SK282897B6

SK282897B6 - Dialkylétery obsahujúce koncové karboxyskupiny alebo tetrazolové skupiny a farmaceutická kompozícia obsahujúca tieto dialkylétery

Info

Publication number: SK282897B6
Application number: SK1286-97A
Authority: SK
Inventors: Charles Larry Bisgaier; Paul Leroy Creger; Alan Robert Saltiel; Sherrie Rae Tafuri
Original assignee: Warner-Lambert Company
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2003-01-09
Also published as: BG63534B1; CZ289556B6; AU4776896A; ATE192732T1; EP0820428B1; NO974397L; PL322407A1; HUP9801825A3; FI973713A0; KR19980703233A; JP3885115B2; NZ302170A; KR100408612B1; HK1009438A1; CA2215233A1; NO307878B1; NO974397D0; PT820428E; BG101993A; ZA962275B

Abstract

Opisujú sa dialkylétery so všeobecným vzorcom (I), v ktorom jednotlivé substituenty majú význam definovaný v patentových nárokoch, ktoré sú použiteľné pri znižovaní určitých plazmových lipidov v tele zvierat vrátane Lp(a), triglyceridov, VLDL-cholesterolu a LDL-cholesterolu a zvyšovaní hladiny ďalších lipidov, napr. HDL-cholesterolu. Opísané zlúčeniny sú účinné pri prevencii a liečení vaskulárnych chorôb a cukrovky.ŕ

Description

Vynález sa týka dialkyléterov majúcich koncové karboxyskupiny alebo tetrazolové skupiny. Tieto zlúčeniny sú použiteľné pri znižovaní určitých plazmových lipidov v tele zvierat, vrátane Lp(a), triglyceridov, VLDL-cholesterolu a LDL-cholesterolu, a pri zvyšovaní hladiny ďalších lipidov, napríklad HDL-cholesterolu. Zlúčeniny sú účinné pri prevencii a liečení vaskulámych ochorení a cukrovky, napríklad zvýšením inzulínovej senzitivity.

Doterajší stav techniky

Vaskulárne ochorenia, napríklad koronárne srdcové ochorenie, porážka, restenóza a periférne vaskulárne ochorenie, si v celosvetovom meradle zachovávajú vedúce postavenie v počte úmrtí a prípadov končiacich invaliditou. Iba v USA umiera každý rok približne 1,5 milióna ľudí na infarkt myokardu, ktorý' spôsobuje venostázické poškodenie srdca. Aj keď je pravda, že stravovacie návyky a životný štýl môžu urýchliť nástup vaskulámych ochorení, významným faktorom pre vývoj vaskulámeho ochorenia končiaceho trvalou invaliditou alebo smrťou je geneticky daná predispozícia spôsobujúca dyslipidémiu. „Dyslipidémia“ sa chápe ako abnormálne hladiny lipoproteinov v krvnej plazme.

Vážne rizikové faktory, ktoré sú spojované so zvýšeným rizikom vzniku vaskulámych ochorení sú, okrem iného, dyslipidémia vysokých hladín nízkohustotného lipoproteínu (LDL) a nízkych hladín vysokohustotných lipoproteínov (HDL). Pomer HDL-cholesterolu ku LDL-cholesterolu je často používaný k posúdeniu možného rizika vzniku vaskulámeho ochorenia. Vzhľadom na to, že je žiaduci vysoký pomer HDL/LDL, sú zlúčeniny, ktoré tento pomer zvyšujú buď znížením LDL, alebo zvýšením HDL, prípadne obidvomi spôsobmi, vysoko žiadané a prínosné. Nedávne štúdie ukázali škodlivosti vysokých hladín modifikovanej formy LDL, označovanej ako lipoproteín(a), ,,Lp(a).

Zdá sa, že Lp(a) je nežiaduci, pretože zvýšené hladiny Lp(a) sú spájané s vývojom aterosklerózy, koronárnej srdcovej choroby, infarktu myokardu, mŕtvice, cerebrálneho infarktu a restenózy po realizácii balónovej angioplastiky. V skutočnosti sa zdá, že Lp(a) je vynikajúcim faktorom pre predpoveď vzniku mŕtvice. Vysoké koncentrácie cholesterolu vo forme Lp(a) sú teda jedným z najdôležitejších rizikových faktorov pre vznik srdcových chorôb s následkom smrti.

Teraz sa zistilo, že určité étery sú účinné pri znižovaní koncentrácie Lp(a) v plazme. Vynález teda poskytuje spôsob znižovania úrovne Lp(a) v plazme, ktorý zahrnuje podanie dialkánového éteru alebo jeho esteru. Tieto typy zlúčenín neboli doteraz používané na liečenie vaskulámej choroby. Patent US 3 920 079 napríklad opisuje 3,3'-oxybis(2,2-dimetylpropiónovú kyselinu) ako plastifikačné činidlo. Patent US 3 330 024 zasa opisuje mnohé alkándioly ako činidlá na zníženie triglyceridov v sére. Patent US 3.674,836 opisuje fenoxyalkánové kyseliny ako činidlá na redukciu triglyceridov. Patent US 4 711 896 opisuje určité a, omega-dikarboxylové kyseliny ako činidlá na znižovanie koncentrácie lipidov.

Cieľom vynálezu je teda poskytnúť mnohé dialkylétery substituované karboxyskupinou, ktoré sú účinné pri znižovaní koncentrácie Lp(a) v plazme. Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť farmaceutické formulácie obsahujúce tieto zlúčeniny a spôsob liečenia vaskulámych chorôb pri použití týchto zlúčenín.

Podstata vynálezu

Ako už bolo uvedené, vynález poskytuje nové chemické entity, charakterizované ako dialkylétery substituované karboxyskupinou alebo tetrazolovou skupinou a ich soli a estery. Vynález poskytuje predovšetkým zlúčeniny definované všeobecným vzorcom (I) ^γι z

XíCH₂)— O-(CH₂)—7<f (d

X r₂ r₃ r₄ v ktorom n a m nezávisle znamenajú celé číslo od 2 do 9;

R_b R₂ R₃ a R4 nezávisle znamenajú alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka; a R, a R₂ spoločne s uhlíkom, na ktorý sú naviazané a Rj a R₄spoločne s uhlíkom, na ktorý sú naviazané, môžu tvoriť karbocyklický kruh majúci 3 až 6 atómov uhlíka;

Yj a Y₂ nezávisle znamenajú karboxylovú skupinu, aldehydovú skupinu, tetrazolovú skupinu a COOR₅, v ktorej R₅znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, pričom alkylová skupina, alkenylová skupina a alkinylová skupina môžu byť substituované jednou alebo dvoma skupinami, zvolenými z halogcnoskupiny, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka a fenylovej skupiny.

Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu majú uvedený všeobecný vzorec, v ktorom n a m znamenajú rovnaké celé číslo a R_b R₂, R₃ a R₄ znamenajú alkylovú skupinu.

Ďalšími výhodnými zlúčeniami sú zlúčeniny, v ktorých Y[ a Y₂ nezávisle znamenajú karboxylovú skupinu alebo COOR5, v ktorej R₅ znamená alkylovú skupinu.

Najvýhodnejšími zlúčeninami podľa vynálezu sú zlúčeniny so všeobecným vzorcom

HO OH v ktorom n a m nezávisle znamenajú celé číslo od 2 do 5, v ideálnom prípade 4 alebo 5.

Veľmi výhodnou zlúčeninou je zlúčenina so všeobecným vzorcom

Vynález takisto poskytuje farmaceutický prijateľné soli kyselín podľa vynálezu.

Ďalšie realizácie vynálezu predstavujú farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeninu so všeobecným vzorcom (I) spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom, riedidlom alebo masťovým základom.

Vynález takisto poskytuje spôsoby liečenia vaskulárnych chorôb, napríklad koronárnej srdcovej choroby, mŕtvice, restenózy a periférnej vaskulárnej choroby. Vynález poskytuje spôsob zníženia Lp(a), plazmových triglyceridov, vysokohustotného lipoproteínového (VLDL) cholesterolu, nízkohustotného lipoproteínového (LDL) cholesterolu a apolipoproteínu B. Vynález ďalej poskytuje spôsob zvýšenia plazmového vysokohustotného lipoproteínového (HDL) cholesterolu, apolipoproteínu A-I a apolipoproteínu E. Vynález takisto poskytuje spôsobí liečenia a prevencie neinzulinovo dependentného diabetes mellitus, ktorého podstata spočíva v zvýšení inzulínovej senzitivity podaním zlúčeniny so všeobecným vzorcom (I).

Zlúčeniny podľa vynálezu budú označené ako alkánové kyseliny a estery. Napríklad zlúčenina so všeobecným vzorcom

bude naviazaná ako kyselina pentánová, konkrétnejšie ako kyselina 2-metyl-2n-propyl-5-(3-metyl-3-hydraxykarbonyl)pentoxypenténová. Ako už bolo uvedené, výhodnými zlúčeninami sú tie zlúčeniny, v ktorých n a m vo všeobecnom vzorci (I) znamenajú celé číslo a R_b R₂, R₃ a R₄ znamenajú rovnaké alkylové skupiny. Ak tak Y_b ako aj Y₂ znamená karboxylovú skupinu, potom budú tieto zlúčeniny označené ako oxybisalkánové kyseliny. Výhodnú zlúčeninu so všeobecným vzorcom

HO OH _A (CH₂)-O-(CH₂)—X ¹ v ktorej n a m znamenajú 4, je možné nazvať ako 6,6'-oxybis(2,2-dimetylhexánovú kyselinu).

Vo všeobecnom vzorci (I) sú R_b R₂, R₃ a R₄ definované tak, že môžu znamenať „alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka“. Tento výraz zahrnuje metylovú skupinu, etylovú skupinu, izopropylovú skupinu, terc.-butvlovú skupinu, n-hexylovú skupinu a 2-metylpentylovú skupinu. Táto alkylová skupina môže byť substituovaná halogenoskupinou, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou s 1 až 6 atómami uhlíka a fenylovou skupinou. Výraz „halogenoskupina“, ako je tu použitý, zahrnuje chloroskupinu, bromoskupinu a jodoskupinu. Výraz „alkoxyskupina s 1 až 6 atómami uhlíka“, ako je tu použitý, znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, naviazanú cez atóm kyslíka, napríklad etoxyskupinu, izopropoxyskupinu, n-hexyloxyskupinu a pod. Typickými substituovanými alkylovými skupinami sú chlórmetylová skupina, 3-hydroxyhexylová skupina, 4-fenylbutylová skupina, 2-jódpentylová skupina, izopropoxymetylová skupina a pod.

R_b R_2> R₃ a R4 môžu takisto znamenať alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka a substituovanú alkenylovú skupinu a alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka a substituovanú alkinylovú skupinu. Typickými skupinami sú napríklad vinylová skupina, 2-propenylová skupina, 3-chlór-4-hexenylová skupina, 2-fenyl-3-pentenylová skupina. etinylová skupina, 2-metoxyetinylová skupina, 2-brómetinylová skupina, 6-fenyl-3-hexinylová skupina a pod.

R( a R₂ môžu v kombinácii s atómom uhlíka, na ktorom sú naviazané, tvoriť karbocyklický kruh, napríklad cyklopropylový kruh, cyklobutylový kruh, cyklohexylový kruh a cyklopentylový kruh. Podobne R₃ a R₄ môžu spoločne s atómom uhlíka, na ktorom sú naviazané, tvoriť karbocyklický kruh s 3 až 6 atómami uhlíka, napríklad cyklopropylový, cyklohexylový a pod.

Y j a Y₂ môžu vo všeobecnom vzorci (I) nezávisle znamenať COOR5 skupinu, v ktorej R₅ znamená alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu alebo alkinylovú skupinu alebo substituovanú alkylovú skupinu, substituovanú alkenylovú skupinu alebo substituovanú alkinylovú skupinu. Tieto skupiny sú ilustrované v súvislosti s R_b R₂, R₃ a R₄.

Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré majú aspoň jednu karboxylovú kyselinovú skupinu (to znamená Y| alebo Y₂znamená COOH), ľahko tvoria farmaceutický prijateľné soli uvedením do reakcie s organickou alebo anorganickou bázou. Typickými bázami, bežne používanými na tieto ciele, sú hydroxid sodný, hydroxid draselný, uhličitan sodný, trietylamín, pyridín, amoniak a pod.

Typickými zlúčeninami podľa vynálezu sú uvedené zlúčeniny so všeobecným vzorcom

Y Y

ΧΗ,Ι-Ο-ΙΟΗ,Ι^-Χ R, R₂ R₃ R₄ v ktorom

n m	*1		*1	R₄	Y,	Y,
2	3	CHj	CHj	CHj	CHj	COOH	COOH
3	3	CHj	CHj	Et	Bt	COOCHj	COOH
2	4	Bt	i-pr	Et	Et	COOH	COOCHj
3	4	3-chlórpropyl	CHj	CH,	2-hydri:ixyetyl.	COOH	CHO
4	4	CHj	CH	CHj	CHj	COOH	COOH
4	4	Et	Et	Bt	Bt	COO'Na*	COO'Na*
4	4	Et	CHj	Q-BU	D-Bu	COOH	COOCHj
4	4	HOCHj	HOCH,	HOCHj	HOCHj	COOEt	COOEt
4	4	nPr	r.Pr	nPr	nPr	tetrazolyl	CHO
4	4	A			A	COOH	COOH
		O		CHj	CHj	CHO	CHO
	4		CHj	CHj	CHj	CHO	CHO
4	5	CHj	CHj	Et	Bt	COOH	CHO
4	5	Bt	iPr	iPr	Bt	COOH	COOH
2	5	n-hexyl	n-hexyl	n-hexyl	n-hexyl	COOH	COOH
2	6	iBu	iBu	nPr	nPr	COO'K*	COO’K*
3	6	CHj	CHj	Bt	Et	COOH	COOH
3	7	HOCHj	CICHj	BrCHj	ICHj	COOH	COOH
4	7	n-pentyl	n-pentvl	CH,OCH,-	CHjOCHj-	COO’EtjN*	COOH
4	e	CKj	CHj	CHj	CH,	CHO	COOH
4	9	CHj	CHj	CH,	CHj	COOn-hexyl	COCEt
5	8	Bt	Bt	Bt	Et	tctrazolyl	tetrazclyl
9	9	Et	Bt	C1CH,	Pnnylmctyl	COOH	COOH

Zlúčeniny podľa vynálezu sa pripravujú pri použití metodológie, ktorá je v oblasti organickej chémie známa. Pri typických syntézach sa alkylhalogenid, substituovaný karboxyskupinou, uvedie do reakcie s alkoholom, substituovaným karboxyskupinou, v prítomnosti bázy, čo povedie ku kondenzácii a vzniku zlúčeniny podľa vynálezu. Na syntézu sa zvyčajne používajú karboxyestery, ktoré poskytnú zlúčeniny podľa vynálezu, v ktorých tak Y_b ako aj Y₂ znamenajú COOR₅. Jednoduché zmydelnenie prevedie v prípade potreby jednu alebo obidve esterové skupiny na voľnú kyselinu. Uvedená reakčná schéma ilustruje uvedenú kondenzačnú reakciu:

Y Y λ~ (CHJ-halo 4 HO-ÍCHJ^X ² .

^Rx ^R ₂ ^R3 ^R«

Výraz ,,-halo“ označuje napríklad bromoskupinu, chloroskupinu, jodoskupinu a Y| a Y₂ znamenajú výhodne COOR<, ale reakcia bude prebiehať rovnako dobre, ak budú Y j a Y₂ nezávisle znamenať tetrazolylovú skupinu alebo CHO. Opísaná reakcia sa zvyčajne uskutočňuje tak, že sa najprv uvedie do reakcie alkanol a približne ekvimoláme množstvo bázy, napríklad hydridu sodného, alebo kovového sodíka, zvyčajne v inaktívnom organickom rozpúšťadle, napríklad benzéne, toluéne, xyléne, tetrahydrofuráne a pod. Týmto spôsobom sa pripraví oxidová forma alkanolu, ktorá sa potom nechá ľahko zreagovať s ekvimolámym množstvom alkylhalogenidu za vzniku zlúčeniny podľa vynálezu. Reakcia je zvyčajne v podstate ukončená počas približne 2 až 10 hodín, ak sa uskutočňuje pri zvýšenej teplote, to znamená teplote približne 50 °C až 120 °C. Zlúčenina podľa vynálezu sa ľahko izoluje jednoduchým odstránením reakčného produktu, napríklad odparením. Získaný produkt sa môže, ak je to potrebné, ďalej čistiť bežnými metódami, napríklad kryštalizáciou z rozpúšťadiel, akými sú napríklad etylacetát, benzén, hexán a pod., alebo chromatograficky, napríklad cez silikagél.

Alternatívnou metódou na prípravu zlúčenín podľa vynálezu jc uvedenie dialkyléteru, substituovaného halogenoskupinou, do reakcie s α,α-disubstituovanou kyselinou octovou alebo esterom, etanolom alebo metyltetrazolom. Túto reakciu ilustruje nasledujúca reakčná schéma:

halo—(CH,)—O—(CH,)—halo + h/

R, R,

Ϊ \

C— (CH,) —o— (CH,) —halo

R, ^Ri	Λ + HC /V *3 ^R< I
	1
\

\ z‘>

/CB, R, R, R.

Opísaný spôsob sa výhodne používa na prípravu zlúčenín podľa vynálezu, v ktorých sú / a R₂ rovnaké ako R₃resp. R₄, a v ktorých sú Y] a Y₂ rovnaké. V takomto prípade sa dialkyléter, substituovaný halogenoskupinou, uvedie do reakcie s 2 ekvivalentmi alebo väčším množstvom derivátu kyseliny octovej alebo tetrazolom, napríklad zlúčeninou

CH, CH,

Reakcia sa zvyčajne uskutočňuje v rozpúšťadle, akým je napríklad tetrahydrofúrán, dioxán, dietyléter a v prítomnosti bázy, napríklad hydridu sodného, kovového sodíka, butyllítia. Reakcia je zvyčajne ukončená približne počas 2 až 10 hodín, ak sa uskutočňuje pri teplote 0 °C až 50 °C. Produkt, to znamená zlúčenina podľa vynálezu, sa ľahko izoluje odstránením reakčného rozpúšťadla, pričom jeho ďalšie čistenie je možné v prípade potreby uskutočňovať bežnými metódami, vrátane chromatografie a kryštalizácie.

Koľkokrát môže byť s cieľom eliminovania nežiaducich vedľajších reakcií žiaduce chrániť niektoré reakčné skupiny s odtrhnuteľnými organickými radikálmi. Hydroxyskupiny a voľné karboxyskupiny je možné napríklad derivatizovať radikálmi, ktoré eliminujú ich schopnosť zasiahnuť do chemických reakcií, ktoré prebiehajú, pričom tento radikál je možné ľahko odstrániť, ak je žiaduce regenerovať voľnú hydroxyskupinu alebo karboxyskupinu. Typické ochranné skupiny pre karboxyskupinu a hydroxyskupinu a spôsoby ich naviazania a následného odtrhnutia sú úplne opísané Greenom a Witsom v „Protective Groups in Organic Synthesis“, 2. ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991. Hydroxyskupiny sa napríklad ľahko chránia prevedením na o-benzylovú skupinu, ktorú je možné v prípade potreby ľahko štiepiť hydrogenolýzou. Karboxyskupiny sa zvyčajne prevádzajú na estery, napríklad paranitrobenzylestery alebo 2,2,2-trichlóretylestery. Tieto esterové skupiny sú v prípade potreby ľahko hydrolyzovateľné za vzniku voľnej karboxylovej skupiny.

Ako už bolo uvedené, karboxylové kyseliny podľa vynálezu ľahko tvoria soli uvedením do reakcie s anorganickou alebo organickou bázou. Výhodnými soľami sú anorganické soli pripravené reakciou s bázami, akými sú napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý a pod. Typickými organickými bázami sú napríklad trietylamín, pyridín, metylamín a pod.

Nasledujúce podrobné príklady realizácie vynálezu si dávajú ako cieľ ilustrovať syntézu zlúčenín podľa vynálezu. Je nutné uviesť, že tieto príklady majú len ilustratívny charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený priloženými patentovými nárokmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

6,6'-Oxybis(2,2-dimetylhexánová kyselina)

Do miešaného roztoku hydridu sodného (28 g 60 % dispergovaného v minerálnom oleji, 700 mmol) v 600 ml suchého tetrahydrofuránu, obsahujúceho 61 g (600 mmol) diizopropylamínu, sa pridalo 52,9 g (600 mmol) kyseliny izobutyrovej. Reakčná zmes sa miešala 30 minút pri 24 °C a potom sa ochladila na 0 °C ľadovo-acetónovom kúpeli. Do studeného roztoku sa pridalo 286 ml 2,IM roztoku n-butyllítia (600 mmol) a zmes sa miešala pri 0 °C 1 hodinu. Do studenej miešanej reakčnej zmesi sa po kvapkách počas 15 minút pridalo 59,7 g (297 mmol) 4,4'-dichlórbutyléteru. Zmes sa ohriala na 24 °C a miešala sa ďalších 48 hodín. Reakčná zmes sa ďalej nariedila pridaním 600 ml vody. Vodná vrstva sa separovala, premyla sa 200 ml dietyléteru a potom sa okyslila na pH 5,0 (Kongo červená) pridaním približne 150 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej. Vodný kyselinový roztok sa trikrát exrahoval 300 ml podielmi dietyléteru. Eterové extrakty sa zlúčili, premyli soľankou, sušili sa nad MgSO₄ a po odparení rozpúšťadla pri zníženom tlaku poskytli produkt vo forme oleja. Získaný olej sa destiloval pri 160 °C a tlaku približne 400 Pa a poskytol 66,7 g 6,6'-oxybis(2,2-dimetylhexánovej kyseliny), t. t. 49 až 51°C.

Elementárna analýza (pre C₁₆H₃₀O₅)

CH vypočítané: 63,479,88 zistené: 63,7510,00

Príklady 2 až 9

Spôsobom, všeobecne opísaným v príklade 1, sa pripravili tieto zlúčeniny: 7,7'-oxybis(2,2-dimetylheptánová kyselina), 5,5'-oxybis(2,2-dimetylpentánová kyselina), 4,4'-oxybis(2,2-dimetylbutánová kyselina), 8,8'-oxybis(2,2-dimetyloktánová kyselina), etyl 2,2-dimetyl-5-(4-metyl-4-etoxykarbonylpentyloxy)pentanoát, etyl 2,2-dimetyl-6-(5-metyl-5-etoxykarbonylhexyloxy)hexanoát, metyl 2,2-dimetyl-8-(7-metyl-7-metoxykarbonyloktyloxy)oktanoát a kyselina 7-(4-metyl-4-hydroxykarbonylpentyloxy)-2,2-dimetylheptánová.

Ako už bolo uvedené, dialkylétery podľa vynálezu sú použiteľné pri liečení a prevencii vaskulárnych chorôb, napríklad koronárnych srdcových chorôb, mŕtvice, restenózy a periférnej vaskulámej choroby, vďaka svojej schopnosti znižovať koncentrácie lipoproteínu bohatého na triglycerid, napríklad nízkohustotného lipoproteínového (LDL) cholesterolu v plazme a zvyšovať koncentrácie plazmového vysokohustotného lipoproteínového (HDL) cholesterolu. Zlúčeniny podľa vynálezu sú účinné predovšetkým pri znižovaní Lp(a) a rovnako tak aj pri zvyšovaní HDL-cholesterolu.

Schopnosť dialkyléterových derivátov so všeobecným vzorcom (I) znižovať hladinu Lp(a) a zvyšovať hladinu HDL-cholesterolu, sa stanovila v in vivo štúdiách, bežne používaných odborníkmi v danom odbore. Štúdie na potkanoch sa uskutočňovali podľa nasledujúceho protokolu.

Z laboratórií Charles River Laboratories sa získali samčeky Sprague-Dawley potkana (100 až 200 g), ktoré sa umiestnili po 3 až 4 zvieratách do klietok a podľa chuti kŕmili potkaním žrádlom Purina a vodou. V klietkach sa udržiavala izbová teplota a svetelný režim, pri ktorom sa po dvanástich hodinách striedalo svetlo a tma, pričom cyklus začalo svetlo o 6 hodine ráno. Potkanom sa denne medzi 6 a 9 hodinou rannou podávali prostredníctvom žalúdkovej sondy testované zlúčeniny, rozpustené alebo suspendované v 0,2 % činidlo Tween-20 a 1,5 % karboxymetylcelulózovom (vo vode) vehikule alebo len vehikule. Ako referenčné činidlo pre všetky štúdie sa použili vehikulum v objeme reprezentujúcom 0,25 % telesnej hmotnosti a gemfibrozil (100 mg/kg/deň). Testované zlúčeniny sa podávali 7 až 14 dní v dávke dosahujúcej až 100 mg/kg/deň. Potkany sa bez predchádzajúceho pôstu znecitliveli inhaláciou éteru, zvážili, uskutočnil sa srdcový odber krvi a podrobili sa hepatikotómii, pomocou ktorej sa stanovila hmotnosť pečene jednotlivých zvierat. Odobraná krv sa previedla do kyviet vakutajnera, s obsahom EDTA, s cieľom izolovať krvnú plazmu. Krv opíc Cynomolgus sa odobrala priamo do kyviet vakutajnera s cieľom izolovať krvné sérum a plazmu.

Samčeky opíc Cynomolgus (macaca fascicularis), ktoré poskytli Charles River Laboratories (Wilmington, MA) sa individuálne umiestili do klietky a kŕmili sa dennou diétou, tvorenou 20 normálnymi opičími sušienkami (Ralston Purlna, St. Louis, MO) a ovocím (1 banán a 12 hrozien). Opice sa umiestili do obmedzovačov pohybu pre základné primáty (Primáte Products Woodside, CA) a bol im zavedený vaskulámy vstupný port (Norfolk Medical Products, Skokie, II) s cieľom získania krvných vzoriek. Účinky zlúčeniny z príkladu 1 sa študovali v režime rastúcich dávok. Počas troch týždňov sa získali od opíc, upevnených vo fixačných kreslách, cez vaskulárne porty tri predštudijné krvné vzorky. Pri štúdii zlúčeniny z príkladu 1 sa opice fixovali v kreslách a denne medzi 5 až 7 rannou hodinou im bola orálnym spôsobom pomocou žalúdkovej sondy podávaná dávka obsahujúca 3 mg/kg (1. týždeň). 10 mg/kg (2. týždeň) a 30 mg/kg (3. týždeň) zlúčeniny z príkladu 1, suspendovanej v 0,2 % povrchovo aktívnom činidle Tween-20 plus 1,5 % karboxycelulózovom vehikule. Počas študijnej periódy sa zvieratám každý týždeň a to vždy 24 hodín po aplikácii dávky a na lačno odobrali krvné vzorky. Ďalšie krvné vzorky odohrané na lačno sa získali jeden týždeň po ukončení aplikácií zlúčeniny z príkladu 1. Konzumácia potravy a chovanie pozorovaných zvierat bolo počas celej študijnej periódy normálne.

Vzorky opičej plazmy sa udržiavali na ľade, rozdelili sa na podiely zodpovedajúce množine kyviet mikrofúgy, rýchlo zmrazili a skladovali pri -70 °C. Vzorky séra sa pred realizáciou opísanej analýzy, ktorá mala určiť prítomnosť špecifických enzýmov alebo albumínu v krvnom šere, skladovali pri 4 °C.

Analýza vzoriek

Triglyceridy sa určili pri použití dostupnej súpravy (Trigli-cinct2, Sclavo, Siena, Italy alebo Triglyceride G. Wako Pure Chemical Industries, Ltd; Osak, Japan). Celkový obsah cholesterolu v plazme sa určil enzymaticky spôsobom opísaným Allainom a kol. v Clin. Chem., 20: 470 až 474 (1974). Celkové profily cholesterolových lipoproteínov v plazme sa určili post-stĺpcovou vysokovýkonnou gólovou chromatografiou (HPGC) analýzou na Superose 6 v reálnom čase (on-line) na Rainin HPLC (pozri Kieft a koľ, J. Lipid Res., 32: 859 - 866 (1991)). Lipoproteínový cholesterol sa určil z celkovo stanoveného cholesterolu a percentnej plošnej distribúcie cholesterolu, stanoveného pomocou HPLC.

Apolipoprotein A-I a E sa v celej plazme kvantifikovali pomocou raketovej imunoelektroforézy metódou Laurella a kol., Methods Enzymol, 73: 339 - 369 (1981) pri použití protilátok, vypestovaných v tele králika proti potkaniemu apo A-I, v tele kozy proti apo E (získané od Dr Patrick Tso, LSU Medical Center, Shreveport, LA). Vzorky plazmy sa pred imunoelektroforézou nariedili 4 M močovinou, 1 % Tritonom X-100, 12 mM Tricinom, 40 mM Trisom, 0,6 mM laktátom vápenatým, 0,01 % azidom sodný, pH 8,2 60 minút pri 52 °C a inkubovali sa. S cieľom stanovenia apolipoproteínov v lineárnom rozmedzí sa uskutočnili príslušné rozriedenia potkanej plazmy. Imunoelektroforéza sa uskutočnila na CelBond fólii (Cat 53748, FMC Bioproducts, Rockland, ME) zvyčajne obsahujúcej buď 4 % králičie anti-potkanie apo A-I, alebo 2 % kozie anti-potkanie apo E antisérum v 1 % agaróze, 2 % polyetylénglykolu 6000 v 24 mM Tricinu, 80 mM Trisu a 1,2 mM laktáte vápenatom. Výška rakety sa určila na géloch zafarbených amidovou čiernou. Pri vyhodnocovaní dát predstavovala hladina apolipoproteíny v plazme, odobranej zvieratám kontrolných skupín, na stupnici hodnotenia 100.

Potkania apo B sa hodnotila v mikrotitrových platniach s malými modifikáciami, opísanými Rifaiom a koľ, v Clin. Chem.. 32: 957 - 961 (1980), to znamená metódou používajúcou protilátky myšacieho apo B, vypestované v tele oviec, ktorá reaguje s potkaním apo-B. Vzorky plazmy získané od pokusných zvierat (5, 10, 20 a 30 μΐ) alebo zhromaždeného štandardu (0 až 50 μΐ) sa zlúčili s 2 M močoviny, 10 % ovčieho anti-myšacieho apo B séra, 1,6 % polyetylénglykolu 8000 (konečná koncentrácia) v celkovom objeme 200 μΐ fosfátom pufrovaného soľného roztoku. Po určení turbidity (OD = 340 nm) nasledovala celonočná inkubácia pri izbovej teplote pri použití 96 jamkového absorbančného spektrofotometra Titertek Multiscan MCC/340MK II (Flow Laboratories). Na stanovenie apo B v lineárnom rozmedzí testu sa použili vhodné rozriedenia potkanej plazmy (zvyčajne 10 μΐ). Pri vyhodnocovaní dát sa hladiny apo B v plazme zvierat, ošetrených účinnou látkou, porovnali s hladinou získanou od kontrolných zvierat, ktoré na ciele experimentu tvorila na stupnici hodnotenie 100.

Lp(a) hladiny pri opiciach sa hodnotili pomocou komerčne dostupnej Lp(a) ELISA súpravy (Apo-Tek Lp(a) Elisa Test Systém, Organon Teknika, Biotechnology Research Inštitúte), vyvinutej na detegovanie ľudského Lp(a). Lp(a) sa kvantifikuje sendvičovou technikou, v ktorej sa apo(a), zachytená anti-apo(a) (potiahnutými mikrotitrovými platňami), stanovila vďaka spojeniu s apo B pomocou rozpustenej enzymaticky naviazanej protilátky.

Štandardné krivky, zostrojené pre ľudskú plazmu a plazmu opice cynomolgus, mohli byť použité na kvantifikovanie Lp(a) opice cynomolgus. V jednom teste sa pre každú vzorku plazmy opíc cynomolgus, ktorý bol len raz rozmrazený, uskutočnili vždy tri stanovenia Lp(a) hodnoty.

Pre potkany kŕmené žrádlom sa uskutočnilo porovnanie potenciálnych účinkov gemfibrozilu s potenciálnymi účinkami zlúčeniny z príkladu 1 na mnohé lipidové parametre. Tieto dáta reprezentujú dáta zhromaždené z niekoľkých samostatných jednotýždenných štúdií a jednej dvojtýždennej štúdie (N = 8 potkanov/skupinu). Dáta pre každú štúdiu sa normalizovali vzhľadom na hodnoty, získané pre potkany každej skupiny ošetrené vehikulom. Gemfibrozil (100 mg/kg/deň) nemal žiadny vplyv na apo A-I plazmy, ktorej hladina sa väčšinou pri aplikácii vyšších dávok zlúčeniny z príkladu zvýšila. Apo E sa pri aplikácii gemfibrozilu zvýšila len mierne, ale podstatne sa zvýšila pri aplikácii zlúčeniny z príkladu 1, pričom toto zvýšenie zodpovedalo veľkosti dávky. Tieto dáta boli zrejmejšie pri jednotýždenných štúdiách (prvý týždeň, N = 30; druhý týždeň N = 8) a neodráža teda podstatnejšie zvýšenie apo E v plazme, ktoré bolo možné pozorovať pri dvojtýždennej aplikácii gemfibrozilu. Tak gemfibrozil, ako aj zlúčenina z príkladu 1 podstatným spôsobom redukujú apo B. Tieto apolipoproteínové zmeny je možné takisto hodnotiť ako pomery apo E k apo B alebo apo A-I k apo B. Parametre pre plazmové lipidy, vrátane celkovej hladiny cholesterolu, lipoproteínového cholesterolu a triglyceridov, sú zlúčeninou z príkladu 1 takisto priaznivo ovplyvnené (obrázok 2). Celková hladina cholesterolu v plazme sa aplikáciou 100 mg/kg gemfibrozilu mierne znížila, zatiaľ čo aplikácia zlúčeniny z príkladu 1 túto hladinu zvýšila dávkovo dependentným spôsobom. Tento vplyv sa odrazil predovšetkým na zvýšení HDL-cholesterolu. Tak gemfibrozil, ako aj zlúčenina z príkladu 1 redukovali VLDL- a LDL-cholesterol. Tieto účinky je možné hodnotiť ako pomer HDL-cholesterolu k VLDLa LDL-cholesterolu, zatiaľ čo 100 mg gemfibrozilu zvýši tento pomer na podobnú hladinu ako 10 mg zlúčeniny z príkladu 1 (Ix až 2x), vyššie hladiny (30 až 100 mg) zlúčeniny z príkladu 1 ďalej zvyšujú tento pomer a toto zvýšenie, získané pri najvyšších koncentráciách dosahuje až osem- a deväťnásobok. Tak gemfibrozil, ako aj zlúčenina z príkladu 1 redukujú triglyceridy v plazme.

Na charakterizovanie lipoproteínových cholesterolových profilov potkanov (obrázok 3) a opíc cynomolgus ošetrených zlúčeninou z príkladu 1 (obrázok 4) sa použila vysokovýkonná gélová chromatografia (HPGC). Obrázok 3 znázorňuje lipoproteínové cholesterolové profily potkanov (8/skupina) ošetrených samotným vehikulom, 100 mg/kg/deň gemfibrozilu alebo 1, 3, 10, 30 alebo 100 mg/kg/deň zlúčeniny z príkladu 1 počas dvoch týždňov. Pre každého potkana sa charakterizoval vždy jeden profil. Všetky profily sa vyniesli v rovnakej mierke a profil prvého potkana kontrolnej skupiny (vybodkovaný profil) sa na porovnanie predradil pred profily potkanov testovanej skupiny. Profily skupiny ošetrenej 100 mg/kg/deň gemfibrozilu boli podobné profilom skupiny ošetrenej 3 až 10 mg/kg/deň zlúčeniny z príkladu 1. Pri predpísaných dávkach zlúčeniny z príkladu 1 sa účinky na lipoproteínový cholesterol ďalej zvyšovali, vrátane redukcie VLDL- a LDL-cholesterolu a zvýšenia HDL-cholesterolu.

HPGC sa takisto použila na charakterizovanie lipoproteínových cholesterolových profilov pre tri samce opice cynomolgus, pred ošetrením, počas ošetrenia a po ošetrení zlúčeninou z príkladu 1. Zvieratá sa dopredu zvolili tak, aby reprezentovali zvieratá s vysokým, priemerným alebo nízkym pomerom LDL- k HDL-cholesterolu. Tri bazálne profily pre každú opicu boli v podstate identické a preto sa urobil ich priemer a použili sa na zostrojenie bazálneho profilu. Jednotýždenné ošetrovanie 3 mg/kg/deň zlúčeninou z príkladu 1 nemalo žiadny vplyv na lipoproteínové cholesterolové profily. Ale ošetrenie 10 mg/kg/deň zlúčeninou z príkladu 1 počas druhého týždňa a 30 mg/kg/deň počas tretieho týždňa progresívne znížilo VLDL-, LDL- a HDLcholesterol, ktorý sa začal pri dvoch z troch opíc po jednotýždňovom prieplachu opäť vracať ku kontrolným hladinám. U primátov tvorí Lp(a) cholesterol stúpajúci výbežok na LDL piku. S postupujúcim ošetrením sa LDL tak stáva symetrickejší, čo pravdepodobne odráža zníženie Lp(a). Lp(a) sa meral priamo pomocou meracieho vybavenia ELISA (obrázok 5). Priama Lp(a) kvantifikácia demonštruje dávkovo dependentnú redukciu Lp(a) hladín, dosahujúcu 62 %, 83 % a 89 % redukciu (78 ±8 % priemer) pri 30 mg/kg dávky zlúčeniny z príkladu 1, nezávisle od bazálnych hladín troch pokusných opíc (obrázok 5). Po jednotýždňovom prieplachu Lp(a) dosiahol späť hladiny pred ošetrením alebo ju dokonca prekročil.

Na rozdiel od potkanov, pri ktorých sa hladina HDL značne zvýšila počas ošetrovania zlúčeninou z príkladu 1, spôsobila táto zlúčenina pri opiciach cynomolgus zníženie

HDL-cholesterolu. Redukcia HDL pri opiciach cynomolgus sa môže odraziť na vysokej hladine cholesterylesterového transferového proteínu (CETP) v týchto druhoch. Potkania plazma má len malú alebo vôbec žiadnu CETP aktivitu. Vysoké úrovne CETP môžu teda urýchľovať rýchlosť transferu HDL-cholesterolu 1 LDL a LDL prekurzorom, čo má za následok zníženie hladín HDL-cholesterolu. Analýza hladín CETP aktivity pri králikoch a mnohých primátoch ukazuje, že hladiny CETP v plazme pri opiciach cynomolgus sú podstatne vyššie (lOx až 12x) ako u ľudí (obrázok 6). Takže sa dá očakávať, že ošetrenie ľudí zlúčeninou podľa vynálezu zahrnuje zníženie VLDL, LDL a Lp(a)cholesterolu a zvýšenie HDL-cholesterolu.

Obrázky 1 až 6 ukazujú výsledky biologického hodnotenia zlúčenín podľa vynálezu. Výsledky sú uvádzané pre výhodnú zlúčeninu z príkladu 1. Obrázok ukazuje štruktúru výhodnej zlúčeniny z príkladu 1 a označuje ju ako „PD 72953“, čo je označenie, pod ktorým je uvedená aj na niektorých ďalších obrázkoch. Referenčným činidlom je gemfibrozil, niekedy tiež označovaný ako „CI-719“.

Obrázok 2 ukazuje účinky zlúčeniny z príkladu 1, ak sa podá potkanom kŕmeným potkaním žrádlom. Počas siedmich dní sa samčekom Sprague-Dawley potkana denne medzi 6 a 9 hodinou rannou orálne aplikovalo vehikulum tvorené karboxymetylcelulúzou a povrchovo aktívnym činidlom Tween, gemfibrozil, alebo zlúčenina z príkladu 1 v naznačených koncentráciách. Pri jednom experimente sa ako kontrolná skupina použila skupina tvorená ôsmimi potkanmi a počas štrnástich dni sa jednej skupine, tvorenej ôsmimi potkanmi, podával genifibrozil a ôsmim potkanom jednotlivých testovaných skupín sa podávalo 1, 3, 10, 30 a 100 mg/kg/deň zlúčeniny z príkladu 1. Zvieratá sa nechali nažrať a napiť podľa chuti a približne 12 hodín po podaní poslednej dávky sa utratili inhaláciou éteru. Celková hladina cholesterolu a triglyceridov sa stanovila enzymaticky. Lipoproteínové profily sa určili pomocou kvantitatívnej vysokovýkonnej gélovej chromatografie (HPGC). HPGC pikové (pozri napríklad obrázok 3) plochy plus hodnota celkovej koncentrácie cholesterolu v plazme sa použili na stanovenie cholesterolu v lipoproteínových frakciách. Apolipoproteíny A-I a E sa určili pomocou imunoelektroforézy. Apolipoproteín B sa určil pri použití imunoturbidometrickej metódy. Pri štrnásťdennom experimente sa ako indikácia aktivity peroxisomatického enzýmu stanovila aktivita hepatickej kamitinovej acyltransferázy. Túto metodológiu opísal Krause a kol. v Pharmacol. Ree., 29: 345 - 357 (1994). Tieto dáta ukazujú, že zlúčenina z príkladu 1 spôsobuje dávkovo dependentné zvýšenie uvedenej aktivity, pričom aktivácia je podobná ako v prípade 100 mg/kg/deň dávky gemfibrozilu. Údaj reprezentuje priemernú hodnotu ±SEM pre hodnoty stanovené vzhľadom na kontrolnú skupinu, získanú z deviatich samostatných experimentov.

Pokiaľ ide o obrázok 2, potkany sa ošetrili opísaným spôsobom. Plazma sa podrobila HPGC, ktorá určila distribúciu cholesterolu medzi lipoproteínmi. Všetky profily pre jednotlivé skupiny ôsmich potkanov sa vyniesli v rovnakej mierke. Pred profilmi testovaných skupín ôsmich potkanov je vždy predradený jeden referenčný profil pre potkana z kontrolnej skupiny.

HPGC sa použila na analyzovanie lipoproteínových cholesterolových profilov v 10 μ plazmy, získanej od troch opíc cynomolgus (opice 90 až 98, 90 až 122, 90 až 182) pred ošetrením a potom po jednotýždennom prieplachu zlúčeninou z príkladu 1. Počas periódy týždenného ošetrenia, kedy sa postupne zvyšovala dávka, sa denne medzi 5 a 6 hodinou rannou podávala na lačno orálna žalúdková sonda účinnej zložky vo vehikule, tvorenom karboxymetylce6 lulózou a povrchovo aktívnym činidlom Tween. Pred aplikáciou dávky sa odobrala zvieratám na lačno krv. Zvieratá sa kŕmili 20 normálnymi opičími sušienkami, 12 hroznami a 1 banánom denne. Vzhľadom na to, že profily troch bazálnych vzoriek pre každú opicu boli v podstate identické, sa urobil priemer týchto profilov a vytvoril sa reprezentatívny profil. Je nutné uviesť, že spolu s prebiehajúcim ošetrením, ktoré postupne redukuje Lp(a), sa redukuje LDL pík a stáva sa symetrickejším.

Lp(a) hodnoty sa stanovili pomocou komerčne dostupnej testovacej súpravy ELISA. Vzorky plazmy z každého odberu krvi sa rozdelili na malé alikvotné objemy (100 μΐ) a zmrazili sa pri -70 °C. Lp(a) pre všetky vzorky plazmy sa stanovili v rovnakom teste. Dáta, ktoré ukazuje obrázok 5, reprezentujú absolútne (horná časť obrázka) a relatívne vztiahnuté na bazálne (spodná časť obrázka) Lp(a) hladiny troch opíc, znázornené na obrázku 4.

Aktivita transferového proteínu cholesterylesteru (CETP), ako ukazuje obrázok 6, sa určila pre mnohé primáty a pre krmivom kŕmené a cholesterolom kŕmené králiky. CETP aktivita sa určovala v celej plazme stanovením rýchlosti transferu fluorescenčného syntetického cholesterylesterového analógu obsiahnutého v mikroemulziách, spôsobom, ktorý opísal Bigsgaler a kol. v Lipid Res., 34: 1625 - 1634(1993).

Na porovnanie relatívnej účinnosti zlúčeniny z príkladu 1 s ďalšími zlúčeninami podľa vynálezu sa uskutočnil jednotýždenný experiment na žrádlom kŕmených potkanoch. Samcom Sprague-Dawley potkana sa sedem dní, vždy medzi 6 a 9 hodinou rannou, orálne podávalo karboxymetylcelulózové vehikulum, obsahujúce Tween, alebo zlúčeniny podľa vynálezu, naznačené na obrázku 7 (štruktúry pozri diagram na obrázku) v dávke 30 mg/kg/deň. Zvieratá sa nechali nažrať a napiť podľa vôle a približne 12 hodín po aplikácii poslednej dávky sa utratili inhalovaním éteru. Triglyceridy v plazme, celková koncentrácia cholesterolu v plazme, distribúcia cholesterolu medzi lipoproteínmi a apolipoproteínmi sa určili už opísaným spôsobom.

Obrázok 7 uvádza výsledky opísaného testu. Tento obrázok ukazuje, že výhodná zlúčenina z príkladu 1 prudko znižuje triglyceridy v plazme v VLDL cholesterol a zvyšuje HDL cholesterol.

Ukázalo sa, že dialkylétery takisto zvyšujú inzulínovú senzitivitu a samy osebe sú použiteľné na zvýšenie využitia glukózy pri dibatetických zvieratách a na ošetrenie cukrovky, predovšetkým neinzulínovo dependentného diabetes mellitus. Zlúčeniny podľa vynálezu sa hodnotili štandardným testom, používajúcim 3T3-L1 adipocyty, ktoré sú veľmi citlivé na inzulín, to znamená spotreba cukru môže byť náhle aktivovaná inzulínom pätnásťnásobne až dvadsaťnásobne. Metodológia použitá pre test je podrobnejšie opísaná Frostom a kol., v J. Biol. Chem.. 260: 2646 - 2652 (1985).

Konkrétnejšie sa 3T3-L1 fibroblastové bunky sa získali zo zbierky Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD). Bunky sa nechali rásť až vytvorili zhluk a potom sa diferencovali do adipocytov. 0. deň sa zhluk buniek ošetril 167 mm inzulínu, 0,25 μΜ dexametazónu a 0,5 mM metylizobutylmetylxantínu v 10 % fetálnom bovinnom sére (FBS), obsahujúcom DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium). O dva dni neskôr sa médium zmenilo na DMEM, obsahujúce 167 nm inzulínu a 10 % FBS. Médium sa potom vymenilo za 10 % DMEM a menilo sa každý deň až do zberu. Testované zlúčeniny, rozpustené v dimetylsulfoxide, sa inkubovali v médiu 0. deň a doplnili sa s každou zmenou média. Rozdiel sa stanovil vizualizáciou kvapôčok tuku zhromaždených v bunkách. Transport glukózy sa meral kvantifikáciou zabudovania [¹⁴C]deoxyglukózy do diferenciovaných buniek v deviatom dni pri použití metodológie opísanej Sandoukem a kol. v Endocrinology, 133: 352 -359 (1993).

Obrázok 8 ukazuje výsledky bunkového vývoja reprezentatívnych zlúčenín podľa vynálezu. Transport glukózy, ktorý sa hodnotil pri bazálnych hladinách, naznačuje expresiu glukózového transportéra Glut 1 v týchto pestovaných adipocytoch. Ako referenčná zlúčenina sa použil trogliazon, zlúčenina, ktorá je klinicky vyvinutá ako činidlo zvyšujúce využitie glukózy u zvierat a ľudí (úplne opísané v príklade 2 patentu US 4,572,912) a ktorá produkuje 70 % zvýšenie transportu glukózy v týchto bunkách pri dávke 5 μΜ. Táto aktivita troglitazónu je predzvesťou jeho inzulínovo-senzitizačných účinkov. Z testovaných zlúčenín podľa vynálezu testované zlúčeniny tak z príkladu 1, ako aj z príkladu 2, produkovali podstatné zvýšenie transportnej aktivity glukózy, pričom zlúčenina z príkladu 2 spôsobuje dvojnásobnú stimuláciu. Zlúčeniny podľa vynálezu sa hodnotili pri dávke 100 μΜ.

Ako je zrejmé z predchádzajúcich údajov, dialkylétery podľa vynálezu sú účinné pokiaľ ide o znižovanie Lp(a), triglyceridov, apolipoproteínu B, VLDL-cholesterolu a LDL-cholesterolu. Zlúčeniny podľa vynálezu takisto zvyšujú apolipoproteín A-I, apolipoproteín E, HDL-cholesterol a HDL/(VLDL-LDL) pomer. Zlúčeniny samy osebe sú použiteľné pri liečení a prevencii pred vaskulárnou chorobou a neinzulínovo dependentným diabetes mellitus. Ďalšou realizáciou tohto vynálezu je spôsob liečenia a prevencie pred vaskulárnou chorobou a diabetes, ktorý zahrnuje podanie účinného množstva zlúčeniny so všeobecným vzorcom (I). „Účinným množstvom“ sa rozumie dávka potrebná na liečenie alebo prevenciu proti vaskulámej chorobe alebo diabetes cicavca. Zlúčeniny sú zvyčajne podávané v dávke približne 50 až 5000 mg/deň, bežnejšie približne 50 až 2000 mg/deň. Bežne používaným dávkovacím režimom bude približne 50 až 300 mg podávaných raz až štyrikrát denne. Rovnaké dávkovacie hladiny sa budú používať na liečenie a prevenciu pred vaskulárnou chorobou a takisto na špecifické zníženie hladín Lp(a) v plazme a zvýšenie HDLcholesterolu v plazme a na liečenie a prevenciu pred diabetes.

Ďalšie realizácie vynálezu predstavujú farmaceutické formulácie, obsahujúce zlúčeninu so všeobecným vzorcom (I) spoločne s farmaceutický prijateľným masťovým základom, nosičom alebo riedidlom. Zlúčeniny je možné formulovať na bežné orálne alebo parenterálne podanie, pričom orálny spôsob podania je výhodnejší. Typickými farmaceutickými nosičmi a masťovými základmi, používanými v orálnych formuláciách sú napríklad laktóza; sacharóza; škroby, napríklad kukuričný škrob a zemiakový škrob; deriváty celulózy, napríklad metylcelulóza a etylcelulóza; želatíny; mastenec; oleje, napríklad rastlinné oleje, sezamový olej, olej zo semien bavlníka; a glykoly, napríklad polyetylénglykol. Orálne prípravky budú mať zvyčajne formu tabliet, kapsuliek, emulzií, roztokov a pod. Takisto je možné použiť formulácie s riadeným uvoľňovaním, napríklad využívajúce polymérnu matricu alebo osmotické čerpadlo a pod. Typické formulácie budú obsahovať približne 5 hmotn. % až 95 hmotn. % dialkyléteru, podaného spolu s masťovým základom alebo nosičom. Do formulácie je možné zabudovať ochuťovadlá, napríklad príchuť čerešní alebo pomaranča.

Na parenterálne podanie, to znamená na bežný intramuskulámy a intravenózny spôsob aplikácie môžu byť zlúčeniny formulované spolu s riedidlami, napríklad izotonickým soľným roztokom, 5 % vodným roztokom glukózy a pod. Zlúčeniny môžu byť takisto formulované s voskmi a gélmi vo formy čapíkov. Zlúčeniny podľa vynálezu sú takisto vhodné na transdermálnu aplikáciu a môžu byť formulované spolu s pcnctračnými činidlami a pod. vo forme náplasti. Nasledujúci príklad ďalej ilustruje typické formulácie podľa vynálezu.

Príklad 10

Prísada Množstvo kyselina 2. 2-dlmetvl-6--( 3-iiietvl-3-hvdrcixykarbonvl- 1OOO 9 butyloxyžhexánová

Laktóza 960 g

Stearát horečnatý 40 9

Zložky sa dokonale premiešali a získanou homogénnou zmesou sa naplnili #4 tvrdé želatínové kapsulky. Každá kapsulka sa naplnila 200 mg zmesou a obsahovala 100 mg účinného dialkyléteru. Kapsulky sa podávali dospelej osobe rýchlosťou denne jedna až tri kapsulky s cieľom znížiť Lp(a) v plazme.

Príklad 11
Prísada	Množstvo
kyselina 2. 2-dimetyl-B-(6-n»etyl-6-etoxykarbanyl~ heptyloxyJhexánová	3000 9
Laktóza	750 9
Kukuričný Škrob	300 9
Želatína	120 9
Voda	1ΟΟΟ g
Stearát horečnatý	20 9

Dialkyléter, laktóza a 150 g kukuričného škrobu sa zmiešalo s roztokom želatíny vo vode. Mokré granulky sa preosiali, vysušili a opäť preosiali. Vysušené granulky sa zmiešali so stearátom horečnatým a zvyšným kukuričným škrobom a zmes sa zlisovala do 698 mg tabliet pri použití 15/32 palcových štandardných konkávnych lisovníkov. Každá tableta obsahovala 500 mg dialkyléteru.

Príklad 12

Prísada		Mi icížstvci
6, 6' - oxybls(2, 2-dimetylhexáncivá kyselina)		4,0 9
Polyoxyetylénsorbltanmcinostearát		U. 1 cm”
Náí.rlumkarhrixymetylcelul óza		11. 6 9
Komplexný kremičitan hlinitohorečnatý		□. 5 9
Cukor		10 g
Glycerín		2 cm®
Benzoát. sodný		D. 5 9
Citrát sodný		0, 2 9
Schválené červené farbiva		1 mg
Čerešňová príchuť		0,02 cm®
Destilovaná voda		100 cm³

Ako polyetylénsorbitanmonostearát je možné použiť napríklad produkty polysorbát 60 alebo Tween 60. Komplexný kremičitan hlinitohorečnatý je gélotvomé činidlo. Je možné použiť napríklad produkt Veegum H. V. Táto látka sa hydratuje cez noc v 10 cm³ destilovanej vody. Z polyetylénsorbitanmonostearátu, čerešňovej príchuti, 30 cm³destilovanej vody a dialkyéteru sa pripraví zmes, ktorá sa vedie cez homogenizér. Pri intenzívnom miešaní sa pridá cukor, glycerín, citrát sodný, benzoát sodný a nátriumkarboxymetylcelulóza a potom hydrátovaný komplexný kremičitan hlinitohorečnatý a roztok červeného farbiva v 2 cm³ vody. Výsledná suspenzia sa homogenizuje, okysli sa na pH 5,0 pridaním kyseliny citrónovej a nariedi do konečného objemu 100 cm³ destilovanou vodou. 55 cm³ orálna dávková jednotka tejto suspenzie obsahuje 200 mg dialkyléteru. Ak je to žiaduce, je možné červené farbivo a čerešňovú príchuť vynechať alebo nahradiť iným farbivom a ochuťovadlom.

Výhodnou realizáciou vynálezu je použitie dialkyléterov pri prevencii a liečení neinzulínovo dependentného diabetes mellitus a stavov, ktoré tejto chorobe predchádzajú·

Neinzulínovo dependentný diabetes mellitus (NIDDM) alebo inak označovaný diabetes typu II je forma diabetes mellitus, ktorá sa vyskytuje prevažne u dospelých jedincov, u ktorých je na použitie dostupná zodpovedajúca produkcia inzulínu a pri ktorom existuje defekt v inzulínom mediovanom využití metabolizmu glukózy v periférnych tkanivách. Vyvinutý NIDDM sa vyznačuje troma hlavnými abnormalitami metabolizmu: rezistenciou k inzulínom mediovanému použitiu glukózy, narušením stravou mediovanej inzulínovej sekrécie a nadprodukciou glukózy v pečeni.

Zdá sa, že u ľudí, u ktorých sa aktuálne vyvíja NIDDM, sa tak deje preto, lebo ich B-bunky nakoniec prestanú udržiavať dostatočnú sekréciu inzulínu, aby kompenzovali inzulínovú rezistenciu. Mechanizmus zodpovedný za poškodenie funkcie B-buniek nebol doteraz identifikovaný, ale môže súvisieť s chronickými poškodeniami na B-bunkách, spôsobenými periferálnou inzulínovou rezistenciou a/alebo účinkami hyperglykémie. Poškodenie B-buniek sa môže takisto vyskytovať ako independentný inherentný defekt u „prediabetických“ jedincov.

NIDDM sa často vyvíja u určitých rizikových skupín populácie, pričom jednou z takýchto skupín sú jedinci s PCOS (polycystický vaječníkový syndróm). PCOS je najbežnejšou endokrinnou chorobou u žien v reprodukčnom veku. Tento syndróm je charakterizovaný hyperandrogenizmom a nepravidelnou gonadotropínovou sekréciou produkujúcou oligo- alebo anovuláciu.

PCOS je spojený s hlbokou inzulínovou rezistenciou, ktorá vedie k podstatnej hyperinzulinémii. V dôsledku tejto inzulínovej rezistencie hrozí u žien s PCOS zvýšené riziko možnosti vyvinutia NIDDM. Hirsutizmus, akné a plešivosť, ktoré sú bežne zisťované u žien s PCOS, sú klinickými známkami hyperandrogenizmu. Menštruačné poruchy a neplodnosť sú dôsledkom dysfunkcie vaječníka súvisiacej s nepravidelnou gonadotropínovou sekréciou. Nadbytok androgénu, spôsobený pravdepodobne eventuálnou konverziou androgénov na estrogén, hrá takisto dôležitú úlohu pri porušení uvoľňovania gonadotropínu pri PCOS.

NIDDM sa takisto vyvíja u jedincov rizikovej skupiny populácie trpiacej GDM (tehotenský diabetes mellitus). Tehotenstvo je normálne spojené s postupnou rezistenciou na inzulínom mediované použitie glukózy. Je faktom, že neinzultovaná senzitivita je nižšia skôr v neskoršom štádiu tehotenstva. Dá sa predpokladať, že inzulínová rezistencia je z veľkej časti sprostredkovaná účinkami cirkulujúcich hormónov, napríklad placentámeho laktogénu, progesterónu a kortizolu, ktoré sa vyvíjajú počas tehotenstva. Z pohľadu inzulínovej rezistencie sa citlivosť pankreatických B-buniek proti glukóze zvyčajne zvyšuje skoro až trikrát v neskoršom štádiu tehotenstva a úlohou odpovede je minimalizovať účinky inzulínovej rezistencie na hladiny cirkulujúcej glukózy'. Tehotenstvo teda poskytuje hlavné „stres-testy“ kapacity B-buniek kompenzovať inzulínovú rezistenciu.

Ďalšou populáciou, ktorá je považovaná za rizikovú, pokiaľ ide o vývoj NIDDM, sú osoby so Syndrómom X: osoby s hyperinzulinémiou ako sprievodným javom; osoby s inzulínovou rezistenciou, vyznačujúce sa hyperinzulinémiou a poruchou odpovede na exofénny inzulín; a osoby s abnormálnym inzulínom a/alebo výskytom glukózových porúch spojených s prebytkom cirkulujúcich glukokorti koidov, rastového hormónu, katecholamínov, glukagónu, paratyroidného hormónu a ďalšími inzulínovo rezistentnými podmienkami.

Zlyhanie liečenia NIDDM môže mať za následok úmrtie v dôsledku kardiovaskulárnej poruchy a ďalších diabetických komplikácii vrátane retinopatie, nefropatie a periferálnej neuropatie. Dlhodobé liečenie NIDDM zahrnuje program, ktorého úlohou je napomáhať v znižovaní krvného cukru v kombinácii s diétou a cvičením. Alternatívne liečenie NIDDM zahrnuje podávanie orálnych hypoglykemických činidiel, napríklad sulfonylmočovín samotných alebo v kombinácii s inzulínovými injekciami.

Vo všetkých prípadoch by bolo teda žiaduce vyvinúť spôsob liečenia rizikových skupín populácie osôb trpiacich PCOS a GDM, ktorý by zabránil alebo oddialil nástup NIDDM, čím by priniesol úľavu, zvýšil kvalitu života, zabránil akútnym a dlhodobým komplikáciám, znížil úmrtnosť a redukoval liečenie sprievodných chorôb populácie, u ktorých existuje riziko vzniku NIDDM. Spôsoby použitia zlúčenín podľa vynálezu pri ošetrovaní rizikových skupín populácie, trpiacich napríklad PCOS a GDM, ktorého cieľom je zabrániť alebo spomaliť nástup NIDDM, uvedené požiadavky spĺňajú.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Dialkyléter všeobecného vzorca

A Ά

---<^CHa)„-°-^CHJL—7( R ^Ra ^Ra ^Rv ktorom n a m nezávisle znamenajú celé číslo od 2 do 9;

R,, R₂, R₃ a R₄ nezávisle znamenajú alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíku, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka; a R) a R₂ spoločne s uhlíkom, na ktorý sú naviazané, a R₃ a R₄spoločne s uhlíkom, na ktorý sú naviazané, môžu tvoriť karbocyklický kruh majúci 3 až 6 atómov uhlíka;

Yi a Y₂ nezávisle znamenajú COOH, CHO, tetrazolovú skupinu a COOR₅, v ktorej R₅ znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, pričom alkylová skupina, alkenylová skupina a alkinylová skupina môžu byť substituované jednou alebo dvomi skupinami, zvolenými z atómu halogénu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka a fenylovej skupiny; a jeho farmaceutický prijateľné soli.
2. Dialkyléter podľa nároku 1, v ktorom R_b R₂, R₃ a R₄znamenajú jednotlivo alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka.
3. Dialkyléter podľa nároku 1, v ktorom Y] a Y₂ nezávisle znamenajú karboxylovú skupinu alebo COOR₅, kde R₅ znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, ktoré sú prípadne substituované jednou alebo dvomi skupinami zvolenými z atómu halogénu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka a fenylovej skupiny.
4. Dialkyléter podľa nároku 1, v ktorom Y| a Y₂ nezávisle znamenajú karboxylovú skupinu alebo COOR₅, v ktorom R₅ znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka.
5. Dialkyléter podľa nároku 4, v ktorom R_b R₂, R₃ a R₄znamenajú jednotlivo rovnakú alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka a tak Y_b ako Y₂ znamená karboxylovú skupinu.
6. Dialkyléter podľa nároku 5, v ktorom R_b R₂, R_; a R₄znamenajú metylovú skupinu.
7. Dialkyléter podľa nároku 6, v ktorom sú n a m rovnaké celé čísla.
8. Dialkyléter podľa nároku 6, v ktorom tak n, ako m znamená 4.
9. Dialkyléter podľa nároku 8, ktorým je 6,6'-oxybis(2,2'-dimetylhexánová kyselina).
10. Dialkyléter podľa nároku 7, v ktorom sa n a m zvolí z 2, 3, 5 alebo 6.
11. Dialky léter podľa nároku 10, ktorým je

5,5'-oxybis(2,2-dimetylpentánová kyselina),

4,4'-oxybis(2,2-dimetylbutánová kyselina),

8,8’-oxybis(2,2-dimetyloktánová kyselina).
12. Dialkyléter podľa nároku 7, v ktorom tak Y_b ako Y₂ znamená COOR₅, kde R₅ znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, ktoré sú prípadne substituované jednou alebo dvomi skupinami zvolenými z atómu halogénu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka a fenylovej skupiny.
13. Dialkyléter podľa nároku 12, v ktorom R₅ znamená metylovú skupinu.
14. Dialkyléter podľa nároku 13, ktorým je metyl-2,2-dimetyl-8-(7-metyl-7-metoxykarbonyloktyloxy)-oktanoát.
15. Dialkyléter podľa nároku 12, v ktorom R₅ znamená etylovú skupinu.
16. Dialkyléter podľa nároku 15, ktorým je etyl-2,2-dimetyl-5-(4-metyl-4-etoxykarbonylhexyloxy)-hexanoát.
17. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1 spoločne s farmaceutický prijateľným riedidlom, nosičom alebo masťovým základom.
18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu, v ktorej Y a Y_; znamenajú nezávisle COOH alebo COOR₅, v ktorom R₅ znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka.
19. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu, v ktorej R_b R₂, R₃ a R4 znamenajú metylovú skupinu.
20. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 19, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu, v ktorej n a m sú identické.
21. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu, v ktorej n a m znamenajú 4.
22. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že obsahuje 6,6'-oxybis(2,2'-dimetylhexánovú kyselinu).