KR20060129475A

KR20060129475A - 에를리히아증에 대한 보호용 개 백신

Info

Publication number: KR20060129475A
Application number: KR1020067019008A
Authority: KR
Inventors: 리앤지비아오 후 (조지); 토마스 제이 헤스; 유-웨이 치앙; 시엔-주 츄 (스티브)
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2006-12-15
Also published as: EP1723170B1; EP2338903A1; AU2005222396A1; CY1112120T1; US20060188524A1; CO5721012A2; EP1723170A1; CN1930185A; ZA200607547B; IL177860A0; ME01252B; JP2008500962A; AR048030A1; ATE530566T1; PL1723170T3; US7635481B2; BRPI0508655A; SI1723170T1; RS52188B; DK1723170T3

Abstract

본 발명은 유효 면역화 양의 불활성화된 에를리키아 캐니스(Ehrlichia canis) 박테린; 약리학적으로 허용가능한 담체; 및 항체 반응 유도제 및 세포-매개 면역 반응 유도제를 본질적으로 포함하는 면역학적 자극량의 면역보강제 시스템을 포함하는 안전하고 효과적인 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 개에서 개 에를리히아증을 예방하거나 개선시키는 방법 또한 제공한다.

Description

에를리히아증에 대한 보호용 개 백신{A CANINE VACCINE FOR PROTECTION AGAINST EHRLICHIOSIS}

개 에를리히아증은 혈액-유래의 세포내 병원체인 에를리키아 캐니스(Ehrlichia canis((이. 캐니스)에 의해 야기되는 치명적 질환이고, 임의의 성장기에 있는 개의 모든 품종을 감염시킨다. 개 에를리히아증은 이 질환의 주된 감염원인 것으로 생각되는 갈색 개의 진드기, 즉 리피세팔루스 상귀니어스(Rhipicephalus sanguineous)에 의해 주로 전염된다. 개 에를리히아증은 미국에서 풍토병인 잠재적으로 치명적인 질환이며 세계적으로 발생한다. 통상적으로, 증상은 유기체의 균주 및 숙주의 면역 상태에 따라 급성 질환 상태부터 만성 질환 상태까지 진행한다. 급성의 경우, 증상에는 점액농성 안루 및 비루, 탈수, 세망내피 과다형성, 발열, 전신성 림프절병증, 비장비대 및 저혈소판증이 포함된다. 만성의 경우, 식욕부진, 우울증, 원기 손실, 강직 및 보행에 대한 거부, 사지 또는 음낭 부종, 및 기침 또는 호흡곤란 등의 다양한 증상이 일어날 수 있다.

현재까지 개 에를리히아증의 효과적인 치료 또는 예방에 유용한 백신이 없다. 모든 형태의 에를리히아증에 대한 통상적인 치료는 테트라시클린과 같은 항생체를 급성의 경우에는 최소 2주 동안 또는 만성의 경우에는 최소 1-2개월 동안 투여하는 것이다. 만성의 경우, 혈액학적 이상증상이 3-6개월 동안 또는 평생 동안 지속될 수 있다. 소모적이고 특이적인 기관 기능장애에 대항하기 위해서는 지지 요법이 필요할 수 있다. 명백하게는, 상기 질환의 효과적인 예방이 감염 후 항생제 처방보다 바람직할 것이다.

그러므로, 본 발명의 목적은 개에서의 개 에를리히아증에 대한 보호 면역의 유도에 유용한 안전하고 효과적인 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개에서 개 에를리히아증을 예방하거나 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 시험 동물에서 임상적인 개 에를리히아증을 유도하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 숙주 방어 및 독성 메카니즘의 평가 및 연구, 및 에를리히아증에 대한 백신의 개선된 개발에 유용하다.

본 발명의 특징은 백신 조성물이 다양한 지리학적 영역에서 유래하는 에를리키아 캐니스의 많은 균주로부터 개를 보호할 수 있다는 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 개 에를리히아증에 대한 효과적인 보호 면역은 임의의 연령에 있는 개에게 부여될 수 있다는 것이다.

본 발명의 추가 목적 및 특징은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.

발명의 개요

본 발명은 유효 면역화 양의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린(bacterin), 약리학적으로 허용가능한 담체, 및 항체 반응 유도제 및 세포-매개 면역(CMI) 반응 유도제를 포함하거나 본질적으로 포함하는 면역학적 자극량의 면역보강제(adjuvant) 시스템을 포함하는 안전하고 효과적인 백신 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 시험 동물에서 임상적인 에를리키아 캐니스 감염을 유도하는 방법으로서, 숙주 방어 및 독성 메카니즘의 연구 및 평가, 및 개 에를리히아증의 치료 및 예방의 개선된 개발에 유용한 방법을 제공한다.

개 에를리히아증의 병인체는 순환하는 포유동물 백혈구에서 단독으로 또는 컴팩트 인클루젼(compact inclusion) 형태로 발생하며 진드기에 의해 전염되는, 리케차(Rickettsiale) 목의 그람-음성 박테리아인 에를리키아 캐니스(E이. 캐니스)이다. 개 에를리히아증은 미국의 많은 지역에서 풍토병이며 세계적으로 발생하는 것으로 알려져 있다. 급성 자연 발생 개 에를리히아증은 록키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever)과 유사하다. 대부분의 급성 케이스는 진드기 벡터의 가장 높은 활성과 부합하는 보다 따뜻한 구강 내에서 발생한다. 개 에를리히아증은 치명적인 질환일 수 있다. 매우 흔하게는, 상기 질환은 식욕부진, 우울증, 원기 손실, 강직 및 보행에 대한 거부, 사지 또는 음낭 부종, 기침 또는 호흡곤란과 같은 다양한 증상을 야기하는, 임의의 연령의 개에 영향을 줄 수 있는 만성 질환이다. 지금까지는, 개 에를리히아증에 대한 이용가능한 공지된 효과적인 백신화 또는 면역화 치료가 없다.

놀랍게도, 본 발명자들은 유효 면역화 양의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린, 약리학적으로 허용가능한 담체, 및 항체 반응 유도제 및 세포-매개 면역(CMI) 반응 유도제를 본질적으로 포함하는 면역학적 자극량의 면역보강제 시스템을 포함하는 백신 조성물을 임의의 성장 단계, 바람직하게는 16주 이상의 연령에 있는 개에게 투여하여 개 에를리히아증을 예방하거나 개선시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합한 에를리키아 캐니스는 1 이상의 균주일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합한 에를리키아 캐니스 박테린은 에보니(Ebony), 브로드풋(Broadfoot), 플로리다(Florida), 이스라엘 611, 고가시마(Kogashima) 1, 루이지아나(Louisiana), 오클라호마(Oklahoma), 베네주엘라(Venezuela), 노쓰 캐롤라이나 주립 대학(NCSU) 균주 제이크(Jake), NCSU 단리물 데몬(Demon), DJ 및 퍼지(Fuzzy)로서 명명된 균주와 같은 1 이상의 균주, 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 세포주, 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 DH82 세포주, 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Rockville, MD)에 기탁되어 수탁 번호 CRL10390을 부여받고 미국 특허 제5,192,679호에 개시된 에를리키아 캐니스 감염 DH82 세포주 등일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합한 에를리키아 캐니스 박테린은 바람직하게는 에보니 및 브로드풋과 같은 2종의 에를리키아 캐니스 균주일 수 있다.

예를 들면, 에보니 균주는 16S 재조합 DNA(rDNA) 서열에 기초할 때 오클라호마 균주와 99.9%의 상동성(즉, 1개의 뉴클레오티드 차이)을 가지며[Mathew JS et al., Attempted transmission of Ehrlichia canis by Rhipicephalus sanguineus after passage in cell culture, Am J Vet Res 1996 Nov; 57(11):1594-8], 에벌레 및 성충 갈색 개 진드기(리피세팔루스 상귀니어스)에 의해 개에게 전염될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Mathew 1996).

플로리다 균주는 보존된 주 면역반응성 28-kDa 단백질 유전자(미국 특허 제6,458,942호) 및 omp-1 다중 유전자 패밀리에 속하는 p30 유전자(미국 특허 제6,432,649호)를 포함하는 것으로 개시되어 있다. 더욱이, 미국 특허 제6,043,085호는 플로리다 균주가 표면 노출될 것으로 예측되는 각각 36개의 아미노산을 가진 14개의 반복부(repeat)를 포함하는 120-kDa 면역우성 항원성 단백질을 가진다는 것을 개시하고 있다. 반복 유니트는 단백질의 표면 노출 영역의 코어를 형성하고 세린 및 글루탐산이 풍부한 친수성 부위이다. 세린 및 글루탐산 각각은 반복 유니트의 아미노산 중 19%를 차지한다. 플로리다 균주는 에를리키아 캐니스 균주 NCSU 제이크보다 덜 독성을 가지는 것으로 생각되지만[Breitschwerdt et al. Doxycycline hyclate treatment of experimental canine Ehrlichiosis followed by challenge inoculation with two Ehrlichia canis strains, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998 Feb; 42(2):362-68], 오클라호마 균주와의 혈청학적 비교는 100% 특이성 및 87.5% 감수성을 나타내었다[Dawson JE et al. Serological comparison of human ehrlichiosis using two Ehrlichia canis isolates. J Infect Dis. 1991 Mar; 163(3):564-7].

무한증식 개 세포주(예컨대, DH82)에서 생장하는 것 외에(Keysary A et al. The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel, Vet. Parasitol. 1996 Apr; 62(3-4):331-40), 이스라엘 611 균주는 무한증식 마우스 마크로파지 세포주(예컨대, J774.A1)에서 생장한다(Keysary A et al. Cultivation of Ehrlichia canis in a continuous BALB/C mouse macrophage cell culture line, J Vet Diag. Invest. 2001 Nov; 13(6):521-3). 이스라엘 611은 2가지 형태의 상실배: (1) 단단하게 팩킹된 형태 및 (2) 느슨하게 팩킹된 형태를 가지며, 이의 16S rRNA 유전자 서열은 오클라호마 균주와는 3개의 뉴클레오티드가 상이하고 플로리다 균주와는 4개의 뉴클레오티드가 상이하며, 각각의 경우 1개의 뉴클레오티드 갭을 가진다(Keysary, 1996). 오클라호마 균주와의 상동성 차이도는 0.54%인 반면, 플로리다 균주와의 차이는 0.61%이다(Keysary, 1996).

플로리다 균주와 마찬가지로, 루이지아나 균주는 보조된 주 면역반응성 28-kDa 단백질 유전자(미국 특허 제6,458,942호), omp-1 다중 유전자 패밀리에 속하는 p30 유전자(미국 특허 제6,432,649호), 및 포면 노출될 것으로 예측되는 각각 36개의 아미노산을 가진 14개의 반복부를 포함하는, 미국 특허 제6,043,085호에 개시된 120-kDa 면역우성 항원성 단백질을 가진다. 반복 유니트는 단백질의 표면 노출 영역의 코어를 형성하며 세린 및 글루탐산이 풍부한 친수성 부위이다. 세린 및 글루탐산 각각은 반복 유니트의 아미노산 중 19%를 차지한다.

유사하게, 오클라호마 균주 또한 보조된 주 면역반응성 28-kDa 단백질 유전자(미국 특허 제6,458,942호), omp-1 다중 유전자 패밀리에 속하는 p30 유전자(미국 특허 제6,432,649호), 및 표면 노출될 것으로 예측되는 각각 36개의 아미노산을 가진 14개의 반복부를 포함하는, 미국 특허 제6,043,085호에 개시된 120-kDa 면역우성 항원성 단백질을 가진다. 반복 유니트는 단백질의 표면 노출 영역의 코어를 형성하며 세린 및 글루탐산이 풍부한 친수성 부위이다. 세린 및 글루탐산 각각은 반복 유니트의 아미노산 중 19%를 차지한다. 추가로, McBride JW와 그의 동료들은 오클라호마가 61 kDa 및 73 kDa의 예측된 분자량을 가지나 각각 140 kDa의 전기이동도(P140)를 가진 548 내지 688개의 아미노산으로 된 단백질을 코딩하는 당단백질 유전자(2,064 bp)를 보유한다는 것을 발견하였다. 140-kDa 단백질 유전자는 14개의(14) 거의 동일한 탠덤(tandem) 배열 108-bp 반복 유니트를 가진다. P140 유전자(1,620 bp)의 14-반복 영역(78%)은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현되었다. 상기 재조합 단백질은 아미노산 서열에 의해 예측된 것보다 1.6 내지 2 배 더 큰 범위의 분자량을 나타내었다. 상기 재조합 단백질에 대한 항체는 에를리키아 캐니스 P140과 반응한다. 탄수화물이 에를리키아 캐니스 재조합 단백질 상에서 검출되었다. 탄수화물 조성 분석은 상기 재조합 단백질 상에서 글루코스, 갈락토스 및 자일로스를 확인시켜 주었다. N-결합(Asn-Xaa-Ser/Thr) 글리코실화에 대한 1개 부위만의 존재, N-글리코시다제 F의 효과의 결핍, P120 및 P140 각각의 반복 영역에서의 70 및 126 Ser/Thr 글리코실화 부위의 존재, 및 단백질에 대한 탄수화물의 높은 몰비는 글리칸이 O-결합될 수 있다는 것을 암시한다(McBride JW et al. Glycosylation of Homologous Immunodominant Proteins of Ehrlichia chaffeensis and Ehrlichia canis. Infection and Immunity, January 2000, 68(1):13-18). 오클라호마는 12.5%의 태아 소 혈청 및 200 mM L-글루타민을 함유하는 최소 필수 배지 중의 개 마크로파지 세포주 DH82에서 생장할 수 있다(Bowie, M. V. et al. Potential value of major antigenic protein 2 for serological diagnosis of heartwater and related Ehrlichial infections, Clin. Diagnostic Lab. Immun., 1999 Mar; 6(2):209-15). FL 균주와의 혈청학적 비교는 100% 특이성 및 87.5% 감수성을 보여주었다(Dawson 1991, supra). 16S rDNA 서열에 기초한 99.9%의 유사성은 균주 에보니(Mathew 1996), 가고시마 1(Unver A et al. Analysis of 16S rRNA gene sequences of Ehrlichia canis, Anaplasma platys, and Wolbachia species from canine blood in Japan, Ann NY Acad. Sci. 2003 Jun; 990:692-8), 및 베네주엘라(Unver A et al. Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolates from dogs, ticks, and a human in Venezuela. J Clin Microbiol. 2001 Aug; 39(8):2788-93)에서 발견되었다.

NCSU 단리물의 경우, 데몬, DJ 및 퍼지, 및 균주 제이크 모두는 보존된 주 면역반응성 28-kDa 단백질 유전자(미국 특허 제6,458,942호)를 가진다. DJ, 퍼지 및 제이크는 omp-1 다중 유전자 패밀리에 속하는 p30 유전자 또한 가진다(미국 특허 제6,432,649호). 제이크는 플로리다 균주보다 더 독성이 강한 것으로 생각되고 있다(Breitschwerdt 1998, supra).

가고시마 1의 거의 전체 16S rRNA 서열은 오클라호마 및 베네주엘라 에를리키아 캐니스 균주의 서열과 99.9%의 서열 동일성(1,387개 중 1개의 염기쌍만 상이함)을 가지면서 가장 유사한 것으로 밝혀졌다(Unver 2003, supra). , 가고시마 1 균주와의 이의 높은 서열 동일성 외에, 유사하게 베네주엘라 균주는 16S rDNA 서열에 기초할 때 오클라호마 균주와 99.9% 유사하다(Unver 2001).

바람직할 실시에서, 에를리키아 캐니스 박테린은 개 단핵구 마크로파지 세포주에서 생장하며, 태아 소 혈청, 글루코스 및 글루타민으로 보충된 RPMI1640을 함유하는 배지에 의해 지지되는 무한증식 개 마크로파지 세포 또는 개 마크로파지 세포주로서 종종 지칭된다. 바람직하게는, 상기 세포는 10% 이하의 태아 소 혈청, 0.5% 락토알부민 가수분해물, 30 ㎍/㎖ 폴리믹신 B, 110 ㎍/㎖ 나트륨 피루베이트, 2.5 ㎎/㎖ 중탄산나트륨, 4 ㎎/㎖ 글루코스, 6 ㎎/㎖ L-글루타민, 0.55 ㎎/㎖ 황산마그네슘으로 보충된 RPMI1640, OptiMEM, 또는 AIM V, 바람직하게는 RPMI1640일 수 있는 지지 배지 상에서 배양되며, 최대 95일 동안, 바람직하게는 최대 35일 동안, 가장 바람직하게는 5 내지 10일 동안 배양하여 ≥ 1x10⁴ TCID₅₀(Tissue Culture Infectious Dose)의 역가를 달성한 후, 배양물을 회수하고 불활성화 처리를 행한다.

그 다음, 이로써 수득한 에를리키아 캐니스 박테린은 통상적인 불활성화 수단으로 불활성화시킨다. 예를 들어, 2원 에틸렌이민, 베타-프로피오락톤, 포르말린, 메르티올레이트, 글루테르알데히드, 황산도데실나트륨 등과 같은 화학적 불활성화제, 또는 이들의 혼합물을 사용한 화학적 불활성화가 있고, 포르말린이 바람직한 불활성화제이다. 박테린은 자외선의 존재 하에 열 또는 소랄렌(psoralen)에 의해서도 불활성화될 수 있다.

불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린의 유효 면역화 양은 선택된 균주 또는 균주들에 따라 다를 수 있고, 보호 면역 반응을 일으키기에 충분한 임의의 양일 수 있다. 투여 유니트가 약 1x10⁴ TCID₅₀ 이상의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린을 포함하는 경우의 양이 적합하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 반응-유도제"는 체액성 면역반응을 증강시킬 수 있는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합물을 지칭한다. 전형적인 예는 에틸렌 말레산 무수물(EMA) 공중합체, 아크릴산과 메타크릴산의 혼합물과 스티렌의 공중합체의 라텍스 에멀젼 예컨대, NEOCRYL^® A-640 (Avecia Neo Resius, Frankfort, IN), 수산화알루미늄 등 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명의 항체 반응-유도제는 바람직하게는 EMA와 NEOCRYL^®의 혼합물이다. NEOCRYL^®은 수용성 아크릴 중합체 및 공중합체에 대한 아베시아 비브이(Avecia BV; Sluisweg 12 P.O. Box 123 NL-5140 AC Waalwijk Netherlands)의 등록 상표명이다. 숫자 A640은 이의 등급을 표시한다. NEOCRYL^® A640은 약 7.5의 pH, 약 100 cps(브룩필드 25℃)의 점도, 40 중량%의 고체를 함유하도록 공급된 8.6 파운드의 갤런 당 중량, 1.30 ㎎/ℓ의 비중력, 44℃의 유리 전이 온도(Tg), 40℃의 최소 막형성 온도(MFFT), 및 50의 (휘발성) 산가를 가진 비유착 수성 스티렌화 아크릴 공중합체이다. 구체적으로, NEOCRYL^® A640은 스티렌과의 비유착 수성 아크릴 공중합체이다. 보다 구체적으로, NEOCRYL^® A640은 아크릴산과 메타크릴산의 혼합물과 스티렌의 공중합체의 라텍스 에멀젼이다.

본 발명에 유용한 EMA 공중합체의 적절한 등급은 산 기능성 공중합체인 EMA-31(Monsanto Co., St. Louis, MO)과 같은 선형 에틸렌-말레산 무수물 공중합체이다. 이들 공중합체는 하기 전형적인 특성: 약 170℃의 연화점, 약 247℃의 분해 온도, 2.3의 pH(1% 용액), 및 0.9-1.2 g/100 ㎖의 비점도(디메틸 포름아미드 중의 1% 용액)를 가진 수용성 미세 백색 자유-유동 분말이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "세포-매개 면역(CMI) 반응 유도제"는 세포성 면역반응을 증강시킬 수 있는 임의의 물질 또는 물질의 혼합물을 지칭한다. 전형적인 예는 생물학적 물질, 예컨대 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 바실 칼메뜨-게렝(Bacille Calmette-Guerin; BCG)(Calbiochem, La Jolla, CA) 등의 약독화된 균주, 및 Th1-관련 사이토카인, 예컨대 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-18(IL-18), 감마 인터페론 등, 바람직하게는 IL-12이거나; 또는 수중유 에멀젼인 물질, 예컨대 EMULSIGEN^® SA(MVP Laboratories, Ralston, NE), SP 오일(스쿠알란, Pluronic^® L121 및 Tween^® 80으로 된 조성물로서, 스쿠알란은 VWR/코닥(Rochester, NY)으로부터 이용가능하고, Pluronic^® L121은 BASF(Mt. Olive, NJ)로부터 이용가능함), SAF-1(신텍스(Syntex) 면역보강제 제제-1, 뮤라밀 디펩티드의 트레오닐 동족체, Tween 80, Pluronic^® L121 및 스쿠알란으로 된 조성물로서, 문헌(Byars, N.E. and Allison, A.C., Vaccine, 5(3):223-28)에 기재됨) 등과 같은 수중 파라핀유 에멀젼, 바람직하게는 EMULSIGEN^® SA, 보다 바람직하게는 수중유 에멀젼이다. EMULSIGEN^®은 에멀젼화된 수중유 특성을 가진 수의학용 항원 면역보강제에 대한 모던 베터리나리 프로덕츠(Modern Veterinary Products; 5404 Miller Ave. Omaha, Nebraska 68127, U.S.A.)의 등록 상표이다. 문자 SA는 이의 등급을 표시한다. 파라민 에멀젼화 오일 면역보강제 베이스(base)인 EMULSIGEN^® SA는 트립틱 대두 브로쓰(Tryptic Soy Broth (TSB))(20% 최종 농도)와 혼합될 때 유백색이고, 점도가 25-50 cps(30 rpm에서의 브룩필드 LV 점도측정계, spindle #18)이며, 8마이크론 이하의 오일상 소적 80% 이상을 포함한다. Pluronic^®은 산화에틸렌과 산화프로필렌의 블록 공중합체에 대한 BASF 코포레이션의 등록 상표이고, 숫자 L121은 이의 등급을 표시한다.

면역보강제 시스템의 면역학적 자극량은 항체 반응 유도제, CMI 유도제, 에를리키아 캐니스 박테린 성분, 잠재적 감염 노출의 정도, 백신 조성물의 투여 방법, 개의 성장 단계 및 크기 등에 따라 다를 수 있다. 게다가, 면역보강제 시스템의 면역학적 자극량은 면역화제 - 에를리키아 캐니스 박테린에 대한 면역반응을 증강시키기에 충분한 양이다. 일반적으로, 약 1 내지 6 %부피/부피, 바람직하게는 약 4 %부피/부피의 양의 항체 반응 유도제 및 약 3 내지 7 %부피/부피, 바람직하게는 약 5 %부피/부피의 양의 CMI 유도제가 적합하다.

본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합한 약리학적으로 허용가능한 담체는 수의학적 약학 조성물에 적합한 임의의 통상의 액상 담체일 수 있고, 바람직하게는 조직 배양 배지에 사용하기에 적합한 것과 같은 균형잡힌 염 용액이다.

활성 성분으로서 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린 외에, 본 발명의 백신 조성물이 광견병 바이러스, 라임병(Lime disease)(보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 개 홍역 바이러스, 개 파르보바이러스(parvovirus), 개 아데노바이러스(adenovirus), 개 코로나(corona) 바이러스, 편모충증(Giardia)에 대해 유도된 항독성 성분; 세로바르스 캐니콜라(serovars canicola), 익테로해모리지애(icterohaemorrhagiae), 포모나(pomona), 그립포티포사(grippotyphosa) 또는 브래티슬라바(bratislava) 등과 같은 렙토스피라 인테로갠스(leptospira interrogans), 또는 이들의 조합물과 같은 다른 활성 성분을 함유할 수도 있다는 것을 생각할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린 성분은 문헌(Nature, 1974, 252, 252-254 or Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13)에 기재된 것과 같은 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린 성분은 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질 등 또는 이들의 조합물과 같은 적절한 생물학적 화합물에 컨쥬게이션시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 투여를 용이하게 하고 투여량의 균일성을 보장하기 위해 투약 유니트 제형으로 제제화될 수 있다. 본 명세서에서, 백신 조성물에 적합한 투약 유니트는 동물에 대한 단위 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유니트를 말하며, 각 유니트는 필요한 면역보강제 시스템 및 담체 또는 비히클과 함께 원하는 면역학적 효과를 나타내도록 계산된 에를리키아 캐니스 박테린의 예정된 양을 함유한다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구, 예를 들어 근육내, 피하, 복강내, 피내 등, 바람직하게는 피하 또는 근육내, 보다 바람직하게는 피하로 투여될 수 있거나, 상기 조성물은 경구 또는 비강내로 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명은 개에서 개 에를리히아증을 예방하거나 개선시키는 방법으로서, 상기 안전하고 효과적인 백신 조성물을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함하는 방법 또한 제공한다.

바람직한 실시에서, 본 발명의 백신 조성물은 에를리키아 캐니스 박테린의 담체에의 잠재적 노출시 결정되는 스케쥴에 따른 유효량으로 비경구, 경구 또는 비강내, 바람직하게는 비경구, 보다 바람직하게는 피하 투여된다. 이러한 방식으로, 치료받은 동물은 자연 노출 전에 면역성을 구축하기 위한 시간을 가질 수 있다. 예를 들어, 전형적인 치료 스케쥴은 잠재적 노출 5주 이상 전에 비경구 투여, 바람직하게는 피하 주사를 포함할 수 있다. 2회 이상의 투여, 예컨대 치료받은 동물의 잠재적 노출 약 5주 전에 첫 번째 투여, 약 2주 전에 두 번째 투여가 바람직하다.

에를리키아 캐니스 박테린의 독성 메카니즘 및 숙주 개의 방어 메카니즘을 효과적으로 연구하고 평가하여 백신 분야를 발전시키고 백신 조성물을 개선시키기 위해, 효과적인 챌린지 모델을 만들어야 한다. 개 에를리히아증에 대한 다양한 챌린지 모델이 공지되어 있다 하더라도, 높은 비율의 시험 동물이 개 에를리히아증과 통상적으로 관련되어 있는 지속적이고 심각한 임상 증상, 예컨대 점액농성 안루, 탈수 등을 입증하게 하는 데 효과적인 챌린지 모델은 없다. 따라서, 보다 우수하고 보다 일관되게 효과적인 챌린지 모델이 백신 및 약물의 평가, 및 에를리키아 캐니스 박테린 및 이에 의해 야기되는 질환의 연구를 위해 필요하다.

놀랍게도, 에를리키아 캐니스 생박테리아의 독성 배양물을 함유하는 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 챌린지 스톡(stock)을 시험 동물에게 투여함으로써 상기 시험 동물에서 특히 효과적인 에를리키아 캐니스 챌린지를 얻을 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다. 독성 에를리키아 캐니스 배양물은 에를리키아 캐니스 에보니, 에를리키아 캐니스 브로드풋 등과 같은 에를리키아 캐니스 미생물, 바람직하게는 에를리키아 캐니스 에보니를 숙주에서 반복적으로 계대배양하는 단계; PBMC를 숙주 혈액 샘플로부터 분리하는 단계; 및 분리된 PBMC를 20% 태아 소 혈청 및 10% 디메틸 술폭사이드와 혼합하는 단계에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명은 시험 동물에서 임상적 개 에를리히아증을 유도하는 방법으로서, 말초혈 단핵 세포 내의 독성 에를리키아 캐니스 미생물을 본질적으로 포함하는 유효량의 에를리키아 캐니스 챌린지 스톡을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법 또한 제공한다. 에를리키아 캐니스 브로드풋(종종 에를리키아 캐니스 BF 또는 브로드풋으로서 지칭됨), 및 에를리키아 캐니스 에보니(종종 에보니로서 지칭됨) 각각의 생존가능한 배양물을 (특허 과정의 목적을 위한 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 조항 및 요건 하에)ATCC에 기탁하였고(2004년 2월 11일), 브로드풋 균주에 대해서는 ATCC 수탁 번호 PTA-5811을, 그리고 에보니 균주에 대해서는 PTA-5812를 부여받았다.

실제 실시에서, 에를리키아 캐니스 미생물의 독성은 숙주 동물에서 반복된 계대배양에 의해 증가된다. 숙주로부터 얻은 전혈 샘플을 히스토파크^®(Histopoque^®) 1077과 같은 구배 배지 상에 위치시키고, 원심분리하여 PBMC 층을 분리한다. 이로써 수득한 PBMC를 20% 태아 소 혈청 및 10% 디메틸 술폭사이드와 혼합하고 저장을 위해 액체 질소에서 동결시켜 챌린지 스톡의 일관되고 연속적인 공급을 제공한다. 이 챌린지 스톡은 시험 동물에게 투여하기 전에 완충제 식염수로 희석할 수 있다. 투여는 피하, 근육내, 피내 등과 같은 임의의 통상적인 접종 경로로 할 수 있고, 가장 바람직하게는 피하 투여로 할 수 있다.

본 발명의 보다 명확한 이해를 위해, 하기 실시예를 아래에 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시적인 것이고 본 발명의 범위 또는 기초 원리를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 사실상, 본 명세서에 나타내고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형이 하기 실시예 및 상기 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 변형 또한 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것이다.

달리 명시하지 않는 한, 모든 부(part)는 중량부이다.

실시예 1

독성 에를리키아 캐니스 챌린지 모델의 평가

A. 챌린지 스톡의 제조

에를리키아 캐니스 에보니 균주 생박테리아를 개에서 반복적으로 계대배양하였다. 감염된 개로부터 얻은 전혈 샘플을 2500xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 담황갈색 코트를 모아 인산염 완충 용액(PBS)으로 희석한 후, 히스토파크^® 1077 상에 적층시키고, 적층된 물질을 400xg에서 45분 동안 원심분리하였다. PBMC를 모아 PBS로 세정하였다. 세정된 PBMC를 20% 태아 소 혈청 및 10% 디메틸 술폭사이드와 혼합하고 액체 질소에서 동결시켰다. 사용하기 전, 1:3 또는 1:4의 챌린지 스톡 : 완충된 식염수의 최종 희석비까지 챌린지 스톡을 완충된 식염수로 희석하였다.

B. 챌린지 방법

이 평가에서, 8 내지 12개월의 연령에 있는 20마리 개를 2개 군으로 무작위로 나누었다. 피하 경로를 통해 상기 개들을 1 ㎖의 희석된 챌린지 스톡으로 챌린지시켰다. 한 군은 1:3 희석의 챌린지 스톡으로 챌린지시키고, 남은 군은 1:4 희석의 챌린지 스톡으로 챌린지시켰다. 챌린지 후, 개들을 관찰하였고, 혈액 샘플을 주당 3x 채취하여 총 56일 동안 혈소판감소증을 비롯한 질환의 임상적 증상을 모니터링하였다.

C. 관찰

관찰된 임상적 증상에는 점액농성 비루 및 안루, 우울증, 탈수, 림프절병증 및 각막 부종이 포함된다. 점액농성 안루 및 탈수는 관찰된 가장 흔한 증상이다. 점액농성 안루 및 탈수는 질환 진행에 특이적이고, 질환의 심각도를 간접적으로 반영한다. 각각의 임상적 증상에 대한 관찰 시점 당 하나의 발생을 기록하고, 군 사이의 총 발생을 비교하였다. 관찰 시점 중, 53%(1:3 희석) 및 35%(1:4 희석)는 점액농성 안루를 보였고, 44%(1:3 희석) 및 30%(1:4)는 탈수를 보였다.

상당히 높은 사망률 또한 이 평가에서 관찰되었다. 사망의 유도는 챌린지 스톡에서 사용된 에를리키아 캐니스 박테린의 강력한 병인(pathogenesis)의 가장 현저한 표시이다. 1:3 희석 치료의 경우, 100%의 개가 에를리히아증의 케이스 정의를 충족시켰고, 1:4 희석 치료의 경우, 80%가 에를리히아증의 케이스 정의를 충족시켰다. 데이타는 표 I에 기재되어 있다.

직장 온도를 에를리히아 감염의 지표로서 기록하였다. 감염된 개들의 대부분이 상승된 직장 온도의 일부 발생을 가졌다. 데이타는 표 II에 기재되어 있다.

혈소판감소증(200,000/㎕ 미만의 혈소판 수)을 챌린지로부터 약 12주 후에 시작되어 나머지 관찰 기간 전체에 관찰하였다. 데이타는 표 III에 기재되어 있다.

D. 결론

상기 챌린지 모델은 개에서 개 에를리히아증의 심각한 임상적 증상을 나타내었고, 추가 연구 및 이에 대한 치료의 평가에서 사용하기 위한 에를리히아증 질환의 케이스 정의를 제공하였다. 개 에를리히아증의 임상적 케이스 정의는 점액농성 안루가 3일 이상 연속적으로 관찰된 시기 및 탈수가 3일 이상 연속적으로 관찰된 시기에서 사망에 의해 정의될 것이다.

희석	임상적 증상	연속 3일 동안 증상을 가진 동물의 수	연속 3일 동안 증상을 가진 동물의 %	임상적 증상의 평균 지속시간	항목별로 기재한 임상적 증상의 총 발생
1:3	점액농성 비루	1/10	10%	0.5일	5
1:3	점액농성 안루^*	7/10	70%	4.8일	48
1:3	우울증	2/10	20%	1.1일	11
1:3	탈수^*	6/10	60%	4.0일	40
1:3	림프절병증	0	0	0	0
1:3	각막 부종	1/10	10%	1.2일	12
1:3	사망^*	9/10	90%
1:4	점액농성 비루	0	0	0.1일	1
1:4	점액농성 안루^*	7/10	70%	3.8일	40
1:4	우울증	0	0	0.7일	7
1:4	탈수^*	5/10	50%	3.4일	34
1:4	림프절병증	0	0	0	0
1:4	각막 부종	1/10	10%	0.5일	5
1:4	사망^*	4/10	40%		NA
* 증상은 에를리히아증의 케이스 정의에 포함된다.

실시예 2

BCG 면역보강 에를리키아 캐니스 박테린에 의해 유도된 효능의 평가

BCG 즉, 약독화된 마이코박테리움 보비스의 멸균 제제는 세포-매개 면역(CMI)의 강력한 유도제로서 인식되어 있다. 상승작용적 CMI 효과를 측정하기 위해, 다양한 농도 수준에서 에를리키아 캐니스 박테린을 BCG로 면역보강시켰다. 종래 연구는 통상적인 (항체 반응 유도) 개 면역보강제(예컨대, EMA 및 Neocryl^®)로만 면역보강된 에를리키아 캐니스 박테린이 보다 덜 강력한 보호 면역을 유도할 수만 있다는 것을 입증하였다.

A. 재료 및 방법

각각 7마리의 개로 구성된 3개의 백신화 군, 및 6마리의 개로 구성된 대조군을 사용하였다. 백신은 하기 면역보강제의 조합으로 면역보강된 에를리키아 캐니스 에보니 균주 박테린 5 로그(log) TCID₅₀(활성화 전 역가)을 함유하였다. 백신 A는 보렐리아 부르그도페리 박테린(BBB) 및 EMA/Neocryl^®을 함유하였다. 백신 B는 보렐리아 부르그도페리 박테린(BBB), EMA/Neocryl^® 및 100 ㎍/투약의 BCG를 함유하였다. 백신 C는 보렐리아 부르그도페리 박테린(BBB), EMA/Neocryl^® 및 1.0 ㎎/투약의 BCG를 함유하였다. 상기 3가지 백신의 다른 조성물은 동일하였다. 대조군 개는 백신화하지 않았다.

27마리 개를 4개 군으로 무작위적으로 나누었다. 각각 7마리의 개로 구성된 첫번째 3개 군은 21일의 간격으로 피하 경로를 통해 백신 A, B 또는 C로 2회 백신화시켰다. 6마리의 개로 구성된 4번째 군은 대조군으로서 작용하였고 백신화하지 않았다. 제2 백신화로부터 16일 후, 모든 개를 독성 이. 캐니스로 챌린지시키고, 총 56일 동안 임상적 증상, 직장 온도 및 혈소판 수의 변화에 대해 관찰하였다.

B. 결과 및 논의

결과는 표 IV에 요약되어 있다. 독성 이. 캐니스 챌린지로부터 56일 후, 7마리의 개 중 4마리의 개(57%)는 백신 A 접종 군에서 혈소판감소증 및 높은 직장 온도를 나타내었다. 동일한 결과를 백신 B 접종 군에서 관찰하였다. 백신 C 군 중의 개 중에서, 7마리의 백신화된 개들 중 단지 2마리의 개(28.5%)는 본 연구 동안 혈소판감소증 및 높은 직장 온도를 나타내었다. 6마리의 대조군 개들 중 5마리의 개(83%)는 혈소판감소증 및 높은 직장 온도를 나타내었다. 각 군의 임상적 증상은 혼합되어 있었고, 군 사이에 차이가 없었다. 체온 및 혈소판 수의 변화는 이. 캐니스 감염 및 에를리히아증의 전형적인 증상이었다.

군	백신 성분	혈소판감소증을 가진 개의 수	온도 상승을 가진 개의 수
백신 A	이. 캐니스 박테린 + BBB¹ + EMA²/Neocryl^® A640³	7마리의 개들 중 4마리(57%)	7마리의 개들 중 4마리(57%)
백신 B	이. 캐니스 박테린 + BBB + EMA/Neocryl^® A640 + 100 ㎍/투약의 BCG⁴	7마리의 개들 중 4마리(57%)	7마리의 개들 중 4마리(57%)
백신 C	이. 캐니스 박테린 + BBB + EMA/Neocryl^® A640 + 1.0 ㎎/투약의 BCG	7마리의 개들 중 2마리(28.5%)	7마리의 개들 중 2마리(28.5%)
대조구	없음	6마리의 개들 중 5마리(83%)	6마리의 개들 중 5마리(83%)

¹BBB = 포트 도지 애니멀 헬스(Fort Dodge Animal Health) 제조 시리얼 출처의 보렐리아 부르그도페리 박테린.

² 몬산토 코포레이션(Monsanto Co.; St. Louis, MO)에 의해 제조됨.

³ 아베시아 네오 레시우스(AVECIA Neo Resius; Frankfort, IN)에 의해 제조됨.

⁴ BCG = 칼바이오켐(Calbiochem; La Jolla, CA) 출처의 약독화된 마이코박테리움 보비스인 바실 칼메뜨-게랭.

본 연구로부터 얻은 결과는 통상적인 (항체 반응 유도) 면역보강제(EMA+Neocryl^®)로만 면역보강된 백신은 보호성을 나타내지 못한다는 것을 명백히 보였다. 백신을 100 ㎍/투약과 같은 보다 낮은 투여량으로 면역보강시켰을 때에도 상기와 같은 결과가 얻어졌다. 그러나, 백신은 1 ㎎/투약의 BCG로 면역보강되었을 때 보호성을 가지게 된다. 따라서, 면역 반응을 증강시키기에 충분한 농도의 CMI 유도제 즉, BCG에 의해 유도된 보호 면역은 이. 캐니스 박테린 백신 효능이라는 결과를 얻게 한다.

C. 결론

CMI는 이. 캐니스 감염으로부터 개를 보호하는 데 필요하다. 통상적인 개 면역보강제로만 면역보강된 이. 캐니스 박테린은 생체 내에서 보호 면역을 유도시키는 데 효과적이지 않다.

실시예 3

불활성화된 이. 캐니스 백신 조성물의 제조

5% 내지 7%의 태아 소 혈청, 2% 글루코스 및 2 mmole 글루타민으로 보충된 RPMI1640을 함유하는 배지에 의해 유지되는 DH82 세포에서 이. 캐니스 박테린의 2가지 균주 즉, 에보니 및 브로드풋 각각을 5 내지 14일 동안 배양하였다. 얻은 배양물을 ≥ 1x10⁴ TCID₅₀의 역가에서 회수하였다. 회수물은 적정하고, 용해시킨 후, 0.1% 포르말린 용액을 첨가하고 24-48시간의 기간 동안 36°± 2C에서 인큐베이션하고 0.1% 포르말린의 일부를 또 첨가하고 24-48시간 동안 36°± C에서 두 번째로 인큐베이션함으로써 불활성화시켰다. 이. 캐니스의 상기 2가지 불활성화된 균주를 1x10^4.5 TCID₅₀의 동등한 투여량에서 하기 면역보강제 시스템과 블렌딩하여 백신 조성물 A를 수득하였다.

백신 조성물 A

성분 설명	㎖ 당 양
불활성화된 이. 캐니스, 에보니 불활성화된 이. 캐니스, 브로드풋 EMA¹-31 NEOCRYL^®2 A-640 Emulsigen^®3 SA MEM⁴	1X10⁴ ^.5 TCID₅₀ 1X10⁴ ^.5 TCID₅₀ 1 %부피/부피 3 %부피/부피 5 %부피/부피 100%까지 QS
¹ 몬산토 코포레이션(St. Louis, MO)에 의해 제조됨. ² 아베시아 네오 레시우스(Frankfort, IN)에 의해 제조됨. ³ MVP 레보레이토리스 인코포레이티드(Ralston, NE)에 의해 제조됨. ⁴ LTI(Grand Island, NY)에 의해 제조된 최소 필수 배지(MEM)

실시예 4

이. 캐니스 백신 조성물 A에 의해 유도된 면역의 12개월 지속기간의 평가

이 평가에서, 15주 내지 16주 연령의 비이글(beagle)들을 2개의 군 즉, 15마리의 개로 구성된 대조군(백신화되지 않은 군)과 27마리의 개로 구성된 백신화된 군으로 나누었다. 백신화된 군은 21일의 간격으로 실시예 3에서 기재된 백신 조성물 A 1 ㎖를 2회 투약받았다. 백신화로부터 12개월 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 이. 캐니스에 의해 감염된 말초혈 단핵 세포(pmbc)의 확립된 동결 챌린지 풀(pool)의 1:3 희석물로 모든 시험 동물을 피하 경로로 챌린지시켰다. 시험 동물은 챌린지로부터 12일 후(DPC) 시작하여 주당 3x 관찰하였다. 동물 복지 및 동물 보호와 이용 위원회(IACUC)의 지침서에 따라, 죽어가거나 신체 상태가 약한 임의의 시험 동물은 주(state)로부터 면허를 받은 수의사가 세밀히 검사하였다.

백신화 후 면역 반응을 정량하기 위해 K-ELISA를 이용하여 이. 캐니스 항체에 대해 혈청 샘플을 평가하였다. 혈청 샘플을 이. 캐니스 전체 세포 추출 단백질로 코팅된 웰에 2회씩 첨가하였다. 이어서, 퍼록시다제-컨쥬게이션된 염소 항-개 면역글로불린(IgG)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 36°±2℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 컨쥬게이트를 제거한 후, ATBS 치환 시스템을 이용하여 플레이트를 현상시켰다. 플레이트를 동적 모드를 이용하여 35-초 간격으로 20분 동안 405-490㎛에서 판독하였다. 혈청학적 결과를 표 V에 기재하였는데, 여기서 DPVI는 백신의 첫 번째 투약 후의 날짜 수를 표시하고; DPV2는 백신의 두 번째 투약 후의 날짜 수를 표시하고; MPV2는 백신의 두 번째 투약 후의 달 수를 표시하며; DPC는 챌린지 후의 날짜 수를 표시한다.

관찰

표 V의 혈청학적 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 백신화 군은 대조군(백신화되지 않은 군)보다 항체에서의 상당한 증가를 보였다. 백신화 군과 대조군 사이의 항체에서의 상당한 차이 또한 챌린지 후에 관찰되었다. 혈청학적 데이타 외에, 헤마토그리트(hematocrit) 값, 혈소판 수, 직장 온도 및 주당 체중을 기록하였다. 헤마토크리트 백분율은 대조군과 비교할 때 백신화 군에서 상당히 더 낮아졌다. 혈소판 수는 챌린지 후 44일까지 대조군과 비교할 때 백신화 군에서 상당히 더 낮아졌다. 체중 감소는 대조군과 비교할 때 백신화 군에서 상당히 적었다. 대조군에서, 87%는 사망을 비롯한 개 에를리히아증에 대한 케이스 정의를 충족시켰다. 백신화 군에서, 44%는 56-일간의 임상 관찰 기간 동안 개 에를리히아증에 대한 케이스 정의를 충족시켰다.

결론

실시예 3의 이. 캐니스 백신 조성물은 개에서 임상적 개 에를리히아증을 상당히 감소시켰다. 상기 백신 1 ㎖의 2회 투약은 12개월 이상의 기간에 걸쳐 면역을 유도하였다. 개에서 이. 캐니스에 대한 항체에서의 상당한 증가는 실시예 3의 백신 조성물의 투여에 의해 얻어졌다.

실시예 5

불활성화된 이. 캐니스 백신에 대한 반응에서 세포-매개 면역의 평가

개 IL-12 및 IFN-γ 엘리스팟(Elispot) 분석시험은 에를리키아 캐니스(이. 캐니스) 박테린으로 백신화된 개에서의 IL-12 및 IFN-γ의 농도를 평가하는 데 이용하였다. 대조군 개와의 비교에 있어서, 백신화된 개로부터 단리된 말초혈 단핵 세포에 의해 생성된 보다 많은 수의 IL-12 및 IFN-γ 스팟(spot)은 CMI 반응이 이. 캐니스 감염에 대한 보호에서 어떤 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.

A. 재료 및 방법

개로 구성된 2개의 군 즉, 이. 캐니스 박테린을 제공받은 백신화 군과, 상기 박테린을 제공받지 못한 대조군을 본 연구에 이용하였다. 이. 캐니스 박테린을 사용한 첫 번째 백신화 후 백신화된 개 및 대조군 개로부터 전혈을 채취하였다. 대조군 개 및 백신화된 개로부터 얻은 전혈 샘플은 멸균된 정맥천자(venipuncture)를 통해 10 ㎖ EDTA 튜브 내로 모았다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 퍼콜(Percoll) 구배 상에서의 원심분리로 단리하였다. 단리 후, PBMC의 수를 세고, 세포 농도를 각 샘플에 대하여 측정하였다. 이어서, 단리된 PBMC를 엘리스팟 분석시험에서 즉시 사용하였다.

개 PBMC를 배양하는 데 사용되는 완전 배양 배지는 동일한 부피의 Aim V(Invitrogen, Carlsbad, CA; Cat. # 12055-083) 및 Ex-Cell(JRH Biosciences, Lenexa, KS; Cat. # 141610-500M), 10% 열 불활성화 말 혈청(Hyclone, Logan, UT; Cat. # SH30074.03) 및 10 ㎍/㎖의 젠타마이신으로 구성되어 있었다.

엘리스팟 분석시험

엘리스팟 플레이트의 준비

IL -12 플레이트

임모빌론(Immobilon) P 플레이트(Millipore, Burlington, MA)를 70% 메탄올로 미리 적시고, 둘베코-보그트(Dulbecco-Vogt) 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세정하고, 마우스 항-인간 IL-12 항체(10 ㎍/㎖; Mabtech, Sweden) 100 ㎕/웰로 코팅하고, 탄산염 완충제(pH 9.6)로 희석하고, 37℃, 5±2% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 DPBS + 0.1% Tween 20으로 세정하고, 36℃, 5±2% CO₂에서 최소 2시간 동안 완전 Aim V/ExCell로 블로킹하였다.

IFN -γ 플레이트

개 IFN-γ 검출용 엘리스팟 플레이트를 개 IL-12 플레이트와 유사한 방식으로 개 IFN-γ에 특이적인 항체를 사용하여 준비하였다. 본 연구에 사용된 플레이트는 R&D 시스템(미네아폴리스, MN; Cat. # EL781)으로부터 구입하였고 제조자의 지시에 따라 준비하였다. 이들 플레이트는 항-개 IFN-γ 폴리클로날 항체로 미리 코팅시켰다.

항원의 준비

6가지 상이한 세포 제제를 항원으로서 먼저 사용하여 IL-12 및 IFN-γ 생성을 자극시켰다. 이들에는

1. 살아있는 이. 캐니스에 의해 감염된 DH82 세포;

2. 이. 캐니스에 의해 감염된 DH82 세포 용해물(세포는 균질화로 용해시켰음);

3. 포르말린 처리에 의해 불활성화된, 이. 캐니스에 의해 감염된 DH82 세포 용해물;

4. 감염되지 않은 살아있는 DH82 세포 단독;

5. 감염되지 않은 DH82 세포 용해물; 및

6. 포르말린 처리에 의해 불활성화된, 감염되지 않은 DH82 세포 용해물

이 포함된다.

첫 번재 3가지 제제를 사용하여 IL-12 및 IFN-γ 생성을 자극시켰다. 두 번째 3가지 제제를 본 시험에서 음성 대조군으로 사용하였다. 분석시험 당일, 살아있는 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포 및 감염되지 않은 DH82 세포를 모아 그 수를 세고, 세포 농도를 측정하였다. 원하는 수의 생존 세포 및 등가의 세포 수의 세포 용해물(포르말린으로 처리되거나 처리되지 않음)을 완전 Aim V/Excell 배양 배지에 재현탁시키고 본 분석시험에 적용하였다. 미토겐 콘카나발린(Concanavalin) A(Con A) 시그마 카달로그 # C0412 및 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)(PHA)로부터 얻은 렉틴 시그마 카달로그 # L-4144를 상기 완전 배양 배지 중에서 준비하고 본 분석시험용 양성 대조군으로서 사용하였다.

이. 캐니스와 PBMC 의 인큐베이션

2시간 배지 블로킹 후, 항체 코팅 플레이트를 둘베코스 인산염-완충 식염수(DPBS) + 0.1% Tween 20으로 세정하였다. 살아있는 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포, 감염되지 않은 DH82 세포, 세포 용해물, 배지 및 양성 대조구를 적절히 희석한 상태로 웰당 150 ㎕의 부피로 항체 코팅 웰에 첨가하였다. 상기 완전 배양 배지에서 원하는 세포 농도까지 희석시킨 희석된 PBMC 및 50 ㎕/웰의 세포 배양물을 적절한 웰 내에 첨가하였다. 이어서, 상기 플레이트를 36℃±2℃, 5±2% CO₂에서 수행되는 분석시험에 따라 20 내지 50시간 동안 인큐베이션하였다.

플레이트 현상

IL -12 플레이트

인큐베이션 후, 세포를 DPBS + 0.1% Tween 20으로 세정하여 제거하였다. 바이오티닐화 검출 항체(Mabtech, Sweden; Cat. #3450-6)를 1.0 ㎍/㎖에서 DPBS + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 희석하고, 사용하기 전에 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다. 100 ㎕의 검출 항체를 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 36℃±2℃, 5±2% CO₂에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체를 제거하고, 플레이트를 DPBS + 0.1% Tween으로 세정하였다. 플레이트를 DPBS + 0.1% Tween 20 중에서 1:1000으로 희석된 100 ㎕/웰 스트렙토아비딘(StreptAvidin)-HRP(KPL, Gaithersburg, MD; Cat. # 14-30-00)과 36℃, 5±2% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 동안, 기질 용액을 제조하였다. 20 ㎎ AEC(3-아미노-9-에틸-카르바졸, Sigma, St. Louis, MO; Cat. # D4254) 1정을 유리 삼각 플라스크 내의 2 ㎖ N,N-디메틸포름아미드(DNF)에 용해시켰다. 일단 용해되면, 58 ㎖의 0.1 M 아세트산나트륨(pH 5.0) 및 30 ㎕ 과산화수소(H₂O₂)를 상기 기질 용액에 첨가한 후, 사용하기 전에 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.

플레이트를 DPBS + 0.1% Tween 20으로 세정한 후, DPBS만으로 세정하여 잔류 세제를 제거하였다. 100 ㎕의 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 최대 20분 동안 인큐베이션하였다. 기질 용액을 제거하고 증류수로 린싱함으로써 반응을 중단시켰다. 플레이트를 실온에서 건조하고, KS ELISPOT 4.4 소프트웨를 갖춘 짜이스(Zeiss) 엘리스팟 판독기(Carl Zeiss Vision, Oberkochen, Germany)를 이용하여 점-생성 유니트(SPC)를 양, 면적 및 강도에 대하여 평가하였다.

IFN -γ 플레이트

인큐베이션 후, 세정 완충제(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용한 세정으로 세포를 제거하였다. 제조자의 지시에 따라 바이오티닐화 검출 항체를 희석 완충제 1(R&D System, Minneapolis, MN) 중에서 희석하고, 사용하기 전에 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 검출 항체 100 ㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 36℃±2℃, 5±2% CO₂에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체를 제거하고, 플레이트를 세정 완충제로 세정하였다. 플레이트를 제조자(R&D System, Minneapolis, MN)의 지시에 따라 희석된 100 ㎕/웰의 스트렙트아비딘-AP와 36℃±2℃, 5±2% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

스트렙트아비딘-AP와의 인큐베이션 후, 플레이트를 세정 완충제로 세정하고 실온에서 웰 당 100 ㎕의 BCIP/NBT(R&D System, Minneapolis, MN)와 20분 동안 인큐베이션하였다. 기질 용액을 제거하고 플레이트를 증류수로 린싱하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 실온에서 건조하고, KS ELISPOT 4.4 소프트웨를 갖춘 짜이스 엘리스팟 판독기(Carl Zeiss Vision, Oberkochen, Germany)를 이용하여 스팟-생성 유니트(SPC)를 양, 면적 및 강도에 대하여 평가하였다.

데이타 분석

결과는 스팟-형성 세포(SFC)로서 판독하여 실험의 성질에 따라 상이하게 표현하였다. 데이타를 제시하는 3가지 가능한 방법이 있다: 각 웰에서의 스팟의 본래 수, 각 샘플에 있어서 각 처리에 대한 스팟의 평균 수 및 자극 지수(Stimulus Index). 자극 지수는 자극받지 않은 웰(세포 + 배양 배지만 있는 웰)에서의 스팟의 평균 수를 자극받은 웰에서의 스팟의 평균 수로 나누어 계산하였다.

B. 결과 및 해석

본 평가는 이. 캐니스 백신화 개로부터 단리된 PBMC에서의 IL-12 및 IFN-γ 분비 세포의 수를 평가하기 위해 수행하였다.

본 실험에서, 1마리의 대조구 개 및 3마리의 백신화된 개를 사용하였다. 본 실험의 결과는 표 VI 및 VII에 기재되어 있다. 표 VI로부터, 데이타는 대조구 개로부터 얻은 PBMC에 의해서는 전혀 생성되지 않는다는 것과 비교할 때 살아있는 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포만이 3마리의 백신화된 개의 PBMC에서 IL-12 생성을 자극하였음을 나타낸다. 자극은 1:1000 희석에서보다 이. 캐니스 스톡의 1:10 희석(1x10⁴ 세포/웰과 동등함)에서 가장 많은 수의 스팟을 가지면서 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포에 투여량 의존적이기도 하다. 포르말린 처리를 하거나 하지 않은 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포 용해물, 살아있는 감염되지 않은 DH82 세포, 감염되지 않은 DH82 세포 용해물, 및 포르말린으로 처리된 DH82 세포 용해물은 임의의 검출가능한 IL-12 반응을 나타내지 못했다. 백신화된 개들 중 2마리는 제3의 백신화된 개보다 더 높은 정도로 반응하였다. 대조구 개는 양성 미토겐(PHA)에 대한 낮은 반응을 제외하고는 임의의 자극에 대한 반응을 나타내지 못하였다.

표 VII은 동일한 4마리의 개들에 대한 IFN-γ 엘리스팟의 결과를 보인다. IL-12와 유사하게, 살아있는 이. 캐니스 DH82 세포는 모든 3마리의 백신화된 개에서 IFN-γ 스팟의 가장 높은 유도를 보였다. 상기 유도는 1:10 희석에서 가장 높은 수준으로 존재하고 1:1000 희석에서 가장 낮은 수준으로 존재하면서 이. 캐니스 세포 수에도 의존한다. 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포 용해물은 백신화된 개의 경우 스팟의 수를 보다 더 낮추었다. 포르말린으로 처리된 용해물은 1:1000 희석에서 백그라운드(background)를 나타내었지만, 1:10 또는 1:100 희석에서는 스팟을 전혀 나타내지 않았다. 이는 단핵 세포 활성에 대한 잔류 포르말린의 억제 효과로 인한 것일 수 있다. 모든 3가지 제제의 경우에서 감염되지 않은 DH82 세포는 살아있는 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포에 비하여 백그라운드 스팟팅(spotting)만을 생성시켰다. 개개의 개 반응은 IL-12 엘리스팟 상에서 관찰된 것과 유사하였다. 동일한 2마리의 백신화된 개는 제3의 개보다 더 높은 반응을 보였고, 대조구 개는 미토겐(Con A) 자극 단독에 대한 낮은 반응을 나타내었다.

본 실험의 결과는 살아있는 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포만이 PBMC에 의한 IL-12 및 IFN-γ 생성 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 이. 캐니스로 감염된 DH82 세포 용해물 또는 포르말린으로 처리된 용해물은 세포 활성에 대한 T 세포 또는 단핵구의 낮은 자극 효과 때문에 사용될 수 없다.

C. 요약

하기 표 VI 및 VII에 기재된 데이타는 CMI가 이. 캐니스 박테린으로 백신화된 개의 보호에서 어떤 역할을 할 수 있다는 것을 입증한다. 백신화된 개에 대한 IL-12 및 IFN-γ 스팟의 증가된 수는 T 세포 및 단핵구의 활성을 나타낸다.

Claims

유효 면역화 양의 불활성화된 에를리키아 캐니스(Ehrlichia canis) 박테린; 약리학적으로 허용가능한 담체; 및 항체 반응 유도제 및 세포-매개 면역 반응 유도제를 본질적으로 포함하는 면역학적 자극량의 면역보강제(adjuvant) 시스템을 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 불활성화된 박테린은 에보니(Ebony), 플로리다(Florida), 이스라엘 611, 고가시마(Kogashima) 1, 루이지아나(Louisiana), 오클라호마(Oklahoma), 베네주엘라(Venezuela), 노쓰 캐롤라이나 주립 대학(NCSU) 균주 제이크(Jake), NCSU 단리물 데몬(Demon), DJ 및 퍼지(Fuzzy)로서 명명된 1 이상의 에를리키아 캐니스 균주, 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 세포주, 및 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 DH82 세포주로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 불활성화된 박테린은 에를리키아 캐니스 에보니, 에를리키아 캐니스 브로드풋 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체 반응 유도제는 에틸렌 말레산 무수물; 스티렌화 아크 릴 공중합체; 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 세포-매개 면역 반응 유도제는 수중유 에멀젼; Th-1-관련 사이토카인; 약독화된 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis); 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 불활성화 박테린은 단위 투여량 당 1×10⁴ TCID₅₀ 이상을 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 항체 반응 유도제는 에틸렌 말레산 무수물과 스티렌화 아크릴 공중합체의 혼합물이고, 약 1 %부피/부피의 에틸렌 말레산 무수물 및 약 3 %부피/부피의 스티렌화 아크릴 공중합체의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 수중유 에멀젼은 수중 파라핀유 에멀젼; 스쿠알란, 및 산화에틸렌과 산화프로필렌으로 된 블록 공중합체를 포함하는 조성물; 신텍스 면역보강제 제제-1(Syntex Adjuvant Formulation-1); 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 Th1-관련 사이토카인은 인터루킨-12; 인터루킨-18; 감 마 인터페론; 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세포-매개 면역 반응 유도제는 수중유 에멀젼이고 약 3 내지 7 %부피/부피의 범위 내에 존재하는 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세포-매개 면역 반응 유도제는 수중유 에멀젼이고 약 5 %부피/부피의 양으로 존재하는 것인 조성물.
개에서 개 에를리히아증(ehrlichiosis)을 예방하거나 개선시키는 방법으로서, 유효 면역화 양의 불활성화된 에를리키아 캐니스 박테린; 약리학적으로 허용가능한 담체; 및 항체 반응 유도제 및 세포-매개 면역 반응 유도제를 본질적으로 포함하는 면역학적 자극량의 면역보강제 시스템을 포함하는 백신 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 불활성화된 박테린이 에보니, 플로리다, 이스라엘 611, 고가시마 1, 루이지아나, 오클라호마, 베네주엘라, 노쓰 캐롤라이나 주립 대학(NCSU) 균주 제이크, NCSU 단리물 데몬, DJ 및 퍼지로서 명명된 1 이상의 에를리키아 캐니스 균주, 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 세포주, 및 상기 명명된 균주들 중 임의의 균주를 가진 에를리키아 캐니스 감염 DH82 세포주로 구성된 군으로부터 선택된 것인 백신 조성물을 가지는 방법.
제12항에 있어서, 상기 불활성화된 박테린이 에를리키아 캐니스 에보니 또는 에를리키아 캐니스 브로드풋 또는 이들의 혼합물인 백신 조성물을 가지는 방법.
제12항에 있어서, 항체 반응 유도제가 에틸렌 말레산 무수물과 스티렌화 아크릴 공중합체의 혼합물인 백신 조성물을 가지는 방법.
제12항에 있어서, 세포-매개 면역 반응 유도제가 수중 파라핀유 에멀젼; 스쿠알란, 및 산화에틸렌과 산화프로필렌으로 된 블록 공중합체를 포함하는 조성물; 신텍스 면역보강제 제제-1; 약독화된 마이코박테리움 보비스; 인터루킨-12; 인터루킨-18; 감마 인터페론; 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 백신 조성물을 가지는 방법.
제12항에 있어서, 상기 불활성화된 박테린이 단위 투여량 당 1×10⁴ TCID₅₀ 이상을 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 조성물을 가지는 방법.
시험 동물에서 임상적 개 에를리히아증을 유도하는 방법으로서, 독성 에를리키아 캐니스 미생물로 감염된 말초혈 단핵 세포를 본질적으로 포함하는 유효량의 챌린지 스톡(challenge stock)을 상기 시험 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방 법.
제18항에 있어서, 상기 스톡 용액은 피하로 투여하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 독성 미생물은 시험 동물에서의 이의 반복된 계대배양(passage)으로 생성시키는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 미생물은 에를리키아 캐니스 에보니인 것인 방법.
독성 에를리키아 캐니스 미생물로 감염된 말초혈 단핵 세포를 포함하는 챌린지 스톡 조성물.
제22항에 있어서, 상기 독성 미생물은 시험 동물에서 반복적으로 계대배양된 에를리키아 캐니스 에보니인 것인 조성물.