HUT65366A - Expression of specific immunogens using viral antigens - Google Patents
Expression of specific immunogens using viral antigens Download PDFInfo
- Publication number
- HUT65366A HUT65366A HU9203931A HU9203931A HUT65366A HU T65366 A HUT65366 A HU T65366A HU 9203931 A HU9203931 A HU 9203931A HU 9203931 A HU9203931 A HU 9203931A HU T65366 A HUT65366 A HU T65366A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- epitope
- protein
- antigenic
- virus
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 5
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical group OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 102200020671 rs121912988 Human genes 0.000 claims description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 102220350531 c.80A>G Human genes 0.000 claims 2
- 102200061298 rs1064795967 Human genes 0.000 claims 2
- 102220323264 rs777883490 Human genes 0.000 claims 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 102220218086 rs781721739 Human genes 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 7
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 abstract 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 abstract 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 80
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 80
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 80
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 80
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 24
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 24
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 12
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 5
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N carbosulfan Chemical compound CCCCN(CCCC)SN(C)C(=O)OC1=CC=CC2=C1OC(C)(C)C2 JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-(4-aminophenoxy)-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 241000132028 Bellis Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 240000008570 Digitaria exilis Species 0.000 description 1
- 235000005459 Digitaria exilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229940121672 Glycosylation inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000696272 Gull adenovirus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000655188 Homo sapiens Tachykinin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000491226 Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1)) Species 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101150051715 Phax gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 description 1
- -1 Quil A glycoside Chemical class 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102100033009 Tachykinin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000028802 immunoglobulin-mediated neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical class OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000012184 tortilla Nutrition 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány influenza vírus hemagglutinin (HA) kiméra fehérjékkel foglalkozik, amelyek vakcinákként alkalmazhatók vírusok, kórokozó baktériumok vagy egyéb, pl. daganatos szövetekre jellemző vagy allergiát okozó és hasonló antigének ellen. Ezek a kiméra fehérjék használhatók továbbá ezen antigének kifejeződésekor azok kezelésére vagy azok és a velük kapcsolatos ellenanyagok kimutatására is. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen fehérjéket kódoló nukleinsav szekvenciák is.
A szervezet számára idegen epitopok, mint pl. a humán immunhiány-betegség vírusának epitopjai, inzertálhatók a HA fehérje antigénhatású részeibe, és ezek a kiméra fehérjék képesek az inzertált epitop ellen fajlagos immunválasz kiváltására.
Vakcinák készítésének több módja lehetséges. Vírusos betegségek elleni vakcinák esetén az alkalmazott eljárások az inaktivált vírusok, élő vírusok, élő rekombináns vírusok, vírus fehérjék, vírus alegység fehérjék stb. használatát foglalják magukba.
Sok vakcina típusnak azonban korlátozott a hatékonysága, részben azért, mert a kórokozók egyes törzsei vagy izolátumai között nagy a genetikai változatosság. Ráadásul, a kórfejlődésben szerepet játszó emberi vagy állati antigének, mint pl. az IgE az allergiás reakcióban, tumor antigének, stb. nem váltanak ki hasznos immunválaszt ugyanazon állatfajban, mint amelyből származnak és valójában inkább tekinthetők saját fehérjéknek, mintsem antigéneknek.
Valójában célszerű egy adott antigén biológiai funkció ját képviselő kisebb peptid szekvenciákat vagy epitopokat (azaz antigén determinánsokat) alkalmazni immunogén anyagként, még homológ állatfajokban is. Elméletileg ezek a peptidek állatba fecskendezve alkalmasak lehetnek immunválasz kiváltására. A gyakorlatban azonban ezek a peptidek gyakran nem jó immunogének, mert kisméretűek, és nem prezentálják magukat az immunrendszer felé előnyösen.
Az ilyen, gyengén immunogén peptidre jó példa a humán immunhiánybetegség vírus (HÍV) külső burok glikoproteinjének (gpl20) második konzervatív egysége. Ez a peptid fontos a HÍV fertőzőképessége és az ellenanyag közvetítette vírus-neutralizáció szempontjából [Science, 1988. február
26., 1021. oldal]. A vírus ezen része (254-274 aminosavak) ellen irányuló antiszérum három különböző HIV-izolátumot képes neutralizálni in vitro anélkül, hogy az befolyásolná a vírus T-sejt receptorhoz vagy CD4-pozitív sejtekhez való kötődését. Ezen konzervatív egységről feltételezik, hogy a vírus behatolása során a kötődést követő eseményekben kulcsszerepe van, és az ellenanyag közvetítte neutralizáció célpontja lehet. Megfigyelték azonban, hogy ez az egység immunológiai szempontból viszonylag néma, amikor az az immunrendszer számára mint természetes HÍV fertőzés prezentálódik. Az immun-némaság ezen formája azt sugallja, hogy ez az epitop például a fehérje konfigurációja miatt rejtve van.
A HÍV antigénekről további részletek találhatók a következő szakirodalmi helyeken: Rusche és munkatársai [Antibodies that Inhibit Fusion of Humán Immunodéiiency Virus-infected Cells Bind a 24 Amino Acid Sequence of the Viral f * « *····« • · « · · · · • · « ·
- 4 Envelope, gpl20, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 3198-3202 (1988)], Bolognesi [Progress in Vaccine Development Against SIV and HÍV, Journal of Acquired Immuné Deficiency Syndromes, 3., 390-394, Raven Press, Ltd, New York, (1990)], Wain-Hobson [Nucleotid Sequence of the AIDS Virus, LAV, Cell, 40, 9-17 (1985)], valamint Ho és munkatársai [Second Conserved Domain of gpl20 Is Important fór HÍV Infectivity and Antibody Neutralization, Science, 239, 1021-1023 (1988)].
Epitop peptidek immunogenitása fokozható azok méretének növelésével, valamely módon fúziós fehérjékhez, makromolekulákhoz vagy adjuvánsokhoz való kapcsolásával, ezáltal megnövelve azok felismerhetőségét (az immunrendszer számára).
Colbere-Garapin és munkatársai számoltak be a 3-as típusú poliovírus (Sabin törzs) inzerciós mutánsának előállításáról, amelyekbe további aminosav-szekvenciákat (tri- vagy hexapeptideket) inzertáltak a VP1 tokfehérje 1. számú neutralizációs egységén belül [Colbere-Garapin és munkatársai, Addition of a Foreign Oligopeptide to the Major Capsid Protein of Poliovírus, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 85, 8668-8672 (1989)].
Evans és munkatársai beszámoltak egy poliovírus antigén hatású kiméra protein előállításáról és jellemzéséről, amely tartalmazza a humán immunhiány betegség I. típusa (HIV-1) transzmembrán glikoproteinjenek egy epitopját (gp41). Az élő polio/HIV kiméra fehérje bőr alá való adásával készült nyúl antiszérum széleskörű neutralizációt mutatott számos amerikai és afrikai eredetű HIV-1 izolátummal szemben [Evans és munkatársai, An Engineered Poliovirus Chimaera Elicits Broadly Reactive HIV-1 Neutralizing Antibodies, Natúré,
339,, 385-388 (1989)]. Élő vírus vektorok alkalmazása, mint amilyen a poliovirus, gyakorlati problémákat vet fel, amenynyiben a szérumban megjelenő ellenanyagok megállíthatják a rekombináns vírus replikációját a szervezetben. Ezenkívül, az élő vírus vektorok esetében az inzert mérete szigorúan behatárolt, és a vektorok korlátozott számú inzerciós helyet tartalmaznak.
Wu és munkatársai az S (122-137) és pre-S2 (120-145) hepatitis B vírus felületi antigének aminosav-szekvenciáinak megfelelő szintetikus nukleotidok klónozott Salmonella flagellin gén hipervariábilis szakaszába való in-frame inzerciójárói számoltak be. Az élő rekombináns baktériummal immunizált állatokban hepatitis B vírus epitopra fajlagos ellenanyagok képződtek, amint azt ELISA próbával kimutatták [Wu és munkatársai, Expression of Immunogenic Epitopes of Hepatitis B Surface Antigén with Hybrid Flagellin Proteins by a Vaccine Strain of Salmonella, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, , 4726-4730 (1989)]. Az immunválasz gyenge volt, rövid ideig tartott, és az immunizálás után rohamosan gyengült.
Michel és munkatársai beszámoltak különböző HÍV burok-fragmensek inzerciójárói a hepatitisz B vírus felületi antigénjébe. Ezekkel a fúziós fehérjékkel immunizált nyulak neutralizációs ellenanyagokat termeltek [Michel és munkatársai, Induction of Anti-Human Immundeficiency Vírus (HÍV) Neutralizing Antibodies in Rabbits Immunized with Recombinant HIV-Hepatitis B Surface Antigén Particles, Proc. Natl.
• ·· <<
• ·«»♦·· ··« · · · · • « · * «»· ·· ···< ··♦
- 6 Acad. Sci. 85, 7957-7961 (1988)].
Hasonlóan, kutatók azt találták, hogy a hisztamin patkány hízósejtekből való felszabadulása gátolható egy humán peptid-fehérje konjugátummal történő immunizálással, mind in vitro, mind in vivő [Stanworth és munkatársai, Allergy Treatment with a Peptide Vaccine, The Láncét, 336, 12791281 (1990)]. Lásd még Stanworth és munkatársai: The Role of High and Low Affinity IgE Receptors in Cell Signalling Processes, Molec. Immunoi., 27.(12), 1291-1296 (1990).
Monoklonális ellenanyagokat is széles körben használtak már passzív immunizálás céljára és diagnosztikai célokra fertőzések vagy kóros állapotok, mint pl. tumor antigének kimutatására. Meghatározott specificitású monoklonális ellenanyag előállítása azonban munkaigényes és bizonytalan kimenetelű. Egy monoklonális ellenanyag specificitásának meghatározásához számos lépésben vakpróbákat kell végezni, átfedő peptidek egész sorozatát használva. Néha a funkcionális epitop nincs immundomináns helyzetben ahhoz, hogy az antigén e régiója ellen monoklonális ellenanyag képződjön.
Ezért szükség van vakcinákra, diagnosztikai és terápiás szerekre, amelyek a találmány szerinti antigén determinánsok és epitopok potenciális immunogenitását használják ki.
Kutatásaink során olyan kiméra fehérjéket találtunk, melyek immunogének és idegen epitop inzertet hordozó A típusú influenza vírus HA fehérjét tartalmaznak. Ezen rekombináns vagy szintetikus kiméra fehérjékkel emlősöket immunizálva peptid specifikus ellenanyagok termelődése váltható ki. Az ezen kiméra fehérjékkel kiváltott immunválasz hosszú • «· ·<
- 7 időtartamú, pl. a hat hónapot meghaladja. Ezek a kiméra fehérjék vagy az azoknak megfelelő ellenanyagok használhatók továbbá diagnosztikai eszközként és kóros állapotokban fertőzések elleni immunterápiás célra, valamint poszt-expozíciós esetekben, amilyen például a kórházakban előforduló véletlen túszúrás.
A HA kiméra fehérjéket kódoló DNS fragmensek szintén a találmány tárgyát képezik. Ezek a fragmensek alapvetően azonos nukleotid szekvenciával rendelkeznek, mint az A típusú influenza vírus HA felületi fehérjéje, amely öt immundomináns antigén helyet tartalmaz. A találmány szerint egy nukleotid szekvenciát, amely lényegében azonos az idegen epitopot kódoló szekvenciával, inzertálunk legalább egy antigén hatású egységet kódoló nukleotid szekvenciába.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan peptidek, amelyek az öt antigénhatású egységgel bíró A típusú influenza vírus HA felületi fehérjéjével azonos aminosav-szekvenciával rendelkeznek, és amelyekben az immundomináns antigénhatású régiók legalább egyikébe az idegen epitoppal lényegében azonos aminosavszekvenciát inzertáltunk.
Ezeket a fehérjéket beadhatjuk arra rászoruló emlősöknek (embernek is) különböző kórképek kezelése vagy megelőzése céljából. Ezeket a peptideket vagy a megfelelő ellenanyagokat vérminta vagy egy frakciója vizsgálatával használhatjuk továbbá annak kimutatására, hogy egy emlős (állat) ki volt-e téve különböző antigének hatásának. A találmány tárgyát képezik a fenti peptideket tartalmazó vakcinák, a fent leírt DNS szakaszokat tartalmazó expressziós vektorok, különösen a • ·
- 8 baculovírusok és a transzformált gazda-mikroorganizmusok.
A mellékelt 1. ábra az A típusú influenza vírus HA fehérjéjét mutatja.
A 2. ábra egy HÍV epitop HA génbe történő inzertálásának folyamatábráját mutatja, amelynek során a HA gén 498. bázisánál (ez a 139 aminosavnak felel meg) egy Apai hasítási helyet hozunk létre.
A találmány tehát új DNS-re és peptidekre, valamint ezek szintézisére vonatkozik, amelyek egy epitoppal inzertált HA influenza felületi fehérjék.
A. HA influenza protein
Az A influenza HA felületi fehérje egyike az A influenza két felületi fehérjéjének. A másik a neuraminidáz (NA). A HA a vírus domináló felületi glikoproteinje és az az antigén, amely ellen a neutralizáló ellenanyagok irányulnak. A HA felelős továbbá a vírus sejtfelületi receptorokhoz való kötődésért, ezért felelős a vírusfertőzés beindításáért. Az influenza A vírus nagy antigén-változatossága következtében gyakran okoz járványokat. Ezen változatossság oka az, hogy a HA fő antigénhatású egységein aminosav-cserék következnek be.
Különböző influenza törzsek különböző HA génjeit klónozták már, és a találmány szerinti megoldásban ezek mindegyike alkalmazható. Különleges figyelmet érdemel az A/WSN/33 törzs HA génje. Ez a gén 1775 nukleotid hosszúságú, és 565 aminosavat kódol [Hiti és munkatársai, Virology, 111, 113-124, (1981) ].
A nukleotid-szekvenciából kikövetkeztetett aminosav• <4 «· * » »·*»·· ··· · · · · • * · t •·· *· ··<» ··
- 9 -szekvencia analízise egy szignál peptid jelenlétére utal, amely a HA kiválasztódásának folyamata során lehasad. Az érett HA-nak két alegysége létezik, a HA1 (325 maradék) és HA2 (222 maradék), melyeket egyetlen arginin maradék köt össze, és amely az érés során lehasadva kétláncú HA-t eredményez. A C-terminális aminosav szekvencia (512-530) erősen hidrofób, és feltehetően a HA transzmembrán régióját alkotja. Hét lehetséges glikozilezési helyet tartalmaz. A HA trimer formát alkot és két elkülöníthető struktúrális régióból áll, egy a memrántól 76.10-10 m-re nyúló alfa hélixből álló csavart szálrendszerből, és egy nem párhuzamos béta-lemezekből álló globuláris régióból, amely a receptor kötő helyet és ennek a váznak a felső részén elhelyezkedő variábilis antigénhatású egységeket tartalmazza.
Az egyéb influenza vírus szubtípusokkal való összehasonlítás azt mutatja, hogy a szekvencia számos szakasza, beleértve az összes ciszteint, minden törzsben konzervatív. Ez azt sugallja, hogy a HA funkcionális aktivitásához egy alapvető felépítés szükséges. A HA2 aminosav szekvenciája konzervatívabb, mint a HAl-é, és a törzsek közötti variációk a HA1 szekvenciákon belüli változások eredménye [Hiti és munkatársai, Virology, 111,113-124 (1981); Wiley és munkatársai, Natúré, 289. 373-378 (1981)].
A HA fehérje háromdimenziós felépítését Wilson és munkatársai [Natúré, 289, 366-373 (1981)] illusztrálták (lásd az
1. ábrát). Ez öt antigénhatású egységet tartalmaz, az A, B, C, D és E egységet, amelyek körülveszik a homorú zsebet képező receptor kötőhelyet. Az A/WSN/33 influenza vírus törzs ♦ ·· « ·· «υ • · ο · ♦ ·· · · · « * · * ··· ·· ···· ···
- 10 HA-jában a megfelelő öt antigénhatású egység elhelyezkedése az alábbiak szerint azonosítható: az A egység (136-142 aminosavak) egy kitüremkedő hurok. A B egység (183-192 aminosavak) egy alfa-helixet képező külső maradékok régiója. A C egység egy domborulat -a harmadlagos struktúrában a Cys-42 és Cys-274 közötti diszulfid hídnál. A D egység egy rejtett régió, a 197-216 aminosavak között elhelyezkedő határfelületben, az E egységet az 52-74 aminosavak alkotják. Úgy tűnik, hogy az öt antigénhatású egység mindegyikében legalább egy aminosav helyettesítés szükséges ahhoz, hogy új járványos influenza törzsek keletkezzenek. Megfigyelték, hogy ezen öt antigénhatású egység ellen irányuló ellenanyagok neutralizálják a vírus fertőzőképességét. Feltételezhető, hogy'az A egység, hozzáférhetősége miatt, jó célpont nagy aktivitású neutralizáló ellenanyag számára [Wiley és munkatársai, Natúré, 289, 373-378 (1981); Wiley és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 56, 365-384 (1987)].
A találmány szerint a HA fehérjét nem-HA vagy idegen epitopok hordozásának eszközeként alkalmazzuk. A HA-ba való inzerció célszerűen ezen öt antigénhatású régió egyikébe vagy többe történik, legcélszerűbben az A régióba. Egy további előnyös inzerciós hely a 183-192 aminosavak által meghatározott régió.
B. Példák idegen epitopokra
A találmány szempontjából hasznos idegen epitopok lehetnek a szakmában járatosak számára közismert, nem HA fehérje eredetű bármely epitopok. Olyan peptid és nukleotid szekvenciák, amelyek lényegükben megfelelnek a természetben előfor«·· ♦ · · · • fr · · ··· ·* ···· ··· dúló epitopoknak, szintén alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban.
Ilyen idegen epitopok lehetnek például vírus epitopok (mint a HIV-1 epitopok, a hepatitisz B epitopok, a retrovírus epitopok és a Herpes simplex epitopok), baktérium fehérje epitopok, IgE effektor egység epitopok (amelyek az allergia eszközéül szolgálnak), az SP10 epitop (egy terhességi antigén), tumor epitopok, beleértve az emlőrák epitopjait és bármely, kórtani jelentőséggel bíró antigénhatású epitopok, valamint azok neutralizáló fehérjéi vagy azok immunogén részei.
Az immunogén rész kifejezés úgy értendő, hogy ide tartoznak egy fehérje azon részei, melyek bármely feltétel szerint immunogének, beleértve azokat is, amelyek az inzertálás előtt immunológiailag némák voltak, de a HA proteinnel való fúzió után immunogénné vagy antigénné váltak. Ilyen peptidek vagy epitopok azonosítására ismert eljárásokat ismertetnek például a következő irodalmi helyeken: Chou és munkatársai, Biochemistry, 13, 222-245 (1974); Holper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981).
A lényegében azonos kifejezés identikus nukleotidvagy aminosav-szekvenciákra, valamint olyan biológiai, genetikai vagy klinikai technikákkal módosított szekvenciákra utal, melyek lényegében azonos biológiai aktivitással rendelkeznek. Nukleotid-szekvencia esetében a biológiai aktivitás lehet pl. egy olyan epitop kódolása, amely megfelelő ellenanyag termelődését indítja meg. Egy aminosav-szekvencia esetében erre példa lehet a megfelelő ellenanyag termelődé12 sének kiváltása. Ilyen aktivitás vizsgálata a szakmában jártas szakember számára ismert módszerekkel történik, amely nem kizárólagos jelleggel, lehet immunfluoreszcencia, ELISA, Western biot, autoradiográfia és hasonlók.
1. HÍV epitopok
A HA-ba a találmány szerint inzertálható idegen epitopok egy csoportja a HIV-1 vírus epitopjai. A HÍV a szerzett immunhiány szindróma (AIDS) kórokozója. A HIV-1 genom három vírus struktúrfehérjét kódol három régióban, a gag régióban, a pol régióban és az env, azaz a vírus-burok régiójában. A gag régió vírus magfehérjéket állít elő.
A fő magfehérjék eredetileg mint a p55 prekurzor fehérje szintetizálódnak. A p55-öt ezután a pol régió által kódolt vírus proteáz pl7, p24, pl5 (p9 és p6) peptidekké alakítja. A gag prekurzornak a vírusrészecskék összeállításában tulajdonítanak fontos szerepet a plazmamembránban. [Gheysen és munkatársai, Cell, 59, 103-112 (1989)]. Mint a legtöbb retrovírus gag protein a p55 (átalakítás után pl7), az N-terminális végén mirisztilcsoportot tartalmaz.
A p24 a HÍV belső magjában található. Úgy tűnik, hogy a pl7 a lipidmembrán belső oldalán helyezkedik el, a pl5 pedig erősen bázikus jellege miatt valószínűleg a HÍV genommal kapcsolódik. A p24 egyike az AIDS betegekben legelőször kimutatható HÍV proteineknek, és a p24, valamint a pl7 ellenes ellenanyagok minden AIDS betegnél jelen vannak. Elfogadott, hogy a magfehérjék, mint pl. a gag, sejt-közvetítette immunitást váltanak ki.
A HIV-1 pol régiója reverz transzkriptáz, proteáz és endonukleáz fehérjéket kódol.
Az env régió a gpl60 burok fehérjét írja át, amely aztán gpl20-ra és gp41-re hasad. A fő burokfehérje, a gpl20, a virion külső felszínén tüskéket képezve helyezkedik el, a gp41 transzmembrán protein pedig egy membrán horgony szekvenciát tartalmaz, amely a gpl20 számára kötőhelyként szolgál a HIV-1 felszínén. A gpl20 tartalmazza a T-sejt receptor (CD4) kötőhelyet, valamint a neutralizáló ellenanyagok által felismert fontosabb egységeket.
A rekombináns gpl20 vagy gpl60 alacsony titerű neutralizáló ellenanyagok termelését váltják ki ismételt injektálásuk után. A HÍV legfontosabb neutralizáló determinánsa a gpl20 V3 hurok hipervariábilis régióján található (303-338 aminosavak). Az ezen peptid által kiváltott ellenanyagok a vírus variánsokra jellemzőek [Javaherian és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6768-6772 (1989)].
Ugyanazon fertőzött személyből antigénszerkezetileg eltérő HIV-ek sorát izolálták. Nukleotid szekvencia vizsgálatok szintén azt mutatták, hogy a HIV-1 izolátumok között számottevő variációk léteznek. Úgy tűnik, hogy ezek a variációk a gpl20-ban koncentrálódnak, és lehetővé teszik az immunvédő mechanizmusok megkerülését. A gpl20 várható antigén hatású epitopjainak többsége az erősen variábilis szekvencia régiókban található, amelyek erősen konzervatív régiókban vannak elszórva [Modrow és munkatársai, J. Virology, 61, 570-578 (1987)]. A gag és pol szekvenciáknak nincsenek erősen variábilis régiói.
Számos megközelítés szerint próbáltak AIDS ellen vakci nát készíteni, pl. inaktivált vírus, élő rekombináns vírus, vírus alegység fehérjék stb. alkalmazásával. Ezek kevés sikerrel jártak, részben az egyes HÍV izolátumok közötti genetikai variációk miatt. Valójában úgy tűnik, hogy a burok fehérjében az aminosavak mintegy 25 %-a mutálhat. A HÍV konzervatív régiói bizonyítottan immun-némák az immunrendszer számára a gpl20 összefüggésében, szemben azok immunogenitásával szintetikus peptidként alkalmazva a fent leírtak szerint. A HÍV konzervatív régióit tartalmazó epitopok, amelyek rendszerint immunológiai értelemben némák, immunogénekké válhatnak, ha a találmány értelmében a HA antigénhatású egy vagy több antigén helyébe inzertáljuk.
Az 1. táblázatban felsorolunk néhány a találmány szerinti eljárásban alkalmazható HÍV epitopot.
1. táblázat
HÍV EPITOPOK
| PEPTIDa | ELHELYEZKEDÉS | MEGJEGYZÉS |
| 1. T 20 E | env255-274 | Az env második konzer- |
| 2. T 16 G | env255-270 | vatív régiója; neutralizáló ellenanyagokat vált ki. |
| 3. D 18 S | env gp41 735-752 | Nagyon hidrofil; számos HÍV törzset neutralizál; gátolja a szincíciumok kialakulását. |
| 4. G 20 E | proteáz aktív hely | Erősen konzervatív minden HÍV törzsben. |
| 5. K 27 R | env403-429 | CD4 kötő dómén; immun- |
| 6. E 14 Q | env414-427 | néma; konzervatív; a peptid ellen termelt ellenanyag neutralizál. |
| 7. N 22 G | env 307-330 | Fő immun-domináns epitop, de erősen variábilis; a ..HIGRGRAFY szekvencia neutralizáló ellenanyagot vált ki. |
| 8. pl7 | gag86-115 | Konzervatív; T-sejt |
| 9. p24 | gag281-305 | választ vált ki |
aA peptidek jelölése azok méretét mutatja, valamint az első és utolsó aminosavat. Egy epitop kivétével valamennyi a vírus fehérjék konzervatív régiójából származik. Az N22G epitop a gpl20 hipervariábilis régiójának felel meg, amelyet V3 huroknak neveznek.
2. IgE Epitopok
A találmány szerint célszerűen alkalmazható másik epitop az IgE immunglobulin egy része, amely alacsony konncentráció bán fordul elő a vérben. Az IgE két láncból, könnyű- és nehézláncból áll. Az IgE a szérum immunglobulinok csekély hányadát alkotja és azonnali típusú túlérzékenységet közvetít, amely allergiás reakciókért felelős, így többek között, de nem kizárólag a széna nátháért, asztmáért, élelmiszer- és gyógyszerérzékenységekért és hasonlókért. Az IgE allergiás választ beindító szerepét szintetikus patkány epszilon, azaz nehézlánc peptidek és azok elleni ellenanyagok segítségével tanulmányozták [Stanworth, Molecular Immunology, 2.1, 11831190, (1984) ; Stanworth és munkatársai, Molecular Immunology, 27, 1291-1296 (1990)]. A keringő IgE nagy affinitású IgE Fc receptorokhoz (Fc-epszilon-RI) kötődik, amelyek hízósejtek és bazofil sejtek felszínén expresszálódnak. Egy IgE közvetítette válasz során a receptorhoz kötött IgE keresztkötéseket képez a multivalens allergénnel, ez az alattuk levő Fc-epszilon-RI recptorok aggregálódásához vezet, amely viszont elindítja az allergiás válaszra jellemző hisztamin és egyéb kémiai modulátorok felszabadulását. Az allergénnel való ismételt találkozás növekvő mennyiségű specifikus IgE termelését és súlyosabb, esetenként végzetes allergiás választ eredményez. Monoklonális és poliklonális ellenanyagok erős allergének azon tulajdonságuk révén, hogy képesek keresztkötéseket képezni az IgE-t kötött receptorokkal.
Az IgE kötődik egy alacsony affinitású IgE Fc receptorhoz (Fc-epszilon-RII) is, amely a B és T sejtek felszínén található. Ez a receptor, más néven CD23, feltehetőleg fontos szerepet játszik az IgE B sejtekben történő szintézisében.
Megállapították, hogy a receptorhoz kötődésért, valamint az effektor funkcióért felelős helyek az IgE molekula különböző részein találhatók. Míg a kötőhely az IgE-nek mind a CH3, mind a CH4 doménjeiben helyezkedik el, addig az effektor vagy trigger egység a CH4 doménben van. A trigger egység peptidjét egy N-terminális kationos fej jellemzi, amelyet a hidrofil farokrésztől három aminosav választ el. A kutatások azt mutatták, hogy ez a peptid közvetíti a hízósejtekben az immunológiai indító jelet mint választ az allergén kihívásra [Stanworth és munkatársai, Láncét, 336, 1279-1281 (1990)]. E peptid aminosavszekvenciája Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe és megfelel a humán IgE nehézlánc 497-506. aminosavainak. Ez a következő két komplementer oligonukleotidból szintetizálható:
| K | T | K | G | S | G | F | F | V | F | ||
| 5' | AAA | ACC | AAG | GGA | TCA | GGA | TTC | TTT | GTA | TTC | GGG |
| CCGG | TTT | TGG | TTC | CCT | AGT | CCT | AAG | AAA | CAT | AAG | CC |
StyI Apai
Ez az epitop megtalálható a HSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEV aminosav-szekvenciájú H22V-t kódoló nukleotid szekvenciában. Ez a peptid az alábbi nukleotid szekvencia alapján szintetizál ható:
| Apai | H | S | T | T | Q | P | R | K | T | K |
| CAC | AGT | ACT | ACA | CAG | CCC | CGC | AAA | ACC | AAG | |
| CCGG | GTG | TCA | TGA | TGT | GTC | GGG | GCG | TTT | TGG | TTC |
| G | S | G | F | F | V | F | S | R | L | E | V |
| GGA | TCA | GGA | TTC | TTT | GTA | TTC | TCA | CGC | CTA | GAG | GTG GCC |
| CCT | AGT | CCT | AAG | AAA | CAT | AAG | AGT | GCG | GAT | CTC | CA |
C. HA-kiméra peptid
A találmány szerinti HA-kiméra peptidek vakcinákként alkalmazhatók peptid-specifikus ellenanyagok termelése céljából, melyek a peptiden belüli különböző szekvenciák elleni specifitások keverékét képviselik. Ezek az ellenanyagok nagy affinitást mutatnak és alkalmasak mind diagnosztikai, mind immunterápiás célokra. A találmány szerinti peptidek kórmegelőző célból is beadhatók fertőzés megakadályozására. Vakcinaként vagy immunterápia céljára az adagolás történhet bármely, a szakmában jártas személy által ismert módon, például orálisan, rektálisan, bukkálisan vagy parenterálisan. A vakcinák vagy az immunterápiás célú gyógyászati készítmények tartalmazhatnak bármely, a szakmában általánosan elterjedt, gyógyászatilag elfogadott hordozót vagy adjuvánst.
Bármely HA kimérába egy vagy több epitop inzertálható, hogy mono-, di-, tri-, tetra- vagy pentavalens kiméra HA-t nyerjünk. Az egyes inzerciós helyekre bevitt epitop lehet ugyanaz vagy különböző. Ha az epitop ugyanaz, jelentősen fokozott ellenanyagválaszt kapunk a monovalens HA kiméra ellen. Ha az epitop különbözik, az multivalens ellenanyag választ eredményez. Egyetlen epitop több kópiája és egy vagy több másik epitop is inzertálható, hogy emelt ellenanyagválaszt és multivalens ellenanyagválaszt kapjunk. E megközelítés egyik felhasználási módja olyan kombinált vakcinák tervezése, amelyek számos betegség vagy betegségcsoport elleni egyidejű vakcinázásra alkalmasak.
Az egyes alkalmazási módok esetén a peptid hatásos menynyisége a szakmában jártas személy által ismert módszerekkel határozható meg. Az optimális dózis megállapítható pl. a találmány szerinti aktív anyag sorozathígításával, egy arra alkalmas vizsgáló módszerrel. Eljárhatunk úgy is, hogy a dózisok és az adagolás gyakorisága szerinti mátrixot képezünk, és a kísérleti alanyok csoportjait hozzárendelve a mátrix egyes részeihez, meghatározzuk az optimális feltételeket.
Vakcinát rendszerint úgy készítünk, hogy a HA-epitoppal rendelkező kiméra antigéneket egy adjuvánssal, azaz Syntex adjuvánssal vagy alummal alposan elkeverjük, és kb. 1-100 Mg-ot adagolunk a kezelendő egyednek. Ezután rendszeres emlékeztető oltásokat adhatunk, pl. 4 hetenként, amíg a peptid ellen magas titerű ellenanyagot nem kapunk. Egyetlen vakcinában egynél több hasonló vagy eltérő HA-epitop fehérje kombinálható. A vakcina készítése tipikusan magába foglalja idegen epitopok - mint amilyen pl. egy HIV-epitop szekvenciát hordozó HA génje - alkalmas vektorba történő inzertálását. Az új fehérjét szövettenyészetben expresszáljuk, és a kiméra fehérjét izoláljuk. Ezután megfelelő állatokat vakcinázunk.
A találmány szerinti HA-epitop antigének alkalmazhatók továbbá antigénhatásnak kitett állapot vagy vírusfertőzés diagnosztizálásához. Fertőző vírus antigének jelenlétének vérmintákból történő kimutatásának legáltalánosabb eljárása az ELISA, amint azt a Current Protocol in Molecular Biology [John Wiley és Fia, (1989)] című kiadvány leírja. A módszert tipikusan úgy hajtjuk végre, hogy mikrotitráló lemezek rekeszeibe a peptidre fajlagos (befogó) ellenanyagokat rögzítünk, ezt követően a vírus-antigént tartalmazó szérummal inkubáljuk. A szabad antigént kimossuk és egy másik, jelt adó hordozóval, mint pl. a torma peroxidáz enzimmel konjugált ellenanyagot adunk hozzá. Az enzim azután kimutatható a szubsztrát színreakciója alapján.
A találmány szerinti HA-epitopot tartalmazó kiméra fehérjék ellen készült ellenanyagok használhatók ezekben a diagnosztikai eljárásokban és diagnosztikai készletekben. Különösen a fent leírt HA-HIV és HA-hepatitis B vagy C epitopok ellen képződött ellenanyagok alkalmazásával végzett átvizsgálás lenne hatékony.
Hasonló módon vizsgálhatjuk ellenanyagok jelenlétét oly módon, hogy az ismeretlen mintát, pl. vért vagy annak egy frakcióját érintkezésbe hozzuk a találmány szerinti kiméra antigénnel.
A találmány szerinti HA-epitopot tartalmazó kiméra fehérjék alkalmazhatók immunterápia céljára is. Például patogénre fajlagos vagy neutralizáló ellenanyagokat termelünk a találmány szerinti, HA-epitopot tartalmazó fehérjék ellen, hogy azokkal a fertőzést és a betegséget feltartóztassuk olyan esetekben, amelyekben az alany már ki volt téve fertőzésnek. Ez passzív immunizálást jelentene, mivel a fertőző ágens elleni neutralizáló ellenanyagokat tartalmazó immunglobulinok alkalmazhatók a fertőzés megfékezésére vagy kézben tartására. Passzív immunizálás például az állatok és emberek veszettség elleni immunizálása, a Gram-negatív baktériumok által okozott szeptikus sokk szindróma kezelése monoklonális ellenanyagokkal és a HÍV elleni immunizálás.
A találmány szerinti kiméra proteineket kódoló genomok expressziós vektor rendszerekbe ültethetők. Alkalmas expressziós vektorok lehetnek a BPV (bovine papilloma vírus) alapú expressziós vektor, dihidrofolát-reduktáz (dhfr)-eredetű vektor, adenovírus vektor vagy a himlő vírus vektor. Külön említést érdemel a baculovírus expressziós rendszer, mint az Autographa californica nuclear polyhedrosis vírussal (AcMnPV) fertőzött rovarsejtek, mint pl. a Spodoptera frugiperda (Sf9) sejtjei.
A fertőzés folyamán a baculovírus nagy mennyiségű polihedrin proteint termel, amely elősegíti a vírus tartalmú zárványok képződését. A polihedrin gént nem találták létfontosságúnak a fertőzés vagy a vírus szaporodása szempontjából. Ennek a génnek a deléciója zárványt nem képző vírust eredményez. A rekombináns baculovírust a transzfer vektor és a vad típusú DNS homológ rekombinációja útján állítjuk elő. A transzfer vektor (pl. pVL941) a polihedron promotert (lásd
3. példa) hordozó vírus DNS szakaszt tartalmazza. Az expresszálandó gént a promoter szekvenciát követő pozícióba inzertáljuk.
Az expressziós vektorba inzertált gént élő vírus vakcinaként adagolhatjuk, pl. adenovírus vagy himlő vírus vakci naként. Nagy mennyiségben is expresszálható alkalmas gazdaszervezetbe, mint pl. E. coliba transzformálva és azután tisztítva.
Valamennyi nukleotid szekvencia, a peptidek és az azokat tartalmazó készítmények rekombináns technikával vagy szintetikusan előállíthatok.
A találmány szerinti megoldás megvalósítási lehetőségeit az alábbi példákkal szemléltetjük. A nukleotid- és aminosav-szekvenciák számozása Hiti és munkatársai [Virology, 111. 113-124 (1981)] szerint történt. A HA gén az A/WSN/33 humán influenza vírus törzsből származik. Az enzimreakciókra vonatkozó rutin rekombináns DNS technikák, plazmid DNS-ek előállítása, célzott mutagenezis, bakteriális és emlős sejt transzformációk stb. a szállító cég utasításai vagy Sambrook és munkatársai [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] leírása szerint történt. Az arányokat és százalékos értékeket tömeg szerint adjuk meg, kivéve ahol azt külön jelezzük.
Az 1-7. példák a HA antigén A egységén elhelyezkedő inzerciós hely létrehozását illusztrálják, ahova idegen epitopokat inzertáltunk kiméra fehérjék nyerése céljából. A
8. példa azt illusztrálja, hogy hasonló stratégiával lehetséges a HA más ismert antigénhatású egységében is inzerciós helyeket létrehozni. Az idegen epitopok aztán az újonnan létrehozott (inzerciós) helyek bármelyikébe inzertálhatók. A
8. példa különösen egy BglII egyedi restrikciós hely létrehozását illusztrálja a HA 184/185 aminosav pozíciójában, amely a B antigénhatású egység rész része. A 9. példa több23 szőrös HA inzerciós helyek alkalmazását mutatja be.
1. példa
HA expressziós vektor létrehozása
A példa ismertetésénél utalunk a 2. ábrára. A HA gén teljes kódoló szekvenciáját hordozó pHAX plazmidot (amelyet a szakirodalom pSV-HA plazmidként is említ [Hartman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 233-237 (1982)]) BamHI-gyel emésztettük az 1,75 kb fragmens izolálása céljából. Ezt a HA-t kódoló DNS szakaszt a pTZ19R (Pharmacia, Inc.) BamHI hasítási helyébe inzertáltuk, így kaptuk a ptZ19HA rekombináns kiónt.
A ptZ19HA felhasználásával a HA szekvenciát pozitív szálként tartalmazó egyszálú DNS-t izoláltunk [Baldari és munkatársai, Gene, 35, 27-32 (1985)]. Ezt a DNS-t használtuk oligonukleotid-közvetítette irányított mutagenezis kivitelezésére az alábbi oligonukleotid felhasználásával: 51-TCT GTA AAA ACT GCT TTT TCG GGC CCT ATG GGA GCA TGA TAC3' (972). Ez az oligonukleotid megfelel a HA gén 480-518 bázispárjának, amely az Apai hasítási helyet (GGGCCC) középre inzertálva tartalmazza. Az ezzel az oligonukleotiddal végzett mutagenezist és az E. coli JM109 transzformálását ismert módon végeztük [Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 15-51. o. (1989)]. Egy klón, a ptZHA139-15 esetében azt találtuk, hogy az újonnan létrehozott Apai hasítási helyen a Gly-139-et Ala-Arg helyettesíti, míg a szekvencia többi része változatlan maradt. Ezt a • « • ·
- 24 régiót a DNS szekvenálásával igazoltuk.
2. példa
Protein epitopok inzertálása
Ismét a 2. ábrára utalunk. Különböző peptideket kódoló komplementer oligomereket szintetizáltunk a foszfotriészter eljárással [Crea és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 70, 5765 (1978)]. A komplementer oligomereket ekvimoláris koncentrációban összekevertük, hogy Apai hasítási helyekkel végződő duplaszálú oligomereket kapjunk. A ligálás előtt az oligomereket az 5’-végükön ATP és DNS-kináz felhasználásával foszforileztük, a gyártó utasításai szerint (Pharmacia, Inc.). Körülbelül 10 ptZHA139-15 plazmidot
Apai restrikciós enzimmel emésztettünk, és bakteriális alkalikus foszfátázzál defoszforileztük [Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1989)]. Körülbelül 100 ng Apai-gyei emésztett plazmidot és az oligonukleotidok 1-1 Mg-ját ligáltuk, és azokkal E. coli sejteket transzformáltunk. A baktériumtelepeket radioaktívan jelölt oligomerek felhasználásával, in situ hibridizációs módszerrel vizsgáltuk. Az inzerteket tartalmazó, feltételezett rekombináns kiónokat ezután szekvenáltuk, hogy az inzertek helyes orientációját és a helyes leolvasó keretet meghatározzuk. Az 1. táblázatban és a 2. ábrán szereplő mind a kilenc HÍV epitopot használtuk.
• 9
3. példa
Rekombináns baculovírusok létrehozása
Standard rekombináns DNS technikákkal [Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)] BamHI szekvenciákkal határolt 1,75 kb HA vagy HA/HIV epitop kiméra géneket inzertáltunk egyenként az AcMNPV eredetű, Dr. Max D. Summers-től kapott pVL941 transzfer vektorba [A Manual of Methods fór Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A&M University, College Station, TX, (1988)]. A heterológ protein gén expressziója a polihedron promoter transzkripciós kontrollja alatt áll. A kívánt gént tartalmazó rekombináns baculovírust Sf9 sejteknek a vad típusú AcMNPV vírus DNS (1 yg) és a rekombináns transzfer plazmid DNS (2 jug) kotranszfekciójával állítottuk elő kalcium-foszfát precipitációs módszerrel [Smith G.E. és munkatársai, Molec. Cell Bioi., 3, 2156-2165 (1983)]. Hat nap múlva a vad típusú és a rekombináns baculovírust tartalmazó tápfolyadékot összegyűjtöttük, és a rekombináns vírusokat határhígításos módszerrel azonosítottuk oly módon, hogy 96 rekeszű lemezen a vírus sorozathígításaival fertőzött Sf9 sejtek génjeit 32P-vel jelölt HA génnel hibridizáltuk [Germann és munkatársai, J. Bioi. Chem., 264. 7814-7824 (1989)]. Három-öt hibridizációs ciklust végeztünk, hogy tiszta, zárvány-negatív (polihedron negatív) vírust kapjunk, amilyen a HA-N22G proteint kódoló AcHA-N22G. Ezt a vírust Sf9 sejtekben tartottuk fenn.
Az Sf9 sejtek 7 x 107 mennyiségét oltottuk be T-150 * · ·« «
- 26 (150 cm2) szövettenyésztő edényekbe. Más eljárás szerint az Sf9 sejteket szuszpenziós tenyészetben növesztettük görgő palackokban, 2-3X106 sejt/ml sűrűség eléréséig. A sejteket ezután 5-10 multiplicitási hányados (MOI) értéknek megfelelő számú rekombináns vírussal fertőztük. 3-4 nap múlva, amikor a HA kimérák expressziója maximumot ért el, a sejteket összegyűjtöttük. PBS-sel való mosás után a membránhoz kötött HA vagy HA-kimérák izolálása céljából a sejteket 1 % detergens keverékkel extraháltuk, amely egyenlő mennyiségű triton X 100-at és dezoxikolátot tartalmazott. Mivel a HA egy glikoprotein, az extraktumot lektin Sepharose 4B affinitás oszlopon (étkezési lencse-lektin, Sigma Chem. Co., St. Louis.
MO.) átengedve részlegesen tisztítottuk. A részlegesen tisztított HA-t vagy a kimérákat immunogén hatásosságuk megállapítása céljából állatok (tengerimalacok) immunizálására használtuk.
4. példa
A HA és HA/HIV kiméra proteinek biológiai sajátságai
Frissen oltott Sf9 sejteket magas titerű (109 pfu/ml) rekombináns vírusokkal fertőztünk, melyeket három nappal később összegyűjtöttünk, és belőlük a 3. példában leírt módszer szerint rekombináns fehérjét izoláltunk. A rekombináns proteinek az össz-sejtfehérje 10-20 %-át tették ki a gél coomassie kék festése alapján becsülve. A rekombináns fehérje 2-10 %-a volt detergenssel extrahálható, és valószínűleg a természetes formát képviselte. A maradék oldhatatlan, a • ·9 ·«· • * * « 4· · ♦·· · · «a « · · · ··« 4« ·««··*
- 27 sejtben tárolt protein volt. A HA és a HA/HIV kiméra fehérjék hármas sávként szintetizálódtak. Az alsó sáv (körülbelül 55 kD) nem glikozilezett formát képviselt, mivel a fertőzött sejtek tunikamicinnal, egy glikozilezést gátló szerrel való kezelése csak ennek a fehérjesávnak a megjelenését eredményezte. A felső két sáv (68 kD és 66 kD) valószínűleg a glikozilezési folyamat különböző fokait képviselte. A rekombináns HA baculovírussal fertőzött sejtek detergenssel való extrahálásakor csak a 66 kD nagyságú fehérjecsík volt extrahálható, ami arra utal, hogy ez a protein fajta membránhoz kötött, és valószínűleg a HA természetes formája.
Immunfluoreszcenciás vizsgálatot végeztünk nyúlban termelt anti-influenza (A/WSN/33) szérummal és fluoreszceinnel konjugált, kecskében termelt anti-nyúl IgG-vel mint második ellenanyaggal [Posse, Virus Rés., 5, 43-59 (1986)]. A rekombináns vírusokkal fertőzött sejtek erős membrán fluoreszcenciát mutattak. Álfertőzött és a vad típussal fertőzött sejtek nem mutattak fluoreszcenciát.
A rekombináns baculovírusokkal fertőzött Sf9 sejtek biológiai aktivitását 1 % csirke vörösvérsejt felhasználásával, hemadszorbcióval és hemagglutinációval vizsgáltuk [Posse, Virus Rés., 5, 43-59 (1986)]. Míg a rekombináns HA baculovírussal fertőzött sejtek jelentős hemadszorbciót mutattak, más, a vad típusú vagy HA-HIV kimérákat (N22G, D18S és T16G) kódoló rekombináns baculovírussal fertőzött sejtek nem mutattak aktivitást ebben a vizsgálatban. Hasonló eredményeket kaptunk, amikor hemagglutinációt végeztünk a sejtek detergens kivonataival. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a
Hív epitop inzerciója a HA-ba érintette a HA biológiai aktivitását közvetítő receptor-kötőhelyet. A HA receptor-kötőhelye közel esik az A antigén hatású egységhez, ahová az epitopokat célzottan inzertáltuk (1. ábra).
5. példa
HA-HIV kiméra proteinekkel beoltott tenqerimalacok immunválasza
Sf9 sejteket 20-30 db T150 palackban a 3. példa szerint előállított HA-N22G-t és HA-D18S-t kódoló rekombináns baculovírusokkal fertőztünk M01=10 mennyiségben. A sejteket a fertőzés után 72 órával összegyűjtöttük, háromszor mostuk PBS-sel, és tisztítási folyamatnak vetettük alá. Részlegesen tisztított HA vagy HA kiméra fehérjéket használtunk tengerimalacok immunizálására. Négy hetes időközökben emlékeztető oltásokat adtunk. Minden injekció után két héttel szérummintát vettünk. A szérum hatásosságát hemagglutináció gátlási (Hl) vizsgálattal állapítottuk meg, amely az antiszérumnak 4 egység rekombináns HA és 1 % csirke vörösvérsejt által adott hemagglutinációs reakciót gátló képességét határozta meg. Minden szérumot először 1:10 arányban hígítottunk és Kaolinnal (100 mg/ml) kezeltünk a természetes gátló anyagok eltávolítása céljából. A Kaolinos kezelés nem volt hatással az ellenanyag titerre.
Eredményeinket a 2. táblázat mutatja.
A második injekció után a rekombináns HA, vagy HA-HIV kiméra proteinek ellen termelt szérumok Hl titere 160 (az *·* · · ♦ • · 9 « • » * »· · <· *
- 29 N22G esetén) és 5120 (a D18S estén) között alakult. Az antigén nélküli kontroll szérum titere 20 volt.
A harmadik injekció után a Hl titer tovább emelkedett minden állatban. Az AcHA-N22G rekombináns baculovírussal fertőzött sejtekből előállított nyers plazmamembránnal fertőzött állatok is 60-80 Hl titert értek el. 40-es vagy magasabb Hl titer tekinthető védő hatásúnak emberek influenza fertőzés elleni vakcinázása esetén.
A fenti kísérletet heterológ influenza vírus törzzsel megismételve nem tapasztaltunk neutralizációt. Ez azt mutatja, hogy a baculovírus vagy az expresszált HA antigének törzsre jellemző neutralizáló ellenanyagokat váltottak ki. A HA-D18S és HA-N22G elleni antiszérumok a HÍV gpl60-nal reagáló ellenanyagokat is tartalmaztak, amint azt a Western biot próba kimutatta. A HA-N22G-vel történt immunizálások eredményeit a 3. táblázatban foglaltuk össze.
Az N22G a HÍV gpl60 legfontosabb neutralizációs doménjének felel meg, és így vakcina kifejlesztésének fő célpontja [Javaherian és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6762-6772 (1989)]. Az állatkísérleteket rekombináns HA vagy HA-N22G felhasználásával megismételtük. Az állatokat először 1-2 pg HA-t vagy kiméra fehérjét tartalmazó részlegesen tisztított készítménnyel immunizáltuk, majd háromszor újraoltottuk. Az inzertált N22G peptid ellenes ellenanyagok termelődését (I) anti-peptid (N22G) ELISA-val, (II) a gpl60 burok fehérjével készült Western blot-tal és (III) in vitro neutralizációs próbával határoztuk meg (lásd a 3. táblázatot) . A második és a harmadik újraoltás után az állatok
mindhárom próba szerint magas titerű specifikus ellenanyagok termelését mutatták. Amint az várható volt, a HA-val immunizált állatok nem mutattak aktivitást ezekben a vizsgálatokban. Külön figyelmet érdemel a HA-N22G-vel immunizált állatok HÍV fertőzés ellenes neutralizáló ellenanyag termelése.
2. táblázat
Tengerimalac szérum második és a harmadik oltása utáni hemaqqlutináció gátlási (Hl) titere
| Antigén | Tengerimalac | Kaolin | HAI titer 2. oltás 3. oltás | |
| HA | A | + | 1280 | 10240 |
| B | + | 1280 | 2560 | |
| N22G | C | + | 160 | _a |
| D | + | 160 | — | |
| D18S | E | + | 5120 | 10240 |
| F | + | 640 | 3790 | |
| kontroll13 | 9 | + | 20 | 40 |
| 10 | + | 20 | 60 | |
| N22GG nyers | ||||
| membrán | 11 | + | 80 | N.V.* |
| nyers | ||||
| üledék | 12 | + | 60 | N.V. |
| Flu WSN | 313-as nyúl | + | 5120 | |
| — | 5120 |
aMindkét állat elpusztult véreztetés közben.
^A kaolin kezelés nélküli kontroll szérum titere 320.
CN.V.= nem vizsgáltuk.
3. táblázat
HA-val és HA-N22G-vel immunizált tengerimalacok szerolóqiai vizsgálata (a 307-330 HIVMN V3 hurok aminosavak) (Csoportonként két állatot használtunk)
| Próba | HA | HA-N22G | ||||
| 1. | 2. | 3. | 1. | 2. | 3 . | |
| HA neutralizációs | 1280 | 2560 | 2560 | 160 | 640 | 2560 |
| titer (Hl) | 1280 | 2560 | 5120 | 160 | 1280 | 1280 |
| HA ELISA titer | 10* 6 | 3X105 | 3X105 | 3X10 | 5 3X105 | 3X105 |
| 106 | 3xl05 | lxlO6 | 3x10 | 5 lxlO5 | lxlO4 | |
| Anti (N22G) | - | — | — | 300 | 30000 | 30000 |
| peptid ELISA | - | - | — | 300 | 10000 | 10000 |
| anti-burok (biot) | — | — | — | N.V. | 20000 | >20000 |
| - | - | - | N.V. | >1000 | 20000 |
| Neutralizációs | ||||||
| ellenanyag | - | - | - | <10 | 40 | >840 |
| titer (NIH-ben | - | - | - | <10 | 20 | 475 |
meghatározva) = Negatív
N.V. = Nem vizsgáltuk
6. példa
HA-IqE (HA-K10F) epitop előállítása
A rekombináns HA gének klónozását a pBLl [Vialard és munkatársai, J. Virology, 69, 37-50 (1990)] baculovírus transzfer vektorba a végeken található restrikciós hasítási helyek módosításával könnyítettük meg. Körülbelül 2 pg ptZHA-139-15 plazmidot emésztettünk BamHI-val, hogy 1,75 kb nagyságú DNS szakaszokat kapjunk. Ezt a DNS szakaszt DNS po32 limeráz Klenow fragmenssel és dezoxinukleotid-trifoszfátokkal (dNTP) való feltöltés után HindlII-mal hasított és feltöltött pGEM—9zf(—) plazmidba (Promega Biotec-Madison, WI) inzertáltuk, így kaptuk a pHA.Nhel plazmidot. Ebből a plazmádból a HA vagy kínéra HA géneket Spel és Xbal emésztés után 1,75 kb DNS szakaszok formájában hasítottunk ki.
Körülbelül 1 M9 pHA.Nhel plazmidot emésztettünk Apaigyei, majd bakteriális alkalikus foszfátázzál defoszforileztük. A K10F peptidet kódoló, két komplementer oligonukleotidot szintetizáltunk.
KTKGSGFFVF
5· AAA ACC AAG GGA TCA GGA TTC TTT GTA TTC GGG GCC 3 '
CCGG TTT TGG TTC CCT AGT CCT AAG AAA CAT AAG AAG CC
StyI Apai
A két oligomert ekvimoláris arányban összekevertük és T4 polinukleotid kináz, valamint ATP felhasználásával foszforileztük. Körülbelül 0,1 Mg defoszforilezett vektort és 1 M9 kettősláncú oligomert ligáltunk, és azokkal E. coli MM294 sejteket transzformáltunk.
Tizenkét kiónból mini DNS preparátumot készítettünk, majd azokat Styl-gyel emésztettük, és inzertált oligomerek jelenlétére vizsgáltuk. Egy kiónban, a pHA.Nhe-hlgE-11-ben az inzertált nukleotid szekvenciát a helyes kódoló sorrendben találtuk. Nukleotid szekvenálással igazoltuk a helyes szekvenciát a kívánt helyen. Ennek a plazmádnak körülbelül 10 Mg-ját együtt emésztettük Spel-gyel és Xbal-gyel, hogy
1,8 kb nagyságú DNS szakaszt izoláljunk.
Körülbelül 10 gg pBlueBac (pBLl, Invitrogen Corp., San Diego, CA) baculovírus transzfer vektort Nhel-gyel emésztettünk, majd BAP-pal defoszforileztünk. Körülbelül ekvimoláris mennyiségű Nhel-gyel hasított vektort és az 1,8 kb DNS-t ligáltuk, és a ligációs elegyet E. coli MM294 sejtek transzfor málására használtuk. Tizenkét kiónt választottunk ki plazmid minipreparátum készítésére. Egy kiónt, a pBL-HA-K10F-5-2 plazmidot, mint a HA.K10F gént helyes orientációban hordozót azonosítottunk.
Hogy rekombináns baculovírust nyerjünk, az AcMNPV vad típusú vírus körülbelül 1 gg-nyi DNS mennyiségét és a pBLHA-K10F-5-2 rekombináns transzfer vektor 2 /ig-ját használtuk Sf9 rovarsejtek transzfektálására kalcium-foszfát precipitációs módszerrel [Summers és munkatársai, A Manual of Methods fór Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A&M University, College Station, TX, (1988)]. A rekombináns baculovírust a transzfer vektor és a vad típusú vírus DNS-e közötti homológ rekombinációjával nyertük. Transzfekció után hat nappal a vad típusú és a rekombináns vírusok elegyét tartalmazó tápfolyadékot összegyűjtöttük. A tápfolyadék sorozathígítását (10-3 - 10-6) frissen leoltott Sf9 sejtek fertőzésére használtuk 100 mm átmérőjű Petri-csészékben, amelyekre X-Gal béta-galaktozidáz szubsztrát tartalmú agarózt rétegeztünk. A kék plakkokként megjelenő rekombináns vírusokat több ciklus plakk tisztítással tovább tisztítottuk [Vialard és munkatársai, J. Virology, 69, 37-50 (1990)]. Ezt a rekombináns baculovírust AcHA.KlOF-nek neveztük. A
HAK10F kiméra fehérje expresszióját a fertőzött Sf9 sejtek fehérjéinek Western biot próbájával igazoltuk, a peptid ellen termelt nyúl-ellenanyagok segítségével. Nagy mennyiségű termelés érdekében végzett tenyésztés és tisztítás után a kimérát vakcinaként használtuk.
7. példa
HA-IqE (HA-H22V) epitop előállítása
A H22V peptidet kódoló nukleinsav szekvenciát HA génbe inzertáltuk, majd baculovírus expressziós rendszerben fejeztük ki a 6. példában ismertetett eljárás szerint. Két komplementer oligonukleotidot szintetizáltunk:
| Apai | H | S | T | T | Q | P | R | K | T | K |
| CAC | AGT | ACT | ACA | CAG | CCC | CGC | AAA | ACC | AAG | |
| CCGG | GTG | TCA | TGA | TGT | GTC | GGG | GCG | TTT | TGG | TTC |
| G | S | G | F | F | V | F | S | R | L | E | V |
| GGA | TCA | GGA | TTC | TTT | GTA | TTC | TCA | CGC | CTA | GAG | GTG GCC |
| CCT | AGT | CCT | AAG | AAA | CAT | AAG | AGT | GCG | GAT | CTC | CA |
A kétszálú oligomert a pHA.Nhel Apai hasítási helyébe inzertáltuk, így kaptuk a rekombináns pHA-Nhe-H22V plazmidot. A fenti plazmidból nyert 1,8 kb Spel/Xpal DNS szakaszt a pBLl Nhel hasítási helyébe inzertálva kaptuk a pBL-HA-H22V-l rekombináns transzfer plazmidot. Ennek a plazmidnak és az AcMNPV DNS-nek a homológ rekombinációjával az ACHA-H22V rekombináns baculovírust kaptuk. Ez a rekombináns baculovírus Sf9 sejteket fertőzve HA-H22V kínéra fehérjét expreszszál, amely tisztítás után vakcinaként alkalmazható.
8. példa
HA expressziós vektor előállítása a B, C, D és E egységekben létrehozott inzerciős helyek segítségével
A HA gént hordozó ptzl9HA rekombináns plazmidból egyszálú DNS-t készítettünk [Baldari és munkatársai, Gene, 35,27-32 (1985)]. Ezt a DNS-t használtuk irányított mutagenezis céljára az alábbi oligomerrel: 5' ACT CTG TTG CTC AGA TCT GCT GGA CGG GTG ATG AAC 3' . Ez az oligonukleotid a HA gén 615-650 bázispárjának (178-189 aminosavak) felel meg, az oligonukleotid közepébe inzertált BglII hasítási hellyel (AGATCT). Az ezzel az oligonukleotiddal végzett mutagenezist és az E.coli JM109 transzformációját Sambrook és munkatársai publikált közleménye szerint végeztük [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 15-51 o. (1989)]. Egy klón, a pt2HA184-l hordozta az újonnan létrehozott BglII hasítási helyet. Ezt a régió DNS szekvenálásával igazoltuk. A mutagenezis eredményeként a 184-Ser, illetve a 185-Asp aminosavakat Arg, illetve Ser aminosavak helyettesítik, míg a szekvencia többi része változatlan maradt.
9. példa
Többszörös inzerciós hellyel rendelkező HA expressziós vektor létrehozása
Egy-egy inzerciós helyet hoztunk létre a HA A, ill. B antigénhatású egységében, ahova két azonos vagy különböző szekvenciájú epitop inzertálható. Az 1. példában ismertetett ptZHA139-15 rekombináns plazmid tartalmazza a HA gént, amelyben az A antigénhatású egységnek megfelelő szekvenciában Apai egyedi hasítási helyet hoztunk létre. Ebből a plazmádból készült egyszálú DNS-t használtunk mutagenezis céljára a 8. példában ismetetett oligomer szekvenciával abból a célból, hogy a B egységben egyedi BglII felismerő szekvenciát hozzunk létre. Egy klón, a pHA139/184 hordozta mind az Apai, mind a BglII újonnan létrehozott hasítási helyeket, amint azt a megfelelő régiók DNS szekvenálásával utóbb igazoltuk. Ezt követően azonos vagy különböző idegen epitopok inzertálhatók a HA bármely ismert antigénhatású egységébe.
A 9. példában leírt eljárás kibővíthető oly módon, hogy az magába foglalja további egyedi hasítási helyek létrehozását a HA C, D és/vagy E antigénhatású egységeiben is. Az itt említett egyedi hasítási helyek úgy értendők, hogy azok magukba foglalják azon hasítási helyeket, amelyeket sem a HA, sem a ptzl9R szekvenciák nem tartalmaznak. Az Apai és BglII helyeken kívül alkalmazható egyedi hasítási helyekre példa az AflII, AvrII, Belli, Nhel, Xhol stb.
10. példa
HÍV fertőzés megelőzése anti-N22G ellenanyagokkal történő passzív immunizálással
Passzív immunizálás hasznos lehet olyan esetekben, amikor egy egyén fertőzött vérrel vagy annak valamely alkotórészével került érintkezésbe. Hasznos lehet továbbá a HÍV anyából magzatba történő átjutásának megakadályozására. A HIV-1 V3 hurok (N22G) ellenes specifikus ellenanyagok megakadályozhatják a fertőzés elterjedését a szervezetben [Berzofsky és munkatársai, Approaches and Issues in the Development of Vaccines Against HÍV, J. Acquired Immuné Deficiency Syndromes, 4, 451-459 (1991)].
Hogy nagy mennyiségű N22G peptid specifikus ellenanyagot nyerjünk, nagy testű állatokat (pl. lovakat) többszöri injekciózással addig immunizálunk, amíg magas titerű HÍV ellenes neutralizáló ellenanyagokat kapunk, amint azt az 5. példában és a 3. táblázatban leírtuk. Az állatokból vért veszünk, hogy abból szérumot kapjunk, amelyet aztán Protein A Agaróz affinitás oszlopon átengedünk a gyártó cég utasításai szerint (GIBCO BRL, Life Technology, Inc., Gaithersburg, MD). Az IgG frakció tartalmazza a HIV-1 ellenes ellenanyagokat. A gyógyászatban szokásos hordozóval formuláit megfelelő mennyiségű IgG-t adunk be injekcióban a HIV-1 fertőzésnek feltehetően kitett személynek. Az injekció adagját és időzítését embereken végzett klinikai kipróbálással határozzuk meg.
A találmány szerinti vakcina megelőző védelmet nyújt vírusos, bakteriális és tumor eredetű antigén hatású anyaggal történő fertőzés ellen oly módon, hogy az idegen invázió ellen neutralizáló ellenanyagok termelését váltja ki a szervezetben, ami a betegség további fejlődését megakadályozza. A tengerimalacban termelt ellenanyag pl., amint azt fent jeleztük, neutralizálja (megöli) a támadó Hív vírust, mielőtt az bejutna és megállapodna a sejtben. Az, hogy a találmány szerinti polipeptidek a HA-ba épített idegen epitopok antigénjeként funkcionálnak, kimutatható pl. a HÍV elleni monoklonális ellenanyagok reakciójával a találmány szerinti HA-HIV módosított anyagokkal.
A találmány szerinti antigénhatású polipeptidekkel különböző adjuvánsok alkalmazhatók, beleértve a Syntex adjuváns, alum (0,2 % pufferőit vizes oldat), Immunostimulating complex (ISCOM), tetanusz toxoid, diftéria toxoid, Quil A glikozid adjuváns (Spikoside; Iscotec AB) [Morein és munkatársai, Natúré, 308, 457-460 (1984)], Muramyl dipeptid derivátum (MTP-PE) MF 59 alacsony olajtartalmú emulzióban és kolesztril-hemiszukcimát (CHS) alapú liposzóma (WO 90/01947 és WO 90/1948 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentések; 4 721 612 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírás) használatát.
A vakcinák hagyományos eljárás szerint készülnek az antigénhatású peptid és az adjuváns szobahőmérsékleten végzett elegyítésével.
Ezek a vakcinák, formulálásuk szerint szájon át, parenterálisan, rektálisan, intranazálisan vagy leginkább intra muszkuláris injekció formájában adhatók be fertőzésveszélynek kitett páciensnek. A hatásos adag az 1-500 Mg, általában
5-300 μg, előnyösen a 15-100 μg tartományba eshet. A kívánt neutralizáló ellenanyagszint (HÍV esetében ennek értéke 300) elérése céljából emlékeztető oltás adható. A betegségtől függően az emlékeztető oltás kb. egy év múlva adható.
A leírás során az egyedi epitopokra való utalás vagy a terminális aminosavak azonosításával és az aminosav-szekvencia hosszának megadásával történt, mint pl. az N22G esetén, ahol az N-terminális aminosav Asn, a C-terminális aminosav Gly, és a szekvencia 22 aminosav hosszú, vagy a szekvenciák irodalomban általánosan használt elnevezését alkalmaztuk, mint pl. a gpl60 és gpl20 esetében.
A HA fehérje legalább egy antigénhatású egységébe bevitt inzert kedvezően 12 aminosav hosszú szekvencia.
Claims (15)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás vírus, kórokozó baktérium vagy más antigén elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy peptidet, amely olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely az öt immundomináns antigénhatású egységet tartalmazó A típusú influenza HA felületi fehérje szekvenciájával lényegében azonos, a peptid inzertként hordozza az említett antigénhatású egységek legalább egyikét, azaz egy olyan aminosav-szekvenciát, amely lényegében azonos az említett vírus, kórokozó baktérium vagy más antigént funkcionálisan képviselő idegen epitopéval, adjuvánssal kombinálunk vagy elegyítünk.
- 2. Az 1. igénypont'szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénhatású egységként a HA fehérje A régióját alkalmazzuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénhatású egységként a HA fehérje 183-192 aminosavjainak megfelelő egységet alkalmazzuk.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 12 aminosavból álló aminosav-szekvencia inzertet alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen epitopként vírus epitopot,IgE effektor egység epitopot, baktérium fehérje epitopot, tumor epitopot vagy egy SP10 epitopot alkalmazunk.
- 6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen epitopként egy HÍV epitopot alkalmazunk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen epitopként a T20G, T16G, D18S, G20E, K27R, E14Q, N22G, P17, P24, gpl60 vagy gpl20 epitopot alkalmazzuk.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként Syntex adjuvánst vagy alumot alkalmazunk.
- 9. Eljárás egy olyan peptid előállítására, amely egy olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely lényegében megegyezik az öt antigénhatású egységgel rendelkező A típusú influenza vírus HA felületi fehérjéjével, és inzert formában tartalmazza az említett antigénhatású egységek legalább egyikét, azaz egy olyan aminosav-szekvenciát, amely lényegében azonos egy idegen epitopéval, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS technikával egy replikációra képes, az említett peptidet kódoló DNS-szekvenciát hordozó vektort állítunk elő, ezzel megfelelő gazdasejteket transzformálunk, a transzformált gazdasejteket tenyésztjük, és a kapott peptidet kívánt esetben kinyerjük.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénhatású egységként a HA fehérje A régiójában levő egységet alkalmazunk.-
- 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénhatású egységként a HA fehérje 183-192 aminosavjainak megfelelő egységet alkalmazunk.
- 12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inzertként legalább 12 aminosav hosszúságú aminosav-szekvenciát alkalmazunk.
- 13. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, az zal jellemezve, hogy idegen epitopként vírus epitopot, IgE effektor hely epitopot, baktérium fehérje epitopot, tumor epitopot vagy egy SP10 epitopot alkalmazunk.
- 14. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen epitopként egy HÍV epitopot alkalmazunk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy epitopként a T20E, T16G, D18S, G20E, K27R, E14Q, N22G, P17, P24, gpl60 vagy gpl20 epitopot alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80510591A | 1991-12-11 | 1991-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9203931D0 HU9203931D0 (en) | 1993-04-28 |
| HUT65366A true HUT65366A (en) | 1994-05-02 |
Family
ID=25190685
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203931A HUT65366A (en) | 1991-12-11 | 1992-12-11 | Expression of specific immunogens using viral antigens |
| HU95P/P00456P HU211548A9 (en) | 1991-12-11 | 1995-06-27 | Expression of specific immunogens using viral antigens |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00456P HU211548A9 (en) | 1991-12-11 | 1995-06-27 | Expression of specific immunogens using viral antigens |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5591823A (hu) |
| EP (1) | EP0546787A3 (hu) |
| JP (1) | JPH05262667A (hu) |
| KR (1) | KR930013112A (hu) |
| CN (1) | CN1073878A (hu) |
| AU (1) | AU2981992A (hu) |
| BR (1) | BR9204978A (hu) |
| CA (1) | CA2084180A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ362692A3 (hu) |
| FI (1) | FI925590A (hu) |
| HU (2) | HUT65366A (hu) |
| IL (1) | IL103928A0 (hu) |
| MX (1) | MX9207113A (hu) |
| NO (1) | NO924780L (hu) |
| SK (1) | SK362692A3 (hu) |
| TW (1) | TW239162B (hu) |
| ZA (1) | ZA929355B (hu) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0633929B1 (en) * | 1992-04-01 | 2004-03-03 | The Rockefeller University | METHOD FOR $i(IN VITRO) PROLIFERATION OF DENDRITIC CELL PRECURSORS AND THEIR USE TO PRODUCE IMMUNOGENS |
| EP0671926B1 (en) * | 1992-08-11 | 2002-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Immunomodulatory peptides |
| WO1995007099A1 (fr) * | 1993-09-09 | 1995-03-16 | The Nisshin Oil Mills, Ltd. | Vaccin et procede pour sa production |
| EP2374894B1 (en) * | 1993-09-13 | 2014-09-17 | Protein Sciences Corporation | A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines |
| US5762939A (en) * | 1993-09-13 | 1998-06-09 | Mg-Pmc, Llc | Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus |
| ES2370937T3 (es) | 1993-09-13 | 2011-12-23 | Protein Sciences Corporation | Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. |
| US6300090B1 (en) | 1994-07-29 | 2001-10-09 | The Rockefeller University | Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells |
| DE69535716T2 (de) * | 1995-05-26 | 2009-03-19 | Protein Sciences Corp., Meriden | Methode für die Produktion von multivalenten Influenza Hämagglutinin Vakzinen |
| US7659119B2 (en) | 1996-02-12 | 2010-02-09 | Argos Therapeutics, Inc. | Method and compositions for obtaining mature dendritic cells |
| AU7471098A (en) * | 1997-04-30 | 1998-11-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The | Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitum or agents |
| US6274378B1 (en) | 1997-10-27 | 2001-08-14 | The Rockefeller University | Methods and compositions for obtaining mature dendritic cells |
| AU2872199A (en) | 1998-02-20 | 1999-09-06 | Rockefeller University, The | Apoptotic cell-mediated antigen presentation to dendritic cells |
| AU2002223398A1 (en) * | 2000-08-10 | 2002-04-08 | Tsinghua University | A vaccine for influenza virus and its preparation |
| JP2004508977A (ja) | 2000-09-11 | 2004-03-25 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | ランフラットタイヤ支持体 |
| WO2004091491A2 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-28 | Transform Pharmaceuticals, Inc. | Profiling conformational variants, antibody compositions and methods of using the same |
| CA2610667A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-07 | Variation Biotechnologies Inc. | Peptide-based influenza vaccine formulation |
| WO2007084568A2 (en) | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Health Research, Inc. | Heteroduplex tracking assay |
| TWI615403B (zh) * | 2007-02-21 | 2018-02-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗 |
| EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
| US10004799B2 (en) | 2007-08-27 | 2018-06-26 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| AU2008293504B2 (en) * | 2007-08-27 | 2012-04-12 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Immunogenic compositions and methods |
| TW201008574A (en) | 2008-08-19 | 2010-03-01 | Oncotherapy Science Inc | INHBB epitope peptides and vaccines containing the same |
| KR101705150B1 (ko) | 2008-10-22 | 2017-02-22 | 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 | Ｒａｂ６ｋｉｆｌ／ｋｉｆ２０ａ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신 |
| CN101708442B (zh) * | 2009-09-04 | 2011-08-24 | 山东中惠仪器有限公司 | 全自动标准气体配制装置 |
| CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| HUE037408T2 (hu) | 2011-06-10 | 2018-08-28 | Univ Oregon Health & Science | CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok |
| AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| US10063211B2 (en) * | 2016-02-03 | 2018-08-28 | Qualcomm Incorporated | Compact bypass and decoupling structure for millimeter-wave circuits |
| RU2022108149A (ru) * | 2016-02-03 | 2022-05-05 | СиДжи ДИСКАВЕРИ, ИНК. | Композиции гемагглютинина гриппа с гетерологичными эпитопами и/или измененными сайтами расщепления при созревании |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0339504A3 (en) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
| US5166057A (en) * | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
| EP0492920A1 (en) * | 1990-12-24 | 1992-07-01 | Merck & Co. Inc. | Chimaeric influenza-HIV vaccine |
-
1992
- 1992-11-30 IL IL103928A patent/IL103928A0/xx unknown
- 1992-11-30 CA CA002084180A patent/CA2084180A1/en not_active Abandoned
- 1992-12-01 JP JP4321768A patent/JPH05262667A/ja active Pending
- 1992-12-02 AU AU29819/92A patent/AU2981992A/en not_active Abandoned
- 1992-12-02 ZA ZA929355A patent/ZA929355B/xx unknown
- 1992-12-07 TW TW081109778A patent/TW239162B/zh active
- 1992-12-07 EP EP19920311146 patent/EP0546787A3/en not_active Withdrawn
- 1992-12-09 FI FI925590A patent/FI925590A/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-12-09 KR KR1019920023656A patent/KR930013112A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-12-09 MX MX9207113A patent/MX9207113A/es unknown
- 1992-12-10 CN CN92113703A patent/CN1073878A/zh active Pending
- 1992-12-10 NO NO92924780A patent/NO924780L/no unknown
- 1992-12-10 CZ CS923626A patent/CZ362692A3/cs unknown
- 1992-12-10 BR BR9204978A patent/BR9204978A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-10 SK SK3626-92A patent/SK362692A3/sk unknown
- 1992-12-11 HU HU9203931A patent/HUT65366A/hu unknown
-
1993
- 1993-12-17 US US08/169,813 patent/US5591823A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-27 HU HU95P/P00456P patent/HU211548A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO924780D0 (no) | 1992-12-10 |
| TW239162B (hu) | 1995-01-21 |
| AU2981992A (en) | 1993-06-17 |
| US5591823A (en) | 1997-01-07 |
| FI925590A (fi) | 1993-06-12 |
| HU9203931D0 (en) | 1993-04-28 |
| FI925590A0 (fi) | 1992-12-09 |
| CZ362692A3 (en) | 1994-02-16 |
| EP0546787A2 (en) | 1993-06-16 |
| EP0546787A3 (en) | 1994-06-01 |
| ZA929355B (en) | 1994-06-02 |
| NO924780L (no) | 1993-06-14 |
| MX9207113A (es) | 1994-05-31 |
| BR9204978A (pt) | 1993-06-15 |
| SK362692A3 (en) | 1995-11-08 |
| KR930013112A (ko) | 1993-07-21 |
| JPH05262667A (ja) | 1993-10-12 |
| HU211548A9 (en) | 1995-12-28 |
| IL103928A0 (en) | 1993-04-04 |
| CA2084180A1 (en) | 1993-06-12 |
| CN1073878A (zh) | 1993-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT65366A (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| JP2012507985A (ja) | 感染因子を含まないエンベロープウイルスベースｖｌｐを単離するための改良法 | |
| JP2013510091A (ja) | キメラＲＳＶ−Ｆポリペプチド、およびレンチウイルスＧａｇまたはアルファレトロウイルスＧａｇに基づくＶＬＰ | |
| JP2009005706A (ja) | 抗−ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）ワクチン | |
| JP2000253876A (ja) | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 | |
| US11576960B2 (en) | Respiratory syncytial virus (RSV) vaccines | |
| CA2171544C (en) | Peptides that elicit neutralizing antibodies against genetically divergent hiv-1 strains | |
| JPH07505412A (ja) | Ｃｔｌ応答の誘導 | |
| AU731706B2 (en) | Recombinant viral pseudo-particles and vaccinal and antitumoral applications thereof | |
| IL106362A (en) | A system for launching multiple particle antigens | |
| WO1995009249A1 (en) | Oral vaccination of mammals | |
| JP4317912B2 (ja) | エイズワクチン | |
| PT1721982E (pt) | Ácidos nucleicos e polipéptidos quiméricos de lissavírus | |
| JPH07170982A (ja) | ワクチンおよびその製造方法 | |
| WO2002026254A2 (en) | Non-replicative particulate vaccine delivery system and methods of making and using same | |
| KR20230059897A (ko) | SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신 | |
| JP2024503482A (ja) | 複製可能アデノウイルス４型ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ワクチンおよびそれらの使用 | |
| WO1995007099A1 (fr) | Vaccin et procede pour sa production | |
| WO1997028265A9 (en) | Measles immunization by dna transcription unit inoculation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |