SU989867A1 - Штамм облигатно-метилотрофной бактерии @ @ ВСБ-792 - Google Patents

Abstract

Штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methylophllus БСБ-792 (коллекци  Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов №ЦМПМ В-1946 - продуцент белково-витаминцой биомассыГ (Л

Description

Изобретение относитс  к области микробиологического синтеза белка и физиологически-активных соединений и представл ет собой новый штамм бактерий - продуцент белкововитаминной биомассы на основе метанола . Получение микробной биомассы на основе метанола - один из эффективных путей обеспечени  народного хоз йства и, в первую очередь, животноводства белково-витаминными концентратами. Планами развити  народного хоз йства предусматриваетс  организаци  крупнотоннажного промыш ленного производства микробной биомассы из метанола, как источника кормового белка и витаминов. Создание отечественного фонда культур, активно растущих за счет метанола и обладающих ценными дл  производства признаками,  вл етс  необходимым условием развити  такого производства и представл ет собой важную народнохоз йственную задачу. Известно много различных штаммов бактерий-метилотрофов, способных развиватьс  за счет метанола СО Систематика этих бактерий мало разработана и многие из селекционированных штаммов их авторы относ т к новым видам и даже новым родам, не описанным в существующих определител х, в частности в наиболее полном определителе бактерий (Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1974,8-th Edition,Balt more, USA) , Большинство известных штаммов метилотрофных бактерий охарактеризовано , однако, лишь в услови х периоди ческого культивировани  или не представл ет практического интереса благодар  недостаточно высоким дл  промьшшенного применени  показател м. Из числа известных штаммов основна  масса принадлежит факультативным метилотрофам, способным помимо мета нола потребл ть источники углерода, содержащие два и более углеродных атома. Значительно меньше найдено облиг ных метилотрофов, хорошо растущих только за счет одноуглеродных соеди нений, в частности метанола, В СССР штаммов облигатных метило трофов нет, а дл  получени  белково витаминной биомассы из метанола предложены два факультативно-метшютрофных штамма Pseudomonas methanolica sp, nev, и КИ-4 C2j. Но эти штаммы очень неустойчивы к инфицирующей микрофлоре, полностью вытесн ютс  посторонней микрофлорой из процесса, обладают сравнительно низкой скоростью роста, растут при скорости протока 0,16-0,18 ч с невысоким выходом биомассы (около 40%), уступа  по указанным показател м облигатнометилотрофным штаммам, предлагаемым за рубежом. Наиболее близким к предложенному штамму по технической сущности, физиолого-биохимическим и культуральным признакам  вл етс  облигатно-метилотрофный штамм Methylobacillus glucogenes gen, nov, sp, nov, pj, Это облигатный метилотроф и облигатный аэроб, хорошо растущий на минеральной среде с метанолом при и рН 6,8-7,0, Из источников углерода использует только метанол и метиламин. Морфологически, представл ет собой неподвижные на всех стади х палочки, размером 0,5-0,8x1,0-1,6 мкм, встречающиес  поодиночке и парами, спор не образует. Окраска по. Грамму отрицательна , тест на каталазу положительный. Колонии на синтетической среде с метанолом округлые диметром около 0,4 мм, блест щие, гладкие, непигментированные. Мол рное содержание гуанина и цитозина в ДНК составл ет 54,1 мол рных %, Поли- -оксимасл ной кислоты не накапливает , но в определенных услови х лимита по азоту образует гликогеноподобнсге вещество. Оптимальна  температура - 30, при 37°С рост прекращаетс . При оптимальных значени х температуры и рН (около 7) максимально короткое врем  удвоени  составл ет 2,9-3,5 ч, что соответствует скорости роста 0,28-0,43 ч ., Штамм испытан при периодическом выращивании в услови х качалочных опытов. По выходу биомассы и содержанию в ней белка штамм не охарактеризован , К недостаткам штамма, которые вы вл ютс  даже в услови х периодического выращивани , относ тс  недостаточно высока  скорость роста и низкий температурный оптимум, Цель изобретени  состоит в селекции нового штамма метитотрофных бактерий с улучшенными свойствами. Дл  достижени  цели предложен штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methylophilus ВСБ-7 ( коллекци  Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ) - продуцент белково-витамин ной биомассы. Пример 1. Предлагаемый штамм Methylobacillus raethylophil ВСБ-792 выделен из бактериального комплекса, спонтанно образовавшегос  в процессе непрерывной ферментации метанола в нестерильных услови  при рН 6,8-7,0. Идентификацию предлагаемого штам ма проводили по определителю бактерий (Bergeys manual of. Determ. 3act.,8-th. Ed. Bait. USA) и описа ни м облигатных метилотрофов в оригинальных стать х, перечисленных в табл. 1. Из таблицы видно, что по сумме признаков предлагаемый штамм ВСБ-792 ближе всего подходит к облигатно-мети отрофным бактери м рода Methylobacillus. Предлагаемый штамм как и бактерии рода Methylobacillus , помимо р да общих с други ми облигатными метилотрофами призна ков, отличает отсутствие подвижности , отсутствие пигментации и близкое мол рное соотношение в ДНК сумм гуанина и цитозина. На основании сходства морфологических и культуральных признаков за вл емый штамм ВСБ-792 отнесен к роду Methylobacil lus и на основании имеющихс  отличий от единственного известного вида этого рода Methylobacillus glucogenes (см. таблицу) определен как новый вид Methylobacillus methylophilus sp. nov. Штамм Methylobacillus methylophi lus ВСБ-792 депонирован в центральной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика Главного управлени  микробиологической промьш1ленности при Совете Министров СССР под номером ЦМПВ В-1946. Штамм ВСБ-792 характеризуетс  следующими свойствами. Морфологические признаки. Клетки в форме палочек с закругленными концами, расположенное пооди ночке или попарно, могут образовывать длинные нити, неподвижны, жгути 74 ки не обнаружены, Р.азмеры односуточных клеток с синтетической среды 0,3-0 ,5 X 1,5-1,8 мкм, размножаютс  бинарным делением, спор не образуют. Окраска по Грамму отрицательна . Колонии на агаризованной синтетической среде с метанолом округлые до мм в диаметре, выпуклые, с гладким краем, блест щие, полупрозрачные, непигментированные. Физиологические и культуральные признаки. Облигатный аэроб, максимум роста при рН 6,8-7,0 и температуре 30-35, хорошо растет при З7с. Облигатный метилотроф. Не использует соединени  с двум  и более углеродными атомами: спирты (этанол, пропанол, изо-пропанол , н-бутанол, изо-бутанол, амиловый и изоатиловый спирты, глицерин, маннит, дульцит), органические кислоты (формиат, ацетат, оксапат, гликолат , пируват, лактат, пропионат, сукцинат, бутират, фумарат, малат, малеат,о -кетоглутарат, цитрат), сахара (глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, ксилозу лактозу, мальтозу , рамнозу). Из С-соединений хорошо растет только на метаноле. Метан, метиламины, формальдегид и формиат не потребл ет. Не растет на обычных средах - молоке , м со-пептонном агаре (МПА), м сопептонном бульоне (МПБ), м сопептонной желатине. В качестве источника азота использует соли аммони , хуже нитраты. Нитриты из нитратов не образует. Сероводород, индол, поли- 5 оксимасл ную кислоту не образует, но может вьщел ть в среду большое количество слизи (полисахариды ) . Ауксоавтотроф, в витаминах и других дополнительных факторах роста не нуждаетс . Тесты на каталазу и оксидазу положительны. Мол рное содержание гуанина и цитозина в ДНК составл ет 55,7+0,4 мол рных %. Предлагаемый штамм ВСБ-792 непатогенен . Штамм ВСБ-792 хорошо растет на инеральных средах с метанолом с ысокой скоростью роста до D 0,5 ч (врем  удвоени  до 2 ч) , арактеризуетс  высоким выходом иомассы, который может превьш1ать 0% к заданному метанолу, и высоким одержанием белка (сырой протеин) более 80% к сухому весу,.а также соединенный витаминной и коферментной природы, в частности витамина BZ до 100 мкг/г, из них до 70 мкг/г в коферментной форме в виде флавина дениндинуклеотида (ФАД), а также более 1000 мкг/г никотинамиддинукле отида (НАД-кофермента), Штамм стабилен при непрерывном выращивании, легко поддерживаетс  в лабораторных услови х, нелизогене Предлагаемый штамм Methylobacillus methyloph. ВСБ-792 отличаетс  от наиболее близкого прототипа Methylobacillus glucogenes по следующим признакам: не использует, мети амин, не накапливает гликогеноподоб ного вещества при дефиците азота, обладает более высокой скоростью роста - Д 0,5 , вместо Д -0,280 ,34 ч у прототипа (или по минимальному времени удвоени  - 2 ч по сравнению с 2,9 ч у прототипа) хорошо растет в более широком интерва ле температур: у прототипа при рост прекращаетс , а за вл емы штамм продолжает развиватьс  при 37-38 С. Вли ние температуры на рос за вл емого штамма представлено в табл. 2. Из таблицы видно, что предлагаемый штамм ВСБ-792 одинаково хорошо растет при 30 и , а при 38С отмечаетс  лишь небольшое снижение выхода. Пример 2. Штамм Methylobacillus -methylophilus ВСБ-792 выращивали непрерывным способом в асептических услови х в лаборатор ных аппаратах 0,7 л с полезным объемом 0,3 л при рН 6,8-7,0 и на среде состава г/л: О FeS04 -7Н,,0 inso4 MnSO -SHjO 0 НзРО(70%) 58 мл Концентраци  метанола в притоке составл ла 1%. Источником азота слу жил акв4иак, который вводили по мере подкислени  среды. Выращивание проводили при скорое ти протока Д-0,25 ч В этих услови выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу соста л л в среднем 52%, Биомасса содержала в пересчете на абсолютно сухое вещество 85% сырого протеина, 106:мкг/г витамина В, 70 мкг/л флавинадениндинуклеотида (ФАД) 1200 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД), 3-8% липидов. Пример 3. Штамм Methylobacillus methyloph ВСБ-792 культивировали так же как в примере 1, Но при , при той же, что в примере 1 скорости протока Д-0,25 ч , Выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу составл л 52%. Пример 4. Штамм Methylobacillus methylophil. ВСБ-792 культивировали в тех же услови х, что и в примере 1, но при температуре выращивани  З8с. Выход биомассы к заданному-метанолу составл л 47%. Пример 5. Штамм Methylobacillus methylophil ВСБ-792 культивировали тем же способом, что и в примере 1, но в аппаратах емкостью 30 л, в нестерильных услови х и скорость протока доводили до Д-0,4 ч. Выход биомассы по абсолютно сухому веществу при скорости протока Д-0,4 ч составл л 54% к заданному метанолу, содержание сырового протеина доходило до 85%. За 140 ч выращивани  в нестерильных услови х штамм не вытесн лс  из процесса инфицирующей микрофлорой и не мен л своих свойств. Пример 6. Штамм Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 культивировали так же и в тех же аппаратах, что в примере 4, но скорость протока доводили до Д-0,5 . Выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу при Д - ,0,5 ч составл л 46%. Таким образом, селекционирован новый штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methyloph. ВСБ-792 с улучшенными свойствами, способный активно развиватьс  на средах с метанолом с высокой скоростью роста до Д-0,5 ч, в широких пределах температуры до 38С с оптимумом 30-35С и обеспечивать высокий выход биомассы, более 50% к заданному метанолу. Штамм образует более 80% сырого протеина, а также ценные соединени  витаминной и кофе ментной природы, в частности, витамин Bj около 100 мкг/г сухого веса, в том числе около 70 мкг/г в виде I флавинадениндинуклеотида (ФАД) и более 1000 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД-кофермент), Штамм выдел ет в среду в определенных услови х большие количества полисахарида , который может иметь практическое значение. Штамм Methylobacillus methylophi ВСБ-792 представл ет собой первую в СССР культуру облигатно-метилотро ных бактерий. Этот штамм, как продуцент белково-витаминной биомассы, не уступает по промьшшенно-Ценным свойствам лучшим зарубежным штаммам облигатно-метилотрофных бактерий, предлагаемым дл  производства микро ной биомассы на основе метанола и по некоторым показател м превосходит их. За вл емый штамм имеет существенные преимущества перед факул тативно-метилотррфны ш бактери ми, в том числе используемыми в СССР в качестве продуцентов микробной биомассы на основе метанола Pseudomona methanolica и Pseudomonas KU-4. Сравнение показателей селекциони рованного штамма Methylobacillus methylophilus с используемыми в СССР факультативно-метилотрофными штаммами представлено в табл. 3. Из представленной таблицы отчетливо видны преимущества за вл емогц штамма перед используемыми в насто - щее врем  в СССР. Применение предлагаемого штамма позволит за счет более высокой скорйсти роста, способности к росту в более широких пределах температуры , а также высокому выходу богатой белком биомассы и большей устойчивости к вытеснению инфицирующей микрофлорой в два с половиной раза уменьшить стоимость биомассы на метаноле, обеспечить более стабильный процесс с меньшей веро тностью вытеснени  продуцента при инфицировании , а также расширить общЬй фонд имеющихс  облигатных метилотрофов и фонд штаммов-продуцентов белково-витаминной биомассы на основе метанола, имеющийс  в СССР. Экономи  от внедрени  предлагаемого штамма вместо используемого в насто щее врем  дл  опытной установки производительностью по микробной биомассе 10 тыс. т в год составит по предварительным расчетам 530 тыс. руб.

 )

а гз ч ю

tx)

н

о

U

о г

а пз и и

989867

Выход биомассы у штамма ВСБ-792 в услоби х непрерывного выращивани  при разных температурах

12

Таблица 2

Claims (1)

1. <claim-text><table border="1"> <tbody><tr><td> Показатели культур</td><td> Предлагаемый штамм ВСБ-792</td><td> Используемые штаммы КИ-4</td></tr> <tr><td> Пределы температуры для роста,’С</td><td> 30-35 выдерживает 38</td><td> 30; повышение до 37 подавляет рост</td></tr> <tr><td> Достигнутая скорость протока в непрерывной культуре, ч’¹</td><td> 0,25-0,50</td><td> 0,16-0,20</td></tr> <tr><td> Выход по сухому веществу, 7« к метанолу</td><td> 46-54</td><td> 36-40</td></tr> <tr><td> Белок (сырой потеин), % к сухому веществу</td><td> 80-85</td><td> 70</td></tr> <tr><td> Витамин В₂, мкг/г сухого ' вещества</td><td> 106</td><td> 69</td></tr> <tr><td> Устойчивость к инфицированию</td><td> Сохраняется в нестерильных условиях</td><td> Вытесняется целиком</td></tr> </tbody></table>