SK282537B6 - Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie Download PDF

Info

Publication number
SK282537B6
SK282537B6 SK1129-95A SK112995A SK282537B6 SK 282537 B6 SK282537 B6 SK 282537B6 SK 112995 A SK112995 A SK 112995A SK 282537 B6 SK282537 B6 SK 282537B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
hydrogen
substituted
hydroxy
pharmaceutically acceptable
tryptase
Prior art date
Application number
SK1129-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK112995A3 (en
Inventor
Kerry Spear
Charles Johnson
Heinz W. Gschwend
Original Assignee
Axys Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Axys Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Axys Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SK112995A3 publication Critical patent/SK112995A3/sk
Publication of SK282537B6 publication Critical patent/SK282537B6/sk

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06086Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095Arg-amino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16Otologicals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08Antiallergic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06086Dipeptides with the first amino acid being basic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a jej soľ, ktorý spolu s farmaceuticky prijateľným nosičom vytvára farmaceutický prostriedok na liečenie imunitou spôsobených zápalových ochorení, najmä súvisiacich s dýchacím traktom. Inhibítor tryptázy môže byť v roztoku nosiča, v roztoku aerosolovateľného farmaceuticky prijateľného netoxického nosiča, alebo v suchom prášku. Ďalej je opísané použitie inhibítora tryptázy na prípravu liečiva na inhaláciu a intravazálnu aplikáciu na liečenie alergickej nádchy a astmy.ŕ

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa všeobecne týka inhibítora tryptázy alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, farmaceutického prostriedku s jeho obsahom na liečenie imunitou spôsobených zápalových ochorení, najmä zápalových ochoreni dýchacích ciest, ako astmy a alergickej nádchy. Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú predovšetkým vhodné na prevenciu alebo liečenie pokročilej fázy broncho-konštrikcie a hypersenzitivity dýchacích ciest spojených s chronickou nádchou.
Doterajší stav techniky
Astma je komplexné ochorenie, spôsobené vzostupom hladiny biochemických mediátorov. Prejavy tohto ochorenia sú akútne aj chronické. Astma sa často prejavuje progresívnym rozvojom hypersenzitivity trachey a bronchov tak vzhľadom k itnunošpecifickým alergénom, ako aj k rôznym chemickým a fyzikálnym podnetom. Hypersenzitivita tkaniva astmatických bronchov je považovaná za následok chronických zápalových reakcií, ktoré dráždia a poškodzujú epitel povrchu dýchacích ciest a podporujú patologické hrubnutie podpovrchových tkanív. Štúdie bronchiálnej biopsie ukázali, že stáli pacienti s miernou astmou majú na stenách dýchacích ciest známky zápalu.
Jedným z iniciátorov zápalového procesu je alergická odpoveď na vdýchnuté alergény. Leukocyty, ktoré nesú IgE receptory, väčšinou mastocyty a bazofily, ale tiež monocyty, makrofágy a eozinofily, sú prítomné v epiteli a podpovrchových tkanivách hladkých svalov bronchov. Tam sa začína ich aktivácia väzbou špecifických vdýchnutých antigénov na IgE receptory. Aktivované mastocyty uvoľnia množstvo aktívnych alebo primárnych chemických mediátorov zápalovej reakcie a enzýmov. Okrem toho vzniká mnoho sekundárnych mediátorov zápalu in situ enzýmovou reakciou aktivovaných mastocytov, konkrétne superoxidy a mediátorov odvodených od lipidov. Degranuláciou mastocytov ďalej vznikajú niektoré veľké molekuly: proteoglykány, peroxidáza, arylsulfatáza B a proteázy - tryptáza a chemotryptická proteináza (chy-máza), pozri „Drug Therapy of Asthma“, kap.62, 1054-54.
Toto uvoľnenie chemických látok z mastocytov je pravdepodobne príčinou včasnej bronchokonštrikcie. Táto reakcia sa objavuje u hypersenzitívnych osôb po expozícii alergénmi, rozptýlenými vo vzduchu. Včasná astmatická reakcia je maximálne 15 minút po expozícii alergénom, zlepšenie nastáva za jednu až dve hodiny. V 25 až 35 % prípadov po včasnej astmatickej reakcii nasleduje ďalší pokles dýchacích funkcií, ktorý začína po niekoľkých málo hodinách a je maximálny medzi 6. a 12. hodinou po expozícii. Táto neskorá astmatická reakcia je sprevádzaná znateľným zvýšením počtu zápalových buniek, ktoré prenikajú hladkým svalstvom bronchov a tkanív epitelu a vylievajú sa do dýchacích ciest. Medzi tieto bunky patria eozinofily, neutrofily a lymfocyty. Bunky sú priťahované chemo taktickým i látkami, uvoľnenými z mastocytov. Prenikajúce bunky sa aktivujú počas neskorej fázy reakcie. Neskorá astmatická odpoveď je považovaná za sekundárnu zápalovú reakciu čiastočne spôsobenú sekrečnou aktivitou makrofágov.
Zodpovedajúci súbor zápalových reakcií sa objavuje tiež vo vrchnej mukóze, zvyčajne ako odpoveď na alergény, rozptýlené vo vzduchu. Rovnako ako pri astme sa mastocyty aktivujú krížovou väzbou molekúl IgE a špecifických antigénov. Pri alergickej trvalej alebo vazomotorickej nádche sa mastocyty aktivujú aj bej expozície partikulárnymi antigénmi. Aj v tomto prípade uvoľňujú mastocyty degranuláciou primárne a sekundárne mediátory zápalu. Do miesta, kde prebiehajú tieto procesy, sú priťahované eozinofily a makrofágy a rozvíjajú zápalovú reakciu. V neskorej fáze reakcie sa často objavuje deštrukcia nosového epitelového tkaniva.
Tryptáza je najvýznamnejšia proteáza, ktorú produkujú ľudské mastocyty. Zúčastňuje sa prípravy neuropeptidov a tkanivového zápalu. Ľudská tryptáza je glykosolovaný, heparínom spojený tetramér. Skladá sa zo 4 heterogénnych katalytických podjednotiek. Aminokyse-linová sekvencia monoméru tryptázy, rovnako ako jej génová štruktúra, sa nepodobajú žiadnej z mnohých proteáz, ktorých štruktúra bola charakterizovaná, pozri „Vanderslice a kol. (1990): Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 3811 - 31815“; „Miller a kol. (1990): J. Clin. Invest. 86: 864 - 870“; „Miller a kol. (1989): J. Clin Invest. 84: 1188 - 1195“; a „Vanderslice a kol. (1989): Biochemistry 28: 4148 - 4155“.
Tryptáza je skladovaná v sekrečných granuliach mastocytov. Po aktivácii mastocytov môžeme prítomnosť tryptázy ľahko zmerať v rôznych biologických tekutinách. Napríklad po anafylaxii sa tryptáza objaví v krvnom riečišti, kde zostáva prítomná niekoľko hodín, pozri „Schwartz a kol. (1987): N. Engl. J. Med. 316: 1622 až 1626“. Jej prítomnosť bola zistená vo vzorkách tekutiny po výplachu nosa a pľúc po expozícii špecifickým antigénom. Pozri „Castells a Schwartz (1988): J. Allerg> Clin. Immunol. 82: 348-355“ a „Wenzel a kol. (1988): Am. Rev. Resp. Dis. 141: 563 - 568“. Hladiny tryptázy v tekutine po výplachu pľúc atopického astmatika sú zvýšené po endobronchiálnej stimulácii alergénom. Niektorí fajčiari cigariet majú významne zvýšené hladiny tryptázy v tekutine po výplachu pľúc v porovnaní so skupinou nefajčiarov. To podporuje hypotézu, že uvoľnenie proteázy z aktivovaných mastocytov môže prispievať k deštrukcii pľúc u fajčiarov. Pozri „Kalendarian a kol. (1988): Chest 94: 119-123“. Okrem toho sa ukázalo, že tryptáza je potenciálnym mutagénom pre fibroblasty, čo svedčí ojej účasti pri pľúcnej fibróze a intersticiálnych pľúcnych ochoreniach. Pozri „Ruoss a kol. (1991): J. Clin. Invest. 88: 493-499“.
Tryptáza sa zúčastňuje na rôznych biologických procesoch, vrátane degradácie vazodilatačných a bronchorelaxačných neuropeptidov, (pozri „Caughey a kol. (1988): J. Pharmacol. Exp. Ther. 244: 133 - 137“; „Franconi a kol. (1988): J. Pharmacol. Exp. Ther. 248: :947 - 951“: a „Tam a kol. (1990): Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 3: 27 - 32“) a tlmenie citlivosti bronchov proti histamínu (pozri „Sekizawa a kol., (1989): J. Clin. Invest. 83: 175 - 179“). Tieto štúdie ukazujú, že tryptáza zrejme zvyšuje bronchokonštrikciu pri astme tým, že ničí bronchodilatačné peptidy.
Ďalej sa ukázalo, že tryptáza štiepi -reťazce fibrinogénu, rovnako ako kininogény s vysokou molekulárnou hmotnosťou za vzniku kininov a má teda spolu s heparínom úlohu lokálneho koagulantu. Schopnosť tryptázy aktivovať prostromelyzín (pro-MMP-3) a prokolagenázu (pro-MMP-1) cez MMP-3 svedči o tom, že tryptáza sa tiež zúčastňuje procesu tkanivového zápalu a premien. Pri tomto pozorovaní bolo tiež zistené, že tryptáza hrá úlohu pri deštrukcii kĺbu pri reumatickej artritíde. Okrem toho tryptáza štiepi peptidy geneticky podobné s kalcitonínom. Pretože tento peptid sa zúčastňuje v procese neurogénneho zápalu, tryptáza je faktorom regulácie kožné2 ho neurogénneho zápalu, pozri „Caughey (1991): Am. J. Respir. Celí Mol. Bio 1.4: 387 - 394“.
Astma sa stala najrozšírenejším chronickým ochorením v priemyselných krajinách. Pri liečení astmy alebo ďalších chorôb spôsobených imunitou, sa konvenčné metódy a terapeutické prostriedky ukázali ako málo účinné. Z toho dôvodu bolo žiaduce poskytnúť dokonalejšie prostriedky a metódy, ktoré odstránia nevýhody týchto konvenčných prostriedkov a metód a umožnia účinnú liečbu týchto chorôb.
Podstava vynálezu
Podstatou predkladaného vynálezu je inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ všeobecného vzorca (I)
(D, členný heterocyklus a R5 je vodík, pričom každý uvedený heterocyklus môže byť ďalej substituovaný hydroxylom a
R7 je -OR8 alebo -NR8R9, kde R8 a R9 sú nezávisle vybrané zo skupiny skladajúcej sa z vodíka, rozvetveného alebo priameho alkylového reťazca majúceho 1 až 6 atómov uhlíka, alebo l-aminokarbonyl-2-fenyletylu, alebo R8 a R9 spolu s dusíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 5-členný alebo 6-členný hetero-cyklus, pričom každý uvedený heterocyklus môže byť ďalej substituovaný aminokarbonylom.
Výhodne v inhibítore tryptázy Ar je 1-hydroxy-2-naftyl, 2-hydroxy-l-naftyl, 3-hydroxy-2-pyridyl alebo 2-hydroxy-3-chinoxalyl, R1 je vodík, R2 je vodík a R3 je vybrané zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov všeobecného vzorca (II) alebo (III), kde jednotlivé substituenty majú už definovaný význam. Tieto inhibítory tryptázy sa používajú na zmiernenie zápalových ochorení spôsobených imunitou.
Zvlášť preferovaným tryptázovým inhibítorom je zlúčenina 3 všeobecného vzorca (X) z tabuľky I a II
kde
Ar je hydroxylom substituovaný aryl alebo hydroxylom substituovaný heteroaryl, kde hydroxyl je umiestnený v polohe orto k amidovému bočnému reťazcu a kde aryl je fenyl, bifenyl alebo naftyl a heteroaryl je aromatická heterocyklická skupina obsahujúca 6 až 10 atómov uhlíka v kruhu a kde Ar môže byť ďalej substituované halogénom, alkylom, alkyloxy, alkyltio, alkylkarbonyloxy, trifluórmetyl, arylom, heteroarylom alebo hydroxyskupinou, pričom každý alkyl je cyklický, priamy alebo rozvetvený reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka a kde ak Ar je hydroxylom susbtituovaný aryl, aromatický kruh nesúci amidový bočný reťazec nie je substituovaný halogénom a nemá alkylovú skupinu, definovanú vyššie, v polohe orto k hydroxylu a kde
R1 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka,
R2 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka,
R3 je vybraný zo skupiny obsahujúcej
X (II) s
(W
Iným preferovaným inhibítorom tryptázy podľa všeobecného vzorca (I) je zlúčenina 15 z tabuľky 1 a II:
(Xl)
(III) ( kde m je celé číslo 3 až 6, p je celé číslo 0 až 2 a q jc celé číslo 0 až 2,
R4 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka a
R5 a R6 sú nezávisle vybrané z vodíka alebo rozvetveného, alebo priameho alkylového reťazca majúceho 1 až 6 atómov uhlíka, alebo
R4 a R5 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 4-členný, 5-členný alebo 6členný heterockylus a R6 je vodík alebo
R4 a R6 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 4-členný, 5-členný alebo 6Inhibítory tryptázy' opísané v predkladanom vynáleze je možné získať známymi technikami z ľahko dostupných východiskových látok, ako je ďalej podrobnejšie opísané.
V závislosti od povahy funkčných skupín môžu zlúčeniny, opísané v tomto vynáleze, ďalej tvoriť soli s rôznymi anorganickými a organickými kyselinami a zásadami. Tieto soli môžu byť tvorené s anorganickými kyselinami ako je kyselina chlorovodíková, kyselina brómovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná a podobne, a s organickými kyselinami, ako je kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina glykolová, kyselina pyrohroznová, kyselina šťaveľová, kyselina hydroxyjantárová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina maleínová, kyselina fumárová, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina škoricová, kyselina mandľová, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina p-toluén-sulfónová, kyselina salicylová a podobne.
Soli môžu vznikať aj zo zvyšku karboxylovej kyseliny pôsobením alkalických kovov alebo báz, ktoré obsahujú alkalické kovy, ako sú hydroxidy alkalických kovov a alkoxidy alkalických kovov, alebo pôsobením kovov alkalických zemín alebo báz, ktoré obsahujú kovy alkalických zemín, ako sú hydroxidy kovov alkalických zemín a alkoxidy kovov alkalických zemín. Ďalej môžu vznikať z karboxylovej kyseliny a organickej zásady, ako sú trimctylamín, dietylamín, etanolamín, piperidín, izopropylamín, cholín, kofeín a ďalšie.
Soli môžu vznikať bežným spôsobom, ako je reakcia voľnej kyseliny alebo bázy produktu s jedným alebo viacerými ekvivalentmi vhodnej bázy alebo kyseliny v rozpúšťadle, v ktorom soľ nie je rozpustná, alebo v rozpúšťadle ako je voda, ktoré sa potom odstráni odparením vo vákuu alebo lyofilizáciou, alebo výmenou katiónu danej bázy za iný katión na vhodnom iónomeniči.
Tu opísané zlúčeniny sa používajú na prevenciu a liečenie zápalových ochorení spôsobených imunitou, najmä spojených s dýchacím traktom, vrátane astmy. Najmä štádium hypersenzitivity spojené s chronickou astmou a alergickou nádchou. Predkladaný vynález teda opisuje farmaceutické prostriedky na liečenie zápalových ochorení spôsobených imunitou, kedy pacient so zápalovým ochorením spôsobeným imunitou reaguje na liečbu inhibítorom tryptázy podaním jeho terapeuticky účinnej dávky podľa tohto vynálezu. Tieto farmaceutické prostriedky môžu existovať v rôznych formách - môžu sa podávať orálne, injekčné a ako infúzne roztoky. Zvyčajne pokiaľ sa používajú na liečenie alebo prevenciu astmy, obzvlášť precitlivenosti spojenej s chronickou astmou, sú tieto farmaceutické prostriedky vo forme aerosólov, práškov alebo roztokov.
Pokiaľ sa používajú pri liečení zápalových stavov kože spôsobených imunitou, používajú sa v kombinácii s netoxickými farmaceutický prijateľnými nosičmi, prípadne môžu byť použité v kombinácii s protizápalovými látkami, ďalšími terapeutikami proti astme, ako napríklad antagonistami -adrenergík, protizápalovými kortikosteroidmi, anticholinergikami a ďalšími.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 je graf, ktorý znázorňuje špecifickú pľúcnu rezistenciu oviec ako funkciu času v hodinách po expozícii. Prázdne štvorčeky predstavujú kontrolné hodnoty a plné krúžky predstavujú hodnoty pre rovnaké zviera po podaní zlúčeniny 3 z tabuľky I a II.
Na obrázku 2 je graf, ktorý ukazuje rozvoj hypersenzitivity oviec pri bronchokonštrikcii spôsobenej carbacholom, 24 hodín po expozícii alergénom, keď je pred carbacholom podaná zlúčenina 3 z tabuľky I a II. Tmavý, jednoliaty stĺpec zodpovedá kontrole, slepá vzorka. Svetlejší jednoliaty stĺpec zodpovedá lieku, slepá vzorka. Pruhovaný stĺpec zodpovedá kontrole, po podaní antigénu. Biely stĺpec zodpovedá lieku, po podaní antigénu.
Nasledujúce definície ďalej ilustrujú a definujú význam a rámec rôznych termínov, ktoré sú tu použité na opis vynálezu.
„Zápalové ochorenia spôsobené imunitou“ všeobecne zahŕňajú choroby, ktoré sú spojené s uvoľňovaním mediátorov z mastocytov a reagujú na liečbu tryptázovým inhibítorom. Príklady týchto ochorení zahŕňajú ochorenia priameho typu hypersenzitivity, ako je astma, alergická nádcha, urticaria a cievny edém, ekzematická dermatitída (atopická dermatitída), anafylaxia, a tiež aj hyperproliferatívne choroby kože, vredy tráviaceho ústrojenstva, zápalové ochorenia čriev, zápalové stavy kože a pod.
„Hypersenzitivita“ sa vzťahuje na neskorú fázu bronchokonštrikcie a hyperreaktivity dýchacích ciest spojených s chronickou astmou. Hypersenzitivita astmatického bronchiálneho tkaniva je považovaná za následok chronickej zápalovej reakcie, ktorá dráždi a ničí epitel lemu júci steny dýchacích ciest a podporuje patologické hrubnutie podpovrchového tkaniva.
„Halogén“ označuje atómy fluóru, brómu, chlóru a jódu.
„Hydroxyl“ označuje skupinu -OH.
„Nižší alkyl“ označuje cyklický, vetvený alebo rovný reťazec alkylovej skupiny jedného až šiestich uhlíkových atómov. Pri tomto termíne sú ďalej uvádzané príklady skupín, ako je metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, i-butyl (alebo 2-metylpropyl), cyklopropylmetyl, i-amyl, n-amyl a hexyl.
„Aiyl“ alebo „Ar“ označuje aromatickú karbocyklickú skupinu, ktorá má jeden kruh (napr. fenyl), viacnásobný kruh (napr. bifenyl) alebo viacnásobné kondenzované kruhy, z ktorých je aspoň jeden aromatický (napr. 1,2,3,4-tetra-hydronaftyl, naftyl, antryl alebo fenantryl), ktoré môžu byť prípadne substituovaný, napr. halogénom, nižším alkylom, nižšou alkoxy skupinou, nižšou alkyltio skupinou, trifluór-metylom, nižšou acyloxy skupinou, arylom, hetero-arylom a hydroxylom. Ale podľa tohto vynálezu aromatický kruh nesúci amidový bočný reťazec nemôže byť ďalej substituovaný halogénom. Okrem toho aromatický kruh nesúci bočný amidový reťazec nemôže mať umiestnenú nižšiu alkylovú skupinu v polohe orto vzhľadom na hydroxylovú skupinu (t. j metá k amido-vému bočnému reťazcu).
„Heterocyklus“ označuje nasýtenú, nenasýtenú alebo aromatickú karbocyklickú skupinu, ktorá má jednoduchý kruh (napr: morfolínový kruh, pyridyl alebo furyl) alebo viacnásobné kondenzované kruhy (napr. naftyridinyl, chinoxalyl, chinolinyl, indolizinyl alebo benzo[b]tienyl) a ktorý má najmenej jeden heteroatóm, ako je N, O alebo S, vnútri kruhu, ktorý môže byť nesubstituovaný alebo substituovaný napr. halogénom, nižším alkylom, nižšou alkylovou skupinou, nižšou alkyltioskupinou, trifluórmetylom, nižšou acyloxysku-pinou a hydroxy skupinou. Termín „heteroaryl“ alebo „HetAr“ označuje heterocyklus, ktorý má najmenej jeden heterocyklický kruh aromatický.
„Arylalkyl“ označuje skupinu -R-Ar, kde Ar je arylová skupina a R je alifatická skupina s rovným alebo vetveným reťazcom. Arylalkylová skupina môže byť nesubstituovaná alebo substituovaná napr. halogénom, nižším alkylom, nižšou alkylovou skupinou, nižšou alkyltioskupinou, trifluórmetylom, nižšou acyloxyskupi-nou a hydroxy skupinou.
„Heteroalkyl“ označuje skupinu -R-HetAr, kde HetAr je heteroalkylová skupina a R je alifatická skupina s rovným alebo vetveným reťazcom. Heteroalkylová skupina môže byť nesubstituovaná alebo substituovaná, napr. halogénom, nižším alkylom, nižšou alkoxylovou skupinou, nižšou alkyltioskupinou, trifluórmetylom, nižšou acyloxyskupinou a hydroxy skupinou.
„Farmaceutický prijateľná soľ“ označuje soli, ktoré zachovávajú biologickú efektivitu a vlastnosti materskej zlúčeniny a ktoré nie sú biologicky alebo inak nežiaduce.
„Farmaceutický alebo terapeuticky prijateľný nosič“ označuje nosné médium, ktoré neinterferuje s biologickým účinkom aktívnych zložiek a ktoré nie je toxické pre pacienta a okolie.
„Stereoizomér“ označuje chemickú zlúčeninu, ktorá má rovnakú molekulovú hmotnosť a chemické zloženie, ale atómy sú inak zoskupené. Chemicky totožné skupiny sa líšia priestorovou orientáciou, a pokiaľ sú čisté, tak stáčajú rovinu polarizovaného svetla, ale niektoré čisté stereoizoméry majú optickú rotáciu, ktorá je taká jemná, že je súčasnými prístrojmi nezistiteľná. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu mať jednu alebo viac asymetric kých uhlíkových atómov a tak môžu zahŕňať rôzne stereoizoméry. Všetky stereo-izoraéry sú zahrnuté do rámca vynálezu.
„Liečba“ alebo „liečenie“ označuje akékoľvek podávanie inhibítora tryptázy in vitro alebo in vivo a zahŕňa:
(i) zastavenie symptómov choroby, (ii) zmenšenie alebo zastavenie dlhodobých vplyvov choroby, (iii) odstránenie symptómov choroby.
Testovanie in vitro a in vivo
V tejto problematike sú známe protokoly testovania in vitro na skríning potenciálnych inhibítorov v ich schopnosti inhibovať tryptázu, pozri napr. „Sturzebecher a kol. (1992): Biol. Vnem. Hoppe-Seyler 173: 10251030“. Zvyčajne tieto stanovenia merajú tryptázou indukovanú hydrolýzu chromogénnej substancie peptidového typu. Podrobnosti postupu, ktorý je tu uvedený ako príklad, sú ďalej opísané.
Ďalej môže byť aktivita zlúčenín opísaných v tomto vynáleze zhodnotená testovaním in vivo na jednom z mnohých modelov astmy zvierat, pozri „Larson: Experimental Models of Reversible Airway Obstruction“, v „The Lung: Scientific Foundations, Crystal, West a kol., editori, Raven Press, Ňew York, 1991; Warner a kol., (1990) Am. Respir. Dis. 141: 253-257“. Ideálny zvierací model by mal kopírovať hlavné klinické a fyziologické znaky ľudskej astmy, vrátane hypersenzitivity dýchacích ciest na chemické mediátory a fyzikálne podnety; vymiznutie obštrukcie dýchacích ciest pri podaní liekov použiteľných pri ľudskej astme (-adrenergiká, metylxantíny, kortikosteroidy a ďalšie; zápal dýchacích ciest s prienikom aktivovaných leukocytov; a chronické zápalové degeneratívne zmeny, ako je zhrubnutie základňovej membrány, hypertrofia hladkého svalstva a zničenie epitelu.
Druhy, používané ako zvieracie modely, zahŕňajú myši, krysy, morčatá, králiky, psy a ovce. Všetky druhy majú nejaké obmedzenia a vhodná voľba závisí od riešeného problému.
Počiatočnú astmatickú odpoveď môžeme zhodnotiť na morčatách a psoch, a obzvlášť na krížencoch chrta a baseta, ktoré rozvíjajú nešpecifickú hypersenzitivitu dýchacích ciest na mnohé nealergénne látky, ako sú metacholín a kyselina citrónová. Vybrané ovce majú dvojitú reakciu na antigénnu stimuláciu proteínmi Ascaris. Pri zvieratách s dvojitou reakciou je včasná astmatická reakcia (IAR) nasledovaná neskoršou astmatickou reakciou (LAR), a to 6 až 8 hodín po expozícii. Hypersenzitivita na carbachol, cholinergén-neho agonistu, vzrastá 24 hodín po antigénnej stimulácii, pri ktorej zviera má LAR.
Ovca ako model alergika bol použitý na zistenie potenciálnych antiastmatických účinkov zlúčenín, uvedených v predkladanom vynáleze. Podávanie prostriedkov obsahujúcich aerosólované roztoky zlúčenín tohto vynálezu alergickým ovciam pred alebo po expozícii špecifickými alergénmi ukázalo, že také prostriedky podstatne zmenšujú alebo odstraňujú neskorú astmatickú reakciu a v dôsledku toho aj hypersenzitivitu.
Inhibítory tryptázy opísané v tomto vynáleze sa tiež používajú na liečenie ostatných ochorení, spôsobených imunitou, pri ktorých tryptázová aktivita prispieva k vzniku patologických stavov. Tieto ochorenia zahŕňajú zápalové ochorenia spojené s mastocytmi, ako je reumatoidná artritída, reumatoidná spondylitída, osteoartritída, dnavá artritída a ostatné artritické stavy, zápalové ochorenia vnútorných orgánov, vredy tráviaceho ústrojenstva a rôzne stavy kože.
Účinnosť inhibítorov tryptázy v tomto vynáleze pri liečení prevažnej väčšiny ochorení spôsobených imunitou môže byť zistená buď postupmi in vitro, alebo in vivo. Teda ich protizápalová účinnosť môže byť demonštrovaná meraniami, ktoré sú v tejto oblasti dobre známe, napríklad technikou Arthusovej obrátenej pasívnej reakcie (Reversed Passive Arthus Reaction - (RPAR)-PAW (pozri napr. „ Ganguly a kol. (1992) U.S. Patent No. 5 126 352“ ) alebo meraním na určenie terapeutického významu zlúčenín pri liečení rôznych stavov kože, ako sú hyperproliferatívne ochorenia kože, v tejto oblasti dobre známe, napríklad Arachidonic Acid Mouse Ear Test (id). Inhibítory tryptázy môžu byť vhodné kvôli svojmu protivredovému pôsobeniu podľa metód opísaných v „Chiu a kol. (1984): Archives Internationales de Pharmacodynamie at de Therapie 270: 128-140“ .
Podávanie in vivo
Podľa tohto vynálezu terapeuticky alebo farmaceutický účinné množstvo inhibítora tryptázy, najmä zlúčenina podľa všeobecného vzorca (I) je podávaná pacientom trpiacim ochorením spôsobeným imunitou. Podľa jedného príkladu je možné ju použiť na prevenciu alebo zlepšenie astmy. Pri použití farmaceutických prostriedkov podľa predkladaného vynálezu pri liečení astmy môže byť inhibítor tryptázy podaný preventívne pred expozíciou alergénom alebo iným faktorom, alebo po tejto expozícii. Inhibítory tryptázy podľa vynálezu sú predovšetkým použiteľné na zlepšenie deštrukcie tkaniva v neskorej fáze, ktorú môžeme pozorovať, pri sezónnej alebo trvalej nádche. Iný aspekt predkladaného vynálezu je zameraný na prevenciu a liečenie ostatných imunitou spôsobených zápalových ochorení spojených s mastocytmi, ako je urticaria a cievny edém, exematická dermatitída (atopická dermatitída) a anafylaxia, rovnako ako hyperproliferatívne ochorenia kože, vredy tráviaceho ústrojenstva a ďalšie.
Farmaceutické prostriedky obsahujúce inhibítory tryptázy môžu byť podávané pri preventívnom a/alebo terapeutickom liečení. Pri terapeutickej aplikácii sú podané pacientom už trpiacim ochorením, ako je opísané, v množstve dostatočnom na liečenie alebo aspoň na čiastočné zastavenie symptómov ochorenia alebo ich komplikácií. Množstvo primerané na dosiahnutie týchto cieľov je definované ako „terapeuticky účinné množstvo alebo dávka“. Množstvo účinné na toto použitie bude závisieť od priebehu a stavu ochorenia, predchádzajúcej terapie, od pacientovho zdravotného stavu a od reakcie na liečivá a od názoru ošetrujúceho lekára.
Pri preventívnej aplikácii sú farmaceutické prostriedky obsahujúce inhibítory tryptázy podľa tohto vynálezu podávané pacientom, ktorí sú citliví alebo z nejakého iného dôvodu hrozí nebezpečenstvo konkrétnej choroby. Množstvo v tomto prípade definujeme ako „preventívne účinné množstvo alebo dávka“. Pri tomto použití presné množstvo opäť závisí od pacientovho zdravotného stavu, hmotnosti atď.
Keď sa už raz stav pacienta zlepšil, tak sa, ak je to nutné, podáva udržiavacia dávka. Ďalej môžu byť znížené dávky alebo frekvencie podávania, alebo oboje, v závislosti od symptómov, aby bola udržaná úroveň zlepšenia symptómov. Keď sa symptómy ustália na žiadanej úrovni, liečenie sa môže ukončiť. Pacienti však môžu vyžadovať prerušovanú dlhodobú liečbu, kým sa symptómy ochorenia opakujú.
Všeobecne vhodná účinná dávka inhibítora tryptázy je v rozsahu od 0,1 do 1000 miligramov (mg) na príjem cu a deň, výhodnejšie v rozsahu od I do 100 mg na deň. Najvýhodnejšie je potrebnú dávku podať v jednej, dvoch, troch alebo štyroch menších dávkach podaných v primeraných intervaloch počas dňa. Tieto menšie dávky môžu byť podané vo forme jednotkových dávok, napríklad s obsahom od 5 do 1000 mg, najlepšie od 10 do 100 mg aktívnej zložky na jednu dávkovú jednotku.
Prostriedky používané pri tejto terapii môžu mať rôzne formy. Tieto formy zahŕňajú napríklad dávky v pevnej, polotuhej alebo tekutej forme, ako sú tablety, prášky, roztoky alebo suspenzie, lipozómy, injekčné a infúzne roztoky. Výber formy závisí od zamýšľaného spôsobu podania a terapeutickej aplikácie.
Aj keď je možné podávať samotnú aktívnu látku podľa tohto vynálezu, je výhodnejšie podávať ju ako súčasť farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje najmenej jednu látku alebo inhibítor tryptázy v terapeutickej alebo farmaceutický účinnej dávke spolu s jedným alebo viacerými terapeuticky alebo farmaceutický prijateľnými nosičmi a ďalšími možnými terapeutickými prísadami. Rôzne možnosti sú opísané napr. v „Gilman a kol. (editori) (1990): Goodman and Gilman s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. vydanie, Pergamon Press“; a „Remington s“ -pozri vyššie. Sú tu uvádzané formy podávania, napr. orálne, intravenózne, intraperitoneálne alebo intramuskulárne podávanie a ďalšie. Farmaceutický prijateľné nosiče zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, pufre a ďalšie zlúčeniny opísané napríklad v „Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ“.
Zvyčajne, ak sú zlúčeniny - inhibítory' tryptázy-podľa predkladaného vynálezu používané na liečenie astmy alebo alergickej nádchy, sú vo forme aerosólu. Termín „aerosól“ zahŕňa akúkoľvek fázu z predkladaného vynálezu, v ktorej je suspendovaný plyn, ktorý umožňuje inhaláciu do bronchiolov alebo do nosa. Aerosól zahŕňa suspenziu plynu a kvapôčok zlúčenín z predkladaného vynálezu, ktorá vzniká v inhalátore alebo v rozprašovači hmly. Aerosól tiež zahŕňa suchý prášok zložený zo zlúčeniny podľa tohto vynálezu, suspendovanej vo vzduchu alebo v inom nosnom plyne, ktorý môže byť dodávaný napríklad vyfúknutím z inhalačného prístroja.
Pre roztoky, používané na prípravu aerosólov v predkladanom vynáleze, je preferovaný rozsah koncentrácií zlúčenín z tohto vynálezu od 0,1 do 100 miligramov (mg)/mililiter (ml), výhodnejšie 0,1 až 30 mg/ml a najvýhodnejšie 1 až 10 mg/ml. Zvyčajne sú roztoky pufrované fyziologicky kompatibilným pufrom, ako je fosfátový alebo hydrogenuhličitanový. Zvyčajný rozsah pH je od 5 do 9, výhodnejšie od 6,5 do 7,8 a najvýhodnejšie od 7,0 do 7,6. Na dosiahnutie osmolarity fyziologického rozmedzia sa zvyčajne pridáva chlorid sodný, najlepšie v rozmedzí 10 % izotonický. Zloženie týchto roztokov na prípravu aerosólových inhalačných prostriedkov je uvádzané v „Remington's Pharmaceutical Sciences“, pozri tiež „Ganderton a Jones: Drug Delivery to the Respirátory Tract, Ellis Horwood (1987)“, „Gonda (1990): Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6: 273313“ a „Raeburn a kol. (1992): J. Pharmacol. Toxicol. Methods27: 143-159“.
Roztoky zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť prevedené do aerosólov akýmkoľvek známym spôsobom bežne používaným na prípravu aerosólových inhalačných farmaceutických prostriedkov. V podstate zahŕňajú prostriedky zaisťujúce stlačenie nádoby s roztokom, zvyčajne s inertným nosným plynom, a prechod stlačeného plynu malým otvorom, v dôsledku čoho kvapôčky roztoku preniknú do úst a trachey zvieraťa, ktorému liek podávame.
Na uľahčenie prieniku látky sa zvyčajne na výstupný otvor nasadzuje náustok.
V jednom z príkladov uskutočnenia tohto vynálezu sa farmaceutické prostriedky skladajú z roztokov zlúčenín inhibítorov tryptázy, - v ktorých sú alebo nie sú obsiahnuté činidlá zvyčajné pre vznik aerosólu pri liečení astmy, ako sú inhalátory s merateľným dávkovaním, dýzové rozprašovače a ultrazvukové rozprašovače. Tieto prostriedky môžu tiež obsahovať náustok, nasadený na výstupný otvor.
V inej aplikácii na liečenie alergickej nádchy farmaceutický prostriedok môže obsahovať roztok zlúčeniny podľa tohto vynálezu v nosnom spreji alebo suchý prášok obsahujúci zlúčeninu podľa tohto vynálezu s exipicientom. Môže byť podávaný práškovým inhalátorom, ktorý obsahuje opísaný prášok.
Je zrejmé, že farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu byť použité v kombinácii s ďalšími látkami na liečenie ochorení spôsobených imunitou a najmä astmy. V týchto kombináciách sa obzvlášť používajú agonisty -adrenergík, pretože odstraňujú symptómy včasnej astmatickej reakcie, zatiaľ čo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu odstraňujú symptómy neskorej astmatickej reakcie. Preferované agonisty -adrenergík v týchto roztokoch zahŕňajú akýchkoľvek zvyčajných agonistov, používaných na odstránenie astmy, ako je albuterol, terbutalín, formoterol, fanoterol alebo prenalín.
Ostatné látky, používané v kombinácii so zlúčeninami podľa tohto vynálezu, zahŕňajú anticholinergiká, ako je ipratrópiumbromid, a proti-zápalové kortikosteroidy (adrenokortikálne steroidy), ako je beklometazón, triamchinolón, fluorizolid alebo dexametazón.
Inhibítory' tryptázy podľa tohto vynálezu môžu byť použité pri liečení zápalových stavov kože, spôsobených imunitou, ako je urticaria a cievny edém, exzematická dermatitída a hyperproliferatívne ochorenia kože, napr. psoriáza, u cicavcov. Ako dôsledok povrchovej aplikácie zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (I) sa očakáva remisia symptómov. Pri jej pôsobení na zápalové stavy kože, spôsobené imunitou, je možné očakávať zmenšenie šupinatosti, erytému, rozsahu ložisiek, svrbenia a ostatných symptómov, spojených so stavmi kože. Dávkovanie liečiva a dĺžka liečby potrebná na úspešné liečenie môže byť pri každom pacientovi rôzna, ale osoba kvalifikovaná v tejto problematike bude schopná určiť tieto variácie a podľa nich určiť, priebeh liečby.
Vynález zahŕňa tiež farmaceutické prostriedky na povrchovú aplikáciu na kožu, obsahujúce inhibítor tryptázy podľa všeobecného vzorca (I), zvyčajne v koncentráciách v rozsahu od 0,001 % do 10 %, spolu s netoxickým farmaceutický prijateľným povrchovým nosičom. Tieto prostriedky sa pripravujú kombináciou aktívnej zložky podľa tohto vynálezu s konvenčnými farmaceutickými rozpúšťadlami a nosičmi, zvyčajne povrchovo používané vo forme suchej, tekutej, vo forme krému a aerosólu. Masti a krémy majú vodný alebo olejový základ s prídavkom vhodného zahusťovadla a/alebo gelovacej látky. Ako základ môžu obsahovať vodu a/alebo tekutý parafín, alebo rastlinný olej, ako je olej z podzemnice olejnej alebo ricínový olej. Zahusťovacie látky, ktoré sú použité podľa povahy základu, zahŕňajú tuhý parafín, stearát hlinitý, ketostearylalkohol.propylénglykol, polyetylénglykoly, lanolín, hydrogenovaný lanolín, včelí vosk a ďalšie.
Pleťové vody môžu byť zložené z vodného alebo olejového základu a všeobecne tiež obsahujú jednu alebo viac nasledujúcich zložiek: stabilizačné činidlá, emulgá tory, disperzné činidlá, suspendačné činidlá, zahusťovadlá, farbiace činidlá, parfumy a ďalšie.
Prášky môžu byť zložené z akéhokoľvek vhodného práškového základu, napr. talku, laktózy, škrobu a pod. Kvapky sú zložené z vodného alebo nevodného základu a ďalej môžu obsahovať jedno alebo viac disperzných činidiel, suspendačných činidiel, rozpustiacich činidiel a ďalších.
Povrchové farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať jedno alebo viac konzervačných alebo baktériostatických činidiel, napr. metylhydroxybenzoát, propylhydroxybenzoát, chlóro-kresol, benzalkónium chlorid a ďalšie. Povrchové farmaceutické prostriedky môžu tiež obsahovať ďalšie aktívne zložky, ako sú antimikrobiálne činidlá, najmä antibiotiká, anestetiká, analgetiká a činidlá proti svrbeniu.
Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú tiež použiteľné pri liečení vredov tráviaceho ústrojenstva. Konkrétnejšie majú chemoterapeutickú aktivitu, ktorá umožňuje odstránenie symptómov vredov tráviaceho ústrojenstva a podporujú liečenie žalúdočných a/alebo dvanástnikových vredov. Môžu byť tiež použité v spojení s ostatnými terapeutickými činidlami, ako sú protizápalové činidlá a/alebo analgetiká, ako je aspirín, indometacín, fenylbutazón, ibuprofén, naproxén, tolemtím a ďalšie.
Farmaceutické prostriedky môžu byť podávané parenterálne alebo orálne pri liečení preventívnom a/alebo terapeutickom. Farmaceutické prostriedky môžu byť podávané v rôznych dávkových jednotkách v závislosti od spôsobu podávania. Napríklad formy dávkových jednotiek vhodné na orálne podávanie zahŕňajú prášky, tablety, kapsuly a dražé.
Farmaceutické prostriedky môžu byť podávané intravenózne a vtedy obsahujú roztok inhibítora tryptázy rozpustený alebo suspendovaný v prijateľnom nosiči, najvýhodnejšie vo vodnom nosiči. Môžu byť použité rôzne nosiče, napríklad voda, pufrovaná voda, 0,4 % fyziologický roztok a ďalšie. Tieto prostriedky sú nepovinne sterilizované, bežnými, dobre známymi sterilizačnými technikami, alebo môžu byť sterilizované filtráciou. Výsledné roztoky môžu byť balené na priame používanie alebo lyofylizované, lyofylizovaný preparát je pred podávaním kombinovaný so sterilným vodným roztokom. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné zložky na dosiahnutie fyziologických podmienok, ako je úprava pH a pufračné činidlá, činidlá na úpravu tonicity, zvlhčovadlá a ďalšie, napr. octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, monolaurát sorbitanu, oleát trietanolamínu a ďalšie.
Na pevné zmesi sú použité pevné nosiče, napríklad farmaceutický čistý manitol, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sacharín sodný, talok, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan sodný a ďalšie. Na orálne podávanie je farmaceutický prijateľný netoxický prostriedok tvorený zmiešaním akejkoľvek bežne používanej zložky, ako sú napríklad uvedené nosiče, a 0,1 až 95 % aktívnej zložky, najvýhodnejšie 20 %.
Na to, aby bol vynález úplne pochopený, slúžia nasledujúce príklady. Je zrejmé, že tieto príklady slúžia iba na ilustráciu a nemôžu byť v žiadnom smere považované za obmedzenia vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
I. Všeobecné metódy
Východiskové materiály, ktoré tu nie sú komerčne dostupné, sú známe alebo môžu byť pripravené metódami, ktoré sú v danej problematike dobre známe. Inhibitor tryptázy - zlúčeninu podľa všeobecného vzorca (I)- je možné pripraviť technikami známymi v danej problematike pri použití syntetických techník pevnej alebo kvapalnej fázy. Napríklad techniky syntézy pevnej fázy polypeptidov sú opísané napríklad v „Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (editori E. Atherton a R.
C. Sheppard) IRL Press at Oxford University Press (1989) and in Marrifield, J. Amer. Chem Soc. 85:21492156 (1963)“. Chémia peptidových väzieb je tiež opísaná v „The Peptides, Vol.l (editori Gross, E. and J. Meienhofer), Academic Press, Orlando (1979)“. Ďalšie techniky vrátane týchto sú „Geysen a kol., J. Imm. Meth., (1987) 102: 259-274“, „Houghten akol., Náture (1991) 154:84-86.
V opísanom postupe na prípravu zlúčeniny-inhibítora tryptázy- podľa tohto vynálezu, sú požiadavky na chrániace skupiny všeobecne dobre známe všetkým, ktorí sú zbehlí v problematike organickej chémie. Použitie vhodnej ochrany skupín je nevyhnutne zahrnuté v uvádzanom postupe, aj keď tu nie je vyslovene opísané.
Opísaná izolácia a čistenie zlúčenín a medziproduktov môže byť vykonaná, ak je to požadované, vhodným separačným alebo puriftkačným postupom, ako je napr. filtrácia, extrakcia, kryštalizácia, kolónová chromatografia alebo preparatívna chromatografia, vysokotlaková kvapalinová chromatografia alebo kombinácia týchto metód. Konkrétne príklady vhodných separačných a izolačných postupov jc možné získať z odkazov na ďalej uvedené príklady. Je samozrejme možné použiť aj ďalšie ekvivalentné separačné alebo izolačné metódy.
Sakaguchiho test slúži na detekciu arginínu a pepdidov obsahujúcich arginín, pozri Stewart a Young „Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, str.l 14“. Bol pripravený roztok I, obsahujúci 0,01 % -naftolu a 5 % močoviny v 95 % etanolu. Roztok II bol pripravený rozpustením 2 gramov (g) brómu v 100 mililitroch (ml) 8 % roztoku hydroxidu sodného vo vode. Do roztoku I bolo pridaných 5 hrudiek hydroxidu sodného. Analyzovaná vzorka bola bodovo nanesená na doštičku na tenkovrstvovú chromatografiu (TLC). TLC doštička bola potom nasprejovaná roztokom L TLC doštička bola vysušená a potom nasprejovaná roztokom II. Červené body indikovali výskyt amino-inimometánových skupín.
II. Syntéza zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (I) v pevnej fáze
A. Príprava zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (3) z tabuľky 1 a II
4-(2',4'-Dimetoxyfenyl-fluórenylmetyloxykar-bonyl (Fmoc)-aminometyl)-fenoxylová živica (Rink Resin: Bachem, CA; 3,5 gramov (g) v navážke 0,289 miliekvivalent/gram (meq/g), 1,01 milimólov (mmol)) bola suspendovaná v 30 ml roztoku Ν,Ν-dimetylformamid (DMF): toluén (1:1 objemovo) obsahujúceho 30 % objemových piperidínu. Reakčná zmes bola miešaná 5 minút a potom prefiľtrovaná. Bola pridaná ďalšia dávka roztoku piperidínu (30 ml) a zmes bola miešaná ďalších 5 minút. Po filtrácii boli častice živice postupne premyté DMF(6x) a metylénchloridom (6x).
Fmoc-L-prolín (Milligen; 6,06 mmol), benzo-triazol1 -yl-oxy-tris-(dimctylamino)-fosfónium nexafluórofosfát (BOP, Novabiochem; 6,06 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (HOBT; Aldrich; 0,06 mmol) bol rozpustený v 30 mi DMF. Výsledný číry roztok bol pridaný k živici Rink a výsledná kašovitá zmes sa 4 hodiny miešala (prebublávaním dusíkom). Reakčná zmes bola prefiltrovaná a častice živice boli premyté, ako už bolo opísané. Skupina Fmoc bola odstránená piperidínom, ako už bolo opísané.
Roztok Fmoc-L-arginínu (PMC) (Milligen; 6,06 mmol), BOP (6,06 mmol) a HOBT (6,06 mmol) v DMF (30 ml) boli pridané k časticiam živice a kašovitá zmes bola miešaná 4 hodiny a potom prefiltrovaná, premytá, opracovaná pôsobením piperidínu a opäť premytá, ako už bolo opísané.
Roztok l-hydroxy-2-naftoovej kyseliny (Aldrich; 1,14 mg; 6,06 mmol), 1,3-diizopropyl-karbodiimid (DIPCDI; Aldrich; 0,949 ml, 6,06 mmol) a HOBT (0,819g, 6,06 ml)v DMF(45 ml) boli pridané do reakčnej zmesi a zmes bola trepaná na trepačke 7 hodín. Po filtrácii, premytí a pridaní piperidínu (ako už bolo opísané), bola živica premytá postupne DMF (6x), metylénchloridom (6x) a metanolom (6x). Živica bola suspendovaná v metanole a trepaná na trepačke cez noc (15 hodín). Bola prefiltrovaná a dvakrát premytá metanolom. Biela sypká hmota bola potom suspendovaná v roztoku obsahujúcom trifluóroctovú kyselinu (TFA): anizol: vodu v pomere 90:5:5 (30 ml). Živica sa okamžite zafarbila do ružová a potom stmavla počas jednej až dvoch minút na sýto-červenú farbu. Po 5 minútach miešania bola reakčná zmes prefiltrovaná. Tento postup bol opakovaný ešte 2x s čerstvým Stepným činidlom, s tým rozdielom, že doba kontaktu bola zvýšená o 10 minút v každom opakovaní.
Roztoky v TFA boli spojené a vzniknutý číry oranžový roztok bol ponechaný na sedimentáciu pri izbovej teplote počas 3,5-hodiny. Zahustenie vo vákuu poskytlo svetložltý olej, ktorý bol udržiavaný vo vákuu (<1 tór) počas 3 hodín. Olej bol rozpustený v 50 % vodnom roztoku acetonitrylu (100 ml) a lyofilizovaný, čím vznikol surový produkt ako špinavobiela pevná látka (471 mg).
Produkt bol analyzovaný HPLC (Polymér Labs 100A PLRP kolóna, 1,0x150 milimetrov (mm), eluovaný lineárnym gradientom 20 až 45 % acetonitrilu počas 13 minút pri prietoku 0,1 ml/min.). Analýza dokázala, že surový produkt bol v podstate jediná zlúčenina (retenčný čas 10,35 minúty, >98 % stanovené UV absorbenciou). Purifikácia bola vykonaná HPLC s použitím pri použití kolóny naplnenej C,8 silikagélom (Vydac; 22 x250 mm, 15 20 m, 300 a, eluovaná lineárnym gradientom 20 až 35 % počas 30 minút pri prietoku 10 ml/min.) . Bolo potrebné opakovať nástrek v množstve 30 až 35 mg. Podobné frakcie (retenčný čas 44 až 48 minúť) boli spojené a lyofílizované, čim bola získaná sypká biela látka (351 mg), ktorá bola tvorená jedinou zlúčeninou (podľa HPLC).
Hmotová „elektrospray“ spektrometria (vypo-čítaná molekulová hmotnosť 440,49, nájdené M+1 = 441,10 a NMR spektroskopia protónová a 13C) sú konzistentné s očakávanou štruktúrou. IH NMR (CD3OD) 67,89 (d, J = = 8 Hz, IH), 7,78 (d. J = 6Hz, IH), 7,76 (d, J = 6Hz, IH), 7,57 (dt, J = 8; 1Hz, IH), 7,48 (dt, J = 8; 1HZ, IH), 7,29 (d, J = 8Hz, IH), pribi. 4,95 (nezreteľný, IH), 4,49 (dd, J = 8; 5HZ, IH), 3,97 (dt, J = 10; 7Hz, IH), 3,73 (dt, J = = 10; 7Hz, IH), 3,23 (t, J = 7Hz, 2H), 2,29 (m, IH), 1,7 až 2,2 (m, 8H).
B. Postup pre ďalšie zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (I)
Podľa uvedeného postupu časti A a pri použití nasledujúcich zlúčenín namiesto 1-hydroxy-2-naftoovej kyseliny:
2- hydroxy-4-metylbenzoová kyselina;
3- hydroxy-2-chinocalinkarboxylová kyselina; 3-hydroxy-2-naftoová kyselina;
2- hydroxy-l-naftoová kyselina;
3- hydroxy-2-pyridínkarboxylová kyselina;
4- hydroxy-7-metyl-3-naftiridínkarboxylová kyselina; 2-hydroxy-3-pyridínkarboxylová kyselina;
2-hydroxy-benzoová kyselina; 2,5-dihydroxybenzoová kyselina a 2-hydroxy-5-fenylbenzoová kyselina (pozri E ďalej) boli pripravené nasledujúce zlúčeniny: zlúčenina 2 z tabuľky I a II; zlúčenina 9 z tabuľky I a II;
zlúčenina 14 z tabuľky I a II; zlúčenina 15 z tabuľky I a II; zlúčenina 16 z tabuľky I a II; zlúčenina 17 z tabuľky I a II; zlúčenina 18 z tabuľky 1 a II; zlúčenina 19 z tabuľky I a II; zlúčenina 20 z tabuľky I a II a zlúčenina 21 z tabuľky I a II.
C. Príprava ostatných zlúčenín podľa všeobecného vzorca (I)
Podľa postupu v uvedenej časti A, pri použití FmocD-prolínu namiesto Fmoc-L-prolínu bola získaná zlúčenina 12 z tabuľky III.
D. Príprava ďalších zlúčenín podľa všeobecného vzorca (I)
Zlúčenina 13 z tabuľky I a II bola pripravená tak, že Fmoc-L-fenylalanín bol naviazaný na živici postupom analogickým, ako je postup naviazania Fmoc-L-prolínu v uvedenej časti A. Skupina Fmoc bola odstránená a na Fmoc prolín bol naviazaný fenylalanín). Ďalší postup syntézy zlúčeniny 13 bol vykonaný pri použití techník opísaných v časti A.
Podobne príprava zlúčeniny 6 a 7 z tabuľky I a II zahŕňa naviazanie Fmoc-piperidín-3-karboxylovej kyseliny alebo Fmoc-piperidín-4-karboxylovej kyseliny na živicu, odstránenie Fmoc skupiny a potom naviazanie Fmoc-Lprolínu. Zvyšok syntézy bol vykonaný rovnako ako v uvedenej časti A.
E. Príprava 2-hydroxy-5-fenylbenzoovej kyseliny
2-Hydroxy-5-fenylbenzoová kyselina bola syntetizovaná nasledujúcim spôsobom. Roztok tetrahydropyránom THP-chráneného 4-fenylfenolu (474 mg. 2 mmol., pripravený z 4-fenylfenolu štandardnými metódami opísanými v „Green and Wuts“ na str. 31-34) v bezvodom THF (5 ml) bol ochladený na -78 °C a bolo pridané nbutyllítium (2 ml 16M v hexáne). Reakčná zmes bola miešaná a zohriata na izbovú teplotu, počas čoho vznikla svetlohnedá suspenzia. Po 2 hodinách bola reakčná zmes ochladená na -78 °C a bol pridaný prebytok bezvodého CO2, ktorý na zmes pôsobil niekoľko minút. Reakčná zmes bola miešaná a zohriata na izbovú teplotu. Po 2 hodinách bola reakčná zmes roztrepaná medzi etyléter a vodný IN roztok NaOH. Vodná vrstva bola ľadom ochladená na 0 °C, okyslená na pH 2 vodným roztokom 1 N HC1. Vodný roztok bol pretrepaný s metylcnchloridom. Organická vrstva bola vysušená nad síranom horečnatým. Zahustenie vo vákuu poskytlo surový produkt ako špinavobielu pevnú látku (258 mg, 2-hydroxy-5fenylbenzoová kyselina). NMR spektroskopia surového produktu bola konzistentná s predpokladanou štruktúrou. IH NMR (DMSO-d6) 68,04 (d, J = 3 Hz, IH), 7,76 (dd, J = 9; 3 Hz, IH), 7,62 (d, J = 7Hz, 2H), 7,44 (t, J = 7Hz, 2H), 7,32 (t, J = 7HZ, III), 7,00 (d, J = 9IIz, III). Vypočítaná molekulová hmotnosť: 466,5. Nájdená molekulová hmotnosť: 467,2. LC gradient 25 až 45 % acetonitrilu počas 13 minút. LC retenčný čas 3,5 minúty. Materiál bol použitý bez ďalšej purifikácie.
III. Syntéza zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (I) v roztoku
A. Príprava zlúčeniny 10 z tabuľky 1 a III
K 20 g (L)-fenylalanínu ochladeného na -5 °C v kúpeli soľ/ľad bolo pridaných 74 ml koncentrovanej kyseliny sírovej. Teplota reakčnej zmesi bola ponechaná, aby sa ustálila a potom bolo pridaných 9,4 ml koncentrovanej kyseliny dusičnej prikvapkávaním počas 5 minút. Reakčná zmes bola miešaná 30 minút a potom pridaná do 700 ml drveného ľadu s vodou; pH bolo upravené na 8-9 koncentrovaným hydroxidom amónnym. Roztok bol ponechaný na kryštalizáciu pri teplote miestnosti a potom cez noc chladený na 4 °C. Svetložltý kryštalický produkt bol prefiltrovaný cez tuhý filtračný papier, premytý studenou vodou a vysušený. Produkt bol rekryštalizovaný v horúcej vode a filtrát bol odparený rekryštalizovaný (2x) s celkovým výťažkom 55 %. Teplota topenia: 218 - 222 °C (surový produkt). TLC: Rf(F) 0,18. NMR: (D2O/NaOD), γ2,99 (dd, J = 13,4; 7,2 Hz, 1H) , 3,10 (dd, J = 13,4; 6,0 Hz, 1H), 3,57 (dd, J = 7,2; 6,0 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 8,21 (d, J = 8,7Hz, 2H).
T-Butylkarbonylom (BOC)-chránené amino-kyseliny je možné pripraviť štandardnými technikami, pozri napr. „Greene and Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wilwy & Sons, Inc.: New York“, str. 327-328(1991).
K. roztoku (s teplotou -20 °C) BOC-chráneného pnitrofenylalanínu (3,00 g, 9,67 mmol) v bezvodom metylénchloride (5 ml) bol pridaný N-metylmorfolín (NMM, 1,07 ml, 9,67 mmol) a následne izobutylchloroformát (1,26 ml, 9,67 mmol). Reakčná zmes bola 15 minút miešaná pri -20 °C. Do zmesi bol pridaný metyl-Lprolínhydrochlorid (L-Pro-OMe, 1,60 g, 9,67 mmol) ako pevná látka a následne ďalší NMM (1,07 ml, 9,67 mmol) . Po hodinovom miešaní pri -20 °C a hodinovom miešaní pri izbovej teplote bola reakčná zmes zahustená vo vákuu a potom zriedená etylacetátom. Etylacetátový roztok bol premytý 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej, vodou a soľným roztokom, vysušený nad síranom horečnatým a zahustený vo vákuu. Kolónovou chromatografiou bolo získaných 2,4 g produktu (výťažok > 60 %).
BOC skupina bola odstránená pôsobením HCI v dioxáne pri použití štandardných podmienok. Pozri napr. „Green and Wuts“, str. 328-329. K roztoku-l-hydroxy-2-naftoovej kyseliny (160 mg, 0,84 mmol) v metylénchloride a Ν,Ν-demetylformaníde (1 : 1, 3 ml) bol pridaný 1-hydrohybenzotriazol (159 mg, 1,17 mmol). Roztok bol ochladený na 0 °C a bol pridaný l-(3-dimetylamínopropyl)-3-etylkarbodiimidhydrochlorid (EDCI, 161 mg, 0,84 mmol). Reakčná zmes bola miešaná jednu hodinu pri 0 °C a 45 minút pri izbovej teplote. Reakčná zmes bola zahustená vo vákuu a zriedená etylacetátom a vodou. Organická vrstva bola separovaná, premytá (4x) vodou a potom soľným roztokom, vysušená a zahustená vo vákuu. Chromatografia poskytla kondenzovaný produkt. (300 mg, 73 %) .
K roztoku kondenzovaného produktu (410 mg, 0,83 mmol) v etylacetáte (20 ml) bola pridaná ľadová kyselina octová (10 kvapiek) a 10 % paládium na aktívnom uhlí (100 mg), tento roztok bol 5 hodín hydrogenovaný. Reakčná zmes bola potom prefiltrovaná cez celit a roztok bol zahustený vo vákuu s výťažkom 375 mg (98 %) produktu, ktorý bol použitý bez ďalšej purifikácie.
K roztoku produktu uvedenej hydrogenačnej reakcie (200 g, 0,45 mmol) v bezvodom metanole (10 ml) bola pridaná kyselina formamidínsulfónová (118 mg, 0,95 mmol, pripravená oxidáciou komerčne dostupnej formamidínsulfónovej kyseliny podľa postupu opísaného v „Mryanoff a kol. (1986), J. Org. Chem. 1882“). Reakčná zmes bola miešaná tri dni. Reakčná zmes bola zahustená vo vákuu a produkt bol izolovaný chromatografiou (eluovaný metanolom:metylénchlo-ridom) s výťažkom 17 mg požadovaného produktu, zlúčeniny 10 z tabuľky III.
IV.Alternatívna syntéza zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (1)
A. Príprava zlúčeniny 3 z tabuľky I a II
Roztok l-benzyloxy-2-naftoovej kyseliny (2,247 g) v tionyl chloride (15 ml) bol refluxovaný 4 hodiny. Prebytočný reagent bol odparený vo vákuu. Zvyšok bol zriedený bezvodým DMF (9 ml) a zahustený na 2 ml. K. tomuto roztoku bol pridaný 4-dimetylaminopyridín (1,02 g). Zmes bola miešaná cez noc pri izbovej teplote. Výsledný pyridínový komplex bol pridaný do miešaného roztoku nitro-L-arginínu (1,77 g), tetrametylguanidínu (1 ml) a lítiumchloridu (4,56 g) v DMF (60 ml). Zmes bola miešaná pri teplote okolia 48 hodín. Väčšina DMF bola odparená vo vákuu a zvyšok bol rozdelený medzi 1,5 normálny (N) vodný roztok HCI a etylacetát. Spojené organické vrstvy boli premyté nasýteným vodným roztokom chloridu sodného a vysušené nad síranom horečnatým. Zahustenie vo vákuu poskytlo surový produkt (3,5 g, 1benzyloxy-2-naftoyl-N-nitro-L-arginín-ová kyselina). TLC: Rf produktu je 0,22 (použitie doštičky silikagélu a elúcie 10 % metanol/kyselina octová v chloroforme), tento materiál bol použitý bez ďalšej purifikácie.
Roztok l-benzyloxy-2-naftoyl-N-nitro-L-arginínovej kyseliny v bezvodom DMF (5 ml) bol ochladený na -25 °C a opracovaný pôsobením izobutylchloroformátu (0,053 ml). Reakčná zmes bola miešaná a ohriata na izbovú teplotu. Po 20 minútach bol pridaný pevný L-prolínamid (ako jeho soľ kyseliny chlorovodíkovej, 65,9 mg). Zmes je miešaná 16 hodín a potom zriedená etylacetátom. Etylacetátový roztok bol premytý 5 % vodným roztokom kyseliny citrónovej, nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného a vysušený nad síranom horečnatým. Roztok bol zahustený vo vákuu a zvyšok bol rozpustený v etanole (40 ml, obsahujúcom 10 % metanolu a 10 % kyseliny octovej) a hydrogenovaný pri 52 librách na štvorcovú stopu (psi) s 10 % paíádiom na uhlí (10 mg) až do ukončenia reakcie (TLC na silikagéli, elúcia chloroformom:metanolom 9:1), ktoré je indikované ziznutím rýchlejšie sa pohybujúcich škvŕn. Reakčná zmes bola prefiltrovaná cez celit, premytá etanolom a metanolom. Zmes bola zahustená vo vákuu a purifikovaná vysokotlakovou kvapalinovou chroma-tografiou za získania 1hydroxy-2-naftoyl-L-arginyl-L-prolín amidu (41 mg, „elektro-spray“ hmotové spektrum: M+l=441), izolovaného ako soľ kyseliny trifluóroctovej.
C. Príprava zlúčeniny 1 z tabuľky II
Podľa uvedeného postupu v časti A a pri použití 2-benzyloxy-l-naftoovej kyseliny namiesto l-benzyloxy-2-naftoovej kyseliny a sarkozínamidu namiesto L-prolín amidu bola získaná zlúčenia 1 z tabuľky III.
D. Príprava ďalších zlúčenín podľa všeobecného vzorca (D
Podľa uvedeného postupu v časti B a pri použití nasledujúcich zlúčenín namiesto sarkozínu:
L-prolín-N,N-dimetylamid;
L-prolínmetylester a trans-4-hydroxy-L-prolínmetylester; boli získané nasledujúce zlúčeniny: zlúčenina 5 z tabuľky I a II; zlúčenina 8 z tabuľky I a II a zlúčenina 4 z tabuľky III.
V. Fyzikálne údaje
Tabuľka 1
Zlúčenín» Molekulír. haotnoit /ypočítiní Molekulu, hnotaoeť nájdení Uf’1!1 Kvapalinoví Gradient3 Kvipalinovt Ret«ndn4 čaiy (ninj
i 414,24 415,1 D 5,8
Z 404,2« 405,5 ' B 11,2
3 440,26 441.1 λ 10,3
4 4’1,26 472,2 D 6.2
3 44»,29 465,1 D 4.8
β2 551.14 551,3 D 7,5
7 551.34 552,1 0 7,3
B 455,26 656,0 D 7,0
9 442,26 443 ,0 • D 5,5
10 - - -
11 456,26 456 ,7. C 24,4
i.2 440,i# 441.a C 13,4
13 617,14 586.0 c 26,9
14 440,26 440,5 A 9,0
15 440,26 440.2* B 6.4
16 391,5 391,8* .0 5.6
17 456,49 456,7* B -9,0
18 393,22 391,8* B 5.5
19 390,4 281,1 A hI-u
10 406,4 407,2 C
11 <66,5 467,2 E 3,5
1. Všetky molekulové hmotnosti boli určené pri použití Finniganovho „elektrospray“ hmotnostného spektrometra, ak nie je uvedené inak.
2. Vo všetkých prípadoch bol použitý binárny gradientový systém obsahujúci acetonitril a vodu. Všetky eluanty obsahovali 0,1 % triíluóroctovej kyseliny. A: 20 až 45 % acetonitrilu počas 13 minút. B: 10 až 35 % acetonitrilu počas 13 minút. C: 5 až 95 % acetonitrilu počas 45 minút. D: 2 až 95 % acetonitrilu počas 10 minút. E: 25 až 45 % acetonitrilu počas 13 minút.
3. Testovaný materiál bol zmesou diastereomérov.
4. Molekulové hmotnosti boli určené Biolonovou hmotnostnou spektrometriou. Hodnoty predstavuje M+.
Určenie tryptázovej inhibicie in vitro
Zlúčeniny (približne 1 mg), ktoré mali byť určené proti tryptáze, boli rozriedené v dimetylsulfoxide (DMSO) a nariedené 1:10 pufrom obsahujúcim 50 milimolámy (mM) Tris-HCI pri pH 8,2, a obsahujúci 100 mM NaCl, 0,05 % Tween-20. Z pôvodného riedenia bolo pripravených 7 ďalších 3-násobných riedení v rovnakom pufri s prídavkom 10 % DMSO. Alikvotné podiely (50 1) z každého zo série 8 riedení boli nanesené do jednotlivých jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky (dno jamiek v tvare U). Tryptáza (25 1; 0,5 mM výsledná koncentrácia) bola pridaná do každej jamky a vzorky boli premiešané a inkubované jednu hodinu pri teplote miestnosti buď pri okolitom osvetlení (t.j. svetlo, ktoré je k dispozícii v miestnosti počas experimentu) alebo za kontrolných podmienok „svetla“ alebo „tmy“. „Svetlo“ tu znamená svetelnú intenzitu 400 až 450 stopových kandiel z fluorescenčnej žiarovky. „Tma“ tu znamená, že nádobky vzorky sú zabalené do hliníkovej fólie. Enzýmová reakcia je potom iniciovaná prídavkom syntetického tripeptidového substrátu, tosyl-GlyProLys-p-nitroanilídu (25 1, 0,5 mM výsledná koncentrácia). Mikrotitračné doštičky boli hneď prenesené do UV/MAX Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices) a hydrolýza chromogénneho substrátu bola sledovaná spektrofotometricky pri 405 mM počas 5 minút. Enzýmové určenia poskytli zvyčajné krivky s lineárnym priebehom za týchto podmienok. Meranie počiatočnej rýchlosti vypočítanej z kriviek priebehu pomocou kinetického analytického programu s názvom „BatchKi“ (komerčne dostupný z Biokin Ltd., Madison WI), program bol použitý na určenie zdanlivých inhibičných konštánt pre každý inhibítor. Tento program je určený na zobrazenie regresií a zobrazenie krivky z nelineárnych dát.
Tabuľka II uvádza inhibičné konštanty (Kí’, mikromolárne (M) ), ktoré boli určené pre niekoľko zlúčenín podľa tohto vynálezu, kde R1 je vodík, R2 je vodík; R3 je -(CH2)3-NII-(C=NH)-NH2; R4 a R5, spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria päťčlenný heterocyklus; a R6 je vodík. Podľa predkladaného vynálezu je zlúčenina označená ako „aktívna“ alebo efektívna ako tryptázový inhibítor, ak jej K/ je menšie než 1000 M. Na rozdiel od K. K,’ nemôže byť skutočná disociačná konštanta komplexu enzým-inhibítor; K,’ zodpovedá K, pre nekompetitívny inhibítor a priamo zodpovedá K, pre kompetitívne a akompetitivne inhibítory.
Vystavenie roztokov testovaných zlúčenín v testovacom médiu svetlu môže znižovať K/. Všeobecne sú podmienky určenia citlivé na svetlo a zmeny intenzity okolitého osvetlenia môžu ovplyvniť reprodukovateľnosť určenia. Na odstránenie tohto potenciálneho zdroja chýb boli niektoré analýzy vykonané v tme. K,’ uvedené v tabuľke II a III bez zátvoriek boli určené za podmienok okolitého osvetlenia. K,’ uvedené so zátvorkami boli určené za podmienok „tmy“, ako boli definované. K.,’ uvedené s hviezdičkou (*) boli merané pri podmienkach „svetla“ ako boli definované (t.j. svetelná intenzita 400 až 450 stopových kandiel).
Tabuľka III uvádza inhibičné konštanty (K/, mikromolárne ( M)), ktoré boli určené pre niekoľko zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Podľa predkladaného vynálezu je zlúčenina označená ako „aktívna“ alebo efektívna ako tryptázový inhibítor, ak jej K/ je menšie než 1000 M.
] Zlúčenina K, * átruXtúra
10 2.5* (16) 44 1 '—S
11 0.3« (40) 0CUJU'‘ ,.A..
Tabiaflca lír
Zlúčenina K, ' a7 Ar
13 0.6* (110} . ,»«>
14 752· (707) -νή2 CCC
15 0.84 -NHj
15 0* (63) -KK2 a.
17 900 ~nh2 a*
Tatmflca ll
Zlúčenina K< ' ’ aT
l >500 -NKj ..Ä.
3 c.3* («| -ffi2
$ 15 aý-
< 82 -ď“.
664
6 206 -OOÍJ
9 23· {56} -ÍOCj ax
Zlúčením
12 2.i· (818)
· · <
K J ,Á..
Ďalšia charakteristika tryptázovej inhibície zlúčeninou 3 z tabuľky I a II
A. Závislosť od pH
Zlúčenina 3 bola určená proti tryptáze pri štyroch rôznych hodnotách pH nasledujúcom pufračnom systéme: 120 mM NaCL, 2,7 mM KCs, 0,13 mM NaH2PO4, 0,896 mM Na2IIPO4. Výsledný použitý pufračný systém zahŕňa 0,05 % Tween-20. Tabuľa IV ukazuje K/ (M) pre zlúčeninu 3 pri rôznych hodnotách pH.
Ttb»»» xv
áj 14 1
Kf (gM) 14 B,0 ľ J
B. Optimalizované určenie pri pH 7,5
Autori vynálezu objavili, žc zlúčenina je menej citlivá na svetlo v nasledujúcom pufračnom systéme: 120 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 0,13 mM NaH2PO4, 0,896 mM Na2HPO4 a 0,05 % Tween-20 pri pH 7,5. Určenie bolo vykonané podľa uvedeného postupu a riedenie zlúčeniny 3 a pridanie tryptázy bolo vykonané pri okolitom osvetlení pri teplote miestnosti (22 až 26 °C). Doštička so vzorkami bola zabalená do hliníkovej fólie na hodinovú inkubáciu pred pridaním substrátu, ktorý bol tiež pripravený pri okolitom osvetlení. Všetky kroky pri riedení a prípravy tryptázy museli byť vykonané počas 5 minút. Okrem toho zlúčenina 3 musí byť riedená DMSO.
Testovanie in vivo
V týchto štúdiách bola použitá ako model astma ovicc. Tieto metódy boli predtým publikované (pozri „Abrahám a kol. (1983) Am. Rev. Respir. Dis. 128: 839-844“; „Allegra a kol. (1983) J. Appl. Physiol. 55: 726-730“; „Russi a kol. (1985) J. Appl. Physiol. 59: 1416-1422“; „Soler a kol. (1989) J. Appl. Physiol. 67: 406-413“).
Každá ovca slúžila ako svoja vlastná kontrola. Hmotnosť týchto zvierat bola od 20 do 50 kg.
V týchto štúdiách bolo 9 mg zlúčeniny 3 z tabuľky I a II rozpustených v 3 ml pufrovaného fyziologického roztoku a výsledný roztok podaný ako aerosól 0,5-hodiny pred expozíciou alergénom, 4 hodiny po expozícii a 24 hodín po expozícii (celková dávka = = 27; n=6). Zlúčenina 3 mala tendenciu redukovať včasnú odpoveď a tlmila neskorú odpoveď, ako je ukázané na obr.l. Pri kontrolnom určení (iba nosič) expozícia antigénom spôsobila vzostup včasnej odpovede nad základnú líniu špecifickej pľúcnej rezistencie (SRL) 374 104 % a 212 21 % (t j. štand. chyba). Napriek tomu ak je ovca liečená zlúčeninou 3 z tabuľky I a II, včasný a neskorší vzostup SRL bol 280 39 % a 72 9 % (p<0,05 proti kontrole, Wilcoxonov bežný test).
Vrchol včasných odpovedí bol nájdený ako priemer maximálnych hodnôt, ktoré sa objavili ihneď po expozí cii. Vrchol neskorších odpovedí bol vypočítaný spriemerovaním maximálnych hodnôt odpovede pre každé zviera počas časovej periódy medzi 6. a 8. hodinou. Tento postup je ustálený a eliminuje možnosť zníženia neskoršej odpovede jednoduchým prieme-rovaním.
hodín po expozícii antigénom sa pri kontrolnej i liečenej vzorke rozvinula hypersenzitivita dýchacích ciest. (Hypersenzitivita dýchacích ciest je vyjadrená ako PC400, t.j, koncentrácia karbacholu, ktorá spôsobila 400 %-ný vzostup SRL. Zníženie v PC400 teda znamená, že sa dýchacie cesty stali precitlivelými). Zlúčenina 3 z tabuľky 1 a II blokuje 24 hod. hypersenzitivitu, pozri obr.2. Základná línia PC400 bola 22,0 3,7 dychových jednotiek v kontrolnej vzorke, pokles na 9,1 ± 1,3 dychových jednotiek po expozícii alergénom (p<0,05 proti základnej línii). Napriek tomu pri vzorke, kde bol podaný liek, P400 bolo nezmenené proti základnej línii (16,0 ± 3,8 dychových jednotiek oproti 17,6 ± 3,5 dychovým jednotkám po expozícii alergénom). Teda liečenie zlúčeninou 3 z tabuľky I a II má štatisticky preukázateľné zlepšenie funkcie dýchacích ciest pri ovciach vystavených expozícii alergénu.
Objavy tohto použitia vo všetkých článkoch a referenciách, vrátane patentov, sú tu uvedené ako referencie.
Je zrejmé, že uvedený opis je ilustratívny a nie reštriktívny. Mnohé spôsoby použitia sú zrejmé všetkým, ktorí sú v danej problematike zbehlí, pri zhrnutí uvedeného opisu. Rámec vynálezu by však nemal byť určený odkazom na uvedený opis, mal by byť určený odkazom na pripojené patentové nároky, spolu s kompletným rámcom ekvivalentov, ktoré majú oprávnenie ako patentové nároky.

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ všeobecného vzorca (I) kde
    Ar je hydroxylom substituovaný aryl alebo hydroxylom substituovaný heteroaryl, kde hydroxyl je umiestnený v polohe orto k amidovému bočnému reťazcu a kde aryl je fenyl. bifenyl alebo naftyl a heteroaryl je aromatická heterocyklická skupina obsahujúca 6 až 10 atómov uhlíka v kruhu, a kde Ar môže byť ďalej substituované halogénom, alkylom, alkyloxy, alkyltio, alkylkarbonyloxy, trifluórmetyl, arylom, heteroarylom alebo hydroxyskupinou, pričom každý alkyl je cyklický, priamy alebo rozvetvený reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka, a kde ak Ar je hydroxylom susbtituovaný aryl, aromatický kruh nesúci amidový bočný reťazec nie je substituovaný halogénom a nemá definovanú alkylovú skupinu, v polohe orto k hydroxylu, a kde
    R1 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka,
    R2 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka,
    R3 je vybraný zo skupiny obsahujúcej kde m je celé číslo 3 až 6, p je celé číslo 0 až 2 a q je celé číslo 0 až 2,
    R4 je vodík alebo rozvetvený, alebo priamy alkylový reťazec majúci 1 až 6 atómov uhlíka a
    R5 a R6 sú nezávisle vybrané z vodíka alebo rozvetveného, alebo priameho alkylového reťazca majúceho 1 až 6 atómov uhlíka, alebo
    R4 a R5 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 4-členný, 5-členný alebo 6členný heterockylus a R6 je vodík, alebo
    R4 a R6 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 4-členný, 5-členný alebo 6členný heterocyklus a R5 je vodík, pričom každý uvedený heterocyklus môže byť ďalej substituovaný hydroxylom a
    R7 je -OR8 alebo -NR8R9, kde R8 a R9 sú nezávisle vybrané zo skupiny skladajúcej sa z vodíka, rozvetveného alebo priameho alkylového reťazca majúceho 1 až 6 atómov uhlíka alebo l-aminokarbonyl-2-fenyletylu, alebo R8 a R9 spolu s dusíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný 5-členný alebo 6-členný hetero-cyklus, pričom každý uvedený heterocyklus môže byť ďalej substituovaný aminokarbonylom.
  2. 2. Inhibitor tryptázy podľa nároku 1,vyznačujú c i sa t ý m , že Ar je l-hydroxy-2-naftyl, 2-hydroxy-1 -nafty!, 3-hydroxy-2-pyridyl alebo 2-hydroxy3-chinoxalyl, R1 je vodík, R2 je vodík a R3 je vybrané zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov všeobecného vzorca (II) alebo (III), kde jednotlivé substituenty majú už definovaný význam.
  3. 3. Inhibitor tryptázy podľa nároku 2, vyznačujú c i sa t ý m , že Ar je l-hydroxy-2-naftyl, R1 je vodík, R2 je vodík. R3 je -(CH2)3NH(CNH)NH2, R4 a R5 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný päťčlenný heterocyklus; R6 je vodík a R' je -NH2.
  4. 4. Inhibitor tryptázy podľa nároku 2, vyznačujú c i sa t ý m , že Ar je 2-hydroxy-l-naftyl, R1 je vodík, R2 je vodík, R3 je -(CH2)3NH(CNH)NH2, R4 a R5 spolu s dusíkom a uhlíkom, na ktoré sú naviazané, tvoria substituovaný päťčlenný heterocyklus; R6 je vodík a R7 je -NH2.
  5. 5. Farmaceutický prostriedok na liečenie imunitou spôsobených zápalových ochorení, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje inhibitor tryptázy alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ podľa nároku 1 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom.
  6. 6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyzná č u j ú c i sa tým, že inhibitor tryptázy je v roztoku nosiča alebo v roztoku aerosólovateľného farmaceutický prijateľného nosiča alebo suchého prášku v koncentrácii od 0,1 do 30 mg/ml.
  7. 7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyzná č u j ú c i sa tým, že obsahuje agonistu β-adrenergík.
  8. 8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, v y značujúci sa tým, že agonistom β-adrenergík je zlúčenina vybraná zo skupiny skladajúcej sa z albuterolu, terbutalínu, formoterolu, fenotcrolu a prenalínu.
  9. 9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, v y značujúci sa tým, že obsahuje protizápalové kortikosteroidy.
  10. 10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 9, v y značujúci sa tým, že protizápalové kortikosteroidy sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa z beklometazónu, triamcinolónu, flurizidu adexametazónu.
  11. 11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyzná č u j ú c i sa tým, že ďalej obsahuje ipratrópium bromid.
  12. 12. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, v y značujúci sa tým, že farmaceutický prijateľným nosičom je netoxický, farmaceutický prijateľný povrchový nosič.
  13. 13. Použitie inhibítora tryptázy alebo farmaceutického prostriedku s jeho obsahom podľa nárokov 1 až 12 vo forme roztoku, aerosólu alebo suchého prášku na prípravu liečiva na inhaláciu a intranazálnu aplikáciu na liečenie alergickej nádchy a astmy.
SK1129-95A 1993-03-12 1994-03-11 Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie SK282537B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3077093A 1993-03-12 1993-03-12
US3118793A 1993-03-12 1993-03-12
PCT/US1994/002706 WO1994020527A1 (en) 1993-03-12 1994-03-11 Compositions and methods for the treatment of immunomediated inflammatory disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK112995A3 SK112995A3 (en) 1996-10-02
SK282537B6 true SK282537B6 (sk) 2002-10-08

Family

ID=26706445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1129-95A SK282537B6 (sk) 1993-03-12 1994-03-11 Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0688337A1 (sk)
JP (1) JPH08507768A (sk)
KR (1) KR100309616B1 (sk)
CN (2) CN1057772C (sk)
AU (1) AU683459B2 (sk)
CZ (1) CZ289930B6 (sk)
FI (1) FI954245A (sk)
PL (1) PL176941B1 (sk)
SK (1) SK282537B6 (sk)
UA (1) UA42719C2 (sk)
WO (1) WO1994020527A1 (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656660A (en) * 1994-06-01 1997-08-12 Arris Pharmaceutical Corporation Compositions and methods for treating mast-cell mediated conditions
CA2200561A1 (en) 1994-09-23 1996-03-28 Ken D. Rice Compositions and methods for treating mast-cell inflammatory conditions
EP0893437A4 (en) 1996-04-10 2000-12-27 Ono Pharmaceutical Co GUANIDINO TRYPTASE INHIBITOR
CZ29799A3 (cs) * 1996-07-30 1999-06-16 Arris Pharmaceutical Corporation Disubstituovaná cyklická sloučenina, způsob její výroby, farmaceutický přípravek a způsob léčení onemocnění živočicha
US5968782A (en) * 1996-12-04 1999-10-19 Brigham And Womens's Hospital, Inc. Mast cell protease that cleaves fibrinogen
US5955431A (en) * 1997-02-05 1999-09-21 Brigham And Women's Hospital, Inc. Mast cell protease peptide inhibitors
AU1208999A (en) * 1997-11-10 1999-05-31 Array Biopharma, Inc. Compounds which inhibit tryptase activity
US6221914B1 (en) * 1997-11-10 2001-04-24 Array Biopharma Inc. Sulfonamide bridging compounds that inhibit tryptase activity
AU1176299A (en) * 1997-11-26 1999-06-15 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Tryptase inhibitors comprising heterocyclic amide compounds
SE9800729L (sv) * 1998-03-06 1999-09-07 Scotia Lipidteknik Ab Ny topikal formulering I
SE515982C2 (sv) * 1998-03-06 2001-11-05 Lipocore Holding Ab Användning av en olja-i-vatten emulsion som bärare för framställning av en topikal kräm eller lotion
DE19939910A1 (de) * 1999-08-23 2001-03-01 Morphochem Ag Neue Verbindungen, die Tryptase-Aktivität hemmen
GB0507577D0 (en) * 2005-04-14 2005-05-18 Novartis Ag Organic compounds

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4201863A (en) * 1974-11-08 1980-05-06 Mitsubishi Chemical Industries, Limited N2 -Arylsulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4456595A (en) * 1982-12-06 1984-06-26 E. R. Squibb & Sons, Inc. Carboxy and substituted carboxy aroly peptides

Also Published As

Publication number Publication date
KR100309616B1 (ko) 2002-02-28
CZ289930B6 (cs) 2002-04-17
EP0688337A1 (en) 1995-12-27
PL176941B1 (pl) 1999-08-31
CZ232195A3 (en) 1996-07-17
FI954245A (fi) 1995-09-28
AU683459B2 (en) 1997-11-13
CN1119019A (zh) 1996-03-20
UA42719C2 (uk) 2001-11-15
CN1057772C (zh) 2000-10-25
FI954245A0 (fi) 1995-09-11
PL310559A1 (en) 1995-12-27
SK112995A3 (en) 1996-10-02
CN1234229A (zh) 1999-11-10
WO1994020527A1 (en) 1994-09-15
JPH08507768A (ja) 1996-08-20
AU6364794A (en) 1994-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5525623A (en) Compositions and methods for the treatment of immunomediated inflammatory disorders
US6211228B1 (en) Compositions and methods for treating mast-cell mediated conditions
SK282537B6 (sk) Inhibítor tryptázy alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
US5656660A (en) Compositions and methods for treating mast-cell mediated conditions
JP4536918B2 (ja) 免疫調整機能を有するγ−グルタミルとβ−アスパルチル化合物および免疫調節剤
JPH08511017A (ja) 新規なペプチド誘導体
SA94140584B1 (ar) اريل لسلفون اميدو- هيدروكساميك مستبدلة
JP2003506491A (ja) 細胞接着インヒビター
HU226979B1 (en) Bicyclic lactam inhibitor of interleukin-1-beta converting enzyme and pharmaceutical compositions containing them
JP2002516309A (ja) 新規VLA−4阻害剤:oMePUPA−V
JPH10502656A (ja) ヒトs−cd23の阻害剤の使用
EP0747055A2 (en) Use of tachykinin receptors antagonists for the treatment of cold and allergic rhinitis
US6673965B1 (en) Hydroxamic acid derivative as inhibitor of the formation of soluble human CD23
EP1101492A1 (en) Novel remedies for allergic diseases
Duflos et al. 6-Amino-2, 4-lutidine carboxamides: α-aminoamide derivatives as systemic and topical inflammation inhibitors
US20020082200A1 (en) Use of inhibitors of human S-CD23
EP0909169A1 (en) Medical use
MXPA01000563A (en) Novel remedies for allergic diseases
MXPA00007186A (en) Vla-4 antagonists