SU1693057A1 - Способ получени никотинамидадениндинуклеотида (НАД) - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к способу получени  никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Цель изобретени  - повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса Культуру Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 выращивают на первой стадии на питательной среде при дробном внесении источников азота и фосфора Поверхно- стно-активное вещество внос т в количестве, составл ющем 5-7% от количества биомассы. На стадии биосинтеза после введени  в среду предшественников НАД культивирование осуществл ют при рН 6,5- 7,0 до достижени  максимального количества в среде целевого продукта. Выход НАД 5,7-6,5 мг/мл. Продолжительность процесса 60-72 ч

Description

Ё

Изобретение относитс  к биотехнологии , к области получени  биологически активных веществ с помощью микроорганизмов .

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса.

Процесс получени  НАД методом глубинной ферментации можно рассматривать как двухстадийный. На первой стадии происходит накопление биомассы, а на второй, котора  начинаетс  после внесени  в среду ПАВ и предшественников, размножение культуры прекращаетс  и происходит синтез НАД. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, которую выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода , азота, магни , кальци , стимул торы

роста При этом источники углерода и азота внос т дробно по мере их исчерпани  в питательной среде. Культивирование ведут до накоплени  биомассы не менее 12 мг/мл (по сухому весу), после чего внос т ПАВ и предшественники биосинтеза НАД. ПАВ внос т в количестве, составл ющем 5-7% от количества биомассы. Было установлено, что выход НАД в сильной степени зависит от соотношени  ПАВ и биомассы Отклонение от указанного интервала приводит к резкому снижению выхода НАД Дальнейшее культивирование ведут дл  биосинтеза НАД, поддержива  рН в среде в пределах 6,5-7,0, в течение 36-42 ч до достижени  максимального количества НАД в среде Вне указанного интервала рН выход НАД значительно ниже. Культивирование в предлагаемых услови х позвол ет стабильно

О

ю

00

о ел

VJ

получать высокий выход НАД (5,7-6,5 мг/мл).

П р и м е р 1. Культуру Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 выращивают при 8-32°С в аэробных услови х на питательной среде следующего состава, % глюкоза 10; КН2Р04 1; КаНРОд 1; MgS04 7Н20 1; aCl2 0,01; дрожжевой экстракт 1; мочевина 0,6; биотин 3 мкг %. Глюкозу, мочевину и биотин в виде водных растворов стерилизуют по отдельности и внос т в среду перед посевом. Дл  посева используют 10% жидкого инокул та, полученного при выращивании культуры на среде, содержащей, %: глюкоза 2; пептон 1; дрожжевой экстракт 1; NaCI 0,3; биотин 3 мкг%. Через 24 ч роста внос т в культуральную жидкость цетилпи- ридинийхлорид(ЦПХ) в количестве 1 мг/мл, никотинамид и аденин по 2 мг/мл. Культивирование продолжают еще 72 ч дл  дости- жени  максимального выхода НАД, составл ющего 2 мг/мл,

П р и м е р 2. Способ осуществл ют согласно примеру 1, но перед посевом внос т все количество биотина (3 мкг%) и половину заданного количества глюкозы и мочевины (5 и 0,3% соответственно). При выращивании продуцента по мере исчерпани  глюкозы в питательной среде добавл ют остальное количество глюкозы и мочевины в два приема (через 12 и 20 ч от начала культивировани ). После 24 ч роста биомасса достигла 15 мг/мл (по сухому весу ). В это врем  внос т ЦПХ в количестве 0,75 мг/мл, что соответствует 5,0% от количества биомассы, затем добавл ют аденин и никотинамид по 2 мг/мл каждого. Культивирование продолжают в течение еще 36 ч, поддержива  рН в среде в интервале 6,5- 7,0 с помощью 10%-ного NaOH или 10%-но- го . Выход НАД достигает 5,7 мг/мл.

Примерз. Способ осуществл ют согласно примеру 1, но ЦПХ и предшественники внос т после 30 ч роста продуцента.

Концентраци  биомассы составл ет к этому времени 18 мг/мл, поэтому ЦПХ внос т в количестве 1,26 мг/мл, что соответствует 7,0% от количества биомассы. Культивирование продолжают в течение еще 40 ч и при этом выход НАД достигает 6,5 мг/мл.

П р и м е р 4. Способ осуществл ют согласно примеру 1, но исходное содержание глюкозы в питательной среде составл ет7% , а мочевины -0,45%. Через 30 ч роста в среду внос т оставшеес  количество глюкозы и мочевины (3 и 0,15% соответственно ), никотиновую кислоту и аденозин по 2 мг/мл и цетилтриметиламмонийбромид

(ЦТАБ) в количестве 0,9 мг/мл, Это количество ЦТАБ выбрано, исход  из того, что в момент его внесени  концентраци  биомассы в среде была 17 мг/мл. Культивирование продолжают еще 42 ч и получают НАД 6,2

мг/мл.

Таким образом, способ позвол ет увеличить выход НАД на 185-225% и сократить врем  процесса с 96 до 60-72 ч.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  никотинамидаденин- динуклеотида (НАД, предусматривающий стадию культивировани  продуцента Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 на питательной среде, содержащей источники

   углерода, азота, фосфора, магни , кальци , и стадию биосинтеза НАД в присутствии поверхностно-активного вещества и предшественников НАД, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода НАД и

   сокращени  продолжительности процесса, источники углерода и азота на стадии культивировани  внос т дробно по мере исчерпани  их в питательной среде и культивирование ведут до накоплени  биомассы

   в количестве 12-18 мг/мл среды, а биосинтез НАД осуществл ют при рН 6,5-7,0 и содержании поверхностно-активного вещества в среде 5-7% от количества накопленной биомассы.