SK76596A3 - Agent for inhibition of pets colonization with salmonella, a process for the production and use thereof - Google Patents

Description

Prostriedok na inhibíciu kolonizácie domácich zvierat salmonelou, spôsob jeho výroby a jeho použitia.

Oblasť techniky

Vynález sa týka určitých probiotík na potláčanie kolonizácie salmonelou u domácich zvierat, vrátane vtáctva, ako hydiny a najmä u kuriat. Napriek úsiliu vedcov a úradov, ktoré sa zaoberajú ochranou verejného zdravia sa výskyt humánnej salmonelózy počas posledných 20 rokov zvýšil. Počet skutočne oznámených prípadov humánnej infekcie prekračuje číslo 40 000 za rok. Informačné stredisko Communicable Disease Center odhaduje, že výskyt humánnych infekcií salmonelou v samotných USA môže robiť každý rok až 2 až 4 milióny. Hlavným zdrojom humánnej infekcie sú pritom potraviny živočíšneho pôvodu, predovšetkým produkty z hydiny.

Doterajší stav techniky

S ohľadom na rozšírenosť Salmonella v životnom prostredí je nepravdepodobné, že by bolo možno hydinu celkom ochrániť pred expozíciou salmonele. Preto sa vedci zamerali na výskum prostriedkov, ktoré vedú k zvýšeniu odolnosti voči kolonizácii hydiny salmonelou, ktorej je táto hydina vystavená. Štúdie sa zamerali najmä na rôzne očkovacie látky, zavádzanie protektívnej normálnej intestinálnej flóry a identifikáciu krmivových prísad inhibujúcich rast salmonely a jej kolonizáciu hydiny. Úloha imunity hostiteľa proti kolonizácii salmonelou je nejasná a tiež zostáva neistota v tom, či stimulácia imunitných odpovedí účinne zvýši odolnosť proti kolonizácii salmonelou. U experimentálnych očkovacích látok sa nedokázala konzistentná účinnosť.

Bolo dobre zdokumentované, že normálna intestinálna mikroflóra zvyšuje odolnosť proti kolonizácii salmonelou. Orálna inokulácia mladých kuriat anaeróbnymi bakteriálnymi kultúrami mikroflóry, ktoré sú tak isto známe pod označením probiotiká (probiotiká sú definované ako bakteriálne kultúry vykazujúce prospešný účinok na zviera, ktorému sú podávané) pripravenými z obsahu slepého čreva alebo trusu dospelých kuriat, účinne znižuje kolonizáciu salmonelou [Snoeyenbos et : 904 až 913 (1979), Sneitz et al., Acta Scand. Sect. B., 89 : 109 až 116 (1981)

Prot. 48 : 778 až 782 (1985)].

kolonizácii týmito cekálnymi naopak kuratá susceptibilnejšie [Pivnick et al., J. Foot Prot., Tieto probiotiká môžu znižovať že rýchlo kolonizujú intestinálny

J. Food brániaca al., Avian Dis., 23 Pathol. Microbiol. a Stavric et al., Chovateľská prax anaeróbnymi organizmami robí voči kolonizácii salmonelou 909 až 916 (1981)].

kolonizáciu salmonelou tým, trakt mladých kuriat (Pivnick et al., vyššie uvedená citácia) tým, že súťažia o miesta pripojenia k intestinálnej stene (Snoeyenbos et al., vyššie uvedená citácia) alebo tým, že vytvárajú baktériostatiká alebo baktericídne prchavé mastné kyseliny s krátkym reťazcom [Barnes et al., J. Hyg. Camb., 82 : 263 až 283, (1979) a Am. J. Clin. Nutr., 33 : 2426 až

2433 (1980), Corrier et al., Avian Dis., 34 : 668 až 676 (1990) a Avian Dis., 34 : 617 až 625 (1990) a Hinton et al., Avian Dis., 34 : 626 až 633 (1990)], ktoré inhibujú rast enteropatogénov.

že len populáciu niekoľkých stoviek rôznych inhibujú rast salmonely.

kultúry normálnej mikroflóry,

Ukázalo sa však, ktoré obsahujú zmiešanú mikroorganizmov účinne normálnej intestinálnej flóry do jednodenných použitia zmesových kultúr mikroorganizmov sa rozsahu používa na potláčanie v niekoľkých európskych krajinách, počtu a typom mikroorganizmov kultúrach, nebol ale

Zavádzanie kuriat za v širokom salmonelou kolonizácie

Vzhľadom k nedefinovanému prítomných v zmesových tento systém v širokom rozsahu akceptovaný v USA. Jednou nevýhodou komplikujúcou široké využitie tejto metódy je hlavne skutočnosť, že zloženie produktu nemôže byť štandardizované, a že teda produkt nie je možno skladovať alebo vyrábať vo veľkom meradle bezo zmien jeho zloženia a účinnosti. Ďalším dôvodom je, že počiatočnou látkou je vždy intestinálny obsah dospelej hydiny, a že teda produkt môže obsahovať patogénne vírusy, baktérie alebo parazity, ktoré môžu ohrozovať zdravie kuriat. Ešte ďalším dôvodom je, že americký úrad na kontrolu potravín a liečiv (U.S. Food & Drug Administration) vydal nedávno nariadenie, že všetky nedefinované kultúry musia byť schválené.

Nedávno bolo oznámené, že laktóza a iné produkty s mliečnym cukrom pridané do krmiva alebo napájače j vody pre kuratá zvyšujú odolnosť kuriat voči kolonizácii salmonelou [Oyofo et al., Avian dis. 33 : 531 až 533, (1989) a Poultry Sci., 68 : 1357 až 1360 (1989), Corrier et al., ibid, a Hinton et al., ibid]. Prísada laktózy do potravy zvyšuje kyslosť obsahu slepého čreva a ovplyvňuje rast a fermentačné produkty normálnej intestinálnej mikroflóry. Prídavok laktózy k potrave môže tiež zvýšiť odolnosť proti kolonizácii salmonelou zvýšením baktériostatického účinku prchavých mastných kyselín s krátkym reťazcom, ako je kyselina octová, kyselina propiónová a kyselina maslová, ktoré sú produkované niektorými normálnymi intestinálnymi baktériami [Corrier et al., Ibid, Hinton et al. ibid].

Odolnosť kuriat voči kolonizácii salmonelou bola tiež ďalej zvýšená, keď bola kuratám podávaná kombinácia laktózovej krmivovej prísady s kultúrami cekálnych anaeróbnych mikroorganizmov vypestovaných na živnej pôde s obsahom laktózy [Corrier et al., ibid, Hinton et al. ibid] .

Podstata vynálezu

V súvislosti s vynálezom bolo teraz vyvinuté definované probiotikum, alebo zmes baktérií účinných pri potláčaní alebo inhibícii kolonizácie hydiny salmonelou. Toto probiotikum zahŕňa definované populácie alebo kultúry v podstate biologicky čistých baktérií. Tieto baktérie zahŕňajú nasledujúce kmene:

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus avium, Lactococcus lactis, Lactobacillus, Eseherichia coli, Citrobacter freundii, Pseudomonas, Serratia liquefaciens, Propionibacterium, Bifidobacterium (alebo Lactobacillus), Eubacterium,

Veillonella a Fusobacterium ako aj ďalšiu baktériu, ktorá patrí do čeľade Enterobacteriaceae a neznámu baktériu označenú ako kmeň OAGPB-5.

Pri aplikácii sa toto probiotikum podáva hydine v množstve účinne inhibujúcom kolonizáciu salmonelou. V prednostnom vyhotovení sa môže inhibícia salmonely zvýšiť prídavkom laktózy k probiotiku. Vyššie uvedené probiotikum je tiež možno kombinovať s konvenčným krmivom za vzniku nového krmiva, ktoré môže hydina orálne prijímať.

Predmetom vynálezu je tiež nový spôsob izolácie probiotík, ktoré sú účinné na potláčanie alebo inhibíciu kolonizácie salmonelou u domácich zvierat, vrátane hydiny, z trusu alebo obsahu slepého čreva alebo hrubého čreva dospelých zvierat. Trus alebo obsah slepého alebo hrubého čreva sa zmieša so živinami alebo kultivačným médiom a bez riedenia inhibuje (tj. v jednorázovej kultúre) za anaeróbnych podmienok. Po tejto predbežnej inkubácii sa výsledná kultúra pestuje prietokovým spôsobom tak dlho, dokiaľ sa nedosiahne ustálený stav. Po dosiahnutí ustáleného stavu sa kultúra môže izolovať na použitie ako probiotikum.

Predmetom vynálezu je teda tiež vylepšený spôsob potlačovania kolonizácie salmonelou u hydiny a prostriedok k vykonávaniu tohto spôsobu.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je zaistenie definovaných kultúr anaeróbnych baktérií (ktoré môžeme ľahko štandardizovať) na potláčanie kolonizácie hydiny salmonelou.

Vynález sa tiež týka zlepšeného spôsobu izolácie zmesí baktérií na použitie ako probiotikum na potláčanie kolonizácie domácich zvierat, najmä hydiny, salmonelou. Ďalšie aspekty a výhody tohto vynálezu sú podrobnejšie popísané ďalej.

Probiotikum podľa vynálezu pri aplikácii účinne potláča kolonizáciu hydiny salmonelou. Znižuje priemernú koncentráciu salmonely v populácii hydiny a/alebo znižuje percentuálny podiel hydiny kolonizovanej týmto patogénom. Vynález môžeme využiť u vtáctva akéhokoľvek typu, pričom ako neobmedzujúce príklady môžeme uviesť hydinu, ako sú kuratá, morky, kačky, prepelice a husi. Po podaní vtákom poskytuje toto probiotikum konzistentnú ochranu proti rôznym druhom salmonely, ako je Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis.

Probiotikum bolo vyvinuté zo slepého čreva kuriat, ktoré

nie sú

kolonizované salmonelou. Ako je to podrobnejšie

popísané v príklade 1, kuratám sa odoberie slepé črevo a inokuluje sa do vhodného kultivačného média. Inkubácia prebieha v jednorázovej kultúre pri anaeróbnych podmienkach.

Získaná kultúry

kultúra sa inkubuje pri podmienkach prietokovej so špecifickou výmenou média tak dlho, dokiaľ sa

nedosiahne ustálený stav čiže stav rovnováhy. Keď sa. vzniknutá kultúra v ustálenom stave izoluje a podá vtákom, vykazuje významnú účinnosť ako probiotikum potláčajúce kolonizáciu ošetrených vtákov salmonelou.

Na základe analýzy bolo z kultúry v ustálenom stave získaných 29 v podstate čistých bakteriálnych izolátov, zahŕňajúcich 15 fakultatívnych a 14 obligátnych anaeróbnych mikroorganizmov. Bolo zistené, že kultúra má nasledujúce zloženie:

I.	Fakultatívne anaeróbne grampozitívne koky: (1) prvý kmeň Enterococcus faecalis, (2) druhý kmeň Enterococcus faecalis, (3) prvý kmeň Enterococcus faecium, (4) druhý kmeň Enterococcus faecium, (5) tretí kmeň Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avlum, (7) tretí kmeň Enterococcus faecalis,
II.	Fakultatívne anaeróbne grampozitívne kokobacily: (8) Lactococcus lactis, (9) prvý kmeň Lactobacillus,
III.	Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne bacily: (10) prvý kmeň Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii,

(12) baktérie patriace do čeľadi Enterobacteriaceae, (13) druh Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) druhý kmeň Escherichia coli,

IV. Obligátne anaeróbne grampozitívne bacily:

(16) prvý druh Propionibacterium, (17) druhý druh Propionibacterium, (18) druhý kmeň Lactobacillus, (19) prvý kmeň Bifidobacterium alebo tretí kmeň Lactobacillus, (20) tretí kmeň Propionibacterium, (21) prvý kmeň Eubacterium, (22) druhý kmeň Eubacterium, (23) neznámy bakteriálny kmeň označený ako OAGPB-5, (24) tretí kmeň Eubacterium, (25) druhý kmeň Bifidobacterium alebo štvrtý kmeň Lactobacillus, (26) tretí kmeň Bifidobacterium alebo piaty kmeň Lactobacillus, (27) štvrtý kmeň Propionibacterium,

V. Obligátne anaeróbne gramnegatívne koky:

(28) druh Veillonella a

VI. Obligátne anaeróbne gramnegatívne bacily:

(29) druh Fusobacterium.

Protobiotická zmes zahŕňajúca všetkých 29 vyššie uvedených bakteriálnych kmeňov bola uložená za podmienok budapeštianskej dohody v zbierke Američan Type Culture

Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) pod označením Competitive Exclusion Culture, CF3, a bolo jej pridelené prírastkové číslo ATCC 55 515). Jednotlivé kmene sú charakterizované v príkladoch 1 a 2.

Výsledné kultúry v ustálenom stave je možno priamo použiť ako probiotiká alebo ich môžeme skladovať na pozdejšie použitie. V prípade skladovania sa môže kultúra skladovať v podobe vyššie uvedenej zmesi alebo sa môžu skladovať jednotlivé vyizolované baktérie. V poslednom uvedenom prípade sa pred použitím pripraví pôvodná zmes rekombinácií izolovaných baktérií.

V prednostnom vyhotovení sa probiotikum podľa vynálezu skladá z baktérií z uloženej kultúry v ustálenom stave charakterizované v príkladoch la 2. V alternatívnom vyhotovení je ale možno mnoho z použitých baktérií získať zo známych alebo štandardných kmeňov alebo z izolátov získaných z hydiny. Tak napríklad je možno kmene určitého rodu alebo druhu z uloženého probiotiká podľa príkladu vyhotovenia nahradiť aspoň jedným rovnakým rodom alebo druhom kmeňa zvoleného z nebmedzujúceho súboru zahŕňajúceho Enterococcus, Lactococcus, E. coli, Citrobacter, Pseudomonas, Serratia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Veillonella, Fusobacterium alebo najmä Lactobacillus. Keď sa používajú zásobné kultúry známych kmeňov, môže sa účinnosť zásobných kultúr zvýšiť tým, že sa baktérie adaptujú na vtáky pasážovaním v ich organizme, prednostne spolu s ostatnými organizmami z kultúry v ustálenom stave, pričom sa z trusu alebo obsahu slepého čreva takto pasážovaná kultúra izoluje. Ak používame hydinové izoláty, je možno baktérie jednotlivo izolovať a získať z trusu alebo obsahu slepého čreva dospelých vtákov pri použití techník, ktoré sú obvyklé v tomto odbore alebo ktoré popísal DeLoach (Patentová prihláška USA poradového čísla 07/822 505). Táto prihláška je tu citovaná ako náhrada za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohto vynálezu.

Predpokladá sa tiež, že by bolo možno vynález realizovať s probiotikom obsahujúcim menej ako všetkých 29 vyššie uvedených bakteriálnych kmeňov, a že by bolo možno dve alebo tri z vyššie uvedených baktérií z probiotika odstrániť pri iba malom znížení účinnosti. Bez toho, že by sa pôvodcovia tohto vynálezu chceli viazať na nejaký konkrétny príklad, je možno uviesť, že redundantné kmene Pseudomonas alebo kmene baktérií, tzn. rody, od ktorých sú prítomné početné kmene alebo druhy, je možno vypustiť bez významného zníženia účinnosti. V súlade s prednostným vyhotovením tohto vynálezu sa však optimálne potlačenie kolonizácie salmonelou dosahuje s probiotikom zahŕňajúcim všetkých 29 vyššie uvedených kmeňov.

Niektoré z kmeňov baktérií, ktoré sa používajú podľa tohto vynálezu, je tiež možno prípadne vybrať na základe ich schopnosti adhézie k epitelovej stene tráviaceho traktu vtáka, ktorému má byť probiotikum aplikované. Pri tejto selekcii používame techniku, ktorú popísal Nurmi et al. v US patente č. 4 689 226. Táto citácia je tu uvedená náhradou za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohto vynálezu.

Predmetom vynálezu je tiež nový spôsob získavania probiotika účinného na potláčanie alebo inhibíciu kolonizácie rôznych domácich zvierat salmonelou. Ako neobmedzujúce príklady domácich zvierat môžeme uviesť vtáky, ale tiež kone, ošípané a hovädzí dobytok. Namiesto toho, aby sa probiotikum vyrábalo zo známych zásobných kultúr alebo čistých bakteriálnych izolátov, je možno (čo sa zistilo s prekvapením) získať stabilné definované probiotikum priamo z trusu alebo obsahu slepého čreva a/alebo hrubého čreva dospelých cieľových zvierat. Pri tomto spôsobe sa trus alebo obsah slepého alebo hrubého čreva najskôr použije ako inokulum na zaočkovanie jednorázovej kultúry a potom sa vykonáva kultivácia za podmienok prietokovej kultúry pri špecifickej výmene média a pri špecifickom pH tak dlho, dokiaľ nedosiahneme ustálený stav alebo rovnováhu. Výslednú kultúru v ustálenom stave môžeme izolovať pre použitie ako probiotikum. Pod označením obsah slepého čreva sa tu rozumie materiál umiestnený vo vnútri slepého čreva, ale tiež samotné slepé črevo vrátane jeho častí, ako je vrstva sliznice.

Stupeň s jednorázovou kultúrou sa môže vykonávať v akomkoľvek z obyčajných fermentorov. Prednostne ale používame chemostat bez riedenia (tj. bez pridávania čerstvého kultivačného média a odstraňovania využitého kultivačného média), aby sa zabránilo prenosu kultúry do nasledujúcich stupňov a aby sa zabránilo prenosu kultúry do nasledujúcich stupňov a aby sa znížila potenciálna kontaminácia kultúry. Po odbere sa obsah slepého čreva alebo hrubého čreva alebo trus, ktoré majú byť použité ako inokulá, zmiešajú s vhodným kultivačným médiom a vzniknutá zmes sa inkubuje za anaeróbnych podmienok. Kultivácia v jednorazovej kultúre by sa mala vykonávať:

(1) po dobu asi 6 až 18 hodín prednostne asi 12 až 18 hodín alebo (2) do dosiahnutia optickej denzity (merané pri 600 nm) aspoň asi 1,0 a/alebo (3) nie dlhšie ako asi 2 hodiny po dosiahnutí hodnoty pH asi 4,2.

Potom by sa mala kultivácia v jednorazovej kultúre skončiť a malo by sa začať s kultiváciou v prietokovej kultúre. Pokiaľ sa doba inkubácie stanovuje na základe vyššie uvedenej podmienky (1) alebo najmä (2), prednostne sa hodnota pH reguluje na asi 5,5 pri použití regulátora pH, ako je to zvykom v tomto odbore. Pokiaľ sa v poslednom uvedenom prípadne nepoužíva regulácia hodnoty pH, je účelné pokračovať v kultivácii v jednorazovej kultúre len tak dlho, dokiaľ sa pH nezníži na hodnotu asi 4,2, aby sa zabránilo usmrteniu niektorých buniek.

Hneď po skončení stupňa kultivácie v jednorazovej kultúre sa začne kultivácia pri podmienkach prietokovej kultúry v chemostate, pri ktorej sa kontinuálne privádza čerstvé médium a odvádza vyčerpaná pôda. Vhodné chemostaty môžeme ľahko určiť a zahŕňajú napríklad chemostaty, ktoré popísal Wang [Fermentation and Enzýme Technology, John Wiley & Sans, New York, 1979, str. 98 až 137,- táto citácia je tu uvedená ako náhrada za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohto vynálezu] . S prekvapením sa zistilo, že rast zmesi v prietokovej kultúre pri použití špecifického riedenia alebo rýchlosti výmeny média a špecifickej hodnoty pH umožňuje, aby sa kultúra dostala do rovnovážneho alebo ustáleného stavu. V závislosti na zvierati použitom ako zdroj pre inokulum, špecificky použitom médiu a podmienkach kultivácie sa môže počet baktérií, ktoré sú pôvodne prítomné, znížiť, za vzniku stabilnej kultúry zahŕňajúcej pomerne malý počet v podstate biologicky čistých ľahko definovateľných baktérií. Tak napríklad, keď používame hydinu, môže sa približne 500 baktérií, ktoré sú prítomné v pôvodnom inokule zredukovať na stabilnú kultúru asi 10 až 40 baktérií. Vhodné podmienky pre tento stupeň zahŕňajú rýchlosť výmeny média v rozmedzí od asi 0,029 do asi 0,10 h^-1, prednostne asi 0,0416 h^-1 a pH v rozmedzí od asi 4,7 do asi 6,5, prednostne asi 5,5.

Hodnota teploty a druh média použitého na jednorázovú a prietokovú kultúru nemajú rozhodujúci význam a je ich možno ľahko určiť. Vhodná teplota môže ležať v rozmedzí od asi 26 do asi 47°C. Môžeme tiež požiť rôzne vhodné kultivačné médiá s rôznymi zdrojmi energie. Ako neobmedzujúci príklad prednostného zdroja energie je možno uviesť glukózu alebo galaktózu a hlavne potom laktózu.

O ustálenom stave hovoríme, keď pH, optická denzita θ°βοο ^a koncentrácia prchavých mastných kyselín v kultúre zostáva približne konštantná. Po dosiahnutí ustáleného stavu sa v ľubovoľnej dobe môže kultúra izolovať pre ďalšie vyššie popísané použitie. Za ideálnych podmienok je tiež vhodné charakterizovať alebo definovať kultúru v ustálenom stave prostredníctvom izolácie a identifikácie bakteriálnych populácií, ktoré sú v nej obsiahnuté, za použitia techník obvyklých v tomto odbore. Po izolácii sa môžu baktérie skladovať neobmedzene dlhú dobu za podmienok umožňujúcich ich neskoršie využitie, ako je to napríklad popísané v patentovej prihláške poradového čísla 07/921,173 podanej 29. júla 1992. Odborníkom v tomto odbore je jasné, že pri vyššie uvedenom spôsobe kultivácie v jednorázovej a prietokovej kultúre sa tiež ako počiatočné inokulum môžu používať izolované alebo biologicky čisté baktérie.

Získané kultúry v ustálenom stave sa podľa tohto vynálezu môžu prípadne podrobiť screeningu za účelom izolácie zmesí vykazujúcich optimálnu účinnosť pri inhibícii kolonizácie cieľového zvieraťa salmonelou. Podľa jedného vyhotovenia sa tento screening môže robiť in vivo za použitia provokácie salmonelou, ako je to bežné v tomto odbore a ako je popísané v príkladoch 3 a 4. V krátkosti sa dá tento postup popísať takto: Kultúra v ustálenom stave sa podá zvieratám, ktoré neobsahujú salmonelu. Po uplynutí doby postačujúcej na usídlenie kultúry v črevách, obvykle po dvoch alebo troch dňoch sa zvieratá provokujú životaschopnou kultúrou salmonely: Po inkubácii sa zvieratá usmrtia a obsah ich slepého čreva sa analyzuje na kolonizáciu salmonelou. Účinná inhibícia kolonizácie salmonelou sa prejaví znížením priemernej koncentrácie salmonely (CFU), alebo znížením percentuálneho podielu kolonizovaných zvierat v ošetrenej populácii, vzhľadom k neošetrenej kontrolnej populácii.

V súvislosti s vynálezom bolo tiež zistené, že probiotiká produkované spôsobom podľa vynálezu alebo akýmkoľvek iným spôsobom, je tiež možno podrobiť spoľahlivému screeningu in vivo na základe analýzy profilu prchavých mastných kyselín (VFA) v slepom čreve. Táto technika nevyžaduje obvyklú provokáciu salmonelou. Na vyhodnotenie účinnosti akejkoľvek kultúry sa po jej podaní cieľovému zvieraťu nechá kultúra usídliť v črevách tak, ako to bolo popísané vyššie. Po dvoch až troch dňoch po ošetrení, prednostne po troch dňoch sa zvieratá usmrtia a stanoví sa koncentrácia kyseliny propiônovej a celková koncentrácia prchavých mastných kyselín (kyseliny octovej, kyseliny propiônovej, kyseliny maslovej, kyseliny izomaslovej, kyseliny Valérovej a kyseliny izovalérovej) v obsahu slepého čreva. Na meranie obsahu týchto kyselín sa môže použiť technika obvyklá v tomto odbore, ako je plynová chromatografia s kvapalnou stacionárnou fázou (GLC), ktorú popísali Corrier et al. (Avian Dis., 34 : 617 až 625, 1990). Táto citácia je tu uvedená náhradou za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Probiotická účinnosť pri inhibícii kolonizácie salmonelou je pritom konštatovaná keď:

(1) je koncentrácia kyseliny propiônovej vyššia alebo rovná približne hodnote 10 mmol/g obsahu slepého čreva a/alebo (2) celková koncentrácia prchavých mastných kyselín dosahuje približne 100 % hodnoty zistenej u neošetrených kontrolných zvierat alebo je vyššia.

Napriek tomu, že je možno koncentráciu kyseliny propiônovej stanoviť po dvoch dňoch predvídateľnosť účinnosti sa znižuje, ak je založená na meraní celkovej koncentrácie prchavých mastných kyselín po treťom dni.

Rovnako ako tomu bolo v prípade vyššie uvedeného probiotika obsahujúceho 29 kmeňov, môžu sa kultúry v ustálenom stave produkované spôsobom podľa vynálezu priamo použiť ako probiotiká alebo sa môžu uložiť na pozdejšie použitie. Podobne je možno aj baktérie obsiahnuté v kultúre izolovať a Identifikovať a známymi alebo štandardnými kmeňmi alebo izolátmi z toho istého cieľového zvieraťa je možno nahradiť baktérie rovnakého rodu alebo druhu obsiahnuté v kultúre v ustálenom stave.

V jednorázovej alebo prietokovej kultúre týchto baktérií vo vhodnom kultivačnom médiu je možno za podmienok anaeróbnej kultivácie obvyklej v tomto odbore vyrobiť veľké množstvá probiotík podľa vynálezu. Z vyššie uvedených spôsobov kultivácie sa dáva prednosč najmä postupom s prietokovou kultúrou, pretože kultúry v ustálenom stave sú výnimočne stále a môžu sa v ustálenom stave neobmedzene dlho uchovávať. Inokulom pre kultúry vo veľkom meradle môže byť vzorka alebo očko kultúry v ustálenom stave, uložené kultúry alebo zásobné kultúry alebo tiež v podstate biologicky čisté izoláty týchto baktérií. Baktérie je možno kultivovať v kombinácii alebo v separátnych kultivačných médiách, pričom v poslednom uvedenom prípade, ktorý umožňuje lepšiu štandardizáciu, sa kultúry miešajú až dodatočne. Ak sa používa naposledy uvedená technika, mala by sa konečná koncentrácia každej baktérie v príslušnej kultúre pred zmiešaním kultúr nastaviť na hodnotu približne v rozmedzí od 10® do 10® organizmov/ml. Odborníkom v tomto odbore je však zrejmé, že vyššie uvedená hodnota koncentrácie nemá rozhodujúci význam a môže sa meniť.

Keď sa kultivácia v jednorázovej kultúre robí vo veľkom meradle, mala by sa kultúra obvykle inkubovať pred použitím po dobu asi 16 až 72 hodín, prednostne po dobu asi 24 až 48 hodín. V súvislosti s vynálezom sa však zistilo, že za akýchkoľvek okolností by sa mala kultivácia v jednorázovej kultúre robiť tak dlho, dokiaľ sa nedosiahnu nasledujúce fermentačné parametre:

(1) koncentrácia kyseliny octovej asi 20mM alebo vyššia, (2) koncentrácia kyseliny propiónovej asi lOmM alebo vyššia a (3) koncentrácia kyseliny maslovej a izomaslovej celkom asi 15mM alebo vyššia.

Použitie probiotika podľa vynálezu nie je ovplyvnené konkrétnym spôsobom jeho výroby. Probiotiká vyrobené akýmikoľvek vyššie popísanými spôsobmi sa môžu používať vždy rovnakým spôsobom. Po výrobe sa môžu bakteriálne kultúry podávať priamo cieľovému zvieraťu buď jednotlivo alebo vo vzájomnej kombinácii. Probiotikum je tiež možno prípadne ďalej zmiešať s vhodným nosičom. Ako neobmedzujúce príklady vhodných nosičov je možno uviesť laktózu alebo odstredené mlieko. Probiotikum je tiež možno zmiešať s malým množstvom krmiva a výsledná zmes sa môže používať vo forme premixu. Kultúry je možno taktiež lyofilizovať, aby sme dosiahli ich stabilitu pri skladovaní. S lyofilizovanými kultúrami sa tiež ľahko manipuluje. Takéto lyofilizované kultúry je možno priamo podávať zvieratám alebo je možno ich alternatívne pred použitím rekonštituovať. Obzvlášť je potrebné sa zmieniť o možnosti zapúzdriť niektorú alebo všetky baktérie za použitia obvyklých spôsobov zapúzdrovania (enkapsulácie). Ako neobmedzujúci príklad zapúzdrovania je možno uviesť zapúzdrovanie v alginátovom géle. Bez toho, aby sa sprievodcovia chceli viazať na platnosť nejakej teórie, predpokladajú, že tento spôsob zapúzdrovania môže zabrániť niektorým baktériám znižovať koncentráciu kyseliny mliečnej v hornej časti črevného traktu na nežiadúcu úroveň.

Zapúzdrenie môže taktiež ochrániť baktérie a umožniť im doraziť do slepého čreva, kde je žiaduca utilizácia kyseliny mliečnej.

Probiotikum podľa vynálezu je taktiež možno kombinovať s inými v podstate biologicky čistými baktériami, ktoré sa používajú v probiotikách účinných na potlačovanie salmonely u domácich zvierat alebo hydiny a najmä s baktériami produkujúcimi kyselinu mliečnu alebo prchavé mastné kyseliny. Ako neobmedzujúce príklady takýchto vhodných baktérií je možno uviesť druhy Peptostreptococcus alebo druhy, ktoré popísal DeLoach v patentovej prihláške USA poradového čísla 07/822,505. Táto citácia je tu uvedená náhradou za prenesenie celého jej obsahu do popisu tohto vynálezu. K probiotiku je možno tiež pridávať iné pomocné prísady, ktoré sa bežne používajú alebo ktoré sú známe v odbore liečenia domácich zvierat alebo hydiny, a ktoré sa hodia najmä na inhibíciu enteropatogénov. Ako vhodné adiuvanty je napríklad možno uviesť kokcídiostaty, ktoré nie sú účinné proti grampozitívnym organizmom. Mimoriadna prednosť sa dáva prídavku laktózy.

Domácim zvieratám alebo hydine sa tiež môžu podávať v neterapeutickej koncentrácii antibiotiká, ako je to bežné v tomto odbore. Takéto antibiotiká je možno podávať v kombinácii s probiotikom alebo samostatne. Alternatívne je možno takéto antibiotiká podávať hydine in ovo v koncentrácii, ktorá je terapeutická, ale ktorá poklesne na neterapeutickú koncentráciu do asi troch dní po vyliahnutí.

Napriek tomu, že sa probiotikum podľa vynálezu bude prevažne podávať alebo zavádzať do zažívacieho traktu tak, že sa bude miešať s krmivom alebo vodou, ktoré zviera orálne konzumuje, nie je možno vylúčiť ani priame orálne alebo nazálne podávanie striekaním alebo rozstriekaním vhodného prostriedku. Aj posledné uvedené alternatívy sú v tomto odbore zvyčajné. Z ešte ďalších alternatív je možno uviesť priame injekčné podanie do gastrointestinálneho traktu alebo kloakálne podávanie. V naposledy uvedenom prípade sa probiotikum môže priamo nastriekať na kloakálny otvor hydiny alebo sa môže aplikovať na výstelku na podlahe koterca. V naposledy uvedenom prípade dôjde ku styku kloakálneho otvoru s probiotikom v priebehu normálnej aktivity hydiny. Hneď ako dôjde ku kontaktu s oblasťou kloaky, probiotikum sa do kloaky zavedie reverznou peristaltikou.

Probiotikum sa môže zvieratám podávať v ľubovoľnej dobe ich života. V prednostnom vyhotovení sa však probiotikum podáva čerstvo vyliahnutým vtákom vo veku v rozmedzí od jedného do štrnástich dní.

Probiotikum sa podáva v množstve, ktoré účinne inhibuje kolonizáciu ošetreného zvieraťa salmonelou v porovnaní s neošetrenými zvieratami. Vhodné množstvo môže odborník v tomto odbore ľahko určiť a bude do istej miery závislé na veku a veľkosti zvieraťa.

Vynález je bližšie objasnený na nasledujúcich príkladoch vyhotovenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu, ktorý je vymedzený pripojenými nárokmi v žiadnom prípade neobmedzujú.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Príprava probiotika

Počiatočné inokulum

Počiatočné inokulum sa získa od troch desať týždňov starých kuriat (brojlerov), ktoré nie sú zamorené salmonelou a boli chované od vyliahnutia na nemedikovanej strave a vode. Vtáky sa usmrtia a za aseptických podmienok sa im vyberie slepé črevo, ktoré sa ihneď prenesie do anaeróbnej komory (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI, USA). Každé slepé črevo sa rozreže na niekoľko kusov a maceruje v miešačke Lab Blender (Tekmar, Cincinnati, OH, USA). Macerované cekálne tkanivo a obsah slepého čreva sa spoja a dôkladne homogenizujú a ku vzniknutému homogenátu sa pridá glycerol do konečnej koncentrácie 20 %. Výsledný cekálny homogenát sa zmrazí pri -70° C a za týchto podmienok sa uchováva až do použitia. Pri použití sa 10 ml zmrazeného cekálneho homogenátu nechá roztopiť a inkubuje sa pri anaeróbnych podmienkach v 100 ml média Viande Levure (VL) pri teplote 39°C. Vzniknutá kultúra sa použije ako očkovacia kultúra pre nasledujúcu kultiváciu za prietokových podmienok (CF) .

Zariadenie pre kultiváciu za prietokových podmienok

Ako stupeň s jednorázovou kultúrou, tak stupeň s prietokovou kultúrou sa uskutočňuje v 1 150 ml chemostatovej nádobe (fermentor BioFlo III, New Brunswick Scientific Co., Edlson, NJ, USA). V stupni prietokovej kultúry sa používajú nasledujúce parametre:

- rýchlosť riedenia 0,0416 h^-1 (čo zodpovedá prietokovej rýchlosti 0,80 ml/min a dobe výmeny média 24 h,

- teplota 39°C a

- rýchlosť miešania 200 min^-1.

Anaeróbne podmienky sa udržujú preplachovaním nádoby konštantným prúdom oxidu uhličitého bez kyslíka.

Rast cekálnych organizmov za podmienok kultivácie v prietokovej kultúre.

Do chemostatovej nádoby sa predloží 1 050 ml sterilnej pôdy Viande Levure (VL) a táto pôda sa inokukuje 100 ml očkovacej kultúry a pri anaeróbnych podmienkach inkubuje v jednorázovej kultúre pri 39°C a rýchlosti miešania (frekvencia otáčania miešadla) 200 min“¹. Po 6 hodinách v jednorázovej kultúre sa uvedie do prevádzky čerpadlo živnej pôdy a kultúra sa začne inkubovať za prietokových podmienok. Ustálený stav dosiahneme po asi 5 dňoch kultivácie v prietokovej kultúre. Podmienky ustáleného stavu sú konštatované, keď pH, optická denzita OD_eoo a koncentrácia prchavých mastných kyselín zostávajú v podstate konštantné.

Keď je prietoková kultúra stará 5 dní a 61 dní, odoberú sa z nej za aseptických podmienok vzorky, ktoré sa nanesú na tryptózový agar doplnený o 5 % hovädzej krvi, McConkeyov agar a krvný agar Center for Disease Control (CDCBA). Misky s tryptózovým agarom a McConkeyovým agarom sa inkubujú na vzduchu 7 dní pri 37°C. Misky s CDCBA sa inkubujú v anaeróbnej komore (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI, USA), ktorá obsahuje atmosféru skladajúcu sa z 80 % dusíka, 10 % vodíka a 10 % oxidu uhličitého. Inkubácia sa uskutočňuje pri 37°C po dobu 7 dní. Ako v prietokovej kultúre starej 5 dní, tak v prietokovej komore starej 61 dní sa identifikuje 29 bakteriálnych izolátov, ktoré sa skladajú z 15 fakultatívnych a 14 obligátnych mikroorganizmov z celkom 10 rôznych rodov. Týchto 29 bakteriálnych izolátov sa identifikuje za použitia biochemických a enzymatických postupov a profilu antimikrobiálnej suspceptibility, čo sú metódy dobre známe v tomto odbore (Holdeman et al., 1977, Anaerobe Laboratory Manual, 4. vydanie, Virginia Polytechnic Inštitúte and State University, Blacksburg, VA, USA; Farmer et al., 1985, J. Clin. Microbiol., 21 : 46 až 78; Lennette et al., 1985, Clinical Microbiology, 4. vydanie, Američan Society for Microbiology, Washington, D.C.; a Devriese et al., 1987, Int. J. Syst. Bacteriol., 37 : 257 až 259. Vyššie uvedené citácie sú tu zmienené náhradou za prenesenie ich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Sú identifikované nasledujúce baktérie:

I. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne koky:

(1) Enterococcus faecalis označený ako kmeň M, (2) Enterococcus faecalis označený ako kmeň N, (3) Enterococcus faecium označený ako kmeň Y, (4) Enterococcus faecium označený ako kmeň Z, (5) Enterococcus faecium označený ako kmeň X, (6) Enterococcus avium (7) Enterococcus faecalis označený ako kmeň 0,

II. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne kokobacily:

(8) Lactococcus lactis poddruh diacetylactis, (9) druh Lactobacillus (kmeň č.l),

III. Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne bacily:

(10) Escherichia coli označený ako kmeň CC-3A, (11) Citrobacter freundii, označený ako kmeň CC-3, (12) baktérie patriace do čeľade Enterobacteriaceae (zrejme druhu Enterobacter, E.coli alebo Kluyvera cryocrescens), (13) druh Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) Escherichia coli označený ako kmeň CC3B,

IV.

V.

Obligátne anaeróbne grampozitívne bacily:

(16) druh Propionibacterium (kmeň č.l, zrejme P. jensenii alebo P. thoenii), (17) druh Propionibacterium (kmeň č. 2, zrejme

P. granulosum, (18) druh Lactobacillus (kmeň č.2) (19) druh Bifidobacterium (kmeň č.l), alebo druh Lactobacillus (kmeň č.3), (20) druh Propionibacterium (kmeň č.3), (21) druh Eubacterium (kmeň č.l) (22) druh Eubacterium (kmeň č.2) (23) neznámy bakteriálny kmeň označený ako OAGPB-5, (24) druh Eubacterium (kmeň č.3), (25) druh Bifidobacterium (kmeň č.2) alebo druh Lactobacillus (kmeň č.4), (26) druh Bifidobacterium (kmeň č.3) alebo druh Lactobacillus (kmeň č.4), (27) druh Propionibacterium (kmeň č.4),

Obligátne anaeróbne gramnegatívne koky:, (28) druh Veillonella a

Obligátne anaeróbne gramnegatívne bacily:

(29) druh Fusobacterium

VI.

Získaná prietoková kultúra charakterizovaná obsahom 29 bakteriálnych izolátov vykazuje kompatibilný rast v zmiešanej kultúre, životaschopnosť v kyslom prostredí (pH 5,0 až 6,5) a ako koncové fermentačné produkty produkuje prchavé mastné kyseliny (VFA).

, Táto probiotická zmes obsahujúca všetkých 29 vyššie uvedených bakteriálnych kmeňov bola uložená za podmienok • Budapeštianskej dohody v zbierke Američan Type Culture

Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) pod označením Competitive Exclusion Culture, CF3, a bolo jej pridelené prírastkové číslo ATCC 55 515.

Príklad 2

Charakterizácia baktérie

Plynová chromatografia s kvapalnou stacionárnou fázou (GLC)

Každým z 29 bakteriálnych kmeňov z CDCBA sa zaočkuje peptón-kvas inková pôda (PY) a pôda PY s prídavkom 1 % glukózy (PYG), a potom sa uskutoční inkubácia pri anaeróbnych podmienkach pri 37°C počas 2 dní. Prchavé mastné kyseliny (VFA) a neprchavé mastné kyseliny (NVFA) sa extrahujú pri použití štandardných postupov a potom detekujú GowMac GLC. GLC sa kalibruje pri použití obchodne dostupných štandardov VFA a NVFA. Výsledky sú uvedené v tabuľkách IA až C.

Charakterizácia bunky, kolónie a kultúry

Gramova reakcia a morfológia buniek fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až 15 sa určí pri použití Gramovho farbenia stérov z krvného agaru po 24-hodinovej inkubácii na vzduchu pri 37°C. Motilita baktérie sa určí pri použití pohyblivého mäkkého agaru (0,4 %) s tetrazoliovými soľami.

Pohyblivé médium sa zaočkuje vzorkou odobranou z krvného agaru a potom 24 hodín inkubuje na vzduchu pri 37°C. Každá skúška sa uskutočňuje dvakrát.

Pre určenie vlastností kultúry sa baktériami 1 až 9 zaočkujú vždy 2 misky s krvným agarom, McConkeyovým agarom, , krvným agarom s azidom sodným a s agarom so žlčovým eskulínom. Vždy jedna miska s krvným agarom, McConkeyovým » agarom, krvným agarom a azidom sodným a s agarom so žlčovým eskulínom sa inkubuje na vzduchu pri 37°C. Jedna miska s krvným agarom a jedna miska s McConkeyovým agarom sa inkubuje v atmosfére 80 % dusíka, 10 % vodíka a 10 % oxidu uhličitého pri teplote 37°C. Jedna miska s krvným agarom s prídavkom azidu sodného a jedna miska s agarom obsahujúcim žlčový eskulín sa inkubuje na vzduchu pri 45°C počas 2 dni. Po 1 a 2 dňoch inkubácie sa zaznamenajú schopnosť rastu, vlastnosti kolónie, hemolytický profil pri krvnom agare, reakcia s laktózou pri McConkeyovom agare a hydrolytická reakcia eskulínu pri agare so žlčovým eskulínom. Každá skúška sa uskutočňuje dvakrát.

Pre stanovenie vlastností kultúry fakultatívnych anaeróbnych gramnegatívnych baktérií 10 až 15 sa použije rovnaký postup, pri ktorom sa však vypustí skúška na krvnom agare s azidom sodným a agare so žlčovým eskulínom.

Pri obligátnych anaeróbnych baktériách 16 až 29 sa určuje Gramova reakcia a morfológia bakteriálnych buniek pri použití Gramovho farbenia sterov z krvného agaru s mozgovosrdcovým nálevom, ktorý je obohatený hemínom a menadiónom (CDCBA), ktorý bol inkubovaný v atmosfére 80 % dusíka, 10 % vodíka a 10 % oxidu uhličitého 2 dni pri 37°C. Motilita sa určí pri použití obchodne dostupného predredukovaného za anaeróbnych podmienok sterilizovaného média (PRAS) z CDCBA a potom nasleduje dvojdenná anaérobna inkubácia pri 37°C.

Pre určenie vlastností kultúry sa baktériami 16 až 29 inokulujú vždy 2 misky s agarom CDCBA a McConkeyovým agarom. Vždy jedna z misiek s agarom s CDCBA a McConkeyovým agarom sa inkubuje na vzduchu pri 37°C a ostávajúca jedna miska s agarom CDCBA a McConkeyovým agarom sa inkubuje pri anaeróbnych podmienkach pri 37°C. Po 1, 3 a 5 dňoch inkubácie » sa zaznamenávajú schopnosť rastu, vlastnosti kolónie, hemolytický profil pri agare CDCBA. Každá skúška sa * uskutočňuje dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 2A až C.

Skúška s katalázou, s oxidázou a skúška redukcie nitrátu

V prípade fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až 9 sa použijú kolónie z krvného agaru inkubovaného na vzduchu 2 dni pri 37°C pre skúšku s katalázou a oxidázou. Ako reakčné činidlo pre skúšku s katalázou sa použije 3 % roztok peroxidu vodíka a ako reakčné činidlo pre skúšku s oxidázou sa použije 1 % roztok dihydrochloridu tetrametyl-p-fenyléndiamínu. Reakcia s oxidázou a katalázou sa charakterizuje ako negatívna alebo pozitívna. Každá skúška sa uskutočňuje dvakrát. Rovnaký postup sa použije pre charakterizáciu fakultatívnych anaeróbnych gramnegatívnych baktérií 10 až 15, iba s tým rozdielom, že sa kultúry inkubujú len 24 hodín.

»

V prípade obligátnych anaeróbnych baktérií 16 až 29 sa a pre skúšku s katalázou a oxidázou použijú kolónie z CDCBA inkubovaného za anaeróbnych podmienok 2 dni pri 37°C. Pre skúšku s katalázou a oxidázou sa použijú rovnaké reakčné činidlá, aké boli uvedené vyššie. Pred pridaním reakčných činidiel sa baktérie pri skúške s katalázou i oxidázou vystavia na dobu 30 minút pôsobeniu vzduchu. Všetky reakcie sa charakterizujú ako pozitívne alebo negatívne. Každá skúška sa uskutočňuje dvakrát.

Pre detekciu nitrát anaeróbnych baktériách 1 až metóde s nitrátovým agarom sa reduktázy vo fakultatívnych 15 použijeme dve metódy. Pri postupuje tak, že sa nitrátový agar obsahujúci 0,1 % dusičnanu draselného inokuluje očkom z krvného agaru, ktorý bol 24 hodín inkubovaný na vzduchu pri

37°C. Po 24-hodinovej inkubácii pri 37°C sa aplikuje činidlo A a B (Ν,Ν-dimetylnaftylamín a kyselina sulfoanilová). Pri anaeróbnej metóde s krvným agarom a papierovým kotúčkom sa organizmus čiarkovaním nanesie na krvný agar a potom sa na silno počiarkovanú oblasť umiestni papierový kotúčik napustený 0,4 % roztokom dusičnanu draselného. Miska sa inkubuje v anaeróbnych podmienkach 24 hodín pri 37°C a potom sa na papierový kotúčik aplikuje činidlo A a činidlo B. Na zistenie, či došlo k redukcii nitrátu, sa na kotúčik ošetrený činidlami nanesie zinkový prach. Všetky reakcie sa charakterizujú ako negatívne a pozitívne a každá skúška sa vykonáva dvakrát.

V prípade obligátnych anaeróbnych baktérií 16 až 29 sa nitrát reduktáza stanovuje pri použití vyššie uvedenej anaeróbnej metódy s krvným agarom a papierovým kotúčkom, ale namiesto krvného agaru sa používa CDCBA.

Aeróbne skúšky s utilizáciou sacharidu

V prípade fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až 9 sa zisťuje produkcia kyseliny z glukózy, dulcitolu, laktózy, maltózy, manitolu, salicínu a sacharózy pri použití 1 % substrátu v základnej pôde s fenolovou červeňou. Pre detekciu tvorby plynu použijeme Durhamovu skúmavku v glukózovej pôde. Každá skúmavka sa zaočkuje skúšobným organizmom z krvného agaru, ktorý bol 24 hodín inkubovaný na vzduchu pri 37°C. Pôdy sa inkubujú na vzduchu 2 dni pri 37^eC. V každej skúmavke sa sleduje zmena farby. Skúmavky zafarbené do červená sú dôkazom negatívneho výsledku a skúmavky so žltým zafarbením sú dôkazom pozitívneho výsledku. Každá skúška sa vykonáva dvakrát.

Rovnaký postup sa použije aj v prípade fakultatívnych anaeróbnych gramnegatívnych baktérií 10 až 15, s tým rozdielom, že sa ako sacharid použije len glukóza, laktóza a sacharóza.

Agar s troma cukrami a železom (TSI) sa zaočkuje kultúrami všetkých fakultatívnych anaeróbnych mikroorganizmov 1 až 15 z krvného agaru, ktorý bol 24 hodín inkubovaný na vzduchu pri 37°C . Po 24 hodinách inkubácie na vzduchu pri 37°C sa reakcie na agare TSI charakterizujú ako pozitívne alebo negatívne. Každá skúška sa vykonáva dvakrát.

V Prípade fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až 9 sa Voges-Proskauerova pôda zaočkuje vzorkou krvného agaru inkubovaného 24 hodín na vzduchu pri 37°C. Pridajú sa činidlá A a B (40 % hydroxid draselný a -naftol) a reakcie sa charakterizujú ako pozitívne alebo negatívne. Skúška sa vykonáva dvakrát.

V prípade fakultatívnych anaeróbnych gramnegatívnych baktérií 1 až 15 sa 2 skúmavky s Voges-Proskauerovou pôdou zafarbenou metylčerveňou (A a B) inokulujú očkom z krvného agaru, potom nasleduje 24-hodinová inkubácia na vzduchu pri 37°C . Pri skúške s metylčerveňou sa do skúmavky A pridá roztok metylčerveni. Pri Voges-Proskauerovej skúške sa reakčné činidlá A a B (40 % hydroxid draselný a -naftol) pridajú do skúmavky B. Reakcia sa charakterizuje ako pozitívna alebo negatívna. Skúška sa vykonáva dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 3A až C.

Skúška s utilizáciou aminokyselín a skúška s ureázou

Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne baktérie 10 až 15 sa skúšajú na lyzíndekarboxylázu a ureázu a baktérie 1 až 15 sa skúšajú na produkciu lyzíndekarboxlázy sa používa agar LIA sa zaočkuje vzorkou krvného indolu. Pre detekciu s lyzínom a železom (LIA). agaru a potom inkubuje 24 hodín na vzduchu pri 37°C. Reakcia sa charakterizuje ako pozitívna alebo negatívna. Každá skúška sa opakuje dvakrát.

Pre detekciu produkcie indolu z tryptofánu sa používajú dve metódy. Tryptofánová pôda, ktorá bola inokulovaná vzorkou krvného agaru, sa inkubuje na vzduchu 24 hodín pri 3 7° C a potom sa nechá reagovať s Ehrlichovým činidlom. Vlastná detekcia sa vykonáva pri použití anaeróbnej metódy s agarom a papierovým kotúčkom. Na misku s krvným agarom sa čiarkovaním nanesie skúšobný organizmus a potom sa na povrch agaru umiestni papierový kotúčik. Miska s krvným agarom sa inkubuje pri anaeróbnych podmienkach pri 37°C po dobu 24 hodín a potom sa na kotúčik nanesie 1 % roztok p-dimetylamínocinnamaldehydu. Výsledky sa charakterizujú ako pozitívne alebo negatívne. Skúška s tryptofánovou pôdou sa dvakrát opakuje a anaeróbna skúška s agarom a kotúčkom sa opakuje raz.

Močovinový agar sa inokuluje vzorkou krvného agaru a potom sa inkubuje na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín. Reakcia sa charakterizuje ako pozitívna alebo negatívna. Skúška sa opakuje dvakrát. Výsledky sú tiež uvedené v tabuľkách 3A až C.

Obchodne dostupný systém API 20E

Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne baktérie 10 až 15 sa tiež hodnotia pomocou 20 biochemických reakcií (viď tabuľka 4) pri použití obchodne dostupného systému podľa inštrukcií výrobcu (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Skúšky sa opakujú dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Skúška fermentácie sacharidu, skúška skvapalňovania želatíny a skúška s utilizáciou aminokyseliny

Obchodne dostupné predredukované za anaeróbnych podmienok sterilizované médium (PRAS) (viď tabuľka 5) sa zaočkuje hustou suspenziou fakultatívne anaeróbnej baktérie 1 až 15 na krvnom agare. Médiá sa inkubujú na vzduchu pri 37°C po dobu 5 dní a po 1, 3a 5 dňoch inkubácie sa pomocou pHmetru stanovuje pH každej kultúry. Kultúry, ktorých hodnota pH je 6,5 alebo nižšia, sú označené ako pozitívne a kultúry s hodnotou pH 6,6 alebo vyššou sú označené ako negatívne. U arginínového média sa hodnotí zvýšenie pH, zatiaľ čo u želatínového média sa hodnotí skvapalnenie. Každá skúška sa raz opakuje.

Rovnaký postup použijeme na charakterizáciu obligátnych anaeróbnych baktérií 16 až 29, len s tým rozdielom, že inokulum sa pripraví z organizmov pestovaných na CDCBA a všetky inkubácie sa uskutočňujú pri anaeróbnych podmienkach. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 5A až C a 3A až C.

Skúšky s obchodne dostupným systémom API rapid STREP

U fakultatívnych baktérií 1 až 9 sa hodnotí 20 biochemických vlastností (viď tabuľka 6) pri použití obchodne dostupného systému na identifikáciu enterokokov a streptokokov podľa inštrukcií výrobcu (Análytab Products, Plainview, NY, USA) . Postup je možno v krátkosti popísať takto: Kolónie z krvného agaru, ktoré boli inkubované na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín sa suspendujú v 3 ml sterilnej destilovanej vody za vzniku bakteriálnej suspenzie ekvivalentnej štandardu McFarland č. 5. Každá kopula sa inokuluje a prúžky sa inkubujú na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín. Po 24-hodinovej inkubácii sa pridajú činidlá na stanovenie produkcie acetoínu, hydrolýzy hippurátu a enzymatické reakcie na pyrrolidonyl-2-naftylamid,

-galaktozidázu, -glukuronidázu, -galaktozidázu, alkalickú fosfatázu a leucínarylamidázu.

Reakcie sa hodnotia po

10-minútovej inkubácii pri izbovej teplote ako pozitívne alebo negatívne. Hydrolýza eskulínu, arginín dihydroláza a produkcia kyseliny z ribózy, arabinózy, manitolu, sorbitolu, laktózy, trehalózy, inulínu, rafinózy, škrobu a glykogénu sa hodnotia ako pozitívne alebo negatívne. Každá skúška sa vykonáva dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

Skúšky s obchodne dostupným systémom API STAPH Trac

U fakultatívnych baktérií 1 až 9 sa hodnotí 19 biochemických vlastností (viď tabuľka 7) pri použití obchodne dostupného systému podľa inštrukcií výrobcu (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Postup môžeme v krátkosti popísať takto: Kolónie z krvného agaru, ktoré boli inkubované na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín sa suspendujú v 3 ml sterilnej destilovanej vody za vzniku bakteriálnej suspenzie ekvivalentnej štandardu McFarland č. 5. Každá kopula sa inokuluje a prúžky sa inkubujú na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín. Po 24-hodinovej inkubácii sa pridajú činidlá na stanovenie produkcie acetoínu, alkalickej fosfatázy, nitrát reduktázy a enzymatických reakcií, na ktorých sa podieľa -metylglukozid, arginín dihydroláza, glukóza, fruktóza, maltóza, manitol, manóza, melibióza, N-acetylglukózamín, rafinóza, sacharóza, trehalóza, ureáza, xylitol a xylóza. Reakcie sa hodnotia ako pozitívne a negatívne. Každá skúška sa vykonáva dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Skúšky s obchodne dostupným systémom API ZYM

U všetkých fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až 15 sa hodnotí enzymatická aktivita pri použití 19 substrátov (viď tabuľka 8) pri použití obchodne dostupného semikvantitatívneho enzymatického systému podľa inštrukcií výrobcu (Analytab Products, Plainview, NY, USA). Postup môžeme v krátkosti popísať takto: Kolónie z krvného agaru, ktoré boli inkubované na vzduchu pri 37°C po dobu 24 hodín sa suspendujú v 3 ml sterilnej destilovanej vody za vzniku bakteriálnej suspenzie ekvivalentnej štandardu McFarland č.

5. Každá kopula prúžku sa inokuluje bakteriálnou suspenziou. Po inkubácii pri 37°C po dobu 4 hodín v tme sa ku každej kopuli pridá činidlo A a Ba reakcie sa nechajú vyvinúť 5 minút pri izbovej teplote. Intenzita zafarbenia reakčnej zmesi sa porovná s interpretačnou schémou podľa výrobcu a klasifikuje sa takto: 0 = žiadna farebná zmena, stopy = menej ako 5 nmol, 2 =10 nmol, 3 = 20 nmol, 4 = 30 nmol, 5 = 40 nmol alebo viacej.

Rovnaký postup sa opakuje s obligátnymi anaeróbnymi baktériami 16 až 29, len s tým rozdielom, že inokulum sa pripraví z organizmov, ktoré rastú pri anaeróbnych podmienkach na CDCBA. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 8A až C.

Skúška pri použití obchodne dostupných misiek Presumpto I, II a III

Obchodne dostupné misky Presumpto I, II a III sa inokulujú obligátnymi anaeróbnymi baktériami 16 až 29 z CDCBA a potom sa misky inkubujú pri anaeróbnych podmienkach pri 37°C po dobu 2 dní. Skúšky sa vykonávajú a výsledky sa hodnotia podľa inštrukcií výrobcu (viď tabuľka 9). Každá skúška sa vykonáva dvakrát. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 9A až D.

Skúšky susceptibility vzhľadom k antimikrobiálnym činidlám

Na skúšanie fakultatívnych anaeróbnych baktérií 1 až na susceptibilitu vzhľadom k vybratým antimikrobiálnym činidlám sa používa štandardná disk-diffusion (viď tabuľka 10). Baktérie sa hodnotia ako rezistentné alebo susceptibilné (vrátane stupňa stredne susceptibilné). Každá skúška sa vykonáva jedenkrát.

Rovnaký postup sa použije aj v prípade obligátnych aeróbnych baktérií 16 až 19; v tomto prípade sa však používa CDCBA a kultúry sa inkubujú pri anaeróbnych podmienkach. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 10A až C.

Výsledky

Výsledky profilov sú uvedené v tabuľkách 1 až 10. Všetky baktérie sa identifikujú podľa štandardných kritérií pre kultúry a štandardných biochemických kritérií.

Príklad 3

Pokusy in vi vo s kuratami (brojlermi) .

Salmonella

Primárny hydinový izolát Salmonella typhiniurium získaný z laboratória National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA 50010, sa podrobí selekcii na rezistenciu voči novobiocínu (NO) a kyseline nalidixovej (NA) a uchováva sa v médiu s obsahom 25 mg NO a 20 mg NA/ml. Provokačné inokulum sa pripraví z nočnej kultúry, ktorá bola predtým prenesená trikrát do sójovej pôdy s tryptikázou a sériovo zriedená sterilným roztokom chloridu sodného pufrovaným fosforečnanom do dosiahnutia koncentrácie 4 x 10⁴ CFU/ml. Koncentrácia životaschopných buniek provokačného inokula sa potvrdí spočítaním kolónií v miskách s agarom zafarbeným briliantovou zeleňou. Médiá použité na kultiváciu NO-NA rezistentných izolátov z provokovaných kuriat obsahujú pri experimentálnych štúdiách 25 mg NO a 20 mg NA/ml za účelom inhibície rastu iných baktérií a nerezlstentných salmoniel.

Usporiadanie pokusu

Kohútiky (brojlery) sa získajú v deň vyliahnutia z priemyselnej liahne a umiestnia sa do kotercov s pevnou dlážkou, na ktorej sú ako stelivo umiestnené borové hobliny. Kuratá sa chovajú pri kontinuálnom osvetlení a umožní sa im voľný prístup k vode a nemedikovanému krmivu z kukuričnej a sójovej múky, ktorého obsah rozhodujúcich živín zodpovedá obsahu doporučenému National Research Council (1984) alebo je vyšší. Papierová výstelka transportných debien pre kuratá a tri náhodne vybraté 25-gramové vzorky krmiva sa postupne kultivujú v pufrovanej peptónovej vode, pôde so selenitom a cystínom a na miskách BGA, ako to bolo nedávno popísané v Andrews et al., 1978, Isolation and Identification of Salmonella, Bacteriological Analytical Manual, 5. vydanie, Assoc. Off. Anál. Chem., Washington, D. C., kapitola 6, 1 až 24, a analyzujú sa na salmonelu. Salmonella spp. sa nezistí ani na papierovej výstelke ani v krmive. Kuratá sa náhodným spôsobom rozdelia na dve skupiny, pričom jedna skupina (kontrolná) nie je nijako liečená a druhej skupine sa podá charakterizovaná kultúra (CC) v pitnej vode. Charakterizovaná kultúra sa zhromaždí ako výtok z prietokovej kultúry z príkladu 1, ktorý obsahuje približne 10® anaeróbnych CFU/ml. Táto kultúra sa pridá k pitnej vode v pomere 1,5 (1 diel CC na 4 diely vody). Ošetrované kuratá dostávajú upravenú vodu po dobu 18 hodín a odhaduje sa, že každé kura vypije 10 ml vody ošetrenej CC. Po 18 hodinách sa zostávajúca ošetrená voda odstráni a nahradí sa čerstvou vodou z vodovodu. Tretí deň, dva dni po ošetrení CC a pred provokáciou salmonelou sa 10 kuriat náhodne zvolených z každej skupiny usmrtí cervikálnou dislokáciou. Potom sa plynovou chromatografiou s kvapalnou stacionárnou fázou (GLC) popísanou vyššie (Corrier et al., 1990, Avian Dis. 34 : 617 až 625) stanoví koncentrácia kyseliny propiónovej (prchavá mastná kyselina, VFA) a celková koncentrácia VFA (kyseliny octovej + kyseliny propiónovej + kyseliny maslovej + kyseliny izomaslovej + kyseliny v obsahu slepého čreva.

Valérovej + kyseliny izovalérovej) zostávajúcim dávka 10* postup na kuratám sa vo veku troch dní podá CFU S. typhimurium (jedná sa vyhodnocovanie účinnosti novo1989, J.

Všetkým provokačná o odporúčaný pripravených kultúr cekálnych baktérií; Mead et al.,

Food Protect. 52 : 500 až 502) . 20 kuriat z každej skupiny vo veku 10 dní sa usmrtí a pri aseptických podmienkach sa im odoberie obsah slepého čreva, v ktorom sa ďalej uvedeným spôsobom zisťuje kolonizácia S. typhimurium. Cekálny obsah 10 desaťdňových usmrtených kuriat sa zvolí náhodným spôsobom a vyššie uvedeným spôsobom sa v ňom určí koncentrácia VFA. Pokus v tomto usporiadaní sa štyri razy zopakuje pri použití novovyliahnutých kuriat a charakterizujú sa cekálne baktérie, ktoré sú udržiavané v prietokovej kultúre po dobu 5 dní (pokus 1), 26 dní

4). Koncentrácia pokusoch 2, 3 a 4 (pokus 2), 40 dní (pokus 3) a 61 dní (pokus VFA obsahu slepého čreva sa stanovuje pri ale nie pri pokuse 1.

Koncentrácia ošetrených kuriat kyseliny propiónovej v obsahu slepého čreva sa významne zvýši s kontrolnými kuratami 3 a 4 (viď tabuľka korelácia (P < 0,005) propiónovej v obsahu kuriat a dekadickým v obsahu slepého čreva (r = -0,99).

(P < 0,005) v porovnaní v deň 3 a v deň 10 pri pokusoch 2, 11). Okrem toho existuje významná medzi zvýšenou koncentráciou kyseliny slepého čreva trojdenných ošetrených logaritmickým poklesom počtu salmoniel desaťdňových ošetrených kuriat

V deň 3 sa významne zvýši (P < 0,01) koncentrácia VFA celkom v obsahu slepého čreva ošetrených kuriat v porovnaní s kontrolnými kuratami (viď tabuľka 12) . Okrem toho existuje významná korelácia (PP < 0,01) medzi zvýšenou koncentráciou VFA celkom v obsahu slepého čreva trojdenných ošetrených kuriat a dekadickým logaritmickým poklesom počtu salmoniel v obsahu slepého čreva desaťdňových ošetrených kuriat (r = -0,67) . V deň 10 je koncentrácia VFA celkom v obsahu slepého čreva ošetrených kuriat podstatne zvýšená (P < 0,05) v porovnaní s kontrolnými kuratami pri pokusoch 3 a 4.

Kolonizácia slepého čreva S. typhimurium

Ako už bolo uvedené vyššie, pri aseptických podmienkach sa z každého kuraťa vyberie jedno slepé črevo. Slepé črevo sa nožnicami rozdelí na malé kúsky a inkubuje pri teplote 37°C po dobu 24 hodín v selenitovej-cystínovej pôde. Po inkubácii sa pôda načiarkuje na misky s BGA. Po 24-hodinovej inkubácii sa misky vyhodnocujú na výskyt typických kolónií S. typhimurium. Časť (0,2 g) obsahu zvyšujúceho slepého čreva sa sériovo zriedi a rozprestrene navzorkuje na misky s BGA pri zriedení 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000. Misky sa inkubujú pri teplote 37°C po dobu 24 hodín a potom sa v nich spočítajú kolónotvorné jednotky (CFU) S. typhimurium pri použití automatického počítača kolónií (Biotran III, New Brunswick, Edison, NJ, USA). Totožnosť typických salmonelových kolónií sa potvrdí biochemickými skúškami na agare s troma cukrami a železom a na agare s lyzínom a železom (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) . Druh salmonely sa identifikuje ako S. typhimurium sérologicky pri použití Salmonella 0 antiséra, skupina 13, faktory 1, 4, 12 a 15 (Difco Laboratories,

Detroit, MI, USA). Počet kolónií salmonely v miske sa vyjadrí ako log_io Salmonella/g obsahu slepého čreva. Obsahom slepého čreva, ktoré boli negatívne vzhľadom ku kultúre salmonely pri zriedení 1 : 100, ale pozitívne po kultivácii v prítomnosti selenitu a cystínu sa pridelí hodnota 1,50 log_io salmoniel/g obsahu slepého čreva. Kultúram so selenitom a cystínom, ktoré boli negatívne na miskách s BGA sa pridelí hodnota log_io salmoniel O.

Pre vyhodnotenie účinnosti liečenia pomocou CC pri rezistencii voči napadnutiu salmonelou sa vypočíta tzv. ochranný faktor (PF), ktorý bol nedávno definovaný v Pivnick and Nurmi, 1982, The Nurmi Concept and its Role in the Control of Salmonellae in Poultry, Developments in Food Microbiology, Davies (ed.), Applied Sciences Publishers, London, 41-70; Mead et al., 1989, J. Food Protect., 52 : 500 až 502. Ochranný faktor je definovaný nasledujúcim spôsobom:

stredný log_io salmoniel v kontrolnej skupine p_{F =} ---------------------------------------------------stredný log_iQ salmoniel v ošetrenej skupine

Rozdiely v počte kuriat pozitívnych vzhľadom ku kultúre

S. typhimurium medzi skupinami sa analyzujú pomocou analýzy chĺ-štvorcov. Rozdiely medzi strednými hodnotami sa určia pri použití Študentovho t-testu, významnosť korelácie a všetky štatistické postupy sa uskutočňujú spôsobom popísaným v Snedecor a Cochran, 1967, Statistical Methods, 6. vydanie, Iowa State University Press, Ames, IA, USA.

Pri každom z pokusov 1, 2, 3 a 4 počet S. typhimurium v obsahu slepého čreva ošetrených kuriat významne poklesne (P < 0,005) o 6,35, 5,39, 3,84 a 5,77 dekadickej logaritmickej jednotky (viď tabuľka 13). Ochranný faktor vypočítaný pre odhad účinnosti charakterizovanej kultúry pri pokusoch 1, 2, 3 a 4 robí 63,5, 7,14, 15,2 a 10,6.

Experimentálna provokačná dávka 10* S. typhimurium vedie ku kolonizácii slepého čreva u kontrolných kuriat vo veku 10 dní pri pokusoch 1, 2, 3 a 4 v 90 až 100 % (viď tabuľka 6) . V porovnaní s kontrolnými kuratami významne poklesne (P < 0,01) počet kuriat pozitívnych vzhľadom k cekálnej kultúre so salmonelou pri pokusoch 1, 2, 3 a 4 o 100, 65, 75 a 60 %.

Príklad 4

Príprava probiotika

Pripraví sa druhá kultúra v ustálenom stave pri použití prietokového postupu podľa vynálezu, popísaného v prihláške USA poradového čísla 07/921,173 podané 29. júla 1992. Táto citácia je tu uvedená ako náhrada za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohto vynálezu.

Táto kultúra v ustálenom stave, ktorá sa označí skratkou

CFII, sa skladá z 11 rôznych baktérií, a to z 4 fakultatívnych anaeróbnych grampozitívnych kokov, 2 fakultatívnych anaeróbnych grampozitívnych bacilov, fakultatívnych anaeróbnych gramnegatívnych bacilov, obligátneho anaeróbneho grampozitívneho bacilu a 1 obligátneho anaeróbneho grampozitívneho kokobacilu. Baktérie sú identifikované takto:

(1) Enterococcus faecalis (označený ako kmeň A), (2) Enterococcus faecalis (označený ako kmeň B), (3) Enterococcus avium, (4) Lactococcus lactis, (5) druh Lactobacillus (označený CMS), (6) Lactobacillus animalis, (7) Citrobacter freundii, (8) Escherichia coli, (9) Escherichia fergusonii, (10) Bifidobacterium animalis a (11) Propionibacterium acidipropionici.

Táto kultúra v ustálenom stave vykazuje významnú účinnosť ako probiotikum pri podaní hydine a v porovnaní s neošetrenými vtákmi významne znižuje kolonizáciu hydiny baktériami Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis.

Tabul'ka ΙΑ

H m rH tď C •H O.

Ai ® ω

IO

H <u c •H

n.

•„I v λ: ω o p< x >« n« u

>· tí

U n₍ X

Pi u

>· Pi n

O Pl X >1 P<

X Pi

I E-' I I I I I I |

I H I I I I I I ) l fH i i I I i I I

I I I I I I II 7

I H I I I I I I |

I C-I I I I 1111 ωω ii lítií tn w i i i iiii xtí . . δ _

O O k Μβ Ό > βΗνβνΐ) > h o

Vtf MU rt L . -----. ~

H«jPOW>HOftfi W>HfdOrtHiíiO βνβ

J H ii · i i I I ω I r I || |

H H I J | | | | j

I w I I I I I I I

I '4 » I I I I f

I t· I l I I i i

II I I I I t l |

E-l f< I I I I | | |

I X

I i ·4 i i i i i i

I H I I Τ' Τ' Τ' I

I >4 I I I I I I ι h ι ι Τι i T ’g o cxj ?

O utí νΰ ____ u > > o > υ U O O M O O O fi h vtf Ό ri o

> νΰ 4J m

«Jxj p O W OH o Qifc OH IÍH E c β β hoijNiBNrtNrt^0, - _ e * * E Ο Ρι·Η ε·Η >·ΗΛί

Množstvo VFA a NVFA sa vyjadrí takto: - = žiadna produkcia T = produkcia stopového množstva, S = produkcia malého množstva L = produkcia veľkého množstva a V = produkcia veľmi veľkého množstva

• wuj III II i tn v) i i i xT'T

Tabuľka 1B

u>

Pi t X >4 i Pi

U> fl

Pi X >1 Pi

Pi in X r-¹ >1

P<

t5 P« Π X r-l >1 I Pl

i— >1

P<

ξ I i ι ι ι ι ιι ι ι I I I I I II ι H ι ι I I I I| ι e4 ι ι ι i7'7'7

I w I I I I H I ι H I I I I H 7 ι l i l l ι i l tn ι I I I ι I 7

I I I I I l l i i ι H ι ι ι ι ι Τ' i » h i Ti 7'7'7'7

l tn l ι ι ι t | | i tn Η ι ι Τ' Τ' 7 7 «tí > o tí «tí «tí š „ .

k «00 >

«tí «tí > > 0 0 ťtí tí r-l «tí «D > U O •rlvU<OM>HOftí OJ>-HtíOctíkrtíO £ O Dig ......

j k u k Ň ! β O Qrrí šxxxx’¹¹ l I I I I 7 T“ 7 xxxx¹¹¹¹ I tn I I II 7'7 ) ω I I l | ι i l H 'I Τ''í'7'7 ξ I t I I I M t I U I I I Τ' μ| Τ'

I ω ι I I H I ι « f ι ι Τ'7*7'7

I I I 1 1111 « ι ι ι Τ' Τ' Τ' 7 > {4 1 I I I H I

I I I I I »7 ^{4 1 f I | E4 I I I I I Τ' IM 7 ctí tí o „ tí>o «tí &

4J

U _ _ O k «tí Ό r-l vtí >

O «tí «tí > «tí 4J > > O > U O * · * O tí \ctí .__^rH>«DA4k43Ne>r-IO<eDN>_I1

Ctí U O O ω O rd O Plte O-rinJrdECPtí •*NCtíNCtí>krdXctípCtí(U<U •H>-H44gXJgOgcw ·γίΛ W

□ p, X x Ph

I H 1 I > I I I I i cn i i u i i i i

títo C CM •H Oh P

Λ! ω u Ch X x cu

I Eh iJ I I I I I I

I Eh h-4 I I I I I I

CM

U cu x x Ch * J J J J ^{1 1}

I I I I I I >-4 I

Ό CM

U Ph X x

Ph i <n i i i i i i i

I I I I I I I I I

I »—J I I I I I I

I H l I l III in

CM > H u Ph X ><

P.

I 1-4 I I I I I |

I ω i i I III <d G vr •'•I CM

0H P M cn

U Ph X x

Ph

I I i-4 E-t ω 4 I I I

E-h ω ω i i i i i i ι ι ι ι ι ι ι

I I I I I I |4 I n CM

U Ph X x Ph

CM CM

U Ph X x pH ι ω ι ι ω ι ι ι ι ι ι-4 ι ι ι ι ι ι ι

I I I l'l J I I EH I I I I I I

u Ph x x Ph

I J I I >-4 I I I I

I W I I > I I I I

I CZ> I I I I ι ι

I Εη I I I I W I

Tabuľka 1C

vd
vd	>
>	0
o	ti vd
M vd Ό >

kl ο < Ρ. >

Cti „ . ._____{_} .. HvíOW>HOPC Λ> ----..Ž

5>-rl«J0<tifc(dO

O ft E rH M M < XJ O O ffl OH o Pifo uhN<dN(dNcd> O PrH E -H vd δ Ρ Ο Ο vd p. Vtí O > h O ο vd vd u > ‘ o o o tí

L tiXJ___

NOHO

P.HX<dtittí<D<y Λ E o E Ή ·ηΛ <M >

O ____

P Vtí '0 r-H <g oj n >,

E tí tí ti σι

KO rj + Ό I Ή + l

X) a + o I «Μ (ti + O I «Μ << z +

Φ ti CO43 _ ti '0 '>1 r4 •H «j + U I «Μ + I

u (ti Λ O U U k ti φ φ (ti -M ti (ti (ti 44

O ΦΛ g°

I· »c

4- Z + Z 4·

O	Ή
u	XI	E
	m	0
II	XJ
	rH	d)
43	ti	H

(ti N '>1 r4

E Φ44 ^Λ £ (ti ti ω Λ Ό h Φ (ti ti (ti

Tabuľka 2A

Charakterizácia bunky, kultúry a kolónie

4- ·!· •ť < 4· Z 4- Z ·!·

CN

4- O i

4- 44- Z 4· Z +

Z 4-

4-

U 1

(ti U-l

+

1

+

+

+

z

1

< Z +

ti

2 ti

Φ

ť *

0

m c

14

ChU'S,

lU

N

01'rl

(ti

(ti

co -

> 0

0

Ό

(ti r4

•rl

CD

E

O r·»

0

in

XJ

ti

U

Φ

(ti

Φ'>

xj m xj

Tí·

44

044

44

14

1CH~

r4

(ti 44 CO

(ti

(ti

O

(ti Ό >N

>N

rH

>1 Φ

Φ

(ti

CD 44

01 0

E

E

Φ

14

•rl

(ti

>i(ti ca

O O

O

o

n 44 (ti

CD (ti

Φ

• ·

Φ

co ti

CO

ti

(d

ti N

(ti Ό XJ

•rl

(tí

E 44

E E

•rl

•rl

N

(ti O<>1

> r4 t4

a

ti

0

ti

O 0

Φ r4

Φ H KÉ VvH U r4

0

0 rH

(o

p

0

C Ό

14 p

H

ti m r4

U

U 0

E

Ή -H 44

XJ

r

U

> -H

(ti tí

(ti 44 U Q 44

(ti 14

(ti

14 XJ

O

<0

o

14 N

01 «

01 CD

p

E (ti S Ό

14

0 0

(0 44 S 44 (ti

(ti Φ

(ti

Φ

u

Φ

Φ

U S S Q « M tí 3 M

U 44 '(ti (ti ti ~ <4-4

CO É ti H Φ > H ti O Ή Λ U O O Ό k * Φ (ti ti (ti

Iti Λ

II

Φ ti XJ ti Vti o b) cn

U -rl O rH

II • · rd •rl

II (ti o > o E N •H ti (tí 44 Cn u M >, O ti O XJ M vti 44 O) •H -H ®Λ ti >.ti co ?

o .. . CD O ti N-H Λ ΟΌΌ

M Φ (ti ti (ti

M (ti Cn (ti (ti ti Φ e m

h φ

44

Cn Φ O-ri r—l ti

O (ti rt! Ή 44 ffl M O O Ž&8

II (ti < m φ u «0 CD (ti (ti Ρ'Φ u « ¹ >X O Φ e : N -rl rl >N ti ti (ti O p) Pi _ _ o X-nO (tí ti 14 Ή XJ tí u

§

XJ (ti JJ rH ti (ti ti

Φ ti

II

-rj C t» ti e e

Tabuľka 2B

Charakterizácia bunky, kultúry a kolónie tn H co r4

CO H tn -x r4 n r4

Γ4

O

O <3 O

O i3 O tí tí «Μ f3 U-l tí U-I <

·»· x »

4•I/·«

Z.

v.

'ť z rX’

Z

4· < z + g₃ tí tí Úl'H tí i-4 oj? tí Ä CO r4 Jh Φ Φ CO Λ tí tí N N tí O^ Φ r4 C \>v<4 U r4 Lí tí m H U O O tíXU ΟΛ! tí M 0) CO Q E tí S Ό tí Φ U Φ Φ

M Pi tí M

tnÄ rú

Φ <0 s Φ •rl o P<

Λ! tí Φ

H-H tn tí . tíxO xj-h > H -H tí O O H tí E «4 -H Λ tí MU U

M R H tí O>N ... . 01 O tí >, tí CO O Φ

O tí tí o > u H U g g o o

C Ό

-H ň óo^tíÄišá m U S £ Q Pi tí

4J ω

Φ r—I M tí λ λ: (n w m φ en

CO

O·

OJ in n

Tabuľka 2C

Charakterizácia bunky, kultúry a kolónie

	(ύ	rf	rf rf rf		rf
	ο	z.	z z z		z
i n	1 d	rf 1	rf rf rf	+ 1	rf
I u	1 _θ	Z 1	z z z	+ 1	z
Λ	d	rf	rf rf rf		rf
+ u	1 ο	Z 1	z z z	+	z
	d	rf	rf rf rf		rf
+ Λ	ι ο	Z 1	z z z	+	z
	d	rf	rf rf rf		rf
+ Λ	1 Ο	Z 1	z z z	+	z
	d	rf	rf rf rf		rf
+ Λ	1 ο	Z 1	z z z	+	z
	d	<	rf rf rf		rf
-1- Λ	1 ο	Z 1	z z z	•1·	z
Λ	d	rf	< rf rf		rf
+ U	1 ο	Z 1	z z z	+	z
	d	rf	rf rf rf		rf
+ η	1 0	Z 1	z z z	+	z

m •rl

>4 O ο^ιΰO X S Q Pi

Tabulka 3A

Biochemické vlastnosti o

H 4- | cn

ΓΊ

4- l (ti í

Φ •d •i o 0« • · b 4J Aíti k u •d k cti 01 (ti (ti Ό <O a ^β Vti (ti (ti O Λ > tí (ti -d XJ Ό O -d N U O$ ‘ (ti N flj H Vti M k (ti Ό tí 4J -H Ό -H (ti X Φ C « O «

+	+	ra X . ra + i	+ 1	+
+ +	1 + +	ra X a i i	1 1	1
+ +	+ + +	d X ra i i	+	1
+ +	+ + +	ra x ra i i	+ 1	1
+ +	+ + +	ra X ra i i	+ 1	1
+ +	• + + +	ra X Q 1 1	+ 1	1
+ +	+ + +	ra x ra i !	+ 1	1

l + + + 4- + g· •d k (ti Λ o cti (0

1 1	+ 1
1	+	<< tí;	1 i
1 1	+	tí;	1 1
1 1	+	tí;	1 1
1 1	+		1 1
1 1	1	Z	1 1
+ 1	+	<< tí;	1 1

d

X ra i l + i i i i d X ra ra \ d tí;

t •d xa >< g o _________ ... k p -d u u u c -d x: o 5-irdrd Λί r4 tí H uk -o tí (ti N _ Vti -d id tí fcg >. o o β Λ>β ή k <d 4J (ti _ o tí Ό (ti tí ,>C! Λί-d

Λ! Φ ω 'd > O (ti •O k k -d O Φ & o t — O rď M tí vti β fi >A β fti d<<ti Ň (ti N Xti (ti N COH (ti •dd oo A(ti4J -------N‘d aO Ό -H U (SE-* (ti N (ti N __... _ 4-> .. > xj i Λ1 uyti Ό k N rd

ΦΌ Φ tí tí ÍHid’-d tí m d S d ítí(ô δ ŕd'Ad 1»' 5) δ íirď tň-d n φ > ω ä> (ti rd Λ! ftuQ J S 2 ωωθι> ftw φ o k -d « k Ό Χτ)Λζ>ν k u p < s > λ o , s < p w p i

tí _ . . „ ________ „ . . .. _ ______ >ik ΜΌ hO-dflw^ rtiHvti

Tabuľka 3A- pokračovanie

Redukcia nitrátu:

na nitrátovom agare: + = rast, - = žiadny rast anaeróbnou metódou: sa určí kotúčkovou metódou na krvnom agare

Utilizácia sacharidu: + = produkcia kyseliny,

- = žiadna produkcia kyseliny

Agar TSI vodorovný/šikmý: a = kyslý, b = alkalický Lyzín dekarboxyláza určená na agare LIA

NA = nepoužiteľné cn r4

CO H

II Z I rH

II Z I id in h + i x· <-l n rH

CN H

-I- I

446

< < z z	/3* z z z z z z	ZZZZZZSZ1
c < Z z	ŕíj rtj z z z Z Z z		+
< < z z	Λ« Λ5 rtí Z Z Z Z Z Z	<<<!<(<<<< í< < z z z z z z z z	4·
< << z z	rtí rtí rtí rtí rtí z z z z z; z.	|<<<<<<<|<<<^|< z z z z z z z z	1

4- H- -I- I

4·

4i + 4-I-

44<0

X «J + I + I + + + I

rJ X ta •I· 4- I •I4vlastnosti

	χυ
m 44
M	u
	•d
ttí	E
44	Θ
rl Λ
P	U
Λ	0
m	•d
E-t	e

• · d X> Vtí

M X> •H

M m Cn «1 & •d XJ (tí (tí <tí N N r4 Mtí Mtí Φ r4 rd >N k Φ •tí O-d tí Ä k cd •d ttí > 'd 44 O d>tí tí d rl ttí tti % •rl k ttí .tí u td ra tí k rl Φ O tí *d ttí tí >tí 44 -d 44 Φ ra

Ϊ •rl xn t o k _ .. >,r4 H^dCHUk'Ok^d'dkO -d *d (tí vtí tí tí >11-4 -d p ttí (tí ttí ttí ttí ttí O rl VI X> tD O X> rl Cn N > Φ ctí •d <O a

ttí

N tí O ttí •d

O vtí í> C Oj cd ctí o Λ t> tí ttí -d x> o O -d N O'td ' r4 Mtí 44 k rtí Ό p u x) -d Ό -d (tí X Φ tí W O ta (tí

N vtí k N H ΦΌ Φ « J* ra r4

O

.. XJ N -d '0 Ό .

tí -d O XJ XJ tí *d Ä ctí N i—I O _ XJ 'd k rl U flj h

I—I co h > o n •O k k -d ‘ (Dft U

X)

O „ > >O I 44 X> 'ttí *d tí Ord M tí'ítí tí tí d Pt N ctí <-4 44 PtU Q »4 2 2 ω co d) > Pt w Φ p k -d <tí k X44 k ϋ !□ < 2 > o< u 2 < co P

- 47 CO (V o <N in

N I I

< ,< z z z z z z <<<<<< z z z z z z <<<<<< z z z z z z <<<<<<<<

Z ~ -------<<<<<<<< ZZZZZZZZ) <<<<<<<< ZZZZZZZZ

Tabul'ka 3C

Biochemické vlastnosti

								& •d
								AJ
				Ό				(tí (d ctí
				•d				N N rd
	• ·			M				Vtí Vtí Φ
	3			(tí		Φί	, s	rd rd >N
	AJ M			X		E	$d rd	O S
	vtí (tí	(tí		O		A!	Φ O	H X Φ
	h (n	Ό		(tí		•d	tí Ό	Ό O-d
	aj <d	<O		m		xn	(tí tí	>ιΛ C
	•rl	Q,					>tí Aí-d	xi íd m
	d '>Ί			(d	(tí	'>1	Λ4 Φ ra	•d (tí >
	F	C vtí	(tí	rl rd	rd N	tí	vd t> 0 (tí	•d Λ4 0
<d	(tí 0 Λ >	a	U 0	(tí (tí 0 tí Ό	H >	Ό M M -d	_ Φ»β
N	(tí -H AJ O O	•d	Vtí AJ	N N AJ Ή h	co o	O Φ Λ O	AJ d Ό rd
vtí	N O Vtí	U NH	N -rl Ό Ό ·γΙ O (tí H M	> XJ l AJ AJ Vtí Vd (tíítí
H Vtí Ä! Vd	Φ Ό	Φ 1	á-rl U	AJ AJ Cí -d £1	o f	J 0 H to tí Vtí	tí d c a N
nj Ό 3 AJ	(tí A!	ta	>,H rd A! rd tí rd O	íd Ό 5	*, U >, Φ Ό h	0 -d 'd (tí Vtí
AJ	•rl ŤJ d	C 5	>,rd-d 3	(tí (tí (tí (tí (tí	(tíOrd'dAJCDOAJrdCnN>QJ
m	X 4) β	(0 rd Aí Λ AJ Q J £ g U> W	cn>ftcn(DOM-H	(0 m >ia: m
w o «	C9					S Ρ» U £ < ►qwp

tn r·!

+ 1 + 1 I I I I + I I++I + + + + + + + 1 + 1 I I I I + I I++I+ + + + + + v r-I + + + + +I + I I + + + + + + + + + + + + + + + +I + I I + + + + + + + + + + +

I+ + + +I + III + IIIIIIIII I+ + + +I + I I I + I I I I I I I | I + I+ +I I I l + l I++I+ + + + + + + I + + I I I l + l I++I + + + + + + + + I I + -I- I I I I I I- -I- 1-)- -1-1 I I + + +I I + + I I I I I++I++III + «r Pu rO λ:

I 'Φ tí 4J Λ W >1

Eh 10 <0 N td rd vd N N r—r v0 vd X HH X o xo k £p Ό O M XP <0 Ä M Λ •H tO Φ ΟΧΌ Φ tí P tí \Η Ή JJ tí tí +> VO O ·Η 'rl H $H . ft tJÍN tíUW Φ Ä M X M -H «k I. „ O<JOOSOHH cd N vo tí •H § w Ό m N Vtí tí vo IM o U H rd rd tí «0 rl rl H N N Ή N rO O O O Ό Ό Ό rl O N+>+>4JNh*H(0tí 4J \O -d -H -rl Ό ro P Ό -rl rd Λί tí “ - ^J ~ m c H

Φ rtí tí N „ tDr-H P tí O Μ O <D rH ro β λ g p -h oip i E u h Xro ______Xrd O rd rO Φ E H

OOHfíCOieníOL..

>>n

Údaje z prvého/druhého opakovania + +I + I + I + I+ +I I + + I +

O rH

Ch

I + I+ +I4-+I + I4- + + + I + + I i + + i 4+ + + + +I+ + + + +I + I + + 11 +

JJ

Vtí

•H M 0) ko i i i + i i++i 1 + 14- + + +14-14- +

I + I + + 1 + + + 4-4- + + +

I + + + + +i++i+ _{+ +}|_{+ + + +}

X> Λί m PQ

I + I + + I + 4- I + + + + + 4-4- | 4- | 4· + + I

I +4-J+ + 4-4-I4-I+ + +I+4- 1 +

I + I+ + +I+4-I + I+ + +I++I4Tabuľka 5A

Skúšky fermentácie sacharidu (N rH

I + I + 4- I + + I + + I + + I + + 4I + + + + + 4- I+ + + + +I 1 + 14+ + + + + + I 4-4.4.4.4.4. + + + +

'>1 > O

Ό X> •H Ntí M M <0 +> Λ m O A m p m m m rH N OKO tí (tí £ N O k____ . .

A Ό o A (tí -d O A rH h Φ (tí N rH Ό (tí O X) N 4J-d (tí

C N H Kd Ό O rH -d X> (tí (tí A -d (tí N Ό rH

Ctí rH N 0'0 x) M m m N N (tí Ό Ό N-d tí id (tí rH _ _ Z : O AJ fi AJ KO M X> N φ Mtí Ό Ό Λ 'd rH O _____ . 4J ......_ _ _ „ _ . ,________NXJOJHO-dO-dN. C A υ A! U X> AJ C -d <H Ό A A Ό tDid X» Λί N AJ c Φ O O (tí rH p >κΛί r4Cr4<HAhOr4 >,r4 b,3OÄfidk„....OkpMrH(tí(tí(tí<D(tí-dO(tí>>iE<DMr4p(ä(tía)S<ti<t>A4k •d -H -d X) m N -d (tí (ú β N V4

N CM r-< CM

O CM + + I + 4- I + I + I+ + + + +I + + rd

XJ '01 r4 o N •H

I I l + I I + I I + I I + I + I I I I I

f—I '« r*·

I + I 4· + I + + + + 4- + + 4- I |

I 4- + 4- 4- I I

111 + •H M Φ

XJ pq co r-C t—{ sr rH m rd

CM r~i '>» >

O

Ό XJ •d '01

M M ol -P Λ M

U A ol tí ω ω

I 4· I

I -II· ·! 4- 4· 4· 4· + 4- 4· 4- 4-14-1 44-4-4-4I- -i- 4· 4- 4- 4- 4- I- 4-4-4-4-4- I 4-4-4-4-4-4- I 4-4-4I I I 4- 4- 4· 4- 4- 4- I 4- 4- 4I + I 4- + I + + + + + + + +

4-14-4-1 I + + I + <e

N r4 01 <-4

O ______

M XJ N N -d tí

Φ Ό5 Ό Ό A -H «4

O '0 O N XJ tí XJ Ό H -H -«4 XJ

01

N N 01 ctí Ό Ό r4 N 0'0 XJ M tí CH tí N O M

0$ tí nh xd '0 O H -d XJ 0$ A *d

N r-4 '0 O X-> XJ-d

N Ό r4 · r4 O

....... XJ_______ ______

Ό O ΜΌ-ΗΌ-Η N A Ό U A <tí tnr4 XJ A N XJ tí Φ o tí -d O A ‘ ;j tí r4 k E 1-4 M φ ......- - — - ..-.-..--....„αίοΐΦ^οΐίΰΛίΡ g (Vrt ωχ» Em

N -d 01

N

CH N

Ctí . .. _ , _ . . . _______N tíAUtMUXJXJtí -d M Ό A A Ό _

O Ctí rd p HtíHM4AUUr4 >. P O Λ!

tí N xd cv C4

P MS r4 f— O ΓΊ

N •rl r4 «RS •d M Φ P Ad RS n vo C4 in Γ4

I I I + I 1451 + I + I 44abuľka 5C‘ ikúšky fermentácie sacharidu

V ΓΊ r>

> O ro p •<4 «ia

M M <a p x: ω o Λ <a ti ω w

I I 14-11144- I I 14-114RS

N RS O O ________ N -d ti . -H -rl -d P Φ MS Ό '0 Λ -d nS r-4 N r4 RS t-1 O Ό O N O P ti P '0 P P

RS N

RS N

RS N r4

O O RS P P N-d RS

RS N r4 flS N ti rS ti N O M

RS N r4 Ό O P P -d

RS N Ό .. .. . _. . .. .. . r-4

OOP'O-dO-dNXjvOUÄRJ - . _ ť _ 3 ti -d O X5 i-4 >, ti o Λ! ti H P E r-4 P φ OPrHti(anS<D>rRSRSAdP UMOHjggÄtó ωχη H ti____

Ή'0 O r-4 -d P RS Λ-Η

RS N r-4 O P

Rf N

RS

C Λ U Ad U P P ti-d’H'OÄXÍ'O CDr4 X> Ad N P ti Φ O O RS r-4 ti SAd r-4 ti H »P Λ P O r-4 - - ⁿ ° -

OPtiHHRSRSRS®RS-dORS <<ĎfcCÍ)HJSSSPdtíWW

+ I I I I I I I 4- I I I I I I I I I II + I I I I I I I + I I I I I I I I I II + I + + I I I I d· + + I + I + d- I I +I + I I d · I I I I d · I d - I + I + d· I I +I

+ + + + I + + + + + + + + + + + I + +^ + + + + I + + + + + + + + + + + I + + I

XJ vo V0 i-i O

N •H + + + + I I I I + I 4- + + 4- + + I II

4- + + + I I I l + l+ + + + d-+l I II + + + 4- I + + I 4- + + + + I + + I+ +I

4· + + + I + + I 4· + + + + I 4·+ I+ + I a r4 Vtí •H M

0)

U * m m !T + + 4- 4- I I 4- + I 4- + + + I + + I I I I + + 4-+I l + l I+ + + +I+4-I I I I + + + 4- I I + I 4- + 4- 4- + I + 4- I l + l +4 4-1 I -I- I d- 4- 4- 4- -I- I -I- 4- I I + I cd

4- 4- 4- -I- I Ι4·Ι I 4- 4- I 4- + I 4· I I 4+ + + 4-I l + l I++I4-+I4-I l + l

Tabuľka 6

Skúšky so systémom API Rapid STREP rd

4-1 +4-1 I I I + + + I + + I + I l + l

4-14-4-1 I I I 4- 4- + I + + I 4- I l + l

XJ «0 o

XJ **. (tí Ju E 4J '>1 (Λ N Ä C 3 U V)

Ό •rl E (0 r4 >. XJ «14 (0 tí

d........- . .

i v0 vtí vtí ω E Ό

N

N <0 .. V0 N X0 XJ Vtí rd C0 10 Ό O N «Μ -H Jd rd CU 3 CU A! ______ _ _ ' tn rd Ό ΌΌΟ (tí m ~ &’ n tí n >-r| 010(000 O OVOmO tí IrdrdrdlOAťm-Hfiyd B O O Ord JJrlrdW tí - ·· _{u x} - -j -_Ä <D M $4 M«$rd(0<0U-rlvOAtíAXJArd<»4 O λ! CnO Ό M 0 0 0 A1 3 piA Η

O N >1 I lrdd)}4-HM(0Om>4tí<0^rd > WW CU tów 0

M <D . <0 -rd (tí N (D >ď-H ·ι4 ·ι4 «Μ rd A

.. .. N Ό XJ M XJ A4 (0 fU A* 3 A* O (tí (0

N r4 r4 Ό O O tí XJ XJ (0 N <0 O N rd ._______tí

N -rd -rl »rd «Ο (0 Ή <0 N Ό tí •H A O tí vu tn •n (0

n cn co

Tabuľka 7

Skúšky so systémom API STAPH Trac’

Enzým / ~ Bakteriálny izc

Substráte 1 23456 + + + + + + + + + i + + + + + + + i i + + + + + + + + + I + + + + + + 4- I I + + + + + + + I I + + 4- I + + I + + I + + + + + + + I I + + + I + + I + + I + + + + + + +I + I I + + + + + + + I + + + + + + + l + l I + + + + + + + I

4- 4- 4· 4- 4· 4- 4· 4-4-1 I 4- 4- + + + + I I + + + + + + + + + I I + + + 4- + + I I + + + + + + + I + I I + + + + + + + I + + + + + + +I + I I + + + + + + + I + + + + + + + 14-1 l + l 1 + 1+ 4-1 + + + + + + +I + I l + l I + I+ +I + 4- + + 4- 4- + I 4- I 4- + I I + I 4- 4- I

4- 4- + + -I- 4- + I -I- I + 4- I 14-1 4- 4- I

O -I- -I- 4- I 4- + I I I 14-1 I 4- I 4- 4- I + + + + I + + l I I l + l I 4- I 4- + I + + + + + + + I I I++I 1+ + + +I + + + + + + + I I I++I I4- + + +I

m N

Ό r4 Ό Ή O H N M N O Ό O Λ4 Aí 3Λ 3 rl -rl (tí r4 0)O N COH O <-4 >,β k >iXJ*H (tí XJ φ fi m

N	3
ΊΟ	β
3 xJ Ο
xJ <tí	•rl
	U
h ra	Φ
xJ 0	O
rl M4	(0
β
vtí	(tí

«JAÍ-rl ffS N ns N «j o N H rt m ν νΌ________

Ό U Ό Ό Ό <tí Λί Λ* β 4J 4J XJ 3 3 β r4 Λ! Φ ι-4 η m m «j μ r4

O <4 O -rl O ϋ O XJ O -rl U ·γΙ Λί β •Η XJ Λ Λ! γ4 β·Η -· - - β ·γ4 ·γ4 3 (β *0 «Μ Ό Λ Φ Ο ·<4 νβ β r4 r4 Ό OWH OSrt! 0) Φ r->r,.v._u.wr,«JÍ>,<l)a)r4»4flJ>i<e I · >4 Μ (tí N ítí N cn

Tabuľka .8A , < nm

Skúšky so semikvantitatívnym enzymatickym systémom api ovoE-«o>-iH£-'Honnonoooooo XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX oinoE-<Or-(H[-iE-<onno(Noooooo

ΟΟΕΗΝΝΗΝΗΟΟΝΓΊνηΟΟΟΟΟΟ \\XXXXXXX XX XX\\\\\\\ ΟΟΕΗΜΝπΝι-ΙΟΟΝΝτηΟΟΟΟΟΟ

OC-’Or-IOnoEHOHrlí'lO.HHrtf'JHOO

OHONONOHOEhNNOHHDNHOO

OOi-tOÍOrHOOOMrHCJOrHOCMEHOOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OOHCNOHOOOHHNOHONEHOOO u vd r-H O

N •rí

m

Q) U Λί rO CQ

VO

CM

OOfNCMOOOOOCMHrHOOOOriQOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OONNE-cOOOOOJHHOOOONOOO

OE-írdCMOOOOOOOnOOOOfHOOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OE-lr-INOOOOOOOdOOOOHOOO

O £-< <-< CM O ·-! O O O O C-* «-Ι O O O O ÍM O O O XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OE-írHCMOr-lOOOOE-íf-lOOOOC'ÍOOO

OOrHCMOHOOOOCMCMOE-lOrtOOOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OrlrINOHOOOOdNOHONOOOO ooononoHOt-incvooO’TnrHoo

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ooor-ioinoE^ootncNOOOvrvf-ioo

nasledujúcim spôsobom:

= menej ako 5 nmol, T (stopy) = menej ako 5 nmol, 1=5 nmol, 2 = 10 nmol, 3 = 20 nmol, 4 = 30 nmol a 5 = 40 nmol alebo viacej.

*Údaje z prvého/druhého opakovania

OinHr-iOOOOOONrMNmOOOtflOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ΟΙΠΗΗΟΟΟΟΟΟΝΝΝΠΟΟΟΙ.ΊΟΟ (Λ

H ooooooooooE-*Aononnooo xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx οοοΕ-<οοοοοοΕ-«Ε-<ογ>ογίποοο ra rH

r* rH pOHr-lOOOOOOOH^-ĽnovOOOO ,OOHHOOOOO0OH%-monOOOO

U)

in H v rH

οηο«Ηοοοοο·-ιοΓΜΐηοο«-<ιηηοο xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx or>oC-<ooooor4fMCNin<No«-<innoo onooovHooovnomoooooo XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ΟΝΟΟΟ'ΓΓ·ΙΟΟΟν·»Γθ<ΝΕ-«Οθε·ΙΟΟ οηηηη·«·<Ν.-|ΓΜΟ·'Γ<Ν<Νη^4ΓΜθ<ΝΟΟ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ΟΠηηΝνΟίΗΓΊΟνΓΊΝνΗΝΟΓ'ίΟΟ

OCMnnnV(NrHCNO«NHOOOOOOOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OrMnvnvCMHNOfMHOOOOOOOO orMoot-ítnnorMOvnorioEHOOOO XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX OMOOHtnriooionnonoEioooo

ooHHoooooOHNHooohooo •xXXXWWXX'xXXXXXXXX's ooEhhqooooohcnhooooooo cn oooooooooocnhoooooooo cn WX\WsW w\\\\\\

OOOOOOOOOOCNfNOOOOOOOO

CO CN

CN

CN

OE-COOOOOOOOf-ir-COOOCNOOOO WXWWWWX.WWWXX OčHQOOOOOOOHrHOOOCNOOOO oinoooooooocNf-cooooMOoo

OinOOOOOOOOCNHOOOOCNOOO

OOOHOOOOOOOCNOOOOOOOO oooHooooooocnoooooooo

OOrHfHOOOOOOOrHrHOOE-lE-lOOO XWXWW'xWX.WXXXXW OOHrHOOOOOOO<-4CNOOHHOOO

OOOrdOOOOOOO r-IOOOCNE-<OOA O O O r-1 O O O O O O E-l <H £h Eh O <1 r-l O O <-<

OOEhEhOOOOOOOHCNOOOOOOO wxwwwwwxwxxxx OOEhEhOOOOOOOiHCNOOOOOOO

a

Μι + +

I

i

I

8 s

CA

ω

CO m <

ca

Φ E

w

2 •0

+·* CA

S Ό

CA

Φ E

tn

Φ E

tí

Φ E Sm

t>

2 Ό

2

(0

(D

Z

(0

Φ

(U

(0

(0

Φ

<0

Φ

CO

Φ

<0

(0

CL

a:

DĹ

Q

CĽ

u.

or

x

OĹ

x

ttí

u.

QC

LL

QC

LL

oc

X

Tabuľka 9A

Skúšky za použitia systému s miskami Presumpto

< z	<0 3	0 •X O	J3 2	0 c c CO	to 3 s	§ c E	to c ra
Q f	«Ρ	E		E 1	f	E |	Φ *}<
Q	O	Ó	d	a	Q	0	0

Porovnanie rastu na LD-žlčovom agare s LD rastom na LD agare: I = menší rast; E = rovnaký rast

ω

o

'ω

CO

«rf (A

«j ’δ

a

g

«rf (A

«* (A

<

«>

E U·

«* W

k. Ό

ω

& Ό

«rf (A

E L.

w

E

«* (A

E U.

CO

CO

Ό

(0

£

>»

CO

φ

Q.

2

(0

CO

z

<0

Φ

CO

>%

CO

><

CO

Φ

ra

Φ

CO

Φ

CO

or

c

K

x

or

ľj

Q.

tr

X

Ω

t£

LL

X

r

or

X

ar

U.

ar

LL

Dí

u.

ar

Hadrolýza želatíny

Tabuľka 9B

Skúška za použitia systému s miskami Presumpto

(A E

2í o

•N

CO

T-

C4 CO ’T

Skúšky 9C

Skúšky za použitia systému Presumpto

< Z Q

I O

Hadrolýza želatíny

CO

CN

w

o

CA

£

e *o

tn

c ♦«· o

ra 8

8 g

CA

CA

ro (A <

+«· CA

φ E

CA

2 Ό

CA

2 Ό

•4·^ CA

Φ E

w

φ E

Φ E

S

CO

CO

φ

>s

(0

Φ

Q.

2

(0

(0

Z

CO

φ

(0

>»

CO

(0

φ

(0

φ

<0

φ

(0

tr

C

£

y

X

θ'

-J

□

D_

θ'

QĹ

Q

Qí

u.

θ'

X

Qí

X

θ'

LL

a

LL

ttľ

LL

or

Hadrolýza želatíny

Tabuľka 9D

Skúšky za použitia systému s miskami Presumpto

E

Ό •Φ E

•d

CA

E

CN

CO

Ό

< Z D

I Q

CN CO N*

CN CO

ΙΟ (Λ tO Pi ΙΟ

C0 ιο ιο ιο σ>

tO to

ΙΟ to to to to to π*.

to

10 to V) tí to to to to «

Ό •rl ϋ rl X) νβ rd Λ

O (d 44 •rl E •rl 4J

E rtí g

Ό (0 'rd Π

N >

ιο to to ν>

to to to to w tí o:

« to tí to pítotototototop:

to to wwdiwwwiflwp;

títítítítítítítntn o rd

4J MO rd O N rl >1 4J •r! rd •rl Ä •H U cu Φ u

CD u>

&

Eh CO r· to rl M Φ JJ

A4 nJ

M· rl

ΓΜ

TJ •H

C •H KJ to to n; to

Ä‘ to to títítítí to tí tí tí tí tí to to <0 tí to tí tí to tí to to to p: to tí to to p: to to to to tí tí to to tí p: to ď. to to to tí to tí tí tí 10 to to tí to to to tí tí to 10 tí tí cí to to to tí to to c: tí to to p: tí p: p: n: to to to to to p: to to to to tí to p: to to p: to to p;

V) n: to to p; n*.

r·', p:

to to tí tí tí to to tí p; p:

'5 C E rd'rl

E E'<d ·Η E MM υ u ^•d rd ftl Ή U ·Η E k E nl U <U P <U X -H E ·Η Λ . c O'r| Λ P O •H k O

E nh rd rd O X X •H E <U

E ftl to to p:

to vi p;

n: n; p: to tí u', r·; to u) n:

p; tí to tí tí tí to n; n: to π; π: n; to oitopiplpícítocopjrípítntjcítoto to

V) to tíuitítítítíuiuitítítítntítítítítn <ú c •H

,. - .. -i •r4 Q, tn U k <m

E E 3 m <tí ω tu 5<<tq«UU υ ε Ifl'H.E k <jM P >t-l . Φ E-H nJ 4J « “ k k Ό - , - O O E X -P -P rd rd Ή O >i E XXHrd k (D U U X X M U <U W >1 <2

E Vd : υ e .—..

I »»d C^x<d'H>

I E l)Vd U rdo

I o -<d “ -·

I k E

C C 'd c e '•H E -H C

U'H k'-H _ J E U >ι·Η X Ή ‘ — O ____ . E >1 N ftrd'H c e ra o x u c •H o 4J C E ra'H c c k U'H'H _ ______ . _ □ o rd X'H o ·Η JC >i >i <Μ·Η·Η >1 & P Ή U U E >i E U -H ......... . _ ,

GO'HO^OXlUEEaraCJrtO rt X Ä ·Η E k O -<d >1 Λ ω <m E k X E E P rd O -P > EMMdkrd-kPE (Q-HCIdW-rd0<U0-rlP3kV<U :<>qxx2;%s;p<cup:toio^H>

4J a ω u ω •H

N Φ M

II

Pi t· r4 •H Λ •rl XJ

OU

Φ U <0 3 ω

II

CO σ>

H co rH ti n;

Pi to tí v) co to to m W f i ti pí tí pí W « totíinvivitotítotíPítítíPíPÍPítí i/J ti w totocopitotítítítítítítín;

cotíwpítíPÍPíw io«cotí«títív) w tí to tí tí Pí ní«/) u vtí <-i O N •d • N rH to to tí ω ω to tí ω tí m ω to w tí to m tí to to w « tí g H? s P s N

S « Há · f, ^w &

i—4 I

MtJ ‘d 8

M x

•d Jj s

A4 § *0 d ta o

Λ N >

>1 JJ d rH •d Λ •d JJ Pi Φ υ co 3 ca d

ä

Λ 'C <0 A4 H ω ŕ xo

Ό rH »r <•1 ••I

CM rH r| rl o rH Ό d c •d KJ ti

V) to

V)

VI tí í4 tí p;

to to tí tí n: w to to tí to tí pí p; n.' n; tí tí tí to tí to tí to pí to to to tí tí to to to p; Pí m in tí w tí ω in tí

V) tí to p; pí to to p; p; p; w w tí tí <0

CO 10

V) tí Pi tO CO CO V)

CO tí

Pi

V)

CO tí V) p; p; vi

VI co

VI to

V) tí w tí to tí p;

VJ p; p; tn tO to pí p;

v>

to tí p; tí ω co

V)

V) tí V) tí

CO <0 aj •H c φ

E d ____ _ >4 j< ·η E -d Λ d d O • Λ Μ» f 1 I 1 ll i b I tí p; to p; p: tí

CO

CO tí tí V) CO CO to tí Pi to to to d c •rt tí V) tí ω

CO

V) to

VJ

V) tí tí in to to vi tí xí rH rH Q Λ!

u c ' d Ή c >4 U'H

4J >trH <D E*d

M'Sď.SdÉO-ď'OÍíip.QUÉÉftďjUďO ω ω >, x

C •M O JJ

C _ fl'HC C

E C -H

C >·Η ta '•h d

C C'h -h •o'-h C'rl'rt U U -rl £!

rH JJ d *d Jj JJ O d C J4 C O O d U OJ JJ Q» H rH a & u m in *h <ď «ď -d o c c jj h o í > c η ώ ΰ rj ·η jj c EECJddeJtUÄJCrHrHMCUd'HCUdCUTHOCUO'rtXJdkcCUd c C M ÍNhVH . _ .c

U^KH ΚΛΗ C >, N CUrH'rí C E 10 O X o

U C .CC *d »H CM'rl > n U'H u H O------------- . o ·<π O >1·Η X'H o Orl X^SH O H £ >, >t

JJdOME^EO-HOtM-H-H^i CU4J Ό 4J ϋ E I >4OdJ2dEO-dO>iOJ3UEEP«dddO o c; x jj +> d ;< £ -h e p p -h > d « w B M x 3'd de>dÄjcŕHríÍ4d *ο·η tu d tu ·<η δ <u ó -η jj 3 k tu d <n n

O) Λ» r· <M

v) vipícnt/iviviviinplviviviviplviin pi cnpitntnvivipiviplrdrdPlp: pl Pi Pi p; m in <λ p? p; o p;

vipivipipipipív)

Tabuľka 10C . · skúšky susceotibility vzhľadom k antxmxkrobxálnym cxnxdlám

----------------- Bakteriálny izolát »n Al rH M

O C“I Ό •H

C •H <n pi t/> p*, rd p: p. ω π: vj p; v> ν» vi vi p; <n p: pí p; p; p; p; p; p;

rd w p; w m in m p; tzi p; p; p; m p; p; p; ni p; w p; ω w ω m n; «n n; p; n; m n; p; rd n;

p! vi p; vi w ω «n p; in p; p; pi n; pi pi ni p;

rH O V) >, X

Ή C .C r-í'M C C C'm-H XJ'H _ .........._.

C'H'h U O ·Η jC M-i P ><rH G U'H U M O . C 'h r—I rH

O Ad Ad > _KC •HOC 'H

C rt'H C U C CC ·Φ Φ P U'H >ΛΗ c5h'h >

-----· c U >vH X'H >, E O -H E O ·Η Ό « Ad JC -H C C P H ' M Cl U 'HHPiíHpPECIE-HOH O-HCPCOO«lPftlUP£ rtjuajPWfHr-rpPOri.cie x-HE-Hjaiomoocxpp •H Qt tn U p <H <H rH «Η ·Η O X C_____ .

eea«iBj(ijfflÄjCHHP<ii«i^ci vi pi w rd pi m m u) en p; m r*l p! pi m n tn p; m rd p; p; p; vi «λ p; v> p; m rd ni w vjrdwplpipipivi c •H

O p c,

C E 'H C ·Η C ϋ'Η p'H C M ftr-í'H : E ití O Ad ϋ - >I>

O E a o P Ad P c ...______ _ .. <U <0

ÄSlZfcPitflAVJHE-O c c fO Ή (O'H C C k O'H'H

I - * ' _ ____ , M -H -H >, Q< P Ό P XO Λ ϋ E E ίΧιβ 0» ΕΡΟ·Η>ι<ΟΦ<μΕ O -P > C H <M P H -H Φ-ΗΟΦΟΉΡΟΡ , , _v I C π v

D O H X'H O ·Η jC

T a b u I k a 11

Účinnosť liečenia za použitia charakterizovanej kultúry cekálnych baktérií vyjadrená ako koncentrácia kyseliny propiónovej v cekálnom obsahu troj- a desaťdňových brojlerov¹

Pokus 2	Pokus 3 Pokus 4
Skupina	Deň 3 Deň 10	Deň 3 Deň 10 Deň 3	Deň 10
Kontrolná	0,6110,58 1,8210,	61 0,6810,60 2,4610,93 0,5410,58	2,8710,88
Ošetrená	21,28115,75* 27,64110,	15* 16,8518,14* 27,0119,48* 20,73110,78*	47,75112,4*

¹Hodnoty sú uvedené ako stredy ± smerodajné odchýlky zo súboru kurčiat v mmol/g cekálneho obsahu ♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,005)

Tabuľka 12

Účinnosť liečenia za použitia charakterizovanej kultúry cekálnych baktérií vyjadrená ako koncentrácia všetkých prchavých mastných kyselín dohromady v cekálnom obsahu troj- a desaťdňových brojlerov¹

	Pokus	2	Pokus 3	Pokus	4
Skupina	Deň 3	Deň 10	Deň 3 Deň 10	Deň 3	Deň	10
Kontrolná	9,0312,30	73,0116,43	14,0316,75 52,87116,98	16,6612,71	71,	95116,25
Ošetrená	14,7515,80**	80,84120,69	45,6018,05** 69,14123,04*	50,67122,59*	*107,	03128,63

¹Hodnoty sú uvedené ako stredy ± smerodajné odchýlky zo súboru 10 kurčiat v mmol/g cekálneho obsahu ♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,005)

Tabuľka 13

Účinnosť liečenia za použitia charakterizovanej kultúry cekálnych baktérií vyjadrená ako počet Salmonella typhimurium v cekálnom obsahu desaťdňových brojlerov

Logio Salmonella/g cekálného obsahu
Skupina	Pokus 1	Pokus 2	Pokus 3	Pokus 4
Kontrolná	6,35±0,99l	6,28±0,53	4,11±2,15	6,37±0,60
Ošetrená	0 ±0*	0,89±l,50*	0,27±0,69*	0,60±0,75*

hodnota je uvedená ako x ± smerodajná odchýlka zo súboru 20 kurčiat ♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,005)

- 67 Tabuľka

Účinnosť liečenia cekálnych baktérií s cekálnou kultúrou za použitia charakterizovanej kultúry vyjadrená ako počet desaťdňových brojlerov pozitívnou na Salmonella typhimurium¹

Kurčatá s cekálnou kultúrou pozitívnou na Salmonella/celkový počet kurčiat x 100 (%)
Skupina	Pokus 1 Pokus 2	Pokus 3 Pokus 4
Kontrolná	20/20 (100) 20/20 (100)	18/20 (90) 20/20	(100)
Ošetrená	0/20 (0)* 7/20 (35)*	3/20 (15)* 8/20	(40)*

♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,01) ^xHodnoty sú uvedená ako stredy ± smerodajné odchýlky zo súboru 10 kurčiat; mmol/g cekálného obsahu ♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,005) ¹Hodnoty sú uvedená ako stredy ± smerodajné odchýlky zo súboru 10 kurčiat; mmol/g cekálného obsahu ♦Významný rozdiel od kontroly (P < 0,005) * = (P < 0,005);

♦ ♦ = (P < 0, 01);

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Prostriedok na inhibíciu kolonizácie vtákov mikroorganizmom Salmonella, vyznačujúci sa tým, že obsahuje v podstate všetky nasledujúce v podstate biologicky čisté baktérie

   I. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne koky:

   (1) prvý kmeň Enterococcus faecalis, (2) druhý kmeň Enterococcus faecalis, (3) prvý kmeň Enterococcus faecium, (4) druhý kmeň Enterococcus faecium, (5) tretí kmeň Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) tretí kmeň Enterococcus faecalis,

   II. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne kokobacily (8) Lactococcus lactis, (9) prvý kmeň Lactobacillus,

   III. Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne bacily (10) prvý kmeň Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) baktérie patriace do čeľadi Enterobacteriaceae, (13) druh Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) druhý kmeň Escherichia coli,

   IV. Obligátne anaeróbne grampozitívne bacily:

   (16) prvý druh Propionibacterium, (17) druhý druh Propionibacterium, (18) druhý kmeň Lactobacillus, (19) prvý kmeň Bifidobacterium alebo tretí kmeň Lactobacillus, (20) tretí kmeň Propionibacterium, (21) prvý kmeň Eubacterium, (22) druhý kmeň Eubacterium, (23) neznámy bakteriálny kmeň označený ako OAGPB-5, (24) tretí kmeň Eubacterium, (25) druhý kmeň Bifidobacterium alebo štvrtý kmeň Lactobacillus, (26) tretí kmeň Bifidobacterium alebo piaty kmeň Lactobacillus, (27) štvrtý kmeň Propionibacterium,

   V. Obligátne anaeróbne gramnegatívne koky:

   (28) druh Veillonella a

   VI. Obligátne anaeróbne gramnegatívne bacily:

   (29) druh Fusobacterium.

   2. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tento prostriedok zahŕňa materiál uložený v zbierke ATCC s prírastkovým číslom 55 515 a/alebo tento prostriedok zahŕňa 26 z vyššie uvedených baktérií a/alebo tento prostriedok zahŕňa 27 z vyššie uvedených baktérií a/alebo tento prostriedok zahŕňa 28 z vyššie uvedených baktériía/alebo tento prostriedok zahŕňa všetky vyššie uvedené baktérie a/alebo tento prostriedok ďalej zahŕňa laktózu a/alebo tento prostriedok ďalej zahŕňa kokcidiostat, ktorý nie je účinný proti grampozitívnym baktériám a/alebo tento prostriedok ďalej obsahuje nosič a/alebo baktéria v tomto prostriedku je zapúzdrená.

   3. Krmivo, vyznačujúce sa tým, že obsahuj e krmivo pre zvieratá v kombinácii s prostriedkom podľa nároku 1. 4. Spôsob inhibície kolonizácie vtákov salmonelou, v y z n a č u j úci s a tým, že sa vtákom podá

   prostriedok obsahujúci v podstate všetky nasledujúce v podstate biologicky čisté baktérie

   I. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne koky:

   (1) prvý kmeň Enterococcus faecalis, (2) druhý kmeň Enterococcus faecalis, (3) prvý kmeň Enterococcus faecium, (4) druhý kmeň Enterococcus faecium, (5) tretí kmeň Enterococcus faecium, (6) Enterococcus avium, (7) tretí kmeň Enterococcus faecalis,

   II. Fakultatívne anaeróbne grampozitívne kokobacily (8) Lactococcus lactis, (9) prvý kmeň Lactobacillus,

   III. Fakultatívne anaeróbne gramnegatívne bacily (10) prvý kmeň Escherichia coli, (11) Citrobacter freundii, (12) baktérie patriace do čeľadi Enterobacteriaceae, (13) druh Pseudomonas, (14) Serratia liquefaciens, (15) druhý kmeň Escherichia coli,

   IV. Obligátne anaeróbne grampozitívne bacily:

   (16) prvý druh Propionibacterium, (17) druhý druh Propionibacterium, (18) druhý kmeň Lactobacillus, (19) prvý kmeň Bifidobacterium alebo tretí kmeň Lactobacillus, (20) tretí kmeň Propionibacterium, (21) prvý kmeň Eubacterium, (22) druhý kmeň Eubacterium, (23) neznámy bakteriálny kmeň označený ako OAGPB-5, (24) tretí kmeň Eubacterium, (25) druhý kmeň Bifidobacterium alebo štvrtý kmeň Lactobacillus, (26) tretí kmeň Bifidobacterium alebo piaty kmeň Lactobacillus, (27) štvrtý kmeň Propionibacterium,

   V. Obligátne anaeróbne gramnegatívne koky:

   (28) druh Veillonella a

   VI. Obligátne anaeróbne gramnegatívne bacily:

   (29) druh Fusobacterium;

   pričom tento prostriedok sa podáva v množstve, ktoré je účinné na inhibíciu kolonizácie čriev týchto vtákov salmonelou.

   5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tento prostriedok zahŕňa materiál uložený v zbierke ATCC s prírastkovým číslom 55 515 a/alebo tento prostriedok zahŕňa 26 z vyššie uvedených baktérií a/alebo tento prostriedok zahŕňa 27 z vyššie uvedených baktérií a/alebo tento prostriedok zahŕňa 28 z vyššie uvedených

   baktérií a/alebo tento prostriedok zahŕňa všetky vyššie uvedené baktérie 6. Spôsob podľa nároku 4, v y z n a č u j ú c i s a tým, že vtákom je hydina. 7. Spôsob podľa nároku 6, v y z n a č u j ú c i s a

   tým, že hydina je zvolená zo súboru zahŕňajúceho kurčatá, morky, kačky, prepelice a husi a/alebo, že hydina je mladšia ako asi 14 dní.

   8. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa vtákom ďalej podáva tiež laktóza a/alebo kokcidiostat, ktorý nie je v podstate účinný proti grampozitívnym baktériám.

   9. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že populácie baktérií sa podávajú s nosičom a/alebo, že baktérie sú zapúzdrené.

   10. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že stupeň podávania zahŕňa orálne podávanie populácií vtákom, prednostne v kombinácii s krmivom a/alebo vodou pre vtákov a/alebo postrek vtákov týmito populáciami a/alebo uvedenie do styku týchto populácií s kloakou vtákov.

   11. Spôsob izolácie probiotika, ktoré je účinné na inhibíciu kolonizácie salmonelou, vyznačujúci sa t ý m , že sa

   a) kultivačné médium zaočkuje trusom, obsahom slepého a hrubého čreva dospelého domáceho zvieraťa a vzniknuté zaočkované médium sa inkubuje v jednorázovej kultúre za anaeróbnych podmienok pri vzniku intermediárnej kultúry;

   b) intermediáma kultúra sa inkubuje v prietokovej kultúre pri rýchlosti výmeny média v rozmedzí od asi 0,029 do asi 0,10 h^-x, pH v rozmedzí od asi 4,7 do asi 6,5 a za anaeróbnych podmienok po dobu postačujúcu pre vznik ustáleného stavu a

   c) kultúra v ustálenom stave zo stupňa b) sa zhromaždí.

   12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že sa ďalej

   d) kultúra v ustálenom stave získaná zo stupňa c) podrobí screeningu na inhibíciu kolonizácie domácich zvierat salmonelou.

   13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že domácim zvieraťom je vták.

   14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že sa stupeň inkubácie jednorázovej kultúry uskutoční po dobu v rozmedzí od asi 6 do asi 18 hodín a/alebo že sa hodnota pH jednorázovej kultúry udržuje na asi 5,5 a/alebo že sa stupeň inkubácie jednorázovej kultúry uskutočňuje tak dlho, pokiaľ sa nedosiahne optickej denzity aspoň asi 1,0 a/alebo že sa stupeň inkubácie jednorázovej kultúry uskutočňuje po dobu asi do dvoch hodín od okamihu, keď hodnota pH dosiahla asi 4,2 a/alebo že je rýchlosť výmeny média asi 0,0416 h^{1 2 3} a hodnota pH v prietokovej kultúre je asi 5,5 a/alebo hodnota pH v jednorázovej kultúre nie je nižšia ako 4,2 a/alebo teplota jednorázovej kultúry a prietokovej kultúry je približne v rozmedzí od 26 do 47°C.

   15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že kultivačné médium obsahuje laktózu.

   16. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že stupeň screeningu zahŕňa

   1) zabezpečenie skúšobného domáceho zvieraťa a podanie kultúry v ustálenom stave zo stupňa c) tomuto zvieraťu
2. 2) zabezpečenie neošetreného kontrolného zvieraťa,
3. 3) správanie skúšobného zvieraťa a kontrolného zvieraťa po dobu 2 až 3 dní,
4. 4) určenie koncentrácie kyseliny propiónovej a koncentrácie všetkých prchavých mastných kyselín spolu v obsahu slepého čreva skúšobného a kontrolného zvieraťa a
5. 5) porovnanie hodnôt koncentrácie kyseliny propiónovej * a koncentrácie všetkých prchavých mastných kyselín spolu u skúšobného zvieraťa s príslušnými hodnotami u kontrolného w zvieraťa;

   pričom kultúra v ustálenom stave sa určí ako účinná na inhibíciu kolonizácie domáceho zvierača salmonelou, keď:

   1) koncentrácia kyseliny propiónovej u skúšobného zvieraťa je asi 10 mmol/g obsahu slepého čreva alebo vyššia a/alebo

   2) koncentrácia všetkých prchavých mastných kyselín spolu u skúšobného zvieraťa je vyššia ako koncentrácia u kontrolného zvieraťa približne o 100 % alebo viacej.

   17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia všetkých prchavých mastných kyselín spolu zahŕňa celkovú koncentráciu kyseliny octovej ’ + kyseliny propiónovej + kyseliny maslovej + kyseliny izomaslovej + kyseliny Valérovej + kyseliny izovalérovej.

   18. Probiotikum pripravitelné spôsobom podľa nároku 12.

   19. Spôsob screeningu bakteriálneho prostriedku na jeho účinnosť ako probiotika na inhibíciu kolonizácie domácich zvierat salmonelou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa

   a) zabezpečenie skúšobného domáceho zvieraťa a podanie skúšaného bakteriálneho prostriedku tomuto zvieraťu,

   b) zabezpečenie neošetreného kontrolného zvieraťa,

   c) správanie skúšobného zvieraťa a kontrolného zvieraťa po dobu 2 až 3 dní,

   d) určenie koncentrácie kyseliny propiónovej a koncentrácie všetkých prchavých mastných kyselín spolu , v obsahu slepého čreva skúšobného a kontrolného zvieraťa a t

   e) porovnanie hodnôt koncentrácie kyseliny propiónovej a koncentrácie všetkých prchavých mastných kyselín spolu u skúšobného zvieraťa s príslušnými hodnotami u kontrolného zvieraťa;

   pričom prostriedok sa určí ako účinný na inhibíciu kolonizácie domáceho zvieraťa salmonelou, keď:

   1) koncentrácia kyseliny propiónovej u skúšobného zvieraťa je asi 10 mmol/g obsahu slepého čreva alebo vyššia a/alebo

   2) koncentrácia všetkých prchavých mastných kyselín spolu u skúšobného zvieraťa je vyššia ako koncentrácia u kontrolného zvieraťa približne o 100 % alebo viacej.

   20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci * sa t ý m , že koncentrácia všetkých prchavých mastných kyselín spolu zahŕňa celkovú koncentráciu kyseliny octovej + kyseliny propiónovej + kyseliny maslovej + kyseliny izomaslovej + kyseliny Valérovej + kyseliny izovalérovej.

   21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa t ý m , že domácim zvieraťom je vták.

   22. Bakteriálny prostriedok účinný na inhibíciu kolonizácie domácich zvierat salmonelou pripravitelný spôsobom podľa nároku 19.