SK55593A3 - Expresion of recombinant proteins in attenuated bacteria - Google Patents

Expresion of recombinant proteins in attenuated bacteria Download PDF

Info

Publication number
SK55593A3
SK55593A3 SK55593A SK55593A SK55593A3 SK 55593 A3 SK55593 A3 SK 55593A3 SK 55593 A SK55593 A SK 55593A SK 55593 A SK55593 A SK 55593A SK 55593 A3 SK55593 A3 SK 55593A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
attenuated
bacterium
attenuated bacterium
protein
promoter
Prior art date
Application number
SK55593A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian G Charles
Steven N Chatfield
Neil F Fairweather
Original Assignee
Wellcome Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB919104596A external-priority patent/GB9104596D0/en
Priority claimed from GB919121208A external-priority patent/GB9121208D0/en
Application filed by Wellcome Found filed Critical Wellcome Found
Publication of SK55593A3 publication Critical patent/SK55593A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Vynález sa týka oslabených baktérií schopných expresie heterológneho proteínu, ich prípravy a vakcín, ktoré ich obsahuj ú.
Doterajší stav techniky
Virulentné kmene Salmonella môžu byť oslabené zavedením špecifických mutácií do génov potrebných pre prežívanie a rast in vivo. Zoslabené varianty, ktoré vytvoria samoobmedzujúce, klinicky bezvýznamné infekcie, môžu byť uvažované ako potenciálne živé orálne vakcíny voči infekciám Salmonellou.
Ty21a je oslabeným variantom Salmonella typhi, ktorá prechováva mutácie v galE a iné neznáme oslabujúce lézie a je povolená pre použitie v mnohých krajinách ako živá orálna tyfoidná vakcína.
Nedávno boli skúšané geneticky vymedzené kmene Salmonella prechovávajúce individuálne špecifické mutanty v rozdielnych génoch, ako experimentálne orálne vakcíny v niekoľkých cielených druhoch. Napríklad Salmonella aro mutanty, ktoré majú auxotrófnu požiadavku na niektoré aromatické zlúčeniny, sa ukázali ako účinné orálne vakcíny u myší, oviec, dobytka, kurčiat a nedávno sa ukázali ako oslabené a imunogénne u dobrovoľníkov. Salmonella dvojité aro mutanty sú uvedené v EP-A-0322237. Salmonella cya crp dvojité mutanty sú tiež účinnými orálnymi vakcínami.
Rovnako ako sú vakcínami v ich vlastnom zmysle voči salmonelóze, môžu byť oslabené Salmonelly považované ako nosiče heterológnych antigénov do imúnneho orálneho systému. To je preto, že Salmonelly môžu byť predávané orálnou cestou a sú potentnými imunogénmi schopnými stimulovať systemické a lokálne bunkové a protilátkové odozvy.
Heterogénne antigény z baktérií, vírusov a parazitov môžu byť zavádzané do hostiteľa pomocou salmonelových vakcín. Jedným potenciálne vážnym nedostatkom pri použití týchto živých vakcín pre antigénne predávanie sú problémy so stabilitou cudzej antigénnej expresie in vivo. Neregulovaná expresia vysokých úrovní cudzieho proteínu v baktériách z mnohonásobnej kópie plazmidov má obyčajne za následok rýchlu stratu plazmidu alebo exprimovaného génu z bunky.
Tento problém môže byť kontrolovaný vo fermentoroch pomocou indukovateľných promótorových systémov ako je trp alebo lac, k umožneniu riadenej indukcie génovej expresie keď sa získa príslušná biomasa. Samozrejme tieto promótory nemôžu byť indukované exogénne aplikovanými induktormi ako je PP alebo IPŤG keď baktérie narastajú v hostiteľských tkanivách počas samoobmedzeného rastu nasledujúcej vakcinácie.
In vivo plazmidová nestabilita počas vakcinácie živými bakteriálnymi vektormi bola v skutočnosti uvádzaná mnohými pracovníkmi /Maskell a kol., Microb. Path. 2, 295 - 305, 1987; Nakayama a kol. Bio/technology 6, 693 - 697, 1988; Tite a kol., Immunology 70, 540 - 546, 1990/. Boli vykonávané početné postupy k prekonaniu tohoto problému včítane použitia integračných systémov pre expresiu heterológneho antigénu z bakteriálneho chromozómu /Hone a kol., Microbiol. Paht. 5, 407 - 418, 1988; Strughéll a kol., Gene 88, 57 - 63, 1990/.
Avšak tento postup je vhodný len pre použitie u niekto3 rých antigénov, pretože expresné úrovne sú často celkom nízke /Maskell a kol., 1987/. Nakayama a kol. popísali použitie pripojenia esenciálneho génu k expresnému plazmidu pre stabilizáciu exprese in vivo. Hoci to je vysoko účinný postup, nezabraňuje tvorbe plazmidov prostých variantov, ale len zaisťuje, že neprežívajú. Ďalšia stabilná, ale konštitutívne vysoká úroveň expresie cudzieho antigénu v salmonelovom vakcinačnom kmeni by mohla spomaliť rýchlosť rastu a teda potenciálne ovplyvniť imunogenecitu živej vakcíny.
Podstata vynálezu
Podlá predloženého vynálezu je vytvorená oslabená baktéria, ktorá je schopná expresie heterológneho proteínu, pričom táto expresia heterológneho proteínu je pod kontrolou promótora, ktorého aktivita je vyvolaná anaeróbnymi podmienkami .
Stabilná expresia heterológneho proteínu môže byť získaná in vivo. Zoslabená baktéria môžu byť. teda použitá ako vakcína. Akákoľvek vhodná baktéria môže byť použitá, napríklad Gram-negatívna baktéria. Niektoré Gram-negatívne baktérie, ako je Salmonella, vnikajú a rastú vo vnútri eukariontných buniek a kolonizujú mukózne povrchy.
Oslabená baktéria môže byť teda vybraná z rodu Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophillus, Neisseria a Yersinia. Alternatívne oslabená baktéria môže byť oslabeným kmeňom enterotoxinogénnej Escherichia coli.
Najmä môžu byť uvažované nasledujúce druhy: Es.typhi - príčina ľudského týfusu; Es.typhimurium - príčina salmonelózy u niektorých živočíšnych druhov; Es.eneeritidis - príčina potravinovej otravy u ľudí; Es.choleraesuis - príčina salmonelózy u bravov; Bordetella pertussis - príčina čierneho kašľa; Haemophylus infuensae - príčina mengitídy; Neisseria gonorhoeae - príčina kvapavky; a Yersinia - príčina otravy potravinami.
Oslabenie baktérie môže byť prisúditelné nerevertujúcej mutácii v géne v aromatickej aminokyselinovej biosyntetickej dráhe baktérie. Je tam aspoň 10 génov zahrnutých pri syntéze chorizmatu, odvetvenej zlúčeniny v aromatickej aminokyselinovej biosyntetickej dráhe. Niektoré z týchto máp vo veľmi rozdielnych miestach na bakteriálnom géne, napríklad aroA /5-enolpyruvil-shikimate-3-fosfátsyntáza/, aroC /chorizmat syntáza/, aroD /3-dihydrochinát dehydratáza/ a aroE /shikimat dehydrogenáza/. Mutácie sa teda môžu.vyskytnúť v aroA, aroC, aroD alebo aroE géne.
Výhodne však oslabená baktéria prechováva nerevertujúcu mutáciu v každom z dvoch diskrétnych génov vo svojej aromatickej aminokyselinovej biosyntetickej dráhe. Takéto baktérie sú zverejnené v E.P-A-0322237. Dvojité aromutanty, ktoré sú vhodné, sú aroA, aroC, aroA aroD a aroA aroE mutantné baktérie. Iné baktérie, majúce mutácie v iných kombináciách aroA, aroC, aroD a aroE génov sú však tiež užitočné. Zvlášť výhodné sú dvojité aro rautanty Salmonella, napríklad dvojité aro mutanty S.typhi alebo S.typhimurium, najmä aroA aroC, aroA aroD a aroA aroE mutanty.
Alternatívne môže oslabená baktéria prechovávať nerevertuj úcu mutáciu v géne, ktorý má spojitosť s reguláciou jedného alebo viacerých iných génov /E.P-A-0400958/. Výhodne sa mutácia vyskytuje u ompRgénu alebo ďalšieho génu zapojeného v regulácii. Existuje veľký počet iných génov, ktoré sú spojené s riadením a sú známe ich odozvy na stimuly prostredia. /Ronson a kol. , Celí. 49. 579 - 581/.
Tento typ oslabenej baktérie môže prechovávať druhú mutáciu v druhom géne. Výhodne je druhý gén taký gén, ktorý kóduje pre enzým zapojený v esenciálnej biosyntetickej dráhe, v príslušných génoch zapojených v prechorizmatovej dráhe zahrnutej pri biosyntéze aromatických zlúčenín. Druhá mutácia je teda výhodná v aroA, aroC alebo aroD géne.
Ďalším typom oslabenej baktérie je tá, v ktorej oslabenie je spôsobené prítomnosťou nerevertujúcej mutácie v DNA baktérii, ktorá kóduje alebo ktorá reguluje expresiu DNA kódovania proteínu, ktorý je produkovaný ako odozva na stres prostredia. Takéto baktérie sú zverejnené v VO 91/15572. Nerevertuj úca mutácia môže byť vypustenie, inzercia, inverzia alebo substitúcia. Delečná mutácia spôsobená vypustením môže byť vytvorená pomocou transpozónu.
Príklady proteínu, ktoré sú produkované ako odozva na stres prostredia zahrňujú tepelne šokové proteíny /ktoré sú produkované ako odozva na zvýšenie teploty nad 42 θθ; výživovo deprivačné proteíny (ktoré sú produkované ako odozva na úroveň esenciálnych živín ako sú fosfáty alebo dusík, ktoré sú pod úrovňami, ktoré mikroorganizmus potrebuje pre prežitie); toxickostresové proteíny (ktoré sú produkované ako odozva na toxické zlúčeniny ako sú farbivá, kyseliny alebo prípadné rastlinné exudáty); alebo metabolické disrupčné proteíny (ktoré sú produkované ako odozva na fluktruáciu napríklad iónových úrovní ovplyvňujúcich schopností mikroorganizmov k osmoregulácii alebo vitamínové alebo kofaktorové úrovne, ktoré prerušia metabolizmus).
Výhodne je tepelne šokový protein kódovaný htrA génom tiež charakterizovaným ako degP. Iné proteíny sú zakódované gény známe tým, že sú zahrnuté v stresovej odozve ako je grpE, groEL, (moPA), dnaK, groES, lon a dnaJ. Existuje mnoho iných proteínov kódovaných génmi, ktoré sú známe tým, že sú vyvolané ako odozva na stres prostredia. (Ronson a kol., Celí. 49, 579 - 581).
Medzi týmito môžu byť spomenuté nasledujúce: ntrB/ntrC systém E.coli, ktorý je indukovaný ako odozva na dusíkovú depriváciu a pozitívne reguluje glnA a nifLA (Buck a kol., Náture 320. 374 - 378, 1986; Hirschman a kol., Proc. Natl. Acat. Sci. USA 82, 7525, 1985; Nixon a kol., Proc. Natl. Acat. Sci USA 83., 7850 - 7854, 1986, Reitzer a Magansanik, Celí., 45., 785, 1986;); phoR/phoB systém E. coli, ktorý je indukovaný ako odozva na fosfátovú depriváciu (Makino a kol., J. Mol. Biol. 192, 549 - 556, 1986b); cpxA/sfrA systém E.coli, ktorý je indukovaný ako odozva na farbivá alebo iné toxické zlúčeniny (Albin a kol., J. Biol. Chem. 261. 4698, 1986; Drury a kol., J. Biol. Chem. 260, 4236 - 4272, 1985).
Analogický systém u Rhisobium je dctB/dctD, ktorý je citlivý na 4C-dikarboxylové kyseliny (Ronson a kol., J. Bacteriol. 169, 2424 a Celí. 49, 579 - 581, 1987). Virulentný systém tohoto typu je popísaný u Acrobacterium. Je to virA/virC systém, ktorý je indukovaný ako odozva na rastlinné exudáty (leRoux a kol., EMBO J. 6, 849 - 856, 1987; Stachel a Zambryski, Am. J. Vet. Res. 45, 59 - 66, 1986; Vinans a kol., Proc. Natl. Acat. Sci. USA 83, 8278, 1986).
Podobne bvgC-bvgA systém u Bordetella pertussis (skôr známy ako vírus) reguluje produkciu virulentných determinanO I tov ako odozvu na fluktuáciu úrovne Mg a kyseliny nikotínovej (Arico a kol., 1989, Proc. Natl. Acat. Sci USA 86. 6671 - 6675).
Pre použitie vo forme živej vakcíny by sa oslabená bak7 téria nemala vracať späť do virulentného stavu. Pravdepodobnosť tohoto diania u mutácie na jednoduchú DNA sekvenciu sa považuje za malú. Avšak riziko reverzie vyskytujúce sa u oslabenej baktérie prítomnosťou mutácie v každej z dvoch diskrétnych DNA sekvencii sa považuje za bezvýznamné. Výhodná oslabená baktéria je teda taká, v ktorej oslabenie je vykonané prítomnosťou mutácie v DNA sekvencii, ktorá kóduje alebo ktorá reguluje expresiu DNA kódovania proteínu, ktorý sa vytvorí ako odozva na stres prostredia a prítomnosťou mutácie v druhej DNA sekvencii.
Druhá DNA sekvencia výhodne kóduje enzým zavedený v esenciálnej autotrófnej dráhe alebo je to sekvencia, ktorej produkt riadi reguláciu osmoticky responzívnych génov, to je ompR (Infect and Immun, 1989, 2136 - 2140). Najvýhodnejšie je mutácia v DNA sekvencii zavedená v aromatickej aminokyselinovej biosyntetickej dráhe, najmä DNA sekvencia kódujúca aroA, aroC alebo aroD.
Oslabené baktérie môžu byť vytvorené zavedením mutácie do DNA sekvencie spôsobmi známymi odborníkom v odbore (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Nerevertujúce mutácie môžu byť vytvorené zavedením hybridného transpozónu TnphoA do, napríklad S.typhimurium kmeňov. TnphoA môže vytvárať enzymatický aktívne proteínové fázy alkalickej fosfatácii do periplazmických alebo membránových proteínov. TnphoA transpozón nesie gén, kódujúci kanamycinovú rezistenciu. Transdukanty sú vybrané tak, že sú kanamycinovo rezistentné rastom kolónií na príslušnom selekčnom médiu.
Alternatívne metódy zahrňujú klonovanie DNA sekvencie do vektora, napríklad plazmidu alebo kozmidu, zavádzajúci selektovateľný markerový gén do klonovanej DNA sekvencie, čo vedie k jej inaktivácii. Plazmid nesúci inaktivovaná DNA sekvenciu a rozdielny selektovateľný marker môže byť zavedený do organizmu známymi postupmi (Maniatis Molecular Cloning and Laboratory Manuál, 1982). Potom je možné vhodnou selekciou identifikovať mutant, v ktorom inaktivovaná DNA sekvencia rekombinovala do chromozómu mikroorganizmu a divoký typ DNA sekvencie bol urobený nefunkčným postupom známym ako allelická výmena. Najmä použitý vektor je výhodne nestabilný v mikroorganizme a bude spontánne stratený. Mutovaná DNA sekvencia na plazmide a divoký typ DNA sekvencie môžu byť vymenené genetickým cross-over účinkom.
Ďalšie spôsoby eliminujúce zavádzanie cudzej DNA do vakcínových kmeňov v polohe mutácií a zavádzanie antibiotických rezistentných markerov do týchto kmeňov.
Heterologny antigén, ktorý je oslabená baktéria schopná exprimovať, môže napríklad obsahovať antigénny determinant patogénneho organizmu. Antigén môže byť odvodený z vírusu, baktérie, huby, kvasinky alebo parazitu. Heterologny proteín teda typicky obsahuje antigénnu sekvenciu odvodenú z vírusu, baktérie, huby, kvasinky alebo parazitu. Najmä môže byť antigénna sekvencia odvodená z typu vírusu ludskej straty imunity (HIV) ako je HIV-1 alebo HIV-2 vírusu, vírusu hepatitídy A alebo B, ludského vírusu nádchy typu 2 alebo typu 14, vírusu oparu, vírusu detskej obrny typu 2 alebo ; 3, vírusu krívačky a slintavky, vírusu chrípky, vírusu koxsackie, bunkového povrchového antigénu CD4 a Chlamydia trachomatis. Antigén môže obsahovať CD4 receptor viažuci namiesto z HIV napríklad z HIV-1 alebo 2. Iné vhodné antigény zahrňujú E.coli tepelne labilný toxín B podjednotku (LT-B), E.coli K88 antigény, P.69 proteín z B.pertussis, tetanový toxínový fragment C a antigény motolice, mykoplazmy, hlíst, pásomníc, vírus besnoty a rotavírusu.
ti.
Výhodný promótor pre použitie pri riadení expresie heterológneho proteínu je nirB promótor. Tento nirB promótor bol izolovaný z E.coli, kde riadi, expresiu operónu, ktorý zahrňuje nitritreduktazový gén nirB (Jayraman a kol., J. Mol. Biol. 196. 781 - 788, 1987), a nirD. nirCa cysG (Peakman a kol., Eur. J. Bio. Chem. 191. 315 - 323, 1990). Je regulovaný tak nitritom, ako aj zmenami tlaku kyslíka v prostredí, pričom sa stáva aktívnym, keď je nedostatok kyslíka. (Cóle, Biochim. Biofys. Acta, 162. 356 - 368, 1968). Odozva na anaerobiózu je sprostredkovaná cez proteín FNR, ktorý pôsobí ako transkripčný aktivátor v mechanizme spoločnom mnohým anaeróbnym respiračným génom.
Delečnou a mutačnou analýzou bola izolovaná časť promótora, ktorá zodpovedá len za anaerobiózu a porovnaním s inými anaeróbicky regulovanými promótormi bolo identifikované súhlasné FNR väzbové miesto (Bell a kol., Nucl. Acid. Res. 17. 3865 - 3874, 1989; Jayraman a kol. Nucl. Acids. Res. 17. 135 - 145, 1989) .
Bolo tiež ukázané, že vzdialenosť medzi predpokladaným FNR väzbovým miestom a -10 homológnou oblasťou je kritická. (Bell a kol., Molec. Microbiol. 4, 1753 - 1763, 1990.) Je teda výhodné použiť len tú časť nirB promótora, ktorá zodpovedá len za anaerobiózu.
Ako je tu použité, referencie k nirB promótoru sa vzťahujú k promótoru samotnému alebo k jeho časti alebo jeho derivátu, ktorý je schopný promočnej expresie kódujúcej sekvencie za anaeróbnych podmienok. Sekvencia, ktorú sme v skutočnosti použili a ktorá obsahuje nirB promótor je:
AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCG GTAGGGCC.
Oslabená baktéria podlá tohoto vynálezu môže byť pripravená transformovaním oslabenej baktérie s DNA štruktúrou obsahujúcou promótor, ktorého aktivita je vyvolaná aeróbnymi podmienkami, ako je nirB promótor funkčne pripojený k DNA sekvencií kódujúci heterológny protein. Môže byl použitá vhodná transformačná technika ako je elektroporácia. Týmto spôsobom môže byl získaná oslabená baktéria schopná expresie proteínu heterôlógneho k tejto baktérii. Kultúra oslabenej baktérie môže byť pestovaná za aeróbnycb podmienok. Dostatočné množstvo baktérie sa takto pripraví pre formuláciu vo forme vakcíny s vyskytujúcou sa minimálnou expresiou heterológneho proteínu.
DNA konštrukcia je typicky replikovatelný expresný vektor obsahujúci nirB promótor funkčne zapojený do DNA sekvencie, kódujúci heterológny protein. Tento nirB promótor môže byť zavedený v expresnom vektore, ktorý už začleňuje gén kódujúci heterológny protein, miesto existujúceho promótora, riadiaceho expresiu tohoto proteínu. Expresný vektor by mal však byť kompatibilný s oslabenou baktériou, do ktorej má byť tento vektor zavedený.
Expresný vektor je opatrený príslušnými transkripčnými a translačnými riadiacimi elementárni, zahrňujúcimi okrem nirB promótora, transkripčné terminačné miesto a translačné štartovacie a zakončovacie kodóny. Je vytvorené príslušné ribozomové väzbové miesto. Vektor obyčajne obsahuje začiatok replikácie a ak je treba selektovatelný markerový gén ako je antibiotický rezistenčný gén. Vektor môže byť plazmid.
Oslabená baktéria tohoto vynálezu môže byť použitá ako vakcína. Táto vakcína obsahuje farmaceutický vhodný nosič alebo riedidlo a aktívnu zložku, oslabenú baktériou.
Vakcína sa výhodne podáva v lyofilizovanej forme, napríklad vo forme toboliek pre orálne podanie pacientovi. Takéto tobolky môžu byť opatrené enterosolvným povlakom obsahujúcim napríklad Eudragate S, Eudragate L, acetát celulózy, ftalát celulózy alebo hydroxypropylmetylcelulózu.
Tieto tobolky môžu byť použité ako také alebo alternatívne môže byť lyofilizovaný materiál rekonštituovaný pred podaním napríklad do formy suspenzie. Rekonštitúcia sa výhodne vykonáva v pufri pri vhodnom pH, aby sa zaistila životnosť organizmov. Aby sa chránila oslabená baktéria a vakcína pred žalúdočnou kyslosťou, podáva sa výhodne hydrogénuhličitan sodný vo forme prípravku pred každým podaním vakcíny. Alternatívne môže byť vakcína pripravená pre parenterálne podanie, intranasálne podanie alebo intramamárne podanie .
Oslabená baktéria tohoto vynálezu môže byť použitá pri profylaktickom ošetrení hostiteľa, najmä ľudského hostiteľa, ale tiež prípadne živočíšneho hostiteľa. Infekcii vyvolanej mikroorganizmom, najmä patogénom, môže teda byť zabránené podaním účinnej dávky oslabenej baktérie podľa vynálezu. Táto baktéria potom vytvára heterológny proteín schopný zvýšiť protilátky v organizme. Použitá dávka bude závislá na rôznych faktoroch včítane veľkosti a hmotnosti hostiteľa, typu formulovanej vakcíny a druhu heterológneho proteínu. Avšak pre oslabenú S.typhi je vhodná dávka obsahujúca orálne podanie od 10^ do ÍO^1 S.typhi organizmov obecne pre dospelého človeka o hmotnosti 70 kg.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúci príklad zobrazuje vynález. V priložených výkresoch:
- 12 obr. 1 až 4 zobrazuje schopnosti izolátov S.typhirium rast in vivo v pečeni, slezine, Peiers ložiskách a mesentérnych miazgových uzlinách u BALB/c myší. Os x označuje dni po infekcii, os y označuje log-^θ živých organizmov na orgán, /\ označuje izolát BRD509, G označuj e izolát BRD847,
O označuje izolát BRD747,
- označuje žiadny ampicilín a ------ označuje pridaný ampicilín, obr. 5 znázorňuje titre antitetanového toxínového fragmentu C myšieho séra. Os x uvádza typy baktérií použitých z myšieho séra, os x ukazuje typy baktérií použitých k expozícií myší. Počet dávok je uvedený v zátvorkách. Os y označuje hodnoty absorbancie pri 492 nm.
Príklad
Konštrukcia pTETnirl5
Expresný plazmid pTETnirl5 bol vytvorený z pTETtacll5 (Makoff a kol., Nucl. Acides. Res. 17. 10191 - 10202, 1989) náhradou EcoRI-Apal oblasti (1354bp) obsahujúcu lacl gén a tac promótor nasledujúcou dvojicou oligos 1 a 2:
01igo-l 5’-AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATC Oligo-2 3’-GTCCATTTAAACTACATGTAGTTTACCATGGGGAACGACTTAG GTTAAGGTAGGCGGTAGGGCC-3’
CAATTCCATCCGCCATC-5’.
Oligonukleotidy boli syntetizované na farmaceutickom génovom zariadení a výsledné plazmidy boli potvrdené sekvencovaním /Makoff a kol, Bio/Technology T_, 1043 - 1046, 1989/.
Konštrukcia SL1334 aroA aroD prechovávajúca pTETnirl5.
Aby sa zostavil Salmonella vakcínový kmeň exprimujúci tetanový toxínový fragment C pod kontrolou nirB promótora, bol prechodný kmeň S. typhiinurium LB5010 (r”m+)(Bullas a Ryo, J. Bact. 156. 471 - 474, 1983) transformovaný pTETnirl5. Kolónie exprimujúce fragment C boli zisťované antibiotickou selekciou nasledovanou imunoblokáciou kolónie antitetanovým toxínovým fragmentom C séra. Kolónie boli pestované cez noc na nitrocelulózových filtroch aerobicky a potom indukované inkubáciou za anaeróbnych podmienok po dobu 4 hodín pred imunoblokáciou.
Jeden kmeň, ktorý bol stabilný v expresii fragmentu C, bol použitý pre prípravu plazmidu DNA. Ten bol použitý pre transformovanie izolátu S.typhimurium SL1344 aroA aroD označeného BRD509 elektroporáciou. Kmeň, ktorý stabilne exprimoval fragment C (kontrola imunoblokáciou, ako bolo vyššie popísané) , bol zvolený pre štúdie in vivo a bol označený BRD847.
Porovnanie kinetík in vivo BRD743 a BRD847 u BALB/c myší
Schopnosť BRD743 (BRD509 prechovávajúci pTET85) a BRD847 rast in vivo bola porovnávaná po orálnom podaní BALB/c myšiam. pTET85 bol vytvorený z pTETtacll5 (Makoff a kol. Nucl. Acids. Res. 17, 10191 - 10202, 1989) vypustením 1.2 kb EcoRI fragmentu nesúceho lacl gén. To viedlo k podstatnej expresii fragmentu C u salmonelových kmeňov. Početné baktérie boli zistené v pečeni, slezine, Peyrs škvrnách a mesentérnych lymfatických uzlinách.
Baktérie izolované z myší boli tiež skúšané na ich schopnosť rásť na doskách obsahujúcich ampicilín ako indiká14 tor percenta organizmov stále zadržujúcich plazmid exprimujúci fragment C. Výsledky sú uvedené na obr. 1 až 4.
Keď boli podobné počiatočné počty organizmov (5.10^) použité k infikácii myši, bolo zistené, že ako BRD743 tak 847 boli schopné napadnúť a vytrvať vo všetkých myších tkanivách, ktoré boli skúšané, ale na nižších úrovniach ako BRD509. Avšak zaujímavým rysom je, že počet organizmov rezistentných na ampicilín, získaných z myší, infikovaných BRD743 sa rýchlo znižuje a všetky organizmy, ktoré boli získané, boli citlivé na ampicilín do 14. dňa. To indikuje, že selekcia in vivo rýchlo vedie k strate pTET85 zo salmonelového vakcínového kmeňa.
Na rozdiel od toho počty s ampicilínom a bez ampicilínu pre BRD847 boli v podstate tie isté po dobu infekcií, ktoré boli sledované. To demonštruje dodatočnú výhodu pTETnirl5 v S.typhimurium vakcínovom kmeni vedúci k organizmom s potenciálom pre expresný fragment C in vivo po ďalšiu dobu so zrejmými výhodami pokiaľ ide o imunogenitu,
Imunizácia BALB/c myší pomocou salmonelových kmeňov prechovávajúcich pTET85 (BRD743) alebo pTETnirl5 (BRD847)
Skupiny 20 myší boli orálne inkubované 5.10^ bunkami na myš buď BRD743 alebo BRD847 alebo BRD509. 25. deň boli odobraté séra od všetkých myší a analyzované zariadením ELISA na antitetanové protilátky. Všetky myši vakcinované BRD847 mali zistiteľnú protilátku antifragment C v 25 dňoch, zatiaľ čo myši, vakcinované BRD743 alebo BRD509 nemali (obr. 5).
25. deň bolo 10 myší z každej skupiny posilnených orálnou inokuláciou rovnakým množstvom homologových organizmov. ELISA analýza séra odobratého od týchto myší 46. deň ukáza15 la, že antifragment C odozvy bol posilnený pre skupiny inokulované BRD743 a BRD847. Titre pre myši posilnené BRD847 boli významne vyššie než u myší posilnených BRD743. Myši posilnené orálne BRD509 zlyhali v produkcii zistiteľnej protilátkovej odozvy voči fragmentu C.
Odozva na tetanový toxín u myší orálne imunizovaných BRD847 a BRD743.
Myši vakcinované orálne BRD743, 847 a 509 boli testované na imunitu voči tetanotoxínovej odozve po jednej alebo dvoch dávkach imunizujúceho kmeňa.
Skupiny 20 myší dostali jednu orálnu dávku 5.10^ organizmov a skupiny 10 myší boli aktivované 25. deň 550%-nými letálnymi dávkami tetanového toxínu (viď tabulka 1). Myši vakcinované BRD847 boli úplne chránené voči aktivácii po jednej orálnej dávke, zatial čo myši vakcinované BRD743 boli len čiastočne chránené (2/10 prežijúcich). Zostávajúce skupiny 10 myší dostali druhú dávku organizmov (5.10^) 25. deň a boli aktivované 46. deň (po prvej dávke). Myši imunizované BRD847 boli úplne chránené po aktivácii tetanovým toxínom, zatiaľ čo myši imunizované BRD743 boli chránené len sčasti (5/10).
Myši imunizované jednou alebo dvoma dávkami BRD509 a aktivované tetanovým toxínom všetky zahynuli. BRD847 je účinná jednorázovo dávková orálna vakcína voči aktivácii tetanovým toxínom u myší. Skupiny myší boli tiež aktivované tetanovým toxínom po prijatí jednej a dvoch intravenóznych dávok 10^ organizmov BRD847 a BRD743. Všetky myši boli plne chránené voči aktivácii tetanovým toxínom po jednej alebo dvoch dávkach vakcínového kmeňa.
Tabulka 1
Orálna imunizácia myší voči tetanu za použitia
S.typhimurium SL1344 aroA aroD pTET85 a S.typhimurium SL1344 aro A aroD pTETnirlS
Vakcína dávka počet počet myší dávok prežijúcich aktiváciu tetanom
SL1344 aroA aroD 8,6xl09 1 0/10
(BRD509) 7,4xl09 2 0/10
SL1344 aroA aroD 6,4xl09 1 2/10
pTET85 (BRD743) 8,2xl09 2 5/10
SL1344 aroA aroD 9,5xl09 1 10/10
pTETnirl5 (BRD847) 7,5xl09 2 9/9

Claims (12)

1. Oslabená baktéria schopná expresie heterológneho proteínu, pričom táto expresia heterológneho proteínu je pod kontrolou promótora, ktorého účinok je vyvolaný anaeróbnymi podmienkami.
2. Oslabená baktéria podľa bodu 1, ktorou je oslabený kmeň Salmonella.
3. Oslabená baktéria podľa bodu 2, ktorou je oslabený kmeň Salmonella typhi alebo Salmonella typhimurium.
4. Oslabená baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich bodov 1 až 3, u ktorej je oslabenie prisúditelné nerevertujúcej mutácii v géne v aromatickoaminokyselinovej biosyntetickej dráhe.
5. Oslabená baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich bodov 1 až 4, u ktorej je oslabenie prisúditelné nerevertujúcej mutácii v DNA baktérii, ktorá kóduje, alebo ktorá reguluje expresiu DNA kódovania, proteín, ktorý je vytvorený ako odozva na stres prostredia.
6. Oslabená baktéria podľa bodu 4, ktorá prechováva nerevertujúcu mutáciu v každom z dvoch diskrétnych génoch v ich aromatickoaminokyselinovej biosyntetickej dráhe.
7. Oslabená baktéria podľa bodu 6, ktorá je aroA aroC, aroA aroD alebo aroA aroE mutantom.
8. oslabená baktéria podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich bodov 1 až 7, v ktorej je promótorom nirB promótor.
9. Oslabená baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich bodov, v ktorej heterológny proteín obsahuje antigénnu sekvenciu z vírusu, baktérie, huby, kvasinky alebo parazitu.
10. Oslabená baktéria podľa bodu 9, v ktorej je heterológny proteín P.69 proteín z Bordetella pertussis alebo je to tetanový toxínový fragment C.
11. Spôsob prípravy oslabenej baktérie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich bodov 1 až 10 vyznačujúci sa tým, že zahrňuje transformáciu oslabenej baktérie s DNA konštrukciou obsahujúcou promótor funkčne viazaný na DNA sekvenciu kódujúci heterológny proteín.
12. Vakcína obsahujúca farmaceutický vhodný nosič alebo riedidlo, vyznačujúca sa tým, že ako aktívnu zložku obsahuje oslabenú baktériu nárokovanú v ktoromkoľvek z bodov 1 až 10.
SK55593A 1991-03-05 1992-03-05 Expresion of recombinant proteins in attenuated bacteria SK55593A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB919104596A GB9104596D0 (en) 1991-03-05 1991-03-05 Production of recombinant proteins
GB919121208A GB9121208D0 (en) 1991-10-04 1991-10-04 Vaccines
PCT/GB1992/000387 WO1992015689A1 (en) 1991-03-05 1992-03-05 Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK55593A3 true SK55593A3 (en) 1993-10-06

Family

ID=26298523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK55593A SK55593A3 (en) 1991-03-05 1992-03-05 Expresion of recombinant proteins in attenuated bacteria

Country Status (18)

Country Link
US (2) US5547664A (sk)
EP (1) EP0574466B1 (sk)
JP (1) JP3415145B2 (sk)
KR (1) KR100240182B1 (sk)
AT (1) ATE180280T1 (sk)
AU (1) AU664360B2 (sk)
CA (1) CA2099841C (sk)
CZ (1) CZ285118B6 (sk)
DE (1) DE69229221T2 (sk)
DK (1) DK0574466T3 (sk)
ES (1) ES2131069T3 (sk)
FI (1) FI110008B (sk)
GR (1) GR3030778T3 (sk)
HU (1) HU219535B (sk)
NO (1) NO309331B1 (sk)
PL (1) PL170938B1 (sk)
SK (1) SK55593A3 (sk)
WO (1) WO1992015689A1 (sk)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9209118D0 (en) * 1992-04-28 1992-06-10 Sb 120 Amsterdam Bv Vaccine compositions
DK0652962T3 (da) 1992-07-31 1999-08-23 Medeva Holdings Bv Ekspression af rekombinante fusionsproteiner i attenuerede bakterier
GB9401787D0 (en) 1994-01-31 1994-03-23 Medeva Holdings Bv Vaccine compositions
EP0712442B1 (en) * 1993-07-30 2002-03-27 Medeva Holdings B.V. Vaccine compositions
GB9401795D0 (en) * 1994-01-31 1994-03-23 Medeva Holdings Bv Vaccines
GB2295394B (en) * 1994-01-31 1997-09-24 Medeva Holdings Bv DNA encoding a fusion protein comprising the C fragment of tetanus toxin
AUPM612494A0 (en) * 1994-06-08 1994-06-30 Csl Limited Treatment or prevention of helicobacter infection
US6254874B1 (en) * 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
GB9521568D0 (en) * 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
CN1253551C (zh) 1997-09-10 2006-04-26 维昂药品公司 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6905691B1 (en) 1997-12-11 2005-06-14 Celltech Pharma Europe Limited Vaccines containing attenuated bacteria
GB9806449D0 (en) 1998-03-25 1998-05-27 Peptide Therapeutics Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US6585975B1 (en) * 1998-04-30 2003-07-01 Acambis, Inc. Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection
FR2778922A1 (fr) * 1998-05-19 1999-11-26 Pasteur Institut Polynucleotides contenant des sequences de regulation de la synthese de toxines de clostridium, et microorganismes les comprenant
US6413768B1 (en) * 1998-12-02 2002-07-02 University Of Maryland Expression plasmids
EP1171577A2 (en) * 1999-04-09 2002-01-16 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Anti-bacterial vaccine compositions
US6790950B2 (en) * 1999-04-09 2004-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial vaccine compositions
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
GB0024203D0 (en) * 2000-10-03 2000-11-15 Peptide Therapeutics Ltd Stabilisation of plasmid inheritance in bacteria
EP1343870A4 (en) * 2000-11-09 2005-07-13 Univ Queensland BACTERIAL EXPRESSION SYSTEMS
US7780961B2 (en) * 2001-05-03 2010-08-24 Actogenix N.V. Self-containing Lactococcus strain
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
AUPR977601A0 (en) * 2001-12-28 2002-01-31 Delta Biotechnology Limited Defective entities and uses therefor
GB0205376D0 (en) * 2002-03-07 2002-04-24 Royal Holloway University Of L Spore germination
EP1513545B1 (en) * 2002-06-19 2008-03-19 Actogenix N.V. Methods and means to promote gut absorption
WO2004046346A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Vib Vzw Self-containing lactobacillus strain
US8029777B2 (en) 2004-08-13 2011-10-04 Marshall Barry J Helicobacter system and uses thereof
JP2008509168A (ja) 2004-08-13 2008-03-27 マーシャル，バリー，ジェー． 細菌デリバリシステム
CA2631598C (en) 2005-11-29 2017-06-27 Actogenix Nv Induction of mucosal tolerance to antigens
PL2066339T3 (pl) * 2006-09-18 2015-02-27 Univ Arkansas Kompozycje i sposoby zwiększania odpowiedzi immunologicznych
JP2010516269A (ja) 2007-01-25 2010-05-20 アクトジェニックス・エヌブイ 抗原の粘膜送達による免疫疾患の治療
US9125854B2 (en) * 2007-10-30 2015-09-08 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
DK3097926T3 (da) * 2007-11-01 2019-12-16 Univ Arkansas Sammensætninger og fremgangsmåder til forstærkning af immunreaktioner på Eimeria
DK2525817T3 (en) 2010-01-21 2017-10-02 Univ Arkansas Vaccine vectors and methods for enhancing immune responses
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
NZ702839A (en) 2010-06-09 2016-04-29 Univ Arkansas Vaccine and methods to reduce campylobacter infection
CN102477440A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 南京大学 治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用
KR20200008014A (ko) 2011-03-21 2020-01-22 알티뮨 인크. 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
PT2956165T (pt) 2013-02-14 2019-11-29 Texas A & M Univ Sys Composições e métodos de potenciação das respostas imunitárias frente a eimeria ou limitação de uma infeção por eimeria
AU2014239557B2 (en) 2013-03-15 2019-01-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens
JP7467027B2 (ja) 2016-05-03 2024-04-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫刺激性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドを含む酵母ワクチンベクター並びにそれを使用する方法
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837151A (en) * 1980-05-19 1989-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen
DE3735381A1 (de) * 1987-03-31 1989-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen
GB8730037D0 (en) * 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
JPH0284172A (ja) * 1988-07-21 1990-03-26 Smithkline Beckman Corp 異種遺伝子の発現能を有し、組換え型ワクチンとして有用なサルモネラ形質転換体
DE3926076A1 (de) * 1989-04-21 1990-10-25 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante dna und expressionsvektor
GB8912330D0 (en) * 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
GB9007194D0 (en) * 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
GB9104596D0 (en) * 1991-03-05 1991-04-17 Wellcome Found Production of recombinant proteins

Also Published As

Publication number Publication date
NO309331B1 (no) 2001-01-15
US5547664A (en) 1996-08-20
PL170938B1 (pl) 1997-02-28
WO1992015689A1 (en) 1992-09-17
EP0574466A1 (en) 1993-12-22
NO932423D0 (no) 1993-07-02
JP3415145B2 (ja) 2003-06-09
AU664360B2 (en) 1995-11-16
CA2099841C (en) 2003-02-25
PL296702A1 (en) 1993-07-26
FI933757A (fi) 1993-08-26
FI933757A0 (fi) 1993-08-26
HU219535B (hu) 2001-05-28
EP0574466B1 (en) 1999-05-19
ES2131069T3 (es) 1999-07-16
CZ285118B6 (cs) 1999-05-12
HU9302492D0 (en) 1993-11-29
GR3030778T3 (en) 1999-11-30
DE69229221T2 (de) 1999-09-23
CA2099841A1 (en) 1992-09-06
US5683700A (en) 1997-11-04
AU1350892A (en) 1992-10-06
HUT66833A (en) 1995-01-30
DK0574466T3 (da) 1999-11-08
DE69229221D1 (de) 1999-06-24
FI110008B (fi) 2002-11-15
CZ100593A3 (en) 1994-01-19
KR100240182B1 (ko) 2000-01-15
ATE180280T1 (de) 1999-06-15
JPH06505158A (ja) 1994-06-16
NO932423L (no) 1993-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5547664A (en) Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria
US5527529A (en) Vaccines comprising attenuated salmonella having mutations in the ompr genes
US5424065A (en) Vaccines containing avirulent phop-type microorganisms
AU584963B2 (en) Non-reverting double mutant salmonella live vaccines
EP1076566B1 (en) Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the vi antigen
KR100242798B1 (ko) 안정한 pur A 벡터 및 이의 사용
JP6329544B2 (ja) 新規生弱毒化赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ワクチン
EP0322237B1 (en) Vaccines
AU2002321652B2 (en) Attenuated bacteria useful in vaccines
US6254874B1 (en) Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
RU2126447C1 (ru) Способ получения аттенуированного штамма бактерий salmonella и вакцина
PL171476B1 (en) Method of obtaining attenuated salmonella bacterium