SU1153669A1 - Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена - Google Patents

Abstract

СНОСОВ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определ емого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуальноили колориметрически , отличающийс   тем, что, с целью повьшени  чувствительности и уменьшени  расхода субстрата, в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ. (Л

Description

Изобретение относитс  к сельскому хоз йству и медицине и может быть использовано дл  определени  антигенов в биологических и других объектах .

Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных ферментом (иммуноферментный анализ), получает все большее распространение благодар  простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными дл  здоровь  веществами . Наиболее пшроко используетс  метод гетерогенного иммунофермент- g ного анализа, при котором соединение антитела с ферментом (коньюгат) присоедин ют к поверхности твердой фазы Существующие способы гетерогенного иммуноферментного анализа различаютс , главным образом типом фермента, использованного дл  получени  коньюг та. Известны способы гетерогенного иммуноферментного анализа антигена с применением р-галактозидазы, пероксидазы , каталазы, глюкозоксидазы, амилазы и дЗ, 3-кетостероидизомеразы . Субстраты этих ферментов - сложны органические соединени , нестойкие при хранении. Визуальный анализ резу татов определени  при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-за невысокой интенсивности окраск или высокой величины фона. Наиболее близким по технической сущности  вл етс  способ гетерогенно го иммуноферментного анализа антиген включающий получение коньюгата специ фического антитела и фермента, присоединение определ емого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически . В качестве субстрата в этом способе используют п-нитрофенилфосфат . Дл  получени  конвюгата специфического антитела и щелочной фо.сфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, после чего избыток последне1 О удал ют диализом или гельфильтрацией. Дл  присоединени  антигена к поверхности твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на не- gg сколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуетс 

определить содержание антигена. Последний присоедин етс  к стенкам сосуда в результате взаимодействи  с адсорбированными на них специфическими антителами. Затем в сосуд помещают раствор коньюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, в результате чего коньюгат св зываетс  с антигеном в количестве, пропорциональном содержанию последнего в образце . После этого прибавл ют раствор субстрата, п-нитрофенилфрсфата и инкубируют с ним. Продуктом ферментативной реакции  вл етс  п-нитрофенол. количество которого измер ют колориметрически при 405 нм. При количественном определении используют калибровочный график, который получают, бер  вместо образца растворы антигена известной концентрации. Качественно присутствие антигена в образце определ ют визуально по по влению желтой окраски. Однако недостатком способа  вл етс  невыска  чувствительность, что св зано с тем, что продукт реакции, п-нитрофенол, имеет невысокий коэффициент экстинкции (15000 ), и возникающа  желта  окраска плохо воспринимаетс  визуально. Допустимый срок хранени  субстрата в растворенном виде составл ет около 1 недели, в твердом виде субстрат заметно разлагаетс  даже при хранении при пониженной температуре, что приводит к возрастанию фона. При определении активности щелочной фосфатазы использз т высокую концентрацию субстрата (Ю мМ), что св зано с высоким значением константы Михаэлиса (1-3 мМ), Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительности и уменьшение расхода субстрата. Поставленна  цель в способе гетеро- генного иммуноферментного анализа антигена , включающем получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определ емого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически , достигаетс  тем, что в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ. Таким образом, сущность изобрете-. ни  заключаетс  в использовании раствора соли пирофосфорной 5сислоты вместо п-нитрофенилфосфата. Продуктом ферментативной реакции в описываемом способе  вл етс  ортофосфат дл  определени  которого используетс  цветна  реакци , изменение коэффициента, экстинкции дл  которой составл ет около 70000 М см , что в 4,6 раз BbiBie, чем дл  п-нитрофенола. Поэтому , несмотр  на то, что скорость образовани  ортофосфата из соли пирофосфорной кислоты равна 40% скорости образовани  п-нитрофенола из п-нитрофенилфосфата , измер ема  оптическа  плотность в описываемом, способе в 1,8 раза вьше. Кроме того измер ема окраска измен етс  от бледно-желтой в отсутствии определ емого антигена до  рко-синей в его присутствии, что наиболее благопри тно дл  визуальной оценки результатов анализа. В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определени , особенно при качественном анализе наличи  низких концентрацией определ емого , антигена. Соль пирофосфорной -КИСЛОТЫ, используема  в качестве субстрата, устойчива неограниченное врем  в твердом состо нии, до 1 года в растворе при °С и до 2 мес цев в растворе- при комнатной температуре. Константа Михаэлиса дл  щелочной фосфатазы по пирофосфат-иону составл ет около 15 мкм, по причине чего можно использовать концентрацию соли пирофосфорной кислотыiOO мкм, что в 100 раз меньше чем дл  п-нитрофенил- фосфата.

Преимуществом изобретени   вл етс  также значительно меньша  стоимость субстрата, - .

Пример 1, Определение антигена - вируса У картофел ,

Коньюгат антител к вирусу У и щелочной фосфатазы кишок теленка получали обработкой их смеси водным раствором глутарового альдегида в концентрации 0,1 мас,%, В углублени  микроплаты дл  иммуноферментного анализа последовательно помещали на 1015 ч при 4С по 0,2 мл раствора анTHjen (2 мкг/мл) в карбонатном буфере рН 9,6, исследуемого экстракта или суспензию очищенного вируса У в 0,1-М буфере трис-НС1 рН 7,5, раствора коньюгата (0,3 ед/мл) в 0,1 М буфере трис-НС1 .рН 7,5 с промежуточной промывкой раствором твин-20 (0,1 мас,%)

и водой, прибавл ли 0,2 мл раствора ,3,0, 10H,j,0 в 0,1 М буфере трисНС1 рН 8,5 и инкубировали 15 мин при , Реакцию с субстратом останавливали прибавлением 0,05 мл окрашивающего реагента следующего состава, мас,%: молибдат аммони  1,3, краситель малахитовый зеленый 0,07, твин20 - 0,15, серна  кислота 20, остальное - вода. Через 10 мин измер ли оптическую плотность при 630 нм с помощью денситометра,

Дл  получени  сравнительных данных параллельно производили определение вируса У в образцах известным методом, использу  те же препараты антител и коньюгата. Раствор, субстрата содержал 10 мМ п-нитрофенилфосфата , Г М диэтаноламин-НС1 рН 0,8 и 0,5 мМ MgClg, Дл  остановки реакции с субстратом прибавл ли 0,05 мл 4 М водного раствора NaOH, Оптическую плотность измер ли при 405 нм.

Данные дл  р да известных концентраций вируса У (калибровочные зависимости ) сведены в т,абл, 1,

Таблица

Как видно из табл,1, оптическа  плотность, измеренна  предлагаемым способом, вьше чем измеренна  известным способом. Видно; также, что оптическа  плотность в присутствии антигена возрастает с ростом концентрации соли пирофосфорной кислоты. Однако при этом возрастает также величина оптической плотности в отсутствии антигена (фон). При концентрации соли пирофосфорной кислоты 0,02 и 0,1 м оптическа  плотность стабильна в течение часа, а при концентрации 1 мМвозрастает на 0,2-0,4 едииицы. Таким образом, оптимальной  вл етс  концентраци  0,1 мМ. I, При визуальном анализе обнаружено что окраска проб измен етс  от бледно-желтой в отсутствии антигена до  рко-синей при высокой концентрации антигена. Окра.ска в пробах с оптической плотностью вьппе 0,15 достоверно отличаетс , от окраски фона. В известном способе окраска измен етс  от бесцветной до желтой, и окраска проб достоверно отличаетс  от окраски фона лишь при оптической плотности выше 1 единицы. При определении содержани  вируса У в экстрактах двух образцов листьев картофел  следующие ре зультаты, приведенные в табл. 2. Как видно, два способа дают близкие значени . Предлагаемым способом наличие вирусаУ в образце 1 определ етс  визуально, тогда как в извест ном способе об зательно использовани денситометра. Таблица2 Пример2. Определение 13 S-глобулина сем н гречихи. Способ осуществл етс  согласно примеру 1, использу  антитела к 13Sглобулину сем н гречихи и следующие концентрации ингредиентов окрашивающего раствора, мас.%: молибдат аммони  0,3, малахитовый зеленый 0,017, твин-20 -0,04, серна  кислота 1 н. Ниже приведены данные,полученные дл  р да концентраций 13S-глобулина сем н гречихи. Концентраци  1ЗЗ-глобу- Оптическа  лина сем н гречихи, плотность мкг/л О0,06

Claims (1)

1. СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально'или колориметрически, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ.

   S

   SU „„ 1153669