Claims (18)
1.กรรมวิธีสำหรับการทำให้รีคอมบิแนนท์ เดสมอนดูส โรตุนดูส ซาลิวารี พลาสมิโนเจน แอคทิเวเทอร์ (recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)(rDSPA 1) บริสุทธิ์จากอาหารเลี้ยงเชื้อชีวภาพ กรรมวิธีประกอบรวมด้วย ดังต่อไปนี้ (a) การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ที่มีค่า pH ระหว่าง 4 และ 7; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตึนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารป่นเปื้อนที่ไม่ใช้โปรตีน (C) การชะ rDSPAO 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน อย่างเลือกจำเพาะ (d)เติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้น (c)ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซินที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5; (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์เรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน, (f)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินอย่างเลือกจำเพาะ, (g)การเติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้นตอน(f) ในเรซินโครมาโทกราฟี เชิงแอฟฟินิตี้ที่มีค่า pH และความแข็งแรงเชิงไอออนต่ำ (h) การล้างเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ อย่างเลือกจำเพาะเพื่อการผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ในสารละลายแอคเควียส1. Procedure for purifying recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator (rDSPA 1) from bioculture medium. The procedure consisted of the following: (a) adding the culture medium to a cation exchange resin with a pH between 4 and 7; (b) washing the cation exchange resin to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants; (c) selective elution of the rDSPA 1 captured by the cation exchange resin; (d) adding the aluminate containing rDSPA 1 from step (c) to a hydrophobic interaction resin with a pH between 3 and 5. (e) Washing of the hydrophobic interresin to remove non-rDSPA1 proteins and non-protein contaminants, (f) Selective elution of rDSPA1 bound by the hydrophobic interaction resin, (g) Addition of aluents containing rDSPA1 from step (f) into affinity chromatography resin with low pH and ionic strength, (h) Washing of the affinity chromatography resin to remove non-rDSPA1 proteins and non-protein contaminants, (i) Selective elution of rDSPA1 bound by the affinity chromatography resin for the production of purified rDSPA1 in aqueous solution.
2. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื่อชีวภาพเป็นอาหารเลี้ยงเชื่อที่ได้รับ การวางเงื่อนไข2. Procedure of Claim 1, whereby the biological culture medium is a conditioned culture medium.
3. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนในขั้นตอน (a)ถูก ประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล -อะก้าโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล3. The procedure of claim 1, in which the cation exchange resin in step (a) is incorporated with crosslinked silica gel-agarose particles or crosslinked methacrylate polymers which have been derivativeized with carboxyl or carboxyalkyl groups.
4.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ถูกประกอบรวม ด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคของซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนต์ กับโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ซึ่งซึ่งกลุ่ม อะมิโนของโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล4. The procedure of claim 1, in which a cation-exchange resin is assembled with a matrix of silica particles covalently bonded to polyethyleneiminesilane in which the amino groups of polyethyleneiminesilane have been derivativeized with carboxyl groups.
5.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 3,ที่ซึ่งภาวะการโหลดในขั้นตอน (a) รวมถึงสารเติมอาหาร เลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 75. Procedure of claim 3, where the loading conditions in step (a) include the addition of culture medium at a pH between 4 and 7.
6.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 4 ที่ซึ่งการชะของ rDSPA 1 ในขั้นตอน (c)ได้รับการ ปฎิบัติ โดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaC1 ระหว่าง 100 มิลลิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์6. The procedure of claim 4 in which the elution of rDSPA 1 in step (c) is performed using a buffer containing 50 millimolar sodium phosphate and between 100 millimolar and 500 millimolar NaC1.
7. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ที่ซึ่ง ไฮโโรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินในขั้นตอน (d) เป็นเรซินไม่มีประตู ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับสายแอลคิลของ 1-10 คาร์บอนในความยาว7. The procedure of claim 1 in which the hydrophobic interaction resin in step (d) is a gateless resin which has been derivativeized with an alkyl chain of 1-10 carbons of length
8. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยอนุภาค ซิลิกาเจล ,อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมสทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว8. The procedure of claim number 7, where an uncharged resin is incorporated with crosslinked silica gel particles, crosslinked agarose, or crosslinked polymer mestachylate.
9.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลม กึ่งแข็ง ซึ่ถูกสังเคราะห์โดยโคพอลิเมอไรเซชันของเอทิลีนไกลคอล และพอลิเมอร์แบบชนิด แมทาคริเลท ซึ่งถูอนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล9. The procedure of claim number 7, in which an uncharged resin assembled with semi-solid spherical beads is synthesized by copolymerization of ethylene glycol and a methacrylate polymer derivative with butyl groups.
10.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9 ที่ซึ่ง ภาวะการโหลดในขั้นตอน (d)รวมถึงการเติม อิลูเอนต์จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 510. Procedure of claim 9 in which the loading condition in step (d) includes the addition of ilulent from step (c) at a pH between 3 and 5.
11.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9, ที่ซึ่ง ความเข้มข้นเอทานอล คือ 29 %11. Procedure of Claim 9, where the ethanol concentration is 29%.
12.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1, ที่ซึ่ง เรซินโคมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ของขั้นตอน (g) ถูกประกอบรวมด้วยโคพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิลเด็กซ์แทรนแและ N,N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ75 ไมครอน12. The procedure of claim 1, in which affinity resin of step (g) is assembled with crosslinked copolymers of allyldextran and N,N'-methylene bisacrylamine in the form of beads with diameters between 25 and 75 microns.
13.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12, ที่ซึ่ง บีดสามารถแยกส่วนโกลลูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน13. The procedure of claim 12, in which the bead can separate globular protein fragments between 20,000 and 8,000,000 kilodaltons.
14.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12 ,ที่ซึ่งการชะในขั้นตอน (i)ได้รับการปฏิบัติโดยใช้ บัฟเฟอร์ซึ่งมี ไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์14. The procedure of claim 12, in which the elution in step (i) is performed using a buffer containing 200 millimolar glycine.
15.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งประกอบรวมต่อไปด้วยการทำให้สารละลายแอคเควียส ของ rDSPA 1 เข้มข้น15. The procedure for claim 1, which includes further concentration of the aqueous solution of rDSPA 1.
16.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 15 ,ประกอบรวมต่อไปด้วยการไลโอฟิไลส์สารละลาย เข้มข้น rDSPA 116. The procedure for claim 15, including the lyophilization of a concentrated rDSPA 1 solution.
17.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งกรรมวิธีประกบอรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 7 ในเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออน ซึ่งประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล , อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือ พอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออนโดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียวฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaCl ระหว่าง 100 มิบบิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์ (d)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5 ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งประกอบด้วยอนุภาคซิลิกาเจล,อะกาโรสที่ถูก เชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซิน โดยใช้บัฟเฟอร์ซึ่งมี HCl 20 มิลลิโมลาร์ (g)การเติมอิลูเอนทฺซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (f) ในเรซินโครมาโทกราฟีเชิง แฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ซึ่งเชื่อมขวางแล้วของแลวลิลเด็กซ์แทรน และ N, N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีนในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ 75 ไมครอน (h)ล้างโครมาโทกราฟีเรซินเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควึยส17. The procedure of claim 1, which includes the following steps: (a) Addition of culture medium at a pH between 4 and 7 to a cation exchange resin containing silica gel particles, crosslinked agarose, or crosslinked methacrylate polymers that have been derivatized with carboxyl or carboxyalkyl groups; (b) Washing of the cation exchange resin to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants; (c) Specific elution of rDSPA 1 captured from the cation exchange resin using a buffer containing 50 millimolar sodium phosphate and between 100 millimolar and 500 millimolar NaCl; (d) Addition of an eluent containing rDSPA 1 from step (c) at a pH between 3 and 5 to a hydrophobic interaction resin containing silica gel particles, crosslinked agarose, or crosslinked methacrylate polymers that have been derivatized with carboxyl or carboxyalkyl groups; or crosslinked polymethacrylate polymer (e) Washing of hydrophobic interaction resin to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants (f) Specific elution of rDSPA 1 captured from hydrophobic interaction resin using a buffer containing 20 millimolar HCl (g) Addition of eluents containing rDSPA 1 from step (f) into affinity chromatography resin assembled with crosslinked polymer of lyle dextran and N,N'-methylene bisacrylamine in bead form with diameters between 25 and 75 microns (h) Washing of affinity chromatography resin to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants (i) Elution of rDSPA 1 captured from affinity chromatography resin Using a buffer containing 200 millimolar glycine at a pH between 4 and 5, pure rDSPA1 was produced in the Aquifer solution.
18.กรรมวิธีสำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ rDSPA 1 จากอาหารเลี้ยงเชื้อ ชีวภาพ ซึ่งกรรมวิธีประกอบรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ระเบียบวิธีการสำหรับการแยกและการทำให้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH 5 ในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ซึ่งถูก ประกอบรวมด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนท์กับพอลิเอทิลีนอิมีน ไซเลน, ที่ซึ่งกลุ่มอะมิโนได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนที่ค่า pH5 ด้วย NaOAc 100 มัลลิโมลาร์ และ NaPO4 50 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินและเปลี่ยนแคตไอออนด้วย บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และไซเดียมคลอไรด์ 500 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 (d)การเติมอิลูเอนท์ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c) ที่ค่า pH 4 ใน ไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลมกึ่งแข็ง ที่ถูกสังเคราะห์ โดยโคพอลิเมอร์ไรเซชันของเอทิลีน ไกลคอลอละพอลิเมอร์แบบชนิดเมทาคริเลทที่ผ่านการทำให้เกิด อนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ และจากนั้นด้วย HCl 20 มัลลิโมลาร์ ซึ่งมี EtoH 19% เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะ rDSPAO l ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีเอทานอล 29% และกรดไฮโดรคลอริก 20 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH 2.5; (g)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA l จากขั้นตอน (f) ที่ค่า pH 2.5 ในเรซิน โครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิล เด็กซ์แทรน และ เรซิน N,N'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ซึ่งแยกโกลบูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน (h)การล้างโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่ โปรตีน (i)การชะ rDSPA1 ที่ได้รับจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควียส18. A procedure for the isolation and purification of rDSPA 1 from a biological culture medium, which includes the following steps: Procedure for isolation and purification (a) Addition of the culture medium at pH 5 to a cation exchange resin incorporated with a matrix of silica particles covalently bonded to polyethyleneimine silane, in which the amino groups have been derivativeized with carboxyl groups. (b) Washing the cation exchange resin at pH 5 with 100 millimolar NaOAc and 50 millimolar NaPO4 at pH 7.5 to remove non-rDSPA1 proteins and non-protein contaminants. (c) Eluution of the rDSPA1 captured from the cation exchange resin with a buffer containing 50 millimolar sodium phosphate and 500 millimolar sodium chloride at pH 7.5. (d) Addition of the eluent containing rDSPA1 from step (c) at pH 4 to the hydrophobic interaction resin, which was assembled with semi-solid spherical beads synthesized by copolymerization of ethylene glycol and a methacrylate polymer derivative with butyl groups. (e) Washing the hydrophobic interaction resin with 20 millimolar HCl and then with 20 millimolar HCl containing 19% EtoH to remove non-rDSPA1 proteins and non-protein contaminants; (f) Eluent of the rDSPA1 bound from the hydrophobic interaction resin with a buffer containing 29% ethanol and 20 millimolar hydrochloric acid at pH 2.5; (g) Addition of the eluent containing rDSPA1 from step (f) at pH 2.5 in the affinity chromatography resin assembled with the crosslinked polymer of allyl dextran and N,N'-methylene bisacrylamine resin. (h) Affinity chromatography was washed with 20 millimolar HCl to remove non-rDSPA1 proteins and non-protein contaminants. (i) The rDSPA1 captured from the affinity chromatography resin was eluted with a buffer containing 200 millimolar glycine at a pH between 4 and 5 to produce purified rDSPA1 in aqueous solution.