SU1243504A1 - Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена - Google Patents

Description

(21 )3697952/30-15

(22) 16,02.84

(46) 30,10.87. Бюл. № 40

(71)МГУ им. М.В.Ломоносова

(72)С.М.Аваева, И.Г.Атабеков, А.В.Кулинич и А.А.Байков

(53) 632.938 (088.8) (56) Дзантиев Б.Б. и Егоров А.М, Современное состо ние и перспективы развити  иммуноферментного анализа. Ж. Всес. хим. общ-ваИМ. Д.И.Менделеева ,. 1982, т. 27, № 4, 82-89.

M.J.ОSullivan, J.W.Bridges, V.Marks. Enzyme innnunoassay: a revie Ann. Clin. Biochem, 1979, № 16, 221-240.

Патент OTA № 3839153, КП. 195-1-03, 5, 1974. .

Патент Велитсобритании № 597754, кл. С 01 В, 1979.

.Патент США № 4298686, кл. 435-7, 1981.

S.A.Lommel, А.Н.McCain, T.J.Morris . Evaluation of indirect of enzymelinked immimosorbentassay. 1982, 72, № 8, 1018-1022.

(54)(57) СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИШУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение конъюгата и антитела из .образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически , отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствител.ности способа, после проведени  реакции с субстратом в реакционную смесь внос т следующие ингредиенты, мас.%: соль молибденовой кислоты

0,15-0,9; краситель малахитовый зеленый 0,005-0,05} поверхностно-активное вещество 0,01-0,06 и неорганическую кислоту 3-7,5. Изобретение относитс  к сельскому хоз йству и медицине и может быть использовано дл  определени  антигенов в биологических и других объектах . Цель изобретени  - повышение чувствительности способа за счет использовани  цветной реакции при определении количества продукта ферментативной реакции. Способ заключаетс  в проведении последовательности следующих операций: получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение конъ.югата и антитела из образца к поверхности твердой фазы, проведени  реакции с субстратом и определении количества антигена в образце ризуальноили колориметрически, ПоаЬе проведени  реакции с субстратом в реакционную смесь внос т ингре диенты, обеспечивающие цветную реакцию , мас,%: соль молибденовой кислоты 0,15-0,9; краситель малахитовый зеленый 0,005-0,05; поверхностноактивное вещество 0,01-0,06 и неорга ническую кислоту 3-7,5, Коэффициент экстинции дл  цветной реакции состав л ет около 70000 см , что в 4,6 раза превышает коэффициент эксти ции п-нйтрофенола. Кроме того, измер ема  окраска измен етс  от бледножеоПой в отсутствие антигена до  рко при высокой его концентрации что наиболее благопри тно дл  визуальной .оценки результатов анализа Эти два фактора значительно увеличивают чувствительностьопределени , особенно при качественном анализе низких концентраций антигена, Е -р и м е р 1, Определение антигена - вируса У картофел , Конъюгат антител вируса У и щелоч ной фосфатазы кишок теленка получали обра.боткой их смеси 0,1%-ным водным раствором глутарового альдегида, В углублении микроплаты дл  иммуноферментного анализа последовательно помещали на 10-15 ч при 4°С по 0,2 мл раствора антител (2 мкг/мп) в карбонатном буфере (рН 9,6), суспензию вируса У известной концентрации в 0,1 М буфере трис-НС (рН 7,4) и конъюгата (0,3 ед/мл) в 0,1 М буфере трис-НС1 (рН 7,4) с промежуточной промывкой 0,1%-ным водным раствором твина - 20 и водой, Затем прибавл ли 0,2 мл раствора п-нитрофен илфосфата (2 мм) в 0-, 1 М буфере диэтаноламин-НС1 (рН 9,8), содержащем 0,5 мМ MgCl , и инкубировали 15 мин при 20°С, Реакцию останавливали прибавг лением 0,05 м. мл окрашивающего раствора , содержащего молибдат аммони , краситель малахитовый леный, поверхностно-активное вещество и кислоту . Через 10МИН измер ли оптическую плотность при 630 нм с помощью денситометра . Дл  получени  сравнительных дан ньгх параллельно определ ли вируса У известным методом, использу  те же препараты специфических антител и коньюгата. Раствор субстрата содержал 10 мМ п-нитрофенилфосфат, 1 М буфер диэтаноламин-НС1 (рН 9,8) и Ор5 мМ MgCl. Дл  остановки реакции гидролиза субстрата прибавл ли 0,05 мл 4 М водного раствора NaOH, Значени  оптической плотности дл  р да известных концентраций вируса У при различном соотношении ингредиентов окрашивающего раствора приведены в табл,1. Количество ингредиентов указано по отношению к конечной смеси окрашивающего раствора и раствора субстрата, В качестве кислоты в пробах 1-11 использована серна  кислота, в пробе 12 - сол на  кислота и в пробе 13 - хлорна  кислота, В качестве поверхностно-активного вещества в пробах 1-9, 12 и 13 использован твин20 , в пробе 10 - стерокс, в пробе 11 - тритон Х-305,

Таблица 1

Как видно из табл.1, увеличение содер гани  молибдата аммони  от 0,15 до 0,9 мас,% приводит к возрастанию оптической плотности. При 0,15 и 0,3 мас,% мопибдата аммони  оптическа  плотность в отсутствие вируса не увеличивалась через 1ч после прибавлени  окрашивающего раствора, а при 0,9 мас.% увеличивалась на 0,10 ,15, Поэтому оптимальной  вл етс  концентраци  молибдата аммони  0,3 мас.%.

Увеличение количества малахитового зеленого также приводило к возрастанию оптической плотности, но из-за значительного увеличени  фона в опыте с 0,05 мас,% малахитового зеленог oптимaль юй  вл етс  величина 0,017 мас,%.

Увеличение количества твина-20 снижало величину оптической плотности , но обеспечивало оптическую прозрачность раствора при более высоких значени х оптической плотности и снижало величину фона. Оптимальной  вл етс  концентраци  твина-20 0,04 мас,%, при которой раствор оптически прозрачен до оптической плотности 5,0, а величина фона не превышает 0 ,07.

При использовании в качестве поверхностно-активного -вещества твина20 , стерокса или тритона Х-305 получены близкие значени  оптической плоности .

Увеличение и уменьшение концентрации серной кислоты по сравнению с 5 мас.% снижало оптическую плотность

50 Использование сол ной и хлорной кислот несколько увеличивало оптическую плотность, но при этом оптическа  плотность .в отсутствие вируса увеличивалась за Г ч на 0,1-0,15 и 0,2-0,3

55 соответственно. Поэтому оптимальной  вл етс  серна  кислота в концентрации 5 мас.%, 1IO-желтой в отсутствие-вируса до  р ко-синей при вь1сокой его концентрации .. Окраска в пробах с оптической плотностью вьше 0,15 достоверно отличаетс  от окраски фона, В изйестном способе окраска измен етс  от бесцветной в отсутствие антигена до желтой в присутствии антигена и окраска проб достоверно отличаетс  от окраски фона лишь при оптической плотности вьппе Ь,0, Предлагаемым и Известным способа ми измерено содержание вируса У в экстрактах двух образцов листьев картофел  с помощью окрашивающего раствора состава, использованного в примере 1, Полученные данные приведены в табл. 2, Т а б л и ц а 2

0,13

0,12 . 1,15 1,15

О 6,7

0,071 0,141

200,291

600,632 46 Как видно из табл.2, два способа дают близкие значени . Предлагаемым способом наличие, вируса в образце 1 определ етс  визуально, тогда как в известном способе об зательно использование денситометра. П р и м е р 2. Определение антигена ЗЗ-глобулина сем н гречихи. Способ осуществл етс  согласно г, примеру 1, использу  антитела к 13Sглобулину сем н гречихи и концентрацию , 10 0,1 NM. Данные дл  р да концентраций 3S глобулина сем н гречихи приведены в табл.З. ТаблицаЗ Оптическа  Концентраци  сем н гречихи, плотность мкг/л