RU2660365C1 - Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов - Google Patents
Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660365C1 RU2660365C1 RU2015149700A RU2015149700A RU2660365C1 RU 2660365 C1 RU2660365 C1 RU 2660365C1 RU 2015149700 A RU2015149700 A RU 2015149700A RU 2015149700 A RU2015149700 A RU 2015149700A RU 2660365 C1 RU2660365 C1 RU 2660365C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- patients
- yeast
- candidiasis
- fungi
- serum
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims abstract description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 claims abstract description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 claims abstract description 7
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 241000223233 Cutaneotrichosporon cutaneum Species 0.000 claims abstract description 6
- 244000168141 Geotrichum candidum Species 0.000 claims abstract description 6
- 235000017388 Geotrichum candidum Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 abstract description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 3
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001527609 Cryptococcus Species 0.000 description 2
- 206010017523 Fungaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000159512 Geotrichum Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 2
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000273930 Brevoortia tyrannus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000000785 Invasive Pulmonary Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 241000555688 Malassezia furfur Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 206010054979 Secondary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 101150063569 slgA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения специфического белоксодержащего антигенного препарата из клинически значимых дрожжевых грибов. Для этого осуществляют культивирование дрожжей Candida albicans, либо Geotrichum candidum, либо Rhodotorula mucilaginosa, либо Cryptococcus neoformans, либо Trichosporon cutaneum в жидкой синтетической питательной среде. Затем клетки отделяют центрифугированием и фильтрацией, а бесклеточную культуральную жидкость лиофилизируют, стандартизуют по концентрации белка и используют в иммунохимических реакциях для определения уровня специфических антител к данным возбудителям микозов. Проводят анализы методами преципитации, ИФА с сыворотками крови пациентов с кандидамикозом. Перед стандартизацией дополнительно культуральную жидкость освобождают от полисахаридов и гликопротеинов путем многократного замораживания-оттаивания и проводят молекулярную фильтрацию через молекулярный фильтр с диаметром пор 100 кДа. О специфичности полученного антигенного препарата делают вывод при одном из условий, что: фракции антигенов с молекулярной массой ниже 100 кДа из видов дрожжей Candida albicans, либо Geotrichum candidum, либо Rhodotorula mucilaginosa, либо Cryptococcus neoformans, либо Trichosporon cutaneum взаимодействуют только с гомологичными сыворотками больных кандидамикозом, но не взаимодействует с сыворотками больных кандидамикозом другого рода дрожжевых грибов; уровни специфических антител к антигенному препарату у пациентов выше, чем в контрольной группе пациентов без кандидамикоза. Использование данного изобретения позволяет получить специфические белоксодержащие препараты из нескольких родов клинически значимых дрожжевых грибов, что дает возможность определить уровень специфических сывороточных и эпителиальных иммуноглобулинов при дифференциальной диагностике микозов и микоаллергозов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии и предназначено для определения уровня специфических антител различных классов в клинических образцах сыворотки крови и различных секретов посредством взаимодействия действия данных образцов со специфическими антигенными препаратами, получаемыми из культур клинически значимых дрожжевых грибов. Данный подход позволяет получить препараты, содержащие специфические белоксодержащие антигенные субстанции клинических дрожжевых грибов, и определить уровень специфических антител к Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon cutaneum и Geotrichum candidum как маркера состояния гуморального иммунитета и глубины инфекционного процесса.
В последние десятилетия наблюдается интенсивное развитие клинической микологии, поскольку на фоне растущего числа вторичных иммунодефицитных состояний и антибиотикотерапии все более широкое распространение получают заболевания, ассоциированные с грибковой, в частности, дрожжевой микрофлорой. Основные усилия медицинских микологов традиционно сосредоточены на наиболее известных возбудителях микозов - Candida albicans и Cryptococcus neoformans [Mayer, F.L. et al., 2013 - https://integrity.thomson-pharma.com/integrity/xmlxsl/PK_BGR_LIST.xml_backgrounder?p_id=29#REF2103714; Cogliati, M., 2013 - https://integrity.thomson-pharma.com/integrity/xmlxsl/PK_BGR_LIST.xml_backgrounder?p_id=30#REF2123483], в то время как, с каждым годом все новые представители микобиоты переходят из разряда сапротрофов или симбионтов в разряд оппортунистов [Yapar, N., 2014 - https://integrity.thomson-pharma.com/integrity/xmlxsl/PK_BGR_LIST.xml_backgrounder?p_id=29#REF2150148]. В течение 15 лет нами собрана коллекция изолятов, среди которых физиолого-биохимическими и молекулярными методами идентифицировано 7 родов клинически значимых дрожжевых грибов [Арзуманян В.Г., 2002].
Средой обитания этих дрожжей являются все виды эпителия, в том числе - кожа. В норме на коже обитают дрожжи рода Malassezia, а в вагинальном тракте и кишечнике - некоторые виды рода Candida. У иммунокомпрометированных носителей многие виды дрожжей ассоциированы с фунгемиями, а некоторые - с аллергомикозами. Роль дрожжей в провокации аллергических заболеваний достоверно установлена пока лишь для трех наиболее известных видов - Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae и Malassezia furfur. С сенсибилизацией к этим видам связаны такие заболевания, как бронхиальная астма, аллергический бронхолегочный микоз, атонический дерматит и аллергический ринит. Реже в этих нозологических формах могут принимать участие также дрожжи родов Geotrichum, Trichosporon и Rhodotorula.
Определение защитных антител различных классов (иммуноглобулинов) является традиционным подходом при диагностике инфекционных заболеваний, поскольку именно с уровнем антител связывают наличие и степень заболевания. Качественная диагностика фунгемий и аллергомикозов предполагает наличие панели высокоспецифичных и стандартизованных дрожжевых антигенов. На данный момент в России не производят препараты антигенов (аллергенов) из дрожжей. За рубежом коммерческий способ получения аллергенов заключается в деструкции клеток дрожжей [Savolainen J. et al., Allergy. 53(4):359-66,1998; Kosonen J. et al, Experimental Dermatology, V. 14, P. 551, 2005; Dojnov B. et al, J. Clinical Laboratory Analysis. 21(6):406-12, 2007]. В результате этого экстракт обогащается неспецифическими маннановыми компонентами, ответственными за перекрестную антигенную реактивность между различными родами дрожжей, что приводит к ложноположительным результатам диагностики. Перспективными считаются рекомбинантные методы получения аллергенов [Zargari A. et al, J. Allergy & Clin. Immunology. - 1999. - V. 103. - N5(1). - P. 877-884; Elguezabal N. et al, Mycopathologia 2005, Volume 160, Issue 2, pp 97-109], однако, они являются дорогостоящими и не обеспечивают полного набора специфических белков.
Наиболее важными в антигенном отношении являются поверхностные компоненты клеток дрожжей, поскольку именно поверхность микробной клетки является той материей, которая непосредственно взаимодействует с клетками и антителами иммунной системы хозяина [Mochon А.В. et al, PLoS Pathogens. 6(3):e1000827, 2010]. Метод выделения поверхностных белков путем экстракции клеток детергентом был апробирован нами на дрожжах Malassezia, а специфичность полученного препарата была установлена иммунологическими методами на сыворотках больных атопическим дерматитом [Арзуманян В.Г. с соавт., Бюллетень эксперим. биологии и медицины", 2000 - N11 - С. 548-551]. Применение данного метода к прочим клиническим дрожжам показало, что получаемые препараты не являются высокоспецифичными, поскольку при обработке клеток детергентом нарушается целостность мембраны цитоплазмы, и в экстракт попадают перекрестно реагирующие белки.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является метод, который более совершенен за счет использования не клеточной биомассы, а внеклеточной культуральной жидкости, что значительно повысило специфичность получаемых препаратов [Arzumanian V.G. et al, Biochem. Physiol., 2013, 2:3 - http://dx.doi.org/10.4172/2168-9652.1000116].
Однако для дальнейшего повышения специфичности требовалось удалить высокомолекулярные полисахариды и гликопротеины, которые, наряду с поверхностными белками, слущиваются с поверхности клеток при культивировании. Для этого после стадии лиофилизации культуральной жидкости мы ввели еще стадию многократного замораживания-оттаивания, при котором полисахариды постепенно уходят в осадок, а также стадию фильтрования через молекулярный фильтр с диаметром пор 100 кДа.
Задачей изобретения является способ получения специфических белоксодержащих антигенных препаратов, позволяющий достоверно определить уровень специфических антител к нескольким родам клинически значимых дрожжевых грибов.
Техническим результатом изобретения является возможность получить специфические белоксодержащие препараты из нескольких родов клинически значимых дрожжевых грибов (Candida, Cryptococcus, Geotrichum, Trichosporon и Rhodotorula, вместо обычных двух - Candida и Cryptococcus), что позволяет определить уровень специфических сывороточных и эпителиальных иммуноглобулинов при дифференциальной диагностике микозов и микоаллергозов.
К техническому результату заявленного способа также относятся: удаление основного количества полисахаридов и следовых количеств полисахаридов.
Указанные задача и технический результат решаются способом получения специфических белоксодержащих антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов, заключающимся в том, что в качестве образца осуществляют культивирование дрожжей Candida albicans в жидкой синтетической питательной среде, затем клетки отделяют центрифугированием и фильтрацией, а бесклеточную культуральную жидкость лиофилизируют, стандартизуют по концентрации белка и используют в иммунохимических реакциях для определения уровня специфических антител к данным возбудителям микозов, проводя анализы методами преципитации, ИФА с сыворотками крови пациентов с кандидамикозом, отличающийся тем, что перед стандартизацией дополнительно культуральную жидкость освобождают от полисахаридов и гликопротеинов путем многократного замораживания-оттаивания и проводят молекулярную фильтрацию через молекулярный фильтр с диаметром пор 100 кДа, причем о специфичности полученных антигенных препаратов делают вывод при одном из условий, что:
- фракции антигенов с молекулярной массой ниже 100 кДа из прочих видов дрожжей не взаимодействовали ни с одной из сывороток больных кандидамикозом;
- уровни специфических антител к антигенному препарату у пациентов в среднем или в разы выше, чем в контрольной группе;
белковые фракции антигенов ниже 100 кДа из нескольких родов клинически значимых дрожжевых грибов взаимодействуют только со своими (т.е. гомологичными) сыворотками, но не взаимодействуют с прочими сыворотками.
Данные антигенные препараты получают также из дрожжей Geotrichum candidum, либо Rhodotorula mucilaginosa, либо Cryptococcus neoformans, либо Trichosporon cutaneum. Получаемые антигены используют в реакциях с секретами эпителиальных тканей. Удаление основного количества полисахаридов достигают за счет применения дополнительной стадии многократного замораживания-оттаивания, а использование дополнительной стадии фильтрования через молекулярный фильтр с диаметром пор 100 кДа позволяет проводить удаление следовых количеств полисахаридов.
Осуществление изобретения
Способ был реализован для разных типов иммунологических реакций. Ниже показаны апробированные примеры реализации способа.
Пример 1. Реакция преципитации в геле агарозы.
В пластиковые чашки Петри диаметром 4 см вносили по 2 мл расплавленного раствора 1% агарозы и после застывания делали пробойником лунки - одну в центре и 3 радиальных.
Для реакции преципитации все антигенные препараты уравнивали по белку до концентрации 3 мг/мл и с помощью нитроцеллюлозной мембраны разделяли на 2 фракции по молекулярному весу: <100 кДа и >100 кДа. В центральную лунку каждой чашки вносили по 10 мкл растворов дрожжевых антигенов.
Сыворотку 1 получали от пациента в возрасте 67 лет с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которого отмечена обильная обсемененность мокроты грибами Candida albicans. Сыворотку 2 получали от пациента, больного атопическим дерматитом (АД), в возрасте 6 лет, у которого отмечена обильная обсемененность лихенифицированной кожи дрожжевыми грибами Rhodotorula mucilaginosa. Контрольная сыворотка была получена от мужчины в возрасте 24 лет, не страдающего микозом и микоаллергозом. Сыворотки разводили в 40 раз и по 10 мкл вносили в радиальные лунки. Чашки с агарозой инкубировали при комнатной температуре в течение 19 часов, после чего учитывали результаты. За 0 принимали отсутствие полосы преципитации, за 1 - наличие слабой полосы преципитации, за 2 - наличие интенсивной полосы преципитации. Результаты взаимодействия приведены в таблице 1.
Из данных таблицы можно заключить, что:
- белковые фракции антигенов из Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa взаимодействовали только со своими (гомологичными) сыворотками, но не взаимодействовали с прочими двумя сыворотками; это свидетельствует о специфичности полученных белковых антигенов;
- гликопротеиновые (выше 100 кДа) фракции антигенов из Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa взаимодействовали как со своей сывороткой, так и с сывороткой больного - носителя Rhodotorula, но не взаимодействовали с контрольной сывороткой; это свидетельствует о наличии перекрестов на уровне полисахаридной фракции;
- обе фракции антигенов из прочих видов дрожжей не взаимодействовали ни с одной из сывороток, что свидетельствует о специфичности полученных антигенных препаратов.
Пример 2. Иммуноферментный анализ.
Сыворотки пациентов 1 группы получали от 6 человек с ХОБЛ в возрасте 67-73 года, у которых имелась значительная обсемененность мокроты грибами Candida albicans. Сыворотки пациентов 2 группы получали от 6 больных АД в возрасте 6-27 лет без высева грибов с поверхности кожи. Контрольные сыворотки получали от 6 женщин в возрасте 24-68 лет, не страдающих микозами и микоаллергозами.
Антигенные препараты фракции <100 кДа разводили до концентрации белка 10 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,6 и в ячейки плоскодонной планшеты вносили по 100 мкл этих растворов, после чего инкубировали 1 час при 37 градусах и ночь в холодильнике. Утром планшеты трижды промывали с фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и вносили по 100 мкл сывороток, разведенных в соответствующее число раз в ФСБ, после чего инкубировали 1 час при 37 градусах и трижды промывали ФСБ. Затем вносили по 100 мкл конъюгата (анти-IgG человека фирмы «Sigma») в разведении 1:400 и инкубировали 1 час при 37 градусах, промывали трижды с ФСБ и вносили по 100 мкл ТМБ. Через 15 мин реакцию останавливали, внося в ячейки по 50 мкл 2 н HCl. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре при длине волны 450 нм.
Примеры типичных зависимостей оптической плотности (уровня антител) от разведения сывороток приведены на Фиг. 1-Фиг. 3.
На Фиг. 1 показан ИФА с сывороткой пациента с ХОБЛ с высевом C. albicans*
*абсцисса - кратность разведения сыворотки, ордината - ОП 450.
На Фиг. 2 показан ИФА с сывороткой пациента с АД с высевом R. mucilaginosa.
На Фиг. 3 показан ИФА с контрольной сывороткой.
Из них видно, что все три сыворотки содержали антитела к антигенному препарату из C. albicans, однако, при значительных разведениях сывороток - в 500-1000 раз - имели место значительные различия в уровнях ОП. Сыворотка пациента с АД, у которого высевались грибы R. mucilaginosa, содержала заметно более высокие уровни антител к этим грибам, чем две другие сыворотки.
Далее приводятся усредненные данные по 18 сывороткам, которые проверяли методом ИФА при разведении в 500 раз.
Из данных таблицы 2 можно сделать следующие выводы:
- уровень IgG-антител к Candida albicans у пациентов с ХОБЛ, являющихся носителями этих дрожжей, в 2-3 раза превышает таковой в группах, где обследуемые не были носителями, что свидетельствует о специфичности полученных антигенных препаратов;
- уровень IgG-антител к Candida albicans в группе пациентов с ХОБЛ в 4-8 раз превышает таковой к остальным грибам в данной группе, что также может свидетельствовать в пользу специфичности полученных препаратов;
- наличие IgG-антител к Candida albicans в сыворотках всех групп обследованных можно объяснить более частыми контактами людей с данным видом грибов.
Важно отметить, что обсемененность мокроты дрожжами C. albicans в изученной группе пациентов с ХОБЛ значительно коррелировала с уровнем IgG-антител к этим грибам - коэффициент корреляции r=0,629.
Пример 3. Дот-блот анализ.
Образцы вагинального отделяемого (ВО) получали от 6 пациенток с острым первичным вульвовагинальным кандидозом (ВВК) в возрасте от 22 до 37 лет; контрольная группа состояла из 6 женщин такого же возраста без симптомов ВВК. Образцы собирали с помощью тампонов OBI "normal", которые затем элюировали точным объемом дистиллированной воды, полученный элюат фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (удаление микрофлоры), фильтрат лиофильно высушивали, растворяли в минимальном объеме воды и использовали для дот-блот анализа. Антиген С.albicans с содержанием белка 1 мг/мл наносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,2 мкм фирмы Whatman по 0,8 мкл в точку, высушивали и отмывали ФР + Tween-20 (0,1%) и 3 раза дистиллированной водой. Затем мембраны с дотами инкубировали 30 мин с 80 мкл блокирующего раствора (ЗФР с 10% сыворотки крупного рогатого скота), после чего к ним добавляли по 20 мкл образцов ВО. Инкубировали в течение ночи.
По окончании инкубации жидкость удаляли, мембраны промывали, как описано выше и добавляли по 100 мкл конъюгатов в блокирующем растворе. Конъюгаты: при определении s-IgA - мышиные моноклональные антитела к s-IgA человека, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:250; при определении IgG - мышиные моноклональные антитела к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:5000. Инкубировали 1 час. По окончании инкубации жидкость удаляли, лунки с мембранами промывали, как описано выше. Затем обрабатывали проявляющим раствором, содержащим перекись водорода, ТМБ и преципитирующий реагент. Проявляли 15-20 мин. Уровни антител в ВО выражали в баллах в зависимости от яркости получаемого пятна: отсутствие пятна - 0 баллов, слабое пятно - 1 балл, и т.д. до 5 баллов.
Результаты представлены в таблице 3.
Кроме уровней IgG и slgA антител в таблице имеются данные по максимальному наблюдаемому в микроскоп числу клеток Candida sp. в неокрашенном мазке в одном поле зрения при увеличении ×1750.
По результатам таблицы 3 можно заключить:
- уровни специфических антител к антигенному препарату из C. albicans в ВО у пациенток с ВВК в среднем значительно выше, чем в контрольной группе, что может свидетельствовать в пользу специфичности полученного препарата;
- уровни специфических антител к антигенному препарату из C. albicans коррелируют с обсемененностью вагины этими грибами.
Claims (4)
1. Способ получения специфического белоксодержащего антигенного препарата из клинически значимых дрожжевых грибов, заключающийся в том, что осуществляют культивирование дрожжей Candida albicans, либо Geotrichum candidum, либо Rhodotorula mucilaginosa, либо Cryptococcus neoformans, либо Trichosporon cutaneum в жидкой синтетической питательной среде, затем клетки отделяют центрифугированием и фильтрацией, а бесклеточную культуральную жидкость лиофилизируют, стандартизуют по концентрации белка и используют в иммунохимических реакциях для определения уровня специфических антител к данным возбудителям микозов, проводя анализы методами преципитации, ИФА с сыворотками крови пациентов с кандидамикозом, отличающийся тем, что перед стандартизацией дополнительно культуральную жидкость освобождают от полисахаридов и гликопротеинов путем многократного замораживания-оттаивания и проводят молекулярную фильтрацию через молекулярный фильтр с диаметром пор 100 кДа, причем о специфичности полученного антигенного препарата делают вывод при одном из условий, что:
- фракции антигенов с молекулярной массой ниже 100 кДа из видов дрожжей Candida albicans, либо Geotrichum candidum, либо Rhodotorula mucilaginosa, либо Cryptococcus neoformans, либо Trichosporon cutaneum взаимодействуют только с гомологичными сыворотками больных кандидамикозом, но не взаимодействует с сыворотками больных кандидамикозом другого рода дрожжевых грибов;
- уровни специфических антител к антигенному препарату у пациентов выше, чем в контрольной группе пациентов без кандидамикоза.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получаемые антигены используют в реакциях с секретами эпителиальных тканей.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149700A RU2660365C1 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149700A RU2660365C1 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2660365C1 true RU2660365C1 (ru) | 2018-07-05 |
Family
ID=62815579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015149700A RU2660365C1 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2660365C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997007232A1 (en) * | 1995-08-11 | 1997-02-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Antigenic preparations |
| RU2311197C1 (ru) * | 2006-09-22 | 2007-11-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий |
| RU2533815C1 (ru) * | 2013-09-09 | 2014-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий |
-
2015
- 2015-11-20 RU RU2015149700A patent/RU2660365C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997007232A1 (en) * | 1995-08-11 | 1997-02-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Antigenic preparations |
| RU2311197C1 (ru) * | 2006-09-22 | 2007-11-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий |
| RU2533815C1 (ru) * | 2013-09-09 | 2014-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ARZUMANYAN V. et al. Physiological Parameters of Clinical Yeasts Growth and Isolation of Specific Antigens // Biochemistry & Physiology: Open Access, [он-лайн], [найдено 12.09. 2016]. Найдено из Интернет: URL: http://www.omicsgroup.org/journals/physiological-parameters-of-clinical-yeasts-growth-and-isolation-of-specific-antigens-2168-9652.1000116.php?aid=17490>. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Biava et al. | Laboratory diagnosis of cystic hydatic disease | |
| Poulain et al. | Antigenic variability of Candida albicans | |
| US20080187988A1 (en) | Cytoplasmic antigens for detection of candida | |
| US4029756A (en) | Serological procedure for determining presence of neisseria gonorrhoeae antibodies | |
| DE4139840A1 (de) | Antigen-zubereitung zum nachweis von h. pylori | |
| CN112014565B (zh) | 一种检测红色毛癣菌的试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法 | |
| CN102703388B (zh) | 抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒 | |
| JP5054426B2 (ja) | 抗β−１，３−グルカン・モノクローナル抗体 | |
| JP5054425B2 (ja) | 抗β−１，６−グルカン・モノクローナル抗体 | |
| Fruit et al. | Expression of an epitope by surface glycoproteins of Candida albicans. Variability among species, strains and yeast cells of the genus Candida | |
| RU2660365C1 (ru) | Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов | |
| CA1050423A (en) | Gonococcal pili, processes for the preparation thereof | |
| Campbell | Serology in the respiratory mycoses | |
| US4696896A (en) | Gonococcal Pili processes for the preparation thereof and the use thereof for the detection of and prevention of infections caused by Neisseria gonorrhoeae | |
| CN102081091A (zh) | 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法 | |
| CN102081092A (zh) | 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法 | |
| CN113406325A (zh) | 一种灰霉病病原菌灰葡萄孢菌间接elisa检测试剂盒 | |
| Chakraborty et al. | Serological detection and immunogold localization of cross‐reactive antigens shared by Camellia sinensis and Exobasidium vexans | |
| WO2021056906A1 (zh) | 杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用 | |
| CN111579780A (zh) | 一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法 | |
| López-Ribot et al. | A comparative study on cell wall antigens and cell surface hydrophobicity in clinical isolates of Candida albicans | |
| WO2018170875A1 (zh) | 一种基因纳米锚定和微流体免疫凝集技术的宠物防诊方法 | |
| WO2023245801A1 (zh) | 一种抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体及其应用 | |
| KR100254414B1 (ko) | 항-결핵균 항체 및 나균 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트 | |
| Hiremath et al. | Rapid diagnosis of sugarcane red rot by Dot-immunobinding assay (DIBA) technique |