JPH04297424A - ライム病ワクチンおよびワクチン効力評価用攻撃モデル - Google Patents
ライム病ワクチンおよびワクチン効力評価用攻撃モデルInfo
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はライム病（Ｌｙｍｅ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）の徴候を予防または緩和するワクチン、
該ワクチンの製造方法および該ワクチンの評価用攻撃（
ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）モデルに関する。
ｉｓｅａｓｅ）の徴候を予防または緩和するワクチン、
該ワクチンの製造方法および該ワクチンの評価用攻撃（
ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）モデルに関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】ライム病は、アイ・ダンミニ
（Ｉ．ｄａｍｍｉｎｉ）、アイ・パシフィカス（Ｉ．ｐ
ａｃｉｆｉｃｕｓ）およびアイ・リシナス（Ｉ．ｒｉｃ
ｉｎｕｓ）を包含するイクソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）科の
ダニによって感受性動物の間を伝播するボレリア・バー
グドロフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）スピロヘーターに起因する。
（Ｉ．ｄａｍｍｉｎｉ）、アイ・パシフィカス（Ｉ．ｐ
ａｃｉｆｉｃｕｓ）およびアイ・リシナス（Ｉ．ｒｉｃ
ｉｎｕｓ）を包含するイクソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）科の
ダニによって感受性動物の間を伝播するボレリア・バー
グドロフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）スピロヘーターに起因する。
【０００３】ヒトの場合、該疾病は、ダニのライフサイ
クルの若虫期におけるダニから得られると考えられる。 ライム病の大部分は、若虫期が始まる６月または７月に
発生する。若虫期のイクソデスダニは非常に小さく、ほ
ぼゴマの実の大きさであり、見つけ出すのが困難である
。ダニは、スピロヘーターに起因する疾病を伝播するの
に、約１２時間以上の間、動物宿主の血液を摂食しなけ
ればならないと考えられている。
クルの若虫期におけるダニから得られると考えられる。 ライム病の大部分は、若虫期が始まる６月または７月に
発生する。若虫期のイクソデスダニは非常に小さく、ほ
ぼゴマの実の大きさであり、見つけ出すのが困難である
。ダニは、スピロヘーターに起因する疾病を伝播するの
に、約１２時間以上の間、動物宿主の血液を摂食しなけ
ればならないと考えられている。
【０００４】イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、シカ、トリお
よびウシを包含する多くの家畜動物は該疾病に対して感
受性である。該動物はヒトに伝播するかもしれないスピ
ロヘーターの病原体保有者として供するため、動物それ
自身だけでなく、該動物の世話人にも危険が及ぶ。本願
発明者らおよび他の者らは、ダニ不在下であっても、イ
ヌがケンネルメイトに該疾病を伝播しうることを立証し
たため、このことはとりわけ真実である。したがって、
該疾病は家畜動物からヒトに伝播しうると考えられる。
よびウシを包含する多くの家畜動物は該疾病に対して感
受性である。該動物はヒトに伝播するかもしれないスピ
ロヘーターの病原体保有者として供するため、動物それ
自身だけでなく、該動物の世話人にも危険が及ぶ。本願
発明者らおよび他の者らは、ダニ不在下であっても、イ
ヌがケンネルメイトに該疾病を伝播しうることを立証し
たため、このことはとりわけ真実である。したがって、
該疾病は家畜動物からヒトに伝播しうると考えられる。
【０００５】ビー・バーグドロフェリスピロヘーターは
哺乳動物組織培養にて用いられる混合物と同様の栄養素
複合混合物を必要とするので、それらを ｉｎｖｉｔｒ
ｏ にて増殖させるのは困難である（バーバー（Ｂａｒ
ｂｏｕｒ）ら、カーレント・マイクロバイオロジー（Ｃ
ｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）８：１２３〜１２６，
１９８３）。スピロヘーターは、培養体にて、（例えば
、１２〜２４時間の倍増時間で）ゆっくりと増殖する。
哺乳動物組織培養にて用いられる混合物と同様の栄養素
複合混合物を必要とするので、それらを ｉｎｖｉｔｒ
ｏ にて増殖させるのは困難である（バーバー（Ｂａｒ
ｂｏｕｒ）ら、カーレント・マイクロバイオロジー（Ｃ
ｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）８：１２３〜１２６，
１９８３）。スピロヘーターは、培養体にて、（例えば
、１２〜２４時間の倍増時間で）ゆっくりと増殖する。
【０００６】ライム病の徴候は変化し、該徴候は他の疾
病の徴候と類似するため該疾病を診断することは困難で
ある。該疾病の初期の徴候は、皮膚発疹、発熱、頭痛な
らびに筋肉および関節痛を包含する。感染後、数週間な
いし数カ月で、該徴候は心臓炎症および再発生関節炎を
包含しうる。その後、該徴候は慢性関節炎および痴呆を
包含しうる。
病の徴候と類似するため該疾病を診断することは困難で
ある。該疾病の初期の徴候は、皮膚発疹、発熱、頭痛な
らびに筋肉および関節痛を包含する。感染後、数週間な
いし数カ月で、該徴候は心臓炎症および再発生関節炎を
包含しうる。その後、該徴候は慢性関節炎および痴呆を
包含しうる。
【０００７】該疾病は、感染後、テトラサイクリン、ペ
ニシリンおよびエリスロマイシンを包含する多くの抗生
物質で治療することができる。それにもかかわらず、ダ
ニが最も攻撃的に該疾病を伝播する２ないし３カ月の期
間を通して効果的である予防処理に対する要求がある。 ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）の米国特許第４７２１６
１７号は、生理学上許容されるビヒクル中、不活性化バ
ーグドロフェリ・スピロヘーターからなるワクチンを記
載している。該ジョンソンのワクチンは、ワクチン接種
後３０日で、ビー・バーグドロフェリの攻撃から齧歯動
物を保護するのに効果的であると開示されている。該ジ
ョンソンのワクチンは、血清中和検定にて効果的である
抗血清を顕在化させることを開示していない。該ワクチ
ンがライム病の徴候の制御に有効であることも開示され
ていない。さらには、該特許は、保護哺乳動物における
抗血清を顕在化させる一群のビー・バーグドロフェリ蛋
白を開示していない。この蛋白群は本願にて初めて開示
されている。
ニシリンおよびエリスロマイシンを包含する多くの抗生
物質で治療することができる。それにもかかわらず、ダ
ニが最も攻撃的に該疾病を伝播する２ないし３カ月の期
間を通して効果的である予防処理に対する要求がある。 ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）の米国特許第４７２１６
１７号は、生理学上許容されるビヒクル中、不活性化バ
ーグドロフェリ・スピロヘーターからなるワクチンを記
載している。該ジョンソンのワクチンは、ワクチン接種
後３０日で、ビー・バーグドロフェリの攻撃から齧歯動
物を保護するのに効果的であると開示されている。該ジ
ョンソンのワクチンは、血清中和検定にて効果的である
抗血清を顕在化させることを開示していない。該ワクチ
ンがライム病の徴候の制御に有効であることも開示され
ていない。さらには、該特許は、保護哺乳動物における
抗血清を顕在化させる一群のビー・バーグドロフェリ蛋
白を開示していない。この蛋白群は本願にて初めて開示
されている。
【０００８】ビー・バーグドロフェリ抗原ＯｓｐＡに対
する抗体は、治療動物に受動免疫を付与するのに効果的
であると記載されている。ＯｓｐＡはビー・バーグドロ
フェリの主外部膜蛋白であり、分子量が約３１Ｋである
。ＯｓｐＡの遺伝子を単離し、発現ベクターが構築され
た（ハウェー（Ｈｏｗｅ）ら、インフェクション・イム
ニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）５
４：２０７〜２１２，１９８６）。したがって、この表
面蛋白はワクチンにおける有用性を立証するかもしれな
い。しかしながら、この蛋白の構成は、他のバーグドロ
フェリ表面蛋白であるＯｓｐＢのように（バーバーら、
インフェクションおよびイムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ），４５：９４〜１０
０，１９８４）、スピロヘーター株の間で変異すると考
えられている（バーバーら、ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディシーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
），１５２：４７８〜４８４，１９８５；ビセット（Ｂ
ｉｓｓｅｔ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイ
クロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．），２５：２２９６〜２３０１，１９８７）
。さらに、関連するボレリア・ヘルムジイ（Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ）スピロヘーターの主蛋白（回
帰熱の起因病原体）も株の間で変異することが知られて
いる（バーバーら、ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メソッド（Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄ．）１５６：１３１２〜１３２４，１９８２）。この
変異がスピロヘーター株を変異することによって感染か
らのクロス保護を阻害し、それによってスピロヘーター
が宿主の動物免疫系を回避する機構が明らかになるかも
しれない。
する抗体は、治療動物に受動免疫を付与するのに効果的
であると記載されている。ＯｓｐＡはビー・バーグドロ
フェリの主外部膜蛋白であり、分子量が約３１Ｋである
。ＯｓｐＡの遺伝子を単離し、発現ベクターが構築され
た（ハウェー（Ｈｏｗｅ）ら、インフェクション・イム
ニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）５
４：２０７〜２１２，１９８６）。したがって、この表
面蛋白はワクチンにおける有用性を立証するかもしれな
い。しかしながら、この蛋白の構成は、他のバーグドロ
フェリ表面蛋白であるＯｓｐＢのように（バーバーら、
インフェクションおよびイムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ），４５：９４〜１０
０，１９８４）、スピロヘーター株の間で変異すると考
えられている（バーバーら、ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディシーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
），１５２：４７８〜４８４，１９８５；ビセット（Ｂ
ｉｓｓｅｔ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイ
クロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．），２５：２２９６〜２３０１，１９８７）
。さらに、関連するボレリア・ヘルムジイ（Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ）スピロヘーターの主蛋白（回
帰熱の起因病原体）も株の間で変異することが知られて
いる（バーバーら、ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メソッド（Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄ．）１５６：１３１２〜１３２４，１９８２）。この
変異がスピロヘーター株を変異することによって感染か
らのクロス保護を阻害し、それによってスピロヘーター
が宿主の動物免疫系を回避する機構が明らかになるかも
しれない。
【０００９】ワクチンを評価する場合、実験室動物が被
験病原体で標準的生殖感染を有することが重要である。 かかる感染は、生殖手段により実験室動物に導入される
ことが好ましい。この種の生殖実験室疾病が「攻撃モデ
ル」であり、それで病原体での攻撃から動物を保護する
ワクチンの効力を試験することができる。該攻撃モデル
は自然に見いだされる疾病と密接に似ていることが好ま
しい。
験病原体で標準的生殖感染を有することが重要である。 かかる感染は、生殖手段により実験室動物に導入される
ことが好ましい。この種の生殖実験室疾病が「攻撃モデ
ル」であり、それで病原体での攻撃から動物を保護する
ワクチンの効力を試験することができる。該攻撃モデル
は自然に見いだされる疾病と密接に似ていることが好ま
しい。
【００１０】種々の齧歯動物の攻撃モデル（スピロヘー
ター注射により該疾病を齧歯動物に誘発する）がライム
病に対するワクチンの効力を評価するのに記載されてい
る（例えば、シャイブル（Ｓｃｈａｉｂｌｅ）ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ，８７：３７６８〜３７７２，１９９０お
よび米国特許第４７２１６１７号）。しかしながら、齧
歯動物において菌血症を誘発することはできるが、齧歯
動物攻撃モデルにおけるライム病の徴候は化学的または
遺伝学的に免疫抵抗性減弱の齧歯動物でのみ報告されて
いる（例えば、シャイブルら、前掲）。
ター注射により該疾病を齧歯動物に誘発する）がライム
病に対するワクチンの効力を評価するのに記載されてい
る（例えば、シャイブル（Ｓｃｈａｉｂｌｅ）ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ，８７：３７６８〜３７７２，１９９０お
よび米国特許第４７２１６１７号）。しかしながら、齧
歯動物において菌血症を誘発することはできるが、齧歯
動物攻撃モデルにおけるライム病の徴候は化学的または
遺伝学的に免疫抵抗性減弱の齧歯動物でのみ報告されて
いる（例えば、シャイブルら、前掲）。
【００１１】さらには、この疾病の罹病者、病原体保有
者または伝播キャリアーとしてのイヌの重要性にもかか
わらず、いまだイヌ攻撃モデルは記載されていない。ア
ッペル（Ａｐｐｌｅ）（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｎ
Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｔｈｅ ＰｒａｃｔｉｃｉｎｇＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａ
ｎ）４（１１）：８８８〜８９２，１９８２）およびグ
リーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら（アメリカン・ジャーナル・
オブ・ベタリナリー・リサーチ（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒ
ｅｓ．）４９：７５２〜７５７，１９８８）は、イヌ攻
撃モデルを開発する従来の試みの不成功を記載している
。せいぜい、イヌの潜伏性実験ビー・バーグドロフェリ
感染が記載されているにすぎない（バーゲス（Ｂｕｒｇ
ｅｓｓ）、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ Ｆｕｅｒ Ｂａ
ｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ
ｕｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ），Ａ２６３：４９〜５４，
１９８６）。
者または伝播キャリアーとしてのイヌの重要性にもかか
わらず、いまだイヌ攻撃モデルは記載されていない。ア
ッペル（Ａｐｐｌｅ）（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｎ
Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｔｈｅ ＰｒａｃｔｉｃｉｎｇＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａ
ｎ）４（１１）：８８８〜８９２，１９８２）およびグ
リーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら（アメリカン・ジャーナル・
オブ・ベタリナリー・リサーチ（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒ
ｅｓ．）４９：７５２〜７５７，１９８８）は、イヌ攻
撃モデルを開発する従来の試みの不成功を記載している
。せいぜい、イヌの潜伏性実験ビー・バーグドロフェリ
感染が記載されているにすぎない（バーゲス（Ｂｕｒｇ
ｅｓｓ）、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ Ｆｕｅｒ Ｂａ
ｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ
ｕｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ），Ａ２６３：４９〜５４，
１９８６）。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は感受性哺
乳動物宿主にて対応する抗血清を顕在化させる、ビー・
バーグドロフェリの少なくとも２種の主抗原からなるワ
クチンを提供することである。
乳動物宿主にて対応する抗血清を顕在化させる、ビー・
バーグドロフェリの少なくとも２種の主抗原からなるワ
クチンを提供することである。
【００１３】本発明のさらなる目的はビー・バーグドロ
フェリ・スピロヘーターの株ないし株変異にもかかわら
ず、ライム病から感受性哺乳動物を保護するワクチンを
提供することである。
フェリ・スピロヘーターの株ないし株変異にもかかわら
ず、ライム病から感受性哺乳動物を保護するワクチンを
提供することである。
【００１４】本発明のもう一つ別の目的は免疫抵抗性減
弱的でない哺乳動物を用い、ライム病の少なくとも１つ
の徴候を示す攻撃モデルを提供することである。該攻撃
モデルを用いてライム病に対するワクチンおよび別の治
療の効力を評価することができる。
弱的でない哺乳動物を用い、ライム病の少なくとも１つ
の徴候を示す攻撃モデルを提供することである。該攻撃
モデルを用いてライム病に対するワクチンおよび別の治
療の効力を評価することができる。
【００１５】本発明のさらにもう一つ別の目的は診断目
的に用いうるビー・バーグドロフェリ抗原およびビー・
バーグドロフェリに対する抗体を提供することである。
的に用いうるビー・バーグドロフェリ抗原およびビー・
バーグドロフェリに対する抗体を提供することである。
【００１６】本発明のさらにもう一つ別の目的はライム
病ワクチンの調製に用いるビー・バーグドロフェリ産生
方法を提供することである。本発明のさらにもう一つ別
の目的は血清中和検定法を提供し、それによりビー・バ
ーグドロフェリに対する抗血清の効力を検定することで
ある。
病ワクチンの調製に用いるビー・バーグドロフェリ産生
方法を提供することである。本発明のさらにもう一つ別
の目的は血清中和検定法を提供し、それによりビー・バ
ーグドロフェリに対する抗血清の効力を検定することで
ある。
【００１７】ビー・バーグドロフェリに対して血清中和
価の抗体を有する動物は、１４、１７、１９、２５、２
８、３１、３４、３８、４１、４４、４８、５２、５４
、５８、６０、６８、８０および９０Ｋの分子量（±３
Ｋ）を有する一連のビー・バーグドロフェリ蛋白に対す
る抗体を有し、菌血症およびビー・バーグドロフェリ・
スピロヘーターによる攻撃後の他のライム病徴候から保
護されることが見いだされた。少なくとも２種のこれら
主抗原からなり、血清中和価を有する抗血清を産生する
ワクチンは、ライム病から感受性哺乳動物を保護するの
に効果的である考えられる。
価の抗体を有する動物は、１４、１７、１９、２５、２
８、３１、３４、３８、４１、４４、４８、５２、５４
、５８、６０、６８、８０および９０Ｋの分子量（±３
Ｋ）を有する一連のビー・バーグドロフェリ蛋白に対す
る抗体を有し、菌血症およびビー・バーグドロフェリ・
スピロヘーターによる攻撃後の他のライム病徴候から保
護されることが見いだされた。少なくとも２種のこれら
主抗原からなり、血清中和価を有する抗血清を産生する
ワクチンは、ライム病から感受性哺乳動物を保護するの
に効果的である考えられる。
【００１８】さらには、天然の感染経路をまねる方法に
て低継代スピロヘーターを注射することにより、該疾病
の人工モデル（「攻撃モデル」）を哺乳動物に顕在化さ
せうることが見いだされた。
て低継代スピロヘーターを注射することにより、該疾病
の人工モデル（「攻撃モデル」）を哺乳動物に顕在化さ
せうることが見いだされた。
【００１９】図１はビー・バーグドロフェリに対し血清
中和価の抗血清を有する免疫化イヌからの抗血清を用い
て明視化したスピロヘーターのウェスタンブロットを示
す。
中和価の抗血清を有する免疫化イヌからの抗血清を用い
て明視化したスピロヘーターのウェスタンブロットを示
す。
【００２０】攻撃モデル
攻撃モデルに用いるスピロヘーターは、感染ダニの中腸
から単離した後、少数の継代を介して培養した。一般に
は、約１０回だけ継代する。好ましくは、２回のみ継代
する。ここで用いる「継代」とは、一般に、培養にて、
１０２〜１０４の生物体／ｍｌから１０６〜１０８の生
物体／ｍｌへの増殖を意味する。
から単離した後、少数の継代を介して培養した。一般に
は、約１０回だけ継代する。好ましくは、２回のみ継代
する。ここで用いる「継代」とは、一般に、培養にて、
１０２〜１０４の生物体／ｍｌから１０６〜１０８の生
物体／ｍｌへの増殖を意味する。
【００２１】該攻撃モデルは、自然に起こるダニ−伝達
感染をまねてデザインする。特に、摂食ダニによるよう
にスピロヘーターを繰り返し注射する。一般に、いずれ
の１回の注射においてもスピロヘーターの用量はスピロ
ヘーターが約１０８以下であり、好ましくは約１０〜約
１０６のスピロヘーターである。最も好ましい具体例に
おいて、スピロヘーターの数は約５０〜約５００００の
スピロヘーターである。投与回数は少なくとも２回であ
り、好ましくは約４回〜約１４回である。好ましくは、
投与間にて少なくとも４時間が経過している。
感染をまねてデザインする。特に、摂食ダニによるよう
にスピロヘーターを繰り返し注射する。一般に、いずれ
の１回の注射においてもスピロヘーターの用量はスピロ
ヘーターが約１０８以下であり、好ましくは約１０〜約
１０６のスピロヘーターである。最も好ましい具体例に
おいて、スピロヘーターの数は約５０〜約５００００の
スピロヘーターである。投与回数は少なくとも２回であ
り、好ましくは約４回〜約１４回である。好ましくは、
投与間にて少なくとも４時間が経過している。
【００２２】いずれの所定の投与もまた、スピロヘータ
ーの自然伝播をまねて変えることができる。例えば、所
定の投与のスピロヘーターを動物の複数の場所に注射し
てもよい。さらに、いずれの注射部位においても、多様
な深度（例えば、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、皮
内（ＩＤ）および皮下（ＳＣ））にて注射することがで
きる。
ーの自然伝播をまねて変えることができる。例えば、所
定の投与のスピロヘーターを動物の複数の場所に注射し
てもよい。さらに、いずれの注射部位においても、多様
な深度（例えば、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、皮
内（ＩＤ）および皮下（ＳＣ））にて注射することがで
きる。
【００２３】スピロヘーター投与の好ましいスケジュー
ルは、約１週間の過程にわたって一日の注射（約１／３
ＩＰ、約１／３ＩＤ、約１／３ＳＣ）である。
ルは、約１週間の過程にわたって一日の注射（約１／３
ＩＰ、約１／３ＩＤ、約１／３ＳＣ）である。
【００２４】スピロヘーターは、一般に、攻撃開始の数
日の範囲内で攻撃したイヌから回収することができる。 跛行が、一般に、約３０日後に見られる。しかしながら
、これら事象の時期は攻撃動物の種類により変化するも
のと思われる。
日の範囲内で攻撃したイヌから回収することができる。 跛行が、一般に、約３０日後に見られる。しかしながら
、これら事象の時期は攻撃動物の種類により変化するも
のと思われる。
【００２５】スピロヘーター血症は、免疫抑制剤または
免疫抑制化学物質を投与することによって、または電離
放射線を照射することによって動物を免疫抑制化するこ
とにより攻撃動物にて強化することができる。そのうち
適当な免疫抑制剤は、種々のグルココルチコイドステロ
イド（デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロンを包
含）、シクロスポリン、アザチオピン（６−メルカプト
プリンの類似体）、ＦＫ−５０６（ガト（Ｇａｔｏ）ら
、トランスプランテーション・プロシーディングス（Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．），１９（Ｓ６）：４
，１９８７）、１５−デオキシスペルグアリン（トド（
Ｔｏｄｏ）ら、トランスプランテーション・プロシーデ
ィングス，２０９（Ｓ１）：２３３〜２３６，１９８８
）等である。デキサメタゾンはＩＣＮ・バイオケミカル
ズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（オハイオ州
、クリーヴランド）およびシェリング・コーポレーショ
ン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）（ニュージャージ
州、ケニルワース、アジウム〜（Ａｚｉｕｍ〜）の商品
名で市販）から入手可能である。メチルプレドニゾロン
・アセテートは、デポ−メドロール〜（Ｄｅｐｏ−Ｍｅ
ｄｒｏｌ〜）（ミシガン州、カラマズー、アップジョン
・カンパニー（ＵｐｊｏｈｎＣｏ．））として、または
デポ−プレデート〜（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｅｄａｔｅ〜）（
アリゾナ州、スコットデール、レゲレ・ファーマシュー
ティカルズ（Ｌｅｇｅｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ））として入手可能である。デキサメタゾンが本
発明の好ましい免疫抑制剤である。
免疫抑制化学物質を投与することによって、または電離
放射線を照射することによって動物を免疫抑制化するこ
とにより攻撃動物にて強化することができる。そのうち
適当な免疫抑制剤は、種々のグルココルチコイドステロ
イド（デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロンを包
含）、シクロスポリン、アザチオピン（６−メルカプト
プリンの類似体）、ＦＫ−５０６（ガト（Ｇａｔｏ）ら
、トランスプランテーション・プロシーディングス（Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．），１９（Ｓ６）：４
，１９８７）、１５−デオキシスペルグアリン（トド（
Ｔｏｄｏ）ら、トランスプランテーション・プロシーデ
ィングス，２０９（Ｓ１）：２３３〜２３６，１９８８
）等である。デキサメタゾンはＩＣＮ・バイオケミカル
ズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（オハイオ州
、クリーヴランド）およびシェリング・コーポレーショ
ン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）（ニュージャージ
州、ケニルワース、アジウム〜（Ａｚｉｕｍ〜）の商品
名で市販）から入手可能である。メチルプレドニゾロン
・アセテートは、デポ−メドロール〜（Ｄｅｐｏ−Ｍｅ
ｄｒｏｌ〜）（ミシガン州、カラマズー、アップジョン
・カンパニー（ＵｐｊｏｈｎＣｏ．））として、または
デポ−プレデート〜（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｅｄａｔｅ〜）（
アリゾナ州、スコットデール、レゲレ・ファーマシュー
ティカルズ（Ｌｅｇｅｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ））として入手可能である。デキサメタゾンが本
発明の好ましい免疫抑制剤である。
【００２６】さらに、スピロヘーター血症は、攻撃モデ
ル用の遺伝学的に免疫不全の動物を用いることによって
強化されると考えられる。
ル用の遺伝学的に免疫不全の動物を用いることによって
強化されると考えられる。
【００２７】ここに開示の攻撃モデルは、以下に開示の
ライム病ワクチンの効力を試験するのに用いることがで
きる。加えて、該攻撃モデルは、抗生物質および受動免
疫化での治療を包含するライム病の他の治療を試験する
のに用いることができる。
ライム病ワクチンの効力を試験するのに用いることがで
きる。加えて、該攻撃モデルは、抗生物質および受動免
疫化での治療を包含するライム病の他の治療を試験する
のに用いることができる。
【００２８】ビー・バーグドロフェリ・ワクチンの生成
好ましくは、ワクチン生成における初期段階で用いられ
るビー・バーグドロフェリ株は感受性哺乳動物にてスピ
ロヘーター血症を誘発する能力を保持している。ビー・
バーグドロフェリ株Ｂ−３１が最も好ましい（受入れ番
号第３５２１０号の下、アメリカン・タイプ・ティシュ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である
）。
好ましくは、ワクチン生成における初期段階で用いられ
るビー・バーグドロフェリ株は感受性哺乳動物にてスピ
ロヘーター血症を誘発する能力を保持している。ビー・
バーグドロフェリ株Ｂ−３１が最も好ましい（受入れ番
号第３５２１０号の下、アメリカン・タイプ・ティシュ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である
）。
【００２９】ビー・バーグドロフェリ・スピロヘーター
は、ＢＳＫ ＩＩ培地（バーバーら、イェール・ジャー
ナル・オブ・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｙａ
ｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．），５７：５２１〜５２
５，１９８４）またはその栄養均等物にて増殖させるこ
とができる。この培地は、哺乳動物細胞用にデザインさ
れた培地（さらにずっと複雑である）の適用であるため
、ビー・バーグドロフェリの増殖速度に有意に影響しな
い範囲内で複数の成分を省略することができると考えら
れる。増殖培地におけるかかる変形は、過度の実験を行
うことなく容易に確認することができ、本発明の範囲内
である。
は、ＢＳＫ ＩＩ培地（バーバーら、イェール・ジャー
ナル・オブ・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｙａ
ｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．），５７：５２１〜５２
５，１９８４）またはその栄養均等物にて増殖させるこ
とができる。この培地は、哺乳動物細胞用にデザインさ
れた培地（さらにずっと複雑である）の適用であるため
、ビー・バーグドロフェリの増殖速度に有意に影響しな
い範囲内で複数の成分を省略することができると考えら
れる。増殖培地におけるかかる変形は、過度の実験を行
うことなく容易に確認することができ、本発明の範囲内
である。
【００３０】培養温度は、一般に２５℃〜４０℃であり
、好ましくは３２℃〜３８℃、最も好ましくは３４℃で
ある。好ましくは、該温度をインキュベーション全体を
通して目標温度の１℃の範囲内で維持する。
、好ましくは３２℃〜３８℃、最も好ましくは３４℃で
ある。好ましくは、該温度をインキュベーション全体を
通して目標温度の１℃の範囲内で維持する。
【００３１】一般に、培地のｐＨは７．０〜８．０であ
る。好ましくは、適宜、酸または塩基を添加することに
よりインキュベーション過程を通して、ｐＨを所望のｐ
Ｈの±０．２ｐＨ単位の範囲内に維持する。最も好まし
くは、ｐＨが７．６±０．２である。
る。好ましくは、適宜、酸または塩基を添加することに
よりインキュベーション過程を通して、ｐＨを所望のｐ
Ｈの±０．２ｐＨ単位の範囲内に維持する。最も好まし
くは、ｐＨが７．６±０．２である。
【００３２】インキュベーションは、一般に、撹拌され
て培養体と空気の間のガス交換が促進される容器中にて
行う。好ましくは、撹拌を約２５〜約１００ｒｐｍで回
転するインペラーで行う。
て培養体と空気の間のガス交換が促進される容器中にて
行う。好ましくは、撹拌を約２５〜約１００ｒｐｍで回
転するインペラーで行う。
【００３３】有意には、ビー・バーグドロフェリの主表
面蛋白であるＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方の産生レベ
ルを検定することによりインキュベーション過程をモニ
ター観察する。これら蛋白をモニターする方法を実施例
２に記載する。これら蛋白の一方にて最大レベルが得ら
れたならば、ビー・バーグドロフェリ培養を終える。該
蛋白をモニターする場合、インキュベーションの終了時
に存在するビー・バーグドロフェリ細胞の少なくとも６
０％が該蛋白を発現することが好ましい。これは免疫蛍
光検定（実施例１に記載）により測定することができる
。さらに好ましくは、該生物体の少なくとも７０％が蛋
白を発現する。なお一層好ましくは、該生物体の少なく
とも９０％が蛋白を発現する。
面蛋白であるＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方の産生レベ
ルを検定することによりインキュベーション過程をモニ
ター観察する。これら蛋白をモニターする方法を実施例
２に記載する。これら蛋白の一方にて最大レベルが得ら
れたならば、ビー・バーグドロフェリ培養を終える。該
蛋白をモニターする場合、インキュベーションの終了時
に存在するビー・バーグドロフェリ細胞の少なくとも６
０％が該蛋白を発現することが好ましい。これは免疫蛍
光検定（実施例１に記載）により測定することができる
。さらに好ましくは、該生物体の少なくとも７０％が蛋
白を発現する。なお一層好ましくは、該生物体の少なく
とも９０％が蛋白を発現する。
【００３４】本発明の一具体例において、インキュベー
ション後、生物体を不活性化するかまたは抗原フラクシ
ョンを生または毒性スピロヘーター不含にて収集する。 該生物体は、メルチオレート、β−プロピレンラクトン
、二元エチレンアミン、フェノール、グルタルアルデヒ
ドおよびホルムアルデヒドを包含する多くの化学剤によ
り不活性化することができる。さらに、該生物体は熱（
例えば、６０℃にて数時間）で不活性化することができ
る。
ション後、生物体を不活性化するかまたは抗原フラクシ
ョンを生または毒性スピロヘーター不含にて収集する。 該生物体は、メルチオレート、β−プロピレンラクトン
、二元エチレンアミン、フェノール、グルタルアルデヒ
ドおよびホルムアルデヒドを包含する多くの化学剤によ
り不活性化することができる。さらに、該生物体は熱（
例えば、６０℃にて数時間）で不活性化することができ
る。
【００３５】好ましい不活性化剤は、グルタルアルデヒ
ドまたはホルムアルデヒドのようなアルデヒドである。 ホルムアルデヒドが最も好ましい。使用するアルデヒド
の濃度は、約０．０５％〜約１％ｖ／ｖが好ましい。最
も好ましくは、濃度が０．１％である。
ドまたはホルムアルデヒドのようなアルデヒドである。 ホルムアルデヒドが最も好ましい。使用するアルデヒド
の濃度は、約０．０５％〜約１％ｖ／ｖが好ましい。最
も好ましくは、濃度が０．１％である。
【００３６】抗原フラクションは、例えば、ゲル濾過、
電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／
または遠心分離で収集することができる。
電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／
または遠心分離で収集することができる。
【００３７】治療すべき哺乳動物に投与する前に、採収
した抗原および／またはスピロヘーターを生理学上許容
される担体に懸濁させる。好ましくは、抗原／スピロヘ
ーターを水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サ
ポニン、オイルまたはアジュバント活性を有する公知の
ポリマーのようなアジュバントと混合する。
した抗原および／またはスピロヘーターを生理学上許容
される担体に懸濁させる。好ましくは、抗原／スピロヘ
ーターを水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サ
ポニン、オイルまたはアジュバント活性を有する公知の
ポリマーのようなアジュバントと混合する。
【００３８】多くのアクリル酸ポリマーおよびアクリル
酸とメタクリル酸ならびにスチレンのコポリマーはアジ
ュバント活性を有している。ポリビニル・ケミカル・イ
ンダストリーズ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（マサチューセッツ州、ウ
ィルミントン）は、かかるポリマーを商品名：ネオクリ
ル（ＮＥＯＣＲＹＬ）の下で市販している。ＮＥＯＣＲ
ＹＬ Ａ６４０は、ｐＨ７．５、粘度１００ｅｐｓ（ブ
ルックフィールド（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）２５℃）、
固体４０重量％、固体３８容量％含有のガロン当たり８
．６ポンドの重量、および酸数４８を有する水性アクリ
ルコポリマーであり、好ましいアジュバントである。詳
しくは、ＮＥＯＣＲＹＬＡ６４０はスチレンと非合一の
水性アクリルコポリマーである。さらに詳しくは、ＮＥ
ＯＣＲＹＬ Ａ６４０はスチレンとアクリル酸およびメ
タクリル酸の混合物とのコポリマーのラテックスエマル
ジョンである。他の有用なＮＥＯＣＲＹＬグレードは５
２０および６２５ならびにＮＥＯＲＥＺ９６６である。 「ＣＳＭＡ」なる語は、スチレンとアクリル酸およびメ
タクリル酸の混合物とのコポリマーを称するのに用いら
れる。
酸とメタクリル酸ならびにスチレンのコポリマーはアジ
ュバント活性を有している。ポリビニル・ケミカル・イ
ンダストリーズ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（マサチューセッツ州、ウ
ィルミントン）は、かかるポリマーを商品名：ネオクリ
ル（ＮＥＯＣＲＹＬ）の下で市販している。ＮＥＯＣＲ
ＹＬ Ａ６４０は、ｐＨ７．５、粘度１００ｅｐｓ（ブ
ルックフィールド（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）２５℃）、
固体４０重量％、固体３８容量％含有のガロン当たり８
．６ポンドの重量、および酸数４８を有する水性アクリ
ルコポリマーであり、好ましいアジュバントである。詳
しくは、ＮＥＯＣＲＹＬＡ６４０はスチレンと非合一の
水性アクリルコポリマーである。さらに詳しくは、ＮＥ
ＯＣＲＹＬ Ａ６４０はスチレンとアクリル酸およびメ
タクリル酸の混合物とのコポリマーのラテックスエマル
ジョンである。他の有用なＮＥＯＣＲＹＬグレードは５
２０および６２５ならびにＮＥＯＲＥＺ９６６である。 「ＣＳＭＡ」なる語は、スチレンとアクリル酸およびメ
タクリル酸の混合物とのコポリマーを称するのに用いら
れる。
【００３９】エチレン／無水マレイン酸コポリマーも別
の好ましいアジュバントである。本発明の有用なエチレ
ン／無水マレイン酸コポリマーの適当なグレードは、Ｅ
ＭＡ−３１（ミズリー州、セントルイス、モンサント社
（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．））のような線状エチレン
／マレイン酸のコポリマーであり、約７５０００〜１０
００００の概算平均分子量を有するエチレンと無水マレ
イン酸が略等量のコポリマーである。これらコポリマー
は、以下の典型的特性を有する水溶性の白色、フリーフ
ロー粉体である：真密度約１．５４ｇ／ｍｌ、軟化点約
１７０℃、融点約２３５℃、分解温度約２７４℃、嵩密
度約２０（ｌｂｓ／ｆｔ３）およびｐＨ２．３（１％溶
液）。
の好ましいアジュバントである。本発明の有用なエチレ
ン／無水マレイン酸コポリマーの適当なグレードは、Ｅ
ＭＡ−３１（ミズリー州、セントルイス、モンサント社
（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．））のような線状エチレン
／マレイン酸のコポリマーであり、約７５０００〜１０
００００の概算平均分子量を有するエチレンと無水マレ
イン酸が略等量のコポリマーである。これらコポリマー
は、以下の典型的特性を有する水溶性の白色、フリーフ
ロー粉体である：真密度約１．５４ｇ／ｍｌ、軟化点約
１７０℃、融点約２３５℃、分解温度約２７４℃、嵩密
度約２０（ｌｂｓ／ｆｔ３）およびｐＨ２．３（１％溶
液）。
【００４０】さらに好ましくは、２種以上のアジュバン
トを採収した抗原および／またはスピロヘーターと混合
する。好ましい組み合わせは、エチレン／無水マレイン
酸コポリマーとＮＥＯＣＲＹＬ Ａ６４０である。
トを採収した抗原および／またはスピロヘーターと混合
する。好ましい組み合わせは、エチレン／無水マレイン
酸コポリマーとＮＥＯＣＲＹＬ Ａ６４０である。
【００４１】該ワクチンのｐＨは、一般に、１Ｎの酸ま
たは塩基を適宜添加することにより約６．８と約７．７
の間に調整する。
たは塩基を適宜添加することにより約６．８と約７．７
の間に調整する。
【００４２】採収した抗原および／またはスピロヘータ
ーを、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風
トキシンのような免疫刺激性巨大分子と結合させてもよ
い。蛋白の巨大分子への結合は、リクイト（Ｌｉｋｈｉ
ｔｅ）の米国特許第４３７２９４５号およびアロマー（
Ａｒｍｏｒ）らの米国特許第４４７４７５７号に開示さ
れている。ワクチン調製の一般的態様は、ニュー・トレ
ンズ・アンド・デベロップメンツ・イン・ワクチンズ（
Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）（ボラー（Ｖｏｌｌｅ
ｒ）ら編、ユニバーシティー・パーク・プレス、メリー
ランド州、バルチモア、１９７８）に記載されている。
ーを、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風
トキシンのような免疫刺激性巨大分子と結合させてもよ
い。蛋白の巨大分子への結合は、リクイト（Ｌｉｋｈｉ
ｔｅ）の米国特許第４３７２９４５号およびアロマー（
Ａｒｍｏｒ）らの米国特許第４４７４７５７号に開示さ
れている。ワクチン調製の一般的態様は、ニュー・トレ
ンズ・アンド・デベロップメンツ・イン・ワクチンズ（
Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）（ボラー（Ｖｏｌｌｅ
ｒ）ら編、ユニバーシティー・パーク・プレス、メリー
ランド州、バルチモア、１９７８）に記載されている。
【００４３】抗原は、ゲル濾過、ここに開示の抗血清を
用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー、分別遠
心分離または電気泳動のような破砕法を包含する数種の
方法により、生または毒性生物体不含にて収集すること
ができる。例えば、ビー・バーグドロフェリの外膜抗原
は低濃度のイオン性または非イオン性のいずれかのデタ
ージェントで抽出しうることが見いだされた。これらの
抽出抗原は、ワクチン接種動物における免疫応答を顕在
化させるのに効果的である。
用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー、分別遠
心分離または電気泳動のような破砕法を包含する数種の
方法により、生または毒性生物体不含にて収集すること
ができる。例えば、ビー・バーグドロフェリの外膜抗原
は低濃度のイオン性または非イオン性のいずれかのデタ
ージェントで抽出しうることが見いだされた。これらの
抽出抗原は、ワクチン接種動物における免疫応答を顕在
化させるのに効果的である。
【００４４】該発明の具体例についての好ましいデター
ジェントは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および
トリトンＸ１００（ミズリー州、セントルイス、シグマ
・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および他
社から入手可能）である。
ジェントは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および
トリトンＸ１００（ミズリー州、セントルイス、シグマ
・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および他
社から入手可能）である。
【００４５】抽出プロトコルを、ビー・バーグドロフェ
リ生物体で、好ましくは約１０８の生物体／ｍｌ、さら
に好ましくは約１０９の生物体／ｍｌと１０１２の生物
体／ｍｌの濃度で開始する。ついでデタージェントを、
ＳＤＳのようなイオン性デタージェントについて、好ま
しくは約０．２％重量／容量〜約０．６ｗ／ｖ％の濃度
まで加える。非イオン性デタージェントの場合、濃度は
、好ましくは約０．２５％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖで
あり、さらに好ましくは約０．８％ｗ／ｖ〜約１．２％
ｗ／ｖである。
リ生物体で、好ましくは約１０８の生物体／ｍｌ、さら
に好ましくは約１０９の生物体／ｍｌと１０１２の生物
体／ｍｌの濃度で開始する。ついでデタージェントを、
ＳＤＳのようなイオン性デタージェントについて、好ま
しくは約０．２％重量／容量〜約０．６ｗ／ｖ％の濃度
まで加える。非イオン性デタージェントの場合、濃度は
、好ましくは約０．２５％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖで
あり、さらに好ましくは約０．８％ｗ／ｖ〜約１．２％
ｗ／ｖである。
【００４６】ついで、該生物体を、一般に、約１００ｒ
ｐｍ〜約３００ｒｐｍで約０．５時間〜約１０時間撹拌
する。好ましくは、該撹拌を約１〜２時間維持する。つ
いで、外膜蛋白を遠心分離により細菌から取り出す。遠
心分離後、上清液は外膜蛋白に富んでおり、ペレット状
物は生物体を含んでいる。
ｐｍ〜約３００ｒｐｍで約０．５時間〜約１０時間撹拌
する。好ましくは、該撹拌を約１〜２時間維持する。つ
いで、外膜蛋白を遠心分離により細菌から取り出す。遠
心分離後、上清液は外膜蛋白に富んでおり、ペレット状
物は生物体を含んでいる。
【００４７】ビー・バーグドロフェリに適用した場合、
該操作により主ビー・バーグドロフェリ抗原が抽出され
、ビー・バーグドロフェリに起因する発熱から感受性哺
乳動物を保護するワクチン用の抗原が得られる。ワクチ
ンを前記方法により抽出抗原から調製する。本発明のも
う一つ別の具体例において、インキュベーション後、ス
ピロヘーターを処理し、ビー・バーグドロフェリの特異
主抗原を単離する。
該操作により主ビー・バーグドロフェリ抗原が抽出され
、ビー・バーグドロフェリに起因する発熱から感受性哺
乳動物を保護するワクチン用の抗原が得られる。ワクチ
ンを前記方法により抽出抗原から調製する。本発明のも
う一つ別の具体例において、インキュベーション後、ス
ピロヘーターを処理し、ビー・バーグドロフェリの特異
主抗原を単離する。
【００４８】本発明のワクチンが、以下の分子量を有す
る抗原によって複数のビー・バーグドロフェリに対する
抗血清を誘発することが見いだされた：１４、１７、１
９、２５、２８、３１、３４、３８、４１、４４、４８
、５２、５４、５８、６０、６８、８０および９０Ｋ±
３Ｋ）。これら抗原を、ビー・バーグドロフェリの「主
抗原」またはその生物学的均等物と称する。本発明によ
れば、有効なワクチンは少なくとも２種の主抗原に対す
る抗血清を誘発する。少なくとも２種のビー・バーグド
ロフェリの公知変異性は、単一特異性ワクチンが広範囲
のバーグドロフェリ単離体に対して効果的でないかもし
れないことを示唆している。好ましくは、ワクチンがビ
ー・バーグドロフェリの少なくとも２種の主抗原に対す
る抗血清を誘発するのに効果的である。さらに好ましく
は、ワクチンが少なくとも３種の主抗原に対する抗血清
を誘発するのに効果的である。好ましくは、該ワクチン
に含まれる抗原の１つがＯｓｐＡ（ＭＷ３１Ｋ）または
ＯｓｐＢ（ＭＷ３４Ｋ）である。３１、３４および４１
Ｋ蛋白は、各々、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢおよびビー・バー
グドロフェリの鞭毛蛋白である。
る抗原によって複数のビー・バーグドロフェリに対する
抗血清を誘発することが見いだされた：１４、１７、１
９、２５、２８、３１、３４、３８、４１、４４、４８
、５２、５４、５８、６０、６８、８０および９０Ｋ±
３Ｋ）。これら抗原を、ビー・バーグドロフェリの「主
抗原」またはその生物学的均等物と称する。本発明によ
れば、有効なワクチンは少なくとも２種の主抗原に対す
る抗血清を誘発する。少なくとも２種のビー・バーグド
ロフェリの公知変異性は、単一特異性ワクチンが広範囲
のバーグドロフェリ単離体に対して効果的でないかもし
れないことを示唆している。好ましくは、ワクチンがビ
ー・バーグドロフェリの少なくとも２種の主抗原に対す
る抗血清を誘発するのに効果的である。さらに好ましく
は、ワクチンが少なくとも３種の主抗原に対する抗血清
を誘発するのに効果的である。好ましくは、該ワクチン
に含まれる抗原の１つがＯｓｐＡ（ＭＷ３１Ｋ）または
ＯｓｐＢ（ＭＷ３４Ｋ）である。３１、３４および４１
Ｋ蛋白は、各々、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢおよびビー・バー
グドロフェリの鞭毛蛋白である。
【００４９】実施例３に記載されている血清中和検定を
用い、所定のビー・バーグドロフェリ抗原に対して定方
向の抗血清の相対的強度を検定することができる。ビー
・バーグドロフェリ感染に対する抗血清の強度は、血清
中和検定におけるビー・バーグドロフェリを中和する抗
血清の能力と相関していると考えられる。さらに、該検
定を用いて２種またはそれ以上の抗原に対して定方向の
抗血清が単一特異性抗血清よりもさらに効果的であるか
どうかを検定することができる。たとえ、所定の抗原に
対して単一特異的である抗血清が血清中和検定において
それ自身効果的でないとしても、該抗血清が別の単一特
異性抗血清の強度を強化することが予想される。従って
、該血清中和検定を用い、完全な補体でない主抗原に対
し定方向の抗血清を顕在化させるワクチンを確認するこ
とができる。
用い、所定のビー・バーグドロフェリ抗原に対して定方
向の抗血清の相対的強度を検定することができる。ビー
・バーグドロフェリ感染に対する抗血清の強度は、血清
中和検定におけるビー・バーグドロフェリを中和する抗
血清の能力と相関していると考えられる。さらに、該検
定を用いて２種またはそれ以上の抗原に対して定方向の
抗血清が単一特異性抗血清よりもさらに効果的であるか
どうかを検定することができる。たとえ、所定の抗原に
対して単一特異的である抗血清が血清中和検定において
それ自身効果的でないとしても、該抗血清が別の単一特
異性抗血清の強度を強化することが予想される。従って
、該血清中和検定を用い、完全な補体でない主抗原に対
し定方向の抗血清を顕在化させるワクチンを確認するこ
とができる。
【００５０】かくして、開示されている各主抗原に対し
定方向の抗血清を製造することができる。例えば、全ス
ピロヘーターの抽出体の抗原はＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離され、特異結合を取り出すこ
とができる。これら結合の位置はポリアクリルアミドゲ
ルの一部を電気ブロットし、該ブロットを標準ウェスタ
ンブロット法により検定することにより確認することが
できる（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２版、サンブロック（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒ
ｅｓｓ）、１９８９および以下の実施例５参照）。
定方向の抗血清を製造することができる。例えば、全ス
ピロヘーターの抽出体の抗原はＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離され、特異結合を取り出すこ
とができる。これら結合の位置はポリアクリルアミドゲ
ルの一部を電気ブロットし、該ブロットを標準ウェスタ
ンブロット法により検定することにより確認することが
できる（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２版、サンブロック（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒ
ｅｓｓ）、１９８９および以下の実施例５参照）。
【００５１】抗原含有のゲルスライスを用い、数種類の
方法で抗原特異性抗血清を高めることができる。例えば
、ゲルスライスを細いゲージ針を通す押出しのような方
法で粉砕することができる。ついで、粉砕したゲルを抗
血清を産生させる動物に注射することができる。ポリア
クリルアミドゲル材がポリマー型アジュバントとして作
用することが予想されるが、アジュバントを該注射材に
加えてもよい。別法として、抗原が実質的にゲルスライ
スから溶出されるまで、該ゲルスライスをデタージェン
ト水溶液中にてインキュベートすることを包含する多く
の公知方法により抗原をゲルスライスから溶出してもよ
い。あるいは、抗原をゲルスライスから電気溶出するこ
ともできる。電気溶出装置はいくつかの製造業者、シュ
レイシャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）（ニューハンプシャー州、キーン）
およびバイオ−ラッド・ラブス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａ
ｂｓ）（カリフォルニア州、リッチモンド）から入手可
能である。さらに、かかる装置は通常の実験室装置から
製造することができる（モレキュラー・クローニング、
前掲、ｐｐ．６．２８〜６．２９参照）。ついで、該溶
出抗原をアジュバントと共にまたはなしで抗血清を産生
させる動物に投与することができる。
方法で抗原特異性抗血清を高めることができる。例えば
、ゲルスライスを細いゲージ針を通す押出しのような方
法で粉砕することができる。ついで、粉砕したゲルを抗
血清を産生させる動物に注射することができる。ポリア
クリルアミドゲル材がポリマー型アジュバントとして作
用することが予想されるが、アジュバントを該注射材に
加えてもよい。別法として、抗原が実質的にゲルスライ
スから溶出されるまで、該ゲルスライスをデタージェン
ト水溶液中にてインキュベートすることを包含する多く
の公知方法により抗原をゲルスライスから溶出してもよ
い。あるいは、抗原をゲルスライスから電気溶出するこ
ともできる。電気溶出装置はいくつかの製造業者、シュ
レイシャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）（ニューハンプシャー州、キーン）
およびバイオ−ラッド・ラブス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａ
ｂｓ）（カリフォルニア州、リッチモンド）から入手可
能である。さらに、かかる装置は通常の実験室装置から
製造することができる（モレキュラー・クローニング、
前掲、ｐｐ．６．２８〜６．２９参照）。ついで、該溶
出抗原をアジュバントと共にまたはなしで抗血清を産生
させる動物に投与することができる。
【００５２】別の方法において、抗原をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分離し、ウェスタンブロ
ットによりなされるのと同様の方法にて種々の吸着膜の
１つに移行させる。ついで、移動膜の適当な部位を取り
出すことにより特異抗原を単離することができる。適当
な膜は、ウェスタンブロットにて通常使用されるニトロ
セルロース膜、ミリポール社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ
ｏｒｐ．）（マサチューセッツ州、ベッドフォード）か
らのイムノビロン〜−Ｐ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ〜−
Ｐ）、およびポリアミンでコートしたガラス繊維膜（バ
ンデケルクホブ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）ら、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１５２：９〜１９、
１９８５およびアベルソールド（Ａｂｅｒｓｏｌｄ）ら
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６１：４２２９〜４２
３８、１９８６）を包含する。該抗原含有の膜スライス
は、抗体を産生させる動物の皮下内に外科的に移植する
ことができる。該膜は遅延放出アジュバントとして作用
すると考えられる。
リルアミドゲル電気泳動により分離し、ウェスタンブロ
ットによりなされるのと同様の方法にて種々の吸着膜の
１つに移行させる。ついで、移動膜の適当な部位を取り
出すことにより特異抗原を単離することができる。適当
な膜は、ウェスタンブロットにて通常使用されるニトロ
セルロース膜、ミリポール社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ
ｏｒｐ．）（マサチューセッツ州、ベッドフォード）か
らのイムノビロン〜−Ｐ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ〜−
Ｐ）、およびポリアミンでコートしたガラス繊維膜（バ
ンデケルクホブ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）ら、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１５２：９〜１９、
１９８５およびアベルソールド（Ａｂｅｒｓｏｌｄ）ら
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６１：４２２９〜４２
３８、１９８６）を包含する。該抗原含有の膜スライス
は、抗体を産生させる動物の皮下内に外科的に移植する
ことができる。該膜は遅延放出アジュバントとして作用
すると考えられる。
【００５３】主抗原は抗体応答を顕在化させるのに効果
的であることが知られている（実施例５参照）。これら
抗原のいくつかはＴ−キラー細胞応答を顕在化させると
考えられる。免疫処理した動物からリンパ球を単離し、
ビー・バーグドロフェリの特異性主抗原に対するＴ−細
胞応答を検定することによりこれらのことが分かる。Ｔ
−細胞活性化応答は、細胞内カルシウムの増加、リンフ
ォカインの生成、細胞増殖および細胞融解活性を包含す
る。Ｔ−細胞のかかる ｉｎ ｖｉｔｒｏ 測定はワイ
ス（Ｗｅｉｓ）らにより記載されている（アドブ・イム
ノール（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、４１：１〜３８、
１９８７）。
的であることが知られている（実施例５参照）。これら
抗原のいくつかはＴ−キラー細胞応答を顕在化させると
考えられる。免疫処理した動物からリンパ球を単離し、
ビー・バーグドロフェリの特異性主抗原に対するＴ−細
胞応答を検定することによりこれらのことが分かる。Ｔ
−細胞活性化応答は、細胞内カルシウムの増加、リンフ
ォカインの生成、細胞増殖および細胞融解活性を包含す
る。Ｔ−細胞のかかる ｉｎ ｖｉｔｒｏ 測定はワイ
ス（Ｗｅｉｓ）らにより記載されている（アドブ・イム
ノール（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、４１：１〜３８、
１９８７）。
【００５４】公知技法を用い、抗血清産生動物からのＢ
細胞をモノクローナル抗体（「ｍｃＡｂ」の単離に使用
することができる（カンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、
モノクローナル・アンチボディー・テクノロジー（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、１３巻、エルセベール（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）
、アムステルダム １９８４；ハーロー（Ｈａｒｌｏ
ｗ）ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュ
アル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス、ニューヨーク、１９８８；ゴディング（Ｇｏ
ｄｉｎｇ）、モノクローナル・アンチボディーズ：プリ
ンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、アカデミック・プレス（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、１９８６
）。かかる抗体は本発明の範囲内である。
細胞をモノクローナル抗体（「ｍｃＡｂ」の単離に使用
することができる（カンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、
モノクローナル・アンチボディー・テクノロジー（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、１３巻、エルセベール（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）
、アムステルダム １９８４；ハーロー（Ｈａｒｌｏ
ｗ）ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュ
アル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス、ニューヨーク、１９８８；ゴディング（Ｇｏ
ｄｉｎｇ）、モノクローナル・アンチボディーズ：プリ
ンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、アカデミック・プレス（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、１９８６
）。かかる抗体は本発明の範囲内である。
【００５５】個々の主抗原の電気泳動性イオン移動はビ
ー・バーグドロフェリの単離体の間でいくらか変わると
考えられる。実施例５のウェスタンブロット法を用い、
他のビー・バーグドロフェリ単離体のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動性イオン移動のパターンを同定す
ることができる。ここに開示の１つの主抗原に対する変
異体の免疫化学均等物は、単一特異性抗血清を用いるウ
ェスタンブロット分析法により確立され、該結合を明視
化することができる。個々のビー・バーグドロフェリ抗
原の電気泳動性変異体を単離し、それに対して得られる
抗血清を血清中和検定にて相対的有効性を評価すること
ができる。
ー・バーグドロフェリの単離体の間でいくらか変わると
考えられる。実施例５のウェスタンブロット法を用い、
他のビー・バーグドロフェリ単離体のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動性イオン移動のパターンを同定す
ることができる。ここに開示の１つの主抗原に対する変
異体の免疫化学均等物は、単一特異性抗血清を用いるウ
ェスタンブロット分析法により確立され、該結合を明視
化することができる。個々のビー・バーグドロフェリ抗
原の電気泳動性変異体を単離し、それに対して得られる
抗血清を血清中和検定にて相対的有効性を評価すること
ができる。
【００５６】以下の「診断法」下にて詳細に記載されて
いるように、本発明の開示はビー・バーグドロフェリの
主抗原の単離および配列特性を教示するに十分である。 したがって、合成抗原または生物学的均等物からなるワ
クチンは本発明の範囲内である。
いるように、本発明の開示はビー・バーグドロフェリの
主抗原の単離および配列特性を教示するに十分である。 したがって、合成抗原または生物学的均等物からなるワ
クチンは本発明の範囲内である。
【００５７】したがって、ワクチンのさらなる具体例に
おいて、該ワクチンは、少なくとも２種のビー・バーグ
ドロフェリの主抗原またはその生物学的均等物（例えば
、合成蛋白）からなる。該ワクチンを生理学上許容され
る担体と組み合わせ、所望により、前記のようにアジュ
バント処理してもよい。該ワクチンのさらなる具体例に
おいて、該ワクチンは発熱または関節炎から感受性哺乳
動物を保護するのに効果的であることにより特徴付けら
れる。
おいて、該ワクチンは、少なくとも２種のビー・バーグ
ドロフェリの主抗原またはその生物学的均等物（例えば
、合成蛋白）からなる。該ワクチンを生理学上許容され
る担体と組み合わせ、所望により、前記のようにアジュ
バント処理してもよい。該ワクチンのさらなる具体例に
おいて、該ワクチンは発熱または関節炎から感受性哺乳
動物を保護するのに効果的であることにより特徴付けら
れる。
【００５８】当業者であれば、本発明のワクチンを他の
ワクチンと組み合わせ、１以上の病原体に対して効果的
な混合ワクチンを得ることを認識するであろう。例えば
、それはレプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・イク
テロハエモラージアエ、レプトスピラ・ハージョ、レプ
トスピラ・グリッポチファサ、ネコ白血病、鼻気管炎、
カリチ、汎白血球減少、オウム病クラミジア、イヌジス
テンパー、アデノウイルス２型、コロナウイルスパライ
ンフルエンザおよびパルボウイルスに対する１以上のワ
クチンと組み合わせたライム病ワクチンを包含する。
ワクチンと組み合わせ、１以上の病原体に対して効果的
な混合ワクチンを得ることを認識するであろう。例えば
、それはレプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・イク
テロハエモラージアエ、レプトスピラ・ハージョ、レプ
トスピラ・グリッポチファサ、ネコ白血病、鼻気管炎、
カリチ、汎白血球減少、オウム病クラミジア、イヌジス
テンパー、アデノウイルス２型、コロナウイルスパライ
ンフルエンザおよびパルボウイルスに対する１以上のワ
クチンと組み合わせたライム病ワクチンを包含する。
【００５９】ワクチン接種
ワクチンは、皮下内、皮内、腹腔内または筋肉内のいず
れかの注射により投与することが好ましい。筋肉内注射
が好ましい。ワクチンは単一のまたは複数の注射により
投与してもよい。ビー・バーグドロフェリに対する経口
暴露がネコにおける抗体応答を顕在化させることが判明
したため（キムニナン（Ｋｉｍｍｉｎａｎ）、ベタリナ
リー・テクニシャン（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈ
ｎｉｃｉａｎ），１０：３８５〜３９７、１９８９）、
経口ワクチンもまた意図するものであり、本発明の範囲
内である。
れかの注射により投与することが好ましい。筋肉内注射
が好ましい。ワクチンは単一のまたは複数の注射により
投与してもよい。ビー・バーグドロフェリに対する経口
暴露がネコにおける抗体応答を顕在化させることが判明
したため（キムニナン（Ｋｉｍｍｉｎａｎ）、ベタリナ
リー・テクニシャン（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈ
ｎｉｃｉａｎ），１０：３８５〜３９７、１９８９）、
経口ワクチンもまた意図するものであり、本発明の範囲
内である。
【００６０】各ワクチン用量中に存在するスピロヘータ
ー抗原の量は、少なくとも、抗体の血清中和価を誘発す
るのに十分な量であるように選択する。（血清中和検定
は補体と共に抗血清のビー・バーグドロフェリを中和す
る能力を測定し、実施例３にてさらに詳細に記載されて
いる。）この量は様々であり、一般に、各用量は約１０
６〜１０１２のスピロヘーター、好ましくは約１０７〜
１０９のスピロヘーターから誘導される抗原からなる。 個々のワクチン調製用の抗原産物の最適量は、ワクチン
接種した哺乳動物の血清中和価をモニター観察する標準
的な研究により確認することができる。
ー抗原の量は、少なくとも、抗体の血清中和価を誘発す
るのに十分な量であるように選択する。（血清中和検定
は補体と共に抗血清のビー・バーグドロフェリを中和す
る能力を測定し、実施例３にてさらに詳細に記載されて
いる。）この量は様々であり、一般に、各用量は約１０
６〜１０１２のスピロヘーター、好ましくは約１０７〜
１０９のスピロヘーターから誘導される抗原からなる。 個々のワクチン調製用の抗原産物の最適量は、ワクチン
接種した哺乳動物の血清中和価をモニター観察する標準
的な研究により確認することができる。
【００６１】診断法
いくつかの主抗原（ＭＷ１４、１７、１９、２５、２８
、３８、４４、４８、５２、５４、５８、６０、６８、
８０および９０Ｋ±３Ｋ）に対する単一特異性抗血清を
診断装置において用い、ビー・バーグドロフェリ抗原の
存在について体液または組織抽出液を検定する。抗原を
調査するこれら抗体を用いる方法が前記およびハーロウ
（Ｈａｒｌｏｗ）ら（アンチボディーズ：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス、ニューヨーク、１９８８）により検討されてい
る。
、３８、４４、４８、５２、５４、５８、６０、６８、
８０および９０Ｋ±３Ｋ）に対する単一特異性抗血清を
診断装置において用い、ビー・バーグドロフェリ抗原の
存在について体液または組織抽出液を検定する。抗原を
調査するこれら抗体を用いる方法が前記およびハーロウ
（Ｈａｒｌｏｗ）ら（アンチボディーズ：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス、ニューヨーク、１９８８）により検討されてい
る。
【００６２】加えて、個々の抗原蛋白は診断助剤として
用いることができる。前記のように単離した蛋白または
主抗原混合物は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離
することができる。該ゲルは膜上に電気ブロットするこ
とができる。ついで、膜のストリップを診断される動物
からの血清を用いる「ウェスタンブロット」として展開
することができる。対照として、公知の陽性または陰性
血清を用い、相当する膜ストリップを明視化することが
できる。
用いることができる。前記のように単離した蛋白または
主抗原混合物は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離
することができる。該ゲルは膜上に電気ブロットするこ
とができる。ついで、膜のストリップを診断される動物
からの血清を用いる「ウェスタンブロット」として展開
することができる。対照として、公知の陽性または陰性
血清を用い、相当する膜ストリップを明視化することが
できる。
【００６３】ゲノミックおよびサブゲノミックＤＮＡを
ビー・バーグドロフェリから単離し、該ＤＮＡを制限酵
素で断片化することができる。ついで、該消化ＤＮＡを
プラスミドまたはファージ発現ベクターに結ぶ。コロニ
ーまたはプラーク（適宜）を増殖させ、１種以上の主抗
原に対する抗血清を用いて検定しうる膜に一部移動させ
る。陽性プラークまたはコロニーは増殖し、それらが発
現する蛋白は、（一般に、ベクター−発現蛋白を適当な
薬剤、通常、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
で誘発した後に）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することがで
きる。そのため、該蛋白は前記のウェスタンブロット法
により調査することができる。
ビー・バーグドロフェリから単離し、該ＤＮＡを制限酵
素で断片化することができる。ついで、該消化ＤＮＡを
プラスミドまたはファージ発現ベクターに結ぶ。コロニ
ーまたはプラーク（適宜）を増殖させ、１種以上の主抗
原に対する抗血清を用いて検定しうる膜に一部移動させ
る。陽性プラークまたはコロニーは増殖し、それらが発
現する蛋白は、（一般に、ベクター−発現蛋白を適当な
薬剤、通常、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
で誘発した後に）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することがで
きる。そのため、該蛋白は前記のウェスタンブロット法
により調査することができる。
【００６４】したがって、該主抗原をコードするＤＮＡ
、厳重な条件下でこのＤＮＡに雑種形成するＤＮＡおよ
び実質的に同一の蛋白をコードするＤＮＡは、本発明の
範囲内である。
、厳重な条件下でこのＤＮＡに雑種形成するＤＮＡおよ
び実質的に同一の蛋白をコードするＤＮＡは、本発明の
範囲内である。
【００６５】つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。
く説明する。
【実施例】実施例１−攻撃モデル
イヌ
１６〜１８週齢の、未だビー・バーグドロフェリに暴露
したことがない２６匹のビーグル犬（カンサス州、トペ
カ、テラコン社（Ｔｈｅｒａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）から入
手）を用いた。１群５匹のイヌで４つの攻撃群を評価し
た。群１および群２ならびに３匹の接触対照を室Ａにて
一緒に収容した。群３および群４ならびに３匹の接触対
照を室Ｂにて一緒に収容した。
したことがない２６匹のビーグル犬（カンサス州、トペ
カ、テラコン社（Ｔｈｅｒａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）から入
手）を用いた。１群５匹のイヌで４つの攻撃群を評価し
た。群１および群２ならびに３匹の接触対照を室Ａにて
一緒に収容した。群３および群４ならびに３匹の接触対
照を室Ｂにて一緒に収容した。
【００６６】ダニからのビー・バーグドロフェリ単離体
ビー・バーグドロフェリで感染したダニをウィスコンシ
ン州にて収集し、消化管（中腸）を約１０００匹のダニ
から摘出し、バーバー−ストエンナー−ケリー（Ｂａｒ
ｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ）（ＢＳＫ）
培地（バーバー（Ｂａｒｂｏｕｒ）ら、カーレント・マ
イクロバイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
）、８：１２３〜１２６、１９８３）にて乳化させ、ア
リコート２ｍｌを有するバイアル中、−１００℃にて貯
蔵した。使用前に、この物質を解氷し、プールし、遠心
分離によりアリコート１ｍｌに付き微生物１００００匹
まで濃縮した。
ビー・バーグドロフェリで感染したダニをウィスコンシ
ン州にて収集し、消化管（中腸）を約１０００匹のダニ
から摘出し、バーバー−ストエンナー−ケリー（Ｂａｒ
ｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ）（ＢＳＫ）
培地（バーバー（Ｂａｒｂｏｕｒ）ら、カーレント・マ
イクロバイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
）、８：１２３〜１２６、１９８３）にて乳化させ、ア
リコート２ｍｌを有するバイアル中、−１００℃にて貯
蔵した。使用前に、この物質を解氷し、プールし、遠心
分離によりアリコート１ｍｌに付き微生物１００００匹
まで濃縮した。
【００６７】攻撃スケジュール
各４群のイヌに、腹部の異なる部位にてスピロヘーター
攻撃の１日の用量を７日連続で投与した。各用量は０．
５ｍｌ当たり５００匹の微生物を含んでいた。針を感染
部位から抜き取る際に該物質を腹腔内（ＩＰ）、皮内（
ＩＤ）および皮下内（ＳＣ）に放出することにより、ツ
ベルクリンシリンジを用いて攻撃を開始した。
攻撃の１日の用量を７日連続で投与した。各用量は０．
５ｍｌ当たり５００匹の微生物を含んでいた。針を感染
部位から抜き取る際に該物質を腹腔内（ＩＰ）、皮内（
ＩＤ）および皮下内（ＳＣ）に放出することにより、ツ
ベルクリンシリンジを用いて攻撃を開始した。
【００６８】免疫抑制
群１のイヌに、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｍｌ、ニュー
ジャージ州０７０３３、ケニルワース、シェリング社（
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、アジウム〜（Ａｚｉ
ｕｍ〜））１ｍｌ用量を、攻撃の日、攻撃開始後２、４
および６日目に投与した。群２のイヌは、攻撃期間の間
、免疫抑制剤で処理しなかった。群３のイヌに、メチル
プレドニゾロンアセテート（２０ｍｇ／ｍｌ、ミシガン
州４９００１、カラマズー、アップジョン社（Ｕｐｊｏ
ｈｎ Ｃｏ．）、デポ−メドロール〜（Ｄｅｐｏ−Ｍｅ
ｄｒｏｌ〜））１ｍｌ用量を、攻撃の初日（「ｄｏｃ」
）および攻撃後（「ｄｐｃ」）６日目（攻撃の日から数
えて）に投与した。群４のイヌには、攻撃期間の間、免
疫抑制剤を投与しなかった。
ジャージ州０７０３３、ケニルワース、シェリング社（
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、アジウム〜（Ａｚｉ
ｕｍ〜））１ｍｌ用量を、攻撃の日、攻撃開始後２、４
および６日目に投与した。群２のイヌは、攻撃期間の間
、免疫抑制剤で処理しなかった。群３のイヌに、メチル
プレドニゾロンアセテート（２０ｍｇ／ｍｌ、ミシガン
州４９００１、カラマズー、アップジョン社（Ｕｐｊｏ
ｈｎ Ｃｏ．）、デポ−メドロール〜（Ｄｅｐｏ−Ｍｅ
ｄｒｏｌ〜））１ｍｌ用量を、攻撃の初日（「ｄｏｃ」
）および攻撃後（「ｄｐｃ」）６日目（攻撃の日から数
えて）に投与した。群４のイヌには、攻撃期間の間、免
疫抑制剤を投与しなかった。
【００６９】攻撃の６０日後、群１および群２ならびに
接触対照のすべてのイヌにデキサメタゾン１ｍｌ用量を
投与し、群３および群４ならびに接触対照のすべてのイ
ヌにメチルプレドニゾロンアセテート１ｍｌを投与した
。
接触対照のすべてのイヌにデキサメタゾン１ｍｌ用量を
投与し、群３および群４ならびに接触対照のすべてのイ
ヌにメチルプレドニゾロンアセテート１ｍｌを投与した
。
【００７０】ビー・バーグドロフェリについての血液試
料試験スピロヘーター攻撃の第１の投与後、２６匹すべ
てのイヌから１日に２回、１４日間連続して血液試料を
摂取した。攻撃後６０日で、１日に２回、１０日間連続
して血液試料を摂取し、剖検の際（攻撃後９０日）に血
液試料を摂取した。血液を１５％Ｎａ２ ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸）溶液含有の試験管に収集した。
料試験スピロヘーター攻撃の第１の投与後、２６匹すべ
てのイヌから１日に２回、１４日間連続して血液試料を
摂取した。攻撃後６０日で、１日に２回、１０日間連続
して血液試料を摂取し、剖検の際（攻撃後９０日）に血
液試料を摂取した。血液を１５％Ｎａ２ ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸）溶液含有の試験管に収集した。
【００７１】全血液１ｍｌをＢＳＫ培地６ｍｌに加え、
混合物を３２℃にて６週間インキュベートした。培養体
を間接蛍光抗体（ＩＦＡ）法を用いて試験した。培養体
をスライド上に分取し、風乾し、冷アセトンにて固定し
た。スライドをビー・バーグドロフェリまたは所定のビ
ー・バーグドロフェリ抗原に対して定方向のムリン抗体
（ＩｇＧ同基準標体）の希釈体で３７℃にて３０分間潅
漑した。ついで、該スライドをリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）でリンスした。ついで、抗−ＩｇＧマウス血清
（ペンシルバニア州、ウェストグラブ、ジャクソン・イ
ムノ・レサーチ・ラブス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｓ）を結合した蛍光イソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）の希釈体を各スライドに加
え、３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。ス
ライドをＰＢＳにて洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて数を読
んだ。蛍光性スピロヘーターの存在は陽性単離を示す。
混合物を３２℃にて６週間インキュベートした。培養体
を間接蛍光抗体（ＩＦＡ）法を用いて試験した。培養体
をスライド上に分取し、風乾し、冷アセトンにて固定し
た。スライドをビー・バーグドロフェリまたは所定のビ
ー・バーグドロフェリ抗原に対して定方向のムリン抗体
（ＩｇＧ同基準標体）の希釈体で３７℃にて３０分間潅
漑した。ついで、該スライドをリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）でリンスした。ついで、抗−ＩｇＧマウス血清
（ペンシルバニア州、ウェストグラブ、ジャクソン・イ
ムノ・レサーチ・ラブス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｓ）を結合した蛍光イソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）の希釈体を各スライドに加
え、３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。ス
ライドをＰＢＳにて洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて数を読
んだ。蛍光性スピロヘーターの存在は陽性単離を示す。
【００７２】ＩＦＡ検定において用いる抗体はビー・バ
ーグドロフェリに対するポリクローナル抗血清（ヒツジ
抗体が、マサチューセッツ州、アクション、フィッツゲ
ラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Ｆｉ
ｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ）より入手可能である）を包含し、さ
らに、モノクローナル抗体（例えば、Ｃｂ−２で、Ｏｓ
ｐＢに対するマウスモノクローナル抗体がテキサス州、
ピー・オー・ボックス９６９、エリジン、ベタリナリー
・クリニカル・リソーセス（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から入手可能で
ある）を用いてもよい。加えて、本願発明における教示
方法にて得られる抗血清を用いてもよい。
ーグドロフェリに対するポリクローナル抗血清（ヒツジ
抗体が、マサチューセッツ州、アクション、フィッツゲ
ラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Ｆｉ
ｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ）より入手可能である）を包含し、さ
らに、モノクローナル抗体（例えば、Ｃｂ−２で、Ｏｓ
ｐＢに対するマウスモノクローナル抗体がテキサス州、
ピー・オー・ボックス９６９、エリジン、ベタリナリー
・クリニカル・リソーセス（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から入手可能で
ある）を用いてもよい。加えて、本願発明における教示
方法にて得られる抗血清を用いてもよい。
【００７３】抗体価
イヌを攻撃の時点で、ついで２、４、６、８、１０、１
４、３０、６０および９０ｄｐｃで放血させた。ビー・
バーグドロフェリの標準懸濁液（２×１０６生物体／ｍ
ｌ）をスライド上にのせ、冷アセトンで６０分間固定し
た。リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で十分にリン
スする前に、試験血清の２倍血清希釈液を、スライド上
、３６℃にて３０分間インキュベートした。ついで、Ｆ
ＩＴＣ−標識抗−イヌＩｇＧ（ヤギから）を各スライド
に加え、３６℃にてさらに３０分間インキュベートした
。スライドをＰＢＳで洗浄し、結果を蛍光顕微鏡で測定
した。ＩＦＡ抗体価の終末点を陽性蛍光を示す最高血清
希釈度として測定した。
４、３０、６０および９０ｄｐｃで放血させた。ビー・
バーグドロフェリの標準懸濁液（２×１０６生物体／ｍ
ｌ）をスライド上にのせ、冷アセトンで６０分間固定し
た。リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で十分にリン
スする前に、試験血清の２倍血清希釈液を、スライド上
、３６℃にて３０分間インキュベートした。ついで、Ｆ
ＩＴＣ−標識抗−イヌＩｇＧ（ヤギから）を各スライド
に加え、３６℃にてさらに３０分間インキュベートした
。スライドをＰＢＳで洗浄し、結果を蛍光顕微鏡で測定
した。ＩＦＡ抗体価の終末点を陽性蛍光を示す最高血清
希釈度として測定した。
【００７４】結果
血液（０〜１４ｄｐｃ）からのスピロヘーターの初期回
収を表１および２に示す。処理方法の過程全体にわたる
スピロヘーターの回収を表３に要約する。一つの結論は
スピロヘーターが４日以内にすべての攻撃イヌから回収
されることである。免疫抑制イヌの場合、スピロヘータ
ーは約２日以内に回収される。
収を表１および２に示す。処理方法の過程全体にわたる
スピロヘーターの回収を表３に要約する。一つの結論は
スピロヘーターが４日以内にすべての攻撃イヌから回収
されることである。免疫抑制イヌの場合、スピロヘータ
ーは約２日以内に回収される。
【００７５】意外にも、長期遅延後には、スピロヘータ
ーで攻撃されなかった接触対照イヌからスピロヘーター
が回収された。しかしながら、スピロヘーターが回収さ
れる回数が低いことから、スピロヘーター血症度は処理
したイヌの場合よりも低度であることは明らかである。
ーで攻撃されなかった接触対照イヌからスピロヘーター
が回収された。しかしながら、スピロヘーターが回収さ
れる回数が低いことから、スピロヘーター血症度は処理
したイヌの場合よりも低度であることは明らかである。
【００７６】指定時期に摂取した血清の抗体価（ＩＦＡ
測定）を表４および５に示す。スピロヘーターに暴露さ
れなかったイヌの高バックグラウンド価（１：１６〜１
：１２８）を他から観察した。これら表中におけるデー
タからの結論は、免疫抑制剤がビー・バーグドロフェリ
・スピロヘーター血症に応答する抗体を増強するという
ことである。この増強は、おそらく、動物を免疫抑制し
た場合に得られる高レベルのスピロヘーター血症による
ものである。
測定）を表４および５に示す。スピロヘーターに暴露さ
れなかったイヌの高バックグラウンド価（１：１６〜１
：１２８）を他から観察した。これら表中におけるデー
タからの結論は、免疫抑制剤がビー・バーグドロフェリ
・スピロヘーター血症に応答する抗体を増強するという
ことである。この増強は、おそらく、動物を免疫抑制し
た場合に得られる高レベルのスピロヘーター血症による
ものである。
【００７７】加えて、跛行が攻撃イヌの７５％にて観察
された。接触対照イヌでは跛行が全く観察されなかった
にもかかわらず、各攻撃群のイヌの６０〜８０％は跛行
を観察した。
された。接触対照イヌでは跛行が全く観察されなかった
にもかかわらず、各攻撃群のイヌの６０〜８０％は跛行
を観察した。
【００７８】ライム病についての本願攻撃モデルは、免
疫抑制されない場合であっても、ライム病の徴候が攻撃
動物に現れるという利点を有する。これは実験室状況に
て示される疾病が自然に感染した動物に見られる疾病と
より近似していることを示唆する。
疫抑制されない場合であっても、ライム病の徴候が攻撃
動物に現れるという利点を有する。これは実験室状況に
て示される疾病が自然に感染した動物に見られる疾病と
より近似していることを示唆する。
【００７９】表 １
イヌ血液からのボレリア・バーグドロフェリの回収室Ａ
デキサメタゾン 攻撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数 １ −／− −／＋ ＋／−
−／− −／− −／＋ ＋／− −／− ＋／＋
−／＋ ＋／＋ −／− ＋／− ＋／＋ −／＋
１３ ２ −／− −／＋ ＋／＋ −／＋ −／−
−／− −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋ ＋／−
−／＋ ＋／− −／＋ −／＋ １５ ３ −
／− −／− ＋／＋ −／＋ −／− −／− −／
− −／＋ ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋
−／＋ −／＋ １５ ４ −／− −／＋
＋／＋ ＋／− −／− ＋／＋ −／＋ −／＋ ＋
／− ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋ −／− −／
− １５ ５ −／− −／＋ −／＋ −／−
＋／＋ −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／− −／＋
−／＋ −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋ １７
７５
デキサメタゾン 攻撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数 １ −／− −／＋ ＋／−
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−／＋ ＋／＋ −／− ＋／− ＋／＋ −／＋
１３ ２ −／− −／＋ ＋／＋ −／＋ −／−
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／− −／− ＋／＋ −／＋ −／− −／− −／
− −／＋ ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋
−／＋ −／＋ １５ ４ −／− −／＋
＋／＋ ＋／− −／− ＋／＋ −／＋ −／＋ ＋
／− ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋ −／− −／
− １５ ５ −／− −／＋ −／＋ −／−
＋／＋ −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／− −／＋
−／＋ −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋ １７
７５
【００８０】
室Ａ Ｗ／Ｏ デキサメタゾン
攻撃後の日数
イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数 ６ −／− −／− −／−
−／− −／＋ ＋／− −／＋ ＋／− ＋／−
＋／＋ −／− −／＋ ＋／− −／＋ −／＋
１１ ７ −／− −／− −／− −／− −／
＋ −／＋ ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋ −／＋
＋／＋ ＋／＋ −／＋ ＋／＋ １６ ８
−／− −／− −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋
／＋ ＋／＋ ＋／− −／− ＋／− −／＋ −／
− ＋／＋ −／− １３ ９ −／− −／−
−／− −／− ＋／＋ −／− ＋／− ＋／−
−／＋ ＋／＋ −／＋ −／＋ ＋／ｎｄ＋／＋ −
／− １２１０ −／− −／− −／− −／−
−／＋ −／− −／＋ ＋／＋ −／＋ −／＋
＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／− −／− １１
６３
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数 ６ −／− −／− −／−
−／− −／＋ ＋／− −／＋ ＋／− ＋／−
＋／＋ −／− −／＋ ＋／− −／＋ −／＋
１１ ７ −／− −／− −／− −／− −／
＋ −／＋ ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／＋ −／＋
＋／＋ ＋／＋ −／＋ ＋／＋ １６ ８
−／− −／− −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋
／＋ ＋／＋ ＋／− −／− ＋／− −／＋ −／
− ＋／＋ −／− １３ ９ −／− −／−
−／− −／− ＋／＋ −／− ＋／− ＋／−
−／＋ ＋／＋ −／＋ −／＋ ＋／ｎｄ＋／＋ −
／− １２１０ −／− −／− −／− −／−
−／＋ −／− −／＋ ＋／＋ −／＋ −／＋
＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／− −／− １１
６３
【００８１】
室Ａ 接触対照
攻撃後の日数
イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１１ −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／− −
／＋ −／− −／− −／− −／− −／＋
２１２ −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／− −
／− −／− −／− −／＋ １１３ −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／＋ −／− −／− −／＋ −／− −
／− −／− ２
５
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１１ −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／− −
／＋ −／− −／− −／− −／− −／＋
２１２ −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／− −
／− −／− −／− −／＋ １１３ −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／＋ −／− −／− −／＋ −／− −
／− −／− ２
５
【００８２】表 ２
イヌ血液からのボレリア・バーグドロフェリの回収室Ｂ
メチルプレドニゾロンアセテート攻撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１４ −／− −／− −／−
＋／− −／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− −
／− −／− −／− −／− ＋／− −／−
５１５ −／− −／＋ ＋／− −／＋ −／＋
＋／− −／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− ＋
／− −／− −／− −／− ９１６ −／−
＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋
＋／＋ −／− −／− −／− ＋／− −／− −
／− −／− １２１７ −／− −／＋ −／＋
＋／＋ ＋／− −／＋ ＋／＋ −／− ＋／−
−／− −／− −／＋ −／− −／− −／−
１０１８ −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋
−／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− ９
４５
メチルプレドニゾロンアセテート攻撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１４ −／− −／− −／−
＋／− −／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− −
／− −／− −／− −／− ＋／− −／−
５１５ −／− −／＋ ＋／− −／＋ −／＋
＋／− −／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− ＋
／− −／− −／− −／− ９１６ −／−
＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋
＋／＋ −／− −／− −／− ＋／− −／− −
／− −／− １２１７ −／− −／＋ −／＋
＋／＋ ＋／− −／＋ ＋／＋ −／− ＋／−
−／− −／− −／＋ −／− −／− −／−
１０１８ −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ ＋／＋
−／＋ ＋／＋ −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− ９
４５
【００８３】
室Ｂ Ｗ／Ｏ メチルプレドニゾロンアセテート攻
撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１９ −／− −／− −／−
−／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋ −／＋ ＋／− −
／＋ −／− −／＋ ＋／＋ −／− −／＋ １
２２０ −／− −／− −／− −／− ＋／＋
＋／− ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／− −／− −
／＋ ＋／− −／− −／− １０２１ −／−
−／− −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ −／−
＋／− −／＋ −／＋ −／− ＋／＋ ＋／− −
／− −／− １０２２ −／− −／− −／−
−／− ＋／＋ ＋／＋ −／＋ ＋／＋ ＋／−
＋／− −／− −／− ＋／＋ ＋／− −／−
１２２３ −／− −／− −／− −／− ＋／＋
＋／＋ ＋／＋ ＋／− −／＋ ＋／− −／−
−／＋ ＋／− −／− −／− １１
５５
撃後の日数 イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数１９ −／− −／− −／−
−／− ＋／＋ ＋／− ＋／＋ −／＋ ＋／− −
／＋ −／− −／＋ ＋／＋ −／− −／＋ １
２２０ −／− −／− −／− −／− ＋／＋
＋／− ＋／＋ ＋／＋ −／− ＋／− −／− −
／＋ ＋／− −／− −／− １０２１ −／−
−／− −／− −／− ＋／＋ ＋／＋ −／−
＋／− −／＋ −／＋ −／− ＋／＋ ＋／− −
／− −／− １０２２ −／− −／− −／−
−／− ＋／＋ ＋／＋ −／＋ ＋／＋ ＋／−
＋／− −／− −／− ＋／＋ ＋／− −／−
１２２３ −／− −／− −／− −／− ＋／＋
＋／＋ ＋／＋ ＋／− −／＋ ＋／− −／−
−／＋ ＋／− −／− −／− １１
５５
【００８４】
室Ｂ 接触対照
攻撃後の日数
イヌ ＤＯＣ １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数２４ −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／＋ −／− −
／− −／− −／＋ −／− −／− −／−
１２５ −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／＋ −／− ＋／− −／− −
／＋ −／− −／− −／− ３２６ −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／−
＋／＋ −／＋ ＋／− −／− −／＋ −／− −
／− ＋／− ６
１０
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１
１２ １３ １４ 陽性 ａｍ／
ｐｍ
単離体数２４ −／− −／− −／−
−／− −／− −／− −／− −／＋ −／− −
／− −／− −／＋ −／− −／− −／−
１２５ −／− −／− −／− −／− −／−
−／− −／− −／＋ −／− ＋／− −／− −
／＋ −／− −／− −／− ３２６ −／−
−／− −／− −／− −／− −／− −／−
＋／＋ −／＋ ＋／− −／− −／＋ −／− −
／− ＋／− ６
１０
【００８５】表 ３
陽性回収を付与する血液試料のパーセント時 期
デキサメタゾン メチルプレドニゾロン
攻撃時の 接触ＤＰＣ 処理
処理
無薬剤 １ 対照 ２０〜１４
５０％ ３２％
４２％ ９％
６０ ８０％
０％ ５０％
３３％６１〜６３ ５３％
５３％ ４０％
６１％９０ ８０％
６０％
５０％ ５０％すべてのイヌを６０
日目に免疫抑制した１ 室ＡおよびＢ（群２および４）
のイヌについて観察２ 室ＡおよびＢの接触対照につい
て観察
デキサメタゾン メチルプレドニゾロン
攻撃時の 接触ＤＰＣ 処理
処理
無薬剤 １ 対照 ２０〜１４
５０％ ３２％
４２％ ９％
６０ ８０％
０％ ５０％
３３％６１〜６３ ５３％
５３％ ４０％
６１％９０ ８０％
６０％
５０％ ５０％すべてのイヌを６０
日目に免疫抑制した１ 室ＡおよびＢ（群２および４）
のイヌについて観察２ 室ＡおよびＢの接触対照につい
て観察
【００８６】表 ４
ボレリア・バーグドロフェリに対する逆数ＩＦＡ抗体価
室Ａ デキサメタゾン 攻撃後の日数： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０ １ ６４ ６４ ６４
１２８ １２８ ２５６ １２８
１０２４００ １０２４００ １０２４００ ２
６４ ６４ ６４ ６４
６４ １２８ １２８ １６０
０ １０２４００ ４０９６００ ３ ６
４ １２８ １２８ ２５６ ５１
２ ５１２ ５１２ ２５６００ １０
２４００ １０２４００ ４ ６４
６４ ６４ １２８ １２８ １
２８ ６４ １６００ １０２４００
１６３８４００ ５ １２８ １２８
１２８ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６００ １０２４００ ４０９６
００ＧＭＴ２ ７３ ８４ ８４
１４７ １６９ ２２３ １４７
１１１４３ １０２４００ ３１０２６７
室Ａ デキサメタゾン 攻撃後の日数： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０ １ ６４ ６４ ６４
１２８ １２８ ２５６ １２８
１０２４００ １０２４００ １０２４００ ２
６４ ６４ ６４ ６４
６４ １２８ １２８ １６０
０ １０２４００ ４０９６００ ３ ６
４ １２８ １２８ ２５６ ５１
２ ５１２ ５１２ ２５６００ １０
２４００ １０２４００ ４ ６４
６４ ６４ １２８ １２８ １
２８ ６４ １６００ １０２４００
１６３８４００ ５ １２８ １２８
１２８ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６００ １０２４００ ４０９６
００ＧＭＴ２ ７３ ８４ ８４
１４７ １６９ ２２３ １４７
１１１４３ １０２４００ ３１０２６７
【００８７】
室Ａ Ｗ／Ｏ デキサメタゾン
攻撃後の日数：
イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０ ６ １６ ６４ ６４
１２８ ６４ １２８ １２８
６４００ ６４００ ６４００ ７
３２ ６４ ５１２ ５１２
５１２ ５１２ ５１２ ６４００
２５６００ １０２４００ ８ １２８
２５６ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６ １６００ ２５６
００ ２５６００ ９ １２８ ２５
６ ２５６ ５１２ ５１２ ５１２
５１２ １６００ １０２４００ １
０２４００１０ ６４ ６４ １２
８ ２５６ ２５６ ２５６ ２５６
４００ １６００ ６４００
ＧＭＴ ５６ １１１ １９４
２９４ ２５６ ２９４ ２９４
２１１１ １４７０６ ２５６００
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０ ６ １６ ６４ ６４
１２８ ６４ １２８ １２８
６４００ ６４００ ６４００ ７
３２ ６４ ５１２ ５１２
５１２ ５１２ ５１２ ６４００
２５６００ １０２４００ ８ １２８
２５６ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６ １６００ ２５６
００ ２５６００ ９ １２８ ２５
６ ２５６ ５１２ ５１２ ５１２
５１２ １６００ １０２４００ １
０２４００１０ ６４ ６４ １２
８ ２５６ ２５６ ２５６ ２５６
４００ １６００ ６４００
ＧＭＴ ５６ １１１ １９４
２９４ ２５６ ２９４ ２９４
２１１１ １４７０６ ２５６００
【００８８】
室Ａ 接触対照
攻撃後の日数：
イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０１１ １６ １６ ３２
３２ ３２ １６ ３２
３２ １２８ １２８１２
１２８ １２８ １２８ ２５６
２５６ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６１３ １２８
５１２ ５１２ ５１２ １０２４
１０２４ １０２４ １０２４ １０２
４ １０２４ ＧＭＴ ６４ １０
２ １２８ １６１ ２０３ １６１
２０３ ２０３ ３２２
３２２ １ すべてのイヌを６０ｄｐｃにて
デキサメタゾンで免疫抑制した
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０１１ １６ １６ ３２
３２ ３２ １６ ３２
３２ １２８ １２８１２
１２８ １２８ １２８ ２５６
２５６ ２５６ ２５６ ２５６
２５６ ２５６１３ １２８
５１２ ５１２ ５１２ １０２４
１０２４ １０２４ １０２４ １０２
４ １０２４ ＧＭＴ ６４ １０
２ １２８ １６１ ２０３ １６１
２０３ ２０３ ３２２
３２２ １ すべてのイヌを６０ｄｐｃにて
デキサメタゾンで免疫抑制した
【００８９】表 ５
ボレリア・バーグドロフェリに対するＩＦＡ抗体価室Ｂ
メチルプレドニゾロン 攻撃後の日数： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ｄ ３０ ６０１
９０１４ ３２ ６４ ２５６
１２８ ２５６ ２５６ １０２４ １
０２４００ ４０９６００ １６３８４００１５
３２ １２８ １２８ ２５６
２５６ ２５６ ２５６ ６４００
２５６００ ４０９６００１６ １６
６４ ６４ ６４ ６４
１２８ １２８ １０２４００ ４０９６０
０ １６３８４００１７ １２８ ２５６
５１２ ５１２ ５１２ ５１２
１０２４ １６００ ４０９６００ １６３８
４００１８ ３２ １２８ １２８
５１２ ５１２ １０２４ １０２４
２５６００ ４０９６００ １６３８４００ ＧＭ
Ｔ ３７ １１１ １６９ ２２
３ ２５６ ３３８ ５１２ １９４
０１ ２３５２５３ １２４１６７５
メチルプレドニゾロン 攻撃後の日数： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ｄ ３０ ６０１
９０１４ ３２ ６４ ２５６
１２８ ２５６ ２５６ １０２４ １
０２４００ ４０９６００ １６３８４００１５
３２ １２８ １２８ ２５６
２５６ ２５６ ２５６ ６４００
２５６００ ４０９６００１６ １６
６４ ６４ ６４ ６４
１２８ １２８ １０２４００ ４０９６０
０ １６３８４００１７ １２８ ２５６
５１２ ５１２ ５１２ ５１２
１０２４ １６００ ４０９６００ １６３８
４００１８ ３２ １２８ １２８
５１２ ５１２ １０２４ １０２４
２５６００ ４０９６００ １６３８４００ ＧＭ
Ｔ ３７ １１１ １６９ ２２
３ ２５６ ３３８ ５１２ １９４
０１ ２３５２５３ １２４１６７５
【００９０】
室Ｂ Ｗ／Ｏ メチルプレドニゾロン攻撃後の日数
： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ｄ ３０ ６０１
９０１９ ３２ １２８ １２８
１２８ １２８ ２５６ ５１２
６００ ２５６００ ２５６００２０
３２ ６４ ６４ １２８
１２８ ２５６ ２５６ ６００
２５６００ ４０９６００２１ ３２
１２８ １２８ １２８ １２８
２５６ ２５６ １６００ １０２４０
０ ４０９６００２２ １２８ ２５６
２５６ １２８ ２５６ ２５６
１２８ ６４００ ２５６００ １０２
４００２３ ３２ ６４ ６４
６４ ６４ ６４ ６４
４００ ２５６００ １０２４００ ＧＭ
Ｔ ４２ １１１ １１１ １１
１ １２８ １９４ １９４ １０
８１ ３３７７９ １３５１１８
： イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ｄ ３０ ６０１
９０１９ ３２ １２８ １２８
１２８ １２８ ２５６ ５１２
６００ ２５６００ ２５６００２０
３２ ６４ ６４ １２８
１２８ ２５６ ２５６ ６００
２５６００ ４０９６００２１ ３２
１２８ １２８ １２８ １２８
２５６ ２５６ １６００ １０２４０
０ ４０９６００２２ １２８ ２５６
２５６ １２８ ２５６ ２５６
１２８ ６４００ ２５６００ １０２
４００２３ ３２ ６４ ６４
６４ ６４ ６４ ６４
４００ ２５６００ １０２４００ ＧＭ
Ｔ ４２ １１１ １１１ １１
１ １２８ １９４ １９４ １０
８１ ３３７７９ １３５１１８
【００９１】
室Ｂ 接触対照
攻撃後の日数：
イヌ ＤＯＣ ２ ４ ６
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０２４ ６４ １２８ １２８
１２８ １２８ １２８ １２８
１２８ １２８ ２５６２５
１２８ ５１２ ５１２ ５１２
５１２ ５１２ ５１２ ５１２
１０２４ １０２４２６ １２８
２５６ ２５６ ５１２ ５１２
２５６ ２５６ ２５６ ５１
２ ５１２ ＧＭＴ １０２ ２５
６ ２５６ ３２２ ３２２ ３２２
２５６ ２５６ ４０６
４０６ １ すべてのイヌを６０ｄｐｃにて
デキサメタゾンで免疫抑制した
８ １０ １４ ３０ ６０１
９０２４ ６４ １２８ １２８
１２８ １２８ １２８ １２８
１２８ １２８ ２５６２５
１２８ ５１２ ５１２ ５１２
５１２ ５１２ ５１２ ５１２
１０２４ １０２４２６ １２８
２５６ ２５６ ５１２ ５１２
２５６ ２５６ ２５６ ５１
２ ５１２ ＧＭＴ １０２ ２５
６ ２５６ ３２２ ３２２ ３２２
２５６ ２５６ ４０６
４０６ １ すべてのイヌを６０ｄｐｃにて
デキサメタゾンで免疫抑制した
【００９２】実施例２−
ビー・バーグドロフェリ・ワクチンの生成 ビー・バーグドロフェリ株 ビー・バーグドロフェリ株Ｂ−３１（受入れ番号３５２
１０の下、アメリカン・タイプ・ティシュー・コレクシ
ョンから入手可能）を用い、大規模の抗原産生培養体に
接種した。
ビー・バーグドロフェリ・ワクチンの生成 ビー・バーグドロフェリ株 ビー・バーグドロフェリ株Ｂ−３１（受入れ番号３５２
１０の下、アメリカン・タイプ・ティシュー・コレクシ
ョンから入手可能）を用い、大規模の抗原産生培養体に
接種した。
【００９３】培養体中の他のビー・バーグドロフェリ株
もビー・バーグドロフェリ抗原の産生にて有用であると
考えられる。好ましくは、ワクチン生成に用いられる株
が哺乳動物におけるスピロヘーター血症の起因となりう
ることである。
もビー・バーグドロフェリ抗原の産生にて有用であると
考えられる。好ましくは、ワクチン生成に用いられる株
が哺乳動物におけるスピロヘーター血症の起因となりう
ることである。
【００９４】スピロヘーター増殖培地
増殖培地を、バーバー（Ｂａｒｂｏｕｒ）らにより記載
されているＢＳＩＩ処方（ヤーレ・ジャーナル・オブ・
バイオロジー・アンド・メディスン（Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．）５７：５２１〜５２５，１９８４）
を修飾することで調製する。用いる処方を以下に示す：
されているＢＳＩＩ処方（ヤーレ・ジャーナル・オブ・
バイオロジー・アンド・メディスン（Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．）５７：５２１〜５２５，１９８４）
を修飾することで調製する。用いる処方を以下に示す：
【００９５】
処方 配合
物質
配合量ＣＭＲＬ１
０６６１（１０Ｘ）（ニューヨーク州、
８３ｍｌ／ｌ グランド
アイランド、ギブコ（ＧＩＢＣＯ））ネオペプトン２（
ミシガン州、デトロイト、
４．６ｇ／ｌ ディフコ
（ＤＩＦＣＯ））炭酸水素ナトリウム（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）
１．８ｇ／ｌ酵母エキス（メリーランド州、コロンビ
ア、 ３．３ｇ／ｌ
オキソイド・ユー・エス・エイ（
Ｏｘｏｉｄ ＵＳＡ））ＨＥＰＥＳ緩衝剤（酸型）（オ
ハイオ州、クレーブランド、 ５．７ｇ／ｌ
リサーチ・オーガニックス（Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ））グルコース（Ｕ．Ｓ．Ｐ
．）
４．３ｇ／ｌクエン酸・三カリ
ウム塩（ミズリー州、セントルイス、 １
．０ｇ／ｌ シグマ・ケミカル（Ｓ
ＩＧＭＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））ピルビン酸ナトリウム
（シグマ）
０．７ｇ／ｌＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン（シグマ）
０．５ｇ／ｌＬ−グルタミン３（ギブコ）
０．４ｇ／ｌウシ血清アルブミン３（ニューヨーク州
、タカホー、 ２５ｇ／ｌ
インターゲン・バイオケム（Ｉｎｔｅｒｇ
ｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．））胎児ウシ血清３（カンサス
州、レネックサ（Ｌｅｎｅｘａ）、 ４．
２ｍｌ／ｌ ハズレトン（ＨＡＺＬ
ＥＴＯＮ））脱イオン水
適量１ パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）
ら、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．５、３０３頁、１９５７に記
載 ２ ビーフ蛋白加水分解物 ３ 熱不安定性
処方 配合
物質
配合量ＣＭＲＬ１
０６６１（１０Ｘ）（ニューヨーク州、
８３ｍｌ／ｌ グランド
アイランド、ギブコ（ＧＩＢＣＯ））ネオペプトン２（
ミシガン州、デトロイト、
４．６ｇ／ｌ ディフコ
（ＤＩＦＣＯ））炭酸水素ナトリウム（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）
１．８ｇ／ｌ酵母エキス（メリーランド州、コロンビ
ア、 ３．３ｇ／ｌ
オキソイド・ユー・エス・エイ（
Ｏｘｏｉｄ ＵＳＡ））ＨＥＰＥＳ緩衝剤（酸型）（オ
ハイオ州、クレーブランド、 ５．７ｇ／ｌ
リサーチ・オーガニックス（Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ））グルコース（Ｕ．Ｓ．Ｐ
．）
４．３ｇ／ｌクエン酸・三カリ
ウム塩（ミズリー州、セントルイス、 １
．０ｇ／ｌ シグマ・ケミカル（Ｓ
ＩＧＭＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））ピルビン酸ナトリウム
（シグマ）
０．７ｇ／ｌＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン（シグマ）
０．５ｇ／ｌＬ−グルタミン３（ギブコ）
０．４ｇ／ｌウシ血清アルブミン３（ニューヨーク州
、タカホー、 ２５ｇ／ｌ
インターゲン・バイオケム（Ｉｎｔｅｒｇ
ｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．））胎児ウシ血清３（カンサス
州、レネックサ（Ｌｅｎｅｘａ）、 ４．
２ｍｌ／ｌ ハズレトン（ＨＡＺＬ
ＥＴＯＮ））脱イオン水
適量１ パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）
ら、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．５、３０３頁、１９５７に記
載 ２ ビーフ蛋白加水分解物 ３ 熱不安定性
【００９６】一定容量の脱イオン水（最終容量の約８０
％）を前記固体の溶解を促進する温度（例えば、３０℃
〜４０℃）まで徐々に加熱する。前記成分を加え、すべ
ての固体が溶解するまで撹拌する。ついで、濃ＮａＯＨ
水溶液を用いてｐＨを７．６±０．１に調整する。容量
を脱イオン水で最終容量に調整する。ついで、該溶液を
滅菌濾過する。
％）を前記固体の溶解を促進する温度（例えば、３０℃
〜４０℃）まで徐々に加熱する。前記成分を加え、すべ
ての固体が溶解するまで撹拌する。ついで、濃ＮａＯＨ
水溶液を用いてｐＨを７．６±０．１に調整する。容量
を脱イオン水で最終容量に調整する。ついで、該溶液を
滅菌濾過する。
【００９７】別法として、熱不安定性成分を減じた前記
成分の溶液を縮小容量にて調製し、オートクレーブで滅
菌する。ついで、熱不安定性成分の滅菌濾過した濃縮溶
液を加え、滅菌水で容量を調整する。
成分の溶液を縮小容量にて調製し、オートクレーブで滅
菌する。ついで、熱不安定性成分の滅菌濾過した濃縮溶
液を加え、滅菌水で容量を調整する。
【００９８】培地成分の源として列挙した製造業者は限
定する意味ではなく、許容しうる品質の例示を示すもの
である。該培地成分は細菌学および／または哺乳動物細
胞培養の分野において周知であり、許容しうる物質は他
の製造業者からも入手可能である。
定する意味ではなく、許容しうる品質の例示を示すもの
である。該培地成分は細菌学および／または哺乳動物細
胞培養の分野において周知であり、許容しうる物質は他
の製造業者からも入手可能である。
【００９９】バーバーらにより記載されているゼラチン
成分はビー・バーグドロフェリ増殖に必要でないことが
判明した。事実、ゼラチンは細菌培養体の粘度を増加さ
せることによりビー・バーグドロフェリの処理を妨害す
る。さらに、ゼラチンがあれば、低温で培養体が「ゲル
化」するため、処理するまで培養体を冷蔵庫にて貯蔵す
ることができない。ゼラチンは、所望により、中程度お
よび小規模培養（２５ｍｌ〜約１０リットル）にて用い
る培地に（１１．７ｇ／リットルにて）加えてもよいが
、一般に、生産規模培養（１０リットル以上）に用いる
培地には加えない。
成分はビー・バーグドロフェリ増殖に必要でないことが
判明した。事実、ゼラチンは細菌培養体の粘度を増加さ
せることによりビー・バーグドロフェリの処理を妨害す
る。さらに、ゼラチンがあれば、低温で培養体が「ゲル
化」するため、処理するまで培養体を冷蔵庫にて貯蔵す
ることができない。ゼラチンは、所望により、中程度お
よび小規模培養（２５ｍｌ〜約１０リットル）にて用い
る培地に（１１．７ｇ／リットルにて）加えてもよいが
、一般に、生産規模培養（１０リットル以上）に用いる
培地には加えない。
【０１００】ビー・バーグドロフェリの増殖十分な細菌
が得られるまで細菌を小型容器にて増殖させて大規模の
発酵槽（好ましくは８００〜２０００リットル）に接種
する。一般に、培養体を培地１ｍｌ当たり３×１０５生
物体で接種する。
が得られるまで細菌を小型容器にて増殖させて大規模の
発酵槽（好ましくは８００〜２０００リットル）に接種
する。一般に、培養体を培地１ｍｌ当たり３×１０５生
物体で接種する。
【０１０１】発酵を以下のモニターし、調節した変数で
行う： 温度 ３
４℃±１℃ｐＨ
７．６±０．２インペラーＲＰＭ
２５〜１００
行う： 温度 ３
４℃±１℃ｐＨ
７．６±０．２インペラーＲＰＭ
２５〜１００
【０１０２】一般に、生物体濃度
が少なくとも１×１０８／ｍｌとなるまで培養体を増殖
させる（約６日間）。 しかしながら、大規模な産生目的には、発酵過程にわた
ってビー・バーグドロフェリ主表面蛋白の産生をモニタ
ー観察することが重要である。ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢ
のいずれかの濃度が実質的に最大量に達した時点（濃度
が降下する前に）で培養を終える。
が少なくとも１×１０８／ｍｌとなるまで培養体を増殖
させる（約６日間）。 しかしながら、大規模な産生目的には、発酵過程にわた
ってビー・バーグドロフェリ主表面蛋白の産生をモニタ
ー観察することが重要である。ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢ
のいずれかの濃度が実質的に最大量に達した時点（濃度
が降下する前に）で培養を終える。
【０１０３】モニター抗原
抗原レベルは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ビー・バーグドロフェリ抗原
に対する抗血清を用いるウェスタンブロット法、ＲＩＡ
、ＥＬＩＳＡおよび補体固定を包含する他の抗体媒介検
定法を含む多くの技法により測定することができる（フ
ァンダメンタル・イムノロジー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），ダブリュ・イー・ポール
（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ）編、ラベン・プレス、ニューヨー
ク、１９８９、３１５〜３５８頁参照）。
法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ビー・バーグドロフェリ抗原
に対する抗血清を用いるウェスタンブロット法、ＲＩＡ
、ＥＬＩＳＡおよび補体固定を包含する他の抗体媒介検
定法を含む多くの技法により測定することができる（フ
ァンダメンタル・イムノロジー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），ダブリュ・イー・ポール
（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ）編、ラベン・プレス、ニューヨー
ク、１９８９、３１５〜３５８頁参照）。
【０１０４】例えば、実施例１に記載したＩＦＡ検定で
抗原をモニター観察する。加えて、主ビー・バーグドロ
フェリ表面蛋白の一つ、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢを発現
する細胞数をこの検定でモニター観察する。
抗原をモニター観察する。加えて、主ビー・バーグドロ
フェリ表面蛋白の一つ、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢを発現
する細胞数をこの検定でモニター観察する。
【０１０５】回収および精製
ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの最大濃度が得られたならば、
ホルムアルデヒドを０．１％の濃度まで添加することに
より（この具体例における）培養体を不活性化する。つ
いで、遠心分離、中空繊維濾過または接線流濾過により
生長培地を除去することにより不活性化スピロヘーター
を濃縮する。所望により、該不活性化生物体を水または
平衡食塩溶液で洗浄してもよい。最後に、該不活性化生
物体を水または平衡食塩溶液に懸濁させて、≧５×１０
８生物体／ｍｌの細胞濃度を形成させる。
ホルムアルデヒドを０．１％の濃度まで添加することに
より（この具体例における）培養体を不活性化する。つ
いで、遠心分離、中空繊維濾過または接線流濾過により
生長培地を除去することにより不活性化スピロヘーター
を濃縮する。所望により、該不活性化生物体を水または
平衡食塩溶液で洗浄してもよい。最後に、該不活性化生
物体を水または平衡食塩溶液に懸濁させて、≧５×１０
８生物体／ｍｌの細胞濃度を形成させる。
【０１０６】ワクチン処方
濃縮体を５×１０８生物体／ｍｌの濃度まで希釈する。
ついで、エチレン／無水マレイン酸コポリマー（例えば
、ミズリー州、セントルイス、モンサント（Ｍｏｎｓａ
ｎｔｏ）より製造）を３％ｖ／ｖの濃度まで加える。つ
いで、ｐＨを１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．８と７．７の間
に調整する。最後に、ＮＥＯＣＲＹＬ Ａ６４０〜を１
％ｗ／ｖの濃度まで加える。
、ミズリー州、セントルイス、モンサント（Ｍｏｎｓａ
ｎｔｏ）より製造）を３％ｖ／ｖの濃度まで加える。つ
いで、ｐＨを１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．８と７．７の間
に調整する。最後に、ＮＥＯＣＲＹＬ Ａ６４０〜を１
％ｗ／ｖの濃度まで加える。
【０１０７】実施例３−血清中和検定
血清中和検定を以下のように行う：
（ａ）血清試料を滅菌濾過し、該血清試料を５６℃にて
３０分間加熱することにより、該試料における補体を不
活性化する。 （ｂ）該血清の一連の希釈液を希釈剤としてＰＢＳを用
いて製造する。希釈液を分離管に加える。 （ｃ）活性増殖するビー・バーグドロフェリ（０．４ｍ
ｌ、３×１０４生物体／ｍｌ）を各分離管に加え、血清
試料と一緒に緩やかに混合した。 （ｄ）滅菌濾過したモルモット補体（０．８ｍｌ、ミズ
リー州、セントルイス、シグマ社から入手）を各分離管
に加え、含有物を緩やかに混合した。 （ｅ）該管を撹拌しながら３５℃にて１時間インキュベ
ートした。 （ｆ）各管からの０．１ｍｌアリコートを別々に培養管
におけるＢＳＫＩＩ培地０．９ｍｌに加えた。該培養体
を３５℃にて７日間増殖させた。
３０分間加熱することにより、該試料における補体を不
活性化する。 （ｂ）該血清の一連の希釈液を希釈剤としてＰＢＳを用
いて製造する。希釈液を分離管に加える。 （ｃ）活性増殖するビー・バーグドロフェリ（０．４ｍ
ｌ、３×１０４生物体／ｍｌ）を各分離管に加え、血清
試料と一緒に緩やかに混合した。 （ｄ）滅菌濾過したモルモット補体（０．８ｍｌ、ミズ
リー州、セントルイス、シグマ社から入手）を各分離管
に加え、含有物を緩やかに混合した。 （ｅ）該管を撹拌しながら３５℃にて１時間インキュベ
ートした。 （ｆ）各管からの０．１ｍｌアリコートを別々に培養管
におけるＢＳＫＩＩ培地０．９ｍｌに加えた。該培養体
を３５℃にて７日間増殖させた。
【０１０８】７日間のインキュベーションの終わりに、
該培養体を、暗視野顕微鏡を用いて視覚性細菌の数を評
点した。「血清中和価」を、免疫処理前血清に対して８
０％までスピロヘーター数を減少させる血清の最高希釈
度として評点した。
該培養体を、暗視野顕微鏡を用いて視覚性細菌の数を評
点した。「血清中和価」を、免疫処理前血清に対して８
０％までスピロヘーター数を減少させる血清の最高希釈
度として評点した。
【０１０９】本願発明者らは、免疫処理したイヌの血清
中和価が４以上である場合はいつでも、該イヌは単離し
たビー・バーグドロフェリ・スピロヘーターでの攻撃に
より誘発されるスピロヘーター血症から効果的に保護さ
れることを観察した。
中和価が４以上である場合はいつでも、該イヌは単離し
たビー・バーグドロフェリ・スピロヘーターでの攻撃に
より誘発されるスピロヘーター血症から効果的に保護さ
れることを観察した。
【０１１０】さらに血清中和検定を用い、Ｈ３ＴＳ、Ｏ
ｓｐＡに対するモノクローナル抗体（ミネソタ州の大学
のラッセル・シー・ジョンソン（Ｒｕｓｓｅｌ Ｃ．Ｊ
ｐｈｎｓｏｎ）から入手）が該血清中和検定（力価＝１
：２３６）において効果的であることを明らかにした。 ＯｓｐＢに対するモノクローナル抗体Ｃｂ−２もまた、
この検定によればビー・バーグドロフェリを中和するの
に効果的である。 鞭毛蛋白（４１Ｋ）に対するモノクローナル抗体は効果
的でなかった。
ｓｐＡに対するモノクローナル抗体（ミネソタ州の大学
のラッセル・シー・ジョンソン（Ｒｕｓｓｅｌ Ｃ．Ｊ
ｐｈｎｓｏｎ）から入手）が該血清中和検定（力価＝１
：２３６）において効果的であることを明らかにした。 ＯｓｐＢに対するモノクローナル抗体Ｃｂ−２もまた、
この検定によればビー・バーグドロフェリを中和するの
に効果的である。 鞭毛蛋白（４１Ｋ）に対するモノクローナル抗体は効果
的でなかった。
【０１１１】実施例４−免疫処理
ワクチン接種
イヌをワクチン接種群とワクチン非接種の対照群に分け
た。ワクチン接種群に、実施例２のワクチン１ｍｌを２
回筋肉内注射した。第２の注射は第１の注射後２２日ま
でに行った。いくつかのデータは、第１のワクチン接種
後の検定数（「ｄｐｖ」）または第２のワクチン接種後
の日数（「ｄｐｖ−２」）の表現で示されている。
た。ワクチン接種群に、実施例２のワクチン１ｍｌを２
回筋肉内注射した。第２の注射は第１の注射後２２日ま
でに行った。いくつかのデータは、第１のワクチン接種
後の検定数（「ｄｐｖ」）または第２のワクチン接種後
の日数（「ｄｐｖ−２」）の表現で示されている。
【０１１２】固有の補体を不活性化するのに用いる条件
、すなわち、希釈緩衝液、加える生物体数、加える補体
数、補体源、補体添加後のインキュベーション条件、お
よび最終インキュベーションにて用いる条件が臨界的で
なく、所望によりまたは個々の環境指示により変更して
もよいことを当業者であれば容易に認識するであろう。
、すなわち、希釈緩衝液、加える生物体数、加える補体
数、補体源、補体添加後のインキュベーション条件、お
よび最終インキュベーションにて用いる条件が臨界的で
なく、所望によりまたは個々の環境指示により変更して
もよいことを当業者であれば容易に認識するであろう。
【０１１３】ビー・バーグドロフェリ攻撃第２のワクチ
ン接種後１５６日に、すべてのイヌを実施例１に記載の
方法を用いてビー・バーグドロフェリで攻撃した。攻撃
方法は、７日連続の５０００スピロヘーターの注射／日
および攻撃初日および攻撃開始後６日目（攻撃後の日数
または「ｄｐｃ」）におけるデキサメタゾン２ｍｇの注
射を包含する。
ン接種後１５６日に、すべてのイヌを実施例１に記載の
方法を用いてビー・バーグドロフェリで攻撃した。攻撃
方法は、７日連続の５０００スピロヘーターの注射／日
および攻撃初日および攻撃開始後６日目（攻撃後の日数
または「ｄｐｃ」）におけるデキサメタゾン２ｍｇの注
射を包含する。
【０１１４】結果
表６は、該ワクチンが、ワクチン接種の５カ月後に開始
したビー・バーグドロフェリ・スピロヘーター攻撃によ
るスピロヘーター血症からイヌを保護するのに効果的で
あったことを示す。非対スチューデント−ｔ試験によれ
ば、該差異の統計的有意性はｐ＝０．００６である。
したビー・バーグドロフェリ・スピロヘーター攻撃によ
るスピロヘーター血症からイヌを保護するのに効果的で
あったことを示す。非対スチューデント−ｔ試験によれ
ば、該差異の統計的有意性はｐ＝０．００６である。
【０１１５】表７は、該ワクチンが跛行行動により明白
なスピロヘーター誘発関節炎からイヌを保護するのに効
果的であることを示す。カイ二乗分析によれば、群間の
差異の統計的有意性はｐ＜０．０１である。
なスピロヘーター誘発関節炎からイヌを保護するのに効
果的であることを示す。カイ二乗分析によれば、群間の
差異の統計的有意性はｐ＜０．０１である。
【０１１６】表８は、該ワクチンがビー・バーグドロフ
ェリでの攻撃後に観察される発熱を制限するのに効果的
であったことを示す。発熱がワクチン接種のイヌでほと
んど観察されないだけでなく、攻撃後４１日経過した後
も発熱は観察されない。対照的に、非ワクチン接種のイ
ヌは長期間（攻撃後６０日まで）にわたって発熱を展開
した。非対スチューデント−ｔ試験によれば、３８日間
の観察にわたるこれら観察における差異の統計的有意性
はｐ＜０．０１であった。
ェリでの攻撃後に観察される発熱を制限するのに効果的
であったことを示す。発熱がワクチン接種のイヌでほと
んど観察されないだけでなく、攻撃後４１日経過した後
も発熱は観察されない。対照的に、非ワクチン接種のイ
ヌは長期間（攻撃後６０日まで）にわたって発熱を展開
した。非対スチューデント−ｔ試験によれば、３８日間
の観察にわたるこれら観察における差異の統計的有意性
はｐ＜０．０１であった。
【０１１７】表９は、ワクチン接種のイヌが第２のワク
チン接種後１５６日目に抗ビー・バーグドロフェリ抗体
の血清中和価を保持していることを示す。スピロヘータ
ー攻撃はワクチン接種したイヌにおけるこの力価を高め
るのに効果的であった。対照的に、非ワクチン接種のイ
ヌは弱抗体応答を高めた。
チン接種後１５６日目に抗ビー・バーグドロフェリ抗体
の血清中和価を保持していることを示す。スピロヘータ
ー攻撃はワクチン接種したイヌにおけるこの力価を高め
るのに効果的であった。対照的に、非ワクチン接種のイ
ヌは弱抗体応答を高めた。
【０１１８】表 ６
攻撃後のイヌにおけるボレリア・バーグドロフェリ・ス
ピロヘーター血症の発達 攻撃後の日数： ７ １０ １
２ １４ １７ １９ ２１ ２４ ２６
２８ ２９ ３０ ３１ ３２ イヌ ワクチン Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｊ 陽性イヌ１ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ の総数 対照 Ｋ Ｌ ＋ Ｍ
＋ ＋ ＋
Ｎ
＋
＋ Ｏ Ｐ Ｑ
＋
＋ Ｒ
＋ ＋ 陽
性イヌ１ １ ０ ０ １ ０ ０
３ １ ０ ０ １ ２ １ ０
の総数 １ 陽性（＋）は間接蛍光抗体試験によりスライド当
たりボレリア生物体が＞１０であることを示す。 表 ６（つづき） 攻撃後のイヌにおけるボレリア・バーグドロフェリ・ス
ピロヘーター血症の発達 攻撃後の日数： ３３ ３４
３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０ ４
１ ４２ 陽性日の
総数／イヌ イヌ ワクチン Ａ
０ Ｂ
０
Ｃ
０ Ｄ
０
Ｅ
０ Ｆ
０
Ｇ
０ Ｈ
０
Ｉ
０ Ｊ
０ 陽性イヌ１
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ の総数 対照 Ｋ
０ Ｌ
１
Ｍ ＋
４ Ｎ
２
Ｏ
０ Ｐ
０
Ｑ ＋
３ Ｒ ＋ ＋
４ 陽性イヌ１
１ ２ １ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ の総数 １ 陽性（＋）は間接蛍光抗体試験によりスライド当
たりボレリア生物体が＞１０であることを示す。
ピロヘーター血症の発達 攻撃後の日数： ７ １０ １
２ １４ １７ １９ ２１ ２４ ２６
２８ ２９ ３０ ３１ ３２ イヌ ワクチン Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｊ 陽性イヌ１ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ の総数 対照 Ｋ Ｌ ＋ Ｍ
＋ ＋ ＋
Ｎ
＋
＋ Ｏ Ｐ Ｑ
＋
＋ Ｒ
＋ ＋ 陽
性イヌ１ １ ０ ０ １ ０ ０
３ １ ０ ０ １ ２ １ ０
の総数 １ 陽性（＋）は間接蛍光抗体試験によりスライド当
たりボレリア生物体が＞１０であることを示す。 表 ６（つづき） 攻撃後のイヌにおけるボレリア・バーグドロフェリ・ス
ピロヘーター血症の発達 攻撃後の日数： ３３ ３４
３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０ ４
１ ４２ 陽性日の
総数／イヌ イヌ ワクチン Ａ
０ Ｂ
０
Ｃ
０ Ｄ
０
Ｅ
０ Ｆ
０
Ｇ
０ Ｈ
０
Ｉ
０ Ｊ
０ 陽性イヌ１
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ の総数 対照 Ｋ
０ Ｌ
１
Ｍ ＋
４ Ｎ
２
Ｏ
０ Ｐ
０
Ｑ ＋
３ Ｒ ＋ ＋
４ 陽性イヌ１
１ ２ １ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ の総数 １ 陽性（＋）は間接蛍光抗体試験によりスライド当
たりボレリア生物体が＞１０であることを示す。
【０１１９】表 ７
ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける跛行
の発達 攻撃後の日数： ３１ ３２ ３３ ３４ ３
５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０ ４１ ４２ ４３
４４ ４５ ４６ ４７ ４８ ４９ ５０
イヌ ワク Ａ チン Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｊ 陽性イヌ１ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ の
総数 対照 Ｋ Ｌ
＋ ＋ Ｍ
＋ ＋
Ｎ Ｏ ＋
＋ ＋ ＋
＋ Ｐ Ｑ Ｒ 陽性イヌ１ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ １ １ １ ０ ０ １ ２ ２ ０ ０ の
総数 １ 陽性（＋）はイヌが体重を１本の脚で支えなかっ
たことを示す。 表 ７（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける跛行
の発達 攻撃後の日数： ５１ ５２ ５３ ５４
５５ ５６ ５７ ５８ ５９ ６０ ６１ ６２ ６
３ ６４ ６５ ６６ 陽性日の
総数／イヌ イヌ ワク Ａ
０ チン Ｂ
０
Ｃ
０ Ｄ
０ Ｅ
０ Ｆ
０ Ｇ
０
Ｈ
０ Ｉ
０
Ｊ
０ 陽性イヌ１ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ の総数 対照 Ｋ
０ Ｌ
＋ ３
Ｍ
＋
３ Ｎ
＋
１ Ｏ
５ Ｐ
０ Ｑ
＋ １
Ｒ
＋
１ 陽性イヌ１ ０ １ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ３ ０ ０ ０ ０ ０ １ の総数 １ 陽性（＋）はイヌが体重を１本の脚で支えなかっ
たことを示す。
の発達 攻撃後の日数： ３１ ３２ ３３ ３４ ３
５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０ ４１ ４２ ４３
４４ ４５ ４６ ４７ ４８ ４９ ５０
イヌ ワク Ａ チン Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｊ 陽性イヌ１ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ の
総数 対照 Ｋ Ｌ
＋ ＋ Ｍ
＋ ＋
Ｎ Ｏ ＋
＋ ＋ ＋
＋ Ｐ Ｑ Ｒ 陽性イヌ１ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ １ １ １ ０ ０ １ ２ ２ ０ ０ の
総数 １ 陽性（＋）はイヌが体重を１本の脚で支えなかっ
たことを示す。 表 ７（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける跛行
の発達 攻撃後の日数： ５１ ５２ ５３ ５４
５５ ５６ ５７ ５８ ５９ ６０ ６１ ６２ ６
３ ６４ ６５ ６６ 陽性日の
総数／イヌ イヌ ワク Ａ
０ チン Ｂ
０
Ｃ
０ Ｄ
０ Ｅ
０ Ｆ
０ Ｇ
０
Ｈ
０ Ｉ
０
Ｊ
０ 陽性イヌ１ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
０ の総数 対照 Ｋ
０ Ｌ
＋ ３
Ｍ
＋
３ Ｎ
＋
１ Ｏ
５ Ｐ
０ Ｑ
＋ １
Ｒ
＋
１ 陽性イヌ１ ０ １ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ３ ０ ０ ０ ０ ０ １ の総数 １ 陽性（＋）はイヌが体重を１本の脚で支えなかっ
たことを示す。
【０１２０】表 ８
ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ２８ ２９
３０ ３１ ３２ ３３
３４ ３５ ３６ ３７
イヌ ワク Ａ １０３．８ − −
− − − １０３．２ −
− − チン Ｂ −
− − − − −
− − − − Ｃ
− − − − −
− − − − −
Ｄ − − −
− − − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − − −
Ｆ １０３．２ − − １０３．４
− − − − １０３．
０ − Ｇ − −
１０４．０ − − − −
− − − Ｈ
− １０３．０ − − −
− １０３．０ − −
− Ｉ − − −
− − − − −
− − Ｊ −
− − − − −
− − − − 陽性イヌ
１ ２ １ １ １ ０
０ ２ ０ １ ０
の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
− − Ｌ −
− − − １０３．０ １０３．０
− − − −
Ｍ − − − −
− − − − −
− Ｎ − −
− − − − −
− − − Ｏ −
１０３．０ − − １０３．４
− １０３．０ − − −
Ｐ − − １０３．０
− − − − −
１０３．０ − Ｑ １０３．０
− − １０３．２ − １０３
．０ − − − −
Ｒ − − − −
− − − １０３．０
− １０３．２ 陽性イヌ１ １ １
１ １ ２ ２ １
１ １ １ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ３８ ３９
４０ ４１ ４２ ４３
４４ ４５ ４６ ４７
イヌ ワク Ａ − − −
− − − −
− − チン Ｂ − −
− − − − −
− − Ｃ
− − − − −
− − −
− Ｄ − − −
− − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − −
Ｆ １０３．０ − １０３．２ １
０３．０ − − −
− − Ｇ −
− − − − −
− − −
Ｈ − − − −
− − − −
− Ｉ − −
− − − − −
− − Ｊ
− − − − −
− − − −
陽性イヌ１ １ ０ １ １
０ ０ ０
０ ０ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − −
− − Ｌ １０３．０
− １０３．２ − − −
− − １０３．８
Ｍ １０３．０ − −
− − １０３．０ −
１０３．４ １０３．５ Ｎ
− − １０３．０ − −
− − − −
Ｏ − − − １
０３．６ １０４．０ １０３．０ −
− １０３．０ Ｐ
− − − − −
− − − −
Ｑ １０３．４ − １０３．２
− − − −
− − Ｒ −
− − − − −
１０３．２ １０４．０ − 陽
性イヌ１ ３ ０ ３ １
１ ２ １ ０ ２
３ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ４８ ４９
５０ ５１ ５２ ５３
５４ ５５ ５６ ５７
イヌ ワク Ａ − − −
− − − − −
− − チン Ｂ −
− − − − −
− − − − Ｃ
− − − − −
− − − − −
Ｄ − − −
− − − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − − −
Ｆ − − − −
− − − − −
− Ｇ − −
− − − − −
− − − Ｈ −
− − − − −
− − − −
Ｉ − − − −
− − − − −
− Ｊ − −
− − − − −
− − − 陽性イヌ１ ０
０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
− − Ｌ −
− − − − −
− − １０３．０ −
Ｍ − − − −
− − − − − １０
３．０ Ｎ − −
− − １０３．０ − −
− − − Ｏ
− − １０３．１ １０３．４ −
１０４．２ − − − −
Ｐ − − −
− − − − −
− − Ｑ −
− − １０３．８ − １０３．
６ １０３．０ １０３．０ − −
Ｒ − − −
− − − − −
− １０３．５ 陽性イヌ１ ０ ０
１ ２ １ ２ １
１ １ ２ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ５８ ５９
６０ ６１ ６２ ６３
６４ ６５ 発熱日の
総数／日 イヌ ワク Ａ − − −
− − − − −
２ チン Ｂ − −
− − − − −
− ０ Ｃ
− − − − −
− − − ０
Ｄ − − −
− − − − −
０ Ｅ − −
− − − − −
− ０ Ｆ
− − − − −
− − − ６
Ｇ − − − −
− − − −
１ Ｈ − −
− − − − −
− ２ Ｉ
− − − − −
− − − ０
Ｊ − − − −
− − − −
０ 陽性イヌ１ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０
１１ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
０ Ｌ − １０３
．５ １０３．３ − − −
− − ８ Ｍ
− − − − −
− − − ５
Ｎ − − −
− − − − −
２ Ｏ −
− １０３．２ − − −
− − １１ Ｐ
− − − − −
− − − ２
Ｑ − １０３．２ −
− − − − −
１０ Ｒ − １０３
．４ − − − −
− − ６ 陽性イヌ１
０ ３ ２ ０ ０
０ ０ ０ ６４ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。
の発達 攻撃後の日数： ２８ ２９
３０ ３１ ３２ ３３
３４ ３５ ３６ ３７
イヌ ワク Ａ １０３．８ − −
− − − １０３．２ −
− − チン Ｂ −
− − − − −
− − − − Ｃ
− − − − −
− − − − −
Ｄ − − −
− − − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − − −
Ｆ １０３．２ − − １０３．４
− − − − １０３．
０ − Ｇ − −
１０４．０ − − − −
− − − Ｈ
− １０３．０ − − −
− １０３．０ − −
− Ｉ − − −
− − − − −
− − Ｊ −
− − − − −
− − − − 陽性イヌ
１ ２ １ １ １ ０
０ ２ ０ １ ０
の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
− − Ｌ −
− − − １０３．０ １０３．０
− − − −
Ｍ − − − −
− − − − −
− Ｎ − −
− − − − −
− − − Ｏ −
１０３．０ − − １０３．４
− １０３．０ − − −
Ｐ − − １０３．０
− − − − −
１０３．０ − Ｑ １０３．０
− − １０３．２ − １０３
．０ − − − −
Ｒ − − − −
− − − １０３．０
− １０３．２ 陽性イヌ１ １ １
１ １ ２ ２ １
１ １ １ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ３８ ３９
４０ ４１ ４２ ４３
４４ ４５ ４６ ４７
イヌ ワク Ａ − − −
− − − −
− − チン Ｂ − −
− − − − −
− − Ｃ
− − − − −
− − −
− Ｄ − − −
− − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − −
Ｆ １０３．０ − １０３．２ １
０３．０ − − −
− − Ｇ −
− − − − −
− − −
Ｈ − − − −
− − − −
− Ｉ − −
− − − − −
− − Ｊ
− − − − −
− − − −
陽性イヌ１ １ ０ １ １
０ ０ ０
０ ０ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − −
− − Ｌ １０３．０
− １０３．２ − − −
− − １０３．８
Ｍ １０３．０ − −
− − １０３．０ −
１０３．４ １０３．５ Ｎ
− − １０３．０ − −
− − − −
Ｏ − − − １
０３．６ １０４．０ １０３．０ −
− １０３．０ Ｐ
− − − − −
− − − −
Ｑ １０３．４ − １０３．２
− − − −
− − Ｒ −
− − − − −
１０３．２ １０４．０ − 陽
性イヌ１ ３ ０ ３ １
１ ２ １ ０ ２
３ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ４８ ４９
５０ ５１ ５２ ５３
５４ ５５ ５６ ５７
イヌ ワク Ａ − − −
− − − − −
− − チン Ｂ −
− − − − −
− − − − Ｃ
− − − − −
− − − − −
Ｄ − − −
− − − − −
− − Ｅ −
− − − − −
− − − −
Ｆ − − − −
− − − − −
− Ｇ − −
− − − − −
− − − Ｈ −
− − − − −
− − − −
Ｉ − − − −
− − − − −
− Ｊ − −
− − − − −
− − − 陽性イヌ１ ０
０ ０ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
− − Ｌ −
− − − − −
− − １０３．０ −
Ｍ − − − −
− − − − − １０
３．０ Ｎ − −
− − １０３．０ − −
− − − Ｏ
− − １０３．１ １０３．４ −
１０４．２ − − − −
Ｐ − − −
− − − − −
− − Ｑ −
− − １０３．８ − １０３．
６ １０３．０ １０３．０ − −
Ｒ − − −
− − − − −
− １０３．５ 陽性イヌ１ ０ ０
１ ２ １ ２ １
１ １ ２ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。 表 ８（つづき） ボレリア・バーグドロフェリ攻撃後のイヌにおける発熱
の発達 攻撃後の日数： ５８ ５９
６０ ６１ ６２ ６３
６４ ６５ 発熱日の
総数／日 イヌ ワク Ａ − − −
− − − − −
２ チン Ｂ − −
− − − − −
− ０ Ｃ
− − − − −
− − − ０
Ｄ − − −
− − − − −
０ Ｅ − −
− − − − −
− ０ Ｆ
− − − − −
− − − ６
Ｇ − − − −
− − − −
１ Ｈ − −
− − − − −
− ２ Ｉ
− − − − −
− − − ０
Ｊ − − − −
− − − −
０ 陽性イヌ１ ０ ０ ０
０ ０ ０ ０ ０
１１ の総数 対照 Ｋ − − −
− − − − −
０ Ｌ − １０３
．５ １０３．３ − − −
− − ８ Ｍ
− − − − −
− − − ５
Ｎ − − −
− − − − −
２ Ｏ −
− １０３．２ − − −
− − １１ Ｐ
− − − − −
− − − ２
Ｑ − １０３．２ −
− − − − −
１０ Ｒ − １０３
．４ − − − −
− − ６ 陽性イヌ１
０ ３ ２ ０ ０
０ ０ ０ ６４ の総数 １ 陰性（−）は１０３．０°Ｆ以下の測定値を示す
。
【０１２１】表 ９
ボレリア・バーグドロフェリに対する血清中和抗体価
０ ＤＰＶ ７ ＤＰＶ−２
１５６ ＤＰＶ−２
０ ＤＰＣ ２１ ＤＰＣイヌ Ａ ＜４ ２０４８
２３
１０２４ Ｂ ＜４
４０９６ １２８
１０２４ Ｃ ＜４
１０２４ １６
５１２ Ｄ ＜
４ ４０９６
３２ １０２４ Ｅ
＜４ ４０９６
８ ５
１２ Ｆ ＜４ ２０
４８ ６４
１０２４ Ｇ ＜４
４０９６ １２８
１０２４ Ｈ ＜４
１０２４ ６４
２０４８ Ｉ
＜４ １０２４
１６ １０２４ Ｊ
＜４ ４０９６
３２ ５
１２ＧＭＴ１ ＜４ ２２９１
３６
８７１ Ｋ ＮＤ
ＮＤ ＜４
＜４ Ｌ Ｎ
Ｄ ＮＤ
＜４ ４
Ｍ ＮＤ ＮＤ
＜４
８ Ｎ ＮＤ
ＮＤ ＜
４ ８ Ｏ
ＮＤ ＮＤ
＜４
１６ Ｐ ＮＤ
ＮＤ ＜４
＜４ Ｑ ＮＤ
ＮＤ
＜４ ４
Ｒ ＮＤ ＮＤ
＜４
４ＧＭＴ
＜
４ ４
０ ＤＰＶ ７ ＤＰＶ−２
１５６ ＤＰＶ−２
０ ＤＰＣ ２１ ＤＰＣイヌ Ａ ＜４ ２０４８
２３
１０２４ Ｂ ＜４
４０９６ １２８
１０２４ Ｃ ＜４
１０２４ １６
５１２ Ｄ ＜
４ ４０９６
３２ １０２４ Ｅ
＜４ ４０９６
８ ５
１２ Ｆ ＜４ ２０
４８ ６４
１０２４ Ｇ ＜４
４０９６ １２８
１０２４ Ｈ ＜４
１０２４ ６４
２０４８ Ｉ
＜４ １０２４
１６ １０２４ Ｊ
＜４ ４０９６
３２ ５
１２ＧＭＴ１ ＜４ ２２９１
３６
８７１ Ｋ ＮＤ
ＮＤ ＜４
＜４ Ｌ Ｎ
Ｄ ＮＤ
＜４ ４
Ｍ ＮＤ ＮＤ
＜４
８ Ｎ ＮＤ
ＮＤ ＜
４ ８ Ｏ
ＮＤ ＮＤ
＜４
１６ Ｐ ＮＤ
ＮＤ ＜４
＜４ Ｑ ＮＤ
ＮＤ
＜４ ４
Ｒ ＮＤ ＮＤ
＜４
４ＧＭＴ
＜
４ ４
【０１２２
】実施例５−ウェスタン・ブロットワクチン接種したイ
ヌからの血清を用い、確立された技法でビー・バーグド
ロフェリ蛋白のウェスタン・ブロットを実施して主抗原
を同定した。ウェスタン・ブロット法は、モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第２版（前掲）、ｐｐ．１７．４７〜１８．７５に
記載されている。
】実施例５−ウェスタン・ブロットワクチン接種したイ
ヌからの血清を用い、確立された技法でビー・バーグド
ロフェリ蛋白のウェスタン・ブロットを実施して主抗原
を同定した。ウェスタン・ブロット法は、モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第２版（前掲）、ｐｐ．１７．４７〜１８．７５に
記載されている。
【０１２３】図１は、第２のワクチン接種後１５４日で
、イヌＡおよびＢ（ワクチン接種）およびイヌＫおよび
Ｌ（非ワクチン接種）から得られた抗血清を明視化した
ビー・バーグドロフェリのウェスタン・ブロットの描写
を示す。
、イヌＡおよびＢ（ワクチン接種）およびイヌＫおよび
Ｌ（非ワクチン接種）から得られた抗血清を明視化した
ビー・バーグドロフェリのウェスタン・ブロットの描写
を示す。
【０１２４】血清中和検定にて効果的である抗血清によ
り同定された主ビー・バーグドロフェリ抗原は、１４、
１７、１９、２５、２８、３１、３４、３８、４１、４
４、４８、５２、５４、５８、６０、６８、８０および
９０Ｋの分子量（±３Ｋ）を有する。
り同定された主ビー・バーグドロフェリ抗原は、１４、
１７、１９、２５、２８、３１、３４、３８、４１、４
４、４８、５２、５４、５８、６０、６８、８０および
９０Ｋの分子量（±３Ｋ）を有する。
【０１２５】
【発明の効果】本発明によれば、ビー・バーグドロフェ
リ主抗原からなるライム病ワクチンを得ることができる
。
リ主抗原からなるライム病ワクチンを得ることができる
。
【図１】 第２のワクチン接種後１５４日で、イヌＡ
およびＢ（ワクチン接種）およびイヌＫおよびＬ（非ワ
クチン接種）から得られた抗血清を明視化したビー・バ
ーグドロフェリのウェスタン・ブロットを示す図である
。
およびＢ（ワクチン接種）およびイヌＫおよびＬ（非ワ
クチン接種）から得られた抗血清を明視化したビー・バ
ーグドロフェリのウェスタン・ブロットを示す図である
。
Claims (38)
- 【請求項１】 ビー・バーグドロフェリ（Ｂ．ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉ）に対して血清中和価の抗体を誘発す
るのに効果的な量のビー・バーグドロフェリ主抗原から
なるライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）からの感受
性哺乳動物保護用ワクチン。 - 【請求項２】 ビー・バーグドロフェリ変異株に起因
するライム病から感受性哺乳動物を保護するのに効果的
である請求項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 ビー・バーグドロフェリの少なくとも
２種の主抗原からなる請求項２記載のワクチン。 - 【請求項４】 主抗原が、各抗原の分子量が±３Ｋの
範囲内で変化していてもよい、ビー・バーグドロフェリ
の２５Ｋ、２８Ｋ、３１Ｋ、３４Ｋ、３８Ｋ、４１Ｋ、
４４Ｋ、４８Ｋ、５２Ｋ、５４Ｋ、５８Ｋ、６０Ｋ、６
８Ｋ、８０Ｋおよび９０Ｋ抗原からなる群より選択され
る請求項３記載のワクチン。 - 【請求項５】 少なくとも２種の主抗原のうちの少な
くとも１種がＯｓｐＡおよびＯｓｐＢからなる群より選
択される請求項３記載のワクチン。 - 【請求項６】 哺乳動物がネコ、イヌ、トリ、ウマ、
ヒツジまたはウシである請求項１記載のワクチン。 - 【請求項７】 哺乳動物がヒトである請求項１記載の
ワクチン。 - 【請求項８】 哺乳動物がネコ、イヌ、トリ、ウマ、
ヒツジまたはウシである請求項５記載のワクチン。 - 【請求項９】 哺乳動物がヒトである請求項５記載の
ワクチン。 - 【請求項１０】 各抗原の分子量が±３Ｋの範囲内で
変化していてもよい、ビー・バーグドロフェリの２５Ｋ
、２８Ｋ、３８Ｋ、４４Ｋ、４８Ｋ、５２Ｋ、５４Ｋ、
５８Ｋ、６０Ｋ、６８Ｋ、８０Ｋおよび９０Ｋの分子量
抗原からなる群より選択される抗原蛋白。 - 【請求項１１】 ライム病による少なくとも１種の関
節炎および発熱から感受性哺乳動物を保護するのに効果
的な量のビー・バーグドロフェリ主抗原からなるライム
病からの感受性哺乳動物保護用ワクチン。 - 【請求項１２】 さらに、レプトスピラ・カニコラ、
レプトスピラ・イクテロハエモラージアエ、レプトスピ
ラ・ハージョ、レプトスピラ・グリッポチファサ、ネコ
白血病、鼻気管炎、カリチ、汎白血球減少、オウム病ク
ラミジア、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、コ
ロナウイルス、パラインフルエンザおよびパルボウイル
スに対するワクチンからなる群より選択される少なくと
も１種のワクチンとからなる請求項１記載のワクチン。 - 【請求項１３】 ビー・バーグドロフェリ菌を培養し
、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方のレベルをモニター観
察し、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方の産生において最
大量が得られたならば、該細菌を不活性化し、生理学的
に許容される担体に該不活性化細菌を混合することから
なることを特徴とするライム病ワクチンの製造方法。 - 【請求項１４】 さらに、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの
一方を発現する細菌をパーセントにてモニター観察する
請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 さらに、少なくとも７０％の培養細
菌がＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方を発現することを要
件とする請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 少なくとも９０％の培養細菌がＯｓ
ｐＡまたはＯｓｐＢの一方を発現する請求項１５記載の
方法。 - 【請求項１７】 不活性化が、ビー・バーグドロフェ
リを不活性化するのに効果的な量のグルタルアルデヒド
またはホルムアルデヒドを加えることからなる請求項１
３記載の方法。 - 【請求項１８】 アルデヒドの添加量が約０．０５％
〜約１．０％ｖ／ｖである請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 さらに、アジュバントを混合した不
活性化細菌に加えることからなる請求項１７記載の方法
。 - 【請求項２０】 さらに、少なくとも１種以上のアジ
ュバントを混合不活性化細菌に加えることからなる請求
項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 アジュバントが、サポニン、オイル
、エチレン／無水マレイン酸コポリマーおよびネオクリ
ル（ｎｅｏｃｒｙｌ）からなる群より選択される請求項
２０記載の方法。 - 【請求項２２】 アジュバントがエチレン／無水マレ
イン酸コポリマーおよびネオクリルである請求項２１記
載の方法。 - 【請求項２３】 ビー・バーグドロフェリ菌を培養し
、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方のレベルをモニター観
察し、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢの一方の産生における最
大量が得られたならば、該培養を終え、該細菌から主抗
原を抽出し、該抽出抗原を生理学的に許容される担体と
混合することからなるライム病ワクチンの製造方法。 - 【請求項２４】 さらに、アジュバントを抽出抗原に
加えることからなる請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 さらに、少なくとも１種以上のアジ
ュバントを抽出抗原に加えることからなる請求項２４記
載の方法。 - 【請求項２６】 アジュバントがサポニン、オイル、
エチレン／無水マレイン酸コポリマーおよびネオクリル
からなる群より選択される請求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 アジュバントがエチレン／無水マレ
イン酸コポリマーおよびネオクリルである請求項２６記
載の方法。 - 【請求項２８】 ダニによる疾病の伝播をまねる方法
にて、毒性ビー・バーグドロフェリ・スピロヘーターを
感受性実験室哺乳動物に注射することからなる哺乳動物
におけるライム病誘発方法。 - 【請求項２９】 スピロヘーターをダニまたは感染哺
乳動物から単離した後、該スピロヘーターを培養体にて
１０回だけ継代する請求項２８記載の方法。 - 【請求項３０】 スピロヘーターを少なくとも２回異
なる時期に注射する請求項２８記載の方法。 - 【請求項３１】 各時期が少なくとも４時間間隔を置
いている請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 スピロヘーターを少なくとも４回の
時期にて注射する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３３】 各スピロヘーター注射を、哺乳動物
における異なる場所にて行う請求項３２記載の方法。 - 【請求項３４】 各注射が約１０〜約１×１０６のス
ピロヘーターからなる請求項３３記載の方法。 - 【請求項３５】 各注射が約５０〜約５００００のス
ピロヘーターからなる請求項３４記載の方法。 - 【請求項３６】 各注射が注射部位にて少なくとも２
種の深度にてスピロヘーターを放出する請求項３５記載
の方法。 - 【請求項３７】 ダニまたは感染哺乳動物から単離し
た後、スピロヘーターを２回だけ継代する請求項３５記
載の方法。 - 【請求項３８】 感染哺乳動物がライム病の少なくと
も１種の徴候を獲得する請求項２８記載の方法。
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