SU1531851A3

SU1531851A3 - Способ получени @ -каротина из суспензии водорослей рода DUNaLIeLLa в растворе хлорида натри с концентрацией не менее 3 М

Info

Publication number: SU1531851A3
Application number: SU843793658A
Authority: SU
Inventors: Куртис Кертан Сирил; Спук Харви
Original assignee: Коммонвелф Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн И Бетатен Лимитед (Фирма)
Priority date: 1981-10-07
Filing date: 1984-09-26
Publication date: 1989-12-23
Also published as: DK260083A; EP0089983A1; BR8207915A; US4554390A; DK260083D0; FI832038L; EP0089983B1; NO832052L; DE3268859D1; WO1983001257A1; EP0089983A4; FI832038A0; JPS58501654A; FI70923B; RO89653A; FI70923C

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и касаетс получени витаминов. Целью изобретени вл етс улучшение качества β-каротина и упрощение процесса. Это достигаетс тем, что водоросли рода DUNALIELLA в растворе хлорида натри концентрацией не менее 3М контактируют с гидрофобным корпускул рным или волокнистым адсорбентом, обрабатывают водоросли растворителем дл экстракции β-каротина, свободного от нежелательных каротиноидов и липидов, а затем отгон ют растворитель из экстракта.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и касаетс получени витаминов.

Цель изобретени - улучгаение качества ft -каротина и упрощение процесса .

Способ осуществл ют следующим образом.

Выделение Dunaliella из суспензий в рассоле продемонстрировано с применением рассола из естественного солевого озера. Такой рассол в достаточной степени насыщен хлористым натрием и он типичен дл рассолов из таких источников в том отношении, что загр знен глиной, галофильными бактери ми и другими нежелательными материалами. Исследование показало.

что число клеток на единицу объема вьше того значени , которое обычно обнаруживают в таких естественных солевых водах, а также что такие клетки клавным образом жизнеспособны. В образце присутствовало лишь небольшое количество лизированных клеток и фрагментов свободного липида и свободного 13 -каротина. Индивидуальные неповрежденные клетки содержали повышенное количество -каротина относительно концентрации в них хлорофилла .

Клеточную суспензию пропускают через пробки из пористого адсорбента, вьтолненные из гидрофобных волокон найлона 66, полизЛира, по.чиакрилата,

ел

оо

00

ел

см

тефлона (по:штетрафторэтилена) и стекловаты, которую делали гидрофобной в результате обработки подход ци1 силаном. Было установлено, что в каждом случае имеет место хороша адсорбци клеток Dunaliella и адсорбированные клетки водорослей удерживаютс в ходе последующего промывани пробок несодержащим клеток насыщенным раствором, хлористого натри дл удалени оклюдированной глины, бактериальных клеток и других нежелательных материалов, которые присутствуют в исходной суспензии. Затем раствор хлористого натри , имеюищй концентрацию ниже 1 моль, перколируют через пробки, на которые адсорбируютс клетки водорослей, и при этом установлено, что указанные клетки легко десорбируютс с адсорбента и удал ютс из системы с жидким эффлю- ентом. Обнаружено, что регенерированные таким образом пробки из адсорбента .способны адсорбировать больше клеток Dunaliella из свежено образца солевого раствора и такой цикл многократно повтор ют.

Адсорбци клеток Dunaliella на гидрофобный адсорбент позвол ет осуществл ть концентрирование клеток и облегчает извлечение содержащегос в них й-каротина. Установлено, что клетки Dunaliella, остава сь адсорбированными на гидрофобном адсорбенте , могут разрушатьс под действием растворител , способного деструкти- ровать клеточную мембрану, и что растворитель позвол ет экстрагироват -каротин, оставл при этом клеточные осколки и нерастворимые клеточные компоненты адсорбированным- на гидрофобной поверхности.

Растворители, подход 1цие дл такой цели, включают, но не ограничиваютс хлорированными растворител ми , такими как хлористый метилен, : хлороформ, четыреххлористый углерод и трихлорэтилен, и ароматическими углеводородами или смес ми ароматических и алифатических углеводородов Дп этой пели могут использоватьс такие углеводороды, как бензол, толуол и пром),1шленные петролейные фракции , содержащие смеси ароматических или алифатических и ароматических углеводородов.Ароматические углеводороды по;1ход т дл этой цели в большей степени, чем алифатические угле0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

водороды, поскольку они обладают большей способностью раствор ть ка- ротиновые компоненты. Л.ч последующего извлечени -каротина предпочитают использовать растворители с относительно низко точкой кипени , пор дка 10П°С шт ниже. Подход щим растворителем дл экстракции J-Ka- ротина вл етс жидка двуокись углерода и низка точка кипени такого растворител минимизирует тенденцию к разложению экстрагированных каро- тиновых компонентов в ходе их отделени и выделени .

Растворимый компонент содержит помимо ft -каротина также тритерпе- ноиды и -нипиды. Такие компоненты мо- г ут быть легко отделены от |3 -каротина , например, фракционной кристаллизацией и/или распределением между растворителем и они могут быть выделены дл других назначе}1ий, например, в качестве химического сырь .

01еточные OCKOJUCH, остающиес после экстракции й-каротина, могут десорбировать с адсорбентом в результате промывани последнего разбав- jieFfHb M раствором хлористого натри шп1 водой согласно описанному способу , и регенерированный таким образом адсорбент может pennpKyjnipoBaTbCH на дальнейшее использование.

Клеточные осколки, представл ющие собой протеиновый материал, могут быть изв1 ечены тгюбым подход щим способом и использованы, например, в качестве кормовой биомассы корма дл животных или протеиновой добавки, пни в качестве протеинового источника дл других применений.

Из промывочной ж дкocти может быть также извлечен вoднopacтвopи lый клеточный компонент, главным образом глицерин.

Пример 1. Стекловату спла- низируют и делают гидрофобной в результате погр окени на 10 мин в 10%-ный (об./об.) раствора дихлорди- метилсилана в гексане. Затем обработанную стекловату п ть раз промывают дистиллированной водой. Колонку длиной 15 см и внешним диаметром 7 см тщательно набивают 90 г обработанной указанным способом стекловатой и 1,5 л суспезии Dunaliella Sa- lina к насыщенном растворе хчористо- гн натри , солерж-тцем 10 клеток/мл, пр1)пускают черсч такую копонрсу с о

5153

скоростью 1,3 л/мин. Затем жидкости дают стечь из колонки и через нее пропускают 700 мл хлористого метилена . Отход пщй хлористый метилен собирают и анализируют на содержание. В-каротина. Установлено, что в эффлю- енте содерткитс 77% Ь-каротина, присутствующего в клетках, содержащихс в исходном растворе.

Затем стекловату реактивируют в результате пропускани 1,6 л дистиллированной воды через колонку с целью десорбции и быстрого отвода оставшихс клеточных осколков. Реактивированную стекловату повторно используют в идентичном эксперименте со следующим образцом той же суспензии клеток Dunaliella. Были по/гучены практически .идентичные результаты.

Пример 2. Магнетит (10 г), проход щий через сито с размером отверстий 20 меш, силанизируют 10%-ным (об./об.) раствором дихлорметилси- лана в гексане в течение 20 мин, затем промывают водой и сушат при 110 С. Силанизированный магнетит перемешивают с 50 мл суспензии, содержащей 2x10 клеток/мл Dunaliella в насыщенном растворе хлористого натри в течение 10 мин. Затем силани- зированный магнетит удал ют из раствора с использованием посто нного магнита. Ю1етки, адсорбированные на магнетите, лизируют путем контактировани магнетита с хлористым метиленом, после чего хлористый метилен отдел ют и анализируют на содержание в нем В-каротина. Установлено , что 87% каротина, присутствующего в исходной суспензии клеток Dunaliella, извлечено с хлористым метиленом.

Силанизированный магнетит реакти- руют в результате п тикратного промывани 10 мл порци ми воды. Затем эксперимент повтор ют с использованием реактивированного магнетита 70% В-каротина, присутствующего в клеточной суспензии Dunaliella, извлекли с хлористым метиленом.

Пример 3. Полиэфирное волокно (1 г) тщательно загружают в колонку длиной 20 см и внешним диаметром 1,5 см. Суспензию клеток Dunaliella Salina (2x10 клеток/мл) в насыщенном растворе хлористого натри пропускают через колонку со скоростью 80 мл/мин. Затем волокно промывают

0

516

20 MJI насьпденнот о раствора хлористого натри и дают жидкости стечь с колонки . Затем волокно перенос т в Экстрактор Сосклета и экстрагируют четырех- хлористым углеродом. Анализ извлеченного экстракта показал, что 2,1 мг р-каротина получен из клеток Dunaliella , которые были адсорбированы на

Q (Полиэфирном волокне.

Пример 4. Повтор .гщ методику примера 3 за тем исключением, что полиэфирное волокно замен ли на 1 г g нейлонового волокна. Анализ экстракта показал, что бьто извлечено 0,5мг В-каротина.

Пример 5. Политетрафторэти- леновое волокно (1,5 г) активируют путем нагревани до 316°С в 98%-ной серной кислоте и дл обесцвечивани смеси добавл ют достаточное количество азотной кислоты. Волокно извлекают , промывают водой, сушат и исполь- 5 зуют в соответствии с методикой примера 3. р -каротин (0,4 мг на г волокна ) извлекают экстракцией четырех- хлористым углеродом.

Пример 6. Акркповое волокно (1 г) обрабатывали согласно методике, описанной в примере 3. и выдел ли 0,5 мг В-каротина.

Пример 7. Антра1;ит (12,5 г) размалывают так, что он проходит через сито с размером отверстий 120 меш (BSS) и затем перемешивают в течение 30 мин с насыщенным раствором хлористого натри (250 мл), содержащим 2x10 клеток/мл Dunaliella Salina . Затем мешалку останавливают, смеси дают осесть перед тем, как сольют верхний слой жидкости и содержимое профильтруют через пробку из свободно упакованной стекловаты. Как осажденный материал, так и тот материал , что осталс на фильтре, промывают насьпценным раствором хлористого натри (20 мл). и промывные жидкости отбрасывают. Фильтр перенос т в тот же контейнер, что и осадок, и объединенные твердые вещества промывают последовательными порци ми хлористого метилена до тех пор, пока промывные жидкости не потер ют окраску , создаваемую присутствующим - каротином. Раствор хлористого метилена анализируют, обнаружено что он содержит 0,7 мг |3-каротина на грамм используемого антрацита.

0

5

0

Пример 8. Графит (12,5 г) использовали вместо антрацита и повтор ли методику, ог1исаь1ную в примере 7. Раствор хлористого метилена анализировали и бьшо обнаружено, что он содержит 0,6 мг R-каротина на грамм графита.

Пример 9. Согласно методике описанной в примере 7, использовали халькопирит (12,5 г) и в результате извлекли 0,6 мг В-каротина на грамм халькопирита.

Пример 10. Сфалерит (12,5 г примен ли по методике, описанной в примере 7. и в результате извлекли 0,25 мг ft -каротина на грамм сфале- ри та.

Пример 11. Пиролюзит (12,5 использовали по методике, описанной в примере 7, и извлекли 0,25 мг - каротина на грамм пиролюзита.

Пример 12, Рутил (12,5 г) использовали по методике, описанной в примере 7. и в результате извлекли 0,2 мг В -каротина на грамм рутила.

Пример 13. Ильменит (12,5 г использовали по методике, описанной в примере 7, и в результате получили 0,4 мг В -каротина на грамм илменита

П р. и м е р 14. Магнетит (12,5 г использовали по методике, описанной в примере 7. за исключением того, чт посто нный магнит примен ли дл отделени магнетита вместо фильтра из стекловаты. В результате извлекли 3,3 мг В -каротина на грамм магнетита .

Пример 15. 50г гэматита с размером частип примерно 120 меш (BSS) сушат при 105°С в течение одного часа и затем обрабатывают 1,4 г дихлорметилсилана в 290 мл петролей- ного эфира в течение 12 ч при 20 С. Затем петролейный эфир удал ют на фильтре с отсосом и обработанный гэ- матит сушат при 105°С в течение 1 ч. 10 г высушенного обработанного гэматита добавл ют в одному литру суспензии клеток Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлористого натри . Затем гэматит извлекают декантацией и прит жением магнитом и экстрагируют 100 мл дихлорметана. Выдел ют 81% р -каротина в расчете на количество, содержащеес в исходной суспенз П5 клеток Dunaliella Salina.

Пример 16. 50 г магнетита обрабатывают 2,5 мл аминопропилтри0

5

0

5

0

5

0

5

этоксисилана и 2,5 мл уксусной кислоты в 250 мл воды в течение 10 мин, затем жидкость частично удал ют в результате фильтрации с отсосом, оставл при этом важный магнетит, который нагревают при 105 С в течение 5 ц дл завершени реакции силана с магнетитом. Обработанный магнетит промывают 100 мл этанола и сушат при 105 С в течение одного часа. 10 г образца отбирают из полученной партии и используют согласно методике, описанной в примере 15. в результате чего извлекают 84% -каротина.

Пример 17. 1 кг магнетита с размером частиц примерно 100 меш (BSS) обрабатывают 2 л 1%-ного раствора дихлордиметилсилана в петролей- ном эфире в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем раствор пет- ролейного эфира удал ют фильтрацией под разрежением и обработанный магнетит сушат при 105°С в течение 1 ч. Готов т лне суспензии Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлористо- ,го натри , перва из которых содер- жит 0,5 мг/л, а втора 5,0 мг/л Л - каротина. Порции высушенного магнетита смешивают с 3-литровыми алик- вотами суспензий Dunaliella Salina в течение 5 мин. Затем магнетит удал ют из солевых растворов с использованием магнита и экстрагируют 100 мл гексана. Гексановый раствор анализируют колориметрически на содержание /3-каротина в результате поглощени света с длиной волны 460 нм.

В табл. 1 приведены значени величины извлечени В-каротина при использовании указанных концентраций 0-каротина в суспензи х и указанных количествах магнетита.

Таблица 1

Пример 18. 500 г сухого маг нетита с размером части 120 мега (BSS) обрабатывают 1 л 1%-ного раствора дихлордиметилсилана в петролей- ном эфире при окружающей температуре в течение 3 ч. Обработанный магнетит отдел ют от растворител декантацией и сливанием с помощью магнита , сушат в течение 0,5 ч и затем размагничивают. Оставшиес в смеси куски разбивают. Каждую из семи 3-литровых аликвот рассола, содержащего Dunaliella (с солевых копий) смешивают с 60 г силанизированного магнетита и тщательно перемешивают в течение 5 мин. Затем магнетит собирают с использованием магнита и сушат на фильтре, работающем под разрежением.

Полученные таким образом семь образцов магнетита, содержащих адсорбированные клетки Dunaliella, объедин ют и ровно расцредел ют по поверхности тонкой стекловаты, которую затем помещают на одну лопасть У-образного сосуда дл работы под давлением. Затем этот сосуд переворачивают и ввод т 500 мл жидкой двуокиси углерода (под давлением АООО кПа и 8 С) и этому растворителю дают повторно перколировать через стекловату путем многократного перевертывани сосуда. Затем жидкую двуокись углерода отвод т и замен ют на свежую аликвоту жидкости. Используют три 500 мл аликвот жидкой двуокиси углерода. Испарение двуокиси углерода дает соответственно 0.36, 0,38 и 0,15 г красной маслообразной жидкости , котора закристаллизовывает- с при охлаждении до -5°С с образованием 23 мг кристаллического 3 -каротина .

Пример 19. Стекл нную вату подвергают силанизации и надел ют гидрофобными свойствами при помощи погружени на 10 мин в 10%-ный (об./ /об.) раствор дихлордиметалсилана (силан А156 фирмы Юнион Карбайд) в гексане. Затем обработанную стекл нную вату промывают п ть раз дистиллированной водой. Колонну длиной 15 см и с внешним диаметром 7 см аккуратно наполн ют 90 г обработанной таким образом стекл нной ваты и 1,5 суспензии клеток Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлорида натри и содержащей 1,0x10 клеток/мл пропускают через эту колонну с объемной скоростью 1,3 л/мин. Собранный вытекающий поток (1,5 л) содержит 1,1х х10 клеток/мл, что указывает на то, что 89% клеток, введенных в колонну, адсорбируетс на стекл нной вате.

Затем насыщенный раствор хлорида натри (1,5 л), не содержащий клеQ ток, пропускают через колонну с той же объемной скоростью и так же собирают вытекающий поток. Установлено, что поток содержит некоторое количество бактериальных клеток и части , цы глины, причем, как то, так и другое содержитс в исходной суспензии, но содержание клеток Dunaliella Salina в нем составл ет менее 10 клеток/мл , что указьшает на то, что по

f. существу нет клеток, адсорбированных на стекл нной вате.

Затем через колонну пропускают 1 л 0,5 М раствора хлорида натри в дистиллированной воде, не содержа-

5 шей клеток, при этом вытекающий поток собирают.

Установлено, что вытекающий поток содержит 1,3 X 10 клеток Dunaliella Salina/MJi, что соответствует 97%

Q клеток, которые адсорбированы на стекл нной вате.

Затем стекл нную вату регенерируют при ПОМО1ЧИ пропускани 1,6 л дис- циллированной во;ф1 через колонну с

тем, чтобы смыть любые оставишес

клетки или осколки клеток. Регенерированную стекл нную вагу вновь используют дл аналогичного эксперимента с еще одной пробой такой же суспензии Dunaliella, при этом получают идентичные результаты.

Пример 20. Провод т серию экспериментов в соответствии с процедурой , описанной в примере 19, затем исключением, что силанизиро- ванную стекл нную вату замен ют органическими полимерными волокнами. В каждом случае имеет место хороша адсорбци клеток Dunalliella, причем

0 адсорбированные клетки водорослей удерживаютс в том случае, когда через колонну пропускают свелоп насыщенный раствор хлорида натри с тем, чтобы удалить поглощенные частиг1ы

5 глины и бактериальные клетки. По существу , все адсорбированные KJICTKTI водорослей десорбируютс , когда их пропускают через колонну П,5 М рлсг0

5

вор хлорида натри . Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Таблииа2

Политетрафторэтилен, активированный перед использованием нагреванием до 316 С в 98%-ной серной кислоте с добавлением достаточного количества азотной кислоты дл того, чтобы V сделать смесь бесцветной. Волокно затем извлекают, промывают водой и суишт перед использованием .

Как и в дополргительном примере 19 волокна регенерируют при помощи пропускани воды через колонну, а затем вновь используют в идентичных экспериментах с другими пробами такой же суспензии Dunaliella, в результате были получены по существу аналогичные результаты.

Пример 21. Магнетит (10 г), пропуп1енный через сито в 120 меш (ESS), диаметр отверсти сита О,123мм подвергают силанизации с использованием 10%-ного (об./об.) раствора ди- хлордиметилсилана в гексане в течение 20 мин, затем промывают водой и сушат при 110 С. Силанизированный магнетит перемешивают с 50 мл суспен- зии, содержащей 2x10 клеток на мл Dunaliella Salina, в насыщенном растворе х-порида натри в течение 10 мин после чего силанизированный магнетит извлекают из раствора при помоищ посто нного магнита.

0

5

0

5

0

Установлено, что раствор содержит 3x10 клеток/мл, что указывает на то, что 85% клеток, первоначально содержащихс в суспензии, бьиго адсорбировано на магнетите.

Затем магнетит суспендируют в 50 мл насып1енного раствора хлорида натри , не содержащего клеток, перемешивают в течение 10 мин и извлекают , как это делалось ранее. Установлено , что раствор содержит 1,2x10 клеток/мл, что указывает на то, что по существу клетки не десорбируютс с магнетита.

I

Затем магнетит пе1)емеш11вают с 30 мл 0,5 М растпора хлорида натри , не содержащего клеток, в течение 10 мин и его извлекают, как это делалось ранее, п результате оставшийс раствор содержит 2,6x10 Dunaliel- 1а/мл, что соответствует 92% десор- бированл клеток, ранее адсорбированных на магнетите.

Силанизированн1.г1 магнетит регенерируют при помощи п тикратной промывки порци ми fl 10 мл воды. Затем повтор ют эксперимент, в результате чего устанавливают, что 837, клеток, i первоначально содержащихс в суспензии , было адсорбировано на магнетите , и 93% этих адсорбированных клеток было десорбировано при помоищ 0,5 М раствора хлорида натри .

Пример 22. Следуют процедуре из примера 21 за тем исключением, что магнетит з.чмен ют на железн к. Установлено, что 82% клеток Dunaliella адсорбировано на красном железн ке и что адсорбированные клетки не десорбировались насьпценным раствором хлорида натри . После перемешивани нагруженного красного железн ка с 0,5 N раствором хлорида натри было десорбировано 95% адсорбированных клеток.

Пример 23. Следуют процедуре из примера 21, причем силанизированный магнетит замен ют серией гидрофобных минералов, так как эти минералы были немагнитными, они удал лись из раствора при помопш оса)ц1,ени и декантации верхнего сло ; п1дкости через фильтр, содержащий не очень сильно уплотненную прокладку ит стекл р - ной ваты. Резу 111,таты ириредены в табл. 3,

13 т а б

лица

1851

пользовании 0,5 М раствора хлорида натри .

Изобретение позвол ет получить р-каротин.фактически не содержащий нежелательных каротиноидов, липидов и т.п., источником которых служат галобактерии, кроме того, изобретение позволит упростить способ за счет исключени сложных операций фильтровани или центрифугировани .

Из табл. 3 видно, что хороша адсорбци клеток Dunaliella имеет место из насыщенного раствора хлорида натри и что исключительно высока десорбци достигаетс при исФормула изобретени

Способ получени -каротина из суспензии водорослей рода Dunaliella в растворе хлорида натри с концентрацией tie менее 3 М. включающий отделение раствора хлорида натри от

водорослей, экстракцию водорослей растворителем и удаление последнего из экстракта, отличающий- с тем, что, с целью улучшени качества PI -каротина и упрощени процесса , отделение раствора хлорида натри от водорослей ведут контактированием суспензии с корпускул рным или волокнистым гидрофобным адсор- бантом.

Claims

Формула изобретения

Способ получения β -каротина из суспензии водорослей рода Dunaliella в растворе хлорида натрия с концентрацией не менее 3 М. включающий отделение раствора хлорида натрия от водорослей, экстракцию водорослей растворителем и удаление последнего из экстракта, отличающийс я тем, что, с целью улучшения качества |Ь -каротина и упрощения процесса, отделение раствора хлорида натрия от водорослей ведут контактиместо из насыщенного раствора хлорида натрия и что исключительно высокая десорбция достигается при ис рованием суспензии с корпускулярным или волокнистым гидрофобным адсор-’ бентом.