JP2016513643A

JP2016513643A - 漏出したアフィニティ精製リガンドの除去

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Publication number: JP2016513643A
Application number: JP2016501314A
Authority: JP
Inventors: トレホ，サムエル・レイ; ブレイク，ロバート・ペリー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2016-05-16
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: AU2014240596B2; WO2014159441A1; ES2674697T5; US11492372B2; EP2969099A1; JP6457479B2; SI3395423T1; MX365501B; MX2019006568A; PT2969099T; US20220144886A1; EP3395423B1; DK2969099T4; EP4026596A1; LT2969099T; PL3395423T3; DK3395423T3; CY1120353T1; SI2969099T2; AU2014240596A1

Abstract

本発明は、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を使用して、高レベルの回収を維持しながら、タンパク質調製物から汚染物質の大部分を除去することを可能にする。本発明の方法を使用すると、浸出したアフィニティクロマトグラフィー汚染物質を組換えタンパク質調製物から除去することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国仮出願番号６１／７８５，０３８の利益を主張する。上記出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、タンパク質調製物からの汚染物質の除去の分野にある。一態様において、本発明は、タンパク質調製物からの浸出したアフィニティクロマトグラフィー汚染物質の除去に関する。

アフィニティクロマトグラフィーは、抗体及びＦ_Ｃ−融合タンパク質などのタンパク質の精製のための強力なツールである。しかしながら、タンパク質を治療用途のために製造する場合、アフィニティクロマトグラフィーの間に試料中に浸出し得る、アフィニティ吸着剤の一部として使用されるタンパク質をはじめとする、他のタンパク質の存在が懸念される。加えて、例えば、精製されているタンパク質を産生する宿主細胞由来のタンパク質など、他のタンパク質汚染物質もまた試料中に存在し得る。

プロテインＡ及びＧは、アフィニティクロマトグラフィーによって抗体を精製するためにしばしば用いられる。Ｆｏｒｄｅｔａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ７５４：４２７−４３５。これらのタンパク質は、多くの異なる抗体の定常（Ｆ_Ｃ）部位に結合するため、有用である。ＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位を含む組換え融合タンパク質を、同様の方法を使用して精製することができる。大半のプロテインＡ及びプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー操作では、少量のプロテインＡまたはＧリガンドがアフィニティカラムから浸出し、遊離リガンドまたは目的とするタンパク質と複合したリガンドのいずれかとして溶離液内に行き着く。抗体または融合タンパク質が治療薬に使用される場合、浸出したリガンド及びリガンド／タンパク質複合体は除去されなければならない。

クロマトグラフィー樹脂の製造業者は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、プロテインＡなどの残余汚染物質を除去することを推奨している。例えば、“ＰｒｏｃｅｓｓＳｃａｌｅＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏｔｅ１１−００１１−６４ＡＡ，２００４−１１（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を参照。Ｋｅｌｌｅｙらは、陽イオン交換クロマトグラフィーが、生成物よりも塩基性の弱い不純物が負荷及び洗浄で除去され、塩基性のより強い不純物が溶離中に生成物から分離される、結合溶離モードでより典型的に使用されると報告した。Ｋｅｌｌｅｙｅｔａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄＢｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．１００：９５０−９６３。同じ著者によると、エンドトキシン及び核酸などのポリアニオンは、所望の生成物が通り抜けることを可能にする条件下でカラムに結合され得るため、陰イオン交換クロマトグラフィーは通常、フロースルーモードで操作される（同文献９５０ページ）。フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーはまた、典型的には、宿主細胞タンパク質及びプロテインＡを除去するために使用することもできる（同文献９６１ページ）。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、プロセススケールのタンパク質産生中に浸出したプロテインＡを除去するのに驚くほど有効である。米国特許番号７，４７６，７２２は、目的とするタンパク質の９０％超の回収及び汚染プロテインＡの５．３〜５．４倍の低減を維持しながら、ヒドロキシアパタイトカラムをフロースルーモードで操作することができることを説明している。しかしながら、いくつかの状況において、ヒドロキシアパタイトは、機械的不安定性及び／もしくは低い再利用性が理由で使い勝手が良くない場合があるか、または浸出したプロテインＡのすべてを十分に除去しない場合がある。そのため、タンパク質の回収を最大限にすると同時に浸出したプロテインＡを除去し、それによって組換えタンパク質産生の費用を制御する代替法が当該技術分野において必要とされている。

Ｆｏｒｄｅｔａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ７５４：４２７−４３５ＰｒｏｃｅｓｓＳｃａｌｅＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏｔｅ１１−００１１−６４ＡＡ，２００４−１１（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｋｅｌｌｅｙｅｔａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄＢｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．１００：９５０−９６３

アフィニティクロマトグラフィーは、タンパク質を単離するための非常に有効な技術であるが、１つの欠点は、アフィニティリガンドが、アフィニティクロマトグラフィー媒体から浸出することによって、結果として生じる組換えタンパク質の試料を汚染し得るということである。アフィニティリガンドは、組換えタンパク質と結合するその能力ゆえに選択されるため、組換えタンパク質も失うことなく最終調製物からそれらを除去することは困難であり得る。本発明は、触手状（ｔｅｎｔａｃｌｅ）陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を使用してこの目的を達成する有効で、穏やかで、かつ容易に拡張可能な方法を提供する。特定の機序に縛られることを望むものではないが、陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体の触手状の側面が、本発明の方法に、組換えタンパク質の回収における著しい損失なしにアフィニティリガンドを除去することにおいて、任意の他の種類の陰イオン交換樹脂または実際には大半の樹脂で観測されるよりも予想外に優れた結果をもたらすと考えられる。

したがって、本方法は、一態様において、組換えタンパク質及び該タンパク質に結合する第２のタンパク質を含有する試料からの組換えタンパク質の精製方法であって、組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合するような条件下で試料を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供し、続いて溶離液中でクロマトグラフィー媒体に結合した組換えタンパク質を溶離することを含み、それによって組換えタンパク質の少なくとも８５％が溶離液中で回収され、第２のタンパク質の少なくとも７５％が溶離液から除去される、方法を提供する。一態様において、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体は、強陰イオン官能基を含有する。そのような強陰イオン官能基は、トリメチル−アンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）であり得る。触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体の樹脂基質は、メタクリレートポリマー樹脂またはポリビニルスチレンポリマー樹脂であり得る。上の実施形態の一態様において、クロマトグラフィー媒体はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐである。

上の実施形態のすべてにおいて、本発明の方法を、抗体のＣ_Ｈ２／Ｃ_Ｈ３領域を含有する組換えタンパク質を精製するために使用することができる。そのようなタンパク質を、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー樹脂などのアフィニティカラム上で精製することができる。したがって、本発明の方法を、第２のタンパク質がプロテインＡまたはプロテインＧであるときに使用することができる。上の実施形態のうちのいずれか１つにおいて、試料をタンパク質のアフィニティ精製から獲得することができる。そのようなアフィニティ精製は、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を介し得る。

本発明の上の態様のいずれかにおいて、組換えタンパク質は抗体またはＦｃ融合タンパク質であり得る。上の態様の一実施形態において、組換えタンパク質は、例えば、エタネルセプトなどの腫瘍壊死因子受容体Ｆｃ融合タンパク質である。

任意に、本発明の上の態様のいずれかにおいて、組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合された後、かつ組換えタンパク質が溶離される前に、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を洗浄工程に供することができる。本発明の上の態様のいずれかにおける別の選択肢として、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィーの前及び／または後に、組換えタンパク質をさらなる精製に供することができる。そのような追加の精製工程は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び／または濾過を含むが、これらに限定されない。加えて、本発明の上の態様のすべてにおいて、組換えタンパク質をその後、薬学的組成物に製剤化することもできる。

実施例１〜８から得た示される樹脂それぞれのスクリーニング及び最適化実験のまとめた結果を示す。試験組換えタンパク質であるエタネルセプトの回収は、Ｘ軸上にプロットされる浸出したプロテインＡの低減量パーセントの関数としてＹ軸上にグラフ化される。使用された樹脂が示され、それらは以下の通りであった：ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｑ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨＩＣ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０−Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＥｔｈｅｒ−６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰＰＧ−６００Ｍ（すべてＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＧｍｂＨより））、ＣＨＴＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴｙｐｅＩＩ８０μｍ粒子樹脂（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）。図１内にグラフ化された回収／浸出したプロテインＡの低減量曲線を重ね合わせたものである。グラフ内でそれぞれの樹脂に使用される記号が、図の凡例内に示される。

定義
吸着剤：吸着剤は、クロマトグラフィーを実施するために使用される、固相担体に付着した少なくとも１個の分子であるか、またはそれ自体が固相である少なくとも１個の分子である。

アフィニティクロマトグラフィー：アフィニティクロマトグラフィーは、クロマトグラフ分離をもたらすために、等電点、疎水性、またはサイズなどの分子の一般的性質よりも、生体分子間の特定の可逆的相互作用、例えば、プロテインＡがＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位に結合する能力を利用するクロマトグラフィーである。実際に、アフィニティクロマトグラフィーは、固相担体に付着したタンパク質などの吸着剤を使用して、吸着剤に多少きつく結合する分子をクロマトグラフ上で分離することを伴う。本明細書にその全体が組み込まれる、Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０）ｉｎＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２：３５７−３７９を参照。

クロマトグラフィー：クロマトグラフィーは、異なる分子を多少強く吸着または保持する、吸着剤への混合物の透過によって、混合物中の化学的に異なる分子を互いに分離することである。吸着剤によってより弱く吸着または保持される分子は、より強く吸着または保持される分子が吸着剤から遊離されない条件下で遊離される。

汚染物質：汚染物質は、精製されているタンパク質の試料中に存在する精製されているタンパク質以外の任意の非自己分子または好ましくない分子、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの生体高分子である。汚染物質は、例えば、精製されているタンパク質を分泌する細胞からの他のタンパク質、及びアフィニティクロマトグラフィーの間に試料中に浸出し得る、アフィニティクロマトグラフィーに使用される吸着剤の一部である、プロテインＡなどのタンパク質を含む。

精製する：タンパク質を精製することは、非自己または好ましくない要素、特に、タンパク質の試料中に存在し得るタンパク質またはＤＮＡなどの生体高分子の量を低減することを意味する。非自己タンパク質の存在は、ゲル電気泳動及び染色、ならびに／またはＥＬＩＳＡアッセイを含む任意の適切な方法で分析され得る。ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動及び染色、ならびに／またはポリメラーゼ連鎖反応を用いた分析を含む任意の適切な方法で分析され得る。

分離：タンパク質は、混合物が、タンパク質の分子の少なくとも大部分が第２のタンパク質の分子の少なくとも大部分を含む混合物の部分から除去されるような工程に供されるときに、両方のタンパク質を含む混合物中の第２のタンパク質から分離される。

実質的に類似：本発明の目的上、タンパク質は、アミノ酸配列が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％互いに同一である場合、実質的に類似しており、変更されていないタンパク質の生物活性を所望の様態で維持または変更する。タンパク質が実質的に類似しているかどうかを決定する目的上、同一とみなされるアミノ酸に含まれるのは、生物活性に影響を与える見込みのない保存的置換であるアミノ酸であり、該保存的置換は以下を含む：ＳｅｒからＡｌａ、ＩｌｅからＶａｌ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＧｌｙからＡｌａ、ＴｈｒからＡｌａ、ＡｓｎからＳｅｒ、ＶａｌからＡｌａ、ＧｌｙからＳｅｒ、ＰｈｅからＴｙｒ、ＰｒｏからＡｌａ、ＡｒｇからＬｙｓ、ＡｓｎからＡｓｐ、ＩｌｅからＬｅｕ、ＶａｌからＬｅｕ、ＧｌｕからＡｌａ、ＧｌｙからＡｓｐ、及びこれらの逆の変更。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈｅｔａｌ．，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７９）を参照。２つのアミノ配列の同一性パーセントは、目視検査及び数学的計算によって計算することができ、またはより好ましくは、この比較は、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７）などのコンピュータプログラム、または他の同等のコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。「ＧＡＰ」プログラムのための好ましいデフォルトパラメータは、以下を含む：（１）ＳｃｈｗａｒｔｚａｎｄＤａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，ＡｔｌａｓｏｆＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）によって説明されるようなＧｒｉｂｓｋｏｖａｎｄＢｕｒｇｅｓｓ（（１９８６），Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５）の加重アミノ酸比較マトリックス、または他の同等の比較マトリックス、（２）アミノ酸配列の各ギャップに対する３０のペナルティ、及び各ギャップ内の各記号に対する１の追加ペナルティ、（３）末端ギャップに対するペナルティ無し、（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし。配列比較の当業者によって使用される他のプログラムもまた使用することができる。

本発明の方法の説明
本発明は、タンパク質に結合する第２のタンパク質を含有する試料からの組換えタンパク質の精製方法を提供する。本方法は、組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合するような条件下で、試料を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供し、続いて溶離液中でクロマトグラフィー媒体に結合した組換えタンパク質を溶離することを伴う。本発明の方法を使用して、本発明の発明者らは、第２の汚染タンパク質の少なくとも７５％を除去しながら、溶離液中の組換えタンパク質の少なくとも８５％を回収することができた。実際には、本発明の方法は、多くの条件において、第２の汚染タンパク質の少なくとも８０％を除去すると同時に、溶離液中の組換えタンパク質の少なくとも９０％を回収することができるようなものであった。そのような優れた結果は、工業生産において典型的に使用されるいかなる他の陰イオン、陽イオン、または疎水性相互作用クロマトグラフィーでも不可能であった。特定の機序に縛られることを望むものではないが、陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体の触手状の側面が、本発明の方法に、任意の他の種類の陰イオン交換樹脂または実際には大半の樹脂で観測されるよりも予想外に優れた結果をもたらすと考えられる。

「触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体」という用語は、典型的には、米国特許番号６，３９８，９６２、６，１４９，９９４、５，８６６，６７３、または５，６４７９８７に開示されるような、触手技術を実装する陰イオン交換マトリックスを指す。触手技術を実装する陰イオン交換マトリックスは、通常その表面に、線状ポリマー鎖（触手）によって形成される間座を含み、そこで陰イオン交換活性を有する官能基が触手に結合される、樹脂粒子である。さらなる実施形態において、該触手を形成するポリマー鎖は、アクリルアミドポリマーである。いくつかの実施形態において、官能基は、ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル−）、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノエチル−）、及びＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル−）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、官能基は強陰イオン交換体である。特定の実施形態において、強陰イオン交換体官能基はＴＭＡＥである。

一態様において、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体の樹脂基質は、メタクリレートポリマー樹脂またはポリビニルスチレンポリマー樹脂である。一実施形態において、メタクリレートまたはポリビニルスチレンポリマーは架橋される。本明細書に記載される実施例において、樹脂粒子は、架橋されたメタクリレートポリマーからなる。触手状陰イオン交換マトリックスの例は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＭｅｄＣａｐ（ｍ）、及びＦｒａｃｔｏｐｒｅｐ（登録商標）ＤＥＡＥイオン交換体（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。

一態様において、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体は、（ｉ）メタクリレートポリマーまたはビニルポリマーの樹脂粒子、例えば、架橋メタクリレートポリマーであり得るメタクリレートポリマー、（ｉｉ）アクリルアミド触手が該樹脂粒子の表面に結合され、かつＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル−）基がアクリルアミド触手官能基に結合される、アクリルアミド触手、を含む。

本発明の方法は、第２のタンパク質が、組換えタンパク質が前もって初期精製されたアフィニティクロマトグラフィー媒体からの浸出したタンパク質であるとき、特に有用である。そのため、一実施形態において、組換えタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、前のアフィニティクロマトグラフィー工程の結果として獲得される。現在使用されている最も一般的なアフィニティクロマトグラフィープロテインは、抗体、またはＦｃ融合タンパク質などの抗体のＣ_Ｈ２／Ｃ_Ｈ３領域を含有する他のタンパク質を結合するために使用される、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬＧである。しかしながら、第２のタンパク質は、組換えタンパク質の構造に応じて組換えタンパク質に結合する任意の他のタンパク質であり得る。

プロテインＡは、元来、特にＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位に結合するブドウ球菌の細胞壁内で発見されるタンパク質である。本発明の目的上、「プロテインＡ」は、市販及び／またはプロテインＡの組換え形態を含む、ブドウ球菌プロテインＡと同一、または実質的に類似している任意のタンパク質である。本発明の目的上、実質的な類似性を決定する目的のためのプロテインＡの生物活性は、ＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位に結合する能力である。

プロテインＧは、元来、特にＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位に結合する連鎖球菌の細胞壁で発見されるタンパク質である。本発明の目的上、「プロテインＧ」は、市販及び／またはプロテインＧの組換え形態を含む、連鎖球菌プロテインＧと同一、または実質的に類似している任意のタンパク質である。本発明の目的上、実質的な類似性を決定する目的のためのプロテインＧの生物活性は、ＩｇＧ抗体のＦ_Ｃ部位に結合する能力である。

プロテインＬＧは、プロテインＧ（上の定義を参照）及びプロテインＬの双方の部位を含むＩｇＧ抗体に結合する組換え融合タンパク質である。プロテインＬは、元来、ペプトストレプトコッカスの細胞壁から単離された。プロテインＬＧは、プロテインＬ及びＧの双方からのドメインを結合するＩｇＧを含む。本明細書にその全体が組み込まれる、Ｖｏｌａｅｔａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６。本発明の目的上、「プロテインＬＧ」は、市販及び／またはプロテインＬＧの組換え形態を含む、プロテインＬＧと同一、または実質的に類似している任意のタンパク質である。本発明の目的上、実質的な類似性を決定する目的のためのプロテインＬＧの生物活性は、ＩｇＧ抗体に結合する能力である。

アフィニティ精製に使用され得る市販のプロテインＡクロマトグラフィー媒体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによって産生されるＰｒｏＳｅｐ（登録商標）制御細孔ガラス樹脂、及び元ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅによって産生されるＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）架橋されたアガロース樹脂を含め、数多く存在する。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ及びＰｒｏＳｅｐ樹脂の双方は、２０ｇ／Ｌ超に近い動的結合能力、２００〜６００ｃｍ／時間の範囲におよぶ抗体の商業的量を産生するための直線流速、及び約２〜約１０のｐＨ安定性を有する。双方の種類の樹脂は、尿素及び他の還元剤にさらされるとき、化学的に安定している。本明細書内の発明を例示する実施例において使用されるプロテインＡクロマトグラフィー媒体の種類は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂である。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂は、天然のプロテインＡよりも安定するように遺伝子操作されているプロテインＡの変更した組換え形態を使用する。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム由来のプロテインＡの浸出量も、本発明の方法を使用して除去することができる。さらに別の市販のプロテインＡクロマトグラフィー媒体は、ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）である。市販のプロテインＧクロマトグラフィー媒体の例は、ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）である。本発明の方法は、既知の、及びまだ開発されていないアフィニティ樹脂を使用することを伴う。

本発明のプロセスはまた、いくつかの実施形態において、少なくとも２つの工程を伴うこともできる。第一に、組換えタンパク質は、吸着剤として固相担体に付着した第２のタンパク質を使用して、アフィニティクロマトグラフィーの予備精製工程を経る。第二に、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体は、組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合されるような条件下で実施される。任意の洗浄工程後、組換えタンパク質は、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体から溶離される。タンパク質を精製する全プロセスは、以下に述べられるように、これらの工程それぞれの前及び／または後に他の工程を含み得る。

平衡化及びクロマトグラフィーの前に、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体は、選択される溶液、例えば、塩及び／または緩衝液中で予備平衡化され得る。予備平衡化は、クロマトグラフィー媒体の再生及び／または保存のために使用される溶液を取り替える機能を果たす。当業者は、予備平衡化溶液の組成物が、保存液の組成物及び後のクロマトグラフィーに使用される溶液に依存することを理解するであろう。そのため、適切な予備平衡化溶液は、クロマトグラフィーの実施に使用されるのと同じ緩衝剤及び塩を、クロマトグラフィーを実施するために使用されるよりも高い濃度で含み得る。クロマトグラフィーに使用することができる緩衝剤及び塩は、以下に論じられる。

試料をカラムに適用する前に、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を、タンパク質をクロマトグラフにかけるために使用される緩衝剤及び塩の中で平衡化することができる。以下に論じられるように、クロマトグラフィー（及び精製されるタンパク質の充填）は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸及び／またはクエン酸塩及び／またはトリス、リン酸、クエン酸、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ならびにＭＥＳ緩衝剤を含む、様々な緩衝剤及び塩の中で起こり得る。そのような緩衝剤または塩は、少なくとも約５．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、平衡化はトリスまたはリン酸ナトリウム緩衝剤を含む溶液中で起こり得る。任意に、トリスまたはリン酸ナトリウム緩衝剤は、０．５ミリモル〜約５０ミリモル濃度、より好ましくは約１５ミリモル〜３５ミリモル濃度である。好ましくは、平衡化は少なくとも約５．５のｐＨで起こる。平衡化は、ｐＨ値約６．０〜約８．６、好ましくはｐＨ値約７．０〜８．５で起こり得る。一態様において、この溶液は、約２５ミリモル濃度及びｐＨ約８のトリス緩衝剤を含む。

本発明のいずれのまたはすべてのクロマトグラフ工程は、任意の機械的手段によって実施することができる。クロマトグラフィーはカラム内で実施され得る。カラムは、圧力なしまたはありで、上から下に、または下から上に送液され得る。カラム内の液体の流れの方向は、クロマトグラフィープロセスの間に逆転され得る。クロマトグラフィーはまた、固相担体が、重力、遠心分離、または濾過を含む任意の好適な手段によって、試料を負荷、洗浄、及び溶離するために使用される液体から分離される、バッチプロセスを使用しても実施され得る。クロマトグラフィーはまた、他よりも強力に試料内のいくつかの分子を吸収または保持するフィルタと試料を接触させることによっても実施され得る。

組換えタンパク質を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合させるための条件は、当業者が決定することができ、組換えタンパク質の電荷、及び陰イオン官能基の強度に依存する。任意に、組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合された後、かつ組換えタンパク質が溶離される前に、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を洗浄工程に供することができる。洗浄緩衝剤は、典型的には、試料が調製され、かつ触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供されている、同じ緩衝剤系であるが、当業者は、組換えタンパク質を溶離せずにクロマトグラフィー樹脂を洗浄するための他の緩衝剤条件を決定することができる。洗浄工程が含まれる場合、洗浄の体積は小さいか、または数カラム体積であり得る。しかしながら、典型的には、カラムを、０．５〜１０カラム体積、より典型的には、１〜５カラム体積で洗浄する。組換えタンパク質を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合させ、任意にその媒体を洗浄した後、組換えタンパク質を、伝導率を増加させること及び／または試料をクロマトグラフにかけるために使用される緩衝剤のｐＨを下げることによって溶離する。組換えタンパク質を選択的に溶離することができる緩衝剤条件は、組換えタンパク質の電荷、及び陰イオン基の強度に部分的に依存する。

一実施形態において、組換えタンパク質は、組換え融合タンパク質エタネルセプト（ＣＡＳ登録番号１８５２４３−６９−０）である。エタネルセプトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で産生されるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対するｐ７５ＴＮＦ受容体の可溶性細胞外ドメインの組換え融合であり、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）という商品名でＡｍｇｅｎＩｎｃ．（ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ、ＣＡ）から市販されている。本発明は、組換えタンパク質としてエタネルセプトを使用して以下の実施例によって例示される。本発明の一実施形態において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製されたアフィニティであったエタネルセプトを含む試料は、約ｐＨ８の緩衝剤中で触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供される。そのような緩衝剤は、約ｐＨ８を有するように滴定されているリン酸塩化合物またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）など、このｐＨ範囲で十分に緩和する任意の種類であり得る。好適なトリス緩衝剤は、２０〜３０ｍＭトリス：ＨＣｌ、より好ましくは約２５ｍＭトリス：ＨＣｌである。任意に、エタネルセプトが触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体から溶離される前に、エタネルセプトが媒体に結合されたままである限り、媒体を同じ緩衝剤またはわずかに異なる緩衝剤で洗浄することができる。一態様において、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体は、上の好適なトリス緩衝剤のうちの１つで洗浄される。一態様において、カラムを洗浄するための緩衝液は、約ｐＨ８の２５ｍＭトリスから本質的になる。カラムは、０．５〜５カラム体積、より典型的には１〜３カラム体積で洗浄することができる。

エタネルセプトの触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体への結合、及び任意に洗浄に続き、それは溶離される。組換えタンパク質エタネルセプトを選択的に溶離する任意の条件を使用することができる。一態様において、エタネルセプトは、ｐＨ約６．５〜約８．５、より好ましくは約７．２〜約７．６の溶離緩衝剤中で溶離される。ここでも、トリス及びリン酸塩化合物、ならびに３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びクエン酸緩衝剤を含むが、これらに限定されない、このｐＨ範囲で十分に緩和する任意の緩衝剤種を使用することができる。例えば、溶離緩衝剤は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭトリスＨＣＬ、及び約ｐＨ７〜約ｐＨ８であり得る。一態様において、溶離緩衝剤は、約２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．６である。溶離緩衝剤の一実施形態は、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．２である。加えて、溶離緩衝剤は、ＮａＣｌ及び／または硫酸ナトリウムなどの塩を有し得る。塩の濃度は、０ｍＭ〜５００ｍＭ、または１００〜２００ｍＭの範囲にわたり得る。したがって、別の代替の溶離緩衝剤は、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌである。

本発明の方法を使用して、本発明の発明者らは、汚染第２タンパク質の大部分を除去しながら、所望の組換えタンパク質を非常に高収率で回収することができている。そのため、一態様において、本発明の方法は、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、及び最も好ましくは９５％の、溶離液中の組換えタンパク質の回収をもたらす。同時に、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、依然としてより好ましくは８０％、さらにより好ましくは８５％の第２の汚染タンパク質が溶離液から除去されるか、または上の回収及び除去の任意の組み合わせを達成することができる。

精製の任意の段階における試料のタンパク質濃度は、任意の好適な方法によって決定することができる。そのような方法は、当該技術分野において周知であり、１）Ｌｏｗｒｙアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、Ｓｍｉｔｈアッセイ、及びコロイド金アッセイなどの比色分析法、２）タンパク質のＵＶ吸収特性を利用した方法、及び３）、同じゲル上での既知量のタンパク質標準との比較に依拠して、ゲル上の染色したタンパク質バンドに基づいた目測、を含む。例えば、Ｓｔｏｓｃｈｅｋ（１９９０），ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎ，ｉｎＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１８２：５０−６８を参照。

組換えタンパク質を「精製すること」とは、不要な汚染物質のレベルを減少させることを意味する。本発明の方法において、不要な汚染物質とは第２のタンパク質である。第２のタンパク質、組換えタンパク質と第２のタンパク質との複合体、及び／または精製されている組換えタンパク質の試料中に存在する他のタンパク質を、任意の適切な手法によって監視することができる。好ましくは、該技術は、約０．５百万分の一（ｐｐｍ）（精製されているタンパク質の１ミリグラムごとのナノグラムとして計算される）〜５００ｐｐｍの範囲で汚染物質を検出するほどの高い精度であるべきである。例えば、当該技術分野においいて周知の方法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、第２のタンパク質による組換えタンパク質の汚染を検出し得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｅｎ（１９９４），Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎＢａｓｉｃＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：４６１−４６６を参照。触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィーは、第２のタンパク質による汚染を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍、依然としてより好ましくは少なくとも約１０倍、さらにより好ましくは少なくとも約１５倍、最も好ましくは少なくとも約２０倍低減し得る。好ましくは、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー後の第２のタンパク質による組換えタンパク質の汚染は、約１００ｐｐｍを超えない、より好ましくは約８０ｐｐｍを超えない、より好ましくは約６０ｐｐｍを超えない、より好ましくは約４０ｐｐｍを超えない、より好ましくは約２０ｐｐｍを超えない、より好ましくは約１０ｐｐｍを超えない、より好ましくは約５ｐｐｍを超えない、より好ましくは約１ｐｐｍを超えない、及び最も好ましくは約０．５ｐｐｍを超えない。そのような第２のタンパク質による汚染は、検出不可能なレベル〜約５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ〜約４００ｐｐｍの範囲にわたり得る。組換えタンパク質が薬理学用途のために精製されている場合、患者が１回の投与量につき特定の量の汚染タンパク質を超えて投与されないようにする目的で、当業者は、第２のタンパク質の好ましいレベルが、患者ごとに投与されるタンパク質の投与量に依存し得ることを理解するであろう。そのため、タンパク質の必要投与量が減少すると、第２のタンパク質による汚染のレベルは、おそらくは増加し得る。

本発明は、遺伝子操作技術を使用して産生されたタンパク質である、組換えタンパク質を精製するために使用することができる。好ましくは、タンパク質は、典型的には一度に数グラムの量の生産規模で産生される。本発明によって企図されるような精製を経るタンパク質は、１つ以上の定常抗体免疫グロブリンドメイン（複数可）を含むことができ、単一または複数可変抗体免疫グロブリンドメイン（複数可）を含み得るが、含む必要はない。それは、天然型タンパク質または組換え融合タンパク質であり得る。それは、抗体のＦ_Ｃ部位を含み得る。それは、非抗体タンパク質も含み得る。

本発明の方法を用いて精製することができる組換えタンパク質の例としては、以下のタンパク質のうちの１つのすべてまたは一部と同一または実質的に類似したアミノ酸配列を含むタンパク質を含む：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエイチン、トロンボポエイチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅｅｔａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦカッパＢの受容体活性化因子のためのリガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許番号５８８８１９）、肥満細胞成長因子、幹細胞成長因子（米国特許番号６，２０４，３６３）、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、メガカリオト成長及び発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノーゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６８２；ＲｕｅｇｇａｎｄＰｙｔｅｌａ（１９９５），Ｇｅｎｅ１６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリンオトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（米国特許番号４，６９５，６２３及び４，８９７４７１）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニュートロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病抑制因子、及びオンコスタチン−Ｍ。本発明の方法に従って精製することができるタンパク質の説明は、例えば、ＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅｓ：ＨａｎｄｂｏｏｋｆｏｒＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、全巻（ＡｇｇａｒｗａｌａｎｄＧｕｔｔｅｒｍａｎ，ｅｄｓ．ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、１９９８）、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙａｎｄＬｅｉｇｈ，ｅｄｓ．、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９３）、及びＴｈｅＣｙｔｏｋｉｎｅＨａｎｄｂｏｏｋ、１及び２巻（ＴｈｏｍｐｓｏｎａｎｄＬｏｔｚｅｅｄｓ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、２００３）に見られ得る。

さらに、本発明の方法は、上記のタンパク質のいずれかの受容体、そのような受容体もしくは上記のタンパク質のうちのいずれかのアンタゴニスト、及び／またはそのような受容体もしくはアンタゴニストと実質的に類似したタンパク質、のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質を精製するのに有用であろう。これらの受容体及びアンタゴニストとしては、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ、ｐ５５及びｐ７５と呼ばれる、米国特許番号５，３９５，７６０及び米国特許番号５，６１０，２７９）の双方の形態、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（タイプＩ及びＩＩ；欧州特許番号０４６０８４６、米国特許番号４，９６８，６０７、及び米国特許番号５，７６７，０６４）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許番号６，３３７，０７２）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許番号５，９８１，７１３、６，０９６，７２８、及び５，０７５，２２２）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許番号０３６７５６６及び米国特許番号５，８５６，２９６）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病抑制因子のための受容体、ＮＦカッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許番号６，２７１，３４９）、オステオプロテゲリン（米国特許番号６，０１５，９３８）、ＴＲＡＩＬのための受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４を含む）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が挙げられる。

酵素活性タンパク質またはそれらのリガンドもまた、本発明を使用して精製することができる。例としては、以下のタンパク質もしくはそれらのリガンド、またはそれらのうちの１つに実質的に類似したタンパク質のうちのすべてもしくは一部を含むタンパク質が挙げられる：ＴＮＦ−α変換酵素、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポプロテインＡ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α１−アンチトリプシン、上記酵素のうちのいずれかのためのリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそれらのリガンドを含む、ジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼファミリーメンバー。

本発明はまた、例えば、上記タンパク質のうちのいずれかを含む組換え融合タンパク質を精製するために使用することもできる。例えば、上記タンパク質のうちの１つに加えてロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部位、または実質的に類似したタンパク質などの多重体化ドメインを含む組換え融合タンパク質を、本発明の方法を使用して産生することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８、Ｌｏｖｅｊｏｙｅｔａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１２８８−１２９３、Ｈａｒｂｕｒｙｅｔａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１−０５、Ｈａｒｂｕｒｙｅｔａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ３７１：８０−８３、Ｈａｋａｎｓｓｏｎｅｔａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：２５５−６４を参照。そのような組換え融合タンパク質の中でも特に含まれるのは、上のタンパク質のうちのいずれかを含むタンパク質の一部が抗体のＦｃ部位に融合されるタンパク質である。そのようなタンパク質の例は、エタネルセプト（ｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃ）及びベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）である。

本発明はまた、抗体またはそれらの部位を精製するために使用することもできる。「抗体」という用語は、任意のイソタイプもしくはサブクラスのグリコシル化された及びグリコシル化されていない双方の免疫グロブリン、または、特定の結合のためのインタクト抗体と拮抗するその抗原結合領域を指し、別途指定されない限りは、ヒト、ヒト化、キメラ、多選択性、単一クローン性、多クローン性、及びそのオリゴマーもしくは抗原結合フラグメントを含む。抗体は免疫グロブリンの任意のクラスであり得る。さらに含まれるのは、目的とするポリペプチドに特定の抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、単鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、及びポリペプチドなどの抗原結合フラグメントまたは領域を有するタンパク質である。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされる宿主細胞から単離される抗体など、組換え法によって調製、発現、作成、または単離されるものを含むが、これらに限定されない。

本発明の方法を使用して精製することができる抗体の例としては、上記タンパク質及び／または以下の抗原を含むが、これらに限定されないタンパク質のうちのいずれか１つまたは組み合わせを認識するものを含むが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びその類似体（米国特許番号５，２７２，０６４及び５，１４９，７９２参照）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許番号６，２３５，８８３参照）ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ；ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、及びｚＴＮＦ４としても知られる；ＤｏａｎｄＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照）、補体Ｃ５、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌と関連して発現される遺伝子産物である）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸及び／もしくは膵臓癌を有する患者の血清内に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、鱗状細胞、前立腺、膵臓、肺及び／もしくは腎臓癌細胞上、及び／または黒色腫、神経膠腫、もしくは神経芽細胞腫に発現した癌関連エピトープもしくはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）付着因子、血小板糖プロテインＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（因子ＶＩＩａ−組織因子の阻害剤である）、ＭＨＣＩ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、連鎖球菌ミュータンス、ならびに黄色ブドウ球菌。本発明の方法を使用して産生することができる既知の抗体の具体例としては、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セトリズマブペゴール、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。

タンパク質は、タンパク質を産生するために遺伝子操作されている生きた宿主細胞によって産生することができる。タンパク質を産生するために細胞を遺伝子操作する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照。そのような方法は、タンパク質をコードし、その発現を可能にする核酸を生きた宿主細胞に導入することを含む。これらの宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、または、好ましくは、培養物中で成長した動物細胞であり得る。細菌宿主細胞は、大腸菌細胞を含むが、これに限定されない。好適な大腸菌株の例としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、及び外来性ＤＮＡを切断できない任意の大腸菌株が挙げられる。使用することができる真菌宿主細胞としては、出芽酵母、ピキアパトリス、及び麹菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる動物細胞株のいくつかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、及びＷＩ３８である。新規動物細胞株は、当業者によって周知の方法を使用して樹立することができる（例えば、形質転換、ウイルス感染、及び／または淘汰によって）。任意に、タンパク質を宿主細胞によって媒体中に分泌させることができる。

組換えタンパク質は、細胞によって産生された後、収穫される。タンパク質が細胞によって培地中に分泌される場合、細胞及び破壊片は、遠心分離、濾過、及び／または凝集などの多くの既知の技術によって培地から除去される。組換えタンパク質が細胞壁または細胞膜の内部に集まる場合、他の既知の方法を使用して、組換えタンパク質を収集し、必要ならば、その後の精製作業のために可溶化する。

典型的には、アフィニティクロマトグラフィーを第１の精製工程として使用することができる。溶液中の組換えタンパク質をアフィニティクロマトグラフィー媒体に結合し、その媒体を洗浄し、該組換えタンパク質を、組換えタンパク質のアフィニティリガンドへの結合を崩壊させることによって溶離する。組換えタンパク質、及び汚染物質または第２のタンパク質としてアフィニティリガンドを含有するこの溶離した試料は、次いで、上により詳しく記載されるように、触手状陰イオン交換クロマトグラフィー媒体上で本発明の方法に供される。

組換えタンパク質が触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体から溶離された後、組換えタンパク質を含む溶離液を、さらなる精製工程に供することができる。代替的に、または加えて、組換えタンパク質を含有する試料を、本発明の方法における触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィーに供する前に、追加の精製工程に供することができる。そのようなさらなる精製工程は、別のイオン交換クロマトグラフィー工程（陰イオン及び／または陽イオン）、別のアフィニティクロマトグラフィー工程、金属アフィニティクロマトグラフィー工程、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、ゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィー工程、及び／または混合モードクロマトグラフィー樹脂であり得る。そのようなクロマトグラフィー工程のための市販の樹脂の例としては、ＣＨＴＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴｙｐｅＩＩ８０μｍ粒子樹脂（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｑ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０−Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＥｔｈｅｒ−６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰＰＧ−６００Ｍ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＧｍｂＨ）、ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＭＡＣＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、組換えタンパク質を濾過によってさらに精製することができる。濾過は、直接（ブロックまたはケーク濾過など）であり得るか、または接線流濾過であり得る。

一態様において、エタネルセプトなどの組換えタンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を介してアフィニティクロマトグラフィーに供される。組換えタンパク質が溶離された後、組換えタンパク質を含有する試料を、上に記載されるような本発明の方法を使用して、触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を介して精製することができる。しかしながら、組換えタンパク質を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供する前または後に、追加のクロマトグラフィー工程を実施することができる。例えば、組換えタンパク質を、プロテインＡ及び他の汚染物質の除去を強化するためにフロースルーモードでヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに、または陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（フロースルー、または結合溶離）に、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（フロースルー、または結合溶離）に供することができる。

組換えタンパク質を触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィーから溶離した後、タンパク質を、それが製剤化される前に、上に記されるようにさらなる精製工程に供することができ、またはそれを直接製剤化することができる。「製剤化される」という用語は、タンパク質が、緩衝剤交換される、滅菌される、大量包装される、及び／または最終ユーザのために包装されることを意味する。一実施形態において、組換えタンパク質は、薬学的組成物中に製剤化される。薬学的組成物のための好適な製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈｅｄ．１９９５、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されるものを含む。

以下の実施例は、例示の目的で提示されるものであって限定するものではない。

実施例１：これらの実験の目的は、できる限り多くの組換えタンパク質を回収しながら、汚染プロテインＡを組換えタンパク質調製物から有効に除去することであった。組換えタンパク質であるエタネルセプトを、形質転換したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞培養物中で発現させ、媒体中に分泌させた。媒体から細胞を除去した後、エタネルセプトを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を介して媒体を送液されることによって初期精製した。浸出したプロテインＡを、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。マイクロタイタープレートを、特にＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅリガンドに対して産生された捕捉抗体としてのニワトリ抗プロテインＡ抗体でコートした。ブロッキング及び洗浄工程後、ビオチン標識されたニワトリ抗プロテインＡ抗体を検出抗体として使用した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂カラムを介した初期精製後の試料中の浸出したタンパク質の量は、約１ｐｐｍ〜約２０ｐｐｍの範囲に及んだ。

次の実験では、初期精製されたエタネルセプトを、以下の条件下で、ＣＨＴＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴｙｐｅＩＩ８０μｍ粒子樹脂（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を介して送液された。％で表されるエタネルセプトの収率を、試料収集の前後にＥＬＩＳＡを使用して決定した。さらに％で表される浸出したプロテインＡの低減量を、上に記載されるサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前後に決定した。

フロースルーモードでヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、エタネルセプトタンパク質の９０％超を回収しながら、浸出したプロテインＡの８０％超を除去することができた。

実施例２：比較的弱い陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、様々な異なる緩衝剤及び溶離条件を以下の表に詳述されるように調査した。エタネルセプト及びプロテインＡの濃度を実施例１のように決定した。

上のデータから分かるように、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅは、特定の条件下で、浸出したプロテインＡを高い割合で除去することができる。しかしながら、それらの条件下では、組換えタンパク質エタネルセプトの回収に影響が出た。

実施例３：この実験では、異なる陰イオン交換樹脂について、高い回収率を維持しながらプロテインＡを除去するその能力を試験した。樹脂は、ＭｅｒｃｋＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙの一部門であるＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されているＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｑであった。すべての送液は結合溶離モードにあった。

この樹脂を使用したエタネルセプトの回収は高かったが、プロテインＡの低減は十分ではなかった。

実施例４：強陽イオン交換体Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）もまた、以下の表に詳述される多種多様な条件の下で試験した。すべての条件において、モードは結合溶離であり、平衡化及び洗浄緩衝剤は７５ｍＭ酢酸ナトリウムであり、溶離は、示される塩濃度（ｍＭで表される）の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤中１５０ｃｍ／時間であった。

この実験において、収率のうちのいくつかは、１００％超であると計算された。しかしながら、これは、クロマトグラフィー工程の機能における違いではなく、負荷の手順及び計算における違いを反映しており、送液の目的上、１００％収率と見なされた。この樹脂を用いた収率は全体的に非常に高かったが、浸出したプロテインＡの除去は、試験したすべての条件下で不十分であった。

実施例５：この実験では、いくつかの異なる疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂について、組換えタンパク質の高いレベルの回収を維持しながら浸出したプロテインＡを除去するその能力を調べた。カラムを平衡化し、クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．８で洗浄した（より高い負荷ｐＨで行われ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５で洗浄した、最後のＨＩＣ−ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰｈｅｎｙｌ−６５０泳動を除く）。それぞれのカラムに負荷し、約１ｍｌ／分のフロースルーモードで送液し、約３カラム体積で洗浄した。

大量の組換えタンパク質エタネルセプトを回収することができたが、これらの条件下では、プロテインＡの非常に少ない低減が観測された。

実施例６：強陰イオン交換体、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）もまた、以下の表に例示されるような多数の条件下で試験した。

ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦでは、収率及び浸出したプロテインＡの除去の双方が、いずれの条件下においても十分ではなかった。

実施例７：多数の他の樹脂を、初期実験（示されていない）で評価したが、所望のレベルの精製及び回収を達成する見込みをほとんど示さなかった。それ故に、それらは、ここに示される最適化実験に供されなかった。

実施例８：この実験では、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、以下の表に詳述されるような様々な条件下で試験した。以下の送液のすべては、結合溶離モードで行われ、１０、５、または３カラム体積で洗浄した。

分析された他の陰イオン、陽イオン、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と比べて、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐは、目的とするタンパク質の非常に高い回収を可能にしながらプロテインＡを除去することに驚くほど優れていた。精査された樹脂のすべてからの結果を、図１内にグラフ化した。樹脂のすべてを１つの全体的な散布図に重ね合わせたものを図２に示した。すべての樹脂における一般的な傾向は、プロテインＡの除去が増加するにつれて収率が減少することである。しかしながら、本データの完全に最適化された部分には、ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｐｔｉｔｅまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐ樹脂のいずれかを使用した結果のみを含む「ショルダー」がある。

本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示を意図した本明細書内に記載される特定の実施形態によって範囲が制限されるものではなく、機能的に同等の方法及び構成要素が本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示される、及び記載されるものに加えて、本発明の様々な変形形態が、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変形形態は、添付の特許請求項の範囲内に入ることが意図される。

Claims

組換えタンパク質と前記タンパク質に結合する第２のタンパク質とを含む試料から前記組換えタンパク質を精製するための方法であって、前記組換えタンパク質が触手状（ｔｅｎｔａｃｌｅ）陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合するような条件下で前記試料を前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供し、続いて溶離液中で前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記組換えタンパク質を溶離することを含み、それによって前記組換えタンパク質の少なくとも８５％が前記溶離液中で回収され、前記第２のタンパク質の少なくとも７５％が前記溶離液から除去される、方法。
前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体が強陰イオン官能基を含有する、請求項１に記載の方法。
前記強陰イオン官能基がトリメチル−アンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）である、請求項２に記載の方法。
前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体の樹脂基質が、メタクリレートポリマー樹脂またはポリビニルスチレンポリマー樹脂である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記クロマトグラフィー媒体が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＴＭＡＥＨｉＣａｐである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えタンパク質が、抗体のＣ_Ｈ２／Ｃ_Ｈ３領域を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記第２のタンパク質が、プロテインＡまたはプロテインＧである、請求項６に記載の方法。
前記試料が、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を介して前記タンパク質のアフィニティ精製から獲得される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えタンパク質が、抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えタンパク質が腫瘍壊死因子受容体Ｆｃ融合タンパク質である、請求項９に記載の方法。
前記タンパク質がエタネルセプトである、請求項１０に記載の方法。
前記試料が、約ｐＨ８で前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に供される、請求項１１に記載の方法。
前記組換えタンパク質が前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体に結合された後、かつ前記組換えタンパク質が溶離される前に、前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体が洗浄工程に供される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記洗浄工程が、前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体を約ｐＨ８の緩衝液で洗浄することを含む、請求項１３に記載の方法。
前記緩衝液が、約ｐＨ８の２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）から本質的になる、請求項１４に記載の方法。
前記組換えタンパク質が、約７．２〜約７．５のｐＨの溶離緩衝剤中で前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィー媒体から溶離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記溶離緩衝剤が２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．２である、請求項１５に記載の方法。
前記溶離緩衝剤が２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌである、請求項１５に記載の方法。
前記組換えタンパク質が、前記触手状陰イオン交換マトリックスクロマトグラフィーの前または後にさらなる精製工程に供される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えタンパク質が薬学的組成物に製剤化される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。