SU877934A1 - Способ выделени цитохрома @ из дрожжей - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА .С ИЗ ДРОЖЖБЯ, предусматривающий дез .йнтеррацшо клеагсв( ионообмёнсгую хроматографию на слабокислотных карбог |ксильных катионитахв три стадии и :лиофильное высушивание препарат й, ;О т л и ч а ю tq и и с   тем, что, JC целью упрощени  процесса, провод т ;механическую дезинтеграцию клеток при температуре 0-8с, на первой : стадии хроматографир т дезинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавл ют водой, а перед лиофильным высушиванием полученньш раствор подвергают гельфацьтрации. .

Description

00

SI

|

о

00

4 Изобретение относитс  к микробио логической промьшшенности, а именно к способам вьщелени  цитохрома С из дрожжей. Цитохром С может использоватьс  в качестве биохимического реактива а также как стимул тор Дыхани  и ок лительного фосфорилировани  в бесклеточных системах. Кроме того, пре парат может быть весьма перспективным дл  применени  его в клинической практике. Известен способ выделени  цитохрома С из дрожжей, предусматриван)щий дезинтеграцию клеток, ионообменную хроматограф ira № №чбокислот ных карбоксильных катионЦ- в три стадий и лиофнльное вьгоушивание пре парата Cl J. Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом и вьщерживают в течение 1 ч при 10 . Затем полученную суспензию фильтруют, осадок подвергают экстра ции (TSE)so (50% ОТ степени насы цени; . Экстракцию провод т 48 ч при.10-15 С. Белковый осадок Отдел ют , а фильтрат диалйзуют в течение 36 ч. Затем дл  получен1|  цитохрома С фильтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой. Элюа подвергают диализу и повторной хроматографии с поеледукхцим диализом. Полученную фракцию, содержащую цито С, концентрируют ..на колонке с ионообменной смолой, ЭЛЮЦЙЮПЕЮёод т воДньм раствором аммиака и ко центрированный расфвор цитохрома С подвергают лиофильной сушке. Недостатке известного способа  вл етс  наличие трудоемких и длительных стадий , а именно: экстракци сульфатом аммони , отделени  осадк многократного диайиза. Кроме того, этилацетат - легковЬспламен кадеес  токсичное вещество, что затрудн ет его применение в больишх количествах . Цель изобретени  - упрощение процесса. /Указанна  цель достигаетс  тем, что в способе выделени  цитохрома С из дрожжей, предусматривающем дезин теграцию клеток, ионообменную хроматографию на слабокислотных карбоксильных катионитах в три стадии и лйофильиое высушивание препарата, провод т механическую дезинтеграцию клеток при на первой стадии хроматографируют деэинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавл ют водйй, а перед лиофильным высушиванием раствор подвергают гельфильтрации. Способ осуществл ют следующим образом. Суспензию дрожжевых клеток подвергают механической дезинтеграцйй вдезинтеграторе ФУГ-1 или экст рузионном дезинтеграторе ДКМ-3 при температуре 0-8°С. Полученный дезинтеграт пропускают через колонку с ионообменной смолой, белок элюируют со смолы буфером, элюат развод т водой и хроматографию повтор ют , затем еще р,аз разбавл ют водой , и хроматографируют. Полученный раствор подвергают гельфильтрации, дл  которой xioryT быть использованы носители на основе декстрана или полиакриламида. Разбавление элюатов перед ионообменной хроматографией провод т дл  снижени  ионной силы раствора; чтобы облегчить последующее св зывание белка со смолой, а гельфильтрацию дл  обессоливани  раствора. После гельфильтрации раствор лиофильно высушивают. В результате получают препарат, содёр сание цитохрома С в котором 95%. П р и мер 1. К 1 кг сырой биом ссы дрожжей сaadida valida ИБФМ-Y- -622 дОбавлйют 1л дистиллированной воды размшиваю.т мешалкой до получени  гомогенной клеточной суспензии , котирую подвергают дезинтеграции в баллийтнческо дезинтеграторе ФУГ-1. Режим дезинтеграции: непрерывна  дезинтеграци  в течение 1 мин, объем дезинтегращионной камеры 200 мл, скорость вращени  ротора ЗООО об/мин; абразив - дивинилбенэолстирольные , микрошарики (диаметром 250-300 мкм} в количестве 150 мл MacunHoiro объела; температуре в дезинтеграционной камере 4 С. Полученный Дезинтеграт пропускают через колонку (размером 22 «150 мм), заполненную катионитомКРК-1-5п. Препарат катионита используют в 1Н)- форме, уравновешенной 0,125 М агФюнийнофосфатным буфером рН 7; скорость пропускани  дезинтеграта поддерживают на уровне 10 мл/мин« После прохождени  дезинтеграта через колонку последнюю промывают 2 л Днетиллироэаннбй воды, затем провод т элюцию 0,25 М аммонийнофосфатным буфером рН 7. Полученный элюат разбавл ют в 3 раза дистиллированной водой и такой раствор пропускают через Hosya колонку с катионитом КрК-1-5п. Описанный процесс ионо« об1(юнной хроматографии повтор ют. Полученный элюат- подвергают гельфильтрации на колонке1100х1000 мл) заполненной обводненным niienaатом гранул акрилекса П-4, после его белковую фракцию/ содержащую цитохром С, подверггиот лиофильному высувшванию. Выход препарата цитохрома С составл ет 280 мг на 1 кг сырой биоассы .

Чистота препарата nq данным спектрофотометрии и диск-электрофоре за в полиакриламидном tens составл ет 95%.

П .р и м ер 2. Способ осуществл ют по примеру 1, но ионообменную хроматох рафию провод т при 8°С, использу  в качестве носител  гранулированный пористый слабокислотный карбоксильный катионит Дмберлит IRC-50; в качестве гельфильтрующёго Материсша используют бефадекс G-2$.

Вызсод препарата цитохрсша С 271на 1 кг сырой биомассы.

Пример 3. К 1 кг сырой биок ассы дрожжей Candida valida MB m-Y622 добавл ют 1 л дистиллированной воды, размешивают мешгщкой до получени  г(могенной клеточной взвеси и такую взвесь подвергают механической дезинтеграции в экструзионном дезинтеграторе ДКМ-3.

Параметры дезинтеграции: непреравка  дезинтегргщи ; производительность - 1 л в-час, давление в |дезинтегра1и1онной камере - 3200 кг/см , температура в дезинтеграционной камере 0-8°С.

Далее способ осуществл ют, как описано в примере 1. Выход цитохрома С составл ет 255 мг на 1 кг сырой бисшассы. Чистота препарата по данньм спектрофотс летрии и диск-электрофореза в полигис рилами дном геле составл ет 95%.

ОписанньШ способ выделени  цитоxiX}Ma С из дрожжей позвсш ет упростить процесс выделени  и сократить . врем  его проведени  более, чем в три раза. При этом получают препарат цитохром С с большим выходом и высокой степенью чистоты.

Claims (1)

1. 454) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА ИЗ ДРОЖЖЕЙ, предусматривающий дез интеграцию клеток, ионообменную хроматографию на слабокислотных карбоксильных катионитах в три стадии и лиофильное высушивание препарата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, проводят механическую дезинтеграцию клеток притемпературе 0-8°С, на первой стадии хроматографируют дезинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавляют водой, а перед лиофильным высушиванием полученный раствор /подвергают гельфильтрации.