SK362692A3

SK362692A3 - Expression of specific immunogens by using of virus antigene

Info

Publication number: SK362692A3
Application number: SK3626-92A
Authority: SK
Inventors: Paul P Hung; Shaw-Guang Lin Lee; Narender K Kalyan
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1992-12-10
Publication date: 1995-11-08
Also published as: CZ362692A3; FI925590A; HU211548A9; IL103928A0; EP0546787A2; JPH05262667A; MX9207113A; TW239162B; HUT65366A; NO924780D0; BR9204978A; CN1073878A; AU2981992A; US5591823A; KR930013112A; ZA929355B; FI925590A0; CA2084180A1; NO924780L; HU9203931D0

Description

Expresia špecifických imunogénov za použitia chimérnych bielkovín s hemaglutinínom chrípkového vírusu sa týka chimémych fragmentov DNA, ktoré obsahujú nukleotidové reťazce, zodpovedajúce štruktúrnemu génu povrchovej bielkoviny HA chrípkového vírusu A s piatimi imunodominanUiými antigénnymi miestami, pričom do aspoň jedného z týchto antigénnych miest je uložený nukleotidový reťazec, zodpovedajúci cudzorodému epitopu. Uvedeným spôsobom je možné vytvoriť zodpovedajúce chiméme peptidy. Získané peptidy sú vhodné na výrobu vakcín proti zodpovedajúcim antigénom a na detekciu expozície týmto antigénom. Peptidy a zodpovedajúce protilátky je možné tiež použiť na liečenie a prevenciu prejavov expozície týmto antigénom vrátane imunoterapie.

r z 3G^6'

—~ —		*· '···
T	r~	*u
XJ<	'S..
r~'	CO	C'
	-Ή	í
		' -k, 1
	O	- O
	<	JTb 2C O

Exprese špecifických imunogenu pri použití vírových antigénu

Oblast vynálezu

Vynález se týká exprese špecifických imunogenu pri použití vírových antigénu, zejména chimérních bílkovin s hemaglutininem chrípkového víru (HA), kterých je možno použit jako vakcín proti virum, pathogenním bakteriím, nebo jiných antigénu, napríklad téch, které jsou špecifické pro nádorové tkáné, vyvolaní alergické odpovedi apod. Tyto chimérní bílkoviny je možno použit pri léčbé projevu téchto antigénu nebo odpovídaj íc ích protilátek. Vynález se rovnež týká kódových nukleotidových retézcu pro tyto bílkoviny.

Do antigenních míst bílkoviny HA je možno uložit cizorodé epitopy, napríklad epitopy viru lidské imunodeficience a získané chimérní bílkoviny pak jsou schopný vyvolat špecifickou imunologickou odpoveď proti uloženému epitopu.

Dosavadní stav techniky

Pri výrobe vakcín se užívá rada prístupu. V prípade vírových onemocnení tyto metódy zahrnují použití inaktivovaných víru, živých víru, živých rekombinantních víru, vírových bílkovinných podjednotek a podobné.

Avšak rada typu vakcín má omezený účinek zčásti vzhledem k tomu, že existují znyčné genetické variace mezi jedním izolátem nebo kmenem určitého organismu a dalšími kmeny. Mimoto lidské nebo živočišné antigény, které se účastní vzniku onemocnení, napríklad IgE pro alergické reakce, nádorové antigény apod. nevyvolávají pŕíznivou imunologickou odpoveď u téhož živočišného druhu, z néjž byly odvozený a je na ne nutno nahlížet jako na vlastní bílkoviny a nikoliv jako na antigény.

Na druhé strane je žádoucí užít malé retezce peptidu nebo epitopy (antigenní determinanty), predstavuj íc í biologickou funkci deného antigénu jako imunogenu i u homologního živočišného druhu. Teoreticky je možno takové peptidy použit k vyvolání imunologické odpovedi po vstriknutí živočichúm. V praxi však tyto peptidy často nejsou dobrými imunogeny vzhledem k tomu, že jsou obvykle malé a nemohou tedy príznive ovlivnit imunologický systém.

Príkladem takového málo imunogenního peptidu múže být druhá konservovaná oblast zevního obalového glykoproteinu (gpl2O) vitú lidské imunodeficience HIV. Bylo prokázáno, že pro infektivitu HIV je tento glykoprotein dôležitý, stejné jako pro neutralizaci protilátek (Science, únor 1988, str. 1021). Antiserum proti této oblasti (aminokyseliny 254274) múže neutrálizovat tri od sebe odlišné izoláty HIV in vitro, aniž by však došlo k ovlivnení väzby víru na receptor T-bunek nebo na CD4-positivní bunky. Má se za to, že konservovaná oblast je kritická pro období po väzbe, kdy dochází k rpúniku víru a mohla by tedy být potenciálním cílem pro neutralizaci protilátkou. Bylo však pozorováno, že tato oblast je z imunologického hlediska pomerne tichá v prípade prírodní infekce virem HIV. Vysvetlením tohoto jevu by mohla být skutečnost, že tento epitop múže být maskován, napríklad určitou konfigurací bílkoviny.

Další podrobnosti, týkající se HIV antigenú je možno nalézt v publikaci Rusche a další, Antibodies that Inhibit Fusion of Human Immunodeficiency Virus-infected Cells Bind a 24 Aminoacid Sequence of the Viral Envelope, gpl20, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3198-3202, kveten 1988; dále Bolognesi, Progress in Vaccine Development Against SIV and HIV, Journal of Acquires Immune Deficiency Syndromes, 3:

390-394, Raven Press, Ltd., New York, 1990, Wain-Hobson, Nucleotide Sequence of the AIDS Vírus, LAV, Celí, 40:9-17, leden 1985; Ho a další, Second Conserved Domain of gpl20 Is Imoprtant for HIV Infectivity and Antibody Neutrálization, Science, 239:1021-1023, 26. února 1988.

Jednou z cest ke zvýšení imunogenity epitopu peptidu je zvštšení jejich velikosti a tím i jejich rozpoznatelnosti väzbou na další bílkoviny, makromolekuly nebo pomocné látky.

V publikaci Colbere-Garapin a další, Addition of a Foreign Oligopeptide to the Major Capsid Protein of Poliovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8668-8672, listopad 1988 se popisuje príprava mutant polioviru 3 (kmeň Sabin) uložením retezce dalších aminokyselín (tri- nebo hexapeptidu) do neutralizačního místa 1 bílkoviny capsidu VPI.

Evans a další podali zprávu o konstrukci a charakterizaci chimérní bílkoviny s antigenním účinkem s obsahem polioviru a epitopu transmembránového glykoproteinu gp41 víru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1). Bylo prokázáno, že králičí antisérum, získané podkožní injekcí živé chiméry polio/HIV bylo schopno neutralizovat nekolik izolátu HIV-1 z Ameriky i Afriky (Evans a další, An Engineered Poliovirus Chimaera Elicits Broadly Reactive HIV-1 Neutralizing Antibodies, Náture, 339: 385-388, 1. června 1989. Avšak pri použití živých vírových vektoru, napríklad polioviru vznikají praktické problémy vzhledem k tomu, že protilátky v séru mohou zabránit replikaci rekombinantního viru v tele. Mimoto existuje v prípade živých vírových vektoru značné omezení, pokud jde o velikost uložené části a existuje také omezené množství poloh, do nichž je tyto části možno uložit.

Wu a další popsali uložení do rámce v prípade synthetických oligonukleotidu, odpovídajících zbytkum aminokyselín S(122-137) a pre-S^ (120-145), povrchových antigénu víru hepatitídy B, do hypervariabilní oblasti klonovaného génu pro flagellin Salmonelly. Zivočichové, imunizovaní živou rekombinantní baktérií pak vytváreli protilátky, špecifické proti epitopum víru hepatitídy B, jak bylo možno prokázat zkouškou ELISA (Wu a další, Expression of Immunogenic Epitopes of Hepatitis B Surface Antigén with Habrid Flagellin Proteins by a Vaccine Strain of Salmonella, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4726-4730, červeň 1989. Imunologická odpoveď byla slabá, krátkodobá a po imunizaci rýchle klesala,

Michel a další popsali uložení ruzných fragmentu obalu HIV do povrchového antigénu víru hepatitídy B. Po imunizaci králíku touto složenou bílkovinou došlo ke tvorbe neutrál i začni ch protilátek (Michel a další, Induction of Anti Human Immunodeficiency Virus (HIV) Neutralizing Antibočies in Rabbits Immunizes with Recombinant HIV-Hepatitis B Surface Antigén Particles, Proc. NAtl. ACAD. Sci. USA, 85:79577961, 1988.

Podobne bylo také prokázáno, že je možno dosáhnout inhibice uvolňování histamínu in vitro i in vivo imunizaci komjugátem lidského peptidu a bílkoviny (Stanworth a další, Allergy Treatment with a Peptide Vaccine, The Lancet, 336: 1279-1281, 7. ríjna 1990 a také Stanworth a další, The Role of High and Low Affinity IgE Receptors in Celí Signalling Processes, Molecular Immunology, 27(12): 1291-1296, 1990.

Monoklonální protilátky (mAb) byly rovnéž široce používány pro pasívni imunizaci a pro diagnostické postupy pri detekci infekcí nebo pathologických stavu, napríklad pri tomnosti nádorových antigénu. Avšak získávání monoklonálních protilátek s požadovanou špecifičností je pracné a výsledek není možno presné predpovédet. Je zapotrebí nékolika stupňové slepé zkoušky a dalšícň zkoušek se sérií prekrývajících se peptidu ke stanovení špecifičnosti mAb. V nékterých pŕípadech se funkční epitop nemusí nacházet v imunodominantní poloze pro antigén, takže pro tuto oblast nevzniká mAb.

Je tedy zrejmé, že by bylo zapotrebí nalézt vakcíny, diagnostické prostŕedky a léčebné prostŕedky na základé potenciálni imunogenity antigenních determinant nebo epitopu podie vynálezu.

Podstatat vynálezu

Nyní byly nalezený chimérní bílkoviny, které jsou imunogenní a obsahují bílkovinu HA chrípkového viru A s uloženým cizorodým epitopem. Pri imunizaci savcu témito rekombonantními nebo synthetickými chimérními bílkovinami dochází ke tvorbé protilátek, špecifických pro tento peptid. Tvorba imunologické odpovedi an tyto bílkoviny chimérního typu je dlouhodobá, napríklad delší než 6 mésícu. Tyto chimérní bílkoviny nebo odpovídající protilátky je možno užít také k diagnostice a imunotherapii proti infekcím a pathologickým stavum a také v období po exposici infekci, napríklad pri poranení jehlami v nemocnicích.

Fragmenty DNA, které jsou kódem pro chimérní bílkoviny s obsahem HA již byly rovnéž zjištény. Tyto fragmenty obsahují nukleotidové ŕetézce, které jsou v podstaté stejné jako ŕetézce, které jsou kódovými ŕetézci pro povrchovou bílkovinu HA chrípkového viru A s péti imunodominantními antigenními místy. Podie vynálezu je možno uložit nukleotidový ŕetezec, v podstaté odpovídající kódovému ŕetézci cizorodého epitopu do nukleotidového ŕetézce pro alespoň jedno z antigén nich míst.

V úvahu padají také peptidy, obsahující retezec ami nokyselin, v podstaté odpovídající ŕetézci povrchové bílkoviny HA chrípkového viru A s peti imunodominantními antigenními místy, pŕičemž se uloží retezec aminokyselín, v podstaté odpovídající ŕetézci cizorodého epitopu do retezce aminokyselín pro alespoň jedno z imunočominantních antigenních míst.

Tyto bílkoviny je možno v účinných množstvích podávať savcum včetné človéka pri léčbe nebo prevenci ruzných pathologických stavu. Mimoto je možno tyto peptidy nebo odpo vídající protilátky užít k detekci vystavení savce pusobení ruzných antigénu napríklad krvi nebo její frakcí. Vynález se rovnéž tyká vakcín s obsahem svrchu uvedených peptidu, vektoru pro expresi, obsahujících fragmenty DNA pro svrchu uvedené peptidy, zejména baculovirus a transformované hostitelské mikroorganismy.

Popis výkresu

Na obr. 1 je znázornén diagram bílkoviny HA chrípkového viru A.

Na obr. 2 je schematicky znázornén prubeh uložení jednoho z epitopu HIV do génu pro HA za vzniku mista pusobení Apal v míste bp 498 (odpovídá aminokyseline 139) génu pro HA.

Podrobný popis vynálezu

Vynález se tyká syntézy, exprese a použití nové DNA a peptidu, obsahujících do jednoho svého epitopu uloženou povrchovou bílkovinu HA chrípkového viru A.

Bílkovina HA chrípkového víru

Povrchová bílkovina HA chrípkového víru A je jednou ze dvou povrchových bílkovin chrípkového víru A. Druhou z téchto dvou bílkovin je neuraminidáza (NA). Bílkovina HA je prevažujícím glykoproteinem víru a je antigenem, proti nemuž jsou namíreny neutrálizuj íc í protilátky. Bílkovina HA je také zodpovedná za spojení víru s receptory bunek a tím i za vznik vírové infekce. Chrípkový vírus A pusobí časté epidemie vzhledem k veliké antigenní variaci víru. Tyto variace jsou zpusobeny zmenami v retézci aminokyselín v hlavních antigenne účinných místech HA.

Byly klonovány ruzné gény pro HA z ruzných kmeňu chrípkových víru a všechny tyto gény byly použitelné pri uskutečňování vynálezu. Zvlášté zajímavý je gen pro HA z kme ne A/WSN/33. Tento gen obsahuje 1775 nukleotidu a je kódem pro 565 aminokyselín, jak bylo popsáno v publikaci Hiti a další, Virology, 111:113-124, 1981.

Analýza retézce aminokyselín, odvozená od nukleoti dového retézce ukazuje pŕítomnost signálního peptidu (17 zbytku aminokyselín), k jehož odštepení dochází v prubehu sekrece HA. Úplná bílkovina HA je tvorená dvéma podjednotka mi, a to HA1 /325 zbytku) a HA2 (222 zbytku), které jsou spolu spojený jediným argininovým zbytkem, cdštépovaným v prubehu tvorby úplné bílkoviny HA, takže vzniká s dvojitým retézcem. Ŕetézec aminokyselín (512-530) na C-terminálním zakončení je velmi hydrofobní a pravdepodobne tvorí transmembránovou oblast HA. Bílkovina obsahuje sedm potenciálních glykosylačních míst. Existuje ve formé trimeru a je prevážne tvorená dvéma štruktúrne odlišnými oblastmi, a to vláknitým systémem špirál šroubovice alfa, zasahujícím do vzdálenosti 76 x 10 m od membrány a globulární oblastí antiparalelnívo beta-systému s obsahem místa pro väzbu re8 ceptoru a s variabilními antigenními místy, uloženými na horním vrcholu tohoto systému.

Srovnání s dalšími subtypy chrípkového víru ukazuje, že ruzné části retézce, včetne všech cysteinových zbytku, jsou konservovány ve všech kmenech. To dáva vznik domnšn ce, že základní štruktúra HA je predpokladem pro funkčnost viru. Retezec aminokyselín HA2 je více konservován než retézec HA1 a variace mezi jednotlivými kmeny jsou práve variacemi v retezci HA1, jak je popsáno v Hiti a další, Virology, 111:113-124, 1981 a Wilwy a další, Náture, 289:363-378, 1981

Trojrozmerná štruktúra bílkoviny HA byla ilustrovaný v publikaci Wilson a další, Náture, 289:366-373, 1981 a je rovnež znázornená na obr. 1. Tato štruktúra má pet antigenních míst: A, B, C, D a E, obklopujících místo pro väzbu na receptor, které je podobné konkávni kapse. V bílkoviné HA chrípkového viru kmene A/WSN/33 je možno identifikovat odpovídajících pét antigenních míst následujícím zpusobem: Místo A (aminokyseliny 136 až 142) je vystupující smyčka. Místo B (aminokyseliny 183 až 192) je oblast zevné uložených zbytku v pblasti šroubovnice alfa. Místo C je v terciár ní štruktúre v disulfidové väzbe mezi cysteinovými zbytky v polohách 42' a 274. Místo D je vnitrní pblast na rozhraní mezi podjednotkami v rozmezí aminokyselín 197-216 a místo E se nachází v rozsahu zbytku aminokyselín 62 až 74. Aby vznikl nový epidemický kmeň chrípkového viru, musí dojít k alespoň jedné substituci aminokyseliny ve všech z péti antigenních míst. Mimoto bylo pozorováno, že protilátky, zamierené proti témto peti antigenním místum neutralizuj! infektivitu viru. Místo A je s ohledem na svou dostupnost pravdepodobné velmi vhodné pro vznik vysoce účinných neutralizujících protilátek. V publikaci Wiely a další, Náture, 289: 373-378, 1981 a Wiley a další, Ann. Rev. Biochem., 56:365394, 1987 je možno nalézt podrobnosti.

Pro účely vynálezu je bílkovina HA užitá jako nosič pro bílkoviny, odlišné od HA nebo pro cizorodé epitopy. Uložení do bílkoviny HA se s výhodou provádí v jednom nebo vetším počtu svrchu uvedených antigenních míst, zvlášté výhodné je uložení do oblasti A. Dalším velmi vhodným místem pro ulo žení je oblast, vymezená aminokyselinami 183-192.

B. Príklady cizorodých epitopu

Cizorodé epitopy, jichž je možno využít pro účely vynálezu jsou odborníkum známé. Využít je možno také peptidy a nukleotidové retezce, v podstate shodné s prírodné se vyskytujícími epitopy.

Príkladem cizorodých epitopu mohou být napríklad epitopy vírového puvodu (napríklad epitopy víru HIV-1, víru hepatitídy B, hepatitídy C, retroviru a víru Herpes simplex) epitopy z bakteriálnich bílkovin, epitopy z efektorových míst IgE (které hrají svou úlohu pri alergiích), epitop SP1O (tehotenský antigén) nádorové epitopy včetné epitopu nádoru mléčné žlázy a jakékoliv jiné antigenní epitopy, mající význam pri vzniku onemocnení a odpovídající neutralizační bílkoviny nebo jejich immunogenní části.

Pod pojmem imunnogenní část se rozumí části bílko viny, které jsou imunogenní za jakýchkoliv podmínek, včetné tech, které se stávají imunogenními nebo antigenními až po fúzi s bílkovinou HA: Metódy pro identifikaci takových pepti du jsou známé a byly popsány napríklad v Chou a další, Biochemistry, 13:222-245, 1974, HOlper a další, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981.

Pod pojmem v podstate shodný se rozumí totožné retezce nukleotidu nebo aminokyselín i ret.šzce, modifikované

I

I i:

- 10 I ľ'

I biologickými, genetickými nebo klinickými postupy a majicí v podstate stejnou biologickou účinnost. V prípade nukleotidových ŕetezcú múže být touto biologickou účinností napríklad schopnost kódovat epitop, který bude vyvolávať odpovídající tvorbu protilátek. V prípade aminokyselín pújde prímo o schopnost vyvolat tvorbu príslušných protilátek. Tuto účinnost je možno prokázat metódami, v oboru známymi, jako je imunofluorescence, ELISA, Western blot, autoradiografie a podobne.

Epitopy HIV

Jednou ze skupín cizorodých epitopú pro uložení čo bílkoviny HA podie vynálezu je epitop HIV-1. HIV je vírus, který je príčinou vznoku získaného syndrómu imunodeficience u lidí, AIDS. V gemonu víru HIV.l jsou kódy pro tri vírové štruktúrni bílkoviny, a to oblast gag, oblast pol a oblast env, pro obalovou bílkovinu viru. Oblast gag produkuje bílkovinu jádra viru.

Hlavní bílkoviny jádra jsou spočátku synthetizovány jako prekursorová bílkovina p55, která je pak dále zpracovávána na bílkoviny pl7, p24, pl5(P9 a P6) vírovou protázou, pro niž je kódem oblast pol. Prekursor gag tedy hraje kritickou úlohu pri sestavování částic viru a plasmatické membrány, jak bylo popsáno v Gheysen a další, Celí, 59:103-112, 1989. Stejné jako vetšina retrovirových bílkovin gag je bílkovina p55 myristylována na svém N-terminálním zakončení (a po zpracování rovnéž bílkovina pl7).

Bílkovina p24 se nachází uvnitŕ jádra HIV. Bílkovina pl7 je lokalizována na vnitŕní strane lipidové membrány a pl5 vzhledm ke své bázické povaze je pravdepodobné spojená s genomem HIV. Bílkovina p24 je jdnou z nejčasnéjších bílkovin HIV, které je možno prokázat u nemocných AIDS a protiI ' látky proti p24 a pl7 je možno prokázat u všech nemocných AIDS. Má se za to, že bílkoýiny jádra, tj. gag, mohou dát vznik bunečné zprostrečkované imunite.

Oblast pol HIV-1 je kodem pro bílkoviny reversní transkriptázu, proteázu a endonukleázu.

Oblast env je kódem pro obalovou bílkovinu gpl6O, která je zpracovávána na gpl2O a gp41. Hlavní obalová bílkovina, gpl2O, je uložená na zevním povrchu virionu jako ostny a transmembránová bílkovína gp41 zahrnuje ŕetezec pro zakotvení v membráne a slouží jako místo spojení gpl2O s povrchem HIV-1. Bílkovína gpl2O obsahuje místo pro väzbu na receptor T-bunék (CD4) a také místa, rozpoznávaná neutralizačními protilátkami.

Rekombinantní gpl2O nebo gpl6O vyvolávají po opakované injekci tvorbu neutrálizačních protilátek s nízkým titrem. Hlavní neutralizační determinanta HIV je uložená v hypervariabiIní oblasti gp!2O ý3 smyčky (aminokyseliny 303-338) Protilátky, produkované vlivem tohoto peptidu jsou špecifické pro jednotlivé varianty vi ci Javaherian a další, Proc.

ru, jak bylo popsáno v publikaNatl. Acad. Sci. USA, 86: 67686772, 1989. :

. i

Z téhož infikovaného jedince byla izolována celá rada antigenne odlišných HIV. Analýza nukleotidových retezcu rovnež prokázala, že v izolátech HIV existuje velká variabilita. Týká se zejména oblasti gpl20 a dovoľuje viru uniknout imunologickému mechanismu. Vétšina predpokládaných antigenních epitopu gpl20 se nachází v cblastech s vysokou variabilitou retezce neži vysoce konservovanými oblastmi, jak bylo popsáno v Modrow a další, J. Virology, 61:570-578, 1987. Retezce gag a pol neobsahují vysoce variabilní oblasti.

Byly vyvíjeny snahy získat ruznými postupy vakcínu proti víru AIDS, napríklad pri použití inaktivovaného víru, živého rekombinantního viru, vírových bílkovinných pojednotek a podobne. Žatím se tyto snahy setkaly pouze s omezeným úspechem, částečné vzhledem ke gentickým variacim mezi ruznými izoláty HIV. Približne 25 % všech aminokyselín obalové části muže být mutováno. Bylo prokázáno, že konservované oblasti viru jsou imunologický tiché v prípade, že jsou užitý k ovlivnení imunologického systému v rámci gpl2O, avšak pri použití ve forme jednotlivých synthetických oligonukleotidu to neplatí. Epitopy, obsahující konservované oblasti HIV, které jsou typicky imunologický tiché se tedy mohou štát imunogenními v prípade, že jsou uložený do jednoho nebo vetšího počtu antigenních míst HA zpusobem podie vynálezu.

V následující tabuice 1 jsou uvedený nekteré epitopy HIV, vhodné pro použití podie vynálezu. Všechny tyto epitopy jsou z konservovaných oblastí vírových bílkovin až na jeden, N22G, který odpovídá hypervariabilní oblasti gpl2O, která je označována jako smyčka V3.

Poznámka k tabuice: A) Peptidy jsou označovaný tak, aby byla uvedená velikost každého z techto peptidu a mimoto první a poslední zbytek aminokyseliny v každém z peptidu.

Tabulka 1

Epitopy viru HIV

Peptid^	Uložení	Poznámky
1. T 20 E	env255-274	druhá konservovaná oblast
2. T 16 G	env255-270	env, vyvolává produkci ne- utralizačních protilátek
3. D 18 S	env gp41 735-752	velmi hydrofilní, neutralizuje nekolik kmeňu HIV-1, pusobí inhi'bici tvorby syncyti í
4. G 20 E	účinné místo pro proteázu	vysoce konservován ve všech kmenech HIV
5. K 27 R	env403-429	väzná oblast CD4, imunológie-
6. E 14 Q	env414-427	ky tichá, konservovaná, protilátky, produkované proti peptidu jsou neutralizační
7. N 22 g	env307-330	hlavní imunočominantní epitop, avšak vysoce variabilní, retezec ...HIGPGRAFY vyvolává tvorbu neutralizačních protilátek
8. pl7	gag86-l15	konservovaná oblast, vyvolává
9 . p24	gag281-305	odpoveď T-bunek

2. Epitopy IgE

Ďalším epitopem vhodným pro použití pri provádení zpusobu podie vynálezu je část imunoglobulinu IgE, který je v nízkych koncentracích prítomen v krvi. IgE je tvoren dvšma retezci, težkým a lehkým. IgE je jednou z menších složek celkového množství imunoglobulinu v krevním séru a zprostredkovává okamžité hypersensitivní reakce, zodpovedné za alergické reakce včetne napríklad senné rýmy, ashmatu, alergií na potraviny a na léčiva apod. Úloha IgE pri zahájení alergické odpovedi byla studována pri použití synthetického peptidu epsilon krysy nebo peptidu s delším retezcem a proti látek proti peptidum, jak bylo popsáno v publikacích Stanworth, Molecular Immunology 21:1183-1190, 1984 a Stanworth a další, Molecular Immunology 27:1291-1296, 1990. CirkulujícíIgE se váže na receptor IgE Fc s vysokou afinitou (Fc =RI) k jehož expresi dochází na povrchu tukových bnek a bazofilu. Pri odpovedi, zprostŕedkované IgE pri pusobení multivalentního alergenu dôjde k agregaci tohoto receptoru, čímž pak dôjde ke spustení uvolňování histamínu a dalších chemických modulátoru alergické odpovedi. Opakovaná exposice alergenu má za násldek zvýšení pnodukce špecifického IgE a tím se, nekdy fatálne, zvyšuje také alergická odpoveď. Monoklonální i polyklonální protilátky jsou mocnými alergeny vzhledem ke své schopnosti zkrížene se vázat na IgE-receptor.

IgE se rovnéž s menší sfinitou váže na receptor IgE Fc (Fc =RII), který se nachází v bunkách B a T. Tento receptor, označovaný také CD23 pravdepodobné hraje dôležitou úlohu pri syntéze IgE v bunkách B.

Bylo prokázáno, že se místa, která se účastní väzby receptoru a místo pro účinnost efektoru nachází na ruzných částech molekuly IgE. Väzné místo je uloženo v obou oblastech CH3 a CH4 IgE, efektor je uložen v oblasti CH4. Peptid v míste efektoru je charakterizovaní N-terminální kationtovou hlavovou částí, oddelenou od hydrofilního konce tremi aminokyselinami. Výzkumy ptvrdily, že tento peptid zprostredkovává signál pro začátek imunologické odpovedi v rukových bunkách jako odpoveď na styk s alergenem, jak bylo popsáno v Stanworth a další, Lancet 336:1279-1281, 1990. Retezec aminokyselín tohoto peptidu je Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-PheVal-Phe a odpovídá aminokyselinám težkého retezce IgE človeka 497-506. Je možno jej synthetizovat ze dvou komplementárních oligonukleotidu:

KTKGSGFFVF 5' AAA ACC AAG GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC GGG GCC 3' CCGGTTT TGG TTC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG CC

Styl Apa 1

Tento epitop je možno nalézt v kódovém nukleotidovém retezci pro H22V s retezcem aminokyselín HSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEV. Tento peptid je možno synthetizovat ž nukleotidového retezce

Apa 1HSTTQPRKTK CAC CGT ACT ACA CAG CCC CGC AAA ACC AAG

CCGG GTG TCA TGA TGT GTC GGG GCG TTT TGG TCC

GSGFFVFSRLEV GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC TCA CGC CTA GAG GTG GCC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG AGT GCG GAT CTC CA

C. HA-chimérní peptidy

HA-chimérní peptidy po.dle vynálezu je možno užít jako vakcíny k produkci špecifických protilátek proti peptídum, tyto protilátky jsou špecifické proti ruzným ŕetéz16 cum v peptidu. Tyto protilátky mají vysokou afinitu a jsou vhodné pro diagnostické účely stejné jako pro účely léčebné. Peptidy podie vynálezu je také možno podávať profylaktický k prevenci infekce. Podávání ve forme vakcíny nebo k imunotherapii je možno uskutečnit jakýmkoliv bežným zpúsobem, známým v oboru, napríklad perorálne, rektálne, od nosu, bukálne nebo parenterálne. Vakcíny nebo farmaceutické prostŕedky pro použití v imunotherapii mohou rovnéž obsahovať jakýkoliv farmaceutický prijateľný nosič nebo pomocnou látku, bežné užívanou v oboru.

Do jakékoliv chiméry, HA je možno uložiť jeden nebo vétší počet peitopu za vzniku di-, tri-, tetra- nebo pentavalentního chimérního HA. Epitop v každém místé uložení múže být stejný nebo ruzný. V prípade, že beží o stejný epitop, bude možno získať vétší množstvi vytvorené protilátky než v prípade monovalentní chiméry HA. v Prípade, že epitopy jsou ruzné, vytvorí se jako odpoveď vétší množstvi protilátek.

Je také možno do chiméry uložiť více než jednu kópii jednoho epitopu a jeden nebo vétší počet dalších epitopu, čímž se získá vétší množstvi protilátky proti jednomu z epitopu a další protilátky současné. Tímto zpusobem je tedy možno získať vícevalentní vakcínu k vakcinaci proti nékolika nemocem nebo nékolika kmenum jednoho onemocnení současné.

Účinné množstvi peptidu pro každé podání je možno stanoviť známymi postupy. Optimálni dávku je napríklad možno stanoviť pri použití sériového fedéní účinné složky podie vynálezu. Je také možno vytvoriť schéma dávek a častosti podávání u pokusných osob a na základe tohoto schematu stanoviť optimálni podmínky podávání.

Ve vakcíne se typicky mísí chimérní antigény s epitopy, uloženými do HA s pomocnými prostŕedky, tj. Syntex nebo alum a pak se injekčné podá hostiteli 1 až 100 míkrogramú vakcíny. Dávky je možno opakovat napríklad každé 4 týdny tak dlouho, až se dosáhne vysokého titru protilátek proti peptidu. V jedné vakcíne je možno kombinovať více než jeden epitop-HA, pŕičemž tyto látky mohou být podobné nebo zcela odlišné. Príprava vakcíny obvykle spočívá v tom, že se uloží gen pro HA s cizorodým epitopem, napríklad s ŕetézcem pro HIV do vhodného vektoru pro expresi. K expresi nové bílkoviny dochází ve tkáňové kultuŕe a chimérní bílkovina se izoluje. Pak se k vakcinaci užije vhodných živočichú.

Antigény typu HA-epitop podie vynálezu je také možno použít k diagnose vystavení pusobení antigénu nebo vírové infekci. ELISA je ejdním z néjbežnéjších postupu pro detekci prítomnosti vírových antigénu v krvi, jak je popsáno v Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Son, 1989. Vyhloubení mikrotitrační plotny se opatrí povlakem protilátek, špecifických pro peptid a pak se ve vyhloubeních inkubuje sérum s obsahem vírových antigénu. Nenavázaný antigén se vymyje a na detekční prostredí se konjuguje· jiný antigén, napríklad enzým nebo peroxidáza z kŕenu.. Pak se prokáže prítomnosť enzýmu napríklad reakci se základním substrátem.

Protilátky, vytvorené proti chimérním bílkovinám typu HA-epitop je možno užít v obdobných diagnostických postupech a v diagnostických balíčcích. Použití bude zvlášté účinné v prípade protilátek proti svrchu popsaným epitopum HA-HIV a proti chimérám HA-hepatitis B nebo C-epitopum.

Podobné je možno provést zkoušky na prítomnosť protilátek tak, že se zkoumaný vzorek, napríklad krev nebo nékterá z jejich frakcí vystaví púsobení chimérních antigénu podie vynálezu.

Chimérní bílkoviny a HA-epitopem je možno využít také v imunotherapii. Je napríklad možno vyvolat tvorbu protilátek, špecifických proti pathogenu nebo neutralizačních protilátek proti kombinaci HA-epitop-bílkovina k zastavení postupu infekce a onemocnení v prípade, že subjekt již byl vystaven infekci. Tím by bylo možno použít i pasívni imunizaci vzhledem k tomu, že imunoglobulíny, obsahujicí neutralizační protilátky proti infekčnímu organismu je možno užít k potlačení infekce. Príklady pasívni imunizace zahrnují imunizaci proti vztekliné u zvírat i u človeka, léčení septického šokového syndrómu pomoci monklonálních protilátek v prípade, že jeho príčinou byly gramnegativní baktérie a imunizaci proti víru HIV.

Genomy, které jsou kódem pro chimérní bílkoviny podie vynálezu je možno uložit do vektoru pro expresi. Vhodnými vektory pro expresi jsou napríklad BPV (vírus papillomu . skotu) a vektory na jeho bazi, vektor, príbuzný dehydrofolátreduktáze dhfr, vektor na bazi adenoviru nebo víru vaccinia. Zvlášté je nutno uvést systém pro expresi na bazi baculoviru, napríklad jde o hmyzí bunky, infikované Autographa californica, virem s inklusemi tvaru mnohostenu, napríklad Spodoptera frugiperda (Sf9).

V prubehu infekce vytvárí baculovirus velké množství bílkoviny tvaru mnohostenu, která se ukládá jako inkluse uvnitŕ víru. Gen pro tvorbu této bílkoviny není podstatný pro infekci nebo pro replikaci víru. Pri vypuštení tohoto génu dochází ke tvorbe víru bez inklusí. Rekombinantní baculoviru je možno získat homologní rekombinací vektoru pro prenos a divokého typu DNA. Vektoru pro prenos (napríklad pVL941) obsahuje segmnet vírové DNA s obsahem promotoru pro vznik bílkoviny ve tvaru mnohostenu (Príklad 3). Gen, k jehož expresi má dojít, se uloží za ŕetézec promotoru.

Gen, uložený ve vektoru pro expresi je možno podávat jako živou vírovou vakcínu, napríklad jako adenovírus nebo virus vaccinia. Je také možno dosáhnout jeho exprese ve velkém množství tnansformací vhodného hostitele, jako E. coli s následným čistením produktu.

Všechny nukleotidové ŕetezce, peptidy a materiály s jejich obsahem je možno pripravit rekombinantními metódami nebo syntheticky.

Popis výhodných provedení

V následujících pŕíkladech, které slouží k ilustraci vynálezu je použito číslování nukleotidových retezcu a retezcu aminokyselín HA podie publikace Hiti a další, Virology 11:113-124, 1981. Gen pro HA byl získán z kmene A/WSN/33 lidského chrípkového viru. Bežné postupy s rekombinantní DNA pro enzymatické reakce, príprava DNA plasmidu, rízená mutageneze, transformace bunek baktérií a savcu apod. byly provádeny podie návodu výnobce nebo podie publikace Sambrook a další, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Všechny podíly a pnocentuální údaje jsou hmotnostní, není-li výslovne uvedeno jinak.

V príkladech 1 až 7 se popisuje vytvorení místa pro uložení v antigenním místé A v HA pro uložení cizonodých epitopu za vzniku chimérních bílkovin. V príkladu 8 se uvádí, že pri použití podobných postupu je možno vytvorit místa pro uložení v dalších známych antigenních místech HA. Cizorodé epitopy je pak možno uložit do jakéhokoliv nové vytvoreného místa v HA. Zvlášté v príkladu 8 se popisuje vytvorení jediného místa púsobeni restrikčního enzýmu BglII v poloze zbytku aminokyselín 184/185 HA, která je součástí antigenního místa B. V príkladu 9 se uvádí použití vétšího počtu takových míst v HA.

Príklad 1

Konstrukce vektoru pro expresi HA

Postup je schematicky znázornén na obr. 2. Plasmid pHAX ( také uvádény jako plasmid pSV-HA v publikaci HArtman a další, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:233-237, 1982), nesoucí úplný kódový retezec génu pro HA byl rozštepen enzymem BamHI a byl izolován fragment o velikosti 1,75 kb. Tento kódový fragment DNA pro HA byl pak uložen do místa púsobení enzýmu BamHI plasmidu pTZ19R (Pharmacia, Inc:.), čímž vznikl rekombinantní kloň ptZ19HA.

DNA s jednoduchým retézcem, obsahující retezec KA jako.positivní retezec byla izolována pri použití ptZ19HA, . jak bylo popsáno v publikaci Baldari a další, Gene, 35:27-32, 1985. Tato DNA byla užitá k provedeni mutageneze, vyvolané pôsobením oligonukleotidu pri použití ná.sledu j í c ího oligonukleotidu: 5'-TCT GTA AAA ACT GCT TTT TCG GGC CCT ATG GGA GCA TGA GAC -3' (/ 972). Tento oligonukleotid odpovídá bp 480519 génu HA s místem pôsobení Apal (GGGCCC) uprostred. Mutageneze pomoci tohoto oligonukleotidu s následnou transformací bunek E. coli JM109 byla provádena známymi postupy podie Sambrook a další, Molecular Cloning, A LAboratory Manual, str. 15-51, 1989. Jeden z klonú, ptZHA139-15 obsahoval nové vytvorené místo pôsobení Apal s gly 139, nahrazeným ala-arg, kdežto zbytek retézce zôstal beze zmeny. Tuto skutečnost bylo možno potvrdit analýzou retézce DNA v této oblasti.

Príklad 2

Uložení cizorodých epitopu.

Postup je schematicky znázornén na obr. 2... Komplementárni oligomery, které jsou kódem pro’ rúzné peptidy, byly synthetizovány fosfotriesterovou metodou podie Crea a další, Proc. Natl. Acas. Sci. USA 70: 5765, 1978. Ekvimolární koncentrace komplementárnich oligomeru byly smíseny za vzniku duplexního oligomeru s okrajovými retézci Apal. Pred väzbou byly oligomery fosforylovány na 5'-zakončení, pomoci ATP a T 4 DNA kinázy podie pokynu dodavatele (Pharmacia, Inc. ) . Približne 10 /Ug ptZHA139 bylo zorštepeno pomoci Apal a defosforylováno alkalickou fosfatázou bakteriálního puvodu podie Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989. Približné 100 ng plasmidu, rozštepeného Apal a 1 ^ug oligonukleotidu bylo navázáno a užito k transformaci E. coli. Bakterální koionie byly zkoumány in situ hybridizací rádioaktívne značenými oligomery. Pak byl analyzován ŕetezec poten ciálne rekombinantních klonu s uloženými cizorodými částmi ke stanovení správné orientace techto části a správnývh čtecích rámcu. Byl užit každý z 9 epitopu HIV z tabulky laz obr. 2.

príklad 3

Konstrukce rekombinantního baculoviru

Pri použití standardních rekombinačních postupu podie Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 byly jednotlivé uložený epitop o 1,75 kb HA nebo epitop HA/HIV chimérního génu s okrajovými retézci BamHI do vektoru pVL941, odvozeného od AcMNPV (získán od Dr.Max D. Summers a popsán v Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas A and M University, College Station, TX, 1988). Exprese génu pro heterologní bílko22 kovinu je pod transkripčním rízením promotoru pro bílkovinu tvaru mnohostenu. Rekombinantní baculovirus, obsahující požadovaný gen byl vytvoren kotransfekcí 1 ^ug DNA divokého typu viru AcMNPV a 2 ^ug rekombinantní DNA plasmidu pro prenos v bunkách Sf9 pri použití srážení fosforečnanem vápenatým podie Smith G.E. a další, Molec. Celí. Biol. 3:2156-2165, 1983. Po šesti dnech bylo odebráno živné prostredí s obsahem viru divokého typu a rekombinantního baculoviru a rekombinant 3 2 m viry byly identifikovaný hybridizaci na P-znacený gen HA z bunek Sf9, infikovaných sériové redeným virem na plotnách s 96 vyhloubeními podie Germann a další, J. Biol. Chem. 264: 7814-7824, 1989. Bylo provedeno tri až šest: cyklu hybridizace k získání čistého viru bez inklusí typu mnohostenu, jako AcHA-N22G, kód pro bílkovinu HA-N22G. Tento vírus byl pak propagován v bunkách Sf9.

Bunky Sf9 byly naočkovány s hustotou približne 7 x 7 bunek na 1 banku T-150 s objemem 150 ml. Bunky Sf9 byly také pestovány v suspenzi v baňce pro odstredivky až do hustoty 2 až 3 x 10⁶ bunek/ml. Pak byly bunky infikovány rekombinantním virem pri multiplicité infekce (MOI) 5 až 10. Po tŕech až čtyŕech dnech, kdy byla exprese chimérního HA maximálni byly bunky izolovány. po promytí PBS byly bunky extraho vány 1% smési smáčedel, obsahující stejné množství tritonu x 100 a deoxycholátu k izolaci HA nebo chiméry HA, vázaných na membránu. Vzhledem k tomu, že HA je glykoprotein, došlo k jeho částečnému vyčistení pri pruchodu extraktu afinitním sloupcem lectin Sepharosy 4B (lectin z lens culinaris, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Částečné čištený HA nebo chiméra pak byly užitý k imunizaci pokusných zvírat (morčat) k vyhočnocení jejich účinnosti jako imunogenu.

Príklad 4

Biologické vlastnosti HA a chimérních bílkcvin HA/HIV

Vysoký titr (10 pfu/ml) rekombinantních viru byl užit k infekci čerstvé na plotny nanesených bunek Sf9 , které byly po dalších tŕech dnech izolovány a zpracovány k izolaci rekonbinantní bílkoviny zpusobem podie príkladu 3. Rekombinantní bílkovina tvorila približne 10 až 20 % celkové bunečné bílkoviny, jak bylo stanoveno zbarvením gélu modrí coomassie. Približne 2 až 10 % bílkoviny bylo možno extrahovat pomoci smáčedla a pravdepodobné šlo o natívni formu. Zbytek byla nerozpustná bílkovina, uložená uvnitŕ bunky. HA a chimérní bílkoviny byly synthetizovány jako trojité pásy. Spodní pás (približné 55 000 molekulová hmotnost) predstavoval neglykosylovanou formu zhledem k tomu, že pri zpracování infikovaných bunek pusobením tunicamycinu, inhibitoru glykosylace, dochází k produkci pouze tohoto pásu bílkoviny. Horní dva pásy s molekulovou hmotností 58 000 a 66 000 predstavuj! pravdepodobne ruzné stupné glykosylačního zpracování. V prípade, že byly bunky, infikované rekombinantním HA-baculovirem extrahovány smáčedlem, bylo možno extrahovat pouze bílkovinu s molekulovou hmotností 66 000, takže tato bílkovina je pravdepodobné spojená s membránou a predstavuje pravdepodobné také natívni formu HA.

Imunofluorescence s králičím anti-flu (A/WSN/33) sérem a s fluoresceinem konjugovanou druhou protilátkou, kozí protilátkou proti králičím tkáním IgG byla provedena podie Posse, Virus Res., 5:43-59, 1986. Bunky, infikované rekombinantním virem mely silné fluorescenční membránu. Bunky po zdanlivé infekci a bunky, infikované divokým typem viru nemély žádnou fluorescenci.

Biologická aktivita bunek Sf9, infikovaných rekombinantním baculovirem byla zkoumána hemadsorpci a hemaglutinací pri použití 1% RBC kuŕete podie publikace Posse, Virus Res. 5:43-59, 1986. Bunky, infikované rekombinantním HA-baculovirem vykazovaly významnou hemadsorpci,, bunky, infikované divokým typem nebo rekombinantním baculovirem včetné chimér HA-HIV (N22G, D18S a 716G) nevykazují pri této zkoušce žádnou aktivitu. Podobných výsledku bylo dosaženo v prípadé, že byla provádéna hemaglutinace pri použití extraktu bunek smáčedlem. Tyto výsledky ukazují, že uložení epitopu HIV do HA ovlivní místo väzby receptoru, které zrpostŕedkovává biologickou účinnost HA. Místo pro väzbu receptoru je v HA uloženo v blízkosti antigenního místa A, do néjž byly selektívne ukládány epitopy (Obr. 1).

Príklad 5

Imunologická odpoveď morčat na injekci chimérní bílkoviny HA-HIV

Bunky Sf9 ve 20 až 30 lahví.ch T150 byly infikovány rekombinantním baculovirem HA-N22G a HA-D18S, pripraveným zpúsobem podie príkladu 3 s MOI 10. Po 72 hodinách po infekci byly bunky izolovány, trikrát promyty PBS a zpracovávány k čistení produktú. K imunizaci morčat byl užit částečné čiš tený HA nebo chimérní bílkoviny s obsahem HA. Další injekce byly podány v intervalech čtyr týdnú. Dva týdny po každé injekci bylo odebíráno sérum.

Účinnost séra byla stanovená inhibicí hemaglutinace (Hl), pri níž se stanoví schopnost antiséra zabránit hemaglutinační reakci, vyvolané 4 jednotkami rekombinantního HA s 1 % kurecího RBC. Všechna séra byla nejprve ŕedéna 1 : 10 a pak zpracovávána púsobením kaolínu (100 mg/ml) k odstra25 není prírodních inhibitoru. Zpracování kaolinem nijak neovlivní titr protilátky. Získané výslekdy jsou shrnuty v následující tabulce 2.

Po druhé injekci mela všechna séra proti rekombirentnímu HA nebo proti chimérní bílkovine HA-HIV titry v rozmezí 150 pro N22G až 5120 pro D18S. Kontrolní sérum bez antigénu melo titr 20.

Po tretí injekci došlo k dalšímu vzestupu titru pri Hl u všech zvíŕat. Zvírata, která byla imunizována surovou plasmatickou membránou z bunek, infikovaných AcHA-N22G-rekombinantním baculovirem méla rovnéž titr Hl 60 až 80. Titr 40 nebo vyšší se považuje za dostatečný k zajištení ochrany proti infekci chrípkovým virem pri vakcinaci lidí.

V prípade, že byl svrchu uvedený pokus opakován pri použití HA z heterologního kmene chrípkového viru (A+Taiwan), nedošlo k žádné neutralizaci. To prokazuje, že baculovirus nebo antigény HA, získané expresí jsou schopný vyvolat tvorbu nautralizačních protilátek, špecifických pro určitý kmeň. Mimoto bylo prokázáno, že antiséra proti HA-D18S a HA-N22G obsahují protilátky, reagující s HIV gpl60, jak bylo prokázáno pri zkoušce Western blot. Výsledky imunizace pri použití HA-N22G jsou shrnuty v následující tabulce 3.

Epitop N22G odpovídá hlavní neutralizační oblasti gplôO HIV a je tedy hlavním cílem pro získání vakcíny podie Javaherian a další, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6762-6772, 1989. Pokusy na zvíratech byly opakovaný pri použití rekombinantního HA nebo HA-N22G. Zvírata byla imunizována zprvu částečne čišteným prostredkem, obsahujícím L až 2 ^ug HA nebo chimérní bílkoviny a pak byly podána ješte 3 další injekce ke zvýšení množství produkovaných protilátek. Produkce protilátek, proti uloženému peptidu, N22G, byla stanovená

I) zkouškou ELISA proti peptidu N22G,

II) zkouškou Western blot s obalovým peptidem gpl6O a

III) neutralizací in vitro (shrnuta v tabulce 3).

Pri druhé a tretí podpurné injekci došlo pri všecb trech zkouškách u zvírat k produkci špecifických protilátek s vysokým titrem. Jak bylo možno očekávat, u zvírat, imunizo vaných HA nedošlo pri techto zkouškách k žádné odpovedi. Zvláštni zajem vzbuzuje produkce neutralizačních protilátek prti infekci HIV u zvírat, imunizovaných HA-N22G.

Tabulka 2

Titr pri inhibici hemaglutinace (Hl) v morčecím séru dva týdny po druhé (2°) a tretí (3°) injekci

Antigén	Morče	Kaolín	Titr 2°	Hl 3°
HA	A	+	1280	10240
	B	+	1280	2560
N22G	C	+	160	a
	D	+	160	-
D18S	E	+	5120	10240
	F	•ŕ	640	3790
nebyl pouzit	9	+	20	40
	10	+	20	60
N22G sur.membrána	11	+	80	ND'
C . p e 1 e t a	12		60	ND
CHripka WSN	králik 313	+	5120
		—	5120

Vysvetlivky k tabulce:

a) obe zvírata uhynula pri odberu krve

b) titr Hl norm c) ND = nebylo	álního séra bez provedeno	kaolínu	je 320
	T a	b u 1 k	a 3
Zkouška		HA		NA-	-N22G
	1 0	„o	n	, o	n	0
	1	2	3	1	2	3
Neutralizace	1280	2560	2560	160	640	2560
HA, titr Hl	1280	2560	5120	160	1280	1280
Titr HA pri	IO⁶	3xl0⁵	3xl0⁵	3xl0⁵	3xl0⁵	lxlO⁵
zkoušce ELISA	io⁵	3xlO⁵	lxlO⁶	3xl0⁵	lxlO⁵	4 1x10
ELISA				300	30000	30000
anti-N22G	-	-	-	300	10000	10000
anti-env	-	-	-	ND	20000	20000
(blot)	-	-	-	ND	1000	20000
titr neutrali-	-	-	-	10	40	810
začních proti-	-	-	-	10	20	475
látek (pri NIH)

- = negatívni výsledek ND = nebylo provedeno

Príklad 6

Príprava epitopu HA-IgE (HA-K10F)

Klonování rekombinantního génu HA v baculoviru jako vektoru, pBLl podie Vialard a další, J. Virology, 69:37-50, 1990 bylo usnadnéno modifikací okrajových restrikčních míst. Približne 2 /Ug plasmidu ptZHA-139-15 byly rozštépeny pomoci BAmHI k izolaci fragmentu o 1,75 kb. Tento fragment DNA byl po vyplnení Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy a deoxanukleotidfosfáty (dNTP) uložen do místa HindlII v plasmidu pGEM 9Zf(-) (Promega Biotec-Madison, WI) za vzniku plasmidu pHA.Nhel. Z tohoto plamsidu byl vyjmut gen pro HA nebo pro chimérní HA jako fragment o 1,75 kb po rozštépení enzymy Spel a Xbal.

Približné 1 ^ug plasmidu pHA.Nhel byl rozštépen púsobením Apal a pak defosforylován bakteriálni alkalickou fosfatázou. Byly synthetizována dva pro peptid K10F kódové komplementárni oligonukleotidy:

KTKGSGFFVF 5' AAA ACC AAG GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC GGG GCC 3

CCGG TTT TGG TTC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG CC

Sty 1 Apa 1

Stejné molární množství obou oligomeru bylo smíseno a fosforylováno pri použití T4 polynukleotidkinázy a ATP. Približné 0,1 ^ug defosforylovaného vektoru a 1 ^ug obou oligomeru. bylo navázáno a pak užito k transformyci bunék E. coli, kmene MM294.

Materiál ze dvanácti klonu byl rozštepen enzymem Styl k prukazu prítomnosti uvedených oligomeru. Bylo prokázáno, že jeden z klonu, pHA.Nhe-hlgE-ll obsahuje uložený ŕetézec oligonukleotidu ve správne orientaci. Analýza ŕetézce potvrdila správne uložený ŕetezec do správného místa. Približne 10 /Ug tohoto plasmidu bylo rozštepeno Spel a Xbal a byl izolován fragment DNA o velikosti 1,8 kb.

Približne 10 ^ug vektoru na bazi baculoviru, pBlueBac (pBLl-Invitrogen Corp.-San Diego, CA) bylo rozštepeno Nhel a defosforylováno BAP. Približné stejné molární množství vektoru, rozštépenéhé Nhel a fragmentu DNA o 1,8 kb bylo navázáno a smes byla užitá k transformaci E. coli MM294. Bylo vybráno 12 klonu pro prípravu miniplasmidu. Jeden z klonu, plasmid pBL-HA-K10F-5-2, byl identifikován jako plasmid, obsahující gen HA.K10F ve správné orientaci.

K získání rekombinantního baculoviru bylo použito približne 1 ^ug viru divokého typu, AcMNPV a 2 ^ug rekombinantního vektoru pBL-HA-K10F-5-2 k transfekci hmyzích bunek Sf9 pri použití srážení fosforečnanem vápenatým, podie Summers a další, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas A and M University, College Station, TX, 1988. Rekombinantní baculovirus byl vytvoren homologní rekombinací mezi vektorem a DNA divokého typu viru. šest dnu po transfekci bylo odebráno prostredí, obsahující smes viru divokého typu a rekombinantního viru. Toto prostredí bylo po seriovém ŕedení (10^- až 10~°) užito k infekci bunek Sf9, čerstvé nanesených na Petriho misky s prumérem 100 mm, opatrené povlakem agarosy s obsahem substrátu pro beta-galaktosidázu, X-gal. Rekombinantní virus, jehož prítomnosť se projevila vznikem modré škvrny, byl dále čištén čištením materiálu z tohoto plaku v nékolika stupních podie Vialard a další, J. Virology 69:37-50, 1990. Tento re30 kombinantní baculovirus byl označen AcHA.KlOF. Exprese chimérní bílkoviny HAK10F byla stanovená analýzou Western blot bílkoviny z infikovaných bunék Sf9 pri použití králičích protilátek, vytvorených proti peptidu. Po pestování v produkčním merítku a po čistení byla chimérní protilátka použitá jako vakcína.

Príklad 7

Príprava epitopu HA-IgE (HA-H22V)

Kodový nukleotidový retezec pro peptid H22G byl uložen do génu HA, jehož exprese pak bylo dosaženo v systému pro expresi na bazi baculoviru zpúsobem podie príkladu 6.

Byly synthetizovány dva komplementárni oligonukleotidy

Apal HSTTQPRKTK ACA AGT ACT -ACA CAG CCC CGC AAA ACC AAG

CCGG GTG TCA TGA TGT GTC GGG GCG TTT TGG TTC

Dvojiý oligomer byl uložen do místa púsobení Apal plasmidu pHA.Nhel za vzniku rekombinantního pHA-Nhe-H22V. Fragment DNA Spel/Xbal o 1,8 kb, získaný z uvedeného plasmidu byl uložen do místa púsobení Nhel v pBLl za vzniku rekombinantního olasmidu pro prenos, pBL-HA-H22V-1. Homologní rekombinací tohoto plasmidu a DNA AcMNPV byl získán rekombinantní baculovirus, AcHA-H22V. Tento rekombinantní baculovirus po infekci bunék Sf9 byl príčinou exprese chimérní bílkoviny HA-H22V, kterou je po čistení možno použit jako vakcínu .

Príklad 8

Konstrukce vektoru pro expresi HA s místy pro uložení, vytvorenými v místech B, C, D a E

Pri použití rekombinantního plasmidu ptZ19HA, nesou cího gen HA byla pripravená DNA s jednoduchým retézcem podie publikace Baldari a další, Gene, 35:27-32, 1985. Tato DNA byla užitá k provedeni cílené mutageneze pri použití následu jícího oligomeru:

5'ACT CTG TTG CTC AGA TCT GCT GGA CGG GTG ATG AAC 3'

Tento oligonukleotid odpovídá párum baží 615-550 (aminokyselina 178-189) génu HA s místem pôsobení BglII (AGATCT) uloženým ve strední části oligonukleotidu. Mutagenese timto oli gonukleotidem a transformace E. coli JM109 byla provedena podie publikace Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, str. 15-51, 1989. Jeden z klonú, pt2HA184-l, mel· nove vytvorené místo pôsobení BglII. To bylo potvrzeno analýzou retézce DNA v této oblasti. Mutageneze méla za následek náhradu ser 184 a asp 185 zbytky arg a ser, kdežto zby tek retézce zôstal nezménen.

Príklad 9

Konstrukce vektoru pro expresi na bazi HA s radou míst pro uložení

Byla vytvorená dve místa pro uložení, a to v antigenním retezci A a B v HA, do téchto míst js možno uložit dva epitopy se stejným nebo odlišným retézcem. Rekombinantní plasmid ptZHA139-15, popsaný v príkladu 1, obsahuje gen HA, v nemž je vytvoŕeno jediné reštrikční místo pro Apal v ŕetéz ci, odpovídajícim antigennímu místu A. DNA s jednoduchým retézcem, pripravená z tohoto plasmidu byla použitá k dosažení mutace spolu s oligomerním retézcem z príkladu 8, který byl konstruován tak, že vzniklo jediné místo púsobení BglII v místé B. Bylo zjišteno, že jeden z klonú, pHA139/184, obsahuje obe nove vytvorená místa Apal a BglII, jak bylo také potvrzeno analýzou retézce DNA z odpovídaj íc ích oblastí. Pak je možno uložit do kteréhokoliv ze známych antigenních míst HA tentýž nebo ruzné cizorodé epitopy.

Postup z príkladu 9 je možno rozšíŕit tak, že mohou vznikat další místa, která jsou jedinými místy púsobení určitého restrikčního enzýmu v oblastech, odpovídaj íc ích antigenním místúm C, D a/nebo E v HA. Tato jediná místa púsobení restrikčních enzymú mohou být jakákoliv místa, která se nenacházejí ani v plasmidu ptZ19R, ani v retézci HA. Kromé Apal a BglII múže jít o AflII, AvrlI, BclII, NheI? Xhol apod.

Príklad 10

Pasívni imuniazce protilátkami Anti-N22G k čosažení prevence infekce HIV

Pasívni imunizace je vhodná v prípadech, kdy múže dojít k nežádoucímu styku s infikovanou krvi nebo materiály po zpracování krve. Podání je vhodné také v prípade prenosu HIV z matky na plod. Podání špecifických protlátek proti HIV-1 smyčka V3 (N22G) by mohlo zabránit vzniku infekce, jak bylo popsáno v Berzofsky J.A. a další, Approaches and Issues in the Development of Vaccines Against HIV, J. Acauired Immune Deficiency Syndromes 4:451-459, 1991.

Aby bylo možno získat velké množství protilátek proti peptidu N22G, imunizují se velká zvíŕata (napríklad kone) opakovanými injekcemi až do dosažení vysokého itiru neutralizačních protilátek proti HIV-1, jak bylo popsáno v príkladu 5 a shrnuto v tabulce 3. Zvíŕatúm se odebírá krev a krevní sérum se pak ihned nechá projít afinitním sloupcem Agarosy s proteinem A k obohacení frakce IgG podie pokynu dodavatele (GIBCO BRL, Life Technology Inc., Gaithersburg, MD). Frakce IgG obsahuje špecifické protilátka proti HIV-1. Vhodné množství IgG spolu s vhodným nosičem se injekčné podává osobám, u nichž pravdepodobné došlo ke styku s HIV-1. Dávka a časový program podávání injekcí je stanoven vždy na základe klinických pokusu.

Je zrejmé, že by bylo možno uvést ješté radu modifikací na základe svrchu uvedeného podrobného popisu vynálezu, pŕičemž tyto modifikace by rovnéž spadaly do rozsahu vynálezu Vynález tedy zcela zrejmé nemúže být omezen na popsaná výhodná provedení.

Vakcína, kterou je možno na základe vynálezu získat muže poskytnout profylaktickou ochranu pred infekcí víry, bakteriemi nebo také nádorovým antigenním materiálem vzhledem k tomu, že u hostitele vyvoláva tvorbu neutrálizačních protilátek, které bráni dalšímu vývoji onemocnéní. Napríklad protilátka, vytvorená v organismu morčete bude neutralizovat (zničí) HIV dríve, než se dostane do vnitrního prostoru bunky. Skutečnost, že antigenní polypeptidy podie vynálezu pusobí jako antigény cizorodých epitopu, uložených do HA je možno prokázat napríklad reakcí s lidskou monoklonální protilátkou proti HIV a HA-HIV modifikovanými sloučeninami podie vynálezu .

Spolu s antigenními polypeptidy podie vynálezu je možno použít radu pomocných látek, napríklad Syntexem dodávanou pomocnou látku alum (ve forme 0,2% vodného roztoku s obsahem pufru), imunostimulační komplex (ISCOM), tetanový toxoid, difterický toxoid, pomocný glykosid Quil A (Spikosiče; Iscotec AB) (Morein a další, Náture 308:457-460,1.984), derivát muramyldipeptidu (MTP-PE) v emulsi s nízkym množstvím oleje MF 59 a s výhodou se užijí liposomy na bazi cholesterylhemisukcinátu (CHS) podie WO 90/01947, 8. bŕezna 1990,

WO 90/1948, 8. bŕezna 1990 a US patentový spis č.4721612.

Vakcíny je možno pripravit obvyklým zpúsobem smísením antigenního peptidu s pomocnou látkou pri teplote místnosti .

Tyto vakcíny je možno podávat v závislosti na zpusobu zpracování perorálne, parenterálne, rektálne, nosní sliz ničí nebo s výhodou nitrožilne pri ohrození infekcí. Účinná dávka je v rozmezí 1 až 500, obvykle 5 až 300 a s výhodou 10 až 100 /Ug a to ve forme jednotlivé dávky nebo vetšího počtu dávek. Dávky je možno opakovat k dosažení požadovaného titru neutralizačních protilátek (300 v prípade HIV). V závislosti na typu onemocnení je možno provést preočkování približne v prubéhu jednoho roku.

V prubehu prihlášky jsou uvádény špecifické epitopy buď uvedením terminálních aminokyselín a délkou retezce epitopu retezce aminokyselín v HIV, tak jak tomu je v prípade N22Gm kde terminálni aminokyselinou je Asn a C-terminální aminokyselinou je Gly a ŕetezec obsahuje 22 zbytku aminokyselín, nebo pomoci bežných názvu pro retezce z literatúry, tak jak tomu je v prípade gpl60 a gpl20. Epitopy víru HIV, užité pri modifikaci molekuly HA mely alespoň dvanáct aminokyselín, aby bylo k disposici dostatečne velké antigenní místo pro rozpoznání hostitelem.

Claims

1. Fragment DNA, obsahujíci nukleotidový ŕetezec, v podstate odpovídající kódovému retezci pro povrchový antigén HA chrípkového viru A s pšti immunodominantními antigenními místy, pričemž do kodového retezce pro alespoň jedno antigenní místo je uložen nukleotidový ŕetezec, , v podstate odpovídající kódovému ŕetézci pro epitopy efektorového místa IgE, epitopy bakteriálni bílkoviny, nádorové epitopy, epitopy SP1O nebo vírové epitopy HIV ze skupiny T2OE, T1.6G, D18S, G20E, K27R, E14Q, N22G, P17, P24, gpl60 a gpl2O.

2. Fragment DNA podie nároku 1, v nemž antigenním místem je oblast A bílkoviny HA.

3. Fragment DNA podie nároku 1, v nemž antigenní místo odpovídá aminokyselinám 183-192 bílkoviny HA.

4. Fragment DNA podie nároku 1, v nemž je uložen kódový nukleotidový ŕetezec pro nékterý z epitopu viru HIV, N22G, D18S nebo T16G.

5. Fragment DNA podie nároku 4, v nemž je uložen kódový nukleotidový ŕetezec pro vírový epito HIV N22G.

6. Fragment DNA podie nároku 1, v nemž je uložen kódový nukleotidový ŕetézec pro epitopy efektorového místa IgE K1OF nebo H22V.

6. Polypeptid, obsahujíci ŕetézec aminokyselín, v podstate odpovídající povrchové bílkoviné HA chrípkového viru A s pšti imunnodominantními antigenními místy, pričemž do retezce aminokyselín alespoň jednoho antigenního místa je u36 ložen retézec aminokyselín, v podsaté odpovídající retézci pro epitopy efektorového místa IgE, epitopy bakteriálni bílkoviny, nádorové epitopy, epitopy SPiO nebo vírové epitopy HIV ze skupiny T2OE, T16G, D18S, G20E, K27R, E1.4Q, N22G, P17, P24, gpl6O a gpl2O.

8. Polypeptid podie nároku 7, v némž je antigenním místem oblast A bílkoviny HA.

9. Polypeptid podie nároku 7, v némž antigenní místo odpovídá aminokyselinám 183 až 192 bílkoviny HA.

10. Polypeptid podie nároku 7, v némž je vloženým retezcem aminokyselín epitop víru HIV N22G, D18S nebo T16G.

11. Polypeptid podie nároku 10, v némž je vloženým retezcem aminokyselín N22G.

12. Polypeptid podie nároku 7, v némž je vloženým retezcem aminokyselín jeden z epitopu efektorového místa IgE K10F nebo H22V.

13. Vakcína, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid s retezcem aminokyselín povrchové bílkoviny HA chrípkového viru A, v némž je v alespoň jednom z péti imunnodominantních antigenních míst uložen cizorodý epitop ze skupiny epitopu efektorového místa IgE, epitopu bakteriálních bálkovin, nádorových epitopu, epitopu SPIO nebo vírových epitopu HIV ze skupiny T20E, T16G, D18S, G20E, K27R, E

14Q, N22G, P17, P24, gpl60 a gpl20.

Vakcína podie nároku 13, vyznačuj íc í s e t í m, že cizorodý epitop je uložen do antigenní oblasti A povrchové bílkoviny HA.

15. Vakcína podie nároku 13, vyznačuj ící s e t í m, že vloženou části je epitop viru HIV, N22G, D18S nebo T16G.

s e t 16. Vakcína podie nároku 15, vyznač u j í c í í m, že vloženou části je N22G. 17. Vakcína podie nároku 13, vyznač u j í c í s e t í m, že vloženou části je epitop efektorového místa

IgE, K1OF nebo H22V.

18. Vakcína podie nároku 13, vyznačuj ící s e t í m, že jako pomocnou látku obsahuje pomocné činidlo Syntex, alum, imunostimulační komplex, tetanový toxoid, difterický toxoid, adjuvantní glykosid Quil A, derivát muramyldipeptidu (MTP-PE) v emulsi s nízkym, obsahem oleje a s výhodou liposom na bazi cholesterylhemisukcinátu.

19. Vakcína podie nároku 13, vyznačuj íc í s e t í m, že jako pomocnou látku obsahuje pomocné činidlo Syntex nebo alum.

baculovi rus ku 1.

Vektor pro expresi, obsahující rekombinantní s genomem, zahrnujícím fragment DNA podie náro21. Mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi podie nároku 20.

22. Bunka hmyzu, transformovaná vektorem pro expresi podie nároku 20.

23. Reakční činidlo pro detekci prítomnosti vírových, bakteriálních nebo nádorových antigénu, vyznačuj íc í s e t í m, že obsahuje špecifické polypeptidové protilátky, vytvorené u savcu proti polypeptidu podie nároku 7.

24. Zpúsob léčení a prevence infekc HIV u savcu, pri nemž se podává účinné množství vakcíny podie nároku 13.

25. Zpúsob léčení a prevence alergických reakcí, pri némž se podává účinné množství vakcíny podie nároku 13.

26. Zpúsob léčení nebo prevence infekce nebo pathologického stavu u savce, pri némž se podává účinné množství . protilátek, vytvorených exposicí hostitele na bílkovinu podie nároku 7.

27. Zpúsob detekce vírových, bakteriálních nebo nádorových antigénu va vzorku krve nebo její frakce u savcu, vyznačující se tím, žese vzorek krve nebo její frakce uvede do styku s účinným, detekce antigénu schopným množstvím polypeptidu podie nároku 23 a stanoví se pritom nost nebo neprítomnost jakéhokoliv výsledného komplexu antigénu a protilátky.