Claims (8)
1.กรรมวิธีสำหรับการทำให้รีคอมบิแนนท์ เดสมอนดูส โรตุนดูส ซาลิวารี พลาสมิโนเจน แอคทิเวเทอร์ (recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)(rDSPA 1) บริสุทธิ์จากอาหารเลี้ยงเชื้อชีวภาพ กรรมวิธีประกอบรวมด้วย ดังต่อไปนี้ (a) การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ที่มีค่า pH ระหว่าง 4 และ 7; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตึนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารป่นเปื้อนที่ไม่ใช้โปรตีน (C) การชะ rDSPAO 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน อย่างเลือกจำเพาะ (d)เติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้น (c)ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซินที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5; (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์เรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน, (f)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินอย่างเลือกจำเพาะ, (g)การเติมอลูเอนต์ที่มี rDSPA 1 จากขั้นตอน(f) ในเรซินโครมาโทกราฟี เชิงแอฟฟินิตี้ที่มีค่า pH และความแข็งแรงเชิงไอออนต่ำ (h) การล้างเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ อย่างเลือกจำเพาะเพื่อการผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ในสารละลายแอคเควียส 2. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื่อชีวภาพเป็นอาหารเลี้ยงเชื่อที่ได้รับ การวางเงื่อนไข 3. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนในขั้นตอน (a)ถูก ประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล -อะก้าโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล 4.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1,ที่ซึ่งเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ถูกประกอบรวม ด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคของซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนต์ กับโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ซึ่งซึ่งกลุ่ม อะมิโนของโพลิเอทิลีนอิมีนไซเลน ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล 5.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 3,ที่ซึ่งภาวะการโหลดในขั้นตอน (a) รวมถึงสารเติมอาหาร เลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 7 6.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 4 ที่ซึ่งการชะของ rDSPA 1 ในขั้นตอน (c)ได้รับการ ปฎิบัติ โดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaC1 ระหว่าง 100 มิลลิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์ 7. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ที่ซึ่ง ไฮโโรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินในขั้นตอน (d) เป็นเรซินไม่มีประตู ซึ่งได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับสายแอลคิลของ 1-10 คาร์บอนในความยาว 8. กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยอนุภาค ซิลิกาเจล ,อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมสทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว 9.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 7, ที่ซึ่ง เรซินไม่มีประจุซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลม กึ่งแข็ง ซึ่ถูกสังเคราะห์โดยโคพอลิเมอไรเซชันของเอทิลีนไกลคอล และพอลิเมอร์แบบชนิด แมทาคริเลท ซึ่งถูอนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล 1 0.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9 ที่ซึ่ง ภาวะการโหลดในขั้นตอน (d)รวมถึงการเติม อิลูเอนต์จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5 11.Process for purification of recombinant Desmodus rotundus salivary plasminogen activator (rDSPA 1). From bio-culture medium The process includes the following: (a) the addition of culture media to cation exchange resins with a pH between 4 and 7; (b) Cation exchange resin washing to remove prototypes other than rDSPA 1 and non-protein contaminants (C), rDSPAO 1 leaching bonded from cation exchange resins. Selectively (d) Add rDSPA 1 alu from step (c) to the hydrophobic interface. Action resin at pH between 3 and 5; (e) Hydrophobic inter resin wash to remove non-rDSPA 1 protein and non-protein contamination, (f) hydrophobic rDSPA 1 leaching. Interaction Selective resin, (g) Adding an alu with rDSPA 1 from the (f) step to the chromatographic resin. Affinity with low pH and ionic strength (h) .Affinity chromatographic resin washing to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants. (i) rDSPA 1 leaching bonded from anffinity chromatographic resin. Specifically, for the production of pure rDSPA 1 in an Acquias solution. 1, where bio-based cultures are obtained Placement of conditions 3. Process of claim clause 1, where the cation exchange resin in the (a) step is assembled with silica gel particles. - Crossed Agarose Or polymethacrylate polymer Crossed Which is obtained through the derivative of the carboxyl group Or carboxylkyl 4. Method of Claims Clause 1, where the cation exchange resin is composed of a matrix of silica particles. Covalent grip With polyethylene, imine, silane Which group Amino of polyethylene, imine silane Through the derivative of the carboxyl group 5. Process of Claims Clause 3, where loading conditions in step (a) include feed additives The culture was cultured at pH values between 4 and 7. 6. Procedure of claim 4, where the rDSPA 1 elution in the (c) procedure was performed using a buffer. Which contains 50 mmol of sodium phosphate and NaC1 between 100 mmolar and 500 mmolar. 7. Procedure of claim 1 where the hyrofobic interaction resin in Step (d) is a doorless resin. It undergoes an alkyl derivative of 1-10 carbon in length 8. Method of claim 7, where the non-ionic resin is composed of silica gel particles, agarose. Crossed Or polymethacrylate polymer that has been cross-linked 9. Procedure of claim 7, where the non-ionic resin is composed of semi-rigid spherical beads synthesized by ethylene glycol copolymerization. And methacrylate polymers, which are derivative with butyl group 1 0. Procedure of claim 9, where loading conditions at the step (d) includes addition Illuents from step (c) at a pH value between 3 and 5 1.
1.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 9, ที่ซึ่ง ความเข้มข้นเอทานอล คือ 29 % 11. Process of claim No. 9, where the ethanol concentration is 29% 1.
2.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1, ที่ซึ่ง เรซินโคมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ของขั้นตอน (g) ถูกประกอบรวมด้วยโคพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิลเด็กซ์แทรนแและ N,N\'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ75 ไมครอน 12. Procedure of claim 1, where the step (g) co-chromatography co-chromatography is composed of a cross-linked copolymer of L. Lil Dextran and N, N \ '- methylene Bisacrylamine In the form of beads with a diameter between 25 and 75 microns.
3.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12, ที่ซึ่ง บีดสามารถแยกส่วนโกลลูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน 13.Procedure of Clause 12, where beads can separate the protein globular between 20,000 and 8,000,000 kD
4.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 12 ,ที่ซึ่งการชะในขั้นตอน (i)ได้รับการปฏิบัติโดยใช้ บัฟเฟอร์ซึ่งมี ไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ 14. Process of claim Article 12, where the elimination in the process (i) be treated using Buffer, which contains 200 mmolar glycine 1.
5.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งประกอบรวมต่อไปด้วยการทำให้สารละลายแอคเควียส ของ rDSPA 1 เข้มข้น 15. Procedure for claim 1, which is further incorporated by concentrating the rDSPA 1-acrylate 1 solution.
6.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 15 ,ประกอบรวมต่อไปด้วยการไลโอฟิไลส์สารละลาย เข้มข้น rDSPA 1 16. Procedures of claim 15, further comprise the rDSPA 1 1 concentrate lyophilisation.
7.กรรมวิธีการของข้อถือสิทธิข้อ 1 ,ที่ซึ่งกรรมวิธีประกบอรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 7 ในเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออน ซึ่งประกอบรวมด้วยอนุภาคซิลิกาเจล , อะกาโรสที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว หรือ พอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว ได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล หรือคาร์บอกซิแอลคิล; (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินแลกเปลี่ยน แคตไอออนโดยใช้บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียวฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และ NaCl ระหว่าง 100 มิบบิโมลาร์ และ 500 มิลลิโมลาร์ (d)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c)ที่ค่า pH ระหว่าง 3 และ 5 ในไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งประกอบด้วยอนุภาคซิลิกาเจล,อะกาโรสที่ถูก เชื่อมขวางแล้ว หรือพอลิเมทาคริเลทพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้ว (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินเพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะอย่างจำเพาะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์ แอคชันเรซิน โดยใช้บัฟเฟอร์ซึ่งมี HCl 20 มิลลิโมลาร์ (g)การเติมอิลูเอนทฺซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (f) ในเรซินโครมาโทกราฟีเชิง แฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ซึ่งเชื่อมขวางแล้วของแลวลิลเด็กซ์แทรน และ N, N\'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีนในรูปแบบของบีดด้วยเส้นผ่าศูนย์กลางระหว่าง 25 และ 75 ไมครอน (h)ล้างโครมาโทกราฟีเรซินเชิงแอฟฟินิตี้เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (i)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควึยส 17. Procedure for Clause 1, where the process is combined with the following steps. (a) The addition of the culture medium at a pH between 4 and 7 in a cation exchange resin consisting of silica gel particles, cross-linked agarose or polymer methacrylate polymer. Crossed Through the derivative of the carboxyl group Or carboxylkyl; (b) Cation exchange resin washing to remove non-rDSPA 1 protein and non-protein contaminants. (c) Specific elution, rDSPA 1 bonded from exchange resins. Cation using buffers Where there is a single-phosphate 50 mmolar and NaCl between 100 mbimolar and 500 mmolar (d), the addition of an iL with rDSPA 1 from step (c) at a pH between 3 and 5, in hydrophobic interaction resin Which contains silica gel particles, Cross linked Or polymethacrylate polymer that has been cross-linked (e) Hydrophobic interaction resin washing to remove non-rDSPA 1 protein and non-protein contaminants. (f) Specific leaching rDSPA 1 bonded from hydrophobic interactivity resin using a buffer containing 20 mmolar HCl (g) Adding aniluent with rDSPA 1 from step (f) in oriented chromatography resin. Ffiniti is composed of lildextran cross-linked polymers and N, N \ '- methylene bisacrylamine to form Of the beads with a diameter of between 25 and 75 microns (h). Washed the chromatographic resin in the affinity to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants (i). RDSPA 1 leaching. That were bonded from an effect chromatographic resin With a buffer containing 200 mm of glycine at a pH between 4 and 5 to produce pure rDSPA 1 in an equus 1 solution.
8.กรรมวิธีสำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ rDSPA 1 จากอาหารเลี้ยงเชื้อ ชีวภาพ ซึ่งกรรมวิธีประกอบรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ระเบียบวิธีการสำหรับการแยกและการทำให้ (a)การเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่า pH 5 ในเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออน ซึ่งถูก ประกอบรวมด้วยเมทริกซ์ของอนุภาคซิลิกา ซึ่งจับยึดแบบโคเวเลนท์กับพอลิเอทิลีนอิมีน ไซเลน, ที่ซึ่งกลุ่มอะมิโนได้ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์กับกลุ่มคาร์บอกซิล (b)การล้างเรซินแลกเปลี่ยนแคตไอออนที่ค่า pH5 ด้วย NaOAc 100 มัลลิโมลาร์ และ NaPO4 50 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (c)การชะ rDSPA 1 ที่ได้รับการจับยึดจากเรซินและเปลี่ยนแคตไอออนด้วย บัฟเฟอร์ ซึ่งมีโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ และไซเดียมคลอไรด์ 500 มิลลิโมลาร์ที่ค่า pH 7.5 (d)การเติมอิลูเอนท์ซึ่งมี rDSPA 1 จากขั้นตอน (c) ที่ค่า pH 4 ใน ไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซิน ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยบีดทรงกลมกึ่งแข็ง ที่ถูกสังเคราะห์ โดยโคพอลิเมอร์ไรเซชันของเอทิลีน ไกลคอลอละพอลิเมอร์แบบชนิดเมทาคริเลทที่ผ่านการทำให้เกิด อนุพันธ์กับกลุ่มบิวทิล (e)การล้างไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชันเรซินด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ และจากนั้นด้วย HCl 20 มัลลิโมลาร์ ซึ่งมี EtoH 19% เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และ สารปนเปื้อนที่ไม่ใช่โปรตีน (f)การชะ rDSPAO l ที่ได้รับการจับยึดจากไฮโดรโฟบิกอินเทอร์แอคชัน เรซินด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีเอทานอล 29% และกรดไฮโดรคลอริก 20 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH 2.5; (g)การเติมอิลูเอนท์ ซึ่งมี rDSPA l จากขั้นตอน (f) ที่ค่า pH 2.5 ในเรซิน โครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ซึ่งถูกประกอบรวมด้วยพอลิเมอร์ที่ถูกเชื่อมขวางแล้วของแอลลิล เด็กซ์แทรน และ เรซิน N,N\'-เมทิลีน บิสอะคริลอะมีน ซึ่งแยกโกลบูลาร์โปรตีนระหว่าง 20,000 และ 8,000,000 กิโลดอลตัน (h)การล้างโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ด้วย HCl 20 มิลลิโมลาร์ เพื่อกำจัดโปรตีนที่ไม่ใช่ rDSPA 1 และสารปนเปื้อนที่ไม่ใช่ โปรตีน (i)การชะ rDSPA1 ที่ได้รับจับยึดจากเรซินโครมาโทกราฟีเชิงแอฟฟินิตี้ ด้วยบัฟเฟอร์ ซึ่งมีไกลซีน 200 มิลลิโมลาร์ ที่ค่า pH ระหว่าง 4 และ 5 เพื่อผลิต rDSPA 1 บริสุทธิ์ใน สารละลายแอคเควียส8. Procedures for the separation and purification of rDSPA 1 from bio-culture media. The process includes the following steps: Methodology for separation and impregnation (a) The addition of the culture medium at pH 5 to the cation exchange resin which is composed of a matrix of silica particles. Which binds covalent to polyethylene imine silane, where amino groups undergo derivative action with carboxyl groups. (b) Washing cation exchange resin at pH5 with NaOAc 100 mullimolar and NaPO4 50 mmolar at pH 7.5 to remove non-rDSPA 1 proteins and non-protein contaminants (c ) Resins-bonded rDSPA 1 leaching and cation conversion with buffers containing 50 mmolar of sodium phosphate and 500 mmolar sydium chloride at pH 7.5 (d). An illuent with rDSPA 1 from step (c) at pH 4 in hydrophobic interaction resin. Which is composed of a round, semi-solid bead Synthetic By the copolymerization of ethylene Glycol polymers, a methacrylate-treated type Derivatives with butyl groups (e) Washing hydrophobic interaction resin with 20 mm HCl and then with HCl 20 mullimolar containing 19% EtoH to remove non-rDSPA 1 protein; and Non-protein contaminants (f), rDSPAO l leaching obtained from hydrophobic interaction. Resin with buffer, which contains 29% ethanol and 20 mmolar hydrochloric acid at pH 2.5; (g) The addition of an illuent containing rDSPA l from step (f) at pH 2.5 in an affinity chromatography resin incorporated with the polymer being welded. Crossed of allyldextran and N, N \ '- methylene resin Bisacrylamine Which separates the globular protein between 20,000 and 8,000,000 kodalton (h). 20 mm HCl chromatographic purification to remove non-rDSPA 1 proteins; and Non-protein contaminants (i), rDSPA1 leaching obtained from buffer chromatographic resins with 200 mmolar glycine at a pH between 4 and 5 To produce pure rDSPA 1 in an acqueais solution.