PT98202B - Processo para a preparacao de uma vacina contra a doenca de lyme, compreendendo uma quantidade dos principais antigenios contra b.burgdorferi - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 98.202 requerente

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION, norteamericana, industrial, com sede em 685 Third Avenue, New York, N.Y.10017, Estados Unidos da América do Norte

EPÍGRAFE- PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA CONTRA A DOENÇA DE LYME, COMPREENDENDO UMA QUANTIDADE DOS PRINCIPAIS ANTIGÉNIOS CONTRA B.BURGDOREERI

INVENTORES- WILLIAM MARSHAL ACREE; BONNIE LEE WALLACE;

HSIEN-HUE STEVE CHU; LLOYD GEORGE CHAVEZ e DAVID SCOTT SANDBLOM

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.³ da Convenção de Paris de 20 de Março de 1SS3.

de Julho de 1990 No.549,190, nos Estados Unidos da America do Norte

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA CONTRA A DOENÇA DE LYME, COMPREENDENDO UMA QUANTIDADE DOS PRINCIPAIS ANTIGÉNIOS CONTRA B. BURGDORFERI

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de uma vacina destinada a prevenir ou aliviar os sintomas da doença de Lyme e a um modelo de desafio destinado a avaliar a referida vacina.

referido processo consiste, por exemplo, em se cultivar bactérias B. Burgdorferi, se monitorizar o nível de Osp A ou de Osp B, se inactivar as bactérias quando é atingido o valor máximo na produção de Osp A ou de Osp B, respectivamente, e se misturar as bactérias inactivadas com um suporte fisiologicamente aceitável.

L.

Âmbito do invento presente invento diz respeito a uma vacina destinada a evitar ou aliviar os sintomas da doença de Lyme, a um processo para a preparação da vacina e a um modelo de desafio destinado a avaliar a vacina.

Antecedentes do invento

A doença de Lyme é causada pela espiroqueta Borrelia burgdorferi e é transmitida a animais a ela predispostos por carraças da família Ixódidas que incluem I. dammini. I. pacificus e I. ricinus.

No caso dos seres humanos, pensa-se qua a doença é contraída de carraças no estádio de ninfa do seu ciclo de vida. A maior parte dos casos de doença de Lyme verificam-se em Junho ou Julho, época que corresponde ao estádio de ninfa. As carraças Ixódidas no estádio de ninfas são muito pequenas, tendo dimensões aproximadas das dimensões das sementes de sésamo, e são de difícil detecção. Pensa-se que a carraça deverá alimentar-se do sangue do animal hospedeiro durante um intervalo de tempo superior a cerca de doze horas para que possa transmitir as espiroquetas causadoras da doença.

Diversos animais domesticados revelam predisposição para esta doença, nomeadamente cães, gatos, cavalos, carneiros, veados, aves e bovinos, o que constitui um perigo não só para os próprios animais como para os seus tratadores humanos, uma vez que os animais funcionam como reservatórios de espiroquetas que podem ser transmitidas aos seres humanos. Os presentes inventores e outros descobriram que os cães podem transmitir a doença aos seus companheiros de canil mesmo na ausência de carraças. Em

conformidade, pensa-se qua a doença pode ser transmitida aos seres humanos por animais domesticados.

É difícil preparar culturas in vitro de espiroquetas B. burgdorferi porque requerem uma mistura complexa de nutrientes semelhante a misturas utilizadas nas culturas de tecidos de mamíferos (Barbour e outros, Curr. Microbiol. 8, pp. 123-126, 1983). A espiroqueta cresce lentamente em cultura (por exemplo com um período de duplicação entre 12 e 24 horas).

Os sintomas da doença de Lyme variam e a doença é difícil de diagnosticar em virtuda da semelhança entre os seus sintomas e os de outras doenças. Os sintomas precoces da doença incluem irritação cutânea, febre, dores de cabeça e dores musculares e articulares. Nas semanas, ou mesmo meses, subsequentes à infecção os sintomas podem incluir inflamação cardíaca e artrite recorrente. Mais tarde, os sintomas podem incluir a artrite crónica e a demência.

A doença pode ser tratada após a infecção com diversos antibióticos que incluem a tetraciclina, a penicilina e a eritromicina. Contudo, será necessário um tratamento profiláctico que seja eficaz durante um período de dois a três meses, período ) durante o qual as carraças transmitem a doença de um modo mais agressivo. A patente nos E.U.A, concedida a Johnson (incorporada no presente invento na sua totalidade, a título de referência), descreve uma vacina constituída por espiroquetas de B. burgdorferi inactivada num veículo fisiologicamente aceitável. A vacina Johnson é descrita como sendo eficaz na protecção de roedores contra o desafio com B. burgdorferi 30 dias após a vacinação. A vacina Johnson não é descrita como elicitando a produção de anti-soro eficaz num ensaio de neutralização de soro, nem é descrita como útil no controlo dos sintomas da doença de

Lyme. Além disso, a referida patente não revela um subconjunto de proteínas de B. burqdorferi que elicitam a produção de anti-soro num mamífero protegido. Este subconjunto é descrito pela primeira vez no presente pedido de patente.

Os anticorpos contra o antigénio Osp A da B. burqdorferi foram descritos como sendo eficazes na atribuição de imunidade passiva a um animal tratado. Osp A é a principal proteína da membrana externa da B. burqdorferi e tem uma massa molecular de cerca de 31K. 0 gene para Osp A foi isolado e os seus vectores de manifestação foram determinados (Howe e outros, Infection Immunitv 54. pp. 207-212, 1986). Em conformidade, esta proteína de superfície pode revelar-se útil numa vacina. Contudo, a composição desta proteína parece variar entre estirpes da espiroqueta (Barbour e outros, J. Infect. Dis. 152. pp. 478-484, 1985; Bisset e outros, J. Clinicai Microbil. 25. pp. 2296-2301, 1987) tal como a da Osp B, outra proteína de superfície (Barbour e outros, Infection and Immunitv 45. pp. 94-100, 1984). Sabe-se que as principais proteínas da espiroqueta aparentada Borrelia hermsii (o agente causador da febre relapsante) também variam entre estirpes (Barbour e outros, J. Experimental Med, 156. pp. 1312-1324, 1982). Esta variabilidade pode inibir a protecção cruzada contra a infecção por diversas estirpes de espiroquetas e assim proporcionar um mecanismo através do qual a espiroqueta ilude o sistema imunitário do animal hospedeiro.

Na avaliação das vacinas é importante a existência de uma infecção padrão reprodutível por um agente patogénico em estudo num animal de laboratório. Uma infecção deste tipo é preferencialmente introduzida por meios reprodutíveis no organismo do animal de laboratório. Uma doença laboratorial reprodutível deste tipo é designada por modelo de desafio e permite testar a eficácia de uma vacina na protecção de um animal contra um desafio pelo agente patogénico. De preferência, o modelo de desafio assemelhar-se-á muito da doença real.

Foram descritos diversos modelos de desafio a roedores (em que a doença é induzida nos roedores mediante a injecção de espiroquetas) como meios de avaliação da eficácia de vacinas contra a doença de Lyme (por exemplo, Schaible e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.. 87. pp. 3768-3772, 1990 e Patente nos E.U.A. ns 4 721 617). Contudo, enquanto que a bacteremia pode ser induzida em roedores, apenas foram relatados sintomas da doença de Lyme num modelo de desafio a roedores no caso de roedores quimica ou geneticamente imuno-comprometidos (cf., por exemplo, Schaible e outros, supra).

Além disso, apesar da importância dos cães como vítimas, reservatórios ou agentes transmissores desta doença, não foi ainda descrito um modelo de desafio canino. 0 insucesso dos esforços realizados até à data no sentido de criar um modelo de desafio canino é descrito por Appel em Compendium on Continuinq Education for the Practisinq Veterinarian, 4(11), pp. 888-892, 1982, e por Greene e outros em Am. J. vet. Res.. 49. pp. 752-757, 1988. Apenas foi descrita uma infecção experimental sub-clínica por B. burodorferi em cães (Burgess, Zentralblatt fttr Bakteriolocrie, Microbioloqie und Hvgiene. A 263. pp. 49-50, 1986) .

Objecto do invento

Um dos objectos do presente invento consiste numa vacina contendo pelo menos dois dos principais antigénios de B. burqdorferi que elicitam a produção do correspondente anti-soro num hóspede mamífero predisposto à infecção pela referida espiroqueta.

Um outro objecto do presente invento consiste numa vacina que proteja contra a doença de Lyme os mamíferos a ela predispostos apesar de variabilidade das espiroquetas B. burqdorferi entre estirpes.

Um outro objecto do presente invento consiste num modelo de desafio que exiba pelo menos um dos sintomas da doença de Lyme e que utilize mamíferos que não estão imuno-comprometidos. 0 modelo de desafio pode ser utilizado para avaliar a eficácia das vacinas e de outros tratamentos da doença de Lyme.

Ainda um outro objecto do presente invento consiste na produção de antigénios de B. burqdorferi e anticorpos contra B. burqdorferi que possam ser utilizados para efeitos de diagnóstico.

Um outro objecto do presente invento consiste num processo para a produção de B. burqdorferi destinadas, por sua vez, à preparação de vacinas contra a doença de Lyme.

Ainda um outro objecto do presente invento consiste num ensaio de neutralização sorosa destinado a testar a potência do anti-soro contra B. burgdorferi.

I

Sumário do invento

Foi agora descoberto que um animal que apresente um título neutralizador de anticorpos contra B. burqdorferi no soro também apresenta anticorpos para um pequeno subconjunto de proteínas de B. burqdorferi com as massas moleculares 14, 17, 19, 25, 28, 31, 34, 38, 41, 44, 52, 54, 58, 60, 68, 80 e 90 K (±3K) e encontra-se protegido contra bacteremia e outros sintomas da doença de Lyme após desafio por espiroquetas B. burqdorferi.

Pensa-se que uma vacina que contenha pelo menos dois destes antigénios principais e que estimule a produção de anti-soro com um título neutralizador protegerá eficazmente contra a doença de Lyme um mamífero a ela predisposto.

Foi também descoberto que um modelo artificial da doença (um modelo de desafio) pode ser provocado em mamíferos mediante a injecção de espiroquetas expandidas poucas vezes de um modo que mime a via natural da infecção.

Breve descrição das figuras

FIGURA 1. Visualização de um teste pela técnica Western usando anti-soro de cães imunizados que apresentam títulos neutralizadores de anticorpos contra B. bugdorferi no soro.

Descrição pormenorizada do invento

Modelo de desafio

As culturas de espiroquetas utilizadas nas injecções do desafio foram expandidas poucas vezes após isolamento a partir do intestino médio de carraças infectadas. Em geral, não são expandidas um número superior a 10 vezes. De preferência, não são expandidas mais de duas vezes. O termo expandida refere-se a expansões da cultura de cerca de 10²-10⁴ organismos/ml para 10θ-10θ organismos/ml.

O modelo de desafio é concebido de modo a mimar uma infecção transmitida por carraças tal como ocorreria naturalmente. Mais especificamente, as espiroquetas são repetidamente injectadas tal como aconteceria durante a alimentação de uma carraça. Em geral, a dose de espiroquetas contida em qualquer uma das injecções é inferior a cerca de 10θ espiroquetas e, de preferência, está compreendida entre cerca de 10 e cerca de 10⁶ espiroquetas. Numa forma de execução sobretudo preferida do presente invento, o número de espiroquetas está compreendido entre cerca de 50 e cerca de 50 000. 0 número de administrações efectuadas é pelo menos 2, de preferência entre cerca de 4 e cerca de 14. De preferência, decorrem pelo menos 14 horas entre as administrações.

Qualquer uma das administrações pode ser variada de modo a mimar a transmissão natural das espiroquetas. Por exemplo, as espiroquetas contidas numa determinada administração podem ser injeetadas numa multiplicidade de locais do animal. Além disso, num qualquer local determinado de injecção, as espiroquetas podem ser injeetadas a profundidades diferentes (por exemplo, intramuscular IM), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) e subcutânea (SC)).

O calendário preferido para a administração de espiroquetas consiste em injecções diárias (aprox. 1/3 IP, aprox. 1/3 ID, aprox. 1/3 SC) durante cerca de uma semana.

As espiroquetas podem ser geralmente recuperadas nos cães desafiados alguns dias após o início do desafio. Após cerca de 30 dias observa-se, em geral, que os cães mancam. Contudo, espera-se que o processamento temporal destes acontecimentos varie com a espécie animal desafiada.

A espiroquetemia pode ser intensificada no animal desafiado mediante a imuno-supressão do animal através da administração de medicamentos ou produtos químicos imuno-supressores ou através de radiação ionizante. Entre os medicamentos imunosupressores adequados contam-se diversos esteróides glucocorticóides (incluindo dexametasona emetilprednisolona), ciclosporinas, azatiopina (um análogo de 6-mercaptopurina), FK-506 (Gato e outros, Transplant. Proc.. 19(S6). p. 4, 1987), 15-desoxipergualin (Todo e outros, Transplant. Proc.fs, 209(Sl). pp. 233-236, 1988), etc. A dexametasona é comercializada por ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio, E.U.A. e por Schering Corp. (sob a marca registada Azium~), Kenilworth, Nova Jersey, E.U.A.. 0 acetato de metilprednisolona é comercializado sob a marca Depo-Medrol-, Kalamazoo, MI, E.U.A. ou sob a marca Depo-Predate~ (Legere Pharmaceuticals, Scottsdale, Arizona, E.U.A.. A dexamatasona é o agente imuno-supressor preferido de acordo com o presente invento.

Também se pensa que a espiroquetemia é intensificada pela utilização de animais geneticamente imuno-deficientes no modelo de desafio.

modelo de desafio revelado no presente invento pode ser usado para testar a eficácia de vacinas contra a doença de Lyme tais como as descritas adiante. Adicionalmente, o modelo de desafio pode ser usado para testar outros métodos de tratamento da doença de Lyme, incluindo os tratamentos com antibióticos e a imunização passiva.

Preparação de uma vacina de B. burqdorferi

As estirpes de B. burcrdorferi usadas no passo inicial da preparação de uma vacina retêm a capacidade de induzir espiroquetemia num mamífero susceptível. Prefere-se acima de todas a estirpe B. burqdorferi B-31 (disponível na American Type Tissue Collection (Colecção americana de tipos de tecido) sob o n2 de acesso 35210).

As culturas de espiroquetas B. burgdorferi podem ser realizadas em meio BSK II (Barbour e outros, Yale J. Biol. Med.. 57. pp. 521-525, 1984) ou um seu equivalente nutritivo. Uma vez que este meio constitui uma adaptação de um meio de cultura concebido para células de mamíferos (que são muito mais complexas) , pode anticipar-se a possibilidade de omissão de numerosos ingredientes sem consequências negativas significativas sobre a taxa de crescimento das B. burgdorferi. Estas alterações no meio de crescimento podem ser facilmente verificadas sem ter de se recorrer a experimentações indevidas e são abrangidas pelo âmbito do presente invento.

A temperatura do meio de cultura está geralmente compreendida entre 25°C e 40°C, de preferência entre cerca de 32°C e cerca de 38°C, sendo o seu valor, com maior preferência, 34 °C. De preferência, a variação da temperatura, no decurso da incubação da cultura, em relação ao ponto de solidificação é inferior a ±1°C.

Em geral, o pH do meio de cultura está compreendido entre 7,0 e 8,0. De preferência, a variação do pH, no decurso da incubação da cultura, em relação ao pH desejado é inferior a ±0,2, o que se obtém por adição de um ãcido ou de uma base, consoante apropriado. Com maior preferência, o pH é 7,6±0,2.

As incubações da cultura realizam-se em geral num recipiente que é agitado de modo a acelerar a permuta de gases entre a cultura e o ar. De preferência, a agitação é efectuada com um impulsionador cuja velocidade de rotação está compreendida entre 25 rpm e cerca de 100 rpm.

Significativamente, o curso da incubação da cultura é monitorizado por meio da avaliação do nível de produção de uma das principais proteínas de superfície da B. burqdorferi. Osp A ou Osp B. Os métodos para monitorizar estas proteínas são descritos no Exemplo 2. As culturas de B. burqdorferi são interrompidas quando se atinge um nível máximo de uma destas proteínas. No caso da proteína que está a ser monitorizada, prefere-se que pelo menos 60% das células de B. burqdorferi presentes manifestem a proteína, o que pode ser medido num ensaio de imuno-fluorescência (descrito no Exemplo 1). Com maior preferência, pelo menos 70% dos organismos manifestam a proteína.

Numa das formas de execução do presente invento, após incubação da cultura, os organismos são inactivados ou recolhem-se as fracções antigénicas isentas de espiroquetas vivas ou virulentas. Os organismos podem ser inactivados por diversos agentes químicos incluindo mertiolato, B-propilenolactona, etilenoamina binária, fenol, glutaraldeído e formaldeído. Os organismos também podem ser inactivados por acção do calor (por exemplo 60°C durante várias horas).

São agentes inactivadores preferidos os aldeídos tais como glutaraldeído ou formaldeído. 0 formaldeído é o agente acima de todos preferido. A concentração utilizada de aldeído está compreendida entre cerca de 0,05% v/v e cerca de 1% v/v. Com maior preferência, a concentração é 0,1%.

A fracção antigénica pode ser recolhida, por exemplo, mediante filtração através de um gel, electroforése, cromatografia de afinidade e/ou centrifugação.

Antes de serem administrados a um mamífero, os antigénios e/ou as espiroquetas recolhidos são suspendidos num veículo fisiologicamente aceitável. De preferência, os antigénios/espiroquetas são misturados com um adjuvante tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, saponina, óleo ou um polímero caracterizado por possuir actividade adjuvante.

Vários polímeros e copolimeros de ãcido acrílico e de ácido metacrílico possuem actividade adjuvante. Polyvinyl Chemical Industries (Wilmington, Massachussetts, E.U.A.) comercializa estes polímeros sob a marca NEOCRYL. O NEOCRYL A640, um copolímero acrílico aquoso em que o pH é 7,5, a viscosidade é 100 eps (Brookfield, 25°C) e o peso, por galão fornecido, é 8,6 libras, que contém percentagens de 40%, em peso, de sólidos, 38%, em volume, de sólidos e cujo número ácido é 48 é um adjuvante preferido. Especificamente, o NEOCRYL A640 é um copolímero acrílico aquoso não coalescente com estireno. Mais especificamente, o NEOCRYL A640 é uma emulsão do tipo latex de um copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e metacrílico. Outras qualidades de NEOCRYL são as 520 e 625, e ainda o NEOREZ 966. O termo CEMA” será doravante utilizado para designar um copolímero de estireno e de uma mistura de ácido acrílico e ácido metacrílico.

copolímero etileno/(anidrido maleico) é outro adjuvante preferido. São qualidades de copolímero etileno/(anidrido maleico) úteis no presente invento os copolimeros lineares etileno/(anidrido maleico) tais como EMA-31 (Monsanto Co., ST. Louis, Missouri, E.U.A.), um copolímero contendo quantidades aproximadamente iguais de etileno e de anidrido maleico cuja massa molecular média estimada está compreendida entre 75 000 e 100 000. Estes copolimeros são pós solúveis em água, brancos, que fluem facilmente e possuem as seguintes propriedades típicas: a densidade real é cerca de 1,54 g/ml, o ponto de amolecimento é cerca de 170°C, o ponto de fusão é cerca de 235°C, a temperatura de decomposição é cerca de 274°C, a densidade volumétrica é cerca de 20 libras/pé³ e o pH (solução a 1%) é cerca de 2,3.

Com maior preferência, misturam-se dois ou mais adjuvantes com os antigénios e/ou as espiroquetas recolhidos. A combinação preferida consiste em copolímero etileno/(anidrido maleico) e NEOCRYL A640.

O pH da vacina é em geral ajustado para um valor compreendido entre cerca de 6,8 e cerca de 7,7 mediante a adição de ãcido ou base IN, consoante o apropriado.

Os antigénios e/ou as espiroquetas recolhidos podem ser conjugados com uma macrornolécuIma imuno-estimulante tal como a hemocianina do keyhole limpet ou a toxina do tétano. A conjugação de proteínas com macromoléculas é revelada por Likhite na patente nos E.U.A. ns 4 372 945 e por Armor e outros na patente nos E.U.A. ns 4 474 757. Os aspectos gerais da preparação de vacinas são descritos em New Trends and Developments in Vaccines (Novas tendências e desenvolvimentos em vacinas), ed. org. por Voller e outros, University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A., 1978.

Podem recolher-se antigénios isentos de organismos vivos ou virulentos mediante diversos métodos que incluem técnicas de fragmentação, tais como filtração através de um gel, cromatografia de imuno-afinidade utilizando anti-soro revelado no presente invento, centrifugação diferencial ou electroforése. Por exemplo, descobriu-se que os antigénios da membrana externa de B. burqdorferi podem ser extraídos com baixas concentrações quer de detergentes iónicos quer de detergentes não iónicos. Estes antigénios extraídos elicitam eficazmente uma reacção imunológica num animal vacinado.

São detergentes preferidos para esta forma de execução do presente invento o dodecilsulfato de sódio (SDS) e o Triton

Χ100 (comercializado por Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, E.U.A. e outras).

O protocolo de extracção parte de organismos B. burqdorferi. de preferência compreendida entre cerca de 10θ organismos/ml, com maior preferência cerca de 10⁹ organismos/ml, e cerca de 10¹² organismos/ml. Adiciona-se então o detergente, de preferência numa concentração compreendida entre cerca de 0,2% p/v e cerca de 0,6% p/v, no caso de um detergente iónico tal como o SDS. No caso dos detergentes não iónicos, a concentração está compreendida, de preferência, entre cerca de 0,25% p/v e cerca de 2,0% p/v, com maior preferência entre 0,8% p/v e cerca de 1,2% p/v.

Os organismos são então agitados, em geral a uma velocidade compreendida entre cerca de 100 rpm e cerca de 300 rpm durante um período compreendido entre cerca de 0,5 horas e cerca de 10 horas. De preferência, a agitação é mantida durante um período compreendido entre cerca de 1 e cerca de 2 horas.

As proteínas da membrana externa são então separadas da maior parte das bactérias por centrifugação. Após centrifugação, o sobrenadante é rico era proteína da membrana externa e o bolo contém os organismos.

Quando aplicado a B. burqdorferi, o procedimento extrai os principais antigénios de B. burqdorferi e proporciona antigénios para uma vacina que protege contra a febre causada por B. burqdorferi os mamíferos a ela susceptíveis.

A vacina é preparada a partir dos antigénios extraídos pelos métodos atrás descritos.

Numa outra forma de execução do presente invento, após a incubação da cultura, as espiroquetas são processadas de modo a isolar-se antigénios principais de B. burgdorferi específicos.

Descobriu-se que uma vacina de acordo com o presente invento induz anti-soro contra uma multiplicidade de B. burgdorferi através de antigénios com as seguintes massas moleculares. 14, 17, 19, 25, 28, 31, 34, 38, 41, 44, 48, 52, 58, 60, 68, 80 e 90K (±3K). Estes antigénios são designados na presente memória descritiva por antigénios principais de B. burgdorferi ou seus equivalentes biológicos. De acordo com o presente invento, uma vacina eficaz induzirá anti-soro contra pelo menos dois dos principais antigénios. A conhecida variabilidade de pelo menos dois antigénios de B. burgdorferi sugere que uma vacina monoespecífica possa não ser eficaz contra um vasto espectro de isolados de B. burgdorferi. De preferência, a vacina induzirá, com eficácia, anti-soro contra pelo menos três dos principais antigénios. De preferência, um dos antigénios incluídos na vacina é o Osp A (massa molecular 31K) ou o Osp B (massa molecular 34K). As proteínas 31K, 34K e 41K são, respectivamente, as proteínas Osp A, Osp B e a proteína flagelada de B. burgdorferi.

O ensaio de neutralização sorosa descrito no Exemplo 3 pode ser usado para avaliar a potência relativa do anti-soro dirigido contra um dado antigénio de B. burgdorferi. Espera-se que exista correlação entre a potência do anti-soro contra a infecção causada por B. burgdorferi e a capacidade do anti-soro neutralizar B. burgdorferi no ensaio de neutralização sorosa. o ensaio também pode ser utilizado para avaliar se o anti-soro dirigido contra dois ou mais antigénios é mais eficaz que os anti-soros monoespecíficos. Antecipa-se que mesmo quando o anti-soro com monoespecificidade para um determinado antigénio é em si mesmo ineficaz no ensaio de neutralização sorosa, o anti-soro pode intensificar a potência de outro anti-soro monoespecífico. Em conformidade, o ensaio de neutralização sorosa pode ser utilizado para validar uma vacina que elicita antisoro dirigido contra menos qua a totalidade dos antigênios principais.

Deste modo se pode preparar antisoro dirigido contra cada um dos principais antigênios revelados. Por exemplo, os antigênios de um extracto de espiroquetas inteiras pode ser separado por electroforése em gel poliacrilamida de SDS e as bandas específicas podem ser excisadas. A localização destas bandas pode ser confirmada através de electromarcação de uma porção de gel poliacrilamida e do teste da marca pela técnica Western de transferência de proteínas (cf. Molecular Cloning, (Clonagem molecular) 2a edição, ed. org. por Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Press, 1989 e Exemplo 5, adiante).

As porções de gel contendo antigênios podem ser utilizadas para elicitar anti-soro com especificidade para um dado antigénio por diversos métodos. Por exemplo, a porção de gel pode ser fragmentada por um método tal como extrusão através de uma agulha de aferição estreita. 0 gel pulverizado pode então ser injectado no animal que se pretende produza anti-soro. Podem

I adicionar-se adjuvantes ao material injectável apesar de se antecipar que o gel poliacrilamida actue como adjuvante do tipo polimérico. Alternativamente, o antigénio pode ser eluído da porção de gel por diversos métodos conhecidos entre os quais se inclui a incubação da porção de gel numa solução aquosa de detergente até o antigénio ter sido substancialmente eluído da porção de gel. Os antigênios podem ser electroeluídos da porção de gel. Os dispositivos de electroeluição são comercializados, por exemplo, por Schleicher & Schtill (Keene, New Hampshire, E.U.A.) e Bio-Rad Labs (Richmond, Califórnia, E.U.A.). Estes dispositivos também podem ser produzidos a partir de vulgar equipamento de laboratório (cf. Molecular Cloning, supra, pp. 6.28-6.29). Os antigénios eluídos podem então ser administrados, com ou sem um adjuvante, ao animal que se pretende produza anti-soro.

Num outro método, os antigénios são separados mediante electroforése em gel poliacrilamida de SDS e transferidos para uma das várias membranas adsorventes do mesmo modo que na técnica Western. Os antigénios específicos podem então ser isolados mediante a excisão da região apropriada da membrana de transferência. São membranas adequadas as membranas nitrocelulósicas vulgarmente utilizadas na técnica Western, Immobilon~-P comercializada por Millipore Corp. Bedford, MA e membranas em fibra de vidro revestidas com poliaminas (Vandekerckhove e outros, Eur. J. Biochem.. 152. pp. 9-19, 1985 e Abersold e outros, J. Biol. Chem.. 261. pp. 4229-4238, 1986). As porções da membrana que contêm antigénios podem ser implantadas subcutaneamente mediante cirurgia no animal que se pretende produza anticorpos. Antecipa-se que a membrana se comporte como um adjuvante de libertação lenta.

Os principais antigénios são conhecidos como agentes eficazes de elicitação de uma reacção imunológica (ver Exemplo 5). Pensa-se que alguns destes antigénios elicitam uma reacção das células T destruidoras. Estas hipóteses podem ser confirmadas através do isolamento de linfócitos de animais imunizados e do teste das reacções das células T a antigénios principais específicos de B. burqdorferi. A reacção de activação de células T inclui um aumento no cálcio intracelular, a produção de linfoquinas, a proliferação celular e a actividade citolítica. Estas medições in vitro referentes a células T são descritas por Weis e outros num artigo publicado em Adv. Immunol.. 41. pp. 1-38, 1987, (incorporado, na sua totalidade, na presente memória descritiva, a título de referência).

As células B de animais produtores de anti-soro podem ser utilizadas no isolamento de anticorpos monoclonais (mcAc) mediante técnicas conhecidas (Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Tecnologia de anticorpos monoclonais), vol. 13. Elsevier, Amsterdam, 1984; Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticorpos: um manual de laboratório), Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 1988; Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Anticorpos: princípios e prática); Academic Press, Londres, 1986). Os anticorpos deste tipo são abrangidos pelo âmbito do presente invento.

Antecipa-se que a migração electroforética dos antigénios principais individuais varie ligeiramente entre isolados de B. burqdorferi. 0 procedimento da técnica Western descrito no Exemplo 5 pode ser usado para identificar o padrão de migração electroforética do gel poliacrilamida de SDS para outros isolados de B. burqdorferi. A equivalência imuno-química entre uma variante e um dos antigénios principais revelados no presente invento pode ser demonstrada mediante análise pela técnica Western utilizando anti-soro monoespecífico a fim de visualizar as bandas. As variantes electroforéticas dos antigénios de B. burqdorferi individuais podem ser isoladas e o anti-soro a elas destinado pode ser avaliado quanto à relativa eficácia no teste de neutralização do soro.

Tal como adiante se descreve em pormenor sob a epígrafe

Diagnósticos, as revelações da memória descritiva do presente pedido de patente são suficientes para ensinar o isolamento e a caracterização sequencial dos principais antigénios de B.

burqdorferi. Consequentemente, as vacinas constituídas por antigénios sintéticos ou pelos seus equivalentes biológicos são abrangidas pelo âmbito do presente invento.

Em conformidade, numa outra forma de execução do presente invento, a vacina é constituída por pelo menos dois dos principais antigénios de B. burqdorferi ou pelos seus equivalentes biológicos (por exemplo proteínas sintéticas). A vacina é combinada com um suporte fisiologicamente aceitável e, facultativamente, com adjuvantes, tal como atrás se descreveu.

Ainda numa outra forma de execução do presente invento, a vacina é caracterizada por proteger eficazmente contra a febre ou a artrite um mamífero predisposto.

clínico especialista deduzirá que as vacinas de acordo com o presente invento podem ser combinadas com outras vacinas de modo a obter-se uma vacina combinada que seja eficaz contra mais do que um agente patogénico. São exemplos deste tipo de vacina a vacina contra a doença de Lyme em combinação com uma ou mais das seguintes vacinas: contra Leptospira canicola. Leptospira icterohaemorrhaqiae. Leptospira hard j o. leptospira qrippotyphasa. leucemia felina, rinotraqueíte, calici, panleucopenia, Chlamydia psittaci, doença canina, adenovirus Tipo 2, coronavírus da paragripe e parvovírus.

Vacinação

A vacina é administrada preferencialmente administrada mediante injecção subcutânea, intradérmica, intraperitoneal ou intramuscular. Prefere-se a injecção intramuscular. A vacina pode ser administrada uma única vez ou múltiplas vezes. Uma vez que a exposição, por via oral, a b. burqdorferi revelou elicitar uma reacção imunológica em gatos (Kimminan, Veterinarv

Technician. 10. pp. 385-397, 1989), as vacinas administráveis por via oral são igualmente contempladas e abrangidas pelo âmbito do presente invento.

A quantidade de antigénios de espiroquetas presentes em cada dose da vacina é seleccionada de modo a ser pelo menos suficiente para induzir um título neutralizador de anticorpos no soro. (o ensaio de neutralização pelo soro mede a capacidade manifestada pelo anti-soro, em conjunção com o complemento, de neutralização de B. burgdorferi e é descrito mais pormenorizadamente no Exemplo 3). Esta quantidade variará mas espera-se que cada dose contenha antigénios derivados de um número de espiroquetas compreendido entre cerca de 10⁶ e cerca de 10¹², de preferência entre cerca de 10? e cerca de 10^ espiroquetas. A quantidade óptima de produto antigénico para uma determinada preparação de vacinas pode ser determinada através de estudos padrão que monitorizam os títulos de neutralização pelo soro de animais vacinados.

Diagnósticos anti-soro monoespecífico contra diversos dos principais antigénios (massas moleculares 14, 17, 19, 25, 28, 38, 44, 48, 52, 54, 58, 60, 68, 80 e 90 (±3K)) pode ser utilizado em estojos de diagnóstico destinados a testar os fluidos corporais ou extractos de tecidos quanto a presença de antigénios de B. burgdorferi. As técnicas para utilizar estes anticorpos como sondas para antigénios encontram-se descritas atrás e ainda por Harlow e outros em Antibodies: A Laboratory Manual (Anticorpos: Manual de laboratório), Cold Spring harbor Press, Nova Iorque, 1988.

Adicíonalmente, as proteínas antigénicas individuais podem ser usadas como auxiliares de diagnóstico. A proteína, ou uma mistura dos principais antigénios isolados tal como atrás se descreveu, pode ser separada mediante electroforese em gel poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). O gel pode ser electromarcado sobre uma membrana. Em seguida, uma tira da membrana pode ser revelada como marca Western (Western blot) utilizando soro de um animal a ser diagnosticado. Como controlos, podem usar-se soros positivos ou negativos conhecidos para visualizar tiras de membrana equivalentes.

ADN genomico e subgenomico pode ser isolado a partir de B. burgdorferi e o ADN pode ser fragmentado por uma enzima de restrição. 0 ADN digerido pode então ser ligado num plasmídeo ou vector de expressão fágico. As colónias ou placas (consoante for apropriado) podem ser cultivadas e parcialmente transferidas para uma membrana que pode ser testada com o auxílio de anti-soro contra um ou mais dos principais antigénios. As placas ou colónias positivas podem ser expandidas e as proteínas nelas manifestadas (em geral depois de a proteína expressa vectorialmente ser induzida por um agente adequado, usualmente o isopropiltio-B-D-galactosídeo) podem ser separadas mediante SDS-PAGE. As proteínas podem, consequentemente, ser estudadas pela técnica de transferência de Western atrás descrita.

Em conformidade, o ADN que codifica os principais antigénios, o ADN que é híbrido em relação a este ADN sob condições rigorosas e o ADN que codifica substancialmente a mesma proteína são abrangidos pelo âmbito do presente invento.

O invento é complementarmente ilustrado pelos seguintes exemplos não limitativos do seu âmbito:

Exemplo 1-0 modelo de desafio

Cães

Foram usados vinte e seis (26) cães beagle (Theracon, Inc., Topeka Kansas, E.U.A.) com idades compreendidas entre 16 e 18 semanas que nunca tinham estado expostos a B. burqdorferi. Avaliaram-se quatro grupos de desafio constituídos, cada um, por cinco cães. Os grupos 1 e 2 e três controlos de contacto foram alojados em conjunto na sala A. Os grupos 3 e 4 e três controlos de contacto foram alojados em conjunto na sala B.

Isolado, obtido a partir de carraças, de B. burqdorferi

Recolheram-se carraças infectadas com B. burgdorferi em Wisconsin e os tractos digestivos (intestinos médios) de aproximadamente 1000 carraças foram removidos e emulsionados em meio Barbour-Stõnner-Kelly (BSK) (Barbour e outros, Curr. Microbiol.. 8, pp. 123-126, 1983) e a emulsão resultante foi armazenada a -100°C em balões contendo, todos eles, partes alíquotas de 2 ml. Antes da utilização, as emulsões foram descongeladas, reunidas e concentradas mediante centrifugação de modo a que cada parte alíquota de 1 ml contivesse 10 000 microrganismos.

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Calendário do desafio

Os cães pertencentes a cada um dos quatro grupos foram desafiados através da administração de sete doses diárias consecutivas de espiroquetas em locais diferentes do abdómen. Cada dose continha 500 microrganismos por 0,5 ml. O desafio foi administrado com o auxílio de uma seringa de tuberculina que libertou o seu conteúdo intraperitonealmente (IP), intradermicamente (ID) e subcutaneamente (SC) à medida que a agulha era retirada do local de infecção.

Imuno-supressão

Aos cães do grupo 1 foram administradas doses de 1 ml cada de dexametasona (2 mg/ml, Aziura-, Schering Corp., Kenilworth, NJ 07033, New Jersey, E.U.A.) no dia do desafio e nos dias 2, 4 e 6 após a iniciação. Os cães do grupo 2 não foram tratados com um agente imuno-supressor no decurso do período de desafio. Aos cães do grupo 3 foram administradas doses de 1 ml de acetato de metilprednisolona (20 mg/ml, Depo-Medrol~, Upjohn Co., Kalamazoo, MI 49001, Michigan, E.U.A.) no primeiro dia do desafio (dd”) e no sexto dia pós-desafio (dpd”, contado a partir do dia do desafio). Aos cães do grupo 4 não foi administrado um agente imuno-supressor durante o período de desafio.

Sessenta dias após o desafio administrou-se a todos os cães pertencentes aos grupos 1 e 2 e aos respectivos controlos de contacto uma dose de 1 ml de dexametasona; aos cães pertencentes aos grupos 3 e 4 e aos respectivos controlos de contacto administrou-se uma dose de 1 ml de acetato de metilprednisolona.

Exame das amostras de sangue quanto à presença de

B. burgdorferi

Após o desafio constituído pela primeira dose de espiroquetas, colheram-se amostras de sangue de todos os 26 cães duas vezes por dia durante 14 dias consecutivos. 60 dias após o desafio colheram-se amostras de sangue duas vezes por dia durante 10 dias consecutivos e também se colheram amostras de sangue no momento da necropsia (90 dias após o desafio). 0 sangue foi

recolhido em tubos contendo uma solução a 15% de NasEDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético).

Adicionou-se 1 ml de sangue inteiro a 6 ml de meio BSK e a mistura foi incubada a 32°C durante seis semanas. As culturas foram examinadas por um método de fluorescência indirecta de anticorpos (IFA). As culturas foram preparadas sobre lâminas, deixadas secar ao ar e fixadas em acetona fria. As lâminas foram inundadas durante 30 minutos a 37°C com uma diluição de anticorpos murinos (isótipo IgG) dirigidos contra B. burqdorferi ou contra um determinado antigénio de B. burqdorferi. As lâminas foram então enxaguadas com solução salina de tampão fosfato (STF). Em seguida, adicionou-se a cada lâmina uma diluição de soro de rato anti-IgG conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson Immuno Research Labs., West Grove, Pennsylvania, E.U.A.) e os lâminas foram incubados a 37°C durante mais 30 minutos. As lâminas foram lavadas com STF e analisadas microscopicamente com o auxílio de um microscópio de fluorescência. A presença de espiroquetas fluorescentes indica um isolamento positivo.

Os anticorpos uitilizáveis no teste IFA incluem o anti-soro policlonal contra B, burqdorferi (anticorpos de carneiro comercializados por Fitzgerald Industries International, Action, Massachusetts, E.U.A.) e também os anticorpos monoclonais (por exemplo Cb-2, um anticorpo monoclonal de rato dirigido contra Osp B, comercializado por Veterinary Clinicai Resources,

P.O. Box 969, Elgin, Texas, E.U.A.). Podem ainda usar-se os anti-soros preparados pelos métodos revelados na memória descritiva do presente pedido de patente.

Titulos de anticorpos

Sangraram-se cães no momento do desafio e, em seguida,

2, 4, 6, 8, 10, 14, 30, 60 e 90 dpd. Colocou-se uma suspensão padrão de B. burqdorferi (2x10^ organismos/ml) sobre uma lâmina e fixou-se com acetona fria durante 60 minutos. Incubaram-se diluições duplas em série de soro a testar sobre uma lâmina a 36°C durante 30 minutos antes de serem cuidadosamente enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato (STF·') . Adicionou-se então a cada lâmina anti-IgG canina marcada com FITC (de carneiro) e incubaram-se as lâminas a 36°C durante mais 30 minutos. As lâminas foram lavadas com STF e os resultados foram determinados por microscopia de fluorescência. 0 valor final do título de anticorpos IFA foi determinado como sendo a diluição do soro mais elevada a manifestar uma fluorescência positiva.

Resultados

A recuperação inicial de espiroquetas do sangue (0 a 14 dpd) está representada nos Quadros 1 e 2. A recuperação de espiroquetas no decurso do regime de tratamento encontra-se resumida no Quadro 3. Uma das conclusões a que se chega é a de que se recuperam espiroquetas de todos os cães desafiados num período de quatro dias. No caso dos cães imuno-suprimidos, as espiroquetas são recuperadas num período de cerca de dois dias.

Surpreendentemente, após um período de espera maior, recuperam-se espiroquetas dos cães controlos de contacto que não foram desafiados com espiroquetas. Contudo, o grau de espiroquetemia parece ser inferior ao dos cães tratados, uma vez que a frequência da recuperação das espiroquetas é inferior.

Os títulos de anticorpos (medidos mediante IFA) do soro recolhido nos momentos referidos estão representados nos Quadros 4 e 5. Os elevados títulos de base dos cães não expostos a espiroquetas (1:16 a 1:128) também foram observados por outros investigadores. A conclusão a que se chega ao analisar estes quadros é a de que os medicamentos imuno-supressores intensificam a reacção imunológica à espiroquetemia B. burgdorferi. Presumivelmente, esta intensificação é devida aos níveis superiores de espiroquetemia obtidos quando o animal é imuno-suprimido.

Observou-se ainda que 75% dos cães desafiados mancavam. 60% a 80% dos cães pertencentes a cada grupo desafiado mancava enquanto que não se observou este fenómeno em nenhum dos cães controlo de contacto.

O presente modelo de desafio para a doença de Lyme é especialmente vantajoso pelo facto de os sintomas da doença de Lyme serem manifestados pelos animais desafiados mesmo quando estes não foram imuno-suprimidos, o que sugere que a doença tal como se revela numa situação laboratorial é semelhante à que se observa em animais infectados por uma via natural.

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títulos de anticorpos (ifa) contra borrelia burgdorferi

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Exemplo 2 - Preparação de uma vacina contra B. burgdorferi

Estirpes de B. burgdorferi

Utilizou-se a estirpe B-31 de B. burgdorferi (que pode ser obtida da American Type Tissue Collection (Colecção americana de tipos de tecidos) sob o n^e de acesso 35210) para iniciar culturas produtoras de antigénios em grande escala.

Antecipa-se a utilidade de outras estirpes de B. burgdorferi na preparação de culturas produtoras de antigénios de B. burgdorferi. Utilizam-se, de preferência, na preparação de uma vacina estirpes que tenham a capacidade de causar espiroquetemia num mamífero.

Meio de cultura de espiroquetas

Prepara-se o meio de cultura modificando a fórmula BS II descrita por Barbour e outros em Yale J. Biol. Med.. 57. pp. 521-525, 1984). A fórmula usada é a seguinte:

Fórmula

Ingrediente Quantidade

CMRL 10661 (iox) (GIBCO, Grand Island, New York,

E.U.A.) 83 ml/1

Neopeptona2 (DIFCO, Detroit, Michigan, E.U.A.)	6,6 g/1
Bicarbonato de sódio (Patente nos E.U.A.)	1,8 g/1
Extracto de levedura (Oxoid USA, Columbia, Maryland,
E.U.A.)	3,3 g/1
Tampão HEPES (forma ácida) (Research Organics,
Cleveland, Ohio, E.U.A.)	5,7 g/1
Glucose (Patente nos E.U.A.)	4,3 g/1
Ácido cítrico - sal tripotássico (SIGMA Chemical
St. Louis, Missouri, E.U.A.)	1,0 g/1
Piruvato de sódio (Sigma)	0,7 g/1
N-Acetil-D-glucosamina (Sigma)	0,5 g/1
L-Glutamina3 (GIBCO)	0,4 g/1
Albumina3 de soro bovino (Intergen Biochem., Tuckahoe, Nova Iorque, E.U.A.)	25 g/1
Soro de vitelo fetal3 (HAZLETON, Lenexa, Kansas, E.U.A.)	4,2 ml/1

Água desionizada para perfazer o volume

Descrito por Parker e outros em Special Publication of the New York Academy of Science” (Publicação especial da Academia de Ciências de Nova Iorque), vol. 5, p. 303. 1957, aqui incorporada a título de referência.

² Hidrolisado de proteína de carne.

³ Lábil sob acção do calor.

Aquece-se suavemente um dado volume de água desionizada (aproximadamente 80% do volume final) até atingir uma temperatura que facilite a dissolução dos sólidos atrãs referidos (por exemplo entre 30°C e 40°C). Adiciona-se a precedente lista de ingredientes e agita-se até todos os sólidos estarem dissolvidos. Ajusta-se então o pH para o valor 7,6±0,l com o auxílio de uma solução concentrada de NaOH. O volume é ajustado para o seu valor final mediante a adição de ãgua desionizada. A solução é então filtrada sob condições de esterilidade.

, Alternativamente, prepara-se uma solução dos ingredientes citados, excepto dos que são lábeis sob acção do calor, num volume reduzido e esteriliza-se a solução obtida numa autoclave. As soluções concentradas e esterilizadas por filtração dos ingredientes lábeis sob acção do calor são então adicionadas e o volume é ajustado por adição de ãgua esterilizada.

Os fabricantes indicados como fontes dos componentes do meio não constituem uma lista restritiva mas antes ilustrativa de uma qualidade aceitável. Os componentes do meio de cultura são bem conhecidos em bacteriologia e/ou preparação de culturas de tecidos de mamíferos e existem outros fabricantes que comercializam produtos aceitáveis.

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Descobriu-se que o componente gelatina descrito por Barbour e outros não é necessário ao crescimento das B. burgdorferi. De facto, a gelatina interfere no processamento das B. burgdorferi ao aumentar a viscosidade da cultura bacteriana. A presença de gelatina também exclui a possibilidade de armazenamento num frigorífico antes do processamento, uma vez que a cultura se transforma num gel a baixa temperatura. A gelatina é facultativamente adicionada (numa proporção de 11,7 g/1) ao meio de cultura usado em culturas em pequena e média escala (25 ml a cerca de 10 1) , não sendo em geral adicionada ao meio de cultura no caso de culturas à escala industrial (10 1 ou mais).

Crescimento de B. burgdorferi

As bactérias são cultivadas em recipientes pequenos até que o seu número seja suficiente para inocular um recipiente de fermentação em grande escala (de preferência com uma capacidade compreendida entre 800 1 e 2000 1). As culturas são geralmente inoculadas com 3xl0⁵ organismos por mililitro de meio.

A fermentação é realizada sob monitorização e controlo dos seguintes parâmetros:

Temperatura 34°C ± 1°C pH 7,6 ± 0,2

Rpm do impulsionador 25 - 100

A cultura só é interrompida (após aproximadamente 6 dias) quando a concentração de organismos é pelo menos lxl0⁸/ml. Contudo, é importante, no caso de produções em grande escala, monitorizar a produção das principais proteínas de superfície de B. burgdorferi no decurso da fermentação. A cultura é interrompida no momento em que as concentrações quer de Osp A quer de Osp B atinjam substancialmente o valor máximo (momento após o qual a concentração diminui).

Monitorização de antigénios

Os níveis de antigénios podem ser medidos por diversas técnicas incluindo a electroforése em gel poliacrilamida de SDS (SDS-PAGE), a transferência de proteínas pela técnica Western usando anti-soro dirigido contra antigénios de B. burgdorferi, outros testes mediados por anticorpos tais como RIA (teste de radio-imunidade), ELISA e fixação de complemento (cf. Fundamental Immunology (Imunologia fundamental), ed. org. por W. E.

Paul, pp. 315-358, Raven Press, Nova Iorque, 1989, aqui incorporado a título de referência).

Neste exemplo, os antigénios são monitorizados pelo teste IFA delineado no Exemplo 1. Adicionalmente, o número de células que manifesta uma das principais proteínas de superfície de B. burqdorferi. Osp A ou Osp B, é monitorizado neste ensaio.

Colheita e purificação

Uma vez atingida a concentração máxima de Osp A ou Osp B, a cultura (nesta forma de execução do presente invento) é inactivada mediante a adição de formaldeído até ser atingida a concentração 0,1%. As espiroquetas inactivadas são então concentradas mediante a remoção do meio de crescimento por centrifugação, filtração através de fibras ocas ou filtração mediante fluxo tangencial. Os organismos inactivados são facultativamente lavados com água ou com uma solução salina equilibrada. Finalmente, os organismos inactivados são novamente suspendidos em água ou numa solução salina equilibrada de modo a formar-se um concentrado contendo um número de organismos por mililitro superior ou igual a 5xl0⁸.

Formulação da vacina

O concentrado é diluído até ser atingida a concentração 5xl0⁸ organismos/ml. Adiciona-se então copolimero etileno/(anidrido maleico) (por exemplo o produzido por Monsanto, St. Louis, Missouri, E.U.A.) até a concentração atingir 3% v/v. 0 pH é então ajustado com o auxílio de NaOH IN até ser atingido um valor compreendido entre 6,8 e 7,7. Finalmente, adiciona-se NEOCRYL A640~ até ser atingida a concentração 1% p/v.

Exemplo 3 - Ensaio de neutralização pelo soro

O ensaio de neutralização pelo soro é efectuado do seguinte modo:

A) Esterilizam-se por filtração amostras de soro e o complemento nas amostras é inactivado mediante aquecimento das amostras de soro durante 30 minutos até atingirem a 56°C.

b) Efectuaram-se diluições em série do soro utilizando STF como diluente. As diluições são adicionadas a tubos separados.

c) Adicionaram-se B. burgdorferi em crescimento activo (0,4 ml, 3x10^ organismos/ml) a cada tubo e misturaram-se cuidadosamente com as amostras de soro.

d) Adicionou-se a cada tubo complemento de porquinho da índia esterilizado por filtração (0,8 ml, Sigma, St. Louis, Missouri, E.U.A.) e agitaram-se suavemente os conteúdos dos tubos.

e) Incubaram-se os tubos a 35°C, sob agitação, durante uma hora.

f) Uma porção alíquota com um volume de 0,1 ml de cada um dos tubos foi separadamente adicionada a 0,9 ml de meio BSK II contido num tubo de cultura. As culturas foram mantidas a 35°C durante sete dias.

Uma vez terminado o período de sete dias de incubação, as culturas foram analisadas quanto ao número de bactérias viáveis com o auxílio de um microscópio de campo negro. 0 título de neutralização pelo soro foi determinado como a diluição do soro mais elevada, causadora de uma diminuição em 80% na contagem de espiroquetas em relação ao soro pré-imunização.

Os presentes inventores observaram que sempre que o título de neutralização pelo soro de um cão imunizado é superior a 4, esse cão permanece efectivamente protegido de espiroquetemia _f induzida pelo desafio por espiroquetas B. burqdorferi isoladas.

ensaio de neutralização pelo soro também foi utilizado para mostrar que o H3TS, um anticorpo monoclonal contra Osp A (obtido de Russell C. Johnson da Universidade de Minnesota, E.U.A.), é eficaz no ensaio de neutralização pelo soro (título=l:236). 0 anticorpo monoclonal Cb-2 contra Osp B também neutraliza eficazmente B. burqdorferi neste ensaio. Um anticorpo monoclonal contra a proteína flagelada (41K) não foi eficaz.

Exemplo 4 - Imunização

Vacinação

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Dividiram-se os cães entre um grupo vacinado e um grupo de controlo não vacinado. Ao grupo vacinado administraram-se duas injecções intramusculares de 1 ml da vacina do Exemplo 2. A segunda injecção sucedeu-se à primeira após 22 dias. Alguns dos dados estarão expressos em termos de número de ensaios após a primeira vacinação (dpv) ou número de dias após a segunda vacinação (dpv-2).

Os clínicos terão evidentemente em conta que as condições precisas utilizadas para inactivar os complementos intrínsecos, isto é, o tampão de diluição, o número de organismos adicionado, a quantidade de complemento adicionada, a fonte do complemento, as condições de incubação após a adição do complemento e as condições utilizadas na incubação final, não são críticas e podem ser variadas consoante o desejado ou ditado pelas circunstâncias particulares.

Desafio por B, burqdorferi

156 dias após a segunda vacinação, todos os cães foram desafiados com B. burqdorferi pelo método descrito no Exemplo 1. 0 regime de desafio consistia em injecções diárias de 5000 espiroquetas durante sete dias consecutivos e uma injecção de 2 mg de dexametasona no primeiro dia do desafio e no sexto dia a contar do início do desafio (dias pós-desafio ou dpd”).

Resultados

Quadro 6 mostra que a vacina foi eficaz no propósito de proteger os cães contra espiroquetemia causada por um desafio por espiroquetas B. burqdorferi iniciado 5 meses após a data da vacinação. Segundo um unpaired student-t test, a significância estatística da diferença é p=0,006.

O Quadro 7 mostra que a vacina foi eficaz no propósito de proteger os cães contra a artrite induzida pelas espiroquetas que se manifesta no comportamento dos cães por um manquejamento. segundo análise do Chi-quadrado a significância estatística da diferença no grupo é p<0,01.

O Quadro 8 mostra que a vacina é eficaz no propósito de limitar a febre observada após o desafio com B. burgdorferi. Não só a febre é um fenómeno observado menos frequentemente nos cães vacinados, como não se observa febre após um período de 41 dias após o desafio. Em contrapartida, nos cães não vacinados observa-se febre no decurso de um período mais longo (até 60 dias após o desafio). Segundo o unpaired student-t test”, a significância estatística da diferença nestas observações ao longo dos 38 dias de observação é p<0,001.

O Quadro 9 mostra que os cães vacinados retêm um título de neutralização pelo soro de anticorpos contra B. burgdorferi 156 dias após a segunda vacinação. O desafio pelas espiroquetas aumentou eficazmente este título nos cães vacinados. Em contrapartida, os cães não vacinados apenas manifestaram uma fraca reacção imunológica.

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Exemplo 5 - Técnica Western

Seguiram-se os métodos já conhecidos para efectuar uma transferência de proteínas de B. burgdorferi pela técnica de Western usando soro de cães vacinados para identificar os principais antigénios. A técnica Western encontra-se descrita em Molecular Cloning (Clonagem molecular), 2a edição, pp. 18.47-18.75, (op. cit.).

A Figura 1 mostra uma representação de marcas de B. burgdorferi obtidas pela técnica Western e visualizadas com anti-soro obtido 154 dias após a segunda vacinação pertencente aos cães A e B (vacinados) e aos cães K e L (não vacinados).

Os principais antigénios de B. burgdorferi. identificados com auxílio de anti-soro eficaz num ensaio de neutralização 52 pelo soro, possuem as massas moleculares (±3K) 14, 17, 19, 25, 28, 31, 34, 38, 41, 44, 48, 52, 54, 58, 60, 80 e 90K.

Claims (2)

1. Reivindicações is - Processo para a preparação de uma vacina contra a doença de Lyme, caracterizada por:

   se cultivar bactérias B. burqdorferi, se monitorizar o nível de Osp A ou de Osp B, se inactivar as bactérias quando é atingido o valor máximo na produção de Osp A ou de Osp B, respectivamente, e se misturar as bactérias inactivadas com um suporte fisiologicamente aceitável.

   22 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a monitorização das bactérias, relativamente à percentagem, que exprimem uma de Osp A ou de Osp B.

   32 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado também por se exigir que pelo menos 70% das bactérias cultivadas expressem A ou Osp B.

   42 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por pelo menos 90% das bactérias cultivadas expressarem Osp A e Osp B.

   52 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida inactivação consistir na adição de uma quantidade de glutaraldeído ou formaldeído que inactive eficazmente a B. burqdorferi.

   6a - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a quantidade de aldeído adicionada estar compreendida entre cerca de 0,05% v/v e cerca de 1,0% v/v.

   7^a - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se adicionar um adjuvante às referidas bactérias inactivadas misturadas.

   8^a - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se adicionar pelo menos mais um adjuvante às referidas bactérias inactivadas misturadas.

   9^a - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os referidos adjuvantes serem seleccionados entre o grupo constituído por saponina, óleo, copolímero de etileno/anidrido maleico e neocrilo.

   10^a - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os referidos adjuvantes serem o copolímero de etileno/anidrido maleico e o neocrilo.

   11^a - Processo para a preparação de uma vacina contra a doença de Lyme, caracterizado por:

   se cultivar bactérias B. burgdorferi.

   se monitorizar o teor de Osp A ou de Osp B, se terminar a refrida cultura quando for atingido um valor máximo na produção de Osp A ou de Osp B, se extrair os principais antigénios das referidas bactérias, e se misturar os antigénios extraídos com um suporte fisiologicamente aceitável.

   12 a - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se adicionar um adjuvante aos referidos antigénios extraídos.

   13a - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se adicionar pelo menos mais um adjuvante aos referidos antigénios extraídos.

   14a - processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por os referidos adjuvantes serem seleccionados entre o grupo constituído por saponina, óleo, copolímero de etileno/anidrido maleico e neocrilo.

   15â - processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por os referidos adjuvantes serem o copolímero de etileno/anidrido maleico e o neocrilo.

   16a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se preparar uma vacina destinada a proteger da doença de Lyme um mamífero, especialmente um mamífero felino, canino, aviário, equino, ovino ou bovino, ou um ser humano, a ela predisposto, compreendendo uma quantidade dos principais antigénios contra B. burqdorferi que induza eficazmente um título neutralizador de anticorpos contra B. burqdorferi no soro sanguíneo.

   17a - processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida vacina proteger de modo eficaz contra a doença de Lyme causada por estirpes variantes de B. burqdorferi um mamífero a ela predisposto.

   18a - Processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida vacina conter pelo menos dois dos principais antigénios contra B. burqdorferi.

   19a - Processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por os referidos antigénios principais serem seleceionados entre o grupo constituído pelos antigénios com as massas moleculares 25K, 28K, 31K,

   34K, 38K, 41K, 44K, 48K, 52K, 54K, 58K, 60K, 68K, 80K e 90K _r contra B. burqdorferi. podendo a massa molecular de cada um destes antigénios apresentar uma variação de ±3K.

   20a - Processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 18, especialmente destinada a um mamífero felino, canino, aviário, equino, ovino ou bovino, ou a um ser humano, caracterizado por pelo menos um dos pelo menos dois referidos antigénios principais ser seleccionado entre o grupo constituído por Osp A e Osp B.
2. 2ia - Processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 16, destinada a proteger contra a doença de Lyme um mamífero a ela predisposto, caracterizado por a | referida vacina conter uma quantidade de um antigénio principal contra B. burqdorferi que proteja de modo eficaz contra pelo menos um dos sintomas da doença de Lyme, artrite e febre, um mamífero a ela predisposto.

   22a - Processo para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por essa vacina incluir pelo menos uma vacina seleccionada entre o grupo constituído por vacinas contra Leptospira canicola. Leptospira icterohaemorrhaqiae, Leptospira hardjo, leptospira qrippotyphasa, leucemia felina, rinotraqueíte, calici, panleucopenia, Chlamvdia psittaci, doença canina, adenovírus Tipo 2, coronavírus, para-influenza e parvovírus.

   23â - Processo de acordo com as reivindicações anterιοί res caracterizado por se preparar uma proteína antigénica seleccionada entre o grupo constituído pelos antigénios contra B. burqdorferi com as massas moleculares 25K, 28K, 38K, 44K, 48K,

   52K, 54K, 58K, 60K, 68K, 80K e 90K, em que as massas moleculares de cada antigénio podem apresentar variações de +3K.

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   24- Processo para a indução da doença de Lyme num mamífero de laboratório a ela predisposto, caracterizado por se injectar espiroquetas B. burqdorferi virulentas no referido mamífero de modo a mimar a transmissão da doença por uma carraça.

   25a - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por não se ter expandido as referidas espiroquetas na cultura um número de vezes superior a 10 desde que foram isoladas na carraça ou no mamífero infectado.

   26â - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por as referidas espiroquetas serem injectadas em pelo menos duas ocasiões diferentes.

   27â - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por cada uma das ocasiões estar separada da seguinte por um período de pelo menos 4 horas.

   28â - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por as referidas espiroquetas serem injectadas em pelo menos quatro ocasiões diferentes.

   29a - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por cada uma das injecções de espiroquetas ser efectuada num local diferente do corpo do referido mamífero.

   30^a - Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por cada uma das injecções conter uma quantidade de espiroquetas compreendida entre cerca de 10 e cerca de 1x10^.

   31^a - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por cada uma das injecções conter uma quantidade de espiroquetas compreendida entre cerca de 50 e cerca de 50 000.

   32a - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por cada uma das injecções libertar espiroquetas no local de injecção em pelo menos duas profundidades diferentes.

   33a - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por não se ter expandido as referidas espiroquetas na cultura um número de vezes superior a 2 desde que foram isoladas na carraça ou no animal infectado.

   34a - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido mamífero injectado manifestar pelo menos um sintoma da doença de Lyme.