SU1712416A1 - Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактери ми РSеUDомоNаS SpecIeS - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, микробиологии и к технологии получени  человеческого лейкоцитарного интерферона. Целью изобретени   вл етс стабилизаци  и повышение выхода конечного продукта. Способ получени  человече-- ского лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактери ми Pseudomonas species путем глубинного культивировани  в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей Гид- ролизат пекарских дрожжей. D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенйый к'алий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОг при температуре 30±0,5°С, рН 7,0±0,1, определени  скорости роста бактерий, заключаетс  в том. что через 15~30 мин после достижени  максимальной скорости роста бактери ми температуру среды понижают от 30±0,5 до 20±0.5°С и процесс.завершают через 2,5±0,5 ч после снижени  температуры, что позвол ет стабилизировать и повысить выход альфа-2 интерферона. 3 ил:. 3 табл../• .-вё

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , микробиологии и технологии получени  человеческого лейкоцитарного интерферона .

Цель изобретени  - повышение выхода конечного продукта.

Способ осуществл етс  следующим образом .

На основании экспериментальных данных разработан способ температурной оптимизации биосинтеза рекомбинантного альфа-2 интерферона бактери ми Pseudomonas species, согласно которому через 15-30 мин после достижени  максимальной скорости роста бактерий температуру среды понижают от 30±0.5 до 20±0,5°С и процесс завершают в начале стационарной фазы или через 2.5±0.5 ч после снижени  температуры, достига  максимального биосинтеза интерферона альфа-2, т.е. полностью использу  потенциал питательной среды: возможность температурной деградации готового продукта исключаетс .

На основании известного графического метода было произведено представление на фазовых плоскост х скорости роста бактерий и концентраций продукта. На фиг.1 показана скорость роста продуцента (в %) от максимальной скорости роста, в табл.Т числовые значени . Спуст  определенный

промежуток времени после того, как бактерии , культивируемые при 30°С, достигают максимальную скорость роста, следует снизить температуру до 20°С, Это должно не только исключить деградацию продукта, что характерно дл  30-градусного режима ферментации , но и повысить производительность .

Из экспериментальных данных (фиг.1 и 3 и табл.1 и 3 видно, что продукт после максимального накоплени  в клетке практически не подвергаетс  температурной деградации при выращивании культуры при 15 и 20°С, а при выращивании при 25 и 30°С деградаци  продукта начинаетс  сразу же после его максимального накоплени . При снижении температуры до 15°С клетки получают слишком большой температурный шок и рост культуры практически прекращаетс . Культивирование при 15°С замедл ет процесс, выход интерферона альфа-2 в 2 раза ниже, чем при 3.0°С. При снижении температуры до 25°С желаемого эффекта не достигаетс , так как после накоплени  продукта наступает его деградаци  так же, как и при ./

Из фиг.1 видно, что, когда скорость роста снижаетс  до 80%, при 30°С начинаетс  деградаци  продукта, а при 20°С в этой точке увеличиваетс  биосинтез продукта и остаетс  стабильным еще 3 ч (табл. 1). При 25°С (фиг.З) получаетс  гибридный вариант, т.е. при снижении скорости роста до 80% происходит увеличение биосинтеза, но потом сразу наступает деградаци  продукта.

Следовательно, температуру культивировани  следует понижать от 30±0,5 до 20±0,5°С до начала деградации продукта, т.е. через 15-30 мин после достижени  максимальной скорости роста (табл.).

Процесс культивировани  следует завершить через 2-3 ч после снижени  температуры потому, что после 2,5±0,5 ч, но не раньше (табл.2), наступает деградаци  продукта . Завершение процесса определ етс  по времени, так как оптическа  плотность повышаетс  незначительно.

П РИ мер. Приготавливают 10 л питательной среды дл  ферментера Blostat Е емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л следующего состава, г/л: гидролизат казеина 120 Мл/л; гидролизат пекарских дрожжей 5; D-глюкоза 10; сернокислый аммоний 3; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,6; хлористый натрий 0,5; сернокислый семиводный магний 0,3; хлористый кальций 0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15. 1 л этой среды разливают в 4 250-качалочные колбы и засевают по 1 мл жидкозаконсервированной культуры Pseudomonas species VG-84. Колбы помещают на 20±2 ч в термостатирующие качалки при 200±20 об/мин и температуре 30±0,5 С,

Полученным инокул том засевают ферментер . К ферментеру подключают бутыли с 10%-ным раствором силиконового пеногасител , 40%-ным раствором гидроокиси натри  и 35%-ным раствором фосфорной

0 кислоты.

Ферментацию начинают при 30°С, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7, пеногашение на уровне датчика. Каждые 30 мин берут пробы культуральной

5 жидкости дл  измерени  оптической плотности на спектрофотометре СФ-26 при А 540 нм в кювете толщиной 1 см и определени  скорости роста. Оптическую плотность (ПО) измен ют по динамике рос0 та: после засева ПО поддерживают на уровне 40% от насыщени , при достижении 2,5-3 оптических единиц (опт.ед.) - 50%, при 4,5-5 опт.ед. - 60%, при 6,5-7 опт.ед. 70% от насыщени .

5 Скорость роста определ ют следующим образом.

Информаци  об оптической плотности среды поступает на ЭВМ IBM/PC. Посредством метода сглаживающих кубических

0 сплайнов сглаживают (фильтраци ) поступающие данные с точностью до 0.2 опт.ед.

Скорость роста бактерий (V) определ ют из выражени 

Хк-Хк-1

VK

tK - tK - 1

где Хк и Хк-1 - фильтрованные сигналы в моменты-времени Тк и tK-i.

Полученное значение скорости роста

бактерий Vk сравнивали с предыдущем

значением VK-I. Спуст  15-30 мин после

удовлетворени  услови  VK - VK-I О темпе . ратуру среды снижают с 30±0,5 до 20±0,5°С

и процесс биосинтеза завершают в начале

стационарной фазы или через 2,5±0,5 ч поеле снижени  температуры.

Таким образом, способ получени  человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактери ми, Pseudomonas species позвол ет полностью использовать потенциал питательной среды и повысить ВЫХ.ОД конечного продукта в 6-7 раз по сравнению с известным способом (см. табл.1 и 2 и фиг.2).

Формул а изобретени  Способ получени  человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактери ми Pseudomonas species путем глубинного культивировани . в присутствии стрептомицина итетрациклина на питательной среде, содержащей гид ролитат пекарских дрожжей, D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОа и при 30±0,5е, рН 7,0±0,1, От личающийсй

Кинетика роста бактерий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

тем, что, с целью повышени  выхода конечного продукта, температуру среды понижают до 20±0,5С после достижени  максимальной скорости роста бактерий, а процесс культивировани  завершают через 2,5±0,5 ч после снижени  температуры.

т а б п и ц а 1

Кинетика роста бактерий и -биосинтез эльфа-2 интерферона (INF) при снижении температуры с 30 до

Та6лица2

Кинетика роста бактЬрий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

Таб ицаЗ W60 Фиг.1 100 cfjift/t,%

Melf-to

1,4 i,i ifl a,s

.

0 0,

ii 6 в fff

0

W j

гг f

QJuz.Z

0 го

т 100 effkti.

60 Фиг.З

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species путем глубинного культивирования, в присутствии стрептомицина итетрацикли5 )1712416 на на питательной среде, содержащей гидрол и та т пекарских дрожжей, D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, 'сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОг и при 30±0,5°С, pH 7,0 ±0,1, от личающийся тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, температуру среды понижают до 2б±0,5°С после достижения максимальной скорости роста бактерий, а 5 процесс культивирования завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры.

   Таблица!

   Кинетика роста бактерий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

   ·' 20°с зо°с t ,ч Плот*' ность, опт.ед. Скорость опт.ед. ч роста Г- 1№, МЕ/лИО⁷ t, ч Плотность, опт.ед. Скорость роста ЮТ, ₉ НЕ/л-10⁷ опт.ед. ч I % 0 0,3 0,35 23 0 0,43 0,17 5. - 3 1,62 0,61 40 - - 2 1,0 0,77 23 “ * А 2,25 0,83 54 - ' 4 3,5 1,80 53 * 6 4,25 1,08 70 0,64 . 5 5,75 2,68 79 1,0 6,5 4,75 1,27 82 5,5 7,37 .3,06 90 7,5 6,5 . 1,55 100 1,2 6 8,25 3,39 100 1,5 . 8,5 7,75 1,19 77 1,9 . 6,5 П,0 3,28 97 - 9,5 8,75 1,41 80 - . ’ 7, 12,5 2,59 76 2,1 10,5 11,15 1,15 74 2,4/ 7,5 13,1 1,80 53 1,95 11 11,0 0,47 31 8,5 14,0 · 0,56 17 11,5 10,75 0,11 8 2,5 9,5 14,6 -0,38 -10 1,1 12,5 11,25 0,17 11 2,1 10,5 14,0 -0,47 -14 -

   Та блица 2

   Кинетика роста бактерий и-биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при снижении температуры с 30 до 20* С

   Ί — . Τ а б л и ц а 3

   Кинетика роста бактЬрий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

   МЕ]лЮ⁹

   з.о

   Ί -1____'_____L—-------L------—J---------1-----20 0 20 40 60 80 100 8x/cft,%

   Фиг.1