SU220920A1 - Способ получения ферментных препаратовлизоцил\ов - Google Patents

Description

Известен способ получени  ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырь  путем приготовлени  из этого сырь  солевого раствора, содержащего хлористый натрий в концентрации от 0,5 до 1,0 и имеющего рН от 5 до 5,5, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором дл  удалени  несорбирующихс  примесей, содержащихс  в исходном сырье, с -последующей десорбцией лнзоцимов дистиллированной водой.

Полученный известным способом лизоцим представл ет собой гомогенный белковый препарат , содержащий примеси около 5% хлористого натри  и следы углеводов.

Дл  освобождени  лизоцима от этих примесей провод т сорбцию лизоцима из раствора, полученного .после первичной сорбции, причем в этот раствор добавл ют фосфаты натри  или кали , довод  рН до 8. Примеси удал ют водой, а лизоцим затем десорбируют 0,5 - 1,0%-ной уксусной кислотой.

Дл  упрощени  процесса получени  очищенных ферментных препаратов лизоцимов согласно лр едлагаемому способу хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой цри температуре , предпочтительно равной от 2 до 4, и рН раствора от 2 до 3°С.

По предлагаемому способу солевой раствор, содержащий лизоцимы, следует приготовл ть путем смешивани  исходного сырь  с бикарбонатом натри  или со смесью бикарбоната и карбоната аммони  до получени  раствора с концентрацией солей от 0.5 до 1,0% и рН 7.9- 8,4.

Кроме того, целесообразно хитин после промывки солевым раствором промывать дистиллированной водой дл  удалени  солей, после чего лизоцим десорбировать 3-5%-ной уксусной кислотой.

Предлагаемый способ заключаетс  в следующем . Получаемый из природного сырь  извеетным сиособом хитин содержит евободные аминогруппы, придающие ему свойства анионообменника и снижающие его специфичность как сорбента лизоцимов.

Дл  устранени  этих свойств целесобразно обработать такой хитин азотистой кислотой , в результате чего аминогруппы замен ютс  гидроксильньши группамп, не обладающими ионообменными свойствами.

Модификацию хитина ведут в 0,3-0,5%ном растворе азотистой кислоты при 2-4°С.

По механическим и физикo-xи.ичecкпм свойствам полученный при этом хитин не отличаетс  от исходного. 1 г модифицированного хитина со средним диаметров частиц от 150 до 200 мк сорбирует около 15 -иг лизоцима. Выделение лизоцима из содержащего его сырь  € помощью получеиного .вышеуказанным способом еорбента провод т следующим епособом. В исходный раствор (сок, экстракт, биологическую жидкость) внос т бикарбонат натри  (или смесь бикарбоната и карбоната аммони ) до концентрации 0,5-1,0о/о и устанавливают рН в интервале от 7,9 до 8,4. Полученный раствор пропускают через слой хитина. Лизоцим при этом полностью сорбируетс  на хитине. Несорбирующиес  примеси, содержащиес  в исходном сырье, удал ют путем промывани  сорбента раствором бикарбоната натри  (или смеси бикарбоната и карбоната аммони ) с теми же значени ми рН и концентрации. После этого сОрбент промывают водой, удал   таким образом соли. Лизоцим десорбируют 3-5%-ной уксусной кислотой. После отмывки его от уксусной кислоты дистиллированной водой хитин может быть использован дл  очередной операции извлечени  лизоцима. Пример 1. В качестве исходного сырь  использовали белок одного куриного  йца (25 мл). Его разбавл ли до 250 мл ,1о/о-ным раствором NaHCOg. Полученный раствор пропускали через колонну (2x30 см) с хитином, диаметр частиц которого составл л от 150 до 200 мк (в колонку предварительно промывали 1%-ным раствором NaHCOs). Отмыли 1о/о-ным раствором NatiCOs; контроль за отмывкой проводили путем измерени  оптической плотцости вытекающего из колонки раствора при 280 ммк  а спектрофотометре СФ-4. Затем колонку промывали водой до удалени  NaHCOa, контролиру  отмывку пробой на окрашивание пламени газовой горелки. Лизоцим десорбировали 5%-ным раствором CHgCOOH и леофильно высушивали. Выход лизоцима составил около 120 мг. Ферментативна  активность его совпадала с активностью стандартного препарата лизоцима , полученного методом пр мой кристаллизации . П р и м ер 2. В качестве исходного сырь  использовали сок (около 400 мл), отжатый из 1 кг неочищенной репы. К соку добавл ли сухой NaHCOa До концентрации 1% и центрифугировали дл  удалени  механичес-ких частиц . Затем из этого очищенного раетвора выдел ли ЛИЗОЦИМ так же, как в примере 1. Выход лизоцима составил около 10 мг, ферментативна  активность его равн лась от активности лизоцима из белка куриных  иц в расчете на единицу веса лиофильно сухих препаратов. Предмет изобретени  1. Способ получени  ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырь  путем .приготовлени  из этого сырь  солевого раствора, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором дл  удалени  несорбирующихс  примесей, содержащихс  в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса получени  очищенных ферментных преПаратов , хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой. 2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что модификацию хитина провод т при температуре от 2 до 4° и рН раствора от 2 до 3°С. 3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что солевой раствор, содержащий лизоцим.ы, приготавливают путем смешивани  исходного сырь  с бикарбонатом натри  или со смесью бикарбоната и карбоната аммони  до получени  их Концентрации 0,5-ID/Q и рН раствора 7,9-8,4, а в качестве солевого раствора, примен емого дл  промывки хитина, используют 1%-ный раствор бикарбоната и карбоната аммони . 4.Способ по п. I, отличающийс  тем, что хитин после промывки солевым раствором Промывают дистиллированной водой, а десорбцию лизоцимов провод т 3 5о/о-ной уксусной кислотой.