîl 25 milimolarllEl bir konsantrasyonda olan ve pH'D/aklasllZJ 8 olan bir Tris tamponu içermektedir. Bulusun herhangi bir adIiEl veya tüm adIilarÇl herhangi bir mekanik araç ile gerçeklestirilebilmektedir. Kromatografi, bir kolonda gerçeklestiriIebilmektedir. Kolon, baleiç ile veya bu olmaks- ve üstten alta dogru veya alttan üste dogru çallStlEllâbilmektedir. Kolondaki aklgkan aklglEllEl yönü, kromatografi prosesleri leelisIa tersinebilmektedir. Kromatograû; yer çekimi, santrifüjleme veya filtreleme dahil uygun olan herhangi bir yöntem kullanilârak numunenin yüklenmesi, yllZlanmalel'e ayrlgtlEllBîasüçin kullanllân aklgkandan katEl destegin ayrI[gElbir kesikli islemin kullanilîhaslîlvaslüslýla da gerçeklestirilebilmektedir. Kromatografi ayrlîia, numunenin içerisindeki molekülleri digerlerinden daha güçlü bir sekilde adsorbe eden veya tutan bir filtre ile numunenin temas ettirilmesi vasltâslýla da gerçeklestirilebilmektedir. Rekombinant proteinin, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlEla baglanmasEI için kosullar, teknikte uzman bir kisi tarafIan belirlenebilmektedir ve rekombinant proteinin yüküne ve anyon islevsel grubunun dayan" baglIE Istege bagllZbIarak, rekombinant protein tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam- baglandßîtan sonra ve rekombinant protein ayrigtlElIBiadan önce, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamEbIr yllZbma adHlElai tabi k-bilmektedir. Yllîbma tamponu, tipik olarak, numunenin hazlîliand[glEl/e tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam- maruz blBikIlglîaynEl tampon sistemidir, ancak teknikte uzman bir kisi, rekombinant proteini ayrlgtlîllîhaks- kromatografi reçinesinin yllZlanmasIEla yönelik diger tampon kosullarIEEJelirleyebilecektir. Eger bir yHZlama sistemi dahil edilirse, yllZlama hacmi az olabilmektedir veya birkaç kolon hacmine sahip olabilmektedir. Ancak, tipik olarak, kolon 0.5 ila 10 kolon hacmi, daha tipik olarak 1 ila kolon hacmi ile yiEanmaktadlEl Rekombinant protein tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlEb baglandllîtan ve opsiyonel olarak ortam y[lZlandl]Ztan sonra, rekombinant protein, numunenin kromatografisi için kullanllân tamponun iletkenliginin artmasüve/veya pH'II azaltllmasü vaslüsüla ayrlgtlîllüiaktadEl Seçici bir sekilde rekombinant proteini ayrlgtlßbilen tampon durumu, klîtnen, rekombinant proteinin yüküne ve anyonik grubun dayanlIEb baglßlacaktlEl Bir yapllândlîilnada, rekombinant protein, rekombinant füzyon proteini etanerseptidir (CAS Hamsteri YumurtallglEl (CHO) hücrelerinde üretilen bir insan IgGl'inin Fc alanlEb bir rekombinant füzyon proteinidir ve Enbrel® ticari marka altIa Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA)'de ticari olarak mevcuttur. Bulus, rekombinant olarak etanersepti kullanan, asaglki çallgma örnekleri vasltâslýla açllZlanmaktadE Bulusun bir yapllândlElnasIa, protein A afinite kromatografisi kullanllârak afinitesi arlEUlElan etanersept içeren bir numune, pH'El/aklaslEIB olan bir tampon içerisinde tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortam. maruz büklßiaktadß Bu tür bir tampon, bir fosfat bilesimi veya pH'II yaklasllZJ 8 olmasEIçin titratlanan bir Tris(hidroksimetil)amin0metan (Tris) gibi bu pH arallgllEtla tampon islevini iyi bir sekilde yerine getiren herhangi bir tür olabilmektedir. Uygun bir Tris tamponu, 20 ila 30 mM Tris:HCI, daha tercihen yaklasllZJ 25 mM Tris:HCI olmaktadlü Tercihe baglElolarak, etanersept tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamIan ayrlStlEllIhadan önce, etanersept ortama bagllîkaldgßürece ortam aynEliampon ile veya az oranda farklüilarak bir tampon ile yllZbnabilmektedir. Bir yönde, tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamü yukarlki uygun Tris tamponlarIan biri ile yllZbnmaktadlEl Bir yönde, kolonun yllZlanmasI yönelik olarak tamponlanan çözelti, temelde pH'I yaklasllZl8 oldugu 25 mM Tris içermektedir. Kolon 0.5 ila 5 kolon hacmi, daha tipik olarak 1 ila 3 kolon hacmi ile yllZlanabilmektedir. Etanerseptin tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlEb baglanmasi. ve tercihe baglElolarak ylEanmasII ardIan ayrlIsIEEnaktadlÜ Rekombinant protein etanerseptini seçici olarak ayrlStlEacak olan herhangi bir kosul kullanllâbilmektedir. Bir yönde, etanersept pH'lZl/aklasllîl 6.5 ila yaklasllZl 8.5 olan, daha tercihen yaklasllZl 7.2 ila yaklaslEl 7.6 olan bir ayrlgtlîma tamponunda ayrlgtlülüiaktadü Tekrar, bu pH arallglIa tampon islevini iyi bir sekilde yerine getiren herhangi bir tampon türü kullanllâbilmekte olup, bunlar Tris ve fosfat bilesiklerinin yanEl sü 3-(N-morfolino)pr0pansülfonik asit (MOPS), 2-(N- mofholin0)etansülfonik asit (MES), 2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]etan sülfonik asit (HEPES), ve sitrat tamponlarIEliçermektedir, ancak bunlarla sIlEIlüdegildir. Örnegin, ayrlstlîilna tamponu yaklasllg 10 mM ila yaklaslla 50 mM Tris HCL olabilmektedir, ve pH yaklas[lZl7 ila pH yaklasllîl8 olabilmektedir. Bir yönde, ayrlgtlüna tamponu yaklasllZlZS mM Tris HCI, pH 7.2 ila pH 7.6'dlE Bir ayrlgtlülna tamponunun bir yapllândlîilnaslZZS mM Tris HCI, pH 7.2'dir. Ilaveten, ayrlgtülna tamponu, NaCI ve/veya sodyum sülfat gibi bir tuza sahip olaiblmektedir. Bu baglamda, alternatif bir diger ayrlStlElna tamponu, 25 mM Tris HCI, pH 7.5 ve yaklasllZl150 mM ila yaklasllg200 mM aras-a NaCl'dir. Bulusun yöntemlerini kullanarak, mevcut bulus sahipleri, arzu edilen rekombinant proteinin verimi yüksek oranlarda kurtarabilmekteyken, bulasan ikinci proteinin çogunu elimine edebilmektedir. Dolaylîlýla, bir yönde, bulusun yöntemleri, bir eIuantI içerisindeki rekombinant proteine yönelik en az %80, daha tercihen %85, daha tercihen %90 ve en çok tercih edilecek sekilde %95 kurtarIi ile sonuçlanmaktadE AynEtamanda, ikinci bulaskan proteinin en az %70, daha tercihen %75, daha tercihen %80 ve daha tercihen %85'i eluanttan giderilmektedir veya yukar-ki kurtarIi veya giderimlerin herhangi bir kombinasyonu elde edilebilmektedir. ArlEUIEmanI herhangi bir evresinde, bir numunenin protein konsantrasyonu uygun olan herhangi bir yöntem ile belirlenebilmektedir. Bu tür yöntemler teknikte iyi bilinmekte olup, sunlarüçermektedir: 1) Lowry denemesi, Bradford denemesi, Smith denemesi ve asllBÜaItI denemesi gibi kolorimetrik yöntemler; 2) proteinlerin UV emme özelliklerinden faydalanan yöntemler; ve 3) aynEjel üzeride bilinen miktarlari protein standartlarElle karsllâstlîilnaya dayanan jeller üzerinde lekelenmis protein bantlarEtemelindeki görsel degerlendirme. Bkz. örn. (1990), Quantitation of Protein, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymol. 182: 50-68. Bir rekombinant proteinin "arIlEIB'iaslZl istenmeyen bir bulaskan seviyesinin azaltilB1asü anlam. gelmektedir. Bulusun yöntemlerinde, istenmeyen bulaskan ikinci proteindir. Ikinci protein, rekombinant protein ve ikinci proteinin bir kompleksi ve/veya arlEtlElIân rekombinant proteinin bir numunesinde mevcut olabilen diger proteinler uygun olan herhangi bir sekilde gözlemlenebilmektedir. Tercihen, teknik, yaklasllîl milyon bas. 0.5 ölçek (ppm) (arlEUIEllân proteinin miligramlîl bas nanogram olarak hesaplanan) ve 500 ppm arallgiiaki bulaskanlarI belirlenmesine yetecek kadar hassas olmaIIlE Örnegin, teknikte iyi bilinen, enzim ile baglantIIJIlmmünosorbent denemesi (ELISA), rekombinant proteinin ikinci protein vasiliasülaolan kontaminasyonunun belirlenmesi için kullanilâbilmektedir. Bkz. örn. Reen (, Basic Protein and Peptide Protocols içinde, Methods Mol. Biol. 32: 461-466. Tentakül anyon degisim matrisi kromatografisi, bir ikinci protein tarafüldan kontaminasyonu en az yaklasllZl iki kat, tercihen en az yaklasllZl üç kat, daha tercihen en az yaklaslKl bes kat, daha tercihen en az yaklaslE on kat, daha tercihen en az yaklasIEl on bes kat, en çok tercih edilecek sekilde en az yaklasllZl yirmi kat azaltabilmektedir. Tercihen, tentakül anyon degisim matrisi kromatografisinin ardIan ikinci protein vasltâslýla rekombinant proteinin kontaminasyonu, yaklaslKl 100 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklaslKl 80 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklasllîl 60 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklas[lZl 40 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklasilîl 20 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklasllîl 10 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklaslEJ 5 ppm'den fazla degildir, daha tercihen yaklasllZl 1 ppm'den fazla degildir ve en çok tercih edilecek sekilde yaklasllZl 0.5 ppm'den fazla degildir. Bu tür bir ikinci protein vaslüslýla kontaminasyon, yaklasllZl 5 ppm, veya yaklasilîlS ppm ila yaklasElZJ400 ppm arasElbeIirlenemeyen seviyelerde olabilmektedir. Bir rekombinant proteinin farmakolojik kullanIi için arIlEIlIhaslZldurumunda, hastanI doz bas. bir bulaskan proteinin belirli bir miktarIan fazlasIEblmamaslZlamaclýla teknikte uzman bir kisi, ikinci proteinin tercih edilen seviyesinin hasta bas. uygulanacak olan protein dozuna baglEblabildigini anlayacaktE Dolaylgma, gerekli olan protein dozunun azalmasü durumunda, bir Ikinci protein tarafIan kontamisyon seviyesinin aitmaslZI mümkün olabilmektedir. Bulus, genetik mühendisligi tekniklerinin kullanUBiaslýla üretilen proteinler olan rekombinant proteinlerin arIlülüiasEiÇin kullanllâbilmektedir. Tercihen, proteinler, tipik olarak tek seferde birkaç gram miktarlEUa olan bir üretim ölçegi ile üretilmektedir. Bulus tarafEUan tasarlandlgllîl üzere arlEUlÜlnaya maruz blßkllân protein, bir veya daha fazla sabir antikor immünoglobulin alanü içerebilmektedir ve tek veya çoklu degisken antikor immunoglobulin alanü içerebilmektedir ancak bu gerekli degildir. Bu, dogal olarak meydana gelen bir protein veya bir rekombinant füzyon proteini olabilmektedir. Bir antikorun bir FC klîlnIEiçerebiImektedir. AyrlEb, antikor olmayan bir protein de içerebilmektedir. Burada açElZlanan yöntemler ile arIlElllâbilen rekombinant proteinlerin örnekleri, yandaki proteinlerin tümü veya bir klârnüle özdes olan veya bunlara büyük oranda benzer olan amino asit sekanslarIElçeren proteinleri kapsamaktadlE tümör nekroz faktörü (TNF), flt3 IigandEl (WO 94/28391), eritropoeitin, trombopoeitin, kalsitonin, IL-2, anjiopoietin-Z (Mai-sonpierre yönelik Iigand (RANKL, WO ile iliskili apoptoz indükleme IigandlîdTRAIL, WO 97/01633), timik stroma-türevli Ienfopoietin, granülosit koloni stimülasyon faktörü, granülosit-makrofaj koloni stimülsyon faktörü (GM-CSF, 588819 numaralüvustralya Patent DokümanDJ mast hücresi büyüme faktörü, stem hücresi büyüme faktörü (6,204,363 numaralDJS Patent DokümanDÇl epidermal büyüme faktörü, keratinosit büyüme faktörü, megakaryot büyüme ve gelisim faktörü, RANTES, insan fibrinojen-benzeri 2 büyüme hormonu, insülin, insülinotropin, insülin-benzeri büyüme faktörleri, paratiroid hormonu, interferonlar, a-interferonlarü y-interferonu, ve konsensus interferonlarlîldahil nörotrofik faktör, sinaptotagmin benzeir proteinler (SLP 1-5), nörotrofin-3, glukagon, interlökinler, koloni stimülasyon faktörleri, lenfotoksin-ß, lösemi Inhibitör faktörü, ve onkostatin-M. AçlElanan yöntemlere göre arlEUlElâbilen proteinlerin açlEIamaIarÇl örnegin Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, tüm ciltler (Aggarwal and Gutterman, ed.. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (ed., McKay ve Leigh, Oxford University Press Inc., New York, 1993); ve The Cytokine Handbook, Ciltler 1 ve 2 (ed. Thompson ve Lotze , Academic Press, San Diego, CA, 2003) referanslarIa bulunabilmektedir. Ilaveten, burada açllZlanan yöntemler, yukarth sözü edilen proteinlere yönelik bir reseptörün aminoasit sekansII tümü veya bir klglnlübu tür bir reseptöre veya yukari sözü edilen proteinlerden herhangi birine yönelik bir antagonist içeren proteinlerin ve/veya bu tür reseptörlere veya antagonistlere büyük oranda benzer proteinlerin arlEdlElllB'iasEliçin kullanllâbilmektedir. Bu reseptörler ve antagonistler sunlarlIliçermektedir: tümör nekroz numaraIEUS Patent DokümanEl/e 5,610,279 numaralEUS Patent DokümanLD Interleukin-l US Patent DokümanÇl ve 5,767,064, numaralElUS Patent DokümanD] IL-1 reseptör antagonistleri (6,337,072 numralElUS Patent Dokümanm IL-1 antagonistleri veya inhibitörleri DokümanDÇl IL-15 reseptörleri, IL-17 reseptörleri, IL-18 reseptörleri, Fc reseptörleri, granülosit-makrofaj kolonisi stimülasyon faktörü reseptörü, granülosit olonisi stimülasyon faktörü reseptörü, onkostatin-M ve lösemi inhibitör faktörüne yönelik reseptörler, NF-kappa osteoprotejerin (6,015,938 numaraIEUS Patent DokümanDJ TRAIL için reseptörler (TRAIL reseptörleri 1, 2, 3, ve 4 dahil), ve Fas veya Apoptoz-Indükleme Reseptörü (AIR) gibi ölüm alanlarIEiçeren reseptörler. Enzimatik olarak aktif proteinler veya bunlari IigandlarEUa arIlEIâbilmektedir. BunlarI örnekleri, yandaki proteinlerden, bunlarI ligandlarIdan birinin veya bunlara büyük oranda benzeyen bir proteinin tümü veya bir klglnlüçermektedir: TNF-alfa Dönüsüm Enzimi dahil bir disintegrin ve metalloproteinaz alanlîbilesinin üyeleri, çesitli kinazlar, glukoserebrosidaz, süperoksit dismutaz, doku plazminojen aktivatörü, Faktör VIII, Faktör IX, apolipoprotein E, apolipoprotein A-I, globinler, bir IL-2 antanogisti, alfa-1 antitripsin, yukar- sözü edilen enzimlerden herhangi birine yönelik Iigandlar ve birçok diger enzimler ve bunlari ligandlarlîl AçilZlanan yöntemler, ayrlEla, örnegin yukarlöh sözü eidlen proteinlerden herhangi birini içeren rekombinant füzyon proteinlerinin arIlEllÜiasElçin kullanllâbilmektedir. Örnegin, yukari sözü edilen proteinlere ilaveten bir Iösin zipperi, bir sarmallÜsarmal, bir immünogloubulinin bir Fc klîlnlîlgibi bir multimerizasyon alanEl/eya büyük oranda benzer bir protein içeren rekombinant füzyon proteinleri, bulusun yöntemleri kullanHârak üretilebilmektedir. Bkz. örn. 7:255-64. Bu tür rekombinant füzyon proteinleri araleldan buraya spesifik olarak dahil edilenler, yukar-ki proteinlerden herhangi biri dahil olmak üzere bir proteinin bir klglnllöl, bir antikorun bir Fc klgln- füzyonland[glElproteinlerdir. Bu tür proteinlerin örnekleri, etanersept (a p75 TNFR:Fc) ve belatasepttir (CT LA4:Fc). AçllZlanan yöntemler, ayrlîla, antikorlarI veya bunlari kilarII arIilElIhaslZliçin kullanilâbilmektedir. "Antikor" terimi, herhangi bir izotipin veya bir alt S.- glikosilatlü/eya glikosilatlEblmayan immünoglobulinlerine isaret etmektedir veya aksi belirtilmedikçe insan, InsanlastlEIllBilgl kimerik, multi-spesifik, monoklonal, poliklonal olanlar da dahil olmak üzere spesifik baglanmaya yönelik bütünlüklü antikor ile yarlgian, bunlar. bir antijen baglama bölgesine veya bunlari oligomer veya antijen baglama fragmanlar. isaret etmektedir. Antikorlar, immünoglobulinin herhangi bir sIlEIIIlJIabilmektedir. Bir hedef polipeptitine spesifik antijen baglanmayßaglamaya yeterli olan bir immünoglobulinin en az bir klglnlElEilçeren Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diakorlar, Fd, dAb, maksikorlar, tek zincirli antikor molekülleri, tümleyici belirleme bölgesi (CDR) fragmanlarÇISCFv, diakorlar, triakorlar, tetrakorlar ve polipeptitler gibi bir antijen baglama fragmanEl/eya bölgesine sahip proteinler de buraya dahildir. "Antikor" terimi, antikorun eksprese edilmesi için transfekte edilen bir konak hücreden izole edilen antikorlar gibi rekombinant araçlar ile hazlîllanan, eksprese edilen, meydana getirilen veya izole edilenleri kapsamaktadü ancak bunlarla sIlElilîlegildir. ArIlÜIlâbilen antikorlar. örnekleri, yukari sözü edilen proteinleri ve/veya yandaki antijenleri kapsayan, ancak bunlarla sIlEllElolmayan her bir proteini veya bunlarlEl bir kombinasyonunu gerçeklestirenleri içermekte olup, antijenler sunlardlE CD2, CD3, CD4, CD8, 4 reseptörü, IL-6 reseptörü, IL-13 reseptörü, IL-18 reseptörü alt birimleri, FGL2, PDGF-ß ve TGF, TGF-ßz, TGF-ßl, EGF reseptörü (bkz. 6,235,883 numaralEUS Patent DokümanDîlVEGF reseptörü, hepatosit büyüme faktörü, osteoprotegerin IigandÇlinterferon gama, B lenfosit stimülatörü (BlyS, ayrlEa BAFF, THANK, TALL-1, ve 2TNF4 olarak bilinmektedir; bkz. Do ve antijeni CA125, tümör antijeni MUC1, PEM antijeni, LCG (akciger kanseri ile iliskili olarak eksprese edilen bir gen ürünü), HER-2, a tümörle iliskili glikoprotein TAG-72, the SK-l antijeni, kolon ve/veya pankreas kanserine sahip hastalar. serumlarIaki yükseltilmis seviyelerde bulunan tümör ile iliskili epitoplar, meme, kolon yaplgkan hücre, prostat, pankreatik, akciger, ve/veya böbrek kanseri hücreleri ve/veya melanom, gliyom, veya nöroblastom hücreleri üzerinde, bir tümörün nekrotik çekirdeginde eksprese edilen kanser ile iliskili epitoplar veya proteinler, integrin alfa 4 beta 7, integrin VLA-4, BZ integrinleri, TRAIL reseptörleri 1, 2, 3, ve 4, RANK, RANK IigandÇlTNF-a, yapiskan molekül VAP-l, epitelyal hücre yaplgkan molekülü (EpCAM), interselüler yaplSkan molekül-3 (ICAM-3), Iökointegrin yaplSkanÇIplatelet glikoproteini gp IIb/II-Ia, kardiyak miyosin aglElzinciri, paratiroid hormonu, rNAPc2 (faktör VIIa-doku faktörünün bir inhibitörü), MHC I, karsinoembriyonik antijen (CEA), alfa-fetoprotein (AFP), tümör nekroz faktörür (TNF), CTLA-4 (bir sitotoiksik T lenfosit ile iliskili antijen), Fc-y-1 reseptörü, HLA-DR 10 beta, HLA-DR antijen, L-selektin, Resiratuvar Sinsisyal Virüsü, insan immünyetmeslik virüsü (HIV), hepatit B virüsü (HBV), Streptococcus mutan/arÜ ve Staph/ycoccus aureus. Üretilebilen, bilinen antikorlarI belirli örnekleri, sIlEllandlEllE'iamak üzere sunlarEliçermektedir; adalimumab, bevasizumab, infliksimab, absiksimab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliksimab, belimumab, briakinumab, kanakinumab, sertolizumab pegol, setuksimab, konatumumab, denosumab, ekulizumab, gemtuzumab ozogamisin, golimumab, ibritumomab tiuksetan, Iabetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituksimab, rovelizumab, tosilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, zalutumumab, ve zanolimumab. Protein, proteinin üretilmesi için genetigi degistirilen canlükonak hücreler tarafIdan üretilebilmektedir. Proteinlerin üreilmesi için hücrelerin genetiginin degistirilmesine yönelik yöntemler teknikte iyi bilinmektedir. Bkz. örn. Ausubel ve meslektaslarÇled. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Bu tür yöntemler, proteini kodlayan veya proteinin ekspresyonunu mümkün küân nükleik asitlerin canlEkonak hücrelere verilmesini içermektedir. Bu konak hücreler; bakteriyel hücreler, fungal hücreler veya tercihen kültür içinde çogaltllân hayvan hücreleri olabilmektedir. Bakteriyel konak hücreleri, Escher/'ch/a 60/1' hücreleri içermektedir, ancak bununla sIlEIllIdegildir. Uygun Eco/i' suslarEörnekleri sunlarEl bölemeyen herhangi bir E. ca/i' susu. Kullanüâbilen fungal konak hücreler, Saccharamyces cerevi'siae, P/ch/a pasta/'is ve Asperg//Ius hücrelerini kapsamaktadlü ancak bunlarla sIlElllII degildir. Kullanllâbilen hayban hücre hatlarlEb dair birkaç örnek CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, ve WI38'dir. Yeni hayvan hücresi hatlarlÇlteknikte uzman kisiler tarafIian iyi bilinen yöntemlerin kullanilBiaslýla meydana getirilebilmektedir (örn. transformasyon, viral enfeksiyon ve/veya seleksiyon vasltâslýla). Tercihe baglElolarak, protein konak hücreler tarafIan ortama salgllânabilmektedir. Rekombinant proteini, hücreler taraflEUan üretildikten sonra toplanmaktadlB Proteinin hücreler tarafIan kültür ortam. salgllânmasüdurumunda, santrifüjleme, filtreleme ve/veya flokülasyon gibi bilinen birkaç teknikten herhangi biri vasltâslýla hücreler ve debris, kültür ortamIan giderilmektedir. Rekombinant proteinin hücre duvarlZl/eya hücre zari. içinde toplamasü durumunda, sonraki arIBna islemleri için rekombinant proteinin toplanmasÇlve gerekli olmaslîlzlurumunda çözündürülmesine yönelik bilinen diger yöntemler kullanUIhaktadlE Tipik olarak, afinite kromatografisi, birinci arIlIiina adIiEIolarak kullanllâbilmektedir. Çözeltideki rekombinant protein, bir afinite kromatografi ortam- baglanmaktadB ortam ylklanmaktad lee rekombinant protein, rekombinant proteinin afinite IigandlEb baglanmasII engellenmesi valeisEla ayrlgtlîllîhaktadlîl ArdIdan, rekombinant protein ve bir bulaskan veya ikinci protein olarak afinite Iigandlülçeren, arlgtlîllîl'ißlolan bu numune, yukarlöla daha ayrlEtiIJIlsekilde açlKlandlglELizere bir tentakül anyon degisim kromatografi ortamlZüzerinde bulusun yöntemlerine tabi kHJIîtnaktadlE Rekombinant protein tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlEEi baglandlthan sonra rekombinant protein içeren eluant, bir diger safastlElna adIilEla tabi k-bilmektedir. Alternatif olarak veya ilaveten, rekombinant proteini içeren numune; bulusun yöntemlerinde tentakül anyon degisim matrisi kromatografisine tabi kliltîinadan önce ilave bir arHÜna adIilEla tabi k-bilmektedir. Bu tür arlEldlElna adIilarÇI bir baska anyon degisim kromatografi adIiE(anyon ve/veya katyon, bir baska afinite kromatografi adIilZIbir metal afinite kromatografi adIIÇlbir hidroksiapatit kromatografi adIilÇIbir hidrofobik interaksiyon kromatografi adiÇlbir jel filtreleme (boyut dlgama) kromatografi adIiü/e/veya bir karlgllîl modlu kromatografi reçinesi olabilmektedir. Bu tür kromatografi adIilarüiçin piyasada mevcut olan reçine örnekleri, CHT Seramik Hidroksiapatit Tip II 80 pm parçacilZlEreçine (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA), DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences), Eshmun0® Q (EMD Millipore), Fractogel® SO3 (Merck Millipore), Toyopearl 650- M, ToyoScreen Ether-650M, ToyoScreen PhenyI-650M, ToyoScreen PPG-6OOM (Tosoh Bioscience GmbH), SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences), IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences), ve Q Sepharose Fast Flow'u (GE Healthcare Life Sciences) kapsamaktadlîl ancak bunlarla sIlEllEldegildir. Ilaveten, rekombinant protein, filtreleme vasißislýla tekrar arEtllEllâbilmektedir. Filtreleme, dogrudan (blok veya kek filtreleme gibi) veya teget aklSIEfiltreleme olabilmektedir. Bir yönde, etanersept gibi rekombinant protein, bir Protein A kromatografi ortamlîilizerinden afinite kromatografisine tabi klElElnaktadlE Rekombinant protein ayrlSt-[Etan sonra, rekombinant proteini içeren numune, yukar- açllglandlglîlüzere bulusun yöntemlerinin kullanilBiaslîla bir tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamEI üzerinden arIlEllâbiImektedir. Ancak, rekombinant proteinin tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamlEia tabi kiiihmaslödan önce veya sonra, bir ilave kromatografi adlEI gerçeklestiriIebilmektedir. Örnegin, protein A ve diger bulaskanlarI giderilmesinin artlElIE1asEl için bir sürekli akgl modunda hidroksiapatit kromatografisine, veya anton veya katyon degisimi kromatografisine (sürekli akil] veya baglama veya ayrEtlEina) veya hidrofobik interaksiyon kromatograiisine (sürekli aklgl veya baglama veya ayrlgtlüna) tabi k-bilmektedir. Rekombinant protein tentakül anyon degisim matrisi kromatografi ortamIan ayrlgt-llîtan sonra, protein formüle edilmeden önce yukarlîlla hatlEllatIlglEl üzere ikave arIlEna adular tabi k-bilmektedir veya dogrudan formüle edilebilmektedir. "Formüle edilmis" terimi, proteinin tamponla degistirildigi, sterilize edildigi, kitlesinin paketlendigi ve/veya bir nihai kullanlEEliçin paketlendigi anlamlEb gelmektedir. Bir yapllândlElnada, rekombinant protein, bir farmasötik bilesim içerisinde formüle edilmektedir. Farmasötik bilesimlere yönelik uygun formülasyonlar, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA referanleUa açügananlarübermektedir. Asaglflhki örnekler, örneklendirme vasßslsîla verilmistir ve lellElland Megildir. ÖRNEKLER Örnek 1: Bu deneylerin amacü bulaskan Protein A bir rekombinant protein preparasyonundan etkili bir sekilde giderilirken, mümkün oldugu kadar fazla rekombinant proteinin kurtarllfhasüUEIBir rekombinant protein, etanersept, dönüstürülmüs bir CHO (Çin Hamsteri Yumurtallglmhücre kültüründe eksprese edilmistir ve bir ortamlEl içine salgllânmlgtlü Hücrelerin ortamdan giderilmesinden sonra, baslanglgl olarak etanersept; ortamI bir MabSelect SuReTM Protein A reçine kolonu (GE Healthcare Life Sciences) üzerinden çallStlEllBiaslîla arilîlliilstlîl Slîbn Protein A, bir sandviç ELISA denemesi kullanllârak belirlenmistir. Mikrotitre plakalarüspesihk olarak MabSelect SuRe IigandIa karsEyetisritilen bir yakalama antikoru olarak bir tavuk anti-protein antikoru ile kaplanmlgtE Bloklama ve y[lZlamada adHIaran sonra, biyotinlenmis bir tavuk anti-protein A antikoru, belirleme antikoru olarak kullanilBilstE MabSelect SuReTM Protein A reçine kolonu üzerinden baslangü arlEUlElnaletlan sonra numune içindeki slîan Protein A miktarlZIyakIaslEll ppm ila yaklasllîlZO ppm aral[g]Ia olmustur. Sonraki deneylerde, baslanglgta arIlEllân etanersept, asag-ki kosullar aItIa, bir CHT Seramik Hidroksiapatit Tip II 80 um partiküllü reçine (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA) üzerinden çallStlEllBHStlEl % olarak eksprese edilen tanerseptin verimi, önceki ve sonraki numune yigillîüzerinde ELISA kullanilârak belirlenmistir. Yine % olarak eksprese edilen slîan protein A'nI azaltüBwa miktarÇlyukarlElh açlKIand[g]EI.`izere sandviç ELISA'nI kullanüß1aslýla, Hidroksiapatit kromatografisinden önce ve sonra belirlenmistir. Reçine: Hidroksiapatit Denge Tamponu Yük Yük YEEama Tamponu Ayrlgt. Ayrlîst. Verim S-n Kosulu pH'ü pH Tampon (%) Protein (mS/cm) Kosulu AzaltlEiEI pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Klorür, 100mM Sodyum Klorür, 3M Sodyum Fosfat, pH 3M Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 Sodyum Fosfat Sodyum Fosfat 3mM Sodyum Fosfat, 3mM Sodyum Fosfat, 65mM Sodyum Klorür, 65mM Sodyum Klorür, 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 9mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 12mM Sodyum Fosfat, 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 6mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 9mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, mistir Imemist 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH ir 6mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 12mM Sodyum Fosfat, 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 6mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 6mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 100mM Sodyum Asetat, 12mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 12mM Sodyum Fosfat, 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 9mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 12mM Sodyum Fosfat, 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, mistir Imemist 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH ir 12mM Sodyum Fosfat, 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 25mM Sodyum Fosfat, 25mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 12mM Sodyum Fosfat, 12mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, mistir lmemist 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH ir 3mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 25mM Sodyum Fosfat, 25mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 12mM Sodyum Fosfat, 12mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 pH 6.8 100mM Sodyum Asetat, 100mM Sodyum Asetat, 3mM Sodyum Fosfat, pH 3mM Sodyum Fosfat, pH 6.8 6.8 Hidroksiapatit kromatografisinin bir sürekli aklSI modunda kullanüüiaslýla, slîhn protein A'nI mümkün olmustur. Örnek 2: Görece zayif] olan enyon degisim reçinesi DEAE Sepharose Fast Flow'un (GE Healthcare Life Sciences) kullanilmaslýla, birçok farklEiiampon ve ayrEtlîiina kosulu, asagIki tabloda ayrlEtliând-[giüizere, kesfedilmistir. Etanersept ve protein A konsantrasyonlarü Örnek 1'deki gibi belirlenmistir. Mod/ Yük Yük Ayrlîstlîhia Ayrlgtlihia Ayrßtlîhia Verim Slîian Denge Kosulu pH'EI Tamponu _Tamponu Aklg HIEI (%) Protein A ve YEIiiama (mS/cm) Iletkenligi AzaltlBiEP/u) Tamponu (mS/cm) ma/ 25mM Tris, 150mM NaCl, pH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 150mM NaCl, pH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 175mM NaCl, pH 8 pH 7.5 ma/ 25mM Tris, 175mM NaCl, pH 8 pH 7.5 ma/ 25mM Tris, 125mM NaCl, pH 8 pH 7.5 ma/ 25mM Tris, 125mM NaCl, pH 8 pH 7.5 ma/ 25mM Tris, 100mM NaCl, pH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 100mM NaCl, pH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 250mM NaCl, pH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 100mM NaCl, PH 8 pH 7.4 ma/ 25mM Tris, 100mM NaCl, pH 8 pH 7.4 55mM Sodyum degildir degildir Fosfat ma/ 25mM Tris 100mM pH 7.4 NaCl pH 7.4 ma/ 25mM Tris 150mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 200mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 100mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 150mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 200mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 165mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 ma/ 25mM Tris 165mM NaCl pH 7.4 pH 7.4 Yukarlölaki verilerden anlasI[glEüzere, DEAE Sepharose, belirli kosullar altIa slîbn Protein A'n yüksek bir yüzdesini giderebilmektedir. Ancak, bu kosullar altlEUa, rekombinant protein etanerseptin kurtarlißekistirilmistir. Örnek 3: Bu deneyde, farklüair anyon degisim reçinesi; protein A'yEgiderirken yüksek bir kurtarIi oranIIZIkoruyabilmesine yönelik olarak test edilmistir. Reçine, Merck KGaA, Darmstadt, Germany'nin bir parçasEblan EMD Millipore'da mevcut olan Eshmun0® Q idi. Tüm çallgtlîdnalar, bir baglama ve ayrlgtlElna modunda gerçeklestirilmistir. Reçine: Eshmuno Q Denge Ve YlEama Yük Yük AyrlStlIjna Tamponu ve Verim S-n Protein A AzaltlBiEl Tamponu Kosulu pH'EI Iletkenlik (°/o) (°/o) mS/cm 21 mS/cm mS/cm 21 mS/cm mS/cm 21 mS/cm mS/cm 21 mS/cm Etanerseptin kurtarIiÇl bu reçinenin Protein A'nI azaltllüiasüieterli degildi. kullanilB1asEldurumunda yüksek olmasi ragmen, Örnek 4: Güçlü katyon degistiricisi Fractogel® , asaglöhki tabloda ayrlEttlândlîllân çesitli birçok kosul aItIa test edilmistir. Tüm kosullara yönelik olarak, mod baglama ve ayrlgtlîilna moduydu, dengeleme ve yiElama tamponu 75mM Sodyum Asetattü/e ayrlStlÜna, belirtilen tuz konsantrasyonunda olan bir 100mM Sodyum Asetat tamponu içerisinde 150 cm/sa'te idi. Test Reçinesi: Fractogel 503 Yük pH'E Yük Kosul Ayrßtlîtna AyrlStlIl Ayrßtihia Tamponu Verim Slîan Protein A AzaltlBiE (mS/cm) pH'EI ma Kosulu (mS/cm) (°/o) (°/o) NaCl'si Verimlerden bazUârIlEl, bu deneyde %100 oldugu hesaplanmlStE Ancak, kromatografi adIiII islevindeki bir farkIUJgIa karsi bu, prosedürdeki ve yükün hesaplanmaslîitjaki bir farkIHJIgîElyansHnaktadIE ve isletimin amaçlarüdogrultusunda %100'Iük bir verim olarak allEmlgtlEl Bu reçine ile verimin geneli oldukça yüksek olmas. ragmen, slîlan protein A'nI giderilmesi, test edilen tüm kosullar altIa yetersizdi. Örnek 5: Bu deneyde, birçok farklEhidrofobik interaksiyon kromatografi reçinesi, slîlan protein A'yügiderirken, aynElzamanda rekombinant proteini kurtarIi seviyesini yüksek tutabilme yetileri için test edilmistir. Kolonlarü pH'lEl 3.8 oldugu Sosyum Sitrat ile dengelenmistir ve y[lZlanmlgIlEl(daha yüksek bir yük Ph'Ida gerçeklestirilen ve pH'E5.5 olan 75 mM Sodyum Sitrat ile ylElanan son HIC-ToyoScreen Phenyl-650'nin çallgtlülßîasüjlglüda). Her bir kolon, yaklasllZll mI/dakikada bir sürekli aklgl modunda yüklenmis ve çallgtlElllüîlStlElve yaklasllZl3 kolon hacmi ile yllZlanmlSIlB Reçine: HIC Reçine Alt Yük Yük Ayrlstlîl'n Ayrlstlîl'na Ayrlgtlîina Verim SBan türü Kosulu pH'EI a pH'El tamponu Tamponu (%) Protein A (mS/cm) Kosulu (mS/cm AzaltüiEP/o) 650-M Sitrat, pH 3.8 Eter-650M Sitrat, pH 3.8 Eter-650M Sitrat, pH 3.8 FeniI-650M Sitrat, pH 3.8 Fenil-650M Sitrat, pH 3.8 FeniI-650M Sitrat, pH 3.8 Fenil-650M Sitrat, pH 3 Fenil-650M Sitrat, pH 5.5 Sitrat, pH 3.8 Yüksek miktarlarda rekombinant protein etanerseptin kurtarlEliElmümkün olmus olsa da Protein A azalIiII oldukça az oldugu bu kosullar alt-a gözlemlenmistir. Örnek 6: Güçlü anyon degistiricisi Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences), asaglühki tabloda gösterildigi üzere bir takn kosullar altlEUa test edilmistir. Reçine: Q Sefaroz FF Denge Yük Yük AyrlStIi-:I'na tamponu AyrlStIîina Verim Süan Protein A ve Ylliama Kosulu pH'EI ve ayrßtmna pH'E] Tamponu (°/o) AzaltlBiEP/a) Tamponu (mS/cm) Kosulu NaCl, pH 7.4 NaCl, pH 7.4 NaCl, pH 7.4 NaCl, pH 7.4 NaCl, pH 7.4 NaCl, pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCl pH 7.4 NaCI pH 7 Fosfat pH 6.8 165mM NaCl, pH 6.9 Fosfat pH 6.6 165mM NaCl, pH 6.6 Q Sepharose FF ile slîlan protein A'nI hem verimi hem de giderilmesi, hiçbir kosul altlEkzla yeterli olmamlStlÜ Örnek 7: Diger birkaç reçine baslangiç] deneylerinde (gösterilmeyen) degerlendirilmistir, ancak istenen arIilîrlna ve kurtar! seviyesinin elde edilmesi için oldukça az umut vadetmistir. Dolaylîlýla, burada gösterilen optimizasyon deneylerine tabi kliItîmamStE Örnek 8: Bu deneyde, Fractogel® EMD TMAE HiCap (EMD Millipore), asag-ki tabloda detayland-[giü'jzere çesitli kosullar altlEUa test edilmistir. Asaglki tüm isletimler, bir baglama ve ayrlgtüna modunda gerçeklestirilmistir ve 10, 5 veya 3 kolon hacmi ile ylKhnmlgtlE Reçine: Fractogel® EMD TMAE HiCap Denge Yililama Yük Yük AyrlStlII'na Ayrlgli AyrlStlîhia Verim Slîbn Tamponu Tamponu Kosulu pH'Ei Tamponu ma Tamponu (%) Prot A (mS/cm) Tampon Kosulu Azaltliilîl 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 165mM NaCl, pH 7.6 8 pH 8 165mM NaCl, pH 7.6 8 pH 8 175mM NaCl, pH 7.5 8 pH 8 175mM NaCl, pH 7.5 8 pH 8 175mM NaCl, pH 7.5 8 pH 8 175mM NaCl, pH 7.5 8 pH 8 165mM NaCl, pH 7.6 8 pH 8 165mM NaCl, pH 7.6 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 250mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 250mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8 pH 8 150mM NaCl, pH 7.4 8.5, kosul 6 pH 8.5, kosul 250mM NaCl, 7.5, kosul 6 pH 7.5, kosul 250mM NaCl, 7.5, kosul 4 pH 7.5, kosul 100mM NaCI 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 8.5, kosul 6 pH 8.5, kosul 100mM NaCl, 8.5, kosul 4 pH 8.5, kosul 250mM NaCl, 8.5, kosul 6 pH 8.5, kOSUI 250mM NaCl, 8.5, kosul 4 pH 8.5, kosul 100mM NaCI 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 7.5, kosul 4 pH 7.5, kosul 100mM NaCl, 8, kOSUI 5 pH 8, k0SU| 5 175mM NaCl, 7.5, kosul 6 pH 7.5, kosul 100mM NaCl 7.5, kosul 4 pH 7.5, kosul 100mM NaCI 8.5, kosul 6 pH 8.5, kosul 100mM NaCI, 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 8.5, kosul 4 pH 8.5, kosul 250mM NaCl, 7.5, kosul 6 pH 7.5, kosul 250mM NaCl, 7.5, kosul 4 pH 7.5, kosul 250mM NaCl, 8.5, kosul 4 pH 8.5, kosul 100mM NaCl, 7.5, kosul 6 pH 7.5, kosul 100mM NaCI, 8.5, kosul 6 pH 8.5, kosul 250mM NaCI, 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCI, 8.5, kosul 6 pH 8.5, kosul 100mM NaCl 7.5, kosul 4 pH 7.5, kosul 250mM NaCI, 8, kosul 5 pH 8, kosul 5 175mM NaCl, 8, kOSuI 5 pH 8, kOSUI 5 7.2, kosul 20 33mM NaCl, pH 8, kosul 5 180mM NaCl, pH 8, kosul 5 mS/cm pH 7.2 33mM NaCl, pH 8, kosul 5 180mM NaCl, pH 8, kosul 5 mS/cm pH 7.2 33mM NaCl, pH 8, kosul 5 160mM NaCl, pH 8, kosul 5 mS/cm pH 7.2 8 45mM NaCl, 150mM NaCl, tir PH 8-0 pH 7.4 8 45mM NaCl, 150mM NaCl, tir pH 8.0 pH 7.4 8 45mM NaCl, 150mM NaCl, tir memisti pH 8.0 pH 7.4 r Analiz edilen diger anyon, katron ve hidrofobik interaiksiyon kromatografi reçinelerine kiyasla, Frac-togel® EMD TMAE HiCap, Protein A'yEgiderirken hedef proteinin çok yüksek oranlardaki kurtarIilElIZrnümkün küfnada saslEllEEbir sekilde basarWUüEtraflEla incelenen tüm reçinelerin sonuçlarÇl Sekil 1'de grafige dökülmüstür. Tüç reçinelerinin genel dagEIIEJi grafigi üzerine bindirilmesi, Sekil 2'de gösterilmektedir. Tüm reçinelere yönelik genel egilim, protein A'nI giderimi artlünlîlken verimin azaltlEhasD/önündedir. Ancak, verilerin tamamen optimize edilmis klîlnlEUa, yalnlîta Hidroksiapatit veya Fractogel® EMD TMAE gHiCap reçinelerinden birini kullanan sonuçlarüberen bir"omuz" mevcuttur. Burada açllZIanan belirli yapllândlîmalarßl, bulusun bireysel yönlerinin tekil örnekleri olmaslZl amaçlanmaktadlü Tabii ki, burada gösterilenlere ve açlEIananlara ilaveten bulusun çesitli modifikasyonlarü teknikte uzman kisilere yukar-ki tarifname ve ekli sekiller vaslßslýla anlaslHEhale gelecektir. TR