TH33047B - กรรมวิธีสำหรับการผลิตของ rDSPA ?1 - Google Patents

Abstract

DC60 (07/11/54) rDSPA อัลฟา1 (recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator ) ได้รับ การผลิตขึ้นมาในปริมาณเชิงการค้าและมีความบริสุทธิ์ที่พอเหมาะสำหรับมาตรฐานทางคลินิก กรรมวิธีการผลิตใช้ประโยชน์ชุดต่อเนื่องของขั้นตอนโครมาโทกราฟี: โครมาโทกราฟีเชิงแลกเปลี่ยน แคตไอออนที่ต่อตามมาโดยไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน โครมาโทกราฟี และสิ้นสุดลงด้วย โครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ rDSPA 1 (recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator ) ได้รับ การผลิตขึ้นในปริมาณเชิงการค้าและมีความบริสุทธิ์ที่พอเหมาะสำหรับมาตรฐานทางครินิก กรรมวิธีการผลิตใช้ประโยชน์ชุดต่อเนื่องของขั้นตอนโครมาโทกราฟี; โครมาโทกราฟิเชิงแลกเปลี่ยน แคตไอออนที่ตามมาโดยไฮโโรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน โครมาโทกราฟี และสิ้นสุดลงด้วย โครมาโทรากฟีเชิงแอฟฟินิตี้

Claims (18)

1.กรรมวิธีสำหรับการทำให้รีคอมบิแนนท์ เดสมอนดูส โรตุนดูส ซาลิวารี พลาสมิโนเจน แอคทิเวเทอร์ (recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)(rDSPA 1) บริสุทธิ์จากอาหารเลี้ยงเชื้อชีวภาพ กรรมวิธีประกอบรวมด้วย ดังต่อไปนี้ (a) การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ที่มีค่า pH ระหว่าง 4 และ 7; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตึนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารป่นเปื้อนที่ไม่ใช้โปรตีน (C) การชะ rDSPAO 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน อย่างเลือกจำเพาะ (d)เติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้น (c)ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซินที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5; (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์เรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน, (f)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินอย่างเลือกจำเพาะ, (g)การเติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้นตอน(f) ในเรซินโครมาโทกราฟี เชิงแอฟฟินิตี้ที่มีค่า pH และความแข็งแรงเชิงไอออนต่ำ (h) การล้างเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ อย่างเลือกจำเพาะเพื่อการผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ในสารละลายแอคเควียส

2. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื่อชีวภาพเป็นอาหารเลี้ยงเชื่อที่ได้รับ การวางเงื่อนไข

3. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนในขั้นตอน (a)ถูก ประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล -อะก้าโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล

4.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ถูกประกอบรวม ด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคของซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนต์ กับโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ซึ่งซึ่งกลุ่ม อะมิโนของโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล

5.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 3,ที่ซึ่งภาวะการโหลดในขั้นตอน (a) รวมถึงสารเติมอาหาร เลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 7

6.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 4 ที่ซึ่งการชะของ rDSPA 1 ในขั้นตอน (c)ได้รับการ ปฎิบัติ โดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaC1 ระหว่าง 100 มิลลิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์

7. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ที่ซึ่ง ไฮโโรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินในขั้นตอน (d) เป็นเรซินไม่มีประตู ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับสายแอลคิลของ 1-10 คาร์บอนในความยาว

8. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยอนุภาค ซิลิกาเจล ,อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมสทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว

9.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลม กึ่งแข็ง ซึ่ถูกสังเคราะห์โดยโคพอลิเมอไรเซชันของเอทิลีนไกลคอล และพอลิเมอร์แบบชนิด แมทาคริเลท ซึ่งถูอนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล

10.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9 ที่ซึ่ง ภาวะการโหลดในขั้นตอน (d)รวมถึงการเติม อิลูเอนต์จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5

11.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9, ที่ซึ่ง ความเข้มข้นเอทานอล คือ 29 %

12.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1, ที่ซึ่ง เรซินโคมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ของขั้นตอน (g) ถูกประกอบรวมด้วยโคพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิลเด็กซ์แทรนแและ N,N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ75 ไมครอน

13.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12, ที่ซึ่ง บีดสามารถแยกส่วนโกลลูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน

14.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12 ,ที่ซึ่งการชะในขั้นตอน (i)ได้รับการปฏิบัติโดยใช้ บัฟเฟอร์ซึ่งมี ไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์

15.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งประกอบรวมต่อไปด้วยการทำให้สารละลายแอคเควียส ของ rDSPA 1 เข้มข้น

16.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 15 ,ประกอบรวมต่อไปด้วยการไลโอฟิไลส์สารละลาย เข้มข้น rDSPA 1

17.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งกรรมวิธีประกบอรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 7 ในเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออน ซึ่งประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล , อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือ พอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออนโดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียวฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaCl ระหว่าง 100 มิบบิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์ (d)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5 ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งประกอบด้วยอนุภาคซิลิกาเจล,อะกาโรสที่ถูก เชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซิน โดยใช้บัฟเฟอร์ซึ่งมี HCl 20 มิลลิโมลาร์ (g)การเติมอิลูเอนทฺซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (f) ในเรซินโครมาโทกราฟีเชิง แฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ซึ่งเชื่อมขวางแล้วของแลวลิลเด็กซ์แทรน และ N, N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีนในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ 75 ไมครอน (h)ล้างโครมาโทกราฟีเรซินเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควึยส

18.กรรมวิธีสำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ rDSPA 1 จากอาหารเลี้ยงเชื้อ ชีวภาพ ซึ่งกรรมวิธีประกอบรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ระเบียบวิธีการสำหรับการแยกและการทำให้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH 5 ในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ซึ่งถูก ประกอบรวมด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนท์กับพอลิเอทิลีนอิมีน ไซเลน, ที่ซึ่งกลุ่มอะมิโนได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนที่ค่า pH5 ด้วย NaOAc 100 มัลลิโมลาร์ และ NaPO4 50 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินและเปลี่ยนแคตไอออนด้วย บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และไซเดียมคลอไรด์ 500 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 (d)การเติมอิลูเอนท์ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c) ที่ค่า pH 4 ใน ไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลมกึ่งแข็ง ที่ถูกสังเคราะห์ โดยโคพอลิเมอร์ไรเซชันของเอทิลีน ไกลคอลอละพอลิเมอร์แบบชนิดเมทาคริเลทที่ผ่านการทำให้เกิด อนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ และจากนั้นด้วย HCl 20 มัลลิโมลาร์ ซึ่งมี EtoH 19% เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะ rDSPAO l ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีเอทานอล 29% และกรดไฮโดรคลอริก 20 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH 2.5; (g)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA l จากขั้นตอน (f) ที่ค่า pH 2.5 ในเรซิน โครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิล เด็กซ์แทรน และ เรซิน N,N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ซึ่งแยกโกลบูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน (h)การล้างโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่ โปรตีน (i)การชะ rDSPA1 ที่ได้รับจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควียส