SU787463A1 - Способ получени тромболитического фермента - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Изобретение относитс  к медицине а именно к способам получени  биологически активных препаратов. Известен способ получени  тромболитического фермента путем выращивани  гриба Т гichothe сiurn roseum, экст ракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителе м с последующим осаждением целевого продукта органическим раствори телем и его очисткой l . Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты препарата, а выход его составл ет 500 мг сырца или нативного протеолитического бел ка - фермента из 1   культуральной жидкости. Цель изобретени  - повышение выхода и чистоты фермента. Указанна  цель достигаетс  тем, что целевой продукт осаждают 96 -ни этиловым спиртом при (-4)-(-7)°С и рН 6,8-7,0, отдел ют осадок центрифугированием при- (-3)-{-2)°С, затем полученный осадок раствор ют в охла денной апирогенной воде из расчета 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и про вод т очистку при . Кроме того,, целевой продукт очищают последовательно осветл ющей фи трацией, диализом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией . Пример. 100 л культуральной жидкости с активностью 400 мм или 2664 уд.ед/мг после отделени  от мицели  помещают в реактор при 20-22°С и экстрагируют затем 4 л хлористого метилена посредством непрерывного перемешивани  в течение 10 мин и последующего отстаивани  в течение 1 ч. Экстракт, содержащий антибиотик, удал етс  через нижний спуск реактора. Измер ют объем водного сло , содержащего фибринолитические ферменты. Водный слой перекачивают в реактор, который имеет рубашку с рассолом дл  Поддержани  рабочей температуры (-4) (-8)°С. Далее провод т осаждение фибринопитических ферментов трехкратным объемом 96 -ного этилового спирта, предварительно охлажденного до -10°С Осаждение провод т при (-4)-(-7) С и рН 6,8-7,0. Выпавший через 3 ч осадок отдел ют центрифугированием в течение 10 мин при 2.000-2.500 тыс.об/ /мин на центрифуге с охлаждением до -3°С. Полученную массу фибринолитических ферментов (1 кг 800 г) раствор ют

в апирогенной .дистиллированной воде (из.расчета 1,5 г осадка на 7,0 мл воды). Раствор подвергают осветл ющей фильтрации посредством пропускани  его через бумажное тесто под вакуумом. После окончани  фильтрации бумажное тесто промывают дистиллированной водой (из расчета 3 мл воды на 1,5 г осадка) дл  полного .выхода фибринолитических ферментов и бумажного теста в раствор. Фильтрат диализуют в целлофановых мешках марки 250-7И против апирогенной дистиллированной воды в течение 48 ч при 0°С, а затем подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры марки Миллипор при величине пор сте зиллизующей пластины 0,22-0,3 мкм и разливают в пенициллиновые флаконы по 2-3 мл. Разлитый фильтрат замораживают и лиофильно высушивают в течени 24 ч при максимальной температуре подогрева 20°С,

Полученный препарат представл ет собой аморфное вещество белого цвета хорошо растворимое в дистиллированной воде и ф.изиологическомрастворе, и  вл етс  комплексом фибринолитических ферментов.

Применение хлороформа дл  экстракции антибиотика (из расчета 4 л хлороформа на 100 л культуральной жидкости ) не измен ет схемы способа получени  тромболитического препарата.

Использование предлагаемого способа выделени  фибринолитических ферментов из непатогенных плесневых грибов Т г 1chothocium roseum обеспечивает увеличение выхода препарата-сырца в 3,6 оаза. Кроме того, улучшаютс  тромболитические свойства препарата , которые выражаютс  в достижении 80% полного лизиса экспериментальных тромбов.,

В опытах in vitro установлено,что добавление небольших количеств препарата к плазме вызывает быстрый лизис кров ного сгустка. Увеличение концентрации препарата преп тствует образованию сгустков. Оптимальна 

концентраци , способствующа  лизису тромбов, равна 15 мг/мл, При изучении ферментативных свойств обнаружено , что препарат обладает способностью активировать плазминоген. Выделенный протеолитический фермент обладает фибринолитической активностью в 3 раза большей, по сравнению с фибринолизином.

Внутривенное вбеденне препарата животным вызывало у большинства из них лизис тромбов в течение 1-9 ч, в то врем  как в контроле лизис тромбов не отмечалс  в течение опыта (24 ч). Применение препарата в сочетании с гепарином сокращает сроки лизиса сгустков в 3-4 раза (возрастает тромболитическа  эффективность препарата).

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   1,Способ получени  тромболитического фермента путем выращивани  гриба ТгichothecI urn roseum, экстракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителем

   с последующим осаждением целевого продукта органическим растворителем его очисткой, отличающийс   тем, что, с целью повышени  выхода и чистоты фермента, целевой продукт осаждают этиловым спиртом при температуре (-4)-(-7) С и

   рН 6,8-7,0, отдел ют осадок центрифугированием при (-3) - (-2)С, затем полученный осадок раствор ют в охлажденной апирогенной воде из расчета

   5 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и провод т очистку при 0-1 С,

   2,Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что целевой продукт очищают поспецоватепъно осветл ющей

   0 фильтрацией, диализом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией ,

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 5 1, Авторское свидетельство СССР № 469348, кл, С 12 D 13/1Ь, 1973,