SE516133C2 - Användning av vissa substituerade indolokinoxaliner för framställning av ett medel för skydd av vävnader, organ och celler vid transplantation - Google Patents

Description

516 133 2 I. Tiden vid intensivvård för donatom. Detta innebär exponering för syre (högre procent och tryck) och avbrytande av ett antal normala kroppsfunktio- HCF.

Il. Tiden efter avlägsnandet till funktionen i mottagaren. Detta år mycket kritiskt. Organet kyles till +4°C och tvättas med en lösning för lagring och trans- port, exempelvis en UW-lösning. Efter avlägsnandet lagras organet i nämnda lösning på is. UW-lösning år en saltlösning med tillsatser för upprätthållande av saltbalansen och undvikande av vâvnadsskada.

III. I mottagaren förekommer flera kritiska steg, varvid det första år reper- fusion, dvs. att återigen sätta igång blodflödet: Reperfusion förorsakar ett massivt oxidativt utbrott. För det andra förekommer immunreaktioner och lång- tidseffekter av transporten (partiell celldöd för vissa grupper av celler).

Optimeringen av transplantationsförfarandet år av stor betydelse och flera mot- tagares liv beror på att hela förfarandet är mycket effektivt och att organen icke förstöres i denna process.

Oxidativ stress inträffar när det föreligger en obalans mellan oxidanter och fria radikaler och skyddande mekanismer såsom SOD-enzym, katalas, DNA-repara- tion etc. Oxidativ stress år en större eller mindre del av de flesta sjukdomar, exempel är: Hjärt/ hjårn-infarkter, trauma, sepsis, artrit, sjukdomar hos immunsystemet, cancer, inflammation, infektion och CNS-sjukdomar. I alla dessa sjukdomar leder oxidativ stress till cellskada och utgången beror på om organet kan överleva den akuta fasen, en situation som är uppenbar under infarkt men även relevant för kroniska sjukdomar såsom artrit med en konstant oxidativ stress hos ledema.

Föreliggande uppfinning avser användning av ett medel vid transplantation av ett organ från en donator till en mottagare med behov av ett sådant organ.

Medlet enligt föreliggande uppfinning år lämpligt att använda i olika steg som har samband med transplantationsförfarandet. Medlet kan sålunda a) administ- 516 135 3 reras oralt, intraperitonealt eller intravenöst till en donator från vilken ett organ skall avlägsnas; b) medlet kan sättas till en lösning i vilken organet skall lagras och 'transporteras (exempelvis en UW-lösning); c) medlet administreras oralt, intraperitonealt eller intravenöst till mottagaren av organet, dvs. den patient i vilken organet skall implanteras.

Vid vävnadsnedbrytning är flera mekanismer inbegripna, eftersom oxidativ stress påverkar vävnader genom flera olika mekanismer, exempelvis genom oxi- dation av proteiner, lipider och DNA. Under oxidationen av proteiner och lipider hos vävnaden skadas alla strukturer allvarligt av fria radikaler, en följd av vilket är förlust av funktion som leder till celldöd och slutligen till död av vävnaden.

Enligt föreliggande uppfinning har det överraskande framkommit att genom användning av ett medel, som är en substituerad indolokinoxalin med följande allmänna formel I, skyddas det organ som transplanteras gentemot nedbrytning förorsakad av oxidativ stress under hela sekvensen av steg som är nödvändiga för genomförande av en transplantation.

Det medel som enligt föreliggande uppfinning skall användas i samband med transplantationen är en förening med följande allmänna formel I: 10 11 1 9 2 R RI 7 /ï 5 . a K* 3 vari Rl är väte eller en eller flera, lämpligen 1 till 4, lika eller olika substituenter i ställningarna 1-4 och/ eller 7-10, valda bland halogen, lämpligen Br, lägre alkyl/alkoxi-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, trifluormetylgrupp, triklor- metylgrupp; och i en av ställningarna 7-10 kan RI vara en hydroxylgrupp; 5 16 13 3 fl: _ fj=¿::¿ 4 eller cykloalkyl och n är ett heltal från 1 till 4 och R3 betecknar väte, lägre alkyl/cykloallql-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, och de fysiologiskt god- tagbara additionsprodukterna av föreningarna med syror och halogenaddukter, lämpligen addukter med jod, jodmonoklorid eller jodmonobromid.

Rl väljes lämpligen bland väte och lägre alkylgrupper, i synnerhet metyl. Ännu låmpligare är Rl metyl i ställningarna 2 och 3 och väte i de andra ställningarna.

En förening som visat sig särskilt effektiv är föreningen med följande formel II: I 3 \ I C33 II Cñg/ Y-ÜH: Sådana föreningar och deras framställning beskrives i EP-patentet 0238459 och US-patentet 4 990 510, vilka införlivas häri genom hänvisning.

Användningen av medlet enligt föreliggande uppfinning i dessa tre tillämpningar [I, II och III] är profylaktisk för att förhindra vävnadsskador under transplanta- tion. Genom behandling av den vävnad som skall transplanteras in situ aktive- ras således de skyddande mekanismerna vilka säkerställer överlevnad av orga- net. Medlet enligt föreliggande uppfinning verkar sålunda på så sätt att väv- nadsnedbrytningsmekanismerna nedregleras/blockeras vilket innebär att perio- den för lagring och transport av vävnaden förlängs. Denna förlängning av tiden innebär att ett större antal länder och områden kan inbegripas i utbytet av väv- nader för transplantation. När vävnader transplanteras utsättes de sålunda för vävnadsnedbrytning om icke DNA / protein / enzymer etc. hos vävnaderna skyd- das gentemot nedbrytning.

Allmän vävnadsskada kan mätas genom bestämning av metabolisk kapacitet eller vävnadsfunktíon. För en vävnad som levern är sålunda förmågan att redu- cera laktatnivåer i blod och producera galla sådana markörer (indikatorer). 516 133 5 Allmän vävnadsskada kan mätas genom bestämning av metabolisk kapacitet eller vävnadsfunktion. För en vävnad som levem är sålunda förmågan att redu- cera laktatniväer i blod och producera galla sådana markörer (indikatorer).

Eftersom DNA kontrollerar hela funktionen för cellen och därigenom hela vävna- den är oxidation av DNA även en riskfaktor för överlevnad. Oxidation av DNA är även en promutagen händelse.

I DNA-oxidationen exponeras celler för reaktivt syre. Under denna oxidativa stress oxiderar hydroxyl och superoxidradikaler dG vilket leder till 8-OH-dG- bildning som är en promutagen händelse som leder till strängbrott, bassubstitu- tioner, ringöppning av dG och/ eller påverkar DNA-metylering. (dG är deoxi- guanosin, en av basema hos DNA).

Medlet enligt formel I representerar ett potentiellt viktigt medel för att öka över- levnaden för celler och organ under transplantation genom att dramatiskt redu- cera oxidativ stress. Medlet enligt formel I är en icke-toxisk substans in vivo och skyddar vävnaderna på två sätt. För det första förekommer en blockering av oxidativa enzym (oxidaser) som alstrar oxidanter. För det andra förekommer en genreglering som aktiverar det allmänna cellförsvaret. Medlet enligt formel I fungerar sålunda icke som en antioxidant utan aktiverar försvarsmekanismerna för cellen för uppreglering av skyddet för oxidativ stress.

I de bifogade ritningarna visar Figur 1 oxidativa skador hos DNA (8-OH-dG) i ett leverperfusionssystem, Figur 2 in vivo-test av råttlevrar med analys av 8-OH-dG, Figur 3 inducering av ischemi i ett leverperfusionssystem och reduktion av laktat, Figurerna 4 och 5 laktat och gallflöde för råttlevrar i perfusionssystem, 516 133 6 Figurema 6 och 7 totalt gallflöde för råttlevrar i perfusionssystem och Figur 8 laktatnivåerna för rättlever i ett perfusionssystem.

För att undersöka de medel som skall användas vid transplantation enligt före- liggande uppfinning testades en lever från råtta i en perfusionslösning i en hjärt/ lung-maskin. För bestämning av organskada analyserades mängden av 8-OH-dG i levern. Som en inducerare av 8-OH-dG sattes dimetylsulfoxid (DMSO) till en perfusionslösning. (DMSO är en känd förening som påverkar cellmembran). I experimentet användes olika testgrupper, en kontrollgrupp av levrar, betecknade kontroller C, utan någon tillsats till perfusionslösningen, en grupp till vilken 100 ul DMSO sattes till perfusionslösningen, vilket resulterade i en betydande ökning av 8-OH-dG, och tre olika grupper till vilka en förening som skall användas enligt föreliggande uppfinning (B220) sattes i en dos av 2, 5 resp. 10 mg före tillsatsen av 100 pl DMSO. Resultaten av testet framgår av fig. 1 i ritningarna.

Av nämnda figur framgår att B220 skyddar gentemot oxidation av DNA på ett dos/respons-sätt. Dessutom framgår att 5220 kan reducera 8-OH-dG till under kontrollvärdena (nedreglering).

I ett annat experiment testades råttor in vivo och levrarna analyserades för 8-OH-dG. I detta experiment fanns tre testgrupper. En kontrollgrupp, en grupp till vilken 2,7-dinitrofluoren (2,7-dNF), som är en välkänd carcinogen som åter- funnits i dieselavgaser och inducerare av 8-OH-dG, administrerades oralt och en grupp till vilken både 2,7-dNF och en förening som skall användas som ett medel enligt föreliggande uppfinning (B220) administrerades. B220 administre- rades vid tre tidpunkter i förhållande till 2,7-dNF-dosen, nämligen -48 timmar, -24 timmar och +6 timmar. Alla doser administrerades oralt med substansen i maj solja. Kontrollprovet mottog endast bärare. Oxidation av DNA (oxidation av guanin, 8-OH-dG) bestämdes i levern. 8-OH-dG år en promutagen händelse som är korrelerad med flera olika typer av sjukdomar, exempelvis cancer, diabetes och infektionssjukdomar. 516 133 7 Resultaten av experimentet framgår av den bifogade fig. 2. Av nämnda figur framgår att B220 icke endast skyddar gentemot 2,7-dNF-inducerad bildning av 8-OH-dG utan även reducerar 8-OH-dG till under kontrollvärdena (nedregle- ring).

Ett tredje experiment genomfördes vari rättlevrar togs ut och utsattes för per- fusion i en hjärt/ lung-maskin. Perfusionslösningen är blod med en implanterad lever. När systemet har nått jämvikt stänges perfusionsflödet av och 10 till 20 minuter senare sättes perfusionsflödet pä igen, vilket kallas reperfusion (ischemi). En känd toxisk effekt av reperfusion (ischemi/infarcering) (Vävnads- skada beroende pä oxidativ stress) är den reducerade förmågan att avlägsna laktat från perfusatet. I detta experiment testades ett medel som skall användas vid transplantation enligt föreliggande uppfinning (B220) i jämförelse med tre olika föreningar kända för att skydda vävnader, nämligen acetylsalicylsyra (ASA, ett välkänt skyddsmedel för inflammatorisk skada och feber), Klomethiasol (ett nytt potentiellt läkemedel för behandling av hjärnskada beroende på hjärn- infarkt) och vitamin E (en välkänd antioxidant, elimineringsmedel för fria radi- kaler). I kontrollproven (C) inducerades endast ischemi. I de andra fyra grup- perna sattes de indikerade substanserna (5 mg) till perfusatet före ischemi.

B22O var den enda substans som gav en betydande reduktion av laktat. ASA som är känd för att nedreglera effekter som har samband med feber, inflamma- tion och smärta gav icke nägra skyddande effekter. Detsamma framgick för Klomethiazol (ett läkemedel för skydd av hjänivävnad efter infarkt) och vitamin E, en välkänd antioxidant och vävnadsskyddande substans.

Resultatet av nämnda tester visas i fig. 3. Av nämnda figur framgår att B220 var den enda substansen av de testade som gav ett statistiskt signifikant skydd.

En serie experiment genomfördes med råttlevrar i en hjärt/ lung-maskin (fig. 4 och 5).

Laktat sattes till en kontrolleverperfusion och gallflödet och laktatnivån bestäm- des som en funktion av tid. Gallflöde är den kliniska parametern för leverfunk- 516 133 8 tion, varvid gäller att ju högre gallflöde dess bättre leverfunktion. Resultaten av kontrollproven visas i de övre diagrammen i fig. 4 och 5. En normal lever ned- reglerar laktatet mycket hastigt till in vivo-nivåer (3-5 mM). Det normala gallflö- det i kontrollprover representeras av den streckade linjen.

I nästa experiment avstängdes en hjärt/ lung-maskin i 10 minuter och därefter startades den igen för att inducera oxidativ stress (reperfusion). Mängden laktat, som är ett mått på vävnadsskada, bestämdes som en funktion av tid och gallflö- det som en funktion av tid bestämdes även som en indikator på toxisk effekt.

Resultaten visas i fig. 4, mittdiagrammet, som indikerar en hög halt av laktat (heldragen kurva) och ett reducerat gallflöde (streckad kurva) efter reperfusion.

Båda dessa effekter är markörer för vävnadsskada.

I nästa experiment genomfördes samma reperfusionsexperiment med B22O när- varande i systemet i en mängd av 2 mg. Resultaten i form av laktatmängder och gallflöde visas i fig. 4, undre diagrammet. Såsom framgår av resultaten i fig. 4 anpassar sig mängden av laktat och gallflödet hastigt till normala värden, vilket indikerade att B22O eliminerar vävnadsskada hos levern som förorsakas av reperfusion. Både laktatavlägsnande och gallflöde var bättre än i kontrollproven.

I nästa experiment (fig. 5) sattes en mycket toxisk förening, triforbolester (TPA) till perfusionsvåtskan. TPA är en inducerare av inflammation och en mycket potent tumörpromotor. Resultaten beträffande laktatmängder och gallflöde visas i fig. 5, mittdiagrammet, vilket indikerar en mycket begränsad kapacitet att reducera laktat och en mycket begränsad kapacitet att producera galla.

Därefter repeterades samma experiment under samma betingelser med undan- tag av att 2 mg B22O även sattes till perfusionen. Resultaten visas i fig. 5, undre diagrammet. Av nämnda resultat framgår att när B22O finnes närvarande i sys- temet förhindrades de toxiska effekterna av TPA och värdena för laktat och gall- flöde äterställdes (och var t.o.m. bättre jämfört med kontrollproven i fig. 5, övre diagrammet). Dessa data är relevanta för det faktum att B22O in vivo i långtids- experiment kan stoppa den mycket potenta tumörpromotoreffekten av TPA (den 516 133 mest potenta tumörpromotorn som är känd i djurexperiment) och "stänga av" tumörprocessen. Verlmingssättet består i en blockering av hyperplasi/inflam- mation.

I ett ytterligare experiment testades råttlever i isolerad perfusion när B220 till- fördes donatom. Donatorerna tillfördes en enkeldos av B220 24 timmar innan levrarna avlägsnades kirurgiskt och hölls vid +30°C i 2 timmar innan de sattes in i perfusion (grupp 3). (Det förekom en "kort" lagring (2 timmar) av råttlever vid en hög temperatur (+30°C) för att efterlikna transplantation). Den andra gruppen tillfördes icke B220 och den första gruppen var kontrollprov som direkt sattes in i perfusion. Med en dos av B220 (i.p. 24 timmar före kirurgi) till dona- torn elimineras de toxiska effekterna bestämt som totalt gallflöde under perfu- sionen. "Transport" och reperfusion ger en massiv oxidativ stress som leder till vävnadsskada.

I fig. 6 var det totala gallflödet en indikator på vävnadsskada som inducerades genom transplantation. Kontrollproven "transp1anterades" direkt till perfusions- systemet medan den andra gruppen av levrar hölls i 2 timmar vid 30°C före "transplantation". Den tredje gruppen representerar de 2 timmarna vid 30°C- behandling men med tillsats av B220 till donatorerna. Av figuren framgår att B22O fullständigt återställde gallflödesvärdet till det för kontrollproven.

Samma experiment upprepades men i stället användes den temperatur som användes under transport av humanlevrar (+4°C). Levrarria lagrades i 24 timmar före installation i perfusionssystemet. Detta skall jämföras med 12 timmar som är det maximala för humanlevertransplantation. Såsom framgår av fig. 7 återställes gallflödet med förbehandling av B22O till donatorn. Fig. 8 visar samma skyddande effekt på laktatnivåer. Experimentet var identiskt med det som visas i ñg. 6 med undantag av använd tid och temperatur.

Experimenten visar att medlet enligt formel I skyddar levern under betingelser som användes för humanlevertransplantation. Detta innebär att medlet kan fungera vid lagringstemperaturer (+4°C) och transporttider som användes vid 516 133 10 humanlevertransplantation. Den skyddande effekten av medlet kan uppnås genom intraperitoneal, oral eller intravenös tillförsel. Tiden för förbehandling kan reduceras om denna tid inte finnes tillgänglig i den akuta situationen.

Tiden för transport mellan en donator och en mottagare kan dessutom mest sannolikt förlängas till 24 timmar jämfört med dagens maximum om 12 timmar.

Av exemplen framgår att förbehandling med B22O till donatom ifråga om trans- plantation effektivt nedreglerar den oxidativa stressen. Denna nedreglering eliminerar icke endast den oxidativa stress som förorsakas av transport utan nedreglerar även den oxidativa stressen till nivåer under kontrollvärdena.

Denna effekt i kombination med en mycket låg toxicitet (praktiskt taget icke- toxisk) tyder på att B22O interfererar med den normala regleringen (skyddet) av oxidativ stress. Dessutom möjliggör den lipofila karaktären för B220 snabb absorption via cellmembran.

Konsekvensen, för transplantation, är att det föreligger en förlängd överlevnad av vävnaderna, dvs. att längre transporter och lagring kommer att vara möjliga (större antal organ kommer att finnas tillgängliga för transplantation) och att chanserna för överlevnad och funktion av organen ökar.

Claims (8)

1 1 PATENTKRAV

1. Användning av en förening som är en substituerad indolokinoxalin med den allmänna formeln I: 10 11 1 vari Rl betecknar väte eller en eller flera, lämpligen 1 till 4, lika eller olika substituenter i ställningarna 1-4 och/ eller 7-10, valda bland halogen, lämpligen Br, lägre alkyl/alkoxi-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, trifluormetylgrupp, triklormetylgrupp; och i en av ställningarna 7-10 kan Rl vara en hydroxyl- gfU-PP; X är en grupp -(CH2)n-R2, vari RQ betecknar en kväveinnehållande basisk grupp, såsom NH2, NHR4 eller NR5R6, vari R4, Rs och RÖ oberoende är lägre alkyl eller cykloalkyl och n är ett heltal från l till 4 och R3 betecknar väte, lägre alkyl/ cykloalkyl-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, och de fysiologiskt god- tagbara additionsproduktema av föreningarna med syror och halogenaddukter, lämpligen addukter med jod, jodmonoklorid eller jodmonobromid, för framställning av ett medel för skydd av vävnader, organ och celler vid trans- plantation.

2. Användning enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a d av att det är en förening vari Rl är metyl i ställningarna 2 och 3 och väte i de andra ställ- ningarna. 516 133 išfšf; 12

3. Användning enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a d av att det är en förening vari RI i en av ställningarna 7- 10 är hydroxi, lämpligen i ställning 9.

4. Användning enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k - n a d av att det är en förening vari X är CH2N(CH3)2 och R3 är väte.

5. Användning enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k - n a d av att föreningen sättes till en lösning i vilken det organ som skall trans- planteras skall lagras och transporteras.

6. Användning enligt något av patentkraven 1-4 för framställning av ett medel avsett att tillsättas perfusionssystemet i samband med transplantationen.

7. Användning enligt något av patentkraven 1-4 för framställning av ett medel avsett att insprutas i eller tillföras en donator från vilken vävnaden skall avlägsnas.

8. Användning enligt något av patentkraven 1-4 för framställning av ett medel avsett att tillföras en mottagare av den vävnad som skall transplanteras. :iriz 13 SAMMANDRAG Användning av en förening med formeln I: 10 11 1 vari RI betecknar väte eller en eller flera, länipligen 1 till 4, lika eller olika substituenter i ställningarna 1-4 och/ eller 7- 10, valda bland halogen, lämpligen Br, lägre alkyl/alkoxi-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, trifluonnetylgnipp, triklormetylgrupp; och i en av ställningarna 7-10 kan Rl vara en hydroxyl- EYUPP; X år en grupp -(CH2)n-R2, vari RQ betecknar en kväveinnehållande basisk grupp, såsom NHQ, NHR4 eller NR5R6, vari R4, Rs och RÖ oberoende är lägre alkyl eller cykloalkyl och n är ett heltal från 1 till 4 och R3 betecknar väte, lägre alkyl/cykloalkyl-grupp som ej har mer än 4 kolatomer, och de fysiologiskt god- tagbara additionsprodukterna av föreningarna med syror och halogenaddukter, lämpligen addukter med jod, jodmonoklorid eller jodmonobromid, som ett medel för skydd av vävnader, organ och celler vid transplantation beskrives.