SK80195A3 - Method of preparation for effective toxoplasma gondii bradyzoit vaccine in the tissue culture - Google Patents

Description

Predložený vynález sa týka toxoplazmózy. Špecifickejšie sa vynález týka tkanivovej kultúry vakcín a diagnostických kitov spôsobov jej prípravy a použitia.

Doterajší stav techniky

Toxoplazmóza je dôležitou a domácich zvierat. Je ozn

Toxoplazma gondii (T. gondii),
pripravených	pri jej použití,
parazitárnou	chorobou	u íudi
čovaná ako	vážny	problém

u séronegatívnych tehotných žien, ktoré ak sú infikované počas tehotenstva, môžu nosiť malformovaný alebo mŕtvy plod. Je tiež pokladaná za vážny problém u jednotlivcov s potlačenou imunitou ako sú pacienti s AIDS a pacienti s rakovinou pri niektorých terapiách liekmi, ktoré potlačujú imunitu. Mnohí z týchto jednotlivcov umierajú kvôli toxoplazmóze.

Mačky sú jedinými zvieratmi, o ktorých je známe, že rozširujú chorobu vylučovaním oocýst. Po prvej expozícii spotrebovaním T. gondii infikovaných cicavcov alebo vtákov nevykazujú žiadne znaky choroby, ale vylučujú až 100 miliónov čerstvých oocýst vo svojich fekáliách. Tieto oocysty môžu zostávať vo vlhkej a znečistenej pôde až 18 mesiacov a sú infekčné voči íud'om a iným živočíchom v priebehu tejto doby. Oocysty môžu infikovať iné cicavce v priebehu kontaktu s nimi, hlavne orálnou cestou. Mačky sa stávajú infikované po žitím infikovaných malých cicavcov a vtákov, ktorí vo svojich tkanivách nosia cysty alebo oocysty. Mačky sú preto konečnými hostireír.i v komplexe života T. gondii. Pohlavný replikačný cyklus cýst T. gondii prebieha v črevách mačiek a vedie k oocystám, ktoré mačky roznášajú vo svojich fekáliách.

Oocysty sú infekčné pre spôsobom.

T. gondii, tkaniva.

orálnym delenia akútnu infekciu iných cicavcov, ktorí sa zvyčajne U týchto iných cicavcov štádium ktoré sa nazýva tachyzoity, môže Oveľa latentnejšie štádium sa nazýva bradyzoity, sa vyvíja sa vyvíjajú v tkanivových cystách delenia, ktoré Bradyzoity infikujú rýchleho spôsobiť pomalého z tachyzoitov.

(ochranný obal). Tisícky bradyzoitov sa-môžu vyvíjať v tkanivovej cyste. Tieto tkanivové cysty sa nachádzajú v skeletálnom a srdečnom svale, mozgu a iných tkanivách centrálneho nervového systému. Obzvlášť podstatná je infekcia buď priamym kontaktom s oocystami v pôde alebo boxoch alebo konzumáciou nedovareného mäsa infikovaných zvierat, obsahujúcich infikované tkanivové cysty. I keď iné cicavce nepodporujú pohlavný rozmnožovací cyklus T. gondii, môžu byť tiež infikované T. gondii. Infekcia vedie k systémovej parazitémii a tvorbe tkanivových cýst.

Ako je zrejmé z predchádzajúceho, vakcína, ktorá by mohla chrániť mačky pred infekciou a následne šírením oocýst, by bola cenným prínosom pre ľudské zdravie. Dr. J. Frenkel a E. Pfefferkron (US patent č. 4473549) identifikovali oocystový negatívny mutant T. gondii, označený T-263. Orálne podanie tkanivových cýst T. gondii mačkám vyvoláva imunitu k šíreniu oocýst, nasledovanému po podnete.

Pretože tachyzoity ľahko rastú v tkanivových kultúrach, bola by ideálna vakcína pripravená z tachyzoitov. Avšak živé alebo inaktivované vakcíny, obsahujúce tachyzoity T-263 mutantu, neboli pokladané za chrániace mačky. Podrobnejšie - nechránia mačky od rozširovania oocýst po vystavení pôvodným kmeňom. Je potrebné uviesť, že i keď sa tachyzoity chirurgicky podajú do duodena, nechránia mačky pred rozširovaním oocýst po podnete s pôvodným divokým oocysty rozširujúcim kmeňom, ktorý je označený ako T-265.

Na rozdiel- od tachyzoitov, bradyzoity modifikovaného živého T-263 mutantu produkované v myši sa ukázali ako chrániace pred rozširovaním oocýst (Frenkel, US patent č. 4473549) nasledujúcim spôsobom. Zatiaľ čo modifikovaný živý T-263 kmeň bol neschopný produkovať oocysty (negatívny fenotyp) pri podaní mačkám, chráni pred rozširovaním oocýst, ak mačky boli vakcinované s T-263 a potom vystavené virulentnému, oocysty produkujúcemu kmeňu T. gondii.

I keď bradyzoity T-263 sú zjavne účinné vo vakcínach, neexistujú žiadne správy o produkcii 'bradyzoitov v tkanivovej kultúre v komerčnej mierke. Súčasne vedomosti rastu bradyzoitov v tkanivovej kultúre zahrňujú rast tachyzoitov v laboratórnej mierke, za špeciálnych podmienok a ich prevedenie na bradyzoity v tkanivových cystách. Lindsay a kol. (J. Parazitology, 1991, 77 (I), str. 126 - 132) popisujú tvorbu tkanivovej cysty s kozím izolátom T. gondii v nasledujúcich bunkách: hovädzie monocyty, bunky plúc ludského zárodku a Madin - Darby bunky hovädzích obličiek. Avšak mačky kŕmené prípravkami, obsahujúcimi tieto bradyzoity kultivované v tkanivovej kultúre, rozširujú oocysty vo svojich fekáliách. Práca Lindsaya a spol. popisuje použitie T. gondii kultivovanej v tkanivovej kultúre na testovanie liekov na aktivitu voči týmto organizmom. Neuvádza použitie tkanivových cýst v tkanivových kultúrach na vývoj vakcíny. Nezmieňuje sa o inhibícii rastu tachyzoitov použitím protilátok alebo inými prostriedkami.

Jones a kol. (Infection and Immunity, január 1986, str. 147 - 156) popisuje in vitro kultiváciu T. gondii cýst v myších astrocytových bunkách. Článok uvádza použitie gama interferónu na inhibíciu nadmerného rastu buniek tkanivovej kultúry s tachyzoitmi kvôli umožneniu vývoja tkanivových cýst. Neuvádza použitie protilátok alebo enzýmov. Tiež neuvádza použitie tkanivových cýst rastúcich v tkanivovej kultúre pre produkciu vakcíny. Hlavne článok uvádza, že je potrebných 40 až 80 dní na tvorbu významného množstva tkanivových cýst. Náklady na tak dlhý rast by bránili komerčnej produkcii vakcín.

Shimada a kol. (Árch. Opthalmol., zv. 92, december 1974) uvádza, že RH kmeň T. gondii môže rásť v králičích korneálnych endoteliálnych bunkách v Leightonových skúmavkách. Článok uvádza použitie protilátky a komplementu morčiat na inhibíciu rastu tachyzoitov. Uvádza, že použitie imúnneho séra samotného alebo samotného komplementu morčiat minimálne inhibuje rast tvorby tachyzoitov a že ich kombinácia vykazuje synergický účinok. Článok neuvádza použitie enzýmov na usmrtenie tachyzoitov alebo použitie tkanivových cýst na prípravu alebo testovanie vakcín.

Výroba účinnej a nákladovo prijatelnej vakcíny T. gondii založenej na tkanivovej kultúre by bola velmi žiaduca. T. gondii bradyzoity neboli produkované v komerčnej mierke v tkanivovej kultúre, formulované, testované vo vakcínach a uvedené ako chrániace, ak sú použité na vakcináciu mačiek.

Podstata vynálezu

V súlade s vyššie uvedeným poskytuje predložený vynález tkanivovú kultúru produkovanú T. gondii, obsahujúcu imunogénne účinné množstvo bradyzoitov na ochranu mačiek pred rozširovaním oocýst. Výrazom imunogénne účinné množstvo je mienené množstvo bradyzoitov vo vakcíne, ktorá bude chrániť mačky pred rozširovaním oocýst. V predloženom vyhotovení vynálezu, tak málo ako 10 modifikovaných živých bradyzoitov podaných orálne mačkám môže poskytnúť ochranu.

Predloženým vynálezom je možné dosiahnuť tkanivové kultúry, obsahujúce T. gondii bradyzoity, v komerčnej mierke. Výraz komerčná mierka znamená, že T. gondii bradyzoity sú produkované v tak vysokom výťažku, že vakcína môže byť formulovaná za ich použitia bez väčšej a/alebo nákladnej koncentrácie antigénneho materiálu tkanivovej kultúry.

Ako je potrebné uviesť, koncentrácia antigénneho materiálu môže poškodiť živé bradyzoity. V spôsoboch podlá stavu techniky ako je tkanivový rast T. gondii v laboratórnej mierke, by antigénny materiál mohol byť koncentrovaný na produkciu vakcín, ktoré ho obsahujú.

Do rozsahu vynálezu spadá i spôsob prípravy tkanivovej kultúry T. gondii, zahrňujúci: kultiváciu tachyzoitov T. gondii v tkanivovej kultúre, udržiavanie tkanivovej kultúry pred nadmerným rastom tachyzoitov a vyvinutie bradyzoitov v tkanivových cystách a usmrtenie zvyšných tachyzoitov.

Do rozsahu predloženého vynálezu kity, obsahujúce vynálezu.

diagnostické predloženého tiež spadajú vakcíny organizmy získané alebo podlá podania oocýst

Spôsob rozširovaním vynález podrobnejšie vakcíny mačkám tiež spadá do popísaný.

kvôli ich ochrane rozsahu vynálezu. Ďalej pred bude predložený vynález vedený na T. gondii, ktorá obsahuje na ochranu mačiek pred

Ako je vyššie tkanivovú kultúru imunnogenicky účinné T. gondii.

bunky alebo bunečnej línie, Ilustrativne môže byť tkanivová bunečná línia vybraná zo skupiny, zahrňujúcej embrya, myšie astrocytové bunky, ludskú bunečnú líniu a ludskú diploidnú plúcnu organizmu boli demonštrované Cutter uvedené, je produkovanú množstvo bradyzoitov

Môže byť použitá akákoľvek tkanivová kultúra primárnej ktorá podporuje rast T. gondii. kultúra alebo bunečná bunky plúc hovädzieho Foreskin fibroblastovú bunku (MRC-5). Tiež pre rast organizmu boli demonštrované Crandell bunečná línia (mačacia), Cutter Laboratories bunečná línia psích obličiek (CLDK), Vero bunečná línia a Madin-Darby bunečná línia hovädzích obličiek (MDBK). Pomaly rastúce bunky ako embryonické hovädzie plúcne bunky, sú obzvlášť výhodné bradyzoitov.

pri kultivácii T. gondii

Vhodná T. gondii je tá, ktorá obsahuje chrániaci antigén a chýba jej reprodukčná schopnosť. Výrazom chýba reprodukčná schopnosť je mienené, že kmeň T. gondii nemôže produkovať oocysty, ktoré by mohli byť rozširované do prostredia. Ilustrativnym, ale neobmedzujúcim príkladom T. gondii, ktorá je tu použiteľná, môže byť T-263 mutant, ktorý bol deponovaný v Američan Type Culture Collection a bol označený ATCC prírastkovým číslom č. 40615.

Modifikované živé alebo produkované vystavením tachyzoi kmeň alkylačnému

N-metyl-N-nitro-nitrózo-guanidin L.C., Toxoplasma gondii: Characterization of Temperature Parasitology 33, 365 - 376 (197

zoslabené	mutanty môžu	byť
v kmeňa T.	gondii ako je	C
činidlu,	ako	je

(Pfefferkron E. R. a Pfefferkron

Isolation and Preliminary Sensitive Mutants. Experimental ) a izoláciou mutantov, ktoré sú odolné k jednému alebo viacerým antimetabolitom. Rezistentné mutanty sú potom ďalej selektované na oocystový negatívny fenotyp a nakoniec selektované na ich schopnosť chrániť mačky.

V špecifickom vyhotovení spôsob prípravy tkanivovej kultúry T. gondii zahrňuje: kultiváciu T. gondii tachyzoitov v tkanivovej kultúre; udržiavanie pred nadmerným rastom tachyzoitov a z nich vyvinutie bradyzoitov v tkanivových cystách prídavkom T. gondii - špecifické protilátky (pozitívne antiséra); rast bradyzoitov do vysokého výťažku, ktorý je dostatočný na prípravu imunogénne účinného množstva bradyzoitov a redukciu počtu zvyšných tachyzoitov prídavkom enzýmov, ktoré sú smrtiace pre tachyzoity. Tkanivová kultúra je preto charakterizovaná tým, že je v podstate zbavená živých tachyzoitov. Proces vedie k vysokému výťažku bradyzoitov na prípravu vakcín v komerčnej mierke. Bez obmedzenia akoukolvek čiastkovou teóriou vynálezu sa má za to, že T. gondii tachyzoitmí infikovaná tkanivová kultúra je stimulovaná na produkciu bradyzoitov v tkanivových cystách prídavkom pozitívneho antiséra.

Nasleduje podrobnejší, ale prípravy T. gondii v tkanivovej v systémoch tkanivových kultúr, systémami. Ak rast tachyzoitov neobmedzujúci popis spôsobu kultúre. Tachyzoity môžu rásť ktoré sú typicky uzatvorenými dosiahol dostatočne vysokú hladinu, kedy je pozorovaný typický cytopatický efekt, pridá sa ku kultivačnému systému T. gondii - špecifická protilátka (pozitívne antisérum). Pozitívne antisérum môže byť použité v takej koncentrácii, že je účinné pri chránení tkanivovej kultúry pred nadmerným rastom tachyzoitov. Môže byť použitá koncentrácia 0,1 % až 10 % a výhodne 3 % až 5 %. Ilustratívne príklady pozitívneho antiséra môžu byť bez akéhokoľvek obmedzenia vybrané zo skupiny, zahrňujúcej kozie, králičie, konské a hovädzie. Tkanivové cysty, obsahujúce bradyzoity, sa nechajú vyvinúť až do dosiahnutia maximálneho počtu tkanivových cýst.

V tomto štádiu sa pridá proteolytický enzým ku tkanivovej kultúre v množstve dostatočnom v podstate na odstránenie zvyšných tachyzoitov. Prídavok proteolytíckého enzýmu tiež spôsobí otvorenie tkanivových cýst a spôsobí uvoľnenie bradyzoitov. Proteolytický enzým môže byť použitý v koncentrácii od 0,0001 % do 5 % a výhodne od 0,0001 % do 0,1 % hmot./obj.. Proteolytický enzým môže byť vybraný zo skupiny, zahrňujúcej pepsín, trypsín a chymotrypsín; preferovaný je pepsín.

Na prípravu v komerčnej mierke sa použije tkanivový kultivačný systém ako je otočná nádoba, bioreaktor alebo podobne. Ilustratívne, jedna otočná nádoba, obsahujúca 200 ml až 1 liter tkanivového kultivačného média, môže produkovať až 500 dávok vakcín. Doba požadovaná na rast je približne sedem dní.

Rysom vynálezu je, že pri použití systémov, pracujúcich vo veľkej mierke, sa jedná o uzatvorené systémy pre rast T. gondii bradyzoitov, nevyužívajú sa striekačky ani ihly na inokuláciu buniek. Uzatvorené systémy preto chránia ľudí pred infekciou. Je tiež rysom vynálezu, že použitím tkanivovej kultúry ňa rast T. gondii môže byť riadená koncentrácia reaktívnych zložiek vakcín.

V podstate tkanivová kultúra môže rásť zbavená živých kontaminantov (baktérií, vírov, plíesní) a môže byť v podstate zbavená reaktívnych zložiek.

Produkty obsahujúce tkanivové kultúry môžu byť vakcíny, diagnostické kity alebo podobne. Vakcína, obsahujúca tkanivovú kultúru, môže byť formulovaná technikami, ktoré sú v odbore známe. Výsledná vakcína obsahuje T. gondii v štádiu, ktoré je účinné na ochranu mačiek voči T. gondii. V predloženom vyhotovení vynálezu obsahuje vakcína T. gondii bradyzoity. Vakcína môže byť v živej alebo modifikovanej živej forme a môže byt v kvapalnom, zmrazenom alebo lyofilizovanom stave. Diagnostický kit môže byt pripravený technikami známymi v odbore.

\⁷ynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré však neslúžia k jeho obmedzeniu a kde všetky diely a percentá sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Ďalej je popísaný špecifický príklad rastu T-263 tkanivových cýst, obsahujúcich bradyzoity. Violky, obsahujúce očkovacie tachyzoity získané od Master Seed produkované v myšom peritoneálnom exudáte a obsahujúce 5 x 10⁵/ml tachyzoitov boli nechané roztopiť a pridané k súvislej Human Foreskin Fibroblast (HSF) monovrstvovej kultúre. Boli nechané, aby sa rozmnožovali až do úplného cytopatického účinku (CPE). Toto prvé spracovanie pasážou tkanivovou kultúrou bolo vykonané kvôli úprave tachyzoitov na tkanivovú kultúru. Embryonické hovädzie pľúcne (EBL) bunky boli kultivované v 75 cm³ bankách za použitia Dulbeccovho minimálneho základného média DMEM + 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) + glutamín a gentamicín. Keď sú bunky súvislé, bolo médium odstránené a bolo pridaných 12 ml/fľaštička Toxoplasma Maintenance Médium (TMM = DMEM so 4500 mg/ml glukózy, 3 % FBS, % glutaminu pri 2 mM a 50 mg/ml gentamycínu). Toto bolo nasledované prídavkom 5 x 10⁵ tachyzoitov z HSF bunečnej kultúry. Fľaštičky boli inkubované pri 37 ‘C v atmosfére 5 % CO2 po štyri dni. Štvrtý deň bolo do každej fľaštičky pridané čerstvé TMM plus 5 % kozieho alebo králičieho antitoxoplazmového séra stanoveného podľa ELISA ako pozitívne. Fľaštičky boli inkubované 3 ďalšie dni za prv uvedených podmienok. Siedmy deň boli cysty zozbierané zoškriabanim buniek gumovou stierkou (alebo podobným zariadením na získavanie buniek, napr. sklenenými guličkami alebo enzýmami (napr. trypsín), ktoré nebudú poškodzovať bradyzoity). Použitím tejto metódy sa získa približne 200 cýst s približne 1 000 000 bradyzoitov na fľaštičku ako bolo stanovené vizuálnym pozorovaním.

Tieto živé tkanivové cysty obsahujúce bradyzoity boli použité na prípravu vakcíny. Boli pripravené vakcíny, v ktorých tkanivové cysty boli nechané intaktné (NON PEPSIN TREATED) alebo boli štiepené 10 min. pri 37 ‘C pomocou 0,05 % pepsínu (PEPSIN DIGESTED). Posledné z uvedených spracovaní nielen zabíja zvyšné tachyzoity, ale tiež uvolňuje bradyzoity. Vakcinové prípravky boli riedené tak, aby obsahovali špecifické množstvá tkanivových cýst alebo bradyzoitov a každý prípravok bol spätne titrovaný na myši v dobe vakcinácie mačky.

Päť mačiek bolo vakcinované buď 10, 100 alebo 1 000 bradyzoitmi, ktoré boli vo forme pepsinom neošetrených (NON PEPSIN TREATED) tkanivových cýst. Ďalších 5 mačiek (na prípravok) bolo vakcinovaných buď 10, 100 alebo 1 000 bradyzoitmi, ktoré boli vo forme pepsinom štiepených (PEPSIN DIGESTED) cýst. Koncentrácie bradyzoitov na dávku boli potvrdené spätnou titráciou v myši. Všetky mačky boli boostrované prípravkami, obsahujúcimi 10, 100 alebo 1 000 bradyzoitov 21 dní po primárnej vakcinácii. 43. deň po primárnej vakcinácii bol všetkým mačkám podaný podnet 10 000 bradyzoitov oocysty rozširujúceho T. gondii kmeňa označeného T-265. Päť mačiek, ktoré neboli vakcinované, bolo vystavených podnetu a slúžia ako kontrola. Vzorky výkalov boli hodnotené na rozširovanie oocýst medzi tretím až štrnástym dňom po vakcinácii a boostre a 14 dní po podnete. Toto hodnotenie výkalov zahrňuje mikroskopické hodnotenie vzoriek výkalov na oocysty. Ďalej boli vzorky výkalov odstredené a supernatant bol odstránený a injektovaný IP do myši. Štyri týždne po injekcii boli myši usmrtené a hodnotené na serokonverziu k T.

gondii.

Serokonverzia myší injektovaných výkalovými supernatantmi (nepriamy aglutinačný titer je > 1

40) indikuje, že v testovanej vzorke bola rozširovaná aspoň jedna oocysta.

Tabulka 1 ukazuje, že žiadne oocysty neboli rozširované po vakcinácii alebo boostere akýmkolvek prípravkom. Je potrebné uviesť, že pat zo šiestich vakcín produkuje u mačiek ochranu. Sto percent (5/5) kontrolných mačiek bolo infikovaných a rozširuje oocysty po podnete. Analýza výsledkov individuálnych vakcín ukazuje, že PEPSIN TREATED cystová vakcína produkuje konzistentnejšiu ochranu. Dávka obsahujúca 10 bradyzoitov chráni 40 % mačiek po podnete. Vakcína obsahujúca 100 bradyzoitov chráni 80 % mačiek. Vakcína, obsahujúca 1 000 bradyzoitov chráni 60 % mačiek po podnete. Vakcíny pripravené z cýst, ktoré neboli ošetrené pepsinom (NON PEPSIN TREATED) (bradyzoity neboli uvolnené z cýst a sú kontaminované tachyzoitmi) chránia nasledovne: 80 % mačiek pri dávke 10 bradyzoitov, 0 % pri dávke 100 bradyzoitov a 75 % pri dávke 1 000 bradyzoitov. Táto nekonzistencia nie je pre komerčný produkt žiaduca. Preto pepsínové štiepenie tkanivových cýst rastúcich v tkanivovej kultúre, ktorá vedie k uvoľneniu bradyzoitov a deštrukcii tachyzoitov je pre komerčnú produkciu vakcín výhodné.

Vakcína môže byť podávaná mačkám akýmkoľvek požadovaným spôsobom. V súčasnosti je preferované orálne podanie. Môžu byť použité dávky 0,1 ml až 2,0 ml a výhodne 0,2 ml až 1,0 ml na mačku. I keď vyššie popísané vakcíny sú kvapalné, je na odborníkovi v odbore, aby pripadne pripravil a vyrobil lyzofilizované alebo zmrazené formy vakcín.

Tabulka 1 Štúdia tkanivová kultúra /vakcinácia - podnet

	Skupina	Skupina ĺ	Skupina	Skupina l·	Skupina	Skupina í	Skupina •I /
				*
.•ocčí ’aciek	-	-	-	-			-
λ der. τιτ®: i . cer. “ oocvstové	<40	<40	<40	<40	<40	<40	<4?
rczšircvar.ie	f IZ t »	0/5	r ,; b w	C; 5	C·:	0/5	1 w
ir.rŕvíkr-“sr;s)
Tvn vakcír.v	No Treat	No Treat	Nc Treat	Pepsin	Pecsir.	Pecsir.	ΚΆ
				Treat	Treat	Treat
Počet bračyzcitov	10	100	1050	• . u	•nr. • w V	1000	K !k
Rozširovanie oocýst po 1. vek.	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	G/5	Kik
21. der. - titer	8000	NS	16000	8000	8000	4000	<40
	<40	NS	8000	<40	40	8000	<40
	8000	<40	40	40	4?	4300	<40
	8000	8000	8000	40	4000	4000	<40
	8000	4000	8000	<40	4000	4000	<4G
Typ vakcíny	No Treat	No Treat	No Treat	Pepsin	Pepsin	Pepsin	ΚΆ
				Treat	Treat	Treat
Počet bračyzoitov Rozširovanie oocvst	1 *1	100	-V'JL·	1C	100	1000	K/A
oo boosterovej dávke	0/5	C/3	0/4	0/5	0/5	0/5	K
43· deň · Lizer	8000	NS	16000	8300	800	4000	<40
	<40	KS	800C	<4C	40	8000	<40
	8000	4000	NS	40	4300	4000	<40
	8000	8000	3200	40	8000	8000	<40
	8000	8000	8000	400?	8CDC	8030	<40
Typ vakcíny	No Treat	No Treat	No Treat	PeDSÍr.	Pepsin	Pepsin	K,·»
				Treat	Treat	Treat
Výsledky podnetu ochrana	8Ci	Ci	75i	40i	80i	60i	Ci
64. deň - titer	8000	KS	16000	16000	830C	8000	8000
	8000	NS	8000	8000	8C00	BC'OC	IÍCCO
	8000	4000	KS	i í 000	8000	800C	8000
	800C	8000	800	8000	16000	8000	• f * f· * .C'J.'v
	8000	50 CC	P** v U o .	8000	C**.· L· t L· V	8C0C	í «/k J

NS - žiadna vzorka

N/A - neaplikované, jedná sa o nevakcinované kontroly No Treat - žiadne spracovanie s pepsinom

Fepsin Treat - spracovanie s pepsinon vek Piačiek = 3 až 6 mesiacov podnet - približne 10 000 bradyzoitov rastlých v myši

I keď vynález bol popísaný podrobne za účelom ilustrácie, je samozrejmé, že odborníkmi môžu byť vykonané rôzne variácie bez toho, aby bol narušený rozsah vynálezu, ktorý je vymedzený patentovými nárokmi.

Claims (15)

1. Tkanivová kultúra produkovaná T. gondii, obsahujúca imunogenicky účinné množstvo bradyzoitov na ochranu mačiek proti T. gondii.

2. Tkanivová kultúra podlá nároku 1, kde T. gondii je charakterizovaný oocystovým negatívnym fenotypom.

3. Tkanivová kultúra podlá nároku 1, kde T. gondii je označený ako T-263.

4. Spôsob prípravy tkanivovej kultúry T. gondii, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje

a) rast tachyzoitov T. gondii v tkanivovej kultúre,

b) udržiavanie tkanivovej kultúry pred nadmerným rastom tachyzoitov a vyvinutie bradyzoitov v tkanivových cystách a

c) usmrtenie zvyšných tachyzoitov.

5. Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že T. gondii je označený ako T-263.

6. Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tkanivová kultúra je vybraná zo skupiny, zahrňujúcej bunky plúc hovädzích embryí, myšie astrocytové bunky, ludské foreskin fibroblastové bunky a MRC-5 bunky.

7. Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že udržiavanie tkanivovej kultúry pred nadmerným rastom tachyzoitov a vyvinutie bradyzoitov zahrňuje pridanie pozitívneho antiséra k tkanivovej kultúre.

8. Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že usmrtenie zvyšných tachyzoitov zahrňuje pridanie proteolytického enzýmu ku tkanivovej kultúre pred alebo po zbere tkanivovej kultúry.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že proteolytický enzým je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej pepsin, trypsín a chymotrypsin.

10. Vakcína obsahujúca tkanivovú kultúru produkovanú T.

* gondii podľa nároku 1.

•

11. Vakcína podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že je živá alebo modifikovaná živá.

12. Vakcína podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým,, že tkanivová kultúra produkovaná T. gondii je odvodená od mutanta označeného ako T-263.

13. Vakcína podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým , že je v kvapalnom zmrazenom alebo lyofilizovanom stave.

14. Diagnostický kit na detekciu T. gondii infekcie, « vyznačujúci sa tým, že obsahuje tkanivovú kultúru podľa nároku 1.

15. Spôsob ochrany mačiek pred rozširovaním oocýst, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podanie vakcíny podľa nároku 1 uvedeným mačkám.