SK282746B6 - Spôsob prípravy antigénového materiálu obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptid, materiál získaný týmto spôsobom a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Opísané sú antigénové prípravky obsahujúce sacharidy a/alebo glykopeptidy pripraviteľné z keratinofilných húb, ako aj kvasiniek, spôsob prípravy týchto antigénových prípravkov, ich použitie ako farmaceutických látok, ako aj ich použitie ako vakcín na profylaxiu a liečenie alergie, ako aj na modulovanie imunitnej odpovede.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka antigénových prípravkov obsahujúcich polysacharidy a/alebo glykopeptidy, ktoré sa dajú pripraviť z keratinofilných húb, ako aj kvasiniek, spôsobov prípravy týchto antigénových prípravkov, ich použitia ako farmaceutických látok, ako aj ich použitia ako vakcín vrátane, ale neobmedzujúc sa na profylaxiu a liečenie alergie, ako aj modulovania imunitnej odpovede.

Doterajší stav techniky

Alergia v tej či onej forme postihuje viac než 20 percent ľudskej populácie a alarmujúci nárast jej všeobecného rozšírenia, chorobnosti a úmrtnosti v priebehu posledného desaťročia viedli k jej označeniu za číslo jeden environmentálnych chorôb (Sutton a Gould, Náture 366, 421-428, 1993). Ľudská a zvieracia populácia sú postihnuté alergiou približne rovnakou mierou.

Pri vývoji alergie hrajú imunologické reakcie kľúčovú úlohu (Paul, William E. (Editor), Fundamental Immunology, Raven Press Books Ltd., New York 1984). V princípe boli opísané dva rôzne typy alergických reakcií. Jedným je okamžitý typ hypersenzitívnosti (ITH), pre ktorý sa maximálna alergická odpoveď na alergén pozoruje v priebehu minút až hodín. Druhým je oneskorený typ hypersenzitívnosti (DTH). V prípade DTH alergická odpoveď na alergén obyčajne dosahuje svoje maximum po 24 až 48 hodinách. ITH je najpravdepodobnejšie sprostredkovaný cez IgE dráhu, zatiaľ čo DTH je zložitejší. Pri vývoji DTH je pravdepodobné, že sa zúčastňujú ďalšie, bunkami (t. j. B- a T-lymfocytmi) sprostredkované odpovede. Napríklad po prenose lymfocytov a protilátok z alergických donorových zvierat na nealergické prijímajúce zvieratá sa u príjemcov vyvinul DTH (Aske-nase P.W., J. exp. Med. 138, 11441155, 1973).

V dôsledku ich priameho vystavenia okolitým antigénom sú tkanivami, ktoré sú najviac postihnuté alergiami, epitelové tkanivá, najmä koža. Napríklad na kožných klinikách tvoria akútna alergická kontaktná dermatitída a chronický alergický kontaktný ekzém až do 15 % všetkých dermatóz. Alergická astma tvorí asi 20 % všetkých prípadov astmy u ľudí.

Alergickými chorobami, ktoré možno klasifikovať ako ITH, sú napríklad atopický ekzém, alergická priedušková astma, senná nádcha, zápal nosovej sliznice, zápal spojovky. Tieto sa môžu taktiež vyvinúť do chronických foriem a nemali by sa považovať výlučne za závislé od IgE reakcií. Príkladmi DTH sú akútna alergická kontaktná dermatitída a chronický alergický kontaktný ekzém, ktoré sa ďalej môžu klasifikovať ako DTH (typu IV) s postihnutím pokožky. Takýto pacient sa predtým senzibilizoval kontaktom s alergénom a vyvolala sa hypersenzitívnosť. Obnovený kontakt s alergénom vyústi do akútnej, subakútnej alebo chronickej zápalovej kontaktnej dermatitídy.

Jedným z príkladov alergickej dermatitídy z veterinárnych kliník je letný ekzém, tiež nazývaný sladký alebo Queens land svrab. Letný ekzém je alergická dermatitída koní, patriaca k atopickej forme alergických chorôb (zahrnujúca reakcie typu I a IV). Letný ekzém je vyprovokovaný poštípaním pakomármi rodov Culicidae a Ceratopgonidae a je charakterizovaný léziami kože s permanentnými eróziami a potením, najmä v oblastiach hrivy, chvosta a brucha. Postihnuté zvieratá prejavujú silnú citlivosť kože na podráždenia, ako je dotyk, dážď, vietor atď., poškodzujúce ich celkové zdravie a výkon. Tak ako pri iných alergiách sa verí, že vývoj tejto choroby je tiež ovplyvnený výživovými faktormi. Symptómy tejto choroby sú viditeľné len od marca do septembra, zatiaľ čo alergénom vyvolaná citlivosť kože sa pozoruje po celý rok. Letný ekzém poskytuje zaujímavý všeobecný modelový systém na štúdium alergie a na vyvinutie protialergických látok.

Navrhli sa mnohé liečenia alergie v závislosti od klinického obrazu. Na liečenie akútnej alergickej kontaktnej dermatitídy, chronického alergického kontaktného ekzému a/alebo atopického ekzému sa obyčajne používajú lipofilné krémy, obsahujúce glukokortikosteroidy, antimikrobiálne látky, protizápalové liečivá a/alebo vápnik. Na liečenie letného ekzému sa rôzne látky aplikovali miestne alebo parenterálne, napríklad steroidné prípravky, insekticídy, rôzne galenické formulácie, salicyláty, oleje alebo peptidy, izolované z mikroorganizmov. Všetky uvedené liečenia sa zameriavajú na symptómy a nie na príčiny alergie.

Narušená imunitná odpoveď alebo imunitná nedostatočnosť často hrajú dôležitú úlohu pri vývoji alergie. Preto sa na liečenie ekzémov, atopického ekzému, kožných vredov a tiež autoimunitných chorôb použili tiež imunoterapeutické metódy, napríklad podávanie imunostimulátorov, ako je BCG, levamisol alebo iné stimulátory (A.M. Tschernucha (Editor), Koscha, publikovala Medicína 1982, Moskva),

Na liečenie blchami spôsobenej alergickej dermatitídy sa úspešne použilo podanie peptidov z protilátok (britská patentová prihláška č. 8913737). Na liečenie atopického ekzému sa tiež použila desenzibilizácia s relatívne dobrými výsledkami (A.M. Tschernucha (Editor), Koscha, publikovala Medicína 1982, Moskva).

Napriek mnohým rôznym prístupom k liečeniu alergie sa podľa našich vedomostí na liečenie alergie nepoužili žiadne antigénové zlúčeniny pripraviteľné z keratinofilných húb alebo kvasiniek.

V kontexte tohto vynálezu sa výraz „rozpustný alebo „nerozpustný týka rozpustnosti vo vodnom roztoku. Výraz „antigénový prípravok sa týka akéhokoľvek zloženia hmoty, ktoré je schopné vyvolať antigénovú alebo imunogénnu odpoveď. Výraz „modulovanie imunitnej odpovede sa týka schopnosti antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu stimulovať alebo zvýšiť imunitnú odpoveď, napríklad demonštrovanú ich schopnosťou stimulovať proliferáciu lymfocytov v bunkovej kultúre (podrobný prehľad sa dá nájsť v Strube a spol., Vet. Med. Rev. 60, 3-15, 1989, BúttnerM., Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 16, č. 1, 1-10, 1993).

Podstata vynálezu

Prekvapujúco sa teraz zistilo, že antigénové prípravky pripraviteľné z keratinofilných húb alebo kvasiniek sa dajú použiť na profylaxiu a liečenie alergií, ako aj na modulovanie imunitnej odpovede, najmä u cicavcov.

Vyvinuli sa teraz spôsoby prípravy antigénového materiálu z keratinofilných húb, ako aj kvasiniek. Antigénové prípravky, pripraviteľné týmito spôsobmi obsahujú polysacharidy a/alebo glykopeptidy. Tieto antigénové prípravky sa môžu použiť ako farmaceutické zmesi, ako aj vakcíny, na liečenie zvierat a ľudí, najmä na liečenie alergií a na modulovanie imunitnej odpovede. Bude sa rozumieť, že farmaceutické zmesi podľa tohto vynálezu môžu mať imunologické, ako aj farmakologické využitie.

Antigénový materiál podľa tohto vynálezu sa tiež môže pripraviť z materiálu získaného z keratinofilných húb alebo kvasiniek, napríklad bunkových stien húb alebo kvasiniek.

Na prípravu antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa vyvinuli tri rôzne spôsoby. Týmito spôsobmi sa dajú pripraviť tri rôzne antigénové frakcie (ASMP, ANMP alebo AEMP), na ktoré v ďalšom budeme odkazovať ako na „frakcie z keratinofilných húb, ako aj kvasiniek. Na antigénové prípravky, obsahujúce viac než jednu frakciu, budeme v ďalšom odkazovať ako na „komplexný prípravok alebo skrátene „komplex.

Spôsob 1:

Frakcia, pripraviteľná týmto spôsobom, pozostáva z antigénového rozpustného materiálu obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptidy (ASMP). Stručne tento spôsob, ktorý je podrobne ilustrovaný v príklade 1, zahrnuje nasledujúce:

Keratinofilné huby alebo kvasinky sa kultivujú na agarových platniach, napríklad ako je opísané v EP 0564620. Výhodným médiom je napríklad agar zo sladového výťažku od Oxoid-u. Taktiež možno použiť iné médiá, ktoré zabezpečia rast keratinofilných húb alebo kvasiniek. Výsledná hubová biomasa sa odsaje a pôsobí sa na ftu vodným roztokom alkálii. Výhodnými vodnými zásaditými roztokmi sú NaOH alebo KOU s výhodnými koncentráciami 0,1 až 5 % (hmotn./objem). Pôsobenie zásadami sa uskutočňuje výhodne pri 20 až 150 °C až do 30 h. Po spracovaní pri podmienkach vodného zásaditého roztoku sa oddelia tuhá a kvapalná fáza prípravku, napríklad centrifugovaním, filtráciou alebo sedimentáciou. Výhodne sa oddelenie dosiahne centrifugovaním, ktoré zabezpečí dobré oddelenie bunkového odpadu húb, napríklad pri silách okolo 3 500 g. Pôsobenie pri podmienkach vodného alkalického roztoku, ako aj krok separácie sa môžu opakovať niekoľkokrát.

Po zásaditom pôsobení sa na výsledný supematant pôsobí pri kyslých podmienkach, napríklad 0,2 až 1,5 M organickou kyselinou alebo 0,05 až 1 M minerálnou kyselinou. Napríklad možno použiť HC1 alebo kyselinu octovú, výhodne pri hodnotách pH medzi pH 2,5 a pH 4,5. Pôsobenie pri kyslých podmienkach vo vodnom roztoku výhodne trvá 2 až 4 hodiny pri teplotách 4 až 8 °C, potom sa uskutoční oddelenie tuhých a kvapalných vrstiev. Pôsobenie pri kyslých podmienkach vo vodnom roztoku, ako aj krok oddelenia sa môžu opakovať niekoľkokrát, výhodne pri podmienkach, aké sú opísané. Potom sa supernatant z oddeľovacieho kroku podrobí kroku zrážania. Zrážanie sa výhodne uskutoční pridaním k supernatantu vhodného organického rozpúšťadla, napríklad alkoholu, ako je nižší alkanol, napríklad metanol alebo etanol. Pomer jedného objemového dielu supernatantu k 2 až 5 objemovým dielom alkoholu vedie k dobrému zrážaniu antigénového materiálu. Môžu sa tiež použiť iné nealkoholové zrážacie postupy, známe odborníkovi v tejto oblasti, napríklad zrážanie síranom amónnym alebo inou soľou môže taktiež viesť k zrážaniu antigénového materiálu. Tuhá fáza sa potom podrobí ďalšiemu oddeľovaciemu kroku, výhodne pri opísaných podmienkach. Výsledná tuhá fáza sa odoberie a, ak je to potrebné, rozpusti sa vo vodnom roztoku, výhodne v destilovanej vode, typicky sa použije 25 až 100 ml. Nakoniec sa ASMP prípravok lyofilizuje a skladuje dlhšie časové intervaly pri suchých podmienkach.

Spôsob 2:

Frakcia, pripraviteľná týmto spôsobom, pozostáva z antigénového nerozpustného materiálu, obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptidy (ANMP). Stručne tento spôsob, ktorý je podrobne ilustrovaný v príklade 2, zahrnuje nasledujúce:

Keratinofilné huby alebo kvasinky sa kultivujú na agarových platniach, napríklad, ako je opísané v EP 0564620. Výhodným médiom je napríklad agar zo sladového výťažku od Oxoid-u. Taktiež možno použiť iné médiá, ktoré zabezpečia rast keratinofilných húb alebo kvasiniek. Výsledná hubová biomasa sa odsaje a pôsobí sa na ňu vodným roztokom alkálii. Výhodnými vodnými zásaditými roztokmi sú NaOH alebo KOH s výhodnými koncentráciami 0,1 až 5 % (hmotn./objem). Pôsobenie zásadami sa uskutočňuje výhodne pri 20 až 150 °C až do 30 h. Po spracovaní pri zá saditých podmienkach vo vodnom roztoku sa oddelia tuhá a kvapalná fáza prípravku, napríklad centrifugovaním, filtráciou alebo sedimentáciou. Výhodne sa oddelenie dosiahne centrifugovaním, ktoré zabezpečí dobré oddelenie bunkového odpadu húb, napríklad pri silách okolo 3 500 g. Pôsobenie pri zásaditých podmienkach vo vodnom roztoku, ako aj krok oddelenia sa môžu opakovať niekoľkokrát. Po zásaditom pôsobení sa na tuhú fázu pôsobí minerálnymi alebo organickými kyselinami. K tuhej fáze sa výhodne pridá 0,2 až 1,5 M kyselina octová alebo 0,05 až 1 M HC1 na 0,5 až 3 hodiny pri teplotách 70 až 100 °C. Po kyslom pôsobení sa tuhá fáza premyje vodným roztokom, výhodne destilovanou vodou. Premývanie sa výhodne opakuje asi päťkrát. Nakoniec sa tuhá fáza suspenduje v destilovanej vode.

Spôsob 3:

Frakcia, pripraviteľná týmto spôsobom, pozostáva z antigénového exogénneho materiálu obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptidy (AEMP). Stručne tento spôsob, ktorý je podrobne ilustrovaný v príklade 3, zahrnuje nasledujúce:

Keratinofilné huby alebo kvasinky sa inkubujú vo vodnom roztoku, alebo kultivujú v kvapalnom médiu až do 240 hodín (objem roztoku alebo kultúry sa tu definuje ako primárny objem PV). Môže sa použiť destilovaná voda (pozri príklad 3.I.), ako aj médiá opísané v EP 0564620. Po inkubácii alebo kultivácii sa hubové bunky oddelia, napríklad centrifugovaním, filtráciou alebo sedimentáciou, výhodne centrifugovaním pri uvedených podmienkach. Výsledný supematant sa potom lyofilizuje a následne sa rozpustí vo vode. Objem vody sa výhodne rovná 0,1 až 0,2 objemu primárneho objemu (PV). Výsledný roztok sa potom podrobí kroku zrážania. Zrážanie sa výhodne uskutoční pridaním k supernatantu vhodného organického rozpúšťadla, napríklad alkoholu, ako je nižší alkanol, napríklad metanol alebo etanol. Pomer jedného objemového dielu supernatantu k 2 až 5 objemovým dielom alkoholu vedie k dobrému zrážaniu antigénového materiálu. Môžu sa tiež použiť iné nealkoholové zrážacie postupy, známe odborníkovi v tejto oblasti, napríklad zrážanie síranom amónnym alebo inou soľou môže taktiež viesť k zrážaniu antigénového materiálu. Výsledná zrazenina sa odoberie a, ak je to potrebné, rozpustí sa vo vodnom roztoku, výhodne v destilovanej vode. Výhodne sa 0,5 až 50 mg zrazeniny rozpustí v 1 ml vodného rozpúšťadla. Nakoniec sa AEMP roztok môže lyofilizovať a skladovať dlhšie časové intervaly pri suchých podmienkach, výhodne pri 2 až 10 °C.

Výhodnými rodmi húb, z ktorých sa dajú pripraviť definované frakcie, sú rody Trichophyton, Microsporum alebo Candida.

Výhodné druhy sú:

- Trichophyton equinum,

- Trichophyton mentagrophytes,

- Trichophyton sarkisovii,

- Trichophyton verrucosum,

- Microsporum canis,

- Microsporum gypseum, alebo

- Candida albicans.

Výhodné kmene uvedených druhov sú:

- Trichophyton equinum DSM č. 7276,

- Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279,

- Trichophyton sarkisovii DSM č. 7278,

- Trichophyton verrucosum DSM 7277,

- Microsporum canis DSM č. 7281,

- Microsporum canis var. obesum DSM č. 7280,

- Microsporum canis var. distortum DSM č. 7275,

- Microsporum gypseum DSM č. 7274, alebo

- Candida albicans DSM č. 9656.

Všetky uvedené kmene prihlasovateľ deponoval v DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Nemecko) podľa ustanovení Budapeštianskej dohody o deponovaní mikroorganizmov. Všetky kmene okrem Candida albicans DSM č. 9656 boli predtým opísané v USSR patentovej prihláške č. 5006861, podanej 21. 10. 1991, a v zodpovedajúcich prihláškach, t. j. vo zverejnenej patentovej prihláške EP 0564620, podanej 17. 10. 1992.

V závislosti od druhov, z ktorých sa dajú získať uvedené frakcie, tieto sú označené podľa nasledujúceho.

Frakcie získané z:

(i) Trichophyton equinum sú označené ako ASMP-TE, ANMP-TE alebo AEMP-TE, (ii) Trichophyton mentagrophytes sú označené ako ASMP-TM, ANMP-TM alebo AEMP-TM, (iii) Trichophyton sarkisovii sú označené ako ASMPTS, ANMP-TS alebo AEMP-TS, (iv) Trichophyton verrucosum sú označené ako ASMP-TV, ANMP-TV alebo AEMP-TV, (v) Microsporum canis sú označené ako ASMP-MC, ANMP-MC alebo AEMP-MC, (vi) Microsporum gypseum sú označené ako ASMPMG, ANMP-MG alebo AEMP-MG, alebo (vii) Candida albicans sú označené ako ASMP-CA, ANMP-CA alebo AEMP-CA.

Tam, kde je uvedená informácia o konkrétnom kmeni, po skratke druhu nasledujú číslice konkrétneho DSM depozitu, napríklad AEMP-CA9656 sa týka AEMP frakcie, pripraviteľnej z kmeňa Candida albicans DSM č. 9656.

Frakcie pripraviteľné, ako je definované v ktoromkoľvek z opísaných spôsobov (1 až 3), obsahujú najmenej jeden jednotlivý antigén, pripraviteľný z najmenej jednej z uvedených húb. Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu obsahujú najmenej jednu z definovaných frakcií alebo ich kombinácií.

Antigénové prípravky (ASMP a AEMP), ako sú opísané v príkladoch 1 a 3:

1) obsahujú monosacharidy, aminokyseliny a nukleotidy, ktoré sú viazané v značnej miere do polymémych štruktúr a v menšej miere sú to voľné monoméry.

2) Hlavne pozostávajú z monosacharidových jednotiek: manóza, galaktóza, glukóza a xylóza a iné v rôznych relatívnych množstvách.

3) Obsahujú zmes polymémych štruktúr vytvorených významným množstvom týchto monosacharidov. Významná časť týchto polymémych štruktúr má molekulové hmotnosti väčšie než 20 000 kD.

4) Obsahujú malé množstvá voľných alebo viazaných aminokyselín.

5) Obsahujú malé množstvá DNA molekúl, o ktorých sa ukázalo, že sú citlivé na nairávenie pomocou DNA-ázy 1.

NMR spektroskopia antigénových prípravkov ASMP a AEMP viedla k NMR spektrogramom, ktoré sú uvedené na obr. 1 až 4.

Chemické posuny a multiplicity signálov (sumarizované v tabuľke 12) súhlasia s údajmi v literatúre pre sacharidy a aminokyseliny.

Pre frakcie AEMP a ASMP, napríklad MG 7274, TM 7279 a CA 9656, pokrývajú sacharidové signály oblasť 3,2 až 5,5 ppm, aminokyselinové signály oblasť 0,75 až 3,45 ppm (bez d-protónov).

ASMP tiež prejavuje typické signály pre acetát-CHj 1,92 ppm.

AEMP frakcie prejavujú tiež typické signály pre disacharidy a aminokyseliny. Napr. TM 7279 spektrum ukazuje signály pre aromatické aminokyseliny, ako je fenylalanín, tyrozín a tryptofán, v oblasti 7,15 až 7,9 ppm.

Čo sa týka jednotlivých frakcii ASMP alebo AEMP, koncentrácie od 0,1 do 50 mg/ml sú výhodné. Čo sa týka jednotlivých frakcií ANMP, výhodné sú koncentrácie od 0,1 do 5 % obj.

Výhodné uskutočnenia antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu zahrnujú napríklad nasledujúce kombinácie frakcií (komplexy):

Komplex 1 obsahuje ASMP-TM, ASMP-MG a ASMP-CA. Koncentrácia každej frakcie je výhodne 0,1 až 50 mg/ml. Veľmi výhodným uskutočnením komplexu 1 je kombinácia ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 a ASMPCA9656.

Komplex 1.1 obsahuje ASMP-MG a ASMP-CA. Koncentrácia každej frakcie je výhodne 0,1 až 50 mg/ml. Veľmi výhodným uskutočnením komplexu 1.1 je kombinácia ASMP-MG7274 a ASMP-CA9656.

Komplex 2 obsahuje ANMP-TM, ANMP-MG a ANMP-CA. Koncentrácia každej frakcie je výhodne 0,1 až 5 % obj.. Veľmi výhodným uskutočnením komplexu 2 je kombinácia ANMP-TM7279, ANMP-MG7274 a ANMPCA9656.

Komplex 3 obsahuje AEMP-TM, AEMP-MG a AEMP-CA. Koncentrácia každej frakcie je výhodne 0,1 až 50 mg/ml. Veľmi výhodným uskutočnením komplexu 3 je kombinácia AEMP-TM7279, AEMP-MG7274 a AEMPCA9656.

Komplex 4 obsahuje ANMP a AEMP. Výhodné sú nasledujúce kombinácie frakcií: (1) ANMP-CA a AEMP-TM alebo (2) ANMP-MG, ANMP-TM a AEMP-TM. Koncentrácia ANMP je výhodne 0,1 až 5 % obj. a AEMP 0,1 až 50 mg/ml. Veľmi výhodnými uskutočneniami komplexu 4 sú nasledujúce kombinácie:

4.1 ANMP-CA9656 a 4.2 ANMP-MG7274 a AEMPTM7279 ANMP-TM7279 a

AEMP-TM7279.

Komplex 5 obsahuje ANMP a ASMP. Výhodnou je kombinácia ANMP-MG, ANMP-TM a ASMP-CA. Koncentrácia jednotlivých ANMP frakcií je výhodne 0,1 až 5 % obj. a jednotlivých ASMP frakcií 0,1 až 50 mg/ml. Veľmi výhodnou je kombinácia ANMP-MG7274, ΛΝΜΡ-ΤΜ7279 a ASMP-CA9656.

Ďalej výhodné antigénové komplexy podľa tohto vynálezu obsahujú napríklad: ASMP a AEMP alebo ASMP a ANMP s koncentráciami pre ASMP a AEMP 0,1 až 50 mg/ml a s koncentráciami pre ANMP 0,1 až 5 % obj.

Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať spolu s vhodnými, fyziologicky prijateľnými nosičmi, ktoré nespôsobujú škodlivé fyziologické vedľajšie účinky a zahrnujú pufre, roztoky alebo pomocné látky, napríklad soľné roztoky, laktátové roztoky alebo Ringerov roztok. Výhodnými nosičmi sú napríklad: Nosič A: vodný roztok, obsahujúci 0,85 % (hmotn./objem) NaCl; Nosič B: vodný roztok, obsahujúci 5 % (hmotn./objem) glukózy, 0,3 % (hmotn./objem) mäsového výťažku „lab-lemco (Oxoid) a 0,1 % (hmotn./objem) kvasinkového výťažku (Oxoid); Nosič C: médium RPMI 1640 (získané od firmy Serva, katalógové číslo 12-702).

Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať samotné alebo ako roztoky na injekciu, krémy, spreje, aerosóly, tablety a v iných aplikačných formách, známych odborníkom v tejto oblasti. Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu môžu ďalej poskytnúť vysokoúčinné vakcíny.

Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu sú schopné stimulovať proliferáciu buniek imunitného systému a tým sú schopné modulovať imunitnú odpoveď. Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu sú ďalej schopné inhibovať proliferáciu ľudských keratinocytov.

Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu môžu vyvolať vysoký stupeň odolnosti proti alergickým reakciám, najmä epitelových tkanív, konkrétnejšie kože. Sú zaujímavé z hľadiska prevencie a liečenia alergie a v našich rukách nemali škodlivé vedľajšie účinky, ako sa demonštrovalo in vivo u laboratórnych zvierat (t. j. morčiat a bielych myší) a u koní (t. j. krížencov a islandských koní).

Najmä akútna alergická dermatitída a lézie kože sa môžu účinne liečiť bez vedľajších účinkov podaním antigénového prípravku podľa tohto vynálezu, t. j. vakcináciou. Po vnútrosvalovej injekcii(ách) antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa môžu odstrániť symptómy alergického zápalu kože, svrbenie a citlivosť kože u jedincov postihnutých alergickou dermatitídou. Úplné vyliečenie zo všetkých alergických symptómov sa dosiahlo v priebehu 2 až 8 týždňov po poslednej injekcii a alergénom indukovaná citlivosť kože na dráždidlá sa odstránila. Ďalej sa v priebehu 1 až 6 týždňov po poslednej injekcii môže odstrániť svrbenie.

Vo výhodnom uskutočnení antigénové prípravky podľa tohto vynálezu poskytujú ochranu a vyliečenie takzvaného letného ekzému koní, najmä islandských koní. Po 1 až 3 vnútrosvalových alebo vnútrokožných injekciách antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa kone, postihnuté letným ekzémom, môžu vyliečiť alebo byť chránené proti letnému ekzému, výhodné sú komplexy 1 a 1.1.

V ďalšom výhodnom uskutočnení antigénové prípravky podľa tohto vynálezu poskytujú ochranu a liečbu proti alopécii u cicavcov. Po 1 až 3 vnútrosvalových alebo vnútrokožných injekciách antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa cicavce, postihnuté alopéciou, môžu vyliečiť alebo byť chránené proti alopécii, výhodné sú komplexy 1 alebo 1.1.

V inom výhodnom uskutočnení antigénové prípravky podľa tohto vynálezu zlepšujú stav srsti a sezónnu výmenu srsti cicavcov. Po 1 až 3 vnútrosvalových alebo vnútrokožných injekciách antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa stav srsti môže významne zlepšiť a u jedincov, postihnutých neúplnou výmenou srsti, sa môže dosiahnuť normálna sezónna srsť, výhodné sú komplexy 1 alebo 1.1.

V inom výhodnom uskutočnení antigénové prípravky podľa tohto vynálezu poskytujú ochranu a liečbu proti ekzému. Po 1 až 3 vnútrokožných alebo vnútrosvalových injekciách alebo po topickom liečení antigénovými prípravkami podľa tohto vynálezu sa cicavce, napríklad ľudia, postihnutí ekzémom, môžu vyliečiť alebo byť chránené proti ekzému, výhodné sú frakcie ASMP-MG, ASMP-CA a ASMP-TM, t. j. ASMP-MG7274, ASMP-CA9656 a ASMP-TM7279 alebo komplexy 1 a 1.1.

V ďalšom výhodnom uskutočnení antigénové prípravky podľa tohto vynálezu poskytujú ochranu a liečbu proti neurodermatitíde. Po topickom liečení antigénovými prípravkami podľa tohto vynálezu sa cicavce, napríklad ľudia, postihnutí neurodermatitídou, môžu vyliečiť alebo byť chránené proti neurodermatitíde, výhodné sú frakcie ASMP-MG, ASMP-CA a ASMP-TM, t.j. ASMP-MG7274, ASMP-CA9656 a ASMP-TM7279 alebo komplexy 1 a 1.1.

Antigénové prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na liečenie pri rôznych indikáciách, ako sú tie, ktoré sú opísané v „Klinische Immunologic, Peter H.H. (Editor), vydal Urban & Schwarzenberg, Mníchov 1991, napríklad:

1. alergické choroby dýchacích ciest

1.1 alergická nádcha a zápal spojiviek

1.1.1 sezónna rinokonjuktivitída

1.1.2 pretrvávajúca nádcha

1.2 bronchiálna astma

1.3 astmatický stav

1.4 astma detí

1.4.1 obštrukčné choroby pľúc po infekčnej bronchiolitíde

1.4.2 mierna záchvatová alebo mierna pretrvávajúca bronchiálna astma

1.4.3 silná pretrvávajúca bronchiálna astma

2. alergická bronchopulmonálna aspergilóza

3. alergie na potraviny

3.1 IgE sprostredkovaná alergia na potraviny

3.1.1 IgE sprostredkovaná alergia na potraviny u detí

3.1.2 IgE sprostredkovaná alergia na potraviny dospievajúcich a dospelých

3.2 IgG a T-bunkami sprostredkované alergie na potraviny

3.3 Neznášanlivosť kravského mlieka

3.4 Heinerov syndróm

3.5 Eozinofilná gastroenteropatia

3.6 Brušné choroby

4. Alergia na poštípanie/bodnutie hmyzom

5. Žihľavka vo všetkých jej formách

5.1 Kontaktná žihľavka

5.2 Žihľavka sprevádzajúca alergické reakcie

5.3 Žihľavka sprevádzajúca neznášanlivosť k prísadám a inhibítorom syntézy prostaglandínu (pseudoalergia)

5.4 Fyzikálna žihľavka

5.4.1 Dermatografizmus (urticaria factitia)

5.4.2 Cholinergická a adrenergická žihľavka

5.4.3 Chladom vyvolaná žihľavka

5.4.4 Svetlom vyvolaná žihľavka

5.4.5 Tlakom vyvolaná žihľavka

5.4.6 Iné zriedkavé formy fyzikálnej žihľavky

5.5 Urtikáma vaskulitída

5.6 Mastocytóza a urtikáma pigmentóza

5.7 Žihľavka sprevádzajúca infekčné choroby

5.8 Žihľavka sprevádzajúca imunotyreoiditídu

5.9 Žihľavka a amyloidóza

6. Angioedém

6.1 Dedičný angioneuroedém (HANE)

6.2 Získaný angioneuroedém

7. Atopická dermatitída, atopický ekzém

8. Alergia na lieky

Tabuľka 1.

Vlastnosti a charakteristiky Candida albicans DSM č. 9656

Vlastnosti a Ľhnrakteris-cika kmeňa	DSM ä. 9656	Epidemický kmeň ó. 008
Opis kultúry	lO-dňová kolónia na	lO-dňová kolónia na
	Saboraudovom agare	Saboraudovom agare
	je krémovito hladká..	je krémovito hladká.
	pastovitá, lesklá a	pastovitá a lesklá s
	vyvýáená so stredo-	prehnutými segmenta-
	vým prehĺbením, o-	mi, okraj kolónie je
	kraj kolónie je pra-	nepravidelný s prie-
	videlný s priemerom 18 až 22 mm	morom 15 až 18 mm
Morfologická	Sf érickooválne	Sféríckooválne
chorakteristika	blastospóry merajú	blastospóry meraj ú
	3,S už 5 x S ai 8	3,5 až 5 x S až 8
	μτη. pseudohýfy sú	gm, pseudohýfy sú
	S až 8 pm Éiroké,	5 až 8 gm široké,
	hýfy sú 2 až 3 μτη	hýfy sú 2 a± 3 μιη Äiroké.
	široké.
	Chlamydospňry na	Chlamydospóry nu
	ryžovom agure ma-	ryžovom ugurc ma-
	ju priemer	jú priemer
	13 až 15 μπι	13 až 16 μm
Patogénna	30 dni po intra-	30 dní po intra-
charakteristika	peritoneálnej in-	peritoneálnej -in-
	jekcii 1O až 1OO	jekcii 10 až 1OO
	miliónov hubových	miliónov hubových
	buniek bielym my.	buniek bielym my-
	šiam 80 % zvierat	šiam 80 % zvi erat
	vykazovalo bruSné	vykazovalo brušné
	granulómy, nopozo-	granulómy, 40 %
	rovali sa žiadne	zvierat uhynulo
	smrteľné účinky

Tento vynález sa ďalej týka Candida albicans kmeňa DSM č. 9656, ktorý sa získal riadenou selekciou, založenou na stabilizácii morfologickej charakteristiky kultúry a zoslabení epidemického kmeňa č. 008, ktorý bol izolovaný z človeka v r. 1990.

Biologické vlastnosti Candida albicans kmeňa DSM č. 9656 sú opísané v tabuľke 1.

Kmeň Candida albicans DSM č. 9656 sa ďalej odlišuje od epidemického kmeňa svojou populačnou stabilitou a morfologickou charakteristikou pri dlhodobom prechádzaní cez živné médiá a nižšou virulenciou. Podľa poznatkov o príprave antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu sa z tohto kmeňa dajú pripraviť vysokoúčinné a bezpečné antigénové prípravky podľa tohto vynálezu.

Odborník v tejto oblasti ľahko rozpozná, že tento vynález je dobre prispôsobený uskutočniť zámery a dosiahnuť uvedené ciele a výhody, ako aj tie, ktoré sú mu inherentné. Tu opísané zlúčeniny, postupy a metódy sú v súčasnosti reprezentatívnymi na výhodné uskutočnenia, majú slúžiť ako príklady a nemajú sa chápať ako obmedzujúce rozsah.

Keď sme teraz všeobecne opísali tento vynález, to isté sa bude ľahšie chápať s odkazom na nasledujúce príklady, ktoré sú zaradené na ilustráciu a nemajú obmedzovať tento vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázkoch 1 až 4 sú znázornené NMR spektrogramy antigénových prípravkov ASMP a AEMP.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Pre všetky príklady sa centrifugovanie uskutočnilo so silami medzi 3000 g a 3500 g počas asi 30 až 50 minút. Médiá sa získali od firmy Oxoid (Unipath GmbH, Am Lippeglacis 6-8, 46483 Wesel, Nemecko) alebo Serva (Serva Feinbiochemica GmbH & Co. KG, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Hcidelberg, Nemecko). Ak nie je uvedené ináč, huby sa kultivovali, ako je opísané v katalógu firmy Oxoid „5. aktualizované nemecké vydanie alebo v EP 0564 620. Kmene húb použité na prípravu antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu, sa získali výberom a zoslabením kmeňov húb, ako je opísané v práci N.V. Mazkevitcha „Spontannaja izmenčivosť i kariologija nesoveršennych gribov, publikovanej vydavateľstvom Nauka, Moskva 1981; a v práci Ivanovej L.G. „Sistematika, morfologičeskaja charakteristika, biologičeskije svojstva vozbuditelej dermatofitozov, obščich dlja životných i čeloveka, Moskva 1992, Knižnica Moskovskej univerzity. Základné kultivačné metódy pre kultúry buniek cicavcov sa ľahko dajú nájsť v práci: Doyle, Griffiths a Newell (Eds.) Celí & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons 1995. Pre keratinocytové štúdie sa použili HaCaT-bunky (Boukamp a spol., J. Celí Biol. 106,761-771,1988, a Rýle a spol., Differentiation 40, 42-54, 1989), rovnako možno použiť izolované keratinocyty alebo iné keratinocytové bunkové línie. Konské lymfocyty sa izolovali a kultivovali, ako je opísané v práci Friemel H. „Immunologische Arbeitsmethoden, publikovanej vydavateľstvom VEB Gustáv Fischer Verlag, Jena 1984; alebo Paul E. „Fundamental Immunology, publikovanej vydavateľstvom Ravcn Press, New York 1984. Radiačné štúdie sa v podstate uskutočnili, ako je opísané v Boehncke a spol., Scand. J. Immunol. 39, 327-332, 1994 a v tam citovaných odkazoch. NaOH, KOH, HCI a kyselina octová sa pripravili ako vodné roztoky. Ak nie je uvedené ináč, výraz „rozpustný sa týka rozpustnosti vo vodnom roztoku. Fyziologicky prijateľnými nosičmi použitými v ďalej opísaných pokusoch, sú napríklad: Nosič A: vodný roztok obsahujúci 0,85 % (hmotn./objem) NaCl; Nosič B: vodný roztok obsahujúci 5 % (hmotn./objem) glukózy, 0,3 % (hmotn./objem) mäsového výťažku „lab-lemco (Oxoid) a 0,1 % (hmotn./objem) kvasinkového výťažku (Oxoid); Nosič C: médium RPMI 1640 (Serva).

Príklad 1

Antigénový rozpustný materiál obsahujúci polysacharid a/alebo glykopeptidy (ASMP) sa pripravil z:

Trichophyton mentagrophytes (ASMP-TM), Microsporum gypseum (ASMP-MG) alebo Candida albicans (ASMP-CA) podľa nasledujúcich postupov:

Huby sa kultivovali na agarových platniach, ako je opísané v EP 0564620. Hubová biomasa sa odsala a na výrobu:

I. ASMP-TM:

(i) Na Trichophyton mentagrophytes biomasu sa pôsobilo 4,5 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 140 °C 1 hodinu, počom nasledovalo centrifugovanie 45 minút. K supematantu sa pridával 4 M roztok kyseliny octovej, kým sa nedosiahlo konečné pH 3,5. Po 2 hodinách sa sediment oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supematantu sa pridali 3 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyofilizovali.

(ii) Na Trichophyton mentagrophytes biomasu sa pôsobilo 0,2 % (hmotn./objem) KOH pri asi 140 °C 1 hodinu, počom nasledovalo centrifugovanie. Na supernatant sa pôsobilo 1 M roztokom HCI pri konečnom pH 3,5 4 hodiny pri 4 až 10 °C. Sediment sa oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supematantu sa pridali 2 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyofilizovali.

II. ASMP-MG (i) Na Microspomm gypseum biomasu sa pôsobilo 0,2 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 140 °C 2 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 0,2 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 140 °C 2 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie a tento postup sa opakoval tretí raz. Na konečný supernatant sa pôsobilo 8 M roztokom kyseliny octovej pri konečnom pH 3,5 3 hodiny pri 18 až 20 °C. Sediment sa potom oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supematantu sa pridali 3 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý' zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyoftlizovali.

(ii) Na Microsporum gypseum biomasu sa pôsobilo 3 % (hmotn./objem) KOH pri asi 75 °C 6 hodín, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 3 % (hmotn./objem) KOH pri asi 75 °C 6 h, počom nasledovalo centrifugovanie. Na konečný supernatant sa potom pôsobilo 0,5 M roztokom HCI pri konečnom pH 3,5 4 hodiny pri 4 až 10 °C. Sediment sa oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supematantu sa pridali 3 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyofilizovali.

III. ASMP-CA:

(i) Na Candida albicans biomasu sa pôsobilo 3,0 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 75 °C 6 hodín, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 3,0 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 75 °C 6 hodín, počom nasledovalo centrifugovanie. Na konečný supernatant sa potom pôsobilo 12 M roztokom kyseliny octovej pri konečnom pH

3,5 2 hodiny pri 4 až 10 °C. Sediment sa potom oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supernatantu sa pridali 2 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyofilizovali.

(ii) Na Candida albicans biomasu sa pôsobilo 4,5 % (hmotn./objem) KOH pri asi 35 °C 3 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 4,5 % (hmotn./objem) KOH pri asi 35 °C 3 h, po čom nasledovalo centrifugovanie, a tento postup sa zopakoval tretí raz. Na konečný supernatant sa potom pôsobilo 0,25 M roztokom HCI pri konečnom pH 3,5 4 hodiny pri 18 až 20 °C. Sediment sa oddelil centrifugovaním a k 1 objemovému dielu supernatantu sa pridali 2 objemové diely etanolu. Sediment, vzniknutý zo zrážania alkoholom, sa sedimentoval centrifugovaním a rozpustil sa v destilovanej vode. Napokon sa jednotlivé ASMP prípravky lyofilizovali.

Príklad 2

Antigcnový nerozpustný materiál obsahujúci polysacharid a/alebo glykopeptidy (ANMP) sa pripravil z: Trichophyton mentagrophytes (ANMP-TM), Microsporum gypseum (ANMP-MG) alebo Candida albicans (ANMPCA) podľa nasledujúcich postupov:

Huby sa kultivovali na agarových platniach, ako je opísané v EP 0564620. Hubová biomasa sa odsala a na výrobu:

I. ANMP-TM:

(i) Na Trichophyton mentagrophytes biomasu sa pôsobilo 0,2 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 35 °C 24 h, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa pôsobilo 0,3 M kyselinou octovou asi 3 hodiny pri asi 60 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval vo vodnom roztoku 0,85 % (hmotn./objem) NaCl (Nosič A) na konečnú koncentráciu 0,5 % obj. ANMP-TM. Tento ANMP-TM prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

(ii) Na Trichophyton mentagrophytes biomasu sa pôsobilo 0,2 % (hmotn./objem) KOH pri asi 35 °C 24 h, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa pôsobilo 0,1 M HCI 30 minút pri 70 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval v RPMI 1640 (Nosič C) na konečnú koncentráciu 1,5 % obj. ANMP-TM. Tento ANMP-TM prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

II. ANMP-MG:

(i) Na Microsporum gypseum biomasu sa pôsobilo 3 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 75 °C 6 hodín, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 3 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 75 °C 6 hodín, počom nasledovalo centrifugovanie. Na výsledný sediment sa pôsobilo 0,7 M kyselinou octovou asi 4 hodiny pri 60 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval vo vodnom roztoku, obsahujúcom 5 % (hmotn./objem) glukózy, 0,1 % (hmotn./objem) kvasinkového výťažku od Oxoid-u a 0,3 % (hmotn./objem) mäsového výťažku lab lemco od Oxoid-u (Nosič B) na konečnú koncentráciu 2,5 % obj. ANMP-MG. Tento ANMP-MG prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

(ii) Na Microsporum gypseum biomasu sa pôsobilo 3 % (hmotn./objem) KOH pri asi 35 °C 3 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo 3 % (hmotn./objem) KOH pri asi 35 °C 3 h, počom nasledovalo centrifugovanie a tento postup sa zopakoval tretí raz. Na výsledný sediment sa pôsobilo 0,5 M HCI 30 minút pri 80 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval v RPMI 1640 (Nosič C) na konečnú koncentráciu 2,0 % obj. ANMP-MG. Tento ANMP-MG prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

III. ANMP-CA:

(i) Na Candida albicans biomasu sa pôsobilo 4,5 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 140 °C 2 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo

4,5 % (hmotn./objem) NaOH pri asi 140 °C 2 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie a tento postup sa zopakoval po tretí raz. Na výsledný sediment sa pôsobilo 1 M kyselinou octovou 1 hodinu pri 60 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval vo vodnom roztoku 0,85 % (hmotn./objem) NaCl (Nosič A) na konečnú koncentráciu 1,5 % obj. ANMP-CA. Tento ANMP-CA prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

(ii) Na Candida albicans biomasu sa pôsobilo 4,5 % (hmotn./objem) KOH pri asi 140 °C 2 hodiny, počom nasledovalo centrifugovanie. Na sediment sa opäť pôsobilo

4,5 % (hmotn./objem) KOH pri asi 140 °C 2 h a na výsledný sediment sa pôsobilo 0,1 M HCI 30 minút pri 100 °C a päťkrát sa premyl destilovanou vodou. Po každom kroku premývania nasledovalo centrifugovanie. Konečný sediment sa opätovne suspendoval v RPMI 1640 (Nosič C) na konečnú koncentráciu 2,5 % obj. ANMP-CA. Tento ANMP-CA prípravok sa skladoval ako suspenzia pri 2 až 10 °C.

Príklad 3

Antigénový exogénny materiál, obsahujúci polysacharid a/alebo glykopeptidy (AEMP), sa pripravil z kvapalných kultúr: Trichophyton mentagrophytes (AEMP-TM), Microsporum gypseum (ANMP-MG) alebo Candida albicans (ANMP-CA). Kvapalné kultúry sa kultivovali pri podmienkach v podstate, ako je opísané v EP 0564620. Jednotlivé AEMP prípravky sa získali podľa nasledujúcich postupov.

I. AEMP-TM: Trichophyton mentagrophytes sa inkuboval 240 h pri 26 °C v 1000 ml destilovanej vody. Potom sa kultúra, obsahujúca asi 1,2 x 10⁸ buniek na ml, centrifugovala. Supernatant sa lyofilizoval a rozpustil v 100 ml destilovanej vody, pridali sa 3 objemové diely metanolu a zrazenina sa rozpustila vo vodnom roztoku. Supernatant sa lyofilizoval, čo viedlo k AEMP-TM.

II. AEMP-MG: Microsporum gypseum sa kultivoval 50 h pri 28 °C v 200 ml Nosiča °C (médium RPMI 1640 od firmy Serva). Kultúra, obsahujúca asi 3 x 10⁷ buniek na ml, sa centrifugovala. Supernatant sa lyofilizoval a rozpustil v 20 ml destilovanej vody, pridali sa 2 objemové diely metanolu a zrazenina sa rozpustila vo vodnom roztoku. Supernatant sa lyofilizoval, čo viedlo k AEMP-TM.

III. AEMP-CA: Candida albicans sa kultivoval 30 h v 800 ml Nosiča B (1 % (hmotn./objem) mäsový výťažok lab-lemco od Oxoid-u, 0,1 % (hmotn./objem) kvasinkového vý-ťažku od Oxoid-u a 5 % (hmotn7objem) dextrázy) pri 37 °C. Kultúra, obsahujúca asi 10⁸ buniek na ml, sa centrifugovala. Supernatant sa lyofilizoval a rozpustil v malom rrrnož štve destilovanej vody, pridali sa 2 objemové diely metanolu a zrazenina sa rozpustila vo vodnom roztoku. Supernatant sa lyofilizoval, čo viedlo k AEMP-TM.

Príklad 4

Stanovil sa vplyv rozličných antigénových prípravkov na rast kultúr keratinocytovýeh buniek (HaCaT-bunkové kultúry).

I. Antigénové frakcie ASMP-TM, ANMP-TM a AEMP-TM, pripravené z Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279, ASMP-MG, ANMP-MG a AEMP-MG, pripravené z Microsporum gypseum DSM č. 7274, a ASMPCA, ANMP-CA a AEMP-CA, pripravené z Candida albicans DSM č. 9656, sa použili v rôznych koncentráciách. ANMP frakcie, pripravené podľa príkladu 2, sa lyofilizovali a opätovne suspendovali v PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok s koncentráciou fosfátu 6,7 mM pri fyziologickom pH asi 7,2; získané od firmy Serva, katalógové číslo 17-516).

Na kultiváciu sa použili 12-miskové platne pre tkanivové kultúry od firmy Falcon (ploché dno, povrchová plocha 9,6 cm⁶). Do každej misky sa vložilo 0,15 ml suspenzie keratinocytovýeh buniek (HaCaT-buniek) s asi 1 miliónom buniek na ml výživného média (RPMI 1640, doplnený 10 % (hmotn./objem) plodového teľacieho séra), 2 ml výživného média a 0,02 až 0,1 ml antigénovej frakcie, rozpustenej v PBS. Do kontrolných misiek sa nepridal žiadny materiál antigénovej frakcie. Kultivácia sa uskutočnila v inkubátore s 5 % obj. CO₂ pri teplote 37 °C asi 48 hodín, kým sa nevyvinula splývajúca bunková monovrstva v kontrolných miskách.

lnhibícia rastu buniek sa stanovila porovnaním veľkosti plochy bunkových vrstiev, na ktoré pôsobili antigénové frakcie, v porovnaní s kontrolami, na ktoré nepôsobili antigénové frakcie (kontrola = 100 %). Výsledky sú uvedené v tabuľkách 2 a 3.

lnhibícia rastu buniek sa pozorovala pri koncentrácii ASMP-MG 0,1 mg/ml, koncentrácii ASMP-TM 0,3 mg/ml a koncentrácii ASMP-CA 1 mg/ml. Pre ANMP (MG, TM a CA) sa inhibícia pozorovala pri koncentrácii 1 mg/ml. Pre AEMP-MG sa inhibícia rastu buniek pozorovala pri koncentrácii 0,3 mg/ml a pre AEMP-TM a AEMP-CA pri koncentrácii 1 mg/ml.

Príklad 5

Stanovil sa vplyv rôznych antigénových frakcií na bunkovú proliferáciu konských lymfocytov.

Použili sa antigénové frakcie ASMP a AEMP hubových kmeňov T. mentagrophytes DSM č. 7279, M. gypseum DSM č. 7274 a °C. albicans DSM č. 9656. Pripravila sa suspenzia asi 40 000 lymfocytov (z islandských koní) na ml výživného média. Výživné médium RPMI 1640 sa doplnilo 10 % (hmotn./objem) plodového teľacieho séra. Kultivácia lymfocytov sa uskutočnila v 96-miskových platniach pre tkanivové kultúry s dnom tvaru H (Falcon č. 3077). 200 TI bunkovej suspenzie sa dodalo do každej misky a pridalo sa 20 TI antigénovej frakcie, rozpustenej v PBS. Kontroly sa uskutočnili bez pridania materiálu antigénovej frakcie.

Platne pre tkanivové kultúry sa inkubovali pri 37 °C s 5 % obj. CO2 72 hodín. Potom sa výživné médium vymenilo a pridal sa roztok (1 ]Ί na misku), obsahujúci H³-tymidín. Uskutočnil sa druhý kultivačný krok počas 12 hodín, kultúra sa premyla PBS. Bunková prolifcrácia sa stanovila radiačnými metódami, opísanými v práci Boehneke a spol., Scand. J. Immunol. 39, 327-332, 1994. Meranie bunkovej proliferácie sa uskutočnilo porovnaním testovaných kultúr s kontrolami, ktoré neboli vystavené mate riálu antigénovej frakcie. Hodnoty na kontroly sa definovali ako 100 %. Výsledok je uvedený v tabuľke 4. Jednotlivé antigénové frakcie mali buď inhibičný alebo stimulačný účinok na proliferáciu lymfocytových buniek.

Príklad 6

Tento príklad ilustruje typické komplexné prípravky. Komplexy (1 až 5), opísané v tomto príklade, sa pripravili z Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279, Microsporum gypseum DSM č. 7274 alebo Candida albicans DSM č. 9656.

I. Komplex 1 obsahuje ASMP-TM, ASMP-MG a ASMP-CA vo vhodnom nosiči, napríklad

Komplex 1	Koncentrácia (ng/ml)
A	B	C
ASMP-TM7279	5	10	30
ASMP-MG7274	5	10	30
ASMP-CA9ä56	5	10	30
	v nosiči	v nosiči	v nosiči
	A, B alebo C	A, B alebo C	A. B alebo C

Komplex 1.1 obsahuje ASMP-MG a ASMP-CA vo vhodnom nosiči, napríklad

Komplex 1,1??	Koncentrácia (mg/ml)
A	B	C
ASMP-MG7274 ASMP-CA9656	5 5 v nosiči A, B alebo C	10 10 v nosiči A, B alebo C	30 30 A, B alebo C

II. Komplex 2 obsahuje ANMP-TM, ANMP-MG a ANMP-CA vo vhodnom nosiči, napríklad

Komplex 2	Koncentrácia [Äobj.J
A	B	C	D
ANMP-TM7279	0,5	1,0	1,5	2.5
ANMP-MG7274	0,5	1,0	1.5	2.5
ANMP-CA9656	0,5	1,0	1.5	2,5
	suspenzia	suspenzia	suspenzia	suspenzia
	v nosiči	v nosiči	v nosiči	v nosiči
	A. B alebo C	A, B alebo C	A, B alebo C	A, B alebo C

III. Komplex 3 obsahuje AEMP-TM, AEMP-MG a AEMP-CA vo vhodnom nosiči, napríklad

Komplex 3	Koncentrácia (ng/ml)
A	B	C
AEMP-TM7279 AEMP-MG7274 AEMP-CA9656	5 5 5 v nosiči A, B alebo C	10 10 10 v nosiči A, B alebo C	30 30 30 v nosiči A. B alebo C

IV. Komplex 4 obsahuje ANMP a AEMP vo vhodnom nosiči, napríklad (i) Komplex

4.1 ANMP-CA9656 2,5 % obj.

AEMP-TM7279 7,1 mg/ml v nosiči A alebo B alebo C (ii)

Komplex 4.2	Koncentrácia
A	B
ANMP-MG7274	2,5 % obj.	3,0 % obj.
ANMP-TM7279	2,5 % obj.	3,0 % obj.
AEMP-TM7279	10,5 mg/ml	18,5 mg/ml
	v nosiči	v nosiči
	A, B alebo C	A, B alebo C

V. Komplex 5 obsahuje ASMP a ANMP vo vhodnom nosiči, napríklad

Komplex S	Koncentrácia
A	B
ANMP-MG7274	1.75 % obj.	3 % obj.
ANMP-TM7279	1,75 % obj.	3 % obj .
ASMP-CA9656	15,6 mg/ml	15,6 mg/ml
	v nosiči	v nosiči
	A, B alebo C	A, B alebo C

Príklad 7

Bezpečnosť rôznych antigénových prípravkov sa testovala vakcinačnými pokusmi v systémoch zvieracích modelov (biele myši, morčatá a kone).

Antigénové frakcie sa pripravili, ako je opísané v príkladoch 1 až 3 a 6, z Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279, Microsporum gypseum DSM č. 7274 alebo Candida albicans DSM č. 9656.

Nasledujúce klinické pozorovania, týkajúce sa stavu vakcinovaných zvierat, sa uskutočňovali denne až do piatich dní po každej vakcinácii:

1. Všeobecný stav

- chuť,

- vplyv na pohyb.

2. Miestna reakcia

- opuch a zápal v mieste injekcie,

- zmeny teploty v mieste injekcie,

- vývoj bolesti v mieste injekcie,

- nevyhnutnosť liečiť miesto injekcie liekmi.

I. Antigénové prípravky sa vstrekli jeden alebo dva razy s intervalom 10 dní vnútrobrušne bielym myšiam a vnútrobrušne a podkožné morčatám. Antigénové prípravky, ich koncentrácie a výsledky sú uvedené v tabuľkách 5 a 6 (A a B). Podkožná alebo vnútrobrušná injekcia hubových antigénov ako jednotlivých alebo komplexných prípravkov najčastejšie nemala žiadny škodlivý účinok na všeobecný stav zvierat a miestna reakcia na mieste injekcie sa nepozorovala.

II. Komplexné prípravky hubových antigénov, ako sú opísané v príklade 6 (komplexy 4.1, 4.2 a 5), sa každý vstrekli raz vnútrosvalovo tomu istému koňovi na rôznych miestach (vľavo a vpravo na krku a do jedného z hrudných svalov). Vakcinovali sa tri rôzne kone: (i) žrebná kobyla, (ii) žriebä, vek 7 až 8 mesiacov, a (iii) žrebec, vek 6 rokov. Antigénové prípravky, ich koncentrácie a výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Vnútrosvalová injekcia hubových antigénov ako komplexného prípravku nemala žiadny vplyv na všeobecný stav koní a miestna reakcia na mieste injekcie sa nepozorovala. Tieto štúdie demonštrujú vynikajúcu bezpečnosť antigénových prípravkov podľa tohto vynálezu.

Príklad 8

Vplyv rôznych antigénových prípravkov na stav kože a osrstenia sa študoval u bielych myší.

Antigénové prípravky sa pripravili, ako je opísané v príkladoch 1 až 3 a 6, z Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279, Microsporum gypseum DSM č. 7274 alebo Candida albicans DSM č. 9656.

Antigénové prípravky sa vstrekli dvakrát s intervalom 10 dní vnútrobrušne bielym myšiam. Pozorovanie stavu kože a osrstenia trvalo päť dní. Antigénové prípravky, ich koncentrácie a výsledky sú uvedené v tabuľke 8. Injekcie antigénových prípravkov zlepšili stav kože a osrstenia bielych myší v porovnaní s kontrolnými zvieratami, postihnutými dermatitídou.

Príklad 9

Účinnosť troch rôznych antigénových prípravkov sa študovala vakcináciou islandských koní, postihnutých letným ekzémom v placebom kontrolovanom pokuse.

Antigénové prípravky sa pripravili, ako je opísané v príkladoch 1 až 3 a 6 z T. mentagrophytes DSM č. 7279, M. gypseum DSM č. 7274 a °C. albicans DSM č. 9656. Objem 1 ml Nosiča A, obsahujúceho jednotlivé antigénové prípravky, sa vstrekol trikrát vnútrosvalovo. Interval medzi každými dvoma injekciami bol päť dní. Injekcie sa podávali striedavo do pravej a ľavej strany hrudného svalu. Antigénové prípravky, ich koncentrácie a výsledky sú uvedené v tabuľkách 9 a 10.

Podanie antigénového prípravku, obsahujúceho ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 a ASMP-CA9656, vyústilo do úplného vyliečenia všetkých vakcinovaných koní (3) štyri týždne po tretej injekcii. Kone kontrolnej skupiny (injekcia Nosiča A bez antigénov) nemali žiadne znaky uzdravenia.

Príklad 10

Bezpečnosť troch rôznych antigénových prípravkov sa študovala vakcináciou islandských koní, postihnutých letným ekzémom v placebom kontrolovanom pokuse.

Antigénové prípravky sa pripravili, ako je opísané v príkladoch 1 až 3 a 6 z T. mentagrophytes DSM č. 7279, M. gypseum DSM č. 7274 a °C. albicans DSM č. 9656. Objem 1 ml Nosiča A, obsahujúceho jednotlivé antigénové prípravky, sa vstrekol trikrát vnútrosvalovo. Interval medzi každými dvoma injekciami bol päť dní. Injekcie sa podávali striedavo do pravej a ľavej strany hrudných svalov. Zvieratá sa sledovali vzhľadom na vedľajšie účinky v priebehu troch dní po každej injekcii. Antigénové prípravky, ich koncentrácie a výsledky sú uvedené v tabuľke 11. Všeobecné vedľajšie účinky, ako je horúčka alebo strata chuti, sa nepozorovali. Len jeden z antigénových prípravkov vyvolal opuchnutie na strane injekcie. Tento malý vedľajší účinok sa pozoroval len u jedného koňa. Nepozorovali sa žiadne znaky bolesti.

Príklad 11

Protialergická účinnosť jednotlivých frakcií ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 a ASMP-CA9656, ako aj komplexu 1, obsahujúceho ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 a ASMP-CA9656, sa študovala na laboratórnom zvieracom modeli.

Jednotlivé frakcie sa pripravili podľa príkladu 1. Komplex 1 sa pripravil podľa príkladov 1 a 6.

CF-1 myši sa senzibilizovali podľa modelu a návodu Mouse Ear Swelling Test (Gad S.C., Dimm B.K., Dobbs D.W., Reilly °C., Walsh R.D.: Development and Validation of an Alternatíve Dermal Sensitization Test: The Mouse Ear Swelling Test (MEST), Toxicology and Applied Pharmacology 84, 93-114, 1986). Toto je dobre známy, schválený a OECD akceptovaný test na skúšanie alergických látok. Na dôkaz účinnosti komplexu alebo jeho jednotlivých frakcií pri jeho protialergickom pôsobení u laboratórneho zvieraťa by sa malo zabrániť napuchnutiu ucha, ktoré je spôsobené alergénom. Uskutočnili sa placebom kontrolované náhodné testy s myšami a dvoma rôznymi alergénmi:

MEST sa uskutočnil s CF-1 myšami, ktoré sú najcitlivejšie naalergény. 6 až 10 týždňov starým CF-1 myšiam sa oholila koža na bruchu, vstreklo sa 0,05 ml Freundovho adjuvans a aplikovalo sa 100 TI alergénu l-chlór-2,4-dinitrochlór-benzén (DNCB) v jednom pokuse a roztočového alergénu v druhom pokuse miestne na oholenú kožu na bruchu od dňa 0 po 4. O sedem dní neskôr sa aplikovalo 20 TI alergénu miestne na testovacie ucho, rozpúšťajúci sa

SK 282746 Β6 roztok na kontrolné ucho. 24 a 48 h neskôr sa merala hrúbka ucha. Ten istý postup sa uskutočnil s kontrolnou skupinou, na ktorú sa pôsobilo placebom namiesto komplexu, resp. frakcií komplexu.

Podanie jednotlivých frakcií ASMP-TM7279, ASMPMG7274 a ASMP-CA9656, ako aj komplexu 1, obsahujúceho ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 a ASMP-CA9656, viedlo k 90 %-nému zníženiu opuchu ucha po senzibilizácii roztočovým alergénom a k 87,5 %-nému zníženiu opuchu ucha po senzibilizácii pomocou DNCB 48 hodín po opätovnom podráždení v porovnaní s kontrolnými skupinami.

Príklad 12

Účinnosť komplexného prípravku, obsahujúceho antigénové prípravky ASMP-MG7274 a ASMP-CA9656, pripravené, ako je opísané v príklade 1, sa demonštrovala vakcináciou islandského koňa, postihnutého letným ekzémom.

Vnútrokožné injekcie objemu 0,4 ml Nosiča A, obsahujúceho 0,2 mg MG a 0,2 mg CA, aplikované trikrát s intervalom päť dní medzi každými dvoma injekciami, viedli k vyliečeniu vakcinovaného koňa tri týždne po poslednej injekcii, ako dokazuje významné zmenšenie klinických symptómov. Nepozorovali sa žiadne vedľajšie účinky.

Príklad 13

Účinnosť antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade 1 (ASMP), z Microsporum gypseum DSM č. 7274, sa demonštrovala vakcináciou 41-ročného muža, trpiaceho ekzémom so zápalom, svrbením a eróziami na koži medzi 4. a 5. prstom na nohe.

Objem 0,1 ml Nosiča A, obsahujúceho 0,4 mg ASMPMG7274, sa vstrekol vnútrokožné jediný raz. Koža sa vrátila do normálneho stavu po 4 až 5 dňoch po liečení. Svrbenie zmizlo už 24 hodín po injekcii. Nepozorovali sa žiadne silné vedľajšie účinky.

Príklad 14

Účinnosť antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade 1 (ASMP), z Candida albicans DSM č. 9656, sa demonštrovala pri liečení neurodermatitídy.

ASMP-CA9656 sa vmiešal do krému, použijúc Kamill Hand und Nagelcreme, získaný od firmy Proctor & Gambie, do konečnej koncentrácie 60 mg ASMPCA9656/ml krému. Prípravok sa aplikoval miestne 3-ročnému dievčatku, trpiacemu neurodermatitídou so žltými chrastami na koži v okolí oboch uší. Krém sa aplikoval miestne na poškodenú časť kože raz denne počas 30 dní. Po tomto liečení sa koža vrátila do normálneho stavu. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 15

Účinnosť antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade 1 (ASMP), z Microsporum gypseum DSM č. 7274, sa demonštrovala pri liečení ekzému.

ASMP-MG7274 sa vmiešal do krému, použijúc „Kamill Hand und Nagelcreme, získaný od firmy Proctor & Gambie, do konečnej koncentrácie 60 mg ASMPMG7274/ml krému. Liečil sa 30-ročný muž, trpiaci ekzémom so zápalom, eróziami a svrbením na prsteníku, miestnou aplikáciou na postihnuté miesta kože raz denne počas 30 dní. To viedlo k úplnému uzdraveniu po liečení. Svrbenie zmizlo niekoľko dni po začatí liečenia. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 16

Účinnosť antigénových prípravkov, pripravených, ako je opísané v príklade 1 (ASMP) z Microsporum gypseum DSM č. 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279 a Candida albicans DSM č. 9656, sa testovala vakcináciou 5-ročného koňa, ktorý až do júna nevymenil zimnú srsť. Objem 1 ml Nosiča A, obsahujúceho 15 mg každého antigénového prípravku ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 a ASMP-CA9656 (konečná koncentrácia 45 mg ASMP/ml) sa vstrekol trikrát s intervalom päť dní vnútrosvalovo, čo viedlo k úplnej výmene na normálnu sezónnu srsť v priebehu 15 dní. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 17

Demonštruje sa účinnosť komplexných antigénových prípravkov, pripravených, ako je opísané v príklade 1 (ASMP) z Microsporum gypseum DSM č. 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279 a Candida albicans DSM č. 9656 pri liečení alopécie.

Dva 7-ročné kone, trpiace alopéciou, jeden na 3 až 5 a jeden na 7 až 10 rôznych miestach po celom tele, sa liečili vakcínou, obsahujúcou 10 mg každého antigénového prípravku ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 a ASMPCA9656 v 1 ml Nosiča A (konečná koncentrácia 30 mg/ml). Vakcína sa vstrekla trikrát s intervalom päť dní vnútrosvalovo, čo viedlo k úplnému obnoveniu osrstenia oboch koní 10 dní po poslednej aplikácii. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 18

Demonštruje sa účinnosť komplexného antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade I (ASMP) z Microsporum gypseum DSM č. 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279 a Candida albicans DSM č. 9656 pri liečení alopécie u koní.

10-ročný kôň, trpiaci alopéciou na 10 až 12 rôznych miestach po celom tele, sa liečil vakcínou, obsahujúcou 15 mg každého antigénového prípravku ASMP-MG7274, ASMPTM7279 a ASMP-CA9656 v 1 ml Nosiča A (konečná koncentrácia 45 mg/ml). Vakcína sa vstrekla trikrát s intervalom päť dni vnútrosvalovo, čo viedlo k úplnému obnoveniu osrstenia 15 dni po poslednej aplikácii. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 19

Demonštruje sa účinnosť komplexného antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade 1 (ASMP) z Microsporum gypseum DSM č. 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279 a Candida albicans DSM č. 9656 pri liečení alopécie u psov.

3-ročná suka, trpiaca alopéciou na 2 až 3 rôznych miestach po celom tele, sa liečila vakcínou, obsahujúcou 10 mg každého antigénového prípravku ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 a ASMP-CA9656 v 1 ml Nosiča A (konečná koncentrácia 30 mg/ml). Vakcína sa vstrekla trikrát s intervalom päť dní vnútrosvalovo, čo viedlo k úplnému obnoveniu osrstenia 15 dní po poslednej aplikácii. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Príklad 20

Demonštruje sa účinnosť komplexného antigénového prípravku, pripraveného, ako je opísané v príklade 1 (ASMP) z Microsporum gypseum DSM č. 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM č. 7279 a Candida albicans DSM č. 9656 pri liečení alopécie u psov.

Dva psy, jeden 5-ročný a jeden 8-ročný, trpiace alopéciou na 2 až 4 rôznych miestach po celom tele, sa liečili vakcínou, obsahujúcou 15 mg každého antigénového prí pravku ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 a ASMPCA9656 v 1 ml Nosiča A (konečná koncentrácia 45 mg/ml). Vakcína sa vstrekla trikrát s intervalom päť dni vnútrosvalovo, čo viedlo k úplnému obnoveniu osrstenia 30 dní po poslednej aplikácii. Vedľajšie účinky sa nepozorovali.

Tabuľka 2

Vplyv koncentrácie rôznych antigénových frakcií na rast keratinocytových bunkových kultúr (HaCaT-buniek) v percentách v porovnaní s kontrolami, nevystavenými antigénovým frakciám (splývajúca bunková monovrstva kontrol = 100%)

Anti génová frakcia	Koncentrácia antigénovej frakcie (og/nl)
	0,003	0,007	0,01	0,015	0,03	0.1	0,3	0,45	í,6		1,25	1.5	1,75	2
		Plocha, pokrytá bunkám, v percentách v porovnaní s	kontrolami
ASMP-MG7274	100	100	100	100	100	75	50	25	25	25	0	0	0	0
ASMP-DI7279	100	100	100	100	100	100	75	50	25	0	0	0	0	0
ASMP-CA9656	100	100	100	100	100	100	100	100	100	75	50	25	25	0
ANHP-MG7274	100	100	100	LOO	100	100	100	100	100	75	75	50	25	0
ANKP-TN7279	100	100	100	too	100	100	100	100	100	75	50	25	25	0
AW-CA9656	100	100	100	100	100	100	100	100	100	75	75	50	25	0
AENP-MG7274	100	100	100	100	100	100	75	75	50	25	0	0	0	0
AEHP-TN7279	100	100	100	ioo	100	100	100	100	100	75	75	50	25	0
AEMP-CA9656	100	100	100	100	100	100	100	100	100	75	50	25	0	0

Tabuľka 3

Koncentrácia rôznych antigénových frakcií, spôsobujúca 50 %-nú inhibiciu rastu keratinocytových buniek (HaCaTbuniek)

Kmeň	Koncentrácia antigénovej frakcie (mg/ml)
ASMP	ANMP	AENP
MG7274	0,3	1.5	0,6
TM7279	0,45	1,25	1.5
CA9656	1,25	1.5	1,25

Tabuľka 4

Vplyv rôznych antigénových frakcií na bunkovú proliferáciu konských lymfocytov

Koncentrácia antigénových frakcii (pg/ml)	Proliferácia konských lymfocytov v % (kontroly bez vystavenia antigénovým frakciám · 100%)
ASMPMG7274	ASMPTM7279	ASMPCA9656	AEMPMG7274	AEMPTM7279	AEMPCA9656
500	81,5	36.2	37,8	19,4	7.0	1.08
50	117	106,9	109,8	76,1	10,2	46,9
O	181	172,8	119,8	129,7	47,3	138,3
O.S	98,6	93,8	134,1	147,8	133,3	138,3
0,05	271,3	94,3	181,5	143.5	94.8	149.8
O.OO5	146,7	207,6	144,7	104,7	109,9	146,3

Tabuľka 5A

Reakcia testovacích zvierat (biele myši, telesná hmotnosť 12 až 14 g) po „prvej injekcii jednotlivých antigénových frakcií

Antigénová frakcia	Koncentrácia W<1) alebo (* ohj.)	Obješ injekcie («1)	Počet vakcinovaných zvierat	Počet zvierat, ktoré vykazujú
liestnu bolesť	liestnu reakciu	vzrast miestnej teploty	stratu chuti	narušenie pohybu	sírte!· ne reakcie
ASNP-MG1274	:«.í ·:/ιΐ	0,5	10	0	0	0	0	0	0
ASNP-TH7279	12.5 >8/il	0,5	10	0	0	0	0	0	0
ASNP-CA9656	15,5 ig/al	0,5	9	0	0	c	[1	0	c
ANNP-MG7274	J,3 í	0.5	1	0	1	0	0	0	0
ÄlW-Tf1213	3,3»	0,5	10	0	2	0	0	0	0
AMP-CM656	3,3»	0,5	10	0	1	0	0	0	0
AEMP-HG7274	15,í ·ί/·1	0,5	10	0	1	0	0	0	0
ΑΕΜΡ-Π7279	11,3 >S/>1	0,5	10	0	1	0	0	0	0
AENP-CA9656	13,5 tg/il	0,5	10	0	1	0	0	0	0

Tabuľka 5 B

Reakcia testovacích zvierat po „prvej injekcii komplexných prípravkov

Kotplet	c.	Koncentrácia (s/l) alebo (»<Aj.)	Obje· injekcie (al)	Poŕet vakcinovaných zvierat	Počet zvierat, ktoré vykazujú
iestnu bolesť	eiestnu reakciu	vžrast aiestnej teploty	stratu chuti	narušenie pohybu	surteíné reakcie
biele eyáí (telesná heotnosť 12 až 14 g)
A.W-NG7274 ANJIP-TH7279 AEMP-TH7279	4.2	2,5 * 2,5* W.5 ng/al	«.5	10	0	0	0	0	0	0
A1W-CA9556 AEHP-TN7279	4.1	2,5« 7.1 «g/il	t,5	10	0	•	0	0	0	0
W-MG7274 AWP-TJ17279 ASHP-CA96S6	$	1,7$ » 1.75« 15,6 ig/il	0.5	10	0	0	0	0	0	0
orčatá (telesná heotnosť 150 až 200 g)
A.W-HG7274 ANMP-TM7279 AEW-TÄ1279	4,2	2,5« 2,5« 1(,5 ig/il	t,5	5	0	0	0	0	0	0
A.W-CA9556 AEMP-TM7279	4.1	2.5« 7.1 ig/il	¢.5		0	0	D	0	0	0
ANHP-MG7274 AMMP-TM7279 ASMP-CA9&56	$	1.75 « 1.75 » 15,6 ig/il	0.5		0	0	0	0	0	0

Tabuľka 6A

Reakcia testovacích zvierat (biele myši, telesná hmotnosť 12 až 14 g) po „druhej injekcii jednotlivých antigénových frakcií

Antigénová frakcia	(oncentrácia (»s/‘l) alebo (* obj.)	Obješ injekcie (n	Počet vakcinovaných zvierat	Počet zvierat, ktoré vykazujú
liestnu bolesť	liestnu reakciu	vzrast DÍestnej teploty	strata chuti	narušenie pohybu	sírte!né reakcie
ASHP-AG7274	10,5 ig/il	1,0	10	0	0	0	0	0	0
ASMP-TH7279	1a,5 ig/il	1,0	10	0	0	0	0	0	0
ASMP-CA9656	15,5 Bg/il	1,0	9	0	0	0	0	0	0
AW-IGW4	3,3 *	0.5	0	0	1	0	0	0	0
W-W2U	3,3»	0,5	10	0	2	0	0	0	0
AW-W556	3,3#	1,0	10	0	1	(1	0	0	0
AEHP-mmu	15,5 ag/il	0,5	10	0	1	0	0	0	0
AEMP.TH7279	11,1 ng/il	1,0	10	D	1	0	0	o	í
AESP-CA9Í56	11,5 Bg/rl	0,5	10	0	1	0	0	0	0

Tabuľka 6B

Reakcia testovacích zvierat po „druhej injekcii komplexných prípravkov

Komplet	í.	Koncentrácia (·8/·1) alebo (« obj.)	Obje· injekcie (®1)	Počet vakcinovaných zvierat	Počet zvierat, ktoré vykazujú
iestnu bolesť	iestnu reakciu	vzrast niestnej teploty	stratu chuti	narušenie pohybu	serteľné reakcie
biele eyíi (telesná heotnosť 12 ai 14 g)
ANHP-NC7274 AW-T«7279 AEMP-TM7279	4.2	2.5 « 2.5 « 10.5 ag/sl	0.5	10	0	0	0	0	«	0
ANMP-CA9656 ΛΕΜΡ-ΤΝ7279	4.1	2,5 1 7,1 «g/al	0.5	10	0	D	0	0	0	0
ANMP-NG7274 ANMP-TK7279 ASNP-CA9656		1,75 ( 1,75 * 15.6 »g/il	0,5	10	0	0	0	0	0	0
orčatá (telesná heotnosť 150 až 200 g)
ANNP-HG7274 WWP-TH7279 áENP-T)l727>	4.2	2.5 í 2.5 * 10.5 «g/«l	1.0	5	0	0	0	0	(1	0
ANMP-CA9656 4EMP-TN7279	4,1	2,5 « 7,t »K/.l	l.o		0	0	0	0	0	0
ANMP-XC7274 ANNP-TN7279 ASNP-CAW56	5	1,75 J 1,75 * 15,6 eg/ol	1,0		0	0	0	0	0	0

Tabuľka 7

Reakcia koní po injekcii (jedinej injekcii) komplexných prípravkov (každý kôň dostal komplexy í. 4.1, 4.2 a 5 súčasne v oddelených injekciách na rôznych miestach)

Kosplci	ô.	Koncentrácia (g/«l) alebo (J obj.)	Obje· injekcie (1)	Počet vakci.novaných koní	Počet koní s «iestnyni reakciám	Počet koni s celkovými reakciami
bolesŕ	opuch/ zápal	vzrast teploty	strata chuti	narjšeríe pohybu	strata zvierat
ANMP-MG7274 AW-TM7279 AEMP-TH7279	4.2	3,0 í 3,0 í 18,5 ag/nl	OJ		0	0
AN71P-CA9656 AEMP-TN7279	4.1	3,0 í 15,6 ag/nl	0,5	3	0	9	0	0	0	0
A.W-NG7274 ANMP-TH7279 ASMP-CA9656	5	3,0 5 3,0 í 15,6	0,5		0	0

Tabuľka 8

Stav kože a osrstenia po injekcii komplexných antigénových prípravkov u bielych myší (telesná hmotnosť 12 až 14 g)

Kunpíex	č.	Koncentrácia (.g/.l) alebo (» obj.)	Injekcia (1)	Počet zvierat	Počet ívierat, ktoré vykazujú nasledujúci stav kože po vakcinácii	Počet zvierat, ktoré vykazujú nasledujúci stav osrstenia po vakcinácii
prvá	druhá	šupinatá	hladká	hladká a lesklá	strapatá a natná
AN1IP-MG7274 ANHP«TM7279 AEJIP-TM7279	4.2	2,S» 2,S J 10.! Bg/il	0.5	1.0	2	0	2	2	0
ANMP-CA9656 ΑΕΠΡ-ΤΜ7279	4.1	2,5 % 7,1 ng/nl	0,5	1.0	3		3	3	0
ANIMC72U ANBP-tM727S ASNP-CA9656		1,75 S 1,15 5 15,6 ng/nl	0,5	1,0	1			1	0
Nevakcínovanc								2	1

Tabuľka 9

Účinnosť vakcinácie rôznymi komplexnými prípravkami, stanovená u islandských koní, postihnutých letným ekzémom

Komplex	č.	Koncentrácia (g/ol) alebo (í obj.)	Objem injekcie (D	Počet injekcií	Počet vakcinovaných koní	štyri týždne po tretej vakcinácii: Počet koni vyliečených ]nevyliečených z letného ekzénu
ASNP-MG7274 ASHP-TM7279 ASNP-CA9656	1	10 ng/nl 10 ag/nl 10 ng/nl	1	J	3	3	0
AWP-NG7274 AMP-TN7279 ANHP-CA9656	2	1 » 1 » 1 >	1	3	3	0	3
AEMP-MG7274 AENP-TN7279 AEHP-CA9656	3	10 ng/nl 10 ng/nl 10 ng/nl	1	5	3	1	2

Tabuľka 10

Účinnosť vakcinácie rôznymi komplexnými prípravkami, stanovená u islandských koní, postihnutých letným ekzémom

Komplex	č.	Koncentrácia jednotlivých frakcií (mg/ml) alebo (í obj·)	Objem injekcie (ml)	Počet injekcií	Počet vakcinovaných koní	štyri týždne po tretej injekcii: počet koní vyliečených zo
svrbenia	ekzénu
ASMP-P1G7274 ASHP-TN7279 ASMP-CA9656	1	10 ng/nl 10 ng/nl 10 ng/nl	1	3	3	3	3
ANHP-HC7274 ANKP-TM7279 ANKP-CA9656	2	1 » 11 1 »	1	3	3	1	0
AEHP-HG7274 AEHP-TH7279 AEKP-CA9656	3	10 ng/nl 10 ng/nl 10 ng/nl	1	3	3	2	1
žiadny antigén (len Nosič A)	-	(kontrola)	1	3	3	0	0

Tabuľka 11

Bezpečnosť vakcinácie rôznymi antigénovými prípravkami, stanovená u islandských koní, postihnutých letným ekzé mom

Komplex	č.	Koncentrácia (-8/11) alebo (* obj.)	Objem injekcie (1)	Počet injekcií	’očet vakcino· vaných tôní	Počet koní s tiestnymi vedfajšíti účinkaní. pozorovanými 1 až 3 dni po prvej až tretej injekcii	’očet koni s celkovými vedľajšími účinkaní, pozorovanými 1 až 3 dni po prvej až tretej injekcii
opuch	bolesť	horúčka	strata chuti
ASBP-NC727Í ASMP-TX7279 ASMP-CA9656	1	10 ng/nl 10 ng/nl 10 ng/nl	1	J	3	0	0	3	0
AW-K7274 ABMP-TH7279 AW-U9Í56	2	1» H 1 J	1	3	3	0	0		0
AENP-HG7274 AEMP-TII7279 AEKP-CA96S6	3	10 eg/ml 10 ig/nl IH ng/nl	1	3		1	«	0	0
žiadny antigén (len Nosič A)		(kontrola)	1	3	3	e	0	0	c

Tabuľka 12

NMR-spektrá

Antigén, pripr.	acetát (ppm)	dublet aminokyseliny	tríplet asinekyseliny	Bultiplet sacharidy (pps)	izolované CH2 aminokyseliny	koncové acyl-CH aminokyseliny	aryl-H anínokys.
ASHP
»7274/ 9-18-1	1.92	CHJ (d,í,8 Hz) 1.33 pp>	CH3 (t,7.1 Hz) 1,18 ppo	3,2 až 4.3	1,7 až 3,45 ppn	0,95 ppn
(Obr. 4)		CHJ (d,7,S Hz) 1.48 ppi		4,9 až 5,4
					CH2(AcB,16 Hz) 2,7 pps/2,5 ppn
CA9656/ b)08	1,92	CHJ (d,7,0 Hz) 1.33 ΡΡ»	CH3 (t,7,1 Hz) 1,18 ppn	3,4 až 4,6	3,28 ppn	0,95 ppn
(Obr. 2)		CHJ (d,7,3 Hz) 1.48 ppi		4,9 až 5,24
TN7279/ 32-u-l-S	1,92	CHJ (d,7,1 Hz) 1.J3 pp®	CH3 (t,7,1 Hz) 1,18 ppn	3,5 až 4,35	2,1 až 3,3 ppm	0,85 až 0,95 ppn
(Obr. 1)		CH3 (d,7,1 Hz) 1,48 ppn		5,0 až 5,25
AENP
TH7279/ p32-5-l		CHJ (d,6,5 Hz) 1,33 ppfl		3,2 až 4,0?	1,6 až 3,12 pps
(Obr. t, A až C)		CH3 (d,7,5 Hz) 1,48 ppn				0,84 až 1,08 PP	7,15 · 7,9 PF®
				CH (d,8,2 Hz) 4,65
				CH (d,8,2 Hz) 5,23

ppm = part per million s = singlet

Obrázky 1 až 4:

NMR pokusy s ASMP a AEMP frakciami, ako sú znázornené na obr. 1 až 4, sa uskutočnili podľa nasledujúceho:

Spektrá sa získali v D₂O na 250 MHz BRUKER digitálnom NMR spektrometri (model DRX 400) s 1H-frekvenciou 400,13 MHz. Šírka rozmietania je 14,5 ppm, teplota okolia 300 K. Chemické posuny sa uvádzajú pomocou vzdialenosti rozpúšťadla.

Štandardné ’H-jednorozmerné spektrá sa získali s použitím príslušného BRUKER impulzového programu.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob prípravy antigénového materiálu, rozpustného vo vodných roztokoch, obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptid (ASMP), vyznačujúci sa t ý m , že sa bunky, húb ktoré patria ku skupine keratinofilných húb alebo kvasiniek, alebo materiál z nich:

   - sa opracuje zásaditým vodným roztokom,

   - tuhá a kvapalná fáza prípravku sa oddelia,

   - po oddelení sa na supernatant pôsobí minerálnou alebo organickou kyselinou, a

   - po oddelení sa ASMP vyzráža zo supematantu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na uvedené bunky húb alebo materiál z nich

   - sa pôsobí asi 0,1 až 5 % (hmotn./objem) KOH alebo NaOH pri asi 20 až 150 °C až do 30 h,

   - centrifugujú sa,

   - po centrifugovaní sa na supernatant pôsobí 0,2 až 1,5 M organickou kyselinou alebo 0,05 až 1 M minerálnou kyselinou,

   - po centrifugovaní sa na supernatant pôsobí vhodným organickým rozpúšťadlom alebo soľou, napríklad alkoholom, ako jc nižší alkanol, alebo síranom amónnym, a

   - zrazenina sa odoberie a, ak je to potrebné, rozpustí sa vo vodnom roztoku.
3. 3. Spôsob prípravy antigénového materiálu, nerozpustného vo vodných roztokoch, obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptid (ANMP), vyznačujúci sa tým, že bunky húb, ktoré patria ku skupine keratinofilných húb alebo kvasiniek, alebo na materiál z nich:

   - sa opracuje zásaditým vodným roztokom,

   - tuhá a kvapalná fáza prípravku sa oddelia, a

   - po oddelení sa na tuhú fázu pôsobí minerálnou alebo organickou kyselinou.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že na uvedené bunky húb alebo materiál z nich:

   - sa pôsobí asi 0,1 až 5 % (hmotn./objem) KOH alebo NaOH pri asi 20 až 150 °C až do 30 h,

   - na tuhú fázu sa pôsobí 0,2 až 1,5 M organickou kyselinou alebo 0,05 až 1 M minerálnou kyselinou, a

   - premyjú sa vodným roztokom.
5. 5. Spôsob prípravy antigénového exogénneho materiálu, obsahujúceho polysacharid a/alebo glykopeptid (AEMP), vyznačujúci sa tým, že bunky húb, ktoré patria ku skupine keratinofilných húb alebo kvasiniek, alebo materiál z nich:

   - sa kultivujú v kvapalnom médiu,

   - tuhá a kvapalná fáza prípravku sa oddelia, a

   - po oddelení sa AEMP vyzráža zo supematantu.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, žc

   - kultivácia trvá až do 250 h,

   - po oddelení tuhej a kvapalnej fázy sa k supematantu pridá alkohol, a

   - zrazenina sa odoberie a, ak je to potrebné, rozpustí sa vo vodnom roztoku.
7. 7. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že

   - po oddelení sa supernatant lyoftlizuje,

   - rozpusti sa vo vodnom roztoku,

   - po zrážaní s 1 až 5 objemovými dielmi alkoholu sa zrazenina rozpustí vo vodnom roztoku,

   - roztok sa lyofilizuje.
8. 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že uvedená keratinofilná huba patrí prinajmenšom k jednému z nasledujúcich rodov húb Trichophvton a/alebo Microsporum a/alebo uvedená kvasinka patrí k rodu Candida.
9. 9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že uvedená huba patrí ku ktorémukoľvek z nasledujúcich druhov húb:

   - Trichophvton equinum,

   - Trichophvton mentagrophvtes,

   - Trichophvton sarkisovii,

   - Trichophvton verrucosum.

   - Microsporum canis,

   - Microsporum gypseum, alebo

   - Candida albicans.
10. 10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že uvedená huba patrí ku ktorémukoľvek z nasledujúcich kmeňov húb:

    - Trichophvton equinum DSM č. 7276,

    - Trichophvton mentagrophvtes DSM č. 7279,

    - Trichophvton sarkisovii DSM č. 7278,

    - Trichophvton verrucosum DSM č. 7277,

    - Microsporum canis DSM č. 7281,

    - Microsporum canis var, obesum DSM č. 7280,

    - Microsporum canis var, distortum DSM č. 7275,

    - Microsporum gypseum DSM č. 7274, alebo

    - Candida albicans DSM č. 9656.
11. 11. Polysacharid a/alebo glykopeptid obsahujúci materiál s protialergickou účinnosťou pri cicavcoch, pričom uvedený materiál je pripraviteľný z keratinofilných húb alebo kvasiniek, alebo z materiálu z nich vhodnými izolačnými metódami podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.
12. 12. Antigénový materiál (ASMP), pripraviteľný podľa nároku 1 alebo 2 alebo ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.
13. 13. Antigénový materiál (ANMP), pripraviteľný podľa nároku 3 alebo 4 alebo ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.
14. 14. Antigénový materiál (AEMP), pripraviteľný podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7 alebo ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.
15. 15. Materiál podľa nároku 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ASMP z kmeňa T. mentagrophvtes DSM č. 7279, ASMP z kmeňa M. gypseum DSM č. 7274 a ASMP z kmeňa C. albicans DSM č. 9656.
16. 16. Materiál podľa nároku 11 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ANMP z kmeňa T. mentagrophvtes DSM č. 7279, ANMP z kmeňa M. gypseum DSM č. 7274 a ANMP z kmeňa C. albicans DSM č. 9656.
17. 17. Materiál podľa nároku 11 alebo 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuje AEMP z kmeňa T. mentagrophvtes DSM č. 7279, AEMP z kmeňa M. gypseum DSM č. 7274 a AEMP z kmeňa C. albicans DSM č. 9656.
18. 18. Materiál, vyznačujúci sa tým, že obsahuje akúkoľvek kombináciu materiálov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 17.
19. 19. Materiál podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ASMP a AEMP.
20. 20. Materiál podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ASMP a AEMP a ANMP.
21. 21. Materiál podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že obsahuje AEMP a ANMP.
22. 22. Materiál podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ASMP a ANMP.
23. 23. Vakcína, obsahujúca materiál podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 22.
24. 24. Vakcína, obsahujúca materiál podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 23 spolu s vhodným fyziologickým nosičom.
25. 25. Roztok na injekcie, obsahujúci materiál podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 24.
26. 26. Materiál podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 na farmaceutické použitie.
27. 27. Použitie materiálu, obsahujúceho polysacharidy a/alebo glykopeptidy, získaného alebo získateľného z keratinofilných húb alebo kvasiniek, na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu a/alebo liečenie alergie.
28. 28. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu a/alebo liečenie alergie.
29. 29. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 na prípravu farmaceutického výrobku na modulovanie imunitnej odpovede.
30. 30. Mikroorganizmus druhu Candida albicans, ako je deponovaný v DSM pod prístupovým číslom 9656, a jej mutanty, ktoré majú nízku patogenitu a ktoré tiež poskytujú materiál podľa nároku 11.
31. 31. Materiál podľa nároku 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ASMP z kmeňa M. gypseum DSM č. 7274 a ASMP z kmeňa C. albicans DSM č. 9656.
32. 32. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 alebo 31 na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu alebo liečenie letného ekzému.
33. 33. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 alebo 31 na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu alebo liečenie alopécie.
34. 34. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 alebo 31 na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu alebo liečenie ekzému.
35. 35. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 alebo 31 na prípravu farmaceutického výrobku na profylaxiu alebo liečenie neurodermatitídy.
36. 36. Použitie materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 25 alebo 31 na prípravu farmaceutického výrobku na zlepšenie osrstenia cicavca.