SK5796A3 - Use of indenoindole compounds - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka použitia hydrofóbnych antioxidantov majúcich indenoindolovú štruktúru na liečenie a uchovanie orgánov in vitro, tiež in vivo. Takéto zlúčeniny sú už známe a sú vysoko účinné v redukcii volných radikálov v lipidoch, alebo dvojfázových lipidoch, ktorých cieiom je peroxidačný proces lipidov a predchádzajú chorobám týmto, alebo podobnými procesmi. Jedinečnosť tohto vynálezu je. založená na použití jednej alebo dvoch špecifických zlúčenín, alebo ich solí, mimoriadne ich terapeuticky prijateľných solí, tak ako aditív v ochrannom roztoku pre orgány, mimoriadne však kardioplegiálny roztok. Takýto ochranný roztok môže byt použitý na liečenie orgánov in situ od darcu, tiež na uloženie orgánov, ktorú sú odobrané. Okrem toho predložený vynález uvádza zlepšený ochranný roztok pre orgány.

Doterajší stav techniky

Biologické procesy produkujú viac alebo menej stabilné medziprodukty obsahujúce nepárové elektróny, z ktorých jeden môže byt donorom, alebo párové elektróny, ktoré sú prijímané z okolia. Takéto medziprodukty sa nazývajú volné radikály a môžu byt produkované rôznymi enzimatickými a neenzimatickými reakciami, niektoré z nich sú dôležité pre životné funkcie, takého ako redukcie ribonukleozidových difosfátov pre syntézu DNA a generáciu prostaglandínov v prostaglandínovej reakčnej syntéze. Podstatná je pre zápal búrlivá odozva poranenej bunky a množstvo ostatných funkcií. Ostatné radikálové reakcie obsahujú myeloperoxidové reakcie v neutopilách a makrofáze; kťbré ničia baktérie a ostatné invadinové častice a prenos elektrónov v mitochondrínovom respiračnom reťazci.

Najvyšší organizmu obsahuje chemické antioxydanty také ako a - tokoferol (vitamín E), kyselinu askorbovú a rôzne radikály a peroxid - inaktivačné enzýmy, ako je superoxid dizmutázy, katalázy a glutation peroxydázy.

Voíné radikály rôznych typov sú stále viac spájané so širokým okruhom stavov a chorôb ako je ischémia a reperfúzia, ateroskleróza, trombóza a embólie, alergie, zápaly, stavy ako sú bronchiálna astma, reumatoidná artritída, stavy podobné Alzheimerovej chorobe, Parkinsonovej chorobe, stárnutiu, kataraktu, diabetes a toxické antineoplastické alebo imunosupresívne pôsobenie a chemikálie. Jedným z možných vysvetlení pre tieto stavy a choroby je fakt, že pre neznáme výsledky endogénneho ochranného pôsobenia proti strate (poškodeniu) radikálov nie sú dodatočne aktivované na ochranu tkaniva voči strate radikálov. Peroxidácia lipidov je dôvodom vytvorenia prebytočných radikálov, ktoré môže utvoriť významné poškodenie cesty vo vyššie uvedených situáciách. Inhibícia tejto lipidovej peroxidácie môže poskytnúť spôsob prevencie alebo ošetrovanie týchto stavov a ochorení.

Základná myšlienka na použitie antioxydantov na zmiernenie ischémie / reperfúznych poranení bola popísaná v niekoíkých článkoch, napríklad v Drugs 42 (4):569 - 605, 1991, a J Lab Clin Med, Vol. 119 (6):598 - 620, 1992. Možnosť použitia indenoindolov na zmiernenie ischémie a oddialenia poranenia tak ako ostatných stavov a chorôb boli navrhnuté M. Sainsburym a H. G. Shertzerom v patentoch EP - A 409 410 a GB 9022453.6-A. Avšak zo skúsenosti vieme, že je veími ťažké ukázať nejakú súvislosť medzi antioxidačným potenciálom a schopnosťou chrániť orgány. Dve špecifické zlúčeniny, ktoré boli teraz vynájdené na použitie na ochranu orgánov podía tohto vynálezu sú už zverejnené EP - A 409 410 a GB 9022453.6-A práve tak ako spôsob ich výroby.

Tento vynález popisuje nové použitie dvoch známych špecifických antióxidantov indenoindolového typu. Tieto obe zlúčeniny spĺňajú požiadavku existencie dostatočnej hydrofobičnosti, to znamená možnosť akumulácie v membránach a možnosť byt silnými inhibítormi pre peroxidáciu lipidov. Tieto antioxidanty môžu byt použité pri liečení v medicíne, na ochranu orgánov in vitro práve tak ako in vivo.

V porovnaní s ostatnými antioxidantami, t.j. s a - tokoferolom, tieto dve špecifické zlúčeniny sú velmi výhodné na použitie podlá tohto vynálezu.

Podstata vynálezu

Tieto dva mdenoindoly, ktoré boli teraz vynájdené su použitelné ako prísady do roztokpv chrániacich orgány a boli u nich objavené zjavné účinnosti, ktoré boli uvedené vyššie. Tieto zlúčeniny poskytujú trvalý a neočakávaný účinok proti rôznym ischémiám a reperfúznym noindoly majú všeobecný vzorec poraneniam. Tieto uvedene indeI a respekíve vzorec II.

H

I II

8-Metoxy-6-metyl-THII 9-Metoxy-7-metyl-izo-THII

Tieto zlúčeniny I a II môžu byť obe ako racemické zmesi, alebo tvoria čisté enantioméry. Do vynálezu tiež spadá použitie zlúčenín vo forme ich farmaceutický prijatelných solí.

Zlúčeniny vzorca I alebo II môžu byť podávané ako ochranný roztok ako také, alebo vo forme farmaceutických prípravkov, ktoré zahŕňajú ich aktívne ingrediencie ako sú volné bázy, alebo ich farmaceutický prijatelné soli ako je hydrochlorid, hydrobromid, laktát, acetát, fosfát, sulfát, citrát, sulfamát, tetrát oxalát a ostatné soli schválené ministerstvom potravinárstva a liečiv (FDA).

Aktívnu látku je vhodné doplniť do ochranného roztoku vo forme farmaceutický prijateľnej dávky.

Tieto zlúčeniny môžu byť prevedené na vhodné soli použitím štandardných postupov. Tieto vhodné bázy a prijateľné kyseliny sú rozpustené v použiteľných roztokoch za pôsobenia zahrievania alebo bez zahrievania. Kryštály sa utvorili bučí spontánne, alebo pri ochladení a potom sa ochladili a premyli malým množstvom chladného roztoku. Čistením a rekryštalizáciou z vhodného roztoku boli obdržané čisté soli.

Forma dávky môže byť bud kvapalný roztok, pripravený na použitie, alebo určený na zriedenie s ochranným roztokom. Alebo alternatívne môže byt dávková forma lyofilizovaná, alebo plnená práškom, prednostne zvolená s ochranným roztokom. Lyofilizovaná zlúčenina môže obsahovať vhodné zvyčajné excipienty.

Konečná koncentrácia aktívnej látky v ochrannom roztoku kolíše okolo 1 x 10“⁷ až do 10 % hmotnostných aktívnej látky.

Tieto ochranné roztoky sú vhodné na liečenie rôznych druhov orgánov, takých ako srdce, obličky a pečeň a tiež ich tkanivá. Takýmto všeobecne dostupným liečebným roztokom je Plegisol a ostatné ochranné roztoky najmä s ohľadom na ich pôvod, také ako sú UW - roztok (University of Wisconsin), Stanfordov roztok, upravený Collinsov roztok, J. Heart Transplant Vol. 7. (6):456-467. 1988. Tento dobrý ochranný roztok podľa tohto vynálezu je vhodný na liečenie orgánov metódou in situ u darovaných a odobraných orgánov.

Vylepšené ochranné roztoky môžu tiež obsahovať konvenčné co - roztoky, excipienty, stabilizátory a/alebo buffre. Liečebné roztoky môžu byt zvyčajne poskytované v rôznych dávkových jednotkách.

Zlúčeniny požívané podľa vynálezu sú známe zlúčeniny. Zlúčenina I je popísaná v EP - A 409 410 príklad 17, a zlúčenina II je popísaná v GB 9022453.6 A, príklad 55. Prezentované zlú5 ceniny môžu byt pripravené podlá informácií vo vyššie uvedených patentoch, alebo inými všeobecnými metódami.

Testy účinnosti a farmakologické vlastnosti zlúčenín

Indenoindoly používané na ochranu orgánov podía tohto vynálezu sú hydrofóbne a so stálou štruktúrou tvorenými katiónovými radikálmi, alebo oxidačnými radikálmi. Tieto silné antioxidanty, tak ako nameraná inhibícia u Fe²⁺ askorbátu spôsobili peroxidáciu lipidov in vitro, s IC_5Q nízkou hodnotnou 10 nM. (EP - A 409 410). Zlúčeniny vzorca la II sú schopné predíst oxidácii lipoproteínov u ludskej plazmy i v prítomnosti buniek hladkého svalstva u králikov alebo myší peritoneálnou makrofázou. Kedf sú tieto zlúčeniny používané ako aditíva do liečebného roztoku na liečenie orgánov, potom stúpa ich výkonnost a tiež lepšie zabraňujú ischémii a strate reperfúzie v izolovanej srdečnej bunke, izolovaná perfúzia srdca u potkana, potkania kostná dreň, obličky a pečeň. Tieto vlastnosti ukazujú, že zlúčeniny vzorca I a II sú pridávané ako aditíva v liečebných roztokoch pre orgány také ako obličky, pečeň, srdce a ich tkanivá.

Indenoindolové zlúčeniny sú účinné ako volné radikály alebo antioxidanty. Pri skúške meranej sústavy bola použitá požadovaná koncentrácia inhibície peroxidácie lipidov 50 % (IC₅₀) u zlúčenín vzorca I a II. Skúšaná sústava askorbát / Fe²⁺ závislá na peroxidácii lipidov a rovnaká sústava bola použitá v (EP - A 409 410) a detailné informácie o tomto systéme sú uvedené vo vyššie popísanom patente.

1. Askorbát / Fe²⁺ - závislý na peroxidácii lipidov i

í

Tabulka 1 ukazuje účinnosť indenoindolov a a - tokoferolu v askorbáte /Fe²⁺ - v závislosti na peroxidácii lipidov.

Tabuíka 1

Zlúčeniny P^IC50

Zlúčenina podía vynálezu:

8- metoxy-6-metyl-THII 8,0

Zlúčenina II podlá vynálezu:

9- metoxy-7-metyl-izo-THII 8,2

Porovnávacie zlúčeniny:

a - Tokoferol (Vitamín E) 5,0

Zlúčenina III:

4b,6,8,9b-Tetrametyl-THII 7,4 (EP - A 409 410, príklad 15)

2. In vitro hypoxia a reoxygenácia obličkového tkaniva

Reoxidácia lipidov bola tiež testovaná v renálnom tkanive. Vzorky boli získané z anesteziovaných potkanov v 2 mm plátkoch a vložené do 50 ml Erlenmeyerových baniek obsahujúcich 40 mmol l¹ Hepovho bufra (pH 7,40) 37 C (10 - 100 mg tkaniva na 4 ml bufra).

Obličkové tkanivo bolo počas 20 minút prebublávané čistým argónom cez bufor. Po tejto antioxidácii boli pridané prísady do bufra a tkanivo bolo držané pod argónovou atmosférou počas 20 minút. Vzorka bola potom reoxygénovaná prebublaním bufra s 95,5 % 0₂:C0₂. Po 30 minútach reoxygenácie bol pridaný chelátor kovu deferoxamín mezilájt (Ciba Geigy AG, Basel, Switzerľhd) s konečnou koncentráciou 4 5 μιηοΐ l^-1. Vzorka bola homogenizovaná v lade, rýchlo ochladená v suchom lade a alkolhole a uložená v -70 C. Po roztavení sústavy v 2-tiobarbirutovej kyseline reaktívnom materiáli (TBARS) bol určený (Svenssonom a ostatnými, Scand J Clin Invest 1993 : 53). Sila antioxidantov (pIC₅₀ to je

- log koncentrácie (antioxidantov) potrebná na redukciu TBARS sústavy 50 % vyššie hodnotených prísad) bola pre zlúčeninu I : 6.8.

Ex vivo ochrana renálneho tkaniva podrobeného hypoxii a reoxygenácii

V askorbáte /Fe²⁺ model zlúčeniny III (antioxidant majúci indenoindolovú štruktúru) bolo pIC^Q 7.4 vybrané do 8.0 a 8.2 pre zlúčeniny I respektíve II. Keď zlúčenina I a II bola podaná potkanom v orálnej dávke 50 mg/kg, zrušila lipidovú peroxidáciu v renálnom tkanive podrobenom ex vivo hypoxii a reoxygenácii do 6 hodín po podaní. V porovnaní ostatných zlúčenín s indenoindolovou štruktúrou zlúčeniny III, vykázala zlúčenina III slabý inhibičný účinok na peroxidácii lipidov, ktorý bol detekovaný iba do 30 minút po podaní. Tieto výsledky ukázali, že zlúčeniny I a II majú unikátne vlastnosti, ktoré sú účinné pre in vivo liečenie lipidovej peroxidácie.

3. Inhibícia straty reoxygenácie v izolovaných srdcových bunkách

3.1. Izolácia srdcových buniek boli dispergované roztokom (typ 1,

Boli oddelené srdcia z 2 až 6 denných potkanov a časti srdečnej komory boli umiestnené do Hanksovho vyrovnaného soľného roztoku bez Ca²⁺ a Mg²⁺, ale s 0,35 g/1 uhličitanu sodného a nakrájané v malých exemplároch. Bunky v roztoku, ale doplnené s kolagénovým

0.8 mg/ml) pri 37 C po 10 minútach a odstredené 160xg počas 5 minút. Potom bolo uskutočnené postupne 5 x v 20 minútových cykloch zažívanie. Bunky z počiatočného vylúhovania boli vyradené. Odstreďovanie bolo uskutočňované v dvadsatminútových intervaloch a roztok kolagenázy bol nahradený Hamsovým F10 kultúrnym médiom, doplný 10 % hovädzím sérom (FBS) 2mM glutamínu, penicilínom 50 IU/ml a streptomycínom 50 μg/ml. Úprava metódy obohatila izoláciu myocytov, ktoré boli použité vrátane nahradených buniek, po 30, resp. po 90 minútach. Myocyty boli umies8 tnené v miske, na ktorej bolo umiestnené jedlo s vrstvou 35 mm s hustotou približe 9 x 10^ buniek/ml.

(1.8 x 10⁶ buniek/jedlo). Bunky boli držané v kultúre počas 6 dní pri teplote 37 ^eC a 5 % CO₂ za aerobných podmienok vo vedeckom inkubátore. V priebehu tohto času je dosiahnutý zhluk buniek a tep srdca je spontánnejši a má približnú frekvenciu 20 - 40 tepov/minútu. Každá kultúra obsahuje 0,9 + alebo - mg protenínov. Doplňujúce F10 prostredie bolo merané každý deň. Antioxidačná zlúčenina II bola pridaná do kultúry v prostredí etanolu, bola dosiahnutá konečná koncentrácia 0,1 % etanolu. Konečná koncentrácia zlúčeniny II bola v prostredí kultúry 0.01, 0.1, 1.0 alebo 5.0 μιηοΐ/l. Pred počiatkom experimentu bolo prostredie myocytu odstránené a zamenené za čerstvé F10 prostredie doplnené glutamínom, ktoré bolo prebublávané čistým argónom jednu hodinu pred pridaním buniek. Kultúry boli premiestnené do špeciálne navrhnutého termostatického prostredia.

Experiment prebiehal počas 300 minút, ktoré zahŕňajú 60 mi nút injekcie, ked dusík (95 % N₂, 5 % C0₂) bol pomaly púštaný do buniek, nasledovalo 240 minút reoxygenácie (95 % 0₂, 5 % CO₂). Bunky ktoré boli životaschopné boli určujúce na prenikanie LD do živného prostredia a boli analyzované po rôznych časoch l, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300 minútach. Výsledky ukazujú, že koncentrácia 1 gmol/l (zlúčenina II) redukuje stratu (LD) v 90 % a vypočítaná hodnota pIC₅₀ (-logIC₅₀) mala hodnotu 7,5.

3.2. Zlepšenie postischemickej regenerácie srdca *

Navrhnuté experimenty skúmali účinnost myokardiálneho zotavenia po šiestich hodinách po ischémii, ked antioxidačné činidlo zlúčeniny II bolo pridané do kryštaloidného kardioplegického roztoku, takého ako je Plegisol (Abbott). Spätná perfúzia (Langendorff) izolovaného srdca u potkanov bola užitá v intra - vertikulárnej srdečnej oblasti.

Do srdca bolo vpravené (10 ml, 4 ’C) jeden Plegisol, alebo Plegisol doplnený 1 μιηοΐ/ΐ zlúčeniny II. Tieto srdcia boli uložené po 6 hodinách vo vlastnom roztoku pri 4 ’C.

V tretej skupine boli srdcia s Plegisolom bez uloženia.

V skupine sŕdc liečených zlúčeninou II s doplnkom Plegisolu bol vývoj tlaku (LVDP = vypočítané ako odchýlka medzi pikom systolického a konečného diastolického tlaku) významne zlepšený s LVDP o 90 % + alebo - 9 % (% preischemickej hodnoty znamenajúce + alebo - SEM) v porovnaní s 57 + alebo - 11 % v ochrane srdca s Plegisolom. Jediná perfúzna sila bez uloženia je výsledkom v LVDP 89 + alebo - 1 %.

Tieto štúdie ukázali, že pridaním zlúčeniny II do ochranných roztokov pre srdce, taký ako je Plegisol, je drastické zlepšenie obnovy srdečnej funkcie u potkanov a toto pridanie môže byť účinné pri klinických transplantáciách srdca, tak ako je transplantácia ostatných orgánov.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie antioxidantov zo skupiny indenoindolových zlúčenín majúci vzorec I a II v roztoku na ochranu orgánov.

   I II
2. 2. Použitie antioxidantov podľa nároku 1 na ochranný roztok na uloženie orgánov in vitro.
3. 3. Použitie antioxidantov podľa nároku 1 kde indenoindolová zlúčenina má vzorec I.
4. 4. Použitie antioxidantov podľa nároku 1 kde indenoindolová zlúčenina má vzorec II.
5. 5. Použitie antioxidantov podľa nároku 1 kde ochranným roztokom je rádioplegiálny roztok.
6. 6. Ochranný roztok pre orgány, vyznačujúci sa tým, že roztok zahŕňa kombináciu indenoindolovej zlúčeniny, majúci vzorec I alebo II a všeobecného ochranného roztoku pre orgány.
7. 7. Ochranný roztok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že roztok obsahuje okolo 1 x 10“? až 10 % hmotnostných indenoindolových zlúčenín.
8. 8. Ochranný roztok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že ochranný roztok pre orgány je kardioplegiálny roztok.
9. 9. Použitie zlúčeniny vybranej zo skupiny indenoindolových zlú čenín, majúcej vzorec la II na výrobu ochranných roztokov na liečenie orgánov in situ a darovaných orgánov.