SU749889A1

SU749889A1 - Способ выделени -триптофана

Info

Publication number: SU749889A1
Application number: SU772450067A
Authority: SU
Inventors: Альберт Федорович Шолин; Евгений Рэмович Рошаль
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1977-02-03
Filing date: 1977-02-03
Publication date: 1980-07-23
Also published as: FR2379512B1; JPS53111061A; CS220409B1; HU180541B; FR2379512A1; PT67542B; PT67542A

Description

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА

.,,r..-,.-,rr J:л:-.,---Л /

3t5«iiB.r--

..

iiiSu J iuJt .,.... - ; 1 Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способу вьщелени L-триптофана из растворов. Известен способ выделени L-триптофана с помощью активированного ; угл . Однако этот способ малоэффективен и имеет существенные недо; . статки,св занные, например, с трудностью десорбции L-триптофана с активированного угл . ; . Известен также ионообменный метод выделени L-триптофана с использованием синтетических ионитов 23. К не достаткам указанного метода можно от нести то, что в нем предусмотрена Очистка триптофана лишь от других аминокислот, а сорбционна емкость сорбентов по отношению к тригггофану используетс неэффективно. Наиболее близким техническим ре ( рм Г Й сущности и достигае . . у , мому. эффекту вл етс способ вьщеле / . НИИ L-трйптофана из растворов nvreM йорбции его на ионообменных смолах. получЕенного элюата и кри T iTEffiflwasffiiim Ip. - . Й5 ° ШзаййОйу способу триптофан Эорбиру10т 11а п6лйстирольном 5$ ьфокатионите или высокоосновном анионите . Примесные аминокислоты удал ют . со смолы пропусканием раствора минеральной соли. Десорбируют триптофан раствором щелочи или аммиака (в случае катиОнитов) или минеральными кислотами (в случае анионитов).L-триптофан выдел ют из элюатов путем многократного упаривани последних с последук цей кристаллизацией и перекристаллизацией .. Недостатком этого способа вл етс то, что Он позвол ет в основном отделить L-триптофай от других аминокислот , что ограничивает его возможности при выделении L-т.риптофана из растворов, содержащих значительные количества иных примесей, например, минеральных солей, окрашенных соединений . Как и в qnoco6e 2 сорбционна емкость ионитов используетс неэффективно , контакт сорбентов с растворакш , содержащими в больших количествах oKpiaiaeHHtie и другие примеси , приводит к необратимой потере обменной емкости сорбентов и ухудшению их работы от цикла к циклу, : затрудн ет злюирование L-триптофана сорбентов. Дл получени рысокочистого продукта примен ют такие трудоемкиеи энергоемкие операции как многократное упаривание, крйсталлизацию и перекристаллизацию. Выход Цгтриптофана i около 50% недостаточно велик. Указанные недостатки затрудн ют использование этого способа в промышленности.

Целью изобретени вл етс разра . ботка более эффективного и технологичного способа выделени 1-трйптофана из растворов, содержащих большое количество минеральных и органических примесей, который позволил бы получать 1-три-пт.офан в промышленных услови х с высокой чистотой и с высоким выходом.

Поставленна цель достигаетс тем что сорбцию L-триптофана осуществл ю на макропористом слабоосновном анионите , а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повторно сорбируют на сульфокатионите в Н-форме с последующей десорбцией L-триптофана с катионита.

При этом дл десорбции L-триптофана с анионита используют обессоленную воду rf/или раствора минеральных кислот в концентрации 0,1-0,5 М при температуре 10,-25°С. Дл десорбции триптофана с катионита примен ют 1,5-3,0% раствор аммиака в водном растворе этанола при температуре 407о .с.: -; -V- -:-

Согласно предлагаемому способу кристаллизацию триптофана из аммиачйо-спиртбвых элюатов целесообразно осуществл ть путем подкислени по следних уксусной кислотой до рН 3,54 ,0 с последующим охлаждением до 0 .joc, «, ., :

Предлагаемый способ осуществл ют следующим образом. . . ,

Содержащую L-триптофан культуральиую гидкость пропускают через колонку с макропористым сорбентом (например , ИА-1р). При этом L-триптофан сорбируетс ,тогда как мийёралбйыё соли, другие аминокислоты инеионогенные компоненты питательной ерёда неароматического характера практически не поглощаютс смолой. Во избежание заиливани сорбента и седиментации микробных клеток в колонне растворв колонку подают в направлении снизу вверх. С другой стороны, такой способ подачи раствора сутцественно улучшает динамику сорбции L-триптофана и исключает слеживание смолы. Диапазон оптимальных значений рН подаваемого раствора от 1,0 до 7,0.

По окончании сорбции колонка с сорбентом промываетс водой.

В случае наличи окрашенных примесей в исходном растворе элюцию L-триптофана следует прр;водить водой йри комнатной температуре с одновременно подачей триптофансодержащего элюата

колонку с. сульфокатионитом (КУ-2-8, дауэкс 50W) в Н-форме. При десорбции с анионита раствор пропускают через колонку сверху вниз, а при сорбции на сульфокатиопитё снизу вверх. Благодар отсутствию минеральных солей и целбго р да других примесей сульфокатиониты поглощают триптофан с выссэкой эффективностью. Одновременно с концентрированием происходит дальнейша очистка триптофана от окрашенных примесей. Дл повышени чистоты конечного продукта осуществл ют, промывку катионита в колонне гор чей водой при температуре 50-90 С.

Элюцию триптофана с катионита провод т 1,5-3,0% раствором аммиака в водном растворе этанола при 50-70с. Этрт способ элюировани позвол ет избежать кристаллизации десорбированного триптофана в колонке и осущест .вить ее в приемнике фракций элюата, не прибега .к многократному упариванию элюата. Во фракци х с содержанием триптофана более 10 г/л при

охлаждении и нейтрализации в уксусной кислоте Происходит кристаллизаци L-триптофана. Выпавшие кристаллы, содержащие L-триптофан, уксусную кислоту и воду, отфильтровывают, промывают этанолом и высушивают в вакууме при температуре пор дка 50 С,

Уже на этом этаПе способ позвол .ёт получать продукт с содержанием

основного вещества пор дка 99% и выходом около 50%.

Кристаллк1ческий продукт может быть подвергнут дополнительной очистке известным методом, включающим обработку активированным углем и перекристаллизацию из водноэтанольных растворов. .

Фракции аммиачного элюата могут быть обработаны известными методами, включающими упаривание, кристаллизаЦик и пёршгрйсталлизацию или возвращены на стадию сорбции на анионите последуюй1егО технологического цикла. Таким образом, общий выход кристаллич ского L-триптофана может быть :

увеличен до 60-70%.

По предлагаемому способу L-триптофан получает со следующими характеристиками: выход кристаллического L-триптофана 50-70%, содержание основного вещества не менее 99%, удельHde оптическое вращение +30-31 , Н jO), влажность не. более 1,0%, золь-, ность (сульфатна ) не более 0,1%, содержание примесей: сульфаты не более 0,01%, хлориды не более 0,01%,

железо не более 0,001%, т желые ме- таллы не более 0,001%. Продукт не содержит примесей других аминокислот, йетоксичен и непирогейен.

Способ по сн етс следук цими при-,.

мерами. . Пример 1, 2л раствора, со-;. держащего 16 г L-триптофана, 8,4 г L-аланина, 5,6 г глицина, 7,0 г валина , 10 г дизинхлоргидрата и 4 г L-глутаминовой кислоты, подают на :колон.ну с ИА-1р (объем смолы 0,45 л) в .направлении снизу вверх со.скоростью 0,5 л/час. После обнаружени L-триптофана в фильтрате (пропущено 1,85 л) фильтрат подают на вторую колонну с ИА-1р (объем смолы 0,1 л). Колонны промывают 0,85 л воды (до обнаружени L-триптофана на выходе из второй колонны), после чего провод т десорбцию 0,2 н НСС с обеих . колонн, пропуска раствор в направле нии сверху вниз со скоростью 0,35 л/час. Одновременно элюат подаю на колонну с КУ-2 в Н-форме (объем смолы 110 мл) в направлении снизу вверх. Элюцию кислотой прекращают после прохождени 7 л раствора. Элюцию L-триптофана с КУ-2 провод т 2,0% раствором а лмиака в 50% растворе этанола при температуре 63°С, подава раствор сверху вниз со скоростью 80 мл/час. Первую фракцию объемом 90 мл отбрасывают. Вторую фракцию объемом 250 мл, содержащую L-триптофан в концентрации более 7,0 г/л, обрабатывают 20 мл лед ной уксусной кислоты до рН 4,5 и охлаждают в течение 20 час при температуре 3-5с. Выпавшие кристаллы отфильт ровывают, промывают охлажденным этанолом и высушивают при 40°С. . В ьезультате получают 11,9 г крис таллического L-триптофана с содержанием основного вещества более 99%. Пример 2. Исходным материалом дл выделени L-триптофана вл етс ферментационна среда, полученна в результате культивировани штампа Вас. subtiEis ВНИИгенет;ика 3557 на питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мо чевину, соли фосфорнокислого кали , сернокислый магний, хлористый натрий Концентраци L-тpиптoфa:нa 6,2.0 г/л. 1 литр культуральной жидкости подают на колонну со смолой ИА-1р объемом 0,25 л снизу вверх со скоростью 0,3 л/час. Затем колонну промывают 0,5 л воды в том же направлении с той же скоростью. После пропускани первых 0,2 л воды и обнаружени в выход щем растворе триптофана в следовых концентраци х выход щий раствор направл ют на вторую колонну со . смолой ИА-1р (объем смолы 250 мл). Десорбцию L-триптофана с первой клонны осуществл ют 3,0 л воды, по .даваемой со скоростью 0,2 л/час в найравлении сверху вниз.. Элюатj содержащий триптофан, пропускают с то же скоростью через .KOJjoHHy с 80 мл сульфокатионита КУ-2-8 в Н-форме в направлении снизу вверх. Затем крnoHHy со смолой КУ-2-8 промывают d,S л воды при температуре со скоростью О,2 л/час. Элюирование триптофана со смолы КУ-2-8 провод т 0,5 л 1,5% раствора аммиака в 50% водном растворе этано-ла при температуре 58с. Элюат собирают по фракци м, Перва фракци объемов 100 мл содержит триптофан в концентрации 0,15 г/л. Эту фракцию :направл ют на стадию сорбции на смоле ИА-1р в последук цем цикле. Втора фракци объемом 70 мл содержит триптофан в концентрации 48 г/л. Эту фракцию обрабатывают 5,0 мл лед ной уксусной кислоты до рН 4,10 и охлаждают до . Выпавшие кристаллы отдел ют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают в вакууме. В результате получаетс 3,02 г кристаллического триптофана, хромато.графически чистого с содержанием основного вещества 99%. L-триптофана в кристаллическом продукте составл ет 48,4%. Содержание триптофана в маточном растворе составл ет 5,2 г/л, объем маточного раствора 65 мл, а вместе с промывными водами 80 мл. Этот раствор после отгонки спирта подают на стадию сорбции на смоле ИА-1р в последующем цикле. Треть фракци элюата объемом 350 мл содержит триптофан в концентрации 4,2 г/л. Эту фракцию упаривают в вакууме до объема 18 мл и охлаждают при . Выпавшие кристаллы триптофана отдел ют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают, в результате получают 1,15 г триптофана с содержанием основного вещества 95%. Общий выход триптофана в кристаллическом продукте составл ет 66%. Маточный раствор после крирталлизации триптофана из третьей фракции элюата возвращают на стадию сорбции на смоле ИА-1 в последующих циклах. Пример 3. Культуральна жидкость та же, что в примере 1. Объем культуральной жидкости 2,6 литра. Объем анионита ИА-1р составл ет 0,5 л. Услови сорбции и десорбции триптофана в случае смолы ИА-1р аналогичны услови м примера 1 за исключением того , что промывку колонны-после сорбции производ т 1,0 литром воды, а ЭЛЮЦИЮ триптофана с .анионита 6,О литрами воды. Элюат, содержащий триптофан , мину промежуточную емкость, подают на колонну с сулькатионитом Дауэкс 50Wx4 20/50 mesh в Н-форме, вз тьм в объеме 70 мл снизу вверх со скоростью 0,2 л/час. По окончании сорбции триптофана колонну с сульфокатионитом промывают 0,5л воды при температуре в направлении снизу вверх со скоростью 0,2 л/час. Элюирование триптофана со смолы . Дауэкс 50Wx4 провод т О,5 л 1,7%

749889 IpactBOpa ал1миака в 50% вбдйомрйство ре этанола при. температуре . Пер вую фракцию объемом. 70 мл, содержащую триптофан в концентрации 0,20 г/ . направл ют на стадию сорбции на анио ните ИА-1р в доследующем цикле. Вторую фракцию элюата с сульфодсатионита .объемом 90 мл,содержащую триптофан в концентрации 80,5 г/л, обрабатывают 5,5 мл лед ной уксусной кислоты до рН 4,15и охлаждают до . Выпав ::ше кристаллы обрабатывают так же, как в примере 1. В результате получают 6,55 г крйсталлическсзго L-триптрфана , хроматрграфическй чистого, с содержанием основного вещества 99% Выход L-триптофана в кристаллическом продукте составл ет 51,2%. Маточный раствор объемом 78 мл ссбдёржанИем триптофана 5,1 г/л и промывные воды после отгонки спирта возвращают на стадию сорбции на анионите ИА-1 в по следующем цикле.. Третью фракцию элюата объемом 315 мл .с содержанием триптофана в концентраций 6,5 .г/л упаривают до объема 30 мл и охлаждают при . Вьатвшие кристаллы отдел ют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают. В результате получаетс 1,98 г кристаллического триптофана с содёржанк е основного вещества 96% Общий выход триптофана в кристаллическом продукте составл ет 67,2%. Кристаллы триптофана с сбдержаЩемоснрвнЬгЬ вещества 96% перекристалл из овывают. Дл этого 2,25 г триптофана раствор ют в 25 мл 50% этанола при нагревании. В раствор добавлШт 0 ,4 г активированного угл , гор чий раствор фильтруют, фильтрат охлажд.ают и выпавшие кристаллы триптофана отфильтровывают, промываюТ этанолом и высушивают. В результате получаю т 1,56 г триптофана, хроматографически чистого, с содержанием основного вещества 99%. Выход на стадий перекристаллизации составл ет 72%

Claims

8 в пересчете на триптофан с содержанием основного вещества 100%; Формула изобретени 1.Способ вьщелени L-триптофана из растворов путем сорбции его на ионообменных смолах, д есорбции полученного элюата и кристаллизации, отличающийс те.м, что, с целью повышени эффективности процеоса , а также получени готового продукта, свободного от примесей, сорбцию L-триптофана осуществл ют на макропористой слабросновном аниониТе , а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повтppнo сорбируют на сульфокатионите в Н-формё с последующей десорбцией L-триптофана с катйонита. 2.Способ по п. 1, отличающ с тем, что десорбцию L-триптофана с анионита осуществл ют обессоленной водой и/или растворами минеральных кислот в концентрации 0,10 ,5 М при температуре 10-25°. 3.Спрсоб по п. 1, бтличающ и и с тем, что десорбцию L-триптофана с катйонита осуществл ют 1,53 ,0% раствором аммиака в водном растворе этанола при температуре 40-70°С. 4.Способ по п. 1, отличающийс тем, что кристаллизацию L-триптофана из аммиачнр-спиртрвых элюатов провод т путем подкислени последних уксусной кислотой до рН 3,5-4,О с последующим охлаждением до 0-5°С. . Источники информации, прин тые вр внимание при экспертизе 1.Патент США 2.416.956, опублик . 1947.
2.Патент .США №.2.700.672, опублик . 1955.
3. Патент США № 3,450.712/ опублик . 1969 (прртртип).